CN118086311A - 抑制PCSK9基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途 - Google Patents

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CN118086311A CN202410480996.4A CN202410480996A CN118086311A CN 118086311 A CN118086311 A CN 118086311A CN 202410480996 A CN202410480996 A CN 202410480996A CN 118086311 A CN118086311 A CN 118086311A
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刘楠
张红丽
陈平
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Abstract

本发明涉及一种抑制PCSK9基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途，所述siRNA包括正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述正义链包括如SEQ ID NO:1至22中任一项所示序列，所述反义链包括如SEQ ID NO:23至44中任一项所示序列。

Description

抑制PCSK9基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抑制PCSK9基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途。
背景技术
血脂异常（dyslipidemia）是最为常见的代谢类相关疾病，主要包括血清中胆固醇（TC）或/和甘油三酯（TG）升高，也包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高或高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）低下在内的各种血脂异常。在各血脂指标中与脑血管疾病（CVD）风险最为相关的是血浆LDL-C水平，因此控制LDL-C水平是血脂治疗的首要目标。
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9（PCSK9）是枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族的一个成员，可以在多种组织表达，能够表达并分泌PCSK9的组织主要是肝脏、小肠以及肾脏。有研究表明，PCSK9蛋白参与脂质代谢，其通过促进低密度脂蛋白受体（LDL-R）受体溶酶体内的降解，导致肝细胞表面LDL-R受体表达降低，进而引起血液中LDL-C水平的升高（Melendez QM等人, .Arch Biochem Biophys. 2017. 625-626:39-53.）。
PCSK9在肝脏的主要功能是调控LDL-C水平，也是第三个被证实与家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH）相关的基因，PCSK9基因的功能缺失性（Loss-of-function，LOF）突变或者遗传失效（genetic invalidation）能够大大降低循环LDL-C的水平，并且能使心血管事件降低达到88%，相反，如果PCSK9基因发生功能获得性（Gain-of-function，GOF）突变，则导致循环LDL-C水平大幅度增加，进而诱发心血管事件的发生（Poirier S等人，Drug Design, Development and Therapy 2013:7 1135–1148.）。PCSK9GOF点突变最初在两个家族性高胆固醇血症（family hypercholesterolemia）的法国家庭（Nantes和Bordeaux）被发现，分别导致循环LDL-C增加2倍（F216L）和4倍（S127R），随后又发现了多个稀少的错义GOF突变，均伴随LDL-C水平的显著升高。其中最为有害的突变是Anglo-Saxon突变D374Y，这些杂合性突变患者的LDL-C水平通常至少有5倍以上的增加，GOFD374Y-PCSK9导致严重的FH表型，并且他汀类药物不能有效降低LDL-C水平。截止目前，已经发现160多个PCSK9等位基因变异，基于人类遗传的研究，PCSK9抑制剂代表了一类新的降低LDL-C的高效方法，最终实现减少动脉粥样硬化和CVD风险的目的（Poirier S等人，DrugDesign, Development and Therapy 2013:7 1135–1148.）。
目前RNAi 作为一种高效且能够序列特异性沉默或敲低基因的技术在在多个疾病治疗领域发展迅速。而目前针对PCSK9的siRNA药物，仅一款阿尔尼拉姆的INCLISIRAN在中国批准上市。因此，有必要开发更多的能够抑制PCSK9基因mRNA转录物的siRNA，以引起PCSK9的表达下调。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制PCSK9基因mRNA转录物的siRNA、其缀合物、药物组合物及用途，其能够有效引起PCSK9的表达下调。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明第一方面提供一种siRNA，其包括正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述正义链包括如SEQ ID NO:1至22中任一项所示序列，所述反义链包括如SEQ ID NO:23至44中任一项所示序列。
