TW202111118A

TW202111118A - 核酸、藥物組合物與綴合物及製備方法和用途

Info

Publication number: TW202111118A
Application number: TW109116933A
Authority: TW
Inventors: 鴻雁張; 高山; 代武康; 田寶磊
Original assignee: 大陸商蘇州瑞博生物技術股份有限公司
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2021-03-16
Also published as: KR20220011656A; AU2020280439A1; JP2022533841A; US20230313195A1; CN113286888A; CN113286888B; WO2020233655A1; CA3141372A1; EP3974530A1; CN117701564A; EP3974530A4

Abstract

本發明提供了一種抑制前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)基因表達的siRNA，含有該siRNA的藥物組合物和綴合物。前述siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，該siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述正義鏈含有核苷酸序列I，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，前述反義鏈含有核苷酸序列II，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異。本發明提供的siRNA及其藥物組合物和綴合物，可以有效治療和/或預防高膽固醇血症。

Description

核酸、藥物組合物與綴合物及製備方法和用途

本發明關於一種能夠抑制前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)基因表達的核酸、藥物組合物和siRNA綴合物。本發明還關於該核酸、藥物組合物與siRNA綴合物的製備方法和用途。

血脂異常，尤其是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)持續偏高是誘發和促進動脈粥樣硬化發生、發展的重要危險因素，與缺血性心腦血管疾病密切相關，嚴重威脅著人類健康。現有的治療血脂異常的藥物主要有他汀類、膽固醇吸收抑制劑、樹脂類、普羅步考、貝特類和煙酸及其衍生物。應用降脂藥降低血漿膽固醇水平可降低心腦血管疾病的發病風險，但仍有相當比例的患者未達到理想的血脂水平。

研究表明，前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)基因在脂質代謝、特別是膽固醇代謝中具有重要作用。通過抑制PCSK9基因表達，能夠有效降低血漿膽固醇水平。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)可基於RNA干擾(RNA interference，RNAi)這一機制，以序列特異性的方式抑制或阻斷感興趣的目的基因的表達，從而達到治療疾病的目的。若能從mRNA層面，抑制PCSK9基因表達，無疑將是最為理想的治療手段。

開發抑制PCSK9基因表達和治療高膽固醇血症的siRNA藥物的關鍵在於尋找合適的siRNA及其修飾以及有效的遞送系統。

本發明的發明人意外發現，具有本發明提供的如下siRNA綴合物能夠特異性地抑制PCSK9基因的表達，並且特異性地靶向肝臟，抑制肝臟中PCSK9基因的表達，實現治療或預防高膽固醇血症。此外，發明人還發明了具有較高活性的siRNA和藥物組合物。

在一些實施方式中，本發明提供了一種siRNA綴合物，該綴合物具有如式(308)所示的結構：

式(308)，其中：n1為選自1-3的整數，n3為選自0-4的整數；m1、m2或m3獨立地為選自2-10的整數；R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 或R₁₅ 各自獨立地為H，或選自於由以下基團所組成的組：C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基以及C₁ -C₁₀ 烷氧基； R₃ 為式A59所示結構的基團：

(A59) 其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ； Nu為siRNA，該siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II選自如下i)-vi)中的一組： i)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- AAGCAAGCAGACAUUUAUZ₁ -3'(SEQ ID NO: 1)； 5'- Z₂ AUAAAUGUCUGCUUGCUU -3'(SEQ ID NO: 2)，其中，Z₁ 為C，Z₂ 為G，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁ 的核苷酸Z₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂ 的核苷酸Z₄ ，前述Z₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； ii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- UUUGUAGCAUUUUUAUUAZ₅ -3' (SEQ ID NO: 61)； 5'- Z₆ UAAUAAAAAUGCUACAAA -3' (SEQ ID NO: 62)，其中，Z₅ 為A，Z₆ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₅ 的核苷酸Z₇ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₆ 的核苷酸Z₈ ，前述Z₈ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； iii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 121所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GCCUGGAGUUUAUUCGGAZ₉ -3' (SEQ ID NO: 121)； 5'- Z₁₀ UCCGAAUAAACUCCAGGC -3' (SEQ ID NO: 122)，其中，Z₉ 為A，Z₁₀ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₉ 的核苷酸Z₁₁ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₀ 的核苷酸Z₁₂ ，前述Z₁₂ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； iv)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 181所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CUGUUUUGCUUUUGUAACZ₁₃ -3' (SEQ ID NO: 181)； 5'- Z₁₄ GUUACAAAAGCAAAACAG -3' (SEQ ID NO: 182)，其中，Z₁₃ 為U，Z₁₄ 為A，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₃ 的核苷酸Z₁₅ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₄ 的核苷酸Z₁₆ ，前述Z₁₆ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； v)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 241所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GGUUUUGUAGCAUUUUUAZ₁₇ -3' (SEQ ID NO: 241)； 5'- Z₁₈ UAAAAAUGCUACAAAACC -3' (SEQ ID NO: 242)，其中，Z₁₇ 為U，Z₁₈ 為A，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₇ 的核苷酸Z₁₉ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₈ 的核苷酸Z₂₀ ，前述Z₂₀ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸；並且， vi)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 301所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GUGACUUUUUAAAAUAAAZ₂₁ -3' (SEQ ID NO: 301)； 5'- Z₂₂ UUUAUUUUAAAAAGUCAC -3' (SEQ ID NO: 302)，其中，Z₂₁ 為A，Z₂₂ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₂₁ 的核苷酸Z₂₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂₂ 的核苷酸Z₂₄ ，前述Z₂₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； R₂ 是長度為1-20個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，R₂ 可任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ 、-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；每個L₁ 獨立地是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，L₁ 可任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ 、-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；

表示基團共價連接的位點；M₁ 表示靶向基團。

在一些實施方式中，本發明提供了一種能夠抑制PCSK9基因表達的siRNA，前述siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述正義鏈和前述反義鏈中的每一個核苷酸獨立地為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸；前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，前述氟代修飾的核苷酸位於核苷酸序列I和核苷酸序列II中，並且，按照5'末端到3'末端的方向，在前述正義鏈中，前述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述正義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在前述反義鏈中，前述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述反義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸，並且，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II選自上述i)-vi)中的一組。

在一些實施方式中，本發明提供了一種藥物組合物，前述藥物組合物含有本發明的siRNA和藥學上可接受的載體。

在一些實施方式中，本發明提供了一種siRNA綴合物，前述siRNA綴合物含有本發明提供的siRNA以及綴合連接至該siRNA的綴合基團。

在一些實施方式中，本發明提供了本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物在製備用於治療和/或預防由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況的藥物中的用途。

在一些實施方式中，本發明提供了一種治療和/或預防由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況的方法，該方法包括將有效量的本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物給予有需要的受試者。

在一些實施方式中，本發明提供了一種抑制肝細胞中PCSK9基因表達的方法，該方法包括將有效量的本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物與前述肝細胞接觸。

在一些實施方式中，本發明提供了一種試劑盒，前述試劑盒含有本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物。

有益效果

本發明提供的siRNA、藥物組合物和siRNA綴合物具有良好的穩定性，較高的PCSK9 mRNA抑制活性，較低的脫靶效應及毒性，和/或能顯著治療或預防由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況，例如，高膽固醇血症。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物在體外細胞實驗中顯示出優異的靶mRNA抑制活性。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物在肝細胞中顯示出至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的靶mRNA抑制率。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物可在體內具有更高的穩定性和/或更高的活性。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物在體內顯示出至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的靶基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物在體內顯示出至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的PCSK9基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物在體內顯示出至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的肝內PCSK9基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物在體內顯示出至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的動物模型中肝內PCSK9基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物在體內顯示出至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的人類受試者中肝內PCSK9基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物未顯示出明顯脫靶效應。脫靶效應可以是例如抑制非靶基因的基因正常表達。據認為，如果脫靶基因表達的結合/抑制與在靶基因效果相比低於50%、40%、30%、20%或10%時，該脫靶效應就是不顯著的。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA在psiCHECK系統中顯示出較高的抑制活性，對目標序列的IC₅₀ 在0.0194-0.0561 nM之間。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA綴合物經皮下單次注射食蟹猴，9 mg/kg的劑量下，相對於給藥前第7天，給藥後第15天對NHP肝組織PCSK9 mRNA的抑制率達56-81%。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA綴合物對血清中PCSK9蛋白表達的抑制更為顯著，給藥後第14天血清中PCSK9蛋白表達的抑制率可達90%以上。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA綴合物能夠顯著抑制血清LDL-c和CHO水平，尤其在給藥後第14天至第29天期間，對LDL-c的抑制率可高達30%以上，甚至高達64%；對CHO也有較高的抑制率，甚至可高達35%以上。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA綴合物單次給藥9 mg/kg的劑量，對高於50% LDL-c抑制率可維持11周之久，並且本發明提供的siRNA綴合物在大鼠、小鼠中均未發現明顯的毒性。綜上，本發明提供的siRNA綴合物起效快，作用時間長，抑制靶mRNA表達顯著，能夠有效降低血清中PCSK9蛋白含量，對血清中LDL-c和CHO有強烈的抑制作用，且生物安全性能良好。

由此說明，本發明提供的siRNA、藥物組合物以及siRNA綴合物能夠抑制PCSK9基因的表達，有效治療和/或預防由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況，具有良好的應用前景。

本發明的其他特徵和優點將在隨後的具體實施方式部分予以詳細說明。

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。

在本發明中，PCSK9 mRNA是指具有Genbank註冊號為NM_174936.3所示序列的mRNA。進一步地，若無其它說明，本發明中所使用的術語“靶基因”是指能轉錄出上述PCSK9 mRNA的基因，術語“靶mRNA”是指上述PCSK9 mRNA。 [定義]

在上文及下文中，如無特別說明，大寫字母C、G、U、A、T表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為氟代修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；P1表示該P1右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸，字母組合VP表示該字母組合VP右側相鄰的一個核苷酸為乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸，字母組合Ps表示該字母組合Ps右側相鄰的一個核苷酸為硫代磷酸酯修飾的核苷酸，大寫字母P表示該字母P右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸。

在上文及下文中，前述“氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。“核苷酸類似物”指能夠在核酸中代替核苷酸，但結構不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、脲嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸的基團。如異核苷酸、橋聯的核苷酸(bridged nucleic acid，簡稱BNA)或無環核苷酸。前述“甲氧基修飾的核苷酸”指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在本文的上下文中，表述“互補”或“反向互補”可互相替代使用，並具有所屬技術領域具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基各自與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤(A)始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中為脲嘧啶(U))相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤(C)始終與嘧啶鹼基胞嘧啶(G)相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶(或脲嘧啶)配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。與此相應地，“錯配”在本領域中意指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補的形式配對存在。

在上文及下文中，如無特別說明，“基本上反向互補”是指所關於的兩段核苷酸序列之間存在不多於3個的鹼基錯配；“實質上反向互補”是指兩段核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；“完全反向互補”是指兩段核苷酸序列之間不存在鹼基錯配。

在上文及下文中，一個核苷酸序列與另外一個核苷酸序列存在“核苷酸差異”，是指前者與後者相比，相同位置的核苷酸的鹼基種類發生了改變，例如，在後者中一個核苷酸鹼基為A時，在前者的相同位置處的對應核苷酸鹼基為U、C、G或者T的情況下，認定為兩個核苷酸序列之間在該位置處存在核苷酸差異。在一些實施方式中，以無鹼基核苷酸或其均等物代替原位置的核苷酸時，也可認為在該位置處產生了核苷酸差異。

在上文及下文中，特別是在描述本發明的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物的製備方法時，除非特別說明，前述核苷單體(nucleoside monomer)指，根據欲製備的siRNA或siRNA綴合物中核苷酸的種類和順序，亞磷醯胺固相合成中使用的修飾或未修飾的核苷亞磷醯胺單體(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有時RNA phosphoramidites也稱為Nucleoside phosphoramidites)。亞磷醯胺固相合成為所屬技術領域具有通常知識者所習知的RNA合成中所用的方法。本發明所用的核苷單體均可商購得到。

在本發明的上下文中，除非另有說明，“綴合”是指兩個或多個各自具有特定功能的化學部分之間以共價連接的方式彼此連接；相應地，“綴合物”是指該各個化學部分之間通過共價連接而形成的化合物。進一步地，“siRNA綴合物”表示一個或多個具有特定功能的化學部分共價連接至siRNA上而形成的化合物。在下文中，有時也將本發明的siRNA綴合物簡稱為“綴合物”。siRNA綴合物應根據上下文，理解為多個siRNA綴合物的總稱或者某個化學式所示的siRNA綴合物。在本發明的上下文中，“綴合分子”應當理解為可通過反應綴合至siRNA，最終形成本發明的siRNA綴合物的特定化合物。