根据某些实施方式，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所述正义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个或十九个。在某些实施方案中，所述反义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或二十一个。在某些实施方案中，所述正义链和所述反义链中的全部的核苷酸为修饰的核苷酸。
本申请的siRNA 中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本申请的siRNA抑制PCSK9 基因表达的功能明显削弱或丧失，并且，本申请中未修饰的siRNA具有与修饰的siRNA具有相当的抑制PCSK9 基因表达的功能。
根据某些实施方式，所述正义链或所述反义链中的至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基，优选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
根据某些实施方式，所述正义链的 5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
根据某些实施方式，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
根据某些实施方式，所述修饰的核苷酸选自 2’-氟代修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，核苷酸类似物或其中任意两种及以上的组合。
进一步地，所述修饰的核苷酸选自2’- 氟代修饰的核苷酸，2’-甲氧基修饰的核苷酸，2’-O-CH2-CH2-O-CH3修饰的核苷酸，2’-O-CH2-CH=CH2修饰的核苷酸，2’-CH2-CH2-CH=CH2修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，核苷酸类似物，反向脱碱基脱氧核糖残基或其中任意两种及以上的组合。
根据一些优选且具体实施方式，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8 和9 位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第 2、6、14和 16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。
根据另一些优选且具体实施方式，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第 2、14和 16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。
进一步地，所述非氟代修饰的核苷酸的核糖基2’位的羟基被甲氧基取代。
进一步地，所述正义链的5’末端的碱基以及所述正义链的3’末端的碱基分别连接含有磷酸酯基或硫代磷酸酯基的反向脱碱基脱氧核糖残基。
根据一些优选且具体实施方式，按照5’到3’的方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1 个核苷酸与第2 个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2 个核苷酸与第3 个核苷酸之间。
根据一些优选且具体实施方式，按照5’到3’的方向，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1 个核苷酸与第2 个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2 个核苷酸与第3 个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1 个核苷酸与第2 个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2 个核苷酸与第3 个核苷酸之间。
根据一些优选且具体实施方式，按照5’到3’的方向，所述反义链的第6位或第7位的核苷酸包括如结构式所示的修饰，其中，R1为H、OH或CH3，R2为天然核碱基、修饰的核碱基、通用碱基或H原子。通过在反义链中增加该结构式所示修饰，可以降低siRNA的脱靶活性，并且基本不影响siRNA的在靶活性。
进一步地，如结构式所示的修饰选自以下任一结构：
。
根据一些优选且具体实施方式，所述的siRNA选自表2、表3或表8中的siRNA。
根据一些优选且具体实施方式，按照5’-3’方向，所述siRNA的正义链为CmsCmsUmGmUmUmUfUfGfCmUmUmUmUmGmUmAmAmAm，反义链为UmsUfsUmAmCmAfAmAmAmGmCmAmAmAfAmCfAmGmGmsUmsCm；或者，按照5’-3’方向，所述siRNA的正义链为IB-s-CmCmUmGmUmUmUfUmGfCmUfUmUmUmGmUmAmAmAm-s-IB，反义链为UmsUfsUmAmCmAmAmAmAmGmCmAmAmAfAmCfAmGmGmsUmsCm。
本发明第二方面提供一种siRNA缀合物，其包括上述siRNA，以及缀合至所述siRNA的缀合基团。
根据某些实施方式，所述缀合基团连接在所述正义链的3’末端和/或5’末端。
根据一些具体且优选实施方式，所述siRNA缀合物的结构式为
，或者
。
本发明第三方面提供一种药物组合物，其包括上述siRNA或上述siRNA缀合物，以及药学上可接受的载体或辅料。
根据一些具体实施方式，所述药物组合物用于抑制PCSK9基因表达。
本发明第四方面提供上述siRNA，或上述siRNA缀合物，或上述药物组合物在用于制备抑制PCSK9基因表达的药剂的中用途。
本发明第五方面提供上述siRNA，或上述siRNA缀合物，或上述药物组合物用于制备治疗和/或预防PCSK9 基因表达相关的疾病的药剂的用途。
进一步地，所述疾病为高脂血症、高胆固醇血症。
其中，所述高胆固醇血症为纯合性家族性高胆固醇血症（HoFH）、杂合性家族性高胆固醇血症（HeFH）。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明提供的siRNA、siRNA 缀合物和药物组合物具有优异的PCSK9 基因表达抑制活性，具有良好的治疗PCSK9 基因表达相关的疾病的潜力。并且，本发明的siRNA、siRNA缀合物和药物组合物组织特异性好，安全性高；药效持续时间长，皮下给药，用药依从性高；与现有同类型的药物相比，药效和安全性都有很大的提升。
附图说明
图1为实施例6的siRNA缀合物在Hep3B细胞中的体外评估结果图；
图2为实施例7的siRNA缀合物在PCSK9人源化小鼠中的体内活性结果图；
图3为实施例8的siRNA缀合物在食蟹猴中的LDL给药前后水平结果图；
图4为实施例8的siRNA缀合物在食蟹猴中的PCSK9蛋白剩余表达水平结果图；
图5为实施例9的siRNA缀合物在雌性大鼠体内的毒理血生化结果图；
图6为实施例9的siRNA缀合物在雄性大鼠体内的毒理血生化结果图。
具体实施方式
需要说明的是，除非另外定义，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为所属领域的技术人员所理解的通常意义。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售产品。
定义
在上文及下文中，2’-甲氧基修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被甲氧基取代形成的核苷酸；同理，2’-氟代修饰的核苷酸是指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代所形成的核苷酸。
硫代磷酸酯键修饰的核苷酸指核苷酸的磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代。VP修饰的核苷酸是指核苷酸的磷酸基团被乙烯基磷酸酯基取代形成的核苷酸。
在上文及下文中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，固相亚磷酰胺合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体。固相亚磷酰胺合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。
本公开中所述的药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒（magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒）、碳纳米管（carbon nanotubes）、介孔硅（mesoporous silicon）、磷酸钙纳米粒（calciumphosphate nanoparticles）、聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）、聚酰胺型树形高分子（polyamidoamine (PAMAM) dendrimer）、聚赖氨酸（poly(L-lysine)，PLL）、壳聚糖（chitosan）、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP）、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物（poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA）、聚（氨乙基乙撑磷酸酯）（poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA）和聚（甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯）（poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA）以及它们的衍生物中的一种或多种。辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
如本说明书所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且所述描述包括事件或状况发生的情况和其中不发生的情况。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类（例如，恒河猴或其他类型的猕猴）、小鼠、猪、马、驴、牛、兔、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的“预防”指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将siRNA、siRNA缀合物或药物组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
本文中的核苷酸单体缩写分别代表如下含义：