如本文所使用的，“任選的”或“任選地”是指其後描述的事件或狀況可以發生或不發生，並且該描述包括事件或狀況發生的情況和不發生的情況。例如，“任選地取代”的“烷基”包括下文定義的“烷基”和“取代烷基”。所屬技術領域具有通常知識者將理解的是，對於包含一個或多個取代基的任何基團，這些基團不打算引入空間上不切實際、合成上不可行和/或本身不穩定的任何取代或取代模式。

如本文所使用的，“烷基”是指具有指定數量的碳原子的直鏈和支鏈，前述數量通常為1至20個碳原子，例如1至10個碳原子，如1至8個或1至6個碳原子。例如，C₁ -C₆ 烷基包含1至6個碳原子的直鏈和支鏈烷基。當提及具有特定數量的碳的烷基殘基時，旨在涵蓋具有該數量的碳的所有支鏈和直鏈形式；因此，例如，“丁基”意味著包括正丁基、仲丁基、異丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和異丙基。亞烷基是烷基的子集，指與烷基相同、但具有兩個連接點的殘基。

如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，前述碳-碳雙鍵是通過從母體烷基的相鄰碳原子中除去一分子氫而獲得的。該基團可以處於雙鍵的順式或反式構型。典型的烯基基團包括但不限於：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些實施方式中，烯基基團具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10個、2至8個或2至6個碳原子。亞烯基是烯基的一個子集，指與烯基相同、但具有兩個連接點的殘基。

如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一個碳-碳三鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，前述碳-碳三鍵是通過從母體烷基的相鄰碳原子中除去兩分子氫而獲得的。典型的炔基基團包括但不限於：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些實施方式中，炔基具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10、2至8或2至6個碳原子。亞炔基是炔基的一個子集，指的是與炔基相同、但有兩個連接點的殘基。

如本文所使用的，“烷氧基”是指通過氧橋連接的指定數量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10個、1至8個、1至6個，或1至4個通過氧橋連接的碳原子。

如本文所使用的，“芳基”是指通過從環碳原子中除去氫原子而衍生自芳香族單環或多環烴環系統形成的基團。前述芳香族單環或多環烴環系統僅含有氫原子和6至18個碳原子，其中前述環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，包含根據Hückel理論的環狀、離域的(4n+2)π-電子體系。芳基包括但不限於苯基、芴基和萘基等基團。亞芳基是芳基的子集，指與芳基相同、但具有兩個連接點的殘基。

如本文所使用的，“鹵素取代基”或“鹵素”指氟代、氯代、溴代或碘代，術語“鹵素”包括氟、氯、溴或碘。

如本文所使用的，“鹵代烷基”是指指定數量的碳原子被一個或多個、直至最大允許數量的鹵素原子取代的如上述所定義的烷基。鹵代烷基的實例包括但不限於三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基或五氟乙基。

“雜環基”是指穩定的3-至18-員非芳香族環基，包含2-12個碳原子和1-6個雜原子，前述雜原子選自氮、氧或硫。除非說明書中另有說明，雜環基是單環、雙環、三環或四環系統，可包括稠環或橋環系統。雜環基中的雜原子可以任選地被氧化。一個或多個氮原子(如果存在的話)任選地被季銨化。雜環基是部分飽和或完全飽和的。雜環基可以通過任何環原子連接至分子的其餘部分。此類雜環基的實例包括但不限於：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫醯基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-氧雜呱嗪基、2-氧雜呱啶基、2-氧雜吡咯烷基、噁唑烷基、呱啶基、呱嗪基、4-呱啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎寧環基、噻唑烷基、四氫呋喃基、三硫醯基(trithianyl)、四氫吡喃基、硫代嗎啉基(thiomorpholinyl)、硫雜嗎啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫嗎啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫嗎啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。

“雜芳基”指由3-至18-員芳香環自由基衍生而成的基團，包含2個至17個碳原子和選自氮、氧和硫的1至6個雜原子。如本文所使用的，雜芳基可以是單環、雙環、三環或四環系統，其中環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，包含根據Hückel理論的環狀離域(4n+2)π-電子體系。雜芳基包括稠環或橋環系統。雜芳基中的雜原子被任選地氧化。一個或多個氮原子(如果存在的話)任選地被季銨化。雜芳基通過任何環原子連接至分子的其餘部分。雜芳基的實例包括但不限於：氮雜環庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b ][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并間二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、哢唑基、噌啉基(cinnolinyl)、環戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氫-5H-環戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氫苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氫苯并[h]噌啉基(5,6 dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氫-5H-苯并[6,7]環庚烷并[1,2-c]噠嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷并[d]噠嗪基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷并[d]吡啶基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、異吲哚基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、異喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、異噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氫喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧雜吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧雜環丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氫苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H -吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氫喹啉基、5,6,7,8-四氫喹唑啉基、5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氫-5H-環庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氫吡啶并[4,5-c]噠嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。

在本發明中可以使用各種羥基保護基團。一般來說，保護基團使化學官能度對特定的反應條件不敏感，並且可以在分子中的該官能團上添加以及去除，而不實質上損害分子的其餘部分。代表性的羥基保護基團公開於Beaucage等人，Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311，以及Greene and Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2, 2d ed，John Wiley & Sons，New York，1991中，以引用的方式將上述文獻各自整體併入本文。在一些實施方式中，保護基團在鹼性條件下穩定，但可以在酸性條件下脫除。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、單甲氧基三苯甲基、9-苯基氧雜蒽-9-基(Pixyl)或9-(對甲氧基苯基)氧雜蒽-9-基(Mox)。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)或TMTr(4,4',4''-三甲氧基三苯甲基)。

“受試者”一詞，如本文所使用的，指任何動物，例如哺乳動物或有袋動物。本發明的受試者包括但不限於人類、非人靈長類(例如，恆河猴或其他類型的獼猴)、小鼠、豬、馬、驢、牛、綿羊、大鼠或任何種類的家禽。

如本文所使用的，“治療”是指的是獲得有益的或期望的結果的方法，包括但不限於治療益處。“治療益處”意味著根除或改善被治療的潛在障礙。此外，治療益處通過根除或改善與潛在障礙相關的一個或多個生理症狀，從而在受試者中觀察到改善而獲得，儘管受試者可能仍然受到潛在障礙的折磨。

如本文所使用的，“預防”是指獲得有益或期望的結果的方法，包括但不限於預防性益處。為了獲得“預防性益處”，可將siRNA綴合物或藥物組合物給予有罹患特定疾病風險的受試者，或給予報告疾病的一種或多種生理症狀的受試者，即便可能該疾病的診斷尚未作出。

在一方面，本發明提供了六種能夠抑制PCSK9基因表達的siRNA。

本發明的siRNA含有核苷酸基團作為基本結構單元，所屬技術領域具有通常知識者習知，前述核苷酸基團含有磷酸基團、核糖基團和鹼基，在此不再贅述。

本發明的siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述正義鏈和反義鏈長度相同或不同，前述正義鏈的長度為19-23個核苷酸，反義鏈的長度為19-26個核苷酸。這樣，本發明提供的siRNA正義鏈和反義鏈的長度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些實施方式中，前述siRNA正義鏈和反義鏈的長度比為19/21、21/23或23/25。 [第一種siRNA]

按照本發明，前述siRNA可以是第一種siRNA。

前述第一種siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述第一種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，其中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- AAGCAAGCAGACAUUUAUZ₁ -3'(SEQ ID NO: 1)； 5'- Z₂ AUAAAUGUCUGCUUGCUU -3'(SEQ ID NO: 2)，其中，Z₁ 為C，Z₂ 為G，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁ 的核苷酸Z₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂ 的核苷酸Z₄ ，前述Z₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在上文與下文中，“位置對應”是指從核苷酸序列相同端起算，處於核苷酸序列中相同的位置。例如，核苷酸序列I的3'端第1個核苷酸是位置對應於SEQ ID NO:1的3'端第1個核苷酸的核苷酸。

在一些實施方式中，前述正義鏈僅包含核苷酸序列I，前述反義鏈僅包含核苷酸序列II。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₄ 位置處的差異，且Z₄ 選自A、U或C。在一些實施方式中，前述核苷酸差異為Z₄ 位置處的差異，Z₄ 選自A、U或C。在一些實施方式中，Z₃ 是與Z₄ 互補的核苷酸。具有上述核苷酸差異的siRNA具有較高的siRNA的靶mRNA抑制能力，而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；前述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個的鹼基錯配；前述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有鹼基錯配。

在一些實施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列： 5'- AAGCAAGCAGACAUUUAUZ₃ -3'(SEQ ID NO: 3)； 5'- Z₄ AUAAAUGUCUGCUUGCUU -3'(SEQ ID NO: 4)，其中，前述Z₄ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₃ 選自A、U、G或C，並且Z₄ 是與Z₃ 互補的核苷酸；在一些實施方式中，Z₃ 為C，Z₄ 為G。

在一些實施方式中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV長度各自為1-4個核苷酸；前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或者完全反向互補；前述核苷酸序列III連接在前述核苷酸序列I的5'末端，前述核苷酸序列IV連接在前述核苷酸序列II的3'末端。在一些實施方式中，前述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或者完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中與由SEQ ID NO: 1表示的核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與前述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為1個核苷酸，核苷酸序列III的鹼基為C，核苷酸序列IV的鹼基為G；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CCC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GGG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為ACCC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GGGU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21。

在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基，核苷酸序列IV的鹼基也就確定了。 [第二種siRNA]

按照本發明，前述siRNA可以是第二種siRNA。

前述第二種siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述第二種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，其中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- UUUGUAGCAUUUUUAUUAZ₅ -3' (SEQ ID NO: 61)； 5'- Z₆ UAAUAAAAAUGCUACAAA -3' (SEQ ID NO: 62)，其中，Z₅ 為A，Z₆ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₅ 的核苷酸Z₇ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₆ 的核苷酸Z₈ ，前述Z₈ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₈ 位置處的差異，且Z₈ 選自A、C或G。在一些實施方式中，前述核苷酸差異為Z₈ 位置處的差異，Z₈ 選自A、C或G。在一些實施方式中，Z₇ 是與Z₈ 互補的核苷酸。具有上述核苷酸差異的siRNA具有較高的siRNA的靶mRNA抑制能力，而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補。

在一些實施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO: 63所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO: 64所示的核苷酸序列： 5'- UUUGUAGCAUUUUUAUUAZ₇ -3' (SEQ ID NO: 63)； 5'- Z₈ UAAUAAAAAUGCUACAAA -3' (SEQ ID NO: 64)，其中，前述Z₈ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₇ 選自A、U、G或C，並且Z₈ 是與Z₇ 互補的核苷酸；在一些實施方式中，Z₇ 為A，Z₈ 為U。

在一些實施方式中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV長度各自為1-4個核苷酸；前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或者完全反向互補；前述核苷酸序列III連接在前述核苷酸序列I的5'末端，前述核苷酸序列IV連接在前述核苷酸序列II的3'末端，前述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或者完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中與由SEQ ID NO: 61表示的核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與前述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為1個核苷酸，核苷酸序列III的鹼基為U，核苷酸序列IV的鹼基為A；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GU，核苷酸序列IV的鹼基組成為AC；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GGU，核苷酸序列IV的鹼基組成為ACC；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GGGU，核苷酸序列IV的鹼基組成為ACCC；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GU，核苷酸序列IV的鹼基組成為AC；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21。

在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基，核苷酸序列IV的鹼基也就確定了。 [第三種siRNA]

按照本發明，前述siRNA可以是第三種siRNA。

前述第三種siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述第三種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，其中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 121所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GCCUGGAGUUUAUUCGGAZ₉ -3' (SEQ ID NO: 121)； 5'- Z₁₀ UCCGAAUAAACUCCAGGC -3' (SEQ ID NO: 122)，其中，Z₉ 為A，Z₁₀ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₉ 的核苷酸Z₁₁ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₀ 的核苷酸Z₁₂ ，前述Z₁₂ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 121所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₁₂ 位置處的差異，且Z₁₂ 選自A、C或G。在一些實施方式中，前述核苷酸差異為Z₁₂ 位置處的差異，Z₁₂ 選自A、C或G。在一些實施方式中，Z₁₁ 是與Z₁₂ 互補的核苷酸。具有上述核苷酸差異的siRNA具有較高的siRNA的靶mRNA抑制能力，而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO: 123所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO: 124所示的核苷酸序列： 5'- GCCUGGAGUUUAUUCGGAZ₁₁ -3' (SEQ ID NO: 123)； 5'- Z₁₂ UCCGAAUAAACUCCAGGC -3' (SEQ ID NO: 124)，其中，前述Z₁₂ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₁₁ 選自A、U、G或C，並且Z₁₂ 是與Z₁₁ 互補的核苷酸；在一些實施方式中，Z₁₁ 為A，Z₁₂ 為U。