A：腺苷-3'-磷酸，Af：2'-氟代腺苷-3'-磷酸，Afs：2'-氟代腺苷-3'硫代磷酸酯，Am：2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸，Ams：2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯，dA：脱氧腺苷-3'-磷酸，C：胞苷-3'-磷酸，Cf：2'-氟代胞苷-3'-磷酸，Cfs：2'-氟代胞苷-3'-硫代磷酸酯，Cm：2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸，Cms：2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯，dC：脱氧胞苷-3'-磷酸，G：鸟苷-3'-磷酸，Gf：2'-氟代鸟苷-3'-磷酸，Gfs：2'-氟代鸟苷-3'-硫代磷酸酯，Gm：2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸，Gms：2'-O-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸酯，dG：脱氧鸟苷-3'-磷酸，U：尿苷-3'-磷酸，Uf：2'-氟代尿苷-3'-磷酸，Ufs：2'-氟代尿苷-3'-硫代磷酸酯，Um：2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸，Ums：2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯，dT：5'-甲基尿苷-3'-磷酸，s：硫代磷酸酯键，P：磷酸，VP：乙烯基磷酸酯，IB：反向脱碱基脱氧核糖残基，其中，IB中的磷酸酯键可以替换为硫代磷酸酯键。
下面结合具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明，并不会对本发明的保护范围进行限制。
实施例1 siRNA的合成
本文中，若未给出实际的试剂来源，则该类试剂可以自任意分子生物学试剂的供应商获得；且具备满足用于分子生物学应用的质量/纯度标准。
使用固体支撑物介导的亚磷酰胺化学于Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上以200纳摩尔(nmol)规格合成PCSK9 siRNA序列。该固体支撑物是通用固体支撑物(深圳逗点生物)。核苷单体原料2’-F RNA、2’-O-甲基RNA等核苷亚磷酰胺单体购自上海兆维或苏州吉玛。全部亚磷酰胺(50mM乙腈溶液)的偶合时间是6分钟(min)，采用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作为活化剂(0.6M乙腈溶液)，使用0.22 M的PADS溶于1:1体积比的乙腈和三甲基吡啶（苏州柯乐玛）溶液作为硫化试剂，硫化反应时间是3分钟（min），使用碘吡啶/水溶液（柯乐玛）作为氧化剂，氧化反应时间2分钟（min）。
固相合成完成后，寡核糖核苷酸自该固体支撑物裂解，采用3:1的28%氨水和乙醇溶液在50℃条件下浸泡16小时。然后高速离心，将上清液转移到另一个离心管中，浓缩蒸发干后，使用C18反向色谱纯化，流动相为0.1M TEAA和乙腈，并使用3%三氟乙酸溶液脱出DMTr。目标寡核苷酸收集后冻干，并经LC-MS鉴定为目标产物，再经过UV（260nm）定量。
所得到的单链寡核苷酸，根据等摩尔比，按照互补配对的两条序列，进行退火，最后所得到的双链siRNA溶于1X PBS中，并调整至实验所需浓度。这些单体通过5’-3’-磷酸二酯键相互连接成寡核苷酸。
实施例2 siRNA缀合物的制备
一、GalNAc靶头
1、L96（N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺癸酰基]]-4-羟基脯氨醇-(GalNAc-烷基)）购自凯莱英医药集团（天津）股份有限公司，其结构式如下：
。
2、化合物SA51 (I-1-7)，其合成方法及结构参见申请号为2024100522838的发明专利。
二、siRNA缀合物制备
通过固相亚磷酰胺法，利用上述步骤的GalNAc化合物为起始循环，按照核苷酸排布顺序自3’-5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。正义链和反义链采用相同的合成条件。
仪器设备型号：Biolytic Dr. Oligo 48固相合成仪，逗点生物Embed CPG Frits通用合成柱DS0200，逗点生物96孔板脱盐柱DC189650（80mg）。表1为合成siRNA缀合物使用的试剂。
合成条件如下：
核苷单体以0.05M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为3分钟，脱保护试剂为DCA，进样体积180 μL。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为3分钟。核苷单体进样体积90 μL，催化剂ACT进样体积110 μL。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为2分钟。盖帽试剂溶液的摩尔比为1:1的CapA和CapB的混合溶液。盖帽试剂进样体积180 μL。
每一步氧化反应条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为3分钟，氧化试剂OXD进样体积为180 μL。
每一步硫化反应条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为4分钟，硫化试剂为0.05 M PADS的吡啶乙腈溶液。硫化试剂进样体积180 μL。
待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干获得正义链和反义链，其中：
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入氨水：乙醇=3:1的混合溶液至体积为0.8 mL。在50℃反应15h，过滤除去剩余载体，将上清液真空浓缩至干。
纯化和脱盐条件如下：利用C18反相色谱柱进行脱盐。具体条件包括：
(1) 样品的准备
向寡核苷酸样品中加入0.1M的TEAA（三乙胺醋酸盐）至体积为0.8 mL。
(2) 96孔板的活化
活化：0.8 mL乙腈通过96孔板的每个孔中进行活化；
平衡：用0.8 mL TEAA（pH 7.0）溶液进行96孔板的平衡。