在一些實施方式中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV長度各自為1-4個核苷酸；前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或者完全反向互補；前述核苷酸序列III連接在前述核苷酸序列I的5'末端，前述核苷酸序列IV連接在前述核苷酸序列II的3'末端，前述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或者完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中與由SEQ ID NO: 121表示的核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與前述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為1個核苷酸，核苷酸序列III的鹼基為G，核苷酸序列IV的鹼基為C；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UAG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CUA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AUAG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CUAU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21。

在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基，核苷酸序列IV的鹼基也就確定了。 [第四種siRNA]

按照本發明，前述siRNA可以是第四種siRNA。

前述第四種siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述第四種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，其中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 181所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CUGUUUUGCUUUUGUAACZ₁₃ -3' (SEQ ID NO: 181)； 5'- Z₁₄ GUUACAAAAGCAAAACAG -3' (SEQ ID NO: 182)，其中，Z₁₃ 為U，Z₁₄ 為A，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₃ 的核苷酸Z₁₅ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₄ 的核苷酸Z₁₆ ，前述Z₁₆ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 181所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₁₆ 位置處的差異，且Z₁₆ 選自U、C或G。在一些實施方式中，前述核苷酸差異為Z₁₆ 位置處的差異，Z₁₆ 選自U、C或G。在一些實施方式中，Z₁₅ 是與Z₁₆ 互補的核苷酸。具有上述核苷酸差異的siRNA具有較高的siRNA的靶mRNA抑制能力，而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO: 183所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO: 184所示的核苷酸序列： 5'- CUGUUUUGCUUUUGUAACZ₁₅ -3' (SEQ ID NO: 183)； 5'- Z₁₆ GUUACAAAAGCAAAACAG -3' (SEQ ID NO: 184)，其中，前述Z₁₆ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₁₅ 選自A、U、G或C，並且Z₁₆ 是與Z₁₅ 互補的核苷酸；在一些實施方式中，Z₁₅ 為U，Z₁₆ 為A。

在一些實施方式中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV長度各自為1-4個核苷酸；前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或者完全反向互補；前述核苷酸序列III連接在前述核苷酸序列I的5'末端，前述核苷酸序列IV連接在前述核苷酸序列II的3'末端，前述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或者完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中與由SEQ ID NO: 181表示的核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與前述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為1個核苷酸，核苷酸序列III的鹼基為C，核苷酸序列IV的鹼基為G；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GAC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GUC；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AGAC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GUCU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AC，核苷酸序列IV的鹼基組成為GU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21。

在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基，核苷酸序列IV的鹼基也就確定了。 [第五種siRNA]

按照本發明，前述siRNA可以是第五種siRNA。

前述第五種siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述第五種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，其中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 241所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GGUUUUGUAGCAUUUUUAZ₁₇ -3' (SEQ ID NO: 241)； 5'- Z₁₈ UAAAAAUGCUACAAAACC -3' (SEQ ID NO: 242)，其中，Z₁₇ 為U，Z₁₈ 為A，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₇ 的核苷酸Z₁₉ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₈ 的核苷酸Z₂₀ ，前述Z₂₀ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 241所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₀ 位置處的差異，且Z₂₀ 選自U、C或G。在一些實施方式中，前述核苷酸差異為Z₂₀ 位置處的差異，Z₂₀ 選自U、C或G。在一些實施方式中，Z₁₉ 是與Z₂₀ 互補的核苷酸。具有上述核苷酸差異的siRNA具有較高的siRNA的靶mRNA抑制能力，而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO: 243所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO: 244所示的核苷酸序列： 5'- GGUUUUGUAGCAUUUUUAZ₁₉ -3' (SEQ ID NO: 243)； 5'- Z₂₀ UAAAAAUGCUACAAAACC -3' (SEQ ID NO: 244)，其中，前述Z₂₀ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₁₉ 選自A、U、G或C，並且Z₂₀ 是與Z₁₉ 互補的核苷酸；在一些實施方式中，Z₁₉ 為U，Z₂₀ 為A。

在一些實施方式中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV長度各自為1-4個核苷酸；前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或者完全反向互補；前述核苷酸序列III連接在前述核苷酸序列I的5'末端，前述核苷酸序列IV連接在前述核苷酸序列II的3'末端，前述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或者完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中與由SEQ ID NO: 241表示的核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與前述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為1個核苷酸，核苷酸序列III的鹼基為G，核苷酸序列IV的鹼基為C；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CUG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CAG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UCUG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CAGA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21。

在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基，核苷酸序列IV的鹼基也就確定了。 [第六種siRNA]

按照本發明，前述siRNA可以是第六種siRNA。

前述第六種siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述第六種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，其中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 301所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GUGACUUUUUAAAAUAAAZ₂₁ -3' (SEQ ID NO: 301)； 5'- Z₂₂ UUUAUUUUAAAAAGUCAC -3' (SEQ ID NO: 302)，其中，Z₂₁ 為A，Z₂₂ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₂₁ 的核苷酸Z₂₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂₂ 的核苷酸Z₂₄ ，前述Z₂₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 301所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₄ 位置處的差異，且Z₂₄ 選自A、C或G。在一些實施方式中，前述核苷酸差異為Z₂₄ 位置處的差異，Z₂₄ 選自A、C或G。在一些實施方式中，Z₂₃ 是與Z₂₄ 互補的核苷酸。具有上述核苷酸差異的siRNA具有較高的siRNA的靶mRNA抑制能力，而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO: 303所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO: 304所示的核苷酸序列： 5'- GUGACUUUUUAAAAUAAAZ₂₃ -3' (SEQ ID NO: 303)； 5'- Z₂₄ UUUAUUUUAAAAAGUCAC -3' (SEQ ID NO: 304)，其中，前述Z₂₄ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₂₃ 選自A、U、G或C，並且Z₂₄ 是與Z₂₃ 互補的核苷酸；在一些實施方式中，Z₂₃ 為A，Z₂₄ 為U。

在一些實施方式中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV長度各自為1-4個核苷酸；前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或者完全反向互補；前述核苷酸序列III連接在前述核苷酸序列I的5'末端，前述核苷酸序列IV連接在前述核苷酸序列II的3'末端，前述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或者完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中與由SEQ ID NO: 301表示的核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與前述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為1個核苷酸，核苷酸序列III的鹼基為G，核苷酸序列IV的鹼基為C；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AUG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CAU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UAUG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CAUA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。在一些實施方式中，前述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG，核苷酸序列IV的鹼基組成為CA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21。

在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基，核苷酸序列IV的鹼基也就確定了。

siRNA的懸垂末端和修飾

以下，對核苷酸序列V、核酸序列、siRNA中的核苷酸修飾以及修飾序列的描述適用於上述第一種siRNA至第六種siRNA中的任意一種。即如果沒有特指，下面對siRNA的描述應視為是對第一種siRNA、第二種siRNA、第三種siRNA、第四種siRNA、第五種siRNA和第六種siRNA逐一進行了描述。例如，如不特別指明具體的siRNA，“前述siRNA還含有核苷酸序列V”的意思是“第一種siRNA、第二種siRNA、第三種siRNA、第四種siRNA、第五種siRNA或第六種siRNA還含有核苷酸序列V”。

在一些實施方式中，前述正義鏈和反義鏈長度不同，前述反義鏈還含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的長度為1至3個核苷酸，連接在前述反義鏈的3'末端，構成反義鏈的3' 突出端。由此，本發明提供的siRNA正義鏈和反義鏈的長度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。在一些實施方式中，前述核苷酸序列V的長度為2個核苷酸，由此，本發明提供的siRNA正義鏈和反義鏈的長度比可以是19/21、21/23或23/25。

前述核苷酸序列V中的每一個核苷酸可以是任意的核苷酸，為了便於合成並節約合成成本，前述核苷酸序列V為連續的2個胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸(dTdT)或連續的2個脲嘧啶核糖核苷酸(UU)；或者，為了提高siRNA反義鏈與靶mRNA的親和力，核苷酸序列V與靶mRNA的相應位置的核苷酸互補。因此，在一些實施方式中，本發明的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度之比為19/21或21/23，此時，本發明的siRNA具有更好的mRNA沉默活性。

靶mRNA的相應位置的核苷酸是指與靶mRNA的第三段核苷酸序列在5'末端相鄰的核苷酸或核苷酸序列，該第三段核苷酸序列是與核苷酸序列II實質上反向互補或完全反向互補，或者與核苷酸序列II和核苷酸序列IV構成的核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補的那段核苷酸序列。

在一些實施方式中，對於前述第一種siRNA，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列： 5'- AAGCAAGCAGACAUUUAUZ₃ -3'(SEQ ID NO: 5)； 5'- Z₄ AUAAAUGUCUGCUUGCUUGG -3'(SEQ ID NO: 6)；或者，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列： 5'- CCAAGCAAGCAGACAUUUAUZ₃ -3'(SEQ ID NO: 7)； 5'- Z₄ AUAAAUGUCUGCUUGCUUGGGU -3'(SEQ ID NO: 8)；其中，前述Z₄ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₃ 選自A、U、G或C，並且Z₄ 是與Z₃ 互補的核苷酸。

在一些實施方式中，對於前述第二種siRNA，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 66所示的核苷酸序列： 5'- UUUGUAGCAUUUUUAUUAZ₇ -3' (SEQ ID NO: 65)； 5'- Z₈ UAAUAAAAAUGCUACAAAAC -3' (SEQ ID NO: 66)，或者，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 67所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 68所示的核苷酸序列： 5'- GUUUUGUAGCAUUUUUAUUAZ₇ -3' (SEQ ID NO: 67)； 5'- Z₈ UAAUAAAAAUGCUACAAAACCC -3' (SEQ ID NO: 68)，其中，前述Z₈ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₇ 選自A、U、G或C，並且Z₈ 是與Z₇ 互補的核苷酸。

在一些實施方式中，對於前述第三種siRNA，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 125所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 126所示的核苷酸序列： 5'- GCCUGGAGUUUAUUCGGAZ₁₁ -3' (SEQ ID NO: 125)； 5'-Z₁₂ UCCGAAUAAACUCCAGGCCU -3' (SEQ ID NO: 126)，或者，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 127所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 128所示的核苷酸序列： 5'- AGGCCUGGAGUUUAUUCGGAZ₁₁ -3' (SEQ ID NO: 127)； 5'-Z₁₂ UCCGAAUAAACUCCAGGCCUAU -3' (SEQ ID NO: 128)，其中，前述Z₁₂ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₁₁ 選自A、U、G或C，並且Z₁₂ 是與Z₁₁ 互補的核苷酸。

在一些實施方式中，對於前述第四種siRNA，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 185所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 186所示的核苷酸序列： 5'- CUGUUUUGCUUUUGUAACZ₁₅ -3' (SEQ ID NO: 185)； 5'-Z₁₆ GUUACAAAAGCAAAACAGGU -3' (SEQ ID NO: 186)，或者，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 187所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 188所示的核苷酸序列： 5'- ACCUGUUUUGCUUUUGUAACZ₁₅ -3' (SEQ ID NO: 187)； 5'-Z₁₆ GUUACAAAAGCAAAACAGGUCU -3' (SEQ ID NO: 188)，其中，前述Z₁₆ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₁₅ 選自A、U、G或C，並且Z₁₆ 是與Z₁₅ 互補的核苷酸。

在一些實施方式中，對於前述第五種siRNA，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 245所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 246所示的核苷酸序列： 5'- GGUUUUGUAGCAUUUUUAZ₁₉ -3' (SEQ ID NO: 245)； 5'- Z₂₀ UAAAAAUGCUACAAAACCCA -3' (SEQ ID NO: 246)，或者，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 247所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 248所示的核苷酸序列： 5'- UGGGUUUUGUAGCAUUUUUAZ₁₉ -3' (SEQ ID NO: 247)； 5'-Z₂₀ UAAAAAUGCUACAAAACCCAGA -3' (SEQ ID NO: 248)，其中，前述Z₂₀ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₁₉ 選自A、U、G或C，並且Z₂₀ 是與Z₁₉ 互補的核苷酸。

在一些實施方式中，對於前述第六種siRNA，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 305所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 306所示的核苷酸序列： 5'- GUGACUUUUUAAAAUAAAZ₂₃ -3' (SEQ ID NO: 305)； 5'- Z₂₄ UUUAUUUUAAAAAGUCACCA -3' (SEQ ID NO: 306)，或者，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 307所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 308所示的核苷酸序列： 5'- UGGUGACUUUUUAAAAUAAAZ₂₃ -3' (SEQ ID NO: 307)； 5'- Z₂₄ UUUAUUUUAAAAAGUCACCAUA -3' (SEQ ID NO: 308)，其中，前述Z₂₄ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₂₃ 選自A、U、G或C，並且Z₂₄ 是與Z₂₃ 互補的核苷酸。