(3) 纯化过程依次按照如下操作：
将0.8 mL包含寡核苷酸的溶液通过脱盐柱；
用0.8 mL 6.5%氨水洗涤96孔板2次，去除失败的序列；
用0.8 mL去离子水冲洗96孔板2次，去除盐分；
用0.8 mL 3%三氟乙酸冲洗96孔板3次，去除DMT，观察到吸附层变橙红色；
用0.8 mL 0.1 M TEAA冲洗96孔板；
用0.8 mL去离子水冲洗96孔板2次，去除三氟乙酸和残余的盐分；
用0.6 mL 20%乙腈进行洗脱，并收集冻干。
检测方法如下：使用WATERS ACQUITY UPLC-LTQ LCMS（COLUMN：ACQUITY UPLC BEHC18）检测上述正义链和反义链纯度并分析分子量。实测值与理论值相符，表明所合成的是3’端和/或5’端缀合了基团的正义链以及反义链。
退火操作如下：将合成获得的正义链和反义链分别溶于注射用水中，配制0.1mg/mL-40mg/mL的溶液，用浓度仪标定等摩尔比混合，90℃加热5分钟，再缓慢自然降温，使它们通过氢键形成双链结构，取样送检测产品的SEC纯度。将双链样品冻干。
实施例3 siRNA对Huh7细胞中人PCSK9的抑制，双浓度活性筛选
在体外测试靶向PCSK9的siRNA对PCSK9 mRNA表达水平的影响，本申请的优先权申请202310601362.5对几百条siRNA进行了测试，现将部分效果较优的siRNA裸序列列于表2，其对应的修饰序列列于表3，表2和表3中的序列的合成方法参见实施例1。
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实验方法：
siRNA初步转染的终浓度为10nM，对10nM浓度下活性剩余百分比小于16%的化合物进行终浓度0.1 nM活性筛选。
Huh7细胞培养于10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件37℃，5% CO2，然后通过胰蛋白酶消化，将细胞重悬。使用 RNAiMAX（Thermo，13778150）将siRNA共转染进1.5x104个细胞中。采用96孔板，每孔将0.3 μL的 RNAiMAX加入到含有siRNA的19.7 μLOpti-MEM中，并使其在室温下孵育15分钟，将混合物加入96孔板中，然后加入重悬于80 μL新鲜完全培养基的细胞。将细胞孵育24小时，利用组织细胞提取试剂盒（志昂生物，MNTR/FX96）提取RNA，进行反转录cDNA（Takara，6210B），通过探针法qPCR（APPLIED BIOSYSTEMS，4444964）测量PCSK9基因的表达水平，具体操作方法见相应说明书。
目的基因PCSK9引物和探针：
正向引物：ACGTGGCTGGCATTGCA（SEQ ID NO.45）；
反向引物：AAGTGGATCAGTCTCTGCCTCAA（SEQ ID NO.46）；
探针：CATGATGCTGTCTGCCGAGCCG（SEQ ID NO.47）；
内参基因β-actin引物和探针：
正向引物：TGCACCACCAACTGCTTAGC（SEQ ID NO.48）；
反向引物：ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA（SEQ ID NO.49）；
探针：TCATCCATGACAACTTTGGTA（SEQ ID NO.50）；
结果以相对于未经过siRNA处理的细胞PCSK9 mRNA表达（其为100%）的剩余百分比来表示，剩余百分比越小，代表siRNA的抑制活性越高，结果见表4。
实施例4 siRNA对HepG2细胞中人PCSK9的抑制，双浓度活性筛选
在HepG2细胞中采用2个浓度（1 nM、0.3 nM）对表3中0.1 nM 表现出40%或更高的体外抑制效果的siRNA进行筛选。
HepG2细胞培养于10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件37℃，5% CO2，然后通过胰蛋白酶消化，将细胞重悬。使用 RNAiMAX（Thermo，13778150）将siRNA共转染进2x104个细胞中。采用96孔板，每孔将0.3 μL的 RNAiMAX加入到含有siRNA的19.7 μL Opti-MEM中，并使其在室温下孵育15分钟，将混合物加入96孔板中，然后加入重悬于80 μL新鲜完全培养基的细胞。将细胞孵育24小时，利用组织细胞提取试剂盒（志昂生物，MNTR/FX96）提取RNA，进行反转录cDNA（Takara，6210B），通过探针法qPCR（Applied Biosystems，4444964）测量PCSK9基因的表达水平，具体操作方法见相应说明书，目的基因和内参基因的引物和探针参见实施例3。
结果以相对于未经过siRNA处理的细胞PCSK9 mRNA表达（其为100%）的剩余百分比来表示，剩余百分比越小，代表siRNA的抑制活性越高，结果见表5。
实施例5 小鼠体内测试优选序列的活性
本实施例中，构建PCSK9-SEAP模型小鼠，评估缀合物活性和长效性以筛选序列。优选出的siRNA缀合物见表6，缀合物按照实施例2的固相合成获得。
/>
实验方法：
在缀合物给药前至少14天，对六至八周龄雌性Balb/C 小鼠（浙江维通利华)通过高压尾静脉注射构建人源化表达PCSK9的小鼠，在5-7秒内通过尾静脉将2 μg含有PCSK9mRNA序列的质粒注射至小鼠中，以产生PCSK9-SEAP模型小鼠(Zhang G等人, “High levelsof foreign gene expression inhepatocytes after tail vein injection of nakedplasmid DNA.” Human GeneTherapy 1999 Vol. 10, p1735-1737.)。PCSK9 siRNA缀合物对PCSK9表达的抑制导致分泌型碱性磷酸酶（SEAP）表达的抑制。在给药前1天，通过眼眶采血，收集血清，根据产品说明书，用Phospha-Light™ SEAP报告基因检测系统(Invitrogen)来测量血清中的SEAP表达水平，且根据平均SEAP水平对小鼠进行分组。其中实验组小鼠给予缀合物，溶媒组小鼠给予磷酸盐缓冲盐水（PBS），按照每只小鼠给予3 mg/kg缀合物的剂量进行皮下给药。给药后7天、14天、21天、28天、35天分别采血，收集血清，并根据产品说明书，用Phospha-Light™ SEAP报告基因检测系统(Invitrogen)来测量血清中的SEAP表达水平。将各动物给药后的SEAP水平除以该动物给药前的SEAP水平，以确定“针对处理前归一化”的表达比率。