在一些實施方式中，本發明前述siRNA為表1a-1f中列出的siPCSKa1、siPCSKa2、siPCSKb1、siPCSKb2、siPCSKc1、siPCSKc2、siPCSKd1、siPCSKd2、siPCSKe1、siPCSKe2、siPCSKf1或siPCSKf2。

如前前述，本發明的siRNA中的核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸。在一些實施方式中，本發明的siRNA中的核苷酸為未經修飾的核苷酸；在一些實施方式中，本發明的siRNA中的部分或全部核苷酸為修飾的核苷酸，核苷酸基團上的這些修飾不會導致本發明的siRNA抑制PCSK9基因表達的功能明顯削弱或喪失。

在一些實施方式中，本發明的siRNA至少含有1個修飾的核苷酸。在本發明的上下文中，所使用的術語“修飾的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羥基被其他基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物，或者具有經修飾的鹼基的核苷酸。前述修飾的核苷酸不會導致siRNA抑制基因表達的功能明顯削弱或喪失。例如，可以選擇J.K. Watts, G.F. Deleavey, and M.J. Damha, Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008, 13(19-20): 842-55中公開的修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA的正義鏈或前述反義鏈中的至少一個核苷酸為修飾的核苷酸，和/或至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基；換句話說，前述正義鏈和前述反義鏈中至少一條單鏈的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分為具有修飾基團的磷酸酯基和/或具有修飾基團的核糖基。

在一些實施方式中，前述正義鏈和/或前述反義鏈中的全部核苷酸均為修飾的核苷酸。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA的正義鏈和前述反義鏈中的每一個核苷酸獨立地為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸。

本發明的發明人驚奇地發現，本發明前述的siRNA在動物實驗中獲得了血漿中穩定性和基因沉默效率的高度平衡。

在一些實施方式中，前述氟代修飾的核苷酸位於核苷酸序列I和核苷酸序列II中，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述核苷酸序列I中至少第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，前述核苷酸序列II中至少第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，前述氟代修飾的核苷酸位於核苷酸序列I和核苷酸序列II中，前述核苷酸序列I中氟代修飾的核苷酸不多於5個，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸；前述核苷酸序列II中氟代修飾的核苷酸不多於7個，並且，前述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，在前述正義鏈中，前述核苷酸序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述正義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在前述反義鏈中，前述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述反義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸。

在本發明的上下文中，“氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的結構。“非氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸、或核苷酸類似物。在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸獨立地選自核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物中的一種。

這些核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸是所屬技術領域具有通常知識者所習知的，這些核苷酸可以選自2'-烷氧基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-經取代的氨基修飾的核苷酸、2'-去氧核苷酸中的一種。

在一些實施方式中，2'-烷氧基修飾的核苷酸為2'-甲氧基(2'-OMe)修飾的核苷酸，如式(8)所示。在一些實施方式中，2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修飾的核苷酸，如式(9)所示。在一些實施方式中，2'-氨基(2'-NH₂ )修飾的核苷酸如式(10)所示。在一些實施方式中，2'-去氧核苷酸(DNA)如式(11)所示：

、

、

、

、

式(7) 式(8) 式(9) 式(10) 式(11)

核苷酸類似物指能夠在核酸中代替核苷酸，但結構不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、脲嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸的基團。在一些實施方式中，核苷酸類似物可以是異核苷酸、橋聯的核苷酸或無環核苷酸。

橋聯的核苷酸(bridged nucleic acid，簡稱BNA)是指受約束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五員環、六員環、或七員環的具有“固定的”C3'-內切糖縮攏的橋聯結構。通常將該橋摻入到該核糖的2'-、4'-位處以提供一個2', 4'-BNA核苷酸。在一些實施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：

、

、

式(12) 式(13) 式(14)

無環核苷酸是核苷酸的糖環被打開形成的一類核苷酸。在一些實施方式中，無環核苷酸可以是解鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：

、

式(15) 式(16) 上述式(15)和式(16)中，R選自H、OH或烷氧基(O-烷基)。

異核苷酸是指核苷酸中鹼基在核糖環上的位置發生改變而形成的化合物。在一些實施方式中，異核苷酸可以是鹼基從核糖環的1'-位移動至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示。

式(17) 式(18)

上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示鹼基，例如A、U、G、C或T；R選自H、OH、F或者如上前述的非氟基團。

在一些實施方式中，核苷酸類似物選自異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一種。在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸，在上文和下文中，前述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在上文及下文中，“氟代修飾的核苷酸”、“2'-氟修飾的核苷酸”、“核糖基團的2'-羥基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸的2'-羥基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示結構的化合物；“甲氧基修飾的核苷酸”、“2'-甲氧基修飾的核苷酸”、“核糖基團的2'-羥基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸核糖基團的2'-羥基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示結構的化合物。

在一些實施方式中，本發明的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在前述正義鏈中，前述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；在前述反義鏈中，前述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，本發明的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的正義鏈中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的正義鏈的其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的反義鏈中核苷酸序列II的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的反義鏈其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；或者，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的正義鏈中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的正義鏈的其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的反義鏈中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的反義鏈其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；或者，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的正義鏈中核苷酸序列I的第7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的正義鏈的其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的反義鏈中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的反義鏈其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA為表1a-1f中列出的siPCSKa1-M1、siPCSKa1-M2、siPCSKa1-M3、siPCSKa2-M1、siPCSKa2-M2、siPCSKa2-M3、siPCSKb1-M1、siPCSKb1-M2、siPCSKb1-M3、siPCSKb2-M1、siPCSKb2-M2、siPCSKb2-M3、siPCSKc1-M1、siPCSKc1-M2、siPCSKc1-M3、siPCSKc2-M1、siPCSKc2-M2、siPCSKc2-M3、siPCSKd1-M1、siPCSKd1-M2、siPCSKd1-M3、siPCSKd2-M1、siPCSKd2-M2、siPCSKd2-M3、siPCSKe1-M1、siPCSKe1-M2、siPCSKe1-M3、siPCSKe2-M1、siPCSKe2-M2、siPCSKe2-M3、siPCSKf1-M1、siPCSKf1-M2、siPCSKf1-M3、siPCSKf2-M1、siPCSKf2-M2或siPCSKf2-M3中的任意一種。

具有上述修飾的siRNA不僅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的穩定性，使核酸具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。同時，上述修飾的siRNA還具有較高的抑制靶mRNA的活性。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA的正義鏈和反義鏈中至少一條單鏈的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分為具有修飾基團的磷酸酯基。在一些實施方式中，具有修飾基團的磷酸酯基為磷酸酯基中的磷酸二酯鍵中的至少一個氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些實施方式中，前述具有修飾基團的磷酸酯基為具有如式(1)所示結構的硫代磷酸酯基：

式(1)。這種修飾能穩定siRNA的雙鏈結構，保持鹼基配對的高特異性和高親和力。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA中，硫代磷酸酯基連接存在於由以下位置組成的組中的至少一處：正義鏈或反義鏈任意一端的第一個和第二個核苷酸之間；正義鏈或反義鏈任意一端的第二個和第三個核苷酸之間；或上述的任意組合。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於除正義鏈5'末端以外的全部上述位置處。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於除正義鏈3'末端以外的全部上述位置處。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於以下位置中的至少一處：前述正義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述正義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述正義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述正義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述反義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述反義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述反義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及前述反義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA為表1a-1f中列出的siPCSKa1-M1S、siPCSKa1-M2S、siPCSKa1-M3S、siPCSKa2-M1S、siPCSKa2-M2S、siPCSKa2-M3S、siPCSKb1-M1S、siPCSKb1-M2S、siPCSKb1-M3S、siPCSKb2-M1S、siPCSKb2-M2S、siPCSKb2-M3S、siPCSKc1-M1S、siPCSKc1-M2S、siPCSKc1-M3S、siPCSKc2-M1S、siPCSKc2-M2S、siPCSKc2-M3S、siPCSKd1-M1S、siPCSKd1-M2S、siPCSKd1-M3S、siPCSKd2-M1S、siPCSKd2-M2S、siPCSKd2-M3S、siPCSKe1-M1S、siPCSKe1-M2S、siPCSKe1-M3S、siPCSKe2-M1S、siPCSKe2-M2S、siPCSKe2-M3S、siPCSKf1-M1S、siPCSKf1-M2S、siPCSKf1-M3S、siPCSKf2-M1S、siPCSKf2-M2S或siPCSKf2-M3S中的任意一種。

在一些實施方式中，前述siRNA反義鏈的5'末端核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸。

常用的前述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸是所屬技術領域具有通常知識者所習知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下結構：

式(2)；再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48中公開了如下4種5'-磷酸類似物修飾的核苷酸：

式(3) 式(4) 式(5) 式(6) 其中，R選自H、OH、甲氧基、氟；Base表示鹼基，選自A、U、C、G或T。

在一些實施方式中，5'-磷酸核苷酸為式(2)所示的含有5'-磷酸的核苷酸，5'-磷酸類似物修飾的核苷酸為含有乙烯基磷酸酯(5'-(E )-vinylphosphonate，E -VP)修飾的核苷酸，如式(3)所示，或者為硫代磷酸酯修飾的核苷酸，如式(5)所示。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA為表1a-1f中列出的siPCSKa1-M1P1、siPCSKa1-M2P1、siPCSKa1-M3P1、siPCSKa2-M1P1、siPCSKa2-M2P1、siPCSKa2-M3P1、siPCSKb1-M1P1、siPCSKb1-M2P1、siPCSKb1-M3P1、siPCSKb2-M1P1、siPCSKb2-M2P1、siPCSKb2-M3P1、siPCSKc1-M1P1、siPCSKc1-M2P1、siPCSKc1-M3P1、siPCSKc2-M1P1、siPCSKc2-M2P1、siPCSKc2-M3P1、siPCSKd1-M1P1、siPCSKd1-M2P1、siPCSKd1-M3P1、siPCSKd2-M1P1、siPCSKd2-M2P1、siPCSKd2-M3P1、siPCSKe1-M1P1、siPCSKe1-M2P1、siPCSKe1-M3P1、siPCSKe2-M1P1、siPCSKe2-M2P1、siPCSKe2-M3P1、siPCSKf1-M1P1、siPCSKf1-M2P1、siPCSKf1-M3P1、siPCSKf2-M1P1、siPCSKf2-M2P1、siPCSKf2-M3P1、siPCSKa1-M1SP1、siPCSKa1-M2SP1、siPCSKa1-M3SP1、siPCSKa2-M1SP1、siPCSKa2-M2SP1、siPCSKa2-M3SP1、siPCSKb1-M1SP1、siPCSKb1-M2SP1、siPCSKb1-M3SP1、siPCSKb2-M1SP1、siPCSKb2-M2SP1、siPCSKb2-M3SP1、siPCSKc1-M1SP1、siPCSKc1-M2SP1、siPCSKc1-M3SP1、siPCSKc2-M1SP1、siPCSKc2-M2SP1、siPCSKc2-M3SP1、siPCSKd1-M1SP1、siPCSKd1-M2SP1、siPCSKd1-M3SP1、siPCSKd2-M1SP1、siPCSKd2-M2SP1、siPCSKd2-M3SP1、siPCSKe1-M1SP1、siPCSKe1-M2SP1、siPCSKe1-M3SP1、siPCSKe2-M1SP1、siPCSKe2-M2SP1、siPCSKe2-M3SP1、siPCSKf1-M1SP1、siPCSKf1-M2SP1、siPCSKf1-M3SP1、siPCSKf2-M1SP1、siPCSKf2-M2SP1、siPCSKf2-M3SP1中的任意一種。 [第七種siRNA]

按照本發明，前述siRNA可以是第七種siRNA。

前述第七種siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述第七種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，其中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 399所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 400所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- AGACCUGUUUUGCUUUUGZ₂₅ -3' (SEQ ID NO: 399)； 5'- Z₂₆ CAAAAGCAAAACAGGUCU-3' (SEQ ID NO: 400)，其中，Z₂₅ 為U，Z₂₆ 為A，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₂₅ 的核苷酸Z₂₇ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂₆ 的核苷酸Z₂₈ ，前述Z₂₈ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 399所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 400所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 400所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₈ 位置處的差異，且Z₂₈ 選自G、U或C。在一些實施方式中，前述核苷酸差異為Z₂₈ 位置處的差異，Z₂₈ 選自G、U或C。在一些實施方式中，Z₂₇ 是與Z₂₈ 互補的核苷酸。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 399所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括從核苷酸序列I的5'端起算的第9個核苷酸Z的差異，且Z為dT。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 399所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₇ 位置處的差異，且Z₂₇ 選自A、G或C。