结果以各组给药前后血清SEAP的剩余表达水平表示（溶媒组为100%），相对剩余表达水平结果如表7所示，缀合物SD003710，SD003712，SD003718，SD003723，SD004034，SD004037这6个化合物初步显示较好的活性，其中缀合物SD004037活性最佳，在给药后35天，仍具有大于80%的活性。
/>
实施例6 优选序列体外活性评估
本实施例中，对HDI模型中活性较好的化合物的裸序列进行进一步筛选。以下为对SD002774进行不同的修饰合成SD005664，测评序列见表8。利用Hep3B细胞体外评估siRNA活性，并与阳性对照SD002849（Inclisiran去缀合）相比。其中，按照5’-3’方向，SD002849的正义链的序列为CmsUmsAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm，反义链的序列为AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAfCmAfGmGfUmCfUmAmGmsAmsAm，其对应的裸序列的正义链序列为CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU（SEQ ID NO:51），反义链序列为ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA（SEQID NO:52）。
实验方法：
在Hep3B细胞中采用9个浓度（5nM开始，3倍稀释，9个浓度）对表8中的siRNA缀合物以及阳性对照进行体外活性评估。
Hep3B细胞培养于10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（Gibco，C11995500BT）中，培养条件37℃，5% CO2，然后通过胰蛋白酶消化，将细胞重悬。使用 RNAiMAX（Thermo，13778150）将不同浓度的siRNA共转染进2x104个细胞中。采用96孔板，每孔将0.3 μL的 RNAiMAX加入到含有siRNA的19.7 μL Opti-MEM（Gibco，31985070）中，并使其在室温下孵育15分钟，将混合物加入96孔板中，然后加入重悬于80 μL新鲜含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（Gibco，C11995500BT）的细胞。将细胞孵育24小时，利用组织细胞提取试剂盒（志昂生物，MNTR/FX96）提取RNA，进行反转录cDNA（Takara，6210B），通过探针法qPCR（APPLIED BIOSYSTEMS，4444964）测量PCSK9基因的表达水平，具体操作方法见相应说明书，其中，目的基因和内参基因的引物和探针序列参见实施例3。
以相对于未经过siRNA处理的细胞PCSK9 mRNA表达（其为100%）的剩余百分比计算IC50，结果见图1。结果显示SD002774、SD005664稍优与阳性对照SD002849活性。
实施例7 优选序列缀合物在PCSK9人源化小鼠中的体内活性
本实施例中，对优选序列SD002774、SD005664进行自研递送SA51缀合，并与阳性对照SD0003320（Inclisiran）相比。缀合物测评序列见表9。
其中，SD004199的缀合物结构为；SD004731的缀合物结构为/>
，其中，该结构式中的siRNA的5’端所示反向脱碱基脱氧核糖残基即为上述表9中的SD004731的正义链的5’端的“s-IB-s-”，而SD004731的正义链的3’端的“-s-IB”未在该结构式中示出，但本领域技术人员知晓3’端的“-s-IB”的结构。
实验方法：
PCSK9人源化小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，选自6-8周雄性小鼠。在给药前1天，通过眼眶采血，收集血清，利用人PCSK9 ELISA试剂盒（SinoBiological，KIT10594）检测PCSK9蛋白水平，进行分组。其中实验组小鼠给予缀合物，溶媒组小鼠给予磷酸盐缓冲盐水（PBS），按照每只小鼠给予3 mg/kg缀合物的剂量进行皮下给药。给药后第7、14、21、28、35、42天进行眼眶采血，收集血清，检测人PCSK9蛋白含量（人 PCSK9 ELISA试剂盒，SinoBiological，KIT10594）。结果以相比于PBS组血清人PCSK9蛋白的相对表达水平标识，如表10所示。
第42天试验终点取材肝脏，利用组织细胞提取试剂盒（志昂生物，MNTR/FX96）提取RNA，进行反转录cDNA（Takara，6210B），通过探针法qPCR（Applied Biosystems，4444964）测量PCSK9基因的表达水平，具体操作方法见相应说明书，其中，目的基因和内参基因的引物和探针的序列参见实施例3。
以相对于PBS组PCSK9 mRNA表达（其为100%）为剩余表达水平，结果见图2。缀合物SD004199和SD004731活性均优于阳性对照SD003320，其中SD004199活性最优。
实施例8 非人灵长类（NHP）体内评估siRNA缀合物
本实施例中，在非人灵长类（NHP）食蟹猴中评估siNRA缀合物SD004199体内活性。
选取2-5年的雌性食蟹猴，每组3只。给药前第7天，采血检测PCSK9蛋白水平及LDL胆固醇水平，进行分组。实验组第0天皮下给药SD003320（阳性对照，Inclisiran）和SD004199，给药剂量6 mpk，动物实验及相应的动物饲养及检疫均委托药明康德开展。给药后每周采集血清，检测LDL胆固醇水平，至给药后第84天。
给药前后LDL水平见图3，SD004199与SD003320活性相当，甚至更优。检测给药后2周PCSK9蛋白水平，以相比于给药前LDL剩余表达水平表示，SD004199与SD003320抑制PCSK9蛋白水平相当，见图4。由此说明SD004199的药效与阳性对照相当，长效性稍优。
实施例9大鼠体内安全性评估
本实施例中，评估优选缀合物SD004199大鼠体内安全性，并与阳性对照进行对比。
选取6-8周龄的斯泼累格·多雷（Sprague-Dawley）大鼠（购自浙江维通利华），每组6只，雌雄各半，第0天根据体重分组。溶媒组皮下给药PBS，实验组分别皮下给药SD003320和SD004199，给药剂量100 mpk，给药后14天处死采血检测血生化并进行尸检。每周观察动物症状并测定动物体重，血生化检测T-BIL（胆红素）、ALT（谷丙转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）、ALP（碱性磷酸酶）、CK（肌酸激酶）、CR（肌酐）、UREA（尿素）等指标，尸检观察心脏、肺、肝、肾、脾有无明显异常，异常组织送检病理。
实验组与对照组体重无显著性差异，尸检无明显异常组织，血生化检测以相比于溶媒组的变化系数来表示，结果见图5和图6。结果表明SD004199安全性均良好，与溶媒组各指标均无统计学差异，个别检测指标表现优于阳性对照SD003320。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (18)

1.一种siRNA，其包括正义链和反义链，其特征在于：所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述正义链包括如SEQ ID NO:1至22中任一项所示序列，所述反义链包括如SEQ ID NO:23至44中任一项所示序列。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基，和/或，所述正义链的 5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，和/或所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
3.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于：所述修饰的核苷酸选自 2’-氟代修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，核苷酸类似物或其中任意两种及以上的组合。
4.根据权利要求3所述的siRNA，其特征在于：所述修饰的核苷酸选自2’- 氟代修饰的核苷酸，2’-甲氧基修饰的核苷酸，2’-O-CH2-CH2-O-CH3修饰的核苷酸，2’-O-CH2-CH=CH2修饰的核苷酸，2’-CH2-CH2-CH=CH2修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，核苷酸类似物，反向脱碱基脱氧核糖残基或其中任意两种及以上的组合。
5.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于：按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8 和9 位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第 2、6、14和 16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。
6.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于：按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第 2、14和 16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。
7.根据权利要求5或6所述的siRNA，其特征在于：所述非氟代修饰的核苷酸的核糖基2’位的羟基被甲氧基取代；或者，所述正义链的5’末端的碱基以及所述正义链的3’末端的碱基分别连接含有磷酸酯基或硫代磷酸酯基的反向脱碱基脱氧核糖残基。
8.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于：按照5’到3’的方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1 个核苷酸与第2 个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2 个核苷酸与第3 个核苷酸之间。
9.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于：按照5’到3’的方向，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1 个核苷酸与第2 个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2 个核苷酸与第3 个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1 个核苷酸与第2 个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2 个核苷酸与第3 个核苷酸之间。