在一些實施方式中，前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 399所示的核苷酸序列之間具有2個核苷酸差異，且前述核苷酸序列I與前述核苷酸序列II完全反向互補，其中前述2個核苷酸差異是Z和Z₂₇ 位置處的差異，且Z為dT，Z₂₇ 選自A、G或C。

具有上述核苷酸差異的siRNA具有較高的siRNA的靶mRNA抑制能力，而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO: 401所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO: 402所示的核苷酸序列： 5'- AGACCUGUdTUUGCUUUUGZ₂₇ -3'(SEQ ID NO: 401)； 5'-Z₂₈ CAAAAGCAAAACAGGUCU-3'(SEQ ID NO: 402)，其中，dT為胸腺嘧啶去氧核苷酸，前述Z₂₈ 是反義鏈5'末端的第一個核苷酸，Z₂₇ 選自A、U、G或C，並且Z₂₈ 是與Z₂₇ 互補的核苷酸；在一些實施方式中，Z₂₇ 為U，Z₂₈ 為A。

在一些實施方式中，對於前述第七種siRNA，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 403所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 404所示的核苷酸序列： 5'- AGACCUGUdTUUGCUUUUGZ₂₇ -3'(SEQ ID NO: 403)； 5'- Z₂₈ CAAAAGCAAAACAGGUCUAG -3'(SEQ ID NO: 404)；或者，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 405所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 406所示的核苷酸序列： 5'- CUAGACCUGUdTUUGCUUUUGZ₂₇ -3'(SEQ ID NO: 405)； 5'- Z₂₈ CAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA -3'(SEQ ID NO: 406)；在一些實施方式中，本發明前述siRNA為表1g中列出的siPCSKg3或siPCSKg4。

在一些實施方式中，上述Z和/或Z₂₇ 位置處有核苷酸差異的siRNA中，至少部分核苷酸為修飾的核苷酸，前述修飾的核苷酸為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸，前述氟代修飾的核苷酸位於核苷酸序列I和核苷酸序列II中，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述核苷酸序列II中至少第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，本發明提供的siRNA為表1g中列出的siPCSKg3-M4、siPCSKg4-M5、siPCSKg3-M4S、siPCSKg4-M5S、siPCSKg3-M4P1、siPCSKg4-M5P1、siPCSKg3-M4SP1或siPCSKg4-M5SP1中的任意一種。

本發明的發明人意外發現，本發明提供的siRNA不僅具有顯著增強的血漿和溶酶體穩定性，還具有較高的靶mRNA抑制活性。

本發明提供的siRNA可以通過本領域常規的siRNA製備方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已經有商業化訂製服務。可以通過使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本發明前述的siRNA中，製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。 [藥物組合物]

本發明提供了一種藥物組合物，前述藥物組合物含有如上前述的siRNA作為活性成分和藥學上可接受的載體。

前述藥學上可接受的載體可以是siRNA給藥領域常規使用的載體，例如但不限於磁性奈米粒(magnetic nanoparticles，如基於Fe₃ O₄ 或Fe₂ O₃ 的奈米粒)、碳奈米管(carbon nanotubes)、介孔矽(mesoporous silicon)、磷酸鈣奈米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、聚醯胺型樹形高分子(polyamidoamine (PAMAM) dendrimer)、聚賴氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、殼聚糖(chitosan)、1,2-二油醯基-3-三甲銨丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羥基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撐磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它們的衍生物中的一種或多種。

前述藥物組合物中，對siRNA和藥學上可接受的載體的含量沒有特別要求，可以是各組分常規的含量。在一些實施方式中，siRNA與藥學上可接受的載體的重量比可以為1 : (1-500)，在一些的實施方式中，上述重量比為1 : (1-50)。

在一些實施方式中，前述藥物組合物中，還可以包含藥學上可接受的其它輔料，該輔料可以為本領域常規採用的各種製劑或化合物的一種或多種。例如，前述藥學上可接受的其它輔料可以包括pH緩衝液、保護劑和滲透壓調節劑中的至少一種。

前述pH緩衝液可以為pH值7.5-8.5的三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽緩衝液和/或pH值5.5-8.5的磷酸鹽緩衝液，例如可以為pH值5.5-8.5的磷酸鹽緩衝液。

前述保護劑可以為肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一種。以前述藥物組合物的總重量為基準，前述保護劑的含量可以為0.01-30重量%。

前述滲透壓調節劑可以為氯化鈉和/或氯化鉀。前述滲透壓調節劑的含量使前述藥物組合物的滲透壓為200-700毫滲莫耳/千克(mOsm/kg)。根據所需滲透壓，所屬技術領域具有通常知識者可以容易地確定前述滲透壓調節劑的含量。

在一些實施方式中，前述藥物組合物可以為液體製劑，例如注射液；也可以為凍乾粉針劑，實施給藥時與液體輔料混合，配製成液體製劑。前述液體製劑可以但不限於用於皮下、肌肉或靜脈注射給藥，也可以但不限於通過噴霧給藥到肺臟、或通過噴霧經肺臟給藥到其它臟器組織(如肝臟)。在一些實施方式中，前述藥物組合物用於靜脈注射給藥。

在一些實施方式中，前述藥物組合物可以為脂質體製劑的形式。在一些實施方式中，前述脂質體製劑中使用的藥學上可接受的載體包含含胺的轉染化合物(下文也可將其稱為有機胺)、輔助脂質和/或聚乙二醇化脂質。其中，前述有機胺、輔助脂質和聚乙二醇化脂質可分別選自於CN103380113A(通過引用的方式將其整體併入本文)中所描述的含胺的轉染化合物或其藥學上可接受的鹽或衍生物、輔助脂質和聚乙二醇化脂質中的一種或多種。

在一些實施方式中，前述有機胺可為CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽：

式(201)，其中：每個X₁₀₁ 或X₁₀₂ 各自獨立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氫或C1-C20烴鏈；每個Y₁₀₁ 或Z₁₀₁ 各自獨立地是C=O、C=S、S=O、CH-OH或SO₂ ；每個R₁₀₁ 、R₁₀₂ 、R₁₀₃ 、R₁₀₄ 、R₁₀₅ 、R₁₀₆ 或R₁₀₇ 各自獨立地是氫，環狀或無環的、被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈脂族基團，環狀或無環的、被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈雜脂族基團，被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈醯基，被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈芳基，被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈雜芳基； x是1-10的整數； n是1-3的整數，m是0-20的整數，p是0或1；其中，如果m=p=0，則R₁₀₂ 是氫；並且，如果n或m中的至少一個是2，那麼R₁₀₃ 和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的結構：

，

式(202) 式(203)；其中，g、e或f各自獨立地是1-6的整數，“HCC”代表烴鏈，且每個*N代表式(201)中的氮原子。

在一些實施方式中，R₁₀₃ 是多胺。在其它實施方式中，R₁₀₃ 是縮酮。在一些實施方式中，在式(201)中的R₁₀₁ 和R₁₀₂ 中的每一個獨立地是任意的被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈烷基或烯基，前述烷基或烯基具有3至約20個碳原子，諸如8至約18個碳原子，和0至4個雙鍵，諸如0至2個雙鍵。

在一些實施方式中，如果n和m中的每一個獨立地具有1或3的值，那麼R₁₀₃ 可以是下述式(204)-式(213)中的任一個：

式(204)，

式(205)，

式(206)，

式(207)，

式(208)，

式(209)，

式(210)，

式(211)，

式(212)和

式(213)；其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自獨立地是1-6的整數，每個“HCC”代表烴鏈，且每個*顯示R₁₀₃ 與在式(201)中的氮原子的可能連接點，其中在任意*位置上的每個H可以被替換以實現與在式(201)中的氮原子的連接。

其中，式(201)所示化合物可以根據CN103380113A中的描述製備。

在一些實施方式中，前述有機胺為如式(214)所示的有機胺和/或如式(215)所示的有機胺：

式(214)，

式(215)；前述輔助脂質為膽固醇、膽固醇的類似物和/或膽固醇的衍生物；前述聚乙二醇化脂質為1,2-二棕櫚醯胺-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。

在一些實施方式中，前述藥物組合物中，前述有機胺、前述輔助脂質和前述聚乙二醇化脂質三者之間的莫耳比為(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)，例如可以為(50-70)：(20-40)：(3-20)。

在一些實施方式中，由本發明的siRNA與上述含胺的轉染試劑形成的藥物組合物顆粒具有約30nm至約200nm的平均直徑，通常為約40nm至約135nm，更通常地，該脂質體顆粒的平均直徑是約50nm至約120nm、約50nm至約100nm、約60nm至約90nm或約70nm至約90nm，例如，該脂質體顆粒的平均直徑是約30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。

在一些實施方式中，由本發明的siRNA與上述含胺的轉染試劑形成的藥物組合物中，siRNA與全部脂質(例如有機胺、輔助脂質和/或聚乙二醇化脂質)的重量比(重量/重量比)在從約1:1至約1:50、從約1:1至約1:30、從約1:3至約1:20、從約1:4至約1:18、從約1:5至約1:17、從約1:5至約1:15、從約1:5至約1:12、從約1:6至約1:12或從約1:6至約1:10的範圍內，例如，本發明的siRNA與全部脂質的重量比為約1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。

在一些實施方式中，前述藥物組合物在銷售時各組分可以獨立存在，在使用時可以液體製劑的形式存在。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA與上述藥學上可接受的載體形成的藥物組合物可以按照已知的各種方法製備，只是用本發明提供的siRNA替代現有siRNA即可；在一些實施方式中，可以按照如下方法製備：

將有機胺、輔助脂質和聚乙二醇化脂質按照上述莫耳比懸浮於醇中並混勻得到脂質溶液；醇的用量使得到的脂質溶液的總品質濃度為2-25mg/mL，例如可以為8-18mg/mL。前述醇選自藥學上可接受的醇，諸如在室溫附近為液體的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400中的一種或多種，例如可以為乙醇。

將本發明提供的siRNA溶解於緩衝鹽溶液中，得到siRNA水溶液。緩衝鹽溶液的濃度為0.05-0.5M，例如可以為0.1-0.2M，調節緩衝鹽溶液的pH至4.0-5.5，例如可以為5.0-5.2，緩衝鹽溶液的用量使siRNA的濃度不超過0.6mg/mL，例如可以為0.2-0.4mg/mL。前述緩衝鹽選自可溶性醋酸鹽、可溶性檸檬酸鹽中的一種或多種，例如可以為醋酸鈉和/或醋酸鉀。

將脂質溶液和siRNA水溶液混合，將混合後得到的產物在40-60℃培養至少2分鐘，例如可以為5-30分鐘，得到培養後的脂質體製劑。脂質溶液和siRNA水溶液的體積比為1：(2-5)。

將培養後的脂質體製劑濃縮或稀釋，去除雜質，除菌，得到本發明提供的藥物組合物，其理化參數為pH值為6.5-8，包覆率不低於80%，粒徑為40-200nm，多分散指數不高於0.30，滲透壓為250-400mOsm/kg；例如理化參數可以為pH值為7.2-7.6，包覆率不低於90%，粒徑為60-100nm，多分散指數不高於0.20，滲透壓為300-400mOsm/kg。

其中，濃縮或稀釋可以在去除雜質之前、之後或同時進行。去除雜質的方法可以採用現有各種方法，例如可以使用切相流系統、中空纖維柱，在100K Da條件下超濾，超濾交換溶液為pH7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)。除菌的方法可以採用現有各種方法，例如可以在0.22μm濾器上過濾除菌。 [siRNA綴合物]

本發明提供了一種siRNA綴合物，前述siRNA綴合物含有上述siRNA以及綴合連接至該siRNA的綴合基團。

一般來說，前述綴合基團包含藥學上可接受的至少一個靶向基團和任選的接頭(linker)，並且，前述siRNA、前述接頭和前述靶向基團依次連接。在一些實施方式中，前述靶向基團為1-6個。在一些實施方式中，前述靶向基團為2-4個。前述siRNA分子可以非共價或共價綴合至前述綴合基團，例如可以共價綴合至前述綴合基團。siRNA與綴合基團的綴合位點可以在siRNA正義鏈的3'端或5'端，也可在反義鏈的5'端，還可以在siRNA的內部序列中。在一些實施方式中，前述siRNA與綴合基團的綴合位點在siRNA正義鏈的3'末端。

在一些實施方式中，前述綴合基團可以連接在核苷酸的磷酸基團、2'-位羥基或者鹼基上。在一些實施方式中，前述綴合基團還可以連接在3'-位羥基上，此時核苷酸之間採用2'-5'磷酸二酯鍵連接。當綴合基團連接在siRNA鏈的末端時，前述綴合基團通常連接在核苷酸的磷酸基團上；當綴合基團連接在siRNA的內部序列時，前述綴合基團通常連接在核糖糖環或者鹼基上。各種連接方式可以參考文獻：Muthiah Manoharanet.al . siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes. ACS Chemical biology, 2015, 10 (5): 1181-7.

在一些實施方式中，前述siRNA與綴合基團間可以通過酸不穩定的、或可還原的化學鍵相連，在細胞內涵體的酸性環境下，這些化學鍵可降解，從而使siRNA成為自由狀態。對於不可降解的綴合方式，綴合基團可連接在siRNA的正義鏈，從而儘量降低綴合對siRNA活性的影響。

在一些實施方式中，前述藥學上可接受的靶向基團可以是siRNA給藥領域常規使用的配體，例如WO2009082607A2中描述的各種配體，以引用的方式將其全部公開內容併入本文。

在一些實施方式中，前述藥學上可接受的靶向基團可以選自以下靶向分子或其衍生物形成的配體中的一種或多種：親脂分子，例如膽固醇、膽汁酸、維生素(例如維生素E)、不同鏈長的脂質分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；適配體；抗體；量子點；糖類，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)；葉酸(folate)；肝實質細胞表達的受體配體，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖殘基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神經遞質(如腎上腺素)、生長因數、轉鐵蛋白等。

在一些實施方式中，前述的每個配體獨立地選自一個能夠與細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與肝細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與哺乳動物細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與人肝細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與肝表面去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結合的配體。這些配體的種類為所屬技術領域具有通常知識者所習知，其作用一般是與靶細胞表面的特異性受體相結合，介導與配體連接的siRNA遞送至靶細胞。

在一些實施方式中，前述藥學上可接受的靶向基團可以是與哺乳動物肝細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結合的任意一種配體。在一些實施方式中，每個配體獨立地為去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清類黏蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)或去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin，ASF)。在一些實施方式中，前述配體為糖或糖的衍生物。

在一些實施方式中，至少一個配體是糖。在一些實施方式中，每個配體均是糖。在一些實施方式中，至少一個配體是單糖、多糖、修飾的單糖、修飾的多糖或糖衍生物。在一些實施方式中，至少一個前述配體可以是單糖、雙糖或三糖。在一些實施方式中，至少有一個配體是修飾的糖。在一些實施方式中，每一個配體均為修飾的糖。在一些實施方式中，每個配體均獨立地選自多糖、修飾的多糖、單糖、修飾的單糖、多糖衍生物或單糖衍生物。在一些實施方式中，每一個或至少一個配體選自於由以下糖所組成的組：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麥芽糖及其衍生物，阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物和唾液酸。

在一些實施方式中，每個前述配體可獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺、N-三氟乙醯半乳糖胺、N-丙醯半乳糖胺、N-正丁醯半乳糖胺、N-異丁醯半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-去氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二去氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-去氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-去氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。前述配體的其它選擇可參見例如CN105378082A的記載，以引用的方式將其全部公開內容併入本文。

在一些實施方式中，前述siRNA綴合物中藥學上可接受的靶向基團可以是半乳糖或N-乙醯半乳糖胺，其中，半乳糖或N-乙醯半乳糖胺分子可以是一價、二價、三價、四價。應當理解的是，這裡記載之一價、二價、三價、四價分別指siRNA分子與含有作為靶向基團的半乳糖或N-乙醯半乳糖胺分子的綴合基團形成siRNA綴合物後，該siRNA綴合物中siRNA分子與半乳糖或N-乙醯半乳糖胺分子的莫耳比為1:1、1:2、1:3或1:4。在一些實施方式中，前述藥學上可接受的靶向基團是N-乙醯半乳糖胺。在一些實施方式中，當本發明記載之siRNA與含有N-乙醯半乳糖胺的綴合基團綴合時，N-乙醯半乳糖胺分子是三價或四價。在一些實施方式中，當本發明記載之siRNA與含有N-乙醯半乳糖胺的綴合基團綴合時，N-乙醯半乳糖胺分子是三價。

靶向基團可經由合適的接頭與siRNA分子相連，所屬技術領域具有通常知識者可以根據靶向基團的具體類型選擇合適的接頭。這些接頭、靶向基團的種類以及與siRNA的連接方式，可參見WO2015006740A2的公開內容，通過引用的方式將其整體內容併入本文。

在一些實施方式中，當前述靶向基團為N-乙醯半乳糖胺時，合適的接頭可以為如式(301)所示的結構：

式(301) 其中， k為1-3的整數； L^A 為具有如式(302)所示結構的包含醯胺鍵的鏈狀部分，每個前述L^A 在其兩端分別與一個前述靶向基團和前述L^C 部分通過醚鍵相連接：

式(302)； L^B 為具有如式(303)所示結構的包含N-醯基吡咯烷的鏈狀部分，前述鏈狀部分在其一端具有羰基並與前述L^C 部分通過醯胺鍵相連接，在另一端具有氧基並與前述siRNA通過磷酸酯鍵相連接：

式(303)； L^C 為基於羥甲基氨基甲烷、二羥甲基氨基甲烷或三羥甲基氨基甲烷的2-4價連接基團，前述L^C 經由氧原子與各個前述L^A 部分通過醚鍵相連接，並且經由氮原子與前述L^B 部分通過醯胺鍵相連接。

在一些實施方式中，當n＝3，L^C 為基於三羥甲基氨基甲烷的4價連接基團時，由作為接頭的-(L^A )₃ 三羥甲基氨基甲烷-L^B -連接N-乙醯半乳糖胺分子和siRNA分子所形成的siRNA綴合物，其結構如下式(304)所示：

式(304)，式中，雙螺旋結構表示siRNA。

同樣，siRNA與綴合基團的綴合位點可以在siRNA正義鏈的3'端或5'端，也可在反義鏈的5'端，還可以在siRNA的內部序列中。

在一些實施方式中，本發明前述siRNA的正義鏈3'末端通過接頭-(L^A )₃ 三羥甲基氨基甲烷-L^B -與三個N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)分子共價綴合，得到siRNA分子與GalNAc分子的莫耳比為1:3的siRNA綴合物，下文也可將其稱為(GalNAc)₃ -siRNA，其結構如下式(305)所示：

式(305)，其中，雙螺旋結構表示前述siRNA，並且前述接頭連接至前述siRNA的正義鏈3'末端。

在一些實施方式中，當前述靶向基團為N-乙醯半乳糖胺時，合適的接頭可以為如式(306)所示的結構：

，式(306) 其中， l為0-3的整數；^* 表示接頭上通過醚鍵與靶向基團連接的位點；^# 表示接頭上通過磷酸酯鍵與siRNA連接的位點。

在一些實施方式中，當l=2時，前述siRNA綴合物具有如式(307)所示的結構：

式(307)，其中，雙螺旋結構表示前述siRNA，並且前述接頭連接至前述siRNA的正義鏈3'末端。

上述綴合物可以通過現有技術中已經詳細描述的方法進行合成。例如，WO2015006740A2中詳細描述了多種綴合物的製備方法。通過所屬技術領域具有通常知識者熟知的方式，獲得本發明的siRNA綴合物。如WO2014025805A1中記載了式(305)所示結構的製備方法，Rajeev等人在ChemBioChem 2015, 16, 903-908中描述了式(307)所示結構的製備方法。

在一些實施方式中，前述siRNA綴合物具有如式(308)所示的結構：

式(308)，其中： n1為選自1-3的整數，n3為選自0-4的整數；每個m1、m2或m3各自獨立地為選自2-10的整數； R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 或R₁₅ 各自獨立地為H，或選自於由以下基團所組成的組：C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基以及C₁ -C₁₀ 烷氧基； R₃ 為式A59所示結構的基團：

(A59) 其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ，Nu為本發明的siRNA； R₂ 是長度為1-20個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，R₂ 可任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ 、-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；每個L₁ 獨立地是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，L₁ 可任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ 、-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)。

在一些實施方式中，L₁ 可選自於由A1-A26基團或其任意組合所組成的組，其中A1-A26的結構和定義如下所示：

、

、

、

、 (A1) (A2) (A3) (A4)

、

、

、

、 (A5) (A6) (A7) (A8)

、

、

、 (A9) (A10) (A11)

、

、

、 (A12) (A13) (A14)

、

、

、 (A15) (A16) (A17)

、

、

、

、 (A18) (A19) (A20) (A21)

、

、

、 (A22) (A23) (A24)

、

； (A25) (A26) 其中，每個j1獨立地為1-20的整數；每個j2獨立地為1-20的整數；每個R'獨立地為C₁ -C₁₀ 烷基；每個Ra獨立地選自式(A27)-(A45)所示的基團或其任意組合所組成的組：

、

、

、

、

、

、 (A27) (A28) (A29) (A30) (A31) (A32)

、

、

、

、

、 (A33) (A34) (A35) (A36) (A37)

、

、

、

、

、 (A38) (A39) (A40) (A41) (A42)

、

或

； (A43) (A44) (A45) 每個Rb獨立地為C₁ -C₁₀ 烷基；

表示基團共價連接的位點。

技術人員會理解的是，儘管為了方便起見，L₁ 被定義為線性亞烷基，但是它可能不是線性基團或者名稱不同，例如由於上述替換和/或取代而產生的胺或烯基。為了本發明內容的目的，L₁ 的長度是連接兩個連接點的鏈中的原子數。為此目的，將替換前述直鏈亞烷基的碳原子而得到的環(如亞雜環基或亞雜芳基)計為一個原子。

M₁ 表示靶向基團，其定義和可選擇的範圍與上述靶向基團相同。在一些實施方式中，每個M₁ 獨立地選自對哺乳動物肝臟細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體具有親合力的配體中的一種。

當M₁ 為對哺乳動物肝臟細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體具有親合力的配體時，在一些實施方式中，n1可以是1-3的整數，n3可以是0-4的整數，保證前述綴合物中M₁ 靶向基團的個數至少為2；在一些實施方式中，n1+n3≥2，這樣可以使得M₁ 靶向基團的個數至少為3，從而使得M₁ 靶向基團與肝表面去唾液酸糖蛋白受體更容易結合，進而促進前述綴合物通過內吞作用進入細胞。實驗表明，當M₁ 靶向基團的個數大於3個時，M₁ 靶向基團與肝表面去唾液酸糖蛋白受體結合的容易程度增加並不明顯，因此，從合成容易程度、結構/製程成本和遞送效率等多方面綜合考慮，在一些實施方式中，n1為1-2的整數，n3為0-1的整數，且n1+n3=2-3。

在一些實施方式中，每個m1、m2或m3各自獨立地選自2-10的整數時，可以使多個M₁ 靶向基團之間的空間位置適合M₁ 靶向基團與肝表面去唾液酸糖蛋白受體的結合，為了使本發明提供的siRNA綴合物更為簡單，更容易合成和/或降低成本，在一些實施方式中，每個m1、m2或m3各自獨立地為2-5的整數，在一些實施方式中，m1=m2=m3。

所屬技術領域具有通常知識者可以理解，當R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 或R₁₅ 各自獨立地選自H、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、以及C₁ -C₁₀ 烷氧基中的一種時，不會改變本發明的siRNA綴合物的性質，均可以實現本發明的目的。在一些實施方式中，R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 或R₁₅ 各自獨立地選自H、甲基或乙基。在一些實施方式中，R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 和R₁₅ 均為H。

R₃ 為式A59所示結構的基團，其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ，基於製備原料易獲取性的考慮，在一些實施方式中，E₁ 為OH或SH。

R₂ 的選擇是為了實現與含氮骨架上的N原子與A59的連接。在本發明的上下文中，“含氮骨架”是指連接有R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 和R₁₅ 的碳原子與N原子互相連接的鏈狀結構。因此，R₂ 可以是任何能夠以適當方式將A59基團連接至含氮骨架上的N原子的連接基團。在一些實施方式中，在通過固相合成的製程製備式(308)所示的siRNA綴合物的情況下，R₂ 基團中需要同時含有與含氮骨架上的N原子連接的連接位點和與R₃ 中的P原子相連接的連接位點。在一些實施方式中，R₂ 中前述與含氮骨架上的N原子連接的位點與N原子形成醯胺鍵，前述與R₃ 上的P原子連接的位點與P原子形成磷酸酯鍵；在一些實施方式中，R₂ 可以是B5、B6、B5'或B6'：

、

； (B5) (B6)，

、

； (B5') (B6')，其中，

表示基團共價鍵連接的位點。

q₂ 的取值範圍可以是1-10的整數，在一些實施方式中，q₂ 為1-5的整數。

L₁ 的作用是將M₁ 靶向基團與含氮骨架上的N連接，為式(308)所示的siRNA綴合物提供肝靶向功能。在一些實施方式中，L₁ 選自式A1-A26基團中的一種或多種的連接組合。在一些實施方式中，L₁ 選自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一種或多種的連接組合。在一些實施方式中，L₁ 選自A1、A4、A8、A10和A11中至少2個的連接組合。在一些實施方式中，L₁ 選自A1、A8、A10中至少2個的連接組合。

在一些實施方式中，L₁ 的長度可以為3-25個原子，3-20個原子、4-15個原子或5-12個原子。在一些實施方式中，L₁ 的長度為3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個原子。

在一些實施方式中，j1為2-10的整數，在一些實施方式中，j1為3-5的整數。在一些實施方式中，j2為2-10的整數，在一些實施方式中，j2為3-5的整數。R'為C₁ -C₄ 烷基，在一些實施方式中，R'為甲基、乙基和異丙基中的一種。Ra為A27、A28、A29、A30和A31中的一種，在一些實施方式中，Ra為A27或A28。Rb為C₁ -C₅ 烷基，在一些實施方式中，Rb為甲基、乙基、異丙基和丁基中的一種。在一些實施方式中，在式A1-A26中各自對j1、j2、R'、Ra、Rb進行選擇，以實現M₁ 靶向基團與含氮骨架上的N原子連接，並使M₁ 靶向基團之間的空間位置更適合M₁ 靶向基團與肝表面去唾液酸糖蛋白受體結合。

在一些實施方式中，該綴合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的結構：

式(403)

式(404)

式(405)

式(406)

式(407)

式(408)

式(409)

式(410)

式(411)

式(412)

式(413)

式(414)

式(415)

式(416)

式(417)

式(418)

式(419)

式(420)

式(421)

。式(422)

在一些實施方式中，式A59中的P原子可以連接到siRNA序列中任何可能的位置，例如，式A59中的P原子可以連接到siRNA正義鏈或反義鏈的任何一個核苷酸上；在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈的任何一個核苷酸上。在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈或反義鏈的端部；在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈的端部。前述端部指前述正義鏈或前述反義鏈中從其一端起算的前4個核苷酸。在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈或反義鏈的末端；在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈的3'末端。在連接至siRNA的正義鏈的上述位置的情況下，式(308)所示的siRNA綴合物進入細胞後，在解旋時，可以釋放出單獨的siRNA反義鏈，以阻斷PCSK9 mRNA翻譯蛋白質的過程，抑制PCSK9基因表達。

在一些實施方式中，式A59中的P可以連接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的鹼基上。在一些實施方式中，式A59中的P原子可通過形成磷酸二酯鍵連接至前述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些實施方式中，式A59中的P原子連接在siRNA正義鏈3'末端核苷酸的3'羥基脫氫後形成的氧原子上(此時，A59中的P原子也可以看作是siRNA中含有的磷酸基團中的P原子)，或者式A59中的P原子通過取代siRNA正義鏈中的一個核苷酸的2'-羥基中的氫與核苷酸連接，或者式A59中的P原子通過取代siRNA正義鏈5'末端核苷酸的5'羥基中的氫與核苷酸連接。

本發明的發明人意外發現，本發明的siRNA綴合物在具有顯著提高的血漿中穩定性、低脫靶效應的同時，還表現出較高的PCSK9 mRNA沉默活性，而且還具有較高的血脂抑制作用。在一些實施方式中，本發明的siRNA可以為表1a-1g中示出的siRNA中的一種。含有這些siRNA的綴合物表現出更高的PCSK9 mRNA沉默活性。

表1a本發明的第一種siRNA序列

siRNA 編號	SEQ ID NO:	序列方向5' - 3'
siPCSKa1	9	AAGCAAGCAGACAUUUAUC
10	GAUAAAUGUCUGCUUGCUUGG
siPCSKa2	11	CCAAGCAAGCAGACAUUUAUC
12	GAUAAAUGUCUGCUUGCUUGGGU
siPCSKa1-M1	13	AmAmGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
14	GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGm
siPCSKa1-M2	15	AmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
16	GmAfUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGm
siPCSKa1-M3	17	AmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
18	GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGm
siPCSKa2-M1	19	CmCmAmAmGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
20	GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmGmUm
siPCSKa2-M2	21	CmCmAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
22	GmAfUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmGmUm
siPCSKa2-M3	23	CmCmAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
24	GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmGmUm
siPCSKa1-M1S	25	AmsAmsGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
26	GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm
siPCSKa1-M2S	27	AmsAmsGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
28	GmsAfsUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm
siPCSKa1-M3S	29	AmsAmsGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
30	GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm
siPCSKa2-M1S	31	CmsCmsAmAmGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
32	GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmsGmsUm
siPCSKa2-M2S	33	CmsCmsAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
34	GmsAfsUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmsGmsUm
siPCSKa2-M3S	35	CmsCmsAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
36	GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmsGmsUm
siPCSKa1-M1P1	37	AmAmGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
38	P1GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGm
siPCSKa1-M2P1	39	AmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
40	P1GmAfUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGm
siPCSKa1-M3P1	41	AmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
42	P1GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGm
siPCSKa2-M1P1	43	CmCmAmAmGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
44	P1GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmGmUm
siPCSKa2-M2P1	45	CmCmAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
46	P1GmAfUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmGmUm
siPCSKa2-M3P1	47	CmCmAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
48	P1GmAfUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmGmUm
siPCSKa1-M1SP1	49	AmsAmsGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
50	P1GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm
siPCSKa1-M2SP1	51	AmsAmsGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
52	P1GmsAfsUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm
siPCSKa1-M3SP1	53	AmsAmsGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
54	P1GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm
siPCSKa2-M1SP1	55	CmsCmsAmAmGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
56	P1GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmsGmsUm
siPCSKa2-M2SP1	57	CmsCmsAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
58	P1GmsAfsUmAmAmAfUmGfUfCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmsGmsUm
siPCSKa2-M3SP1	59	CmsCmsAmAmGmCmAfAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm
60	P1GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmGmGmsGmsUm

表1b 本發明的第二種siRNA序列

siRNA 編號	SEQ ID NO:	序列方向5' - 3'
siPCSKb1	69	UUUGUAGCAUUUUUAUUAA
70	UUAAUAAAAAUGCUACAAAAC
siPCSKb2	71	GUUUUGUAGCAUUUUUAUUAA
72	UUAAUAAAAAUGCUACAAAACCC
siPCSKb1-M1	73	UmUmUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
74	UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCm
siPCSKb1-M2	75	UmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
76	UmUfAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCm
siPCSKb1-M3	77	UmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
78	UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCm
siPCSKb2-M1	79	GmUmUmUmUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
80	UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmCmCm
siPCSKb2-M2	81	GmUmUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
82	UmUfAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmCmCm
siPCSKb2-M3	83	GmUmUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
84	UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmCmCm
siPCSKb1-M1S	85	UmsUmsUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
86	UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm
siPCSKb1-M2S	87	UmsUmsUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
88	UmsUfsAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm
siPCSKb1-M3S	89	UmsUmsUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
90	UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm
siPCSKb2-M1S	91	GmsUmsUmUmUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
92	UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmsCmsCm
siPCSKb2-M2S	93	GmsUmsUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
94	UmsUfsAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmsCmsCm
siPCSKb2-M3S	95	GmsUmsUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
96	UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmsCmsCm
siPCSKb1-M1P1	97	UmUmUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
98	P1UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCm
siPCSKb1-M2P1	99	UmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
100	P1UmUfAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCm
siPCSKb1-M3P1	101	UmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
102	P1UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCm
siPCSKb2-M1P1	103	GmUmUmUmUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
104	P1UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmCmCm
siPCSKb2-M2P1	105	GmUmUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
106	P1UmUfAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmCmCm
siPCSKb2-M3P1	107	GmUmUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
108	P1UmUfAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmCmCm
siPCSKb1-M1SP1	109	UmsUmsUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
110	P1UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm
siPCSKb1-M2SP1	111	UmsUmsUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
112	P1UmsUfsAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm
siPCSKb1-M3SP1	113	UmsUmsUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
114	P1UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm
siPCSKb2-M1SP1	115	GmsUmsUmUmUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
116	P1UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmsCmsCm
siPCSKb2-M2SP1	117	GmsUmsUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
118	P1UmsUfsAmAmUmAfAmAfAfAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmsCmsCm
siPCSKb2-M3SP1	119	GmsUmsUmUmUmGmUfAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm
120	P1UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmAmCmsCmsCm

表1c 本發明的第三種siRNA序列

siRNA 編號	SEQ ID NO:	序列方向5' - 3'
siPCSKc1	129	GCCUGGAGUUUAUUCGGAA
130	UUCCGAAUAAACUCCAGGCCU
siPCSKc2	131	AGGCCUGGAGUUUAUUCGGAA
132	UUCCGAAUAAACUCCAGGCCUAU
siPCSKc1-M1	133	GmCmCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
134	UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUm
siPCSKc1-M2	135	GmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
136	UmUfCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUm
siPCSKc1-M3	137	GmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
138	UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUm
siPCSKc2-M1	139	AmGmGmCmCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
140	UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmAmUm
siPCSKc2-M2	141	AmGmGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
142	UmUfCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmAmUm
siPCSKc2-M3	143	AmGmGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
144	UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmAmUm
siPCSKc1-M1S	145	GmsCmsCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
146	UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm
siPCSKc1-M2S	147	GmsCmsCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
148	UmsUfsCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm
siPCSKc1-M3S	149	GmsCmsCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
150	UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm
siPCSKc2-M1S	151	AmsGmsGmCmCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
152	UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmsAmsUm
siPCSKc2-M2S	153	AmsGmsGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
154	UmsUfsCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmsAmsUm
siPCSKc2-M3S	155	AmsGmsGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
156	UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmsAmsUm
siPCSKc1-M1P1	157	GmCmCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
158	P1UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUm
siPCSKc1-M2P1	159	GmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
160	P1UmUfCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUm
siPCSKc1-M3P1	161	GmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
162	P1UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUm
siPCSKc2-M1P1	163	AmGmGmCmCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
164	P1UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmAmUm
siPCSKc2-M2P1	165	AmGmGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
166	P1UmUfCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmAmUm
siPCSKc2-M3P1	167	AmGmGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
168	P1UmUfCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmAmUm
siPCSKc1-M1SP1	169	GmsCmsCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
170	P1UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm
siPCSKc1-M2SP1	171	GmsCmsCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
172	P1UmsUfsCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm
siPCSKc1-M3SP1	173	GmsCmsCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
174	P1UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm
siPCSKc2-M1SP1	175	AmsGmsGmCmCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
176	P1UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmsAmsUm
siPCSKc2-M2SP1	177	AmsGmsGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
178	P1UmsUfsCmCmGmAfAmUfAfAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmsAmsUm
siPCSKc2-M3SP1	179	AmsGmsGmCmCmUmGfGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm
180	P1UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmCmUmsAmsUm

表1d 本發明的第四種siRNA序列

siRNA 編號	SEQ ID NO:	序列方向5' - 3'
siPCSKd1	189	CUGUUUUGCUUUUGUAACU
190	AGUUACAAAAGCAAAACAGGU
siPCSKd2	191	ACCUGUUUUGCUUUUGUAACU
192	AGUUACAAAAGCAAAACAGGUCU
siPCSKd1-M1	193	CmUmGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
194	AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUm
siPCSKd1-M2	195	CmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
196	AmGfUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUm
siPCSKd1-M3	197	CmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
198	AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUm
siPCSKd2-M1	199	AmCmCmUmGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
200	AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmCmUm
siPCSKd2-M2	201	AmCmCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
202	AmGfUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmCmUm
siPCSKd2-M3	203	AmCmCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
204	AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmCmUm
siPCSKd1-M1S	205	CmsUmsGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
206	AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm
siPCSKd1-M2S	207	CmsUmsGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
208	AmsGfsUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm
siPCSKd1-M3S	209	CmsUmsGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
210	AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm
siPCSKd2-M1S	211	AmsCmsCmUmGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
212	AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmsCmsUm
siPCSKd2-M2S	213	AmsCmsCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
214	AmsGfsUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmsCmsUm
siPCSKd2-M3S	215	AmsCmsCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
216	AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmsCmsUm
siPCSKd1-M1P1	217	CmUmGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
218	P1AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUm
siPCSKd1-M2P1	219	CmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
220	P1AmGfUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUm
siPCSKd1-M3P1	221	CmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
222	P1AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUm
siPCSKd2-M1P1	223	AmCmCmUmGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
224	P1AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmCmUm
siPCSKd2-M2P1	225	AmCmCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
226	P1AmGfUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmCmUm
siPCSKd2-M3P1	227	AmCmCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
228	P1AmGfUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmCmUm
siPCSKd1-M1SP1	229	CmsUmsGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
230	P1AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm
siPCSKd1-M2SP1	231	CmsUmsGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
232	P1AmsGfsUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm
siPCSKd1-M3SP1	233	CmsUmsGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
234	P1AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm
siPCSKd2-M1SP1	235	AmsCmsCmUmGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
236	P1AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmsCmsUm
siPCSKd2-M2SP1	237	AmsCmsCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
238	P1AmsGfsUmUmAmCfAmAfAfAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmsCmsUm
siPCSKd2-M3SP1	239	AmsCmsCmUmGmUmUfUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm
240	P1AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmGmUmsCmsUm

表1e 本發明的第五種siRNA序列

siRNA 編號	SEQ ID NO:	序列方向5' - 3'
siPCSKe1	249	GGUUUUGUAGCAUUUUUAU
250	AUAAAAAUGCUACAAAACCCA
siPCSKe2	251	UGGGUUUUGUAGCAUUUUUAU
252	AUAAAAAUGCUACAAAACCCAGA
siPCSKe1-M1	253	GmGmUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
254	AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAm
siPCSKe1-M2	255	GmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
256	AmUfAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAm
siPCSKe1-M3	257	GmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
258	AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAm
siPCSKe2-M1	259	UmGmGmGmUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
260	AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmGmAm
siPCSKe2-M2	261	UmGmGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
262	AmUfAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmGmAm
siPCSKe2-M3	263	UmGmGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
264	AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmGmAm
siPCSKe1-M1S	265	GmsGmsUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
266	AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm
siPCSKe1-M2S	267	GmsGmsUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
268	AmsUfsAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm
siPCSKe1-M3S	269	GmsGmsUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
270	AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm
siPCSKe2-M1S	271	UmsGmsGmGmUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
272	AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmsGmsAm
siPCSKe2-M2S	273	UmsGmsGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
274	AmsUfsAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmsGmsAm
siPCSKe2-M3S	275	UmsGmsGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
276	AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmsGmsAm
siPCSKe1-M1P1	277	GmGmUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
278	P1AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAm
siPCSKe1-M2P1	279	GmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
280	P1AmUfAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAm
siPCSKe1-M3P1	281	GmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
282	P1AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAm
siPCSKe2-M1P1	283	UmGmGmGmUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
284	P1AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmGmAm
siPCSKe2-M2P1	285	UmGmGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
286	P1AmUfAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmGmAm
siPCSKe2-M3P1	287	UmGmGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
288	P1AmUfAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmGmAm
siPCSKe1-M1SP1	289	GmsGmsUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
290	P1AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm
siPCSKe1-M2SP1	291	GmsGmsUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
292	P1AmsUfsAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm
siPCSKe1-M3SP1	293	GmsGmsUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
294	P1AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm
siPCSKe2-M1SP1	295	UmsGmsGmGmUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
296	P1AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmsGmsAm
siPCSKe2-M2SP1	297	UmsGmsGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
298	P1AmsUfsAmAmAmAfAmUfGfCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmsGmsAm
siPCSKe2-M3SP1	299	UmsGmsGmGmUmUmUfUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm
300	P1AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmCmAmsGmsAm

表1f 本發明的第六種siRNA序列

siRNA 編號	SEQ ID NO:	序列方向5' - 3'
siPCSKf1	309	GUGACUUUUUAAAAUAAAA
310	UUUUAUUUUAAAAAGUCACCA
siPCSKf2	311	UGGUGACUUUUUAAAAUAAAA
312	UUUUAUUUUAAAAAGUCACCAUA
siPCSKf1-M1	313	GmUmGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
314	UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAm
siPCSKf1-M2	315	GmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
316	UmUfUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAm
siPCSKf1-M3	317	GmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
318	UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAm
siPCSKf2-M1	319	UmGmGmUmGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
320	UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmUmAm
siPCSKf2-M2	321	UmGmGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
322	UmUfUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmUmAm
siPCSKf2-M3	323	UmGmGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
324	UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmUmAm
siPCSKf1-M1S	325	GmsUmsGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
326	UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm
siPCSKf1-M2S	327	GmsUmsGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
328	UmsUfsUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm
siPCSKf1-M3S	329	GmsUmsGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
330	UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm
siPCSKf2-M1S	331	UmsGmsGmUmGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
332	UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmsUmsAm
siPCSKf2-M2S	333	UmsGmsGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
334	UmsUfsUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmsUmsAm
siPCSKf2-M3S	335	UmsGmsGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
336	UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmsUmsAm
siPCSKf1-M1P1	337	GmUmGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
338	P1UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAm
siPCSKf1-M2P1	339	GmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
340	P1UmUfUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAm
siPCSKf1-M3P1	341	GmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
342	P1UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAm
siPCSKf2-M1P1	343	UmGmGmUmGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
344	P1UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmUmAm
siPCSKf2-M2P1	345	UmGmGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
346	P1UmUfUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmUmAm
siPCSKf2-M3P1	347	UmGmGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
348	P1UmUfUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmUmAm
siPCSKf1-M1SP1	349	GmsUmsGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
350	P1UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm
siPCSKf1-M2SP1	351	GmsUmsGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
352	P1UmsUfsUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm
siPCSKf1-M3SP1	353	GmsUmsGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
354	P1UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm
siPCSKf2-M1SP1	355	UmsGmsGmUmGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
356	P1UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmsUmsAm
siPCSKf2-M2SP1	357	UmsGmsGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
358	P1UmsUfsUmUmAmUfUmUfUfAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmsUmsAm
siPCSKf2-M3SP1	359	UmsGmsGmUmGmAmCfUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm
360	P1UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmCmAmsUmsAm

表1g 本發明的第七種siRNA序列

siRNA 編號	SEQ ID NO:	序列方向5' - 3'
siPCSKg3	407	AGACCUGUdTUUGCUUUUGU
408	ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG
siPCSKg4	409	CUAGACCUGUdTUUGCUUUUGU
410	ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA
siPCSKg3-M4	411	AmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
412	AmCfAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmAmGm
siPCSKg4-M5	413	CmUmAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
414	AmCfAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmAmGmAmAm
siPCSKg3-M4S	415	AmsGmsAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
416	AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmsAmsGm
siPCSKg4-M5S	417	CmsUmsAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
418	AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmAmGmsAmsAm
siPCSKg3-M4P1	419	AmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
420	P1AmCfAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmAmGm
siPCSKg4-M5P1	421	CmUmAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
422	P1AmCfAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmAmGmAmAm
siPCSKg3-M4SP1	423	AmsGmsAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
424	P1AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmsAmsGm
siPCSKg4-M5SP1	425	CmsUmsAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm
426	P1AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmAmGmsAmsAm

本發明前述siRNA或siRNA綴合物中，每個相鄰核苷酸之間由磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵連接，磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵中的非橋接氧原子或硫原子帶有負電荷，它可以以羥基或巰基的形式存在，羥基或巰基中的氫離子也可以部分或全部被陽離子取代。前述陽離子可以是任意的陽離子，如金屬陽離子，銨離子NH₄ ⁺ ，有機銨陽離子中的一種。出於提高溶解性考慮，在一種實施方式中，前述陽離子選自鹼金屬離子、三級胺形成的銨陽離子和季銨陽離子中的一種或多種。鹼金屬離子可以是K⁺ 和/或Na⁺ ，三級胺形成的陽離子可以是三乙胺形成的銨離子和/或N,N-二異丙基乙胺形成的銨離子。因此，本發明前述siRNA或siRNA綴合物可以至少部分以鹽的形式存在。在一種方式中，磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵中的非橋接氧原子或硫原子至少部分與鈉離子結合，本發明前述siRNA或siRNA綴合物以鈉鹽或部分鈉鹽的形式存在。

所屬技術領域具有通常知識者清楚知曉的是，可以通過使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本發明記載之siRNA中。製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。所有修飾的核苷單體均可以商購得到或者採用已知方法製備得到。 [式(308)所示的siRNA綴合物的製備]

可以採用任意合理的合成路線製備式(308)所示的siRNA綴合物。

在一些實施方式中，式(308)所示的siRNA綴合物可以採用如下方法製備，該方法包括在亞磷醯胺固相合成的條件下，分別按照siRNA正義鏈和反義鏈的核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應；分離出siRNA的正義鏈和反義鏈，退火，其中，前述siRNA為上述本發明的siRNA；並且，該方法還包括在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式(321)所示的化合物與核苷單體或連接在固相載體上的核苷酸序列接觸，使式(321)所示的化合物經偶聯反應連接至核苷酸序列。下文中，式(321)所示的化合物也稱作綴合分子。

式(321) 其中： R₄ 為能夠結合至式(308)所示的化合物中Nu代表的siRNA的基團。在一些實施方式中，R₄ 為能夠通過共價鍵結合至Nu代表的siRNA的基團。在一些實施方式中，R₄ 為能夠經反應而通過磷酸二酯鍵綴合至Nu代表的siRNA的任意官能團的基團；每個S₁ 獨立地是M₁ 中全部活性羥基被YCOO-基團取代而形成的基團，其中，每個Y獨立地選自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵代苯基以及烷基苯基中的一種；在一些實施方式中，Y為甲基。

n1、n3、m1、m2、m3、R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 、R₁₅ 、L₁ 、M₁ 各自的定義和可選擇的範圍如前前述。

R₄ 的選擇是為了實現與含氮骨架上的N原子的連接，並且為合成式(308)所示的siRNA綴合物提供合適的反應位點。在一些實施方式中，R₄ 中包括R₂ 連接基團或經保護的R₂ 連接基團，以及可通過反應與siRNA形成A59所示結構的官能團。

在一些實施方式中，R₄ 包含可與Nu代表的siRNA或核苷單體上的基團形成亞磷酸酯的第1官能團以及可與羥基或氨基反應形成共價鍵的第2官能團或者含有由前述共價鍵連接的固相載體。在一些實施方式中，前述第1官能團為亞磷醯胺、羥基或被保護的羥基。在一些實施方式中，前述第2官能團為亞磷醯胺、羧基或羧酸鹽。在一些實施方式中，前述第2官能團為經由共價鍵連接至分子其他部分的固相載體，前述共價鍵由羥基或氨基形成。在一些實施方式中，前述固相載體經由磷酸酯鍵、羧酸酯鍵或醯胺鍵連接。在一些實施方式中，前述固相載體為樹脂。

在一些實施方式中，前述第1官能團含有羥基、-OR_k 或式(C3)所示的基團；前述第2官能團含有式(C1)、(C2)、(C3)、(C1')或(C3')所示的結構：

，

，

， (C1) (C2) (C3)

，

， (C1') (C3') 式中，q₁ 為1-4的整數，X為O或NH，M⁺ 為陽離子，R_k 為羥基保護基團，SPS表示固相載體，

表示基團共價連接的位點。

在一些實施方式中，前述第1官能團含有亞磷醯胺基團，如式(C3)所示，該亞磷醯胺基團可以與核苷酸上的任意位置的羥基，如2'位羥基或3'位羥基發生偶聯反應形成亞磷酸酯，並經氧化或硫化形成式A59所示的磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，將綴合分子綴合至siRNA。此時，即使前述第2官能團並不存在，式(321)化合物也能夠綴合至核苷酸，不影響式(308)所示的siRNA綴合物的獲得。在此情況下，在經由亞磷醯胺固相合成等方法獲得siRNA的正義鏈或反義鏈後，使式(321)化合物與核苷酸序列中末端核苷酸上的羥基反應，並在後續的氧化或硫化過程中形成磷酸二酯鍵連接或硫代磷酸酯連接，將式(321)化合物綴合至siRNA。

在一些實施方式中，前述第1官能團含有被保護的羥基。在一些實施方式中，前述第2官能團包含可與固相載體反應的基團，前述反應提供包含固相載體的綴合分子。在一些實施方式中，前述第2官能團含有羧基、羧酸鹽或亞磷醯胺，如式(C1)、(C2)或(C3)所示，當前述第2官能團包含羧基或羧酸鹽時，式(321)化合物與固相載體，例如樹脂上的羥基或氨基進行酯化反應或醯胺化反應，形成經羧酸酯鍵連接的包含固相載體的綴合分子。當前述第2官能團包含亞磷醯胺官能團時，式(321)化合物與通用固相載體，例如樹脂上的羥基發生偶聯反應，並經氧化形成經磷酸二酯鍵連接的包含固相載體的綴合分子。隨後，以上述連接固相載體後的產物作為起始，按照亞磷醯胺固相合成方法依次連接核苷單體，獲得連接有綴合基團的siRNA的正義鏈或反義鏈。在亞