10.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于：按照5’到3’的方向，所述反义链的第6位或第7位的核苷酸包括如结构式所示的修饰，其中，R1为H、OH或CH3，R2为天然核碱基、修饰的核碱基、通用碱基或H原子。
11.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：按照5’-3’方向，所述siRNA的正义链为CmsCmsUmGmUmUmUfUfGfCmUmUmUmUmGmUmAmAmAm，反义链为UmsUfsUmAmCmAfAmAmAmGmCmAmAmAfAmCfAmGmGmsUmsCm；或者，
按照5’-3’方向，所述siRNA的正义链为IB-s-CmCmUmGmUmUmUfUmGfCmUfUmUmUmGmUmAmAmAm-s-IB，反义链为UmsUfsUmAmCmAmAmAmAmGmCmAmAmAfAmCfAmGmGmsUmsCm。
12.一种siRNA缀合物，其特征在于：其包括权利要求1至11中任一项所述的siRNA，以及缀合至所述siRNA的缀合基团。
13.根据权利要求12所述的siRNA缀合物，其特征在于：所述缀合基团连接在所述正义链的3’末端和/或5’末端。
14.根据权利要求12所述的siRNA缀合物，其特征在于：所述siRNA缀合物的结
构式为，或者
。
15.一种药物组合物，其特征在于：其包括权利要求1至11中任一项所述的siRNA或权利要求12至14中任一项所述的siRNA缀合物，以及药学上可接受的载体或辅料。
16.如权利要求1至11中任一项所述的siRNA，或权利要求12至14中任一项所述的siRNA缀合物，或如权利要求15所述的药物组合物在用于制备抑制PCSK9基因表达的药剂的中用途。
17.如权利要求1至11中任一项所述的siRNA，或权利要求12至14中任一项所述的siRNA缀合物，或如权利要求15所述的药物组合物用于制备治疗和/或预防PCSK9 基因表达相关的疾病的药剂的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于：所述疾病为高脂血症、高胆固醇血症。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102458366A (zh) * 2009-06-15 2012-05-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna
CN108220295A (zh) * 2012-12-05 2018-06-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 PCSK9 iRNA组合物及其使用方法
CN109957566A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 广州市锐博生物科技有限公司 修饰的寡核苷酸和可用于合成修饰的寡核苷酸的化合物
US20210238606A1 (en) * 2018-04-18 2021-08-05 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Pcsk9 targeting oligonucleotides for treating hypercholesterolemia and related conditions
CN113286888A (zh) * 2019-05-22 2021-08-20 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CN115427570A (zh) * 2020-01-10 2022-12-02 斯克里贝治疗公司 用于靶向pcsk9的组合物和方法
CN115572726A (zh) * 2021-06-21 2023-01-06 上海君实生物医药科技股份有限公司 一种抑制PCSK9基因表达的siRNA及其用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102458366A (zh) * 2009-06-15 2012-05-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna
CN108220295A (zh) * 2012-12-05 2018-06-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 PCSK9 iRNA组合物及其使用方法
CN109957566A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 广州市锐博生物科技有限公司 修饰的寡核苷酸和可用于合成修饰的寡核苷酸的化合物
US20210238606A1 (en) * 2018-04-18 2021-08-05 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Pcsk9 targeting oligonucleotides for treating hypercholesterolemia and related conditions
CN113286888A (zh) * 2019-05-22 2021-08-20 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CN115427570A (zh) * 2020-01-10 2022-12-02 斯克里贝治疗公司 用于靶向pcsk9的组合物和方法
CN115572726A (zh) * 2021-06-21 2023-01-06 上海君实生物医药科技股份有限公司 一种抑制PCSK9基因表达的siRNA及其用途

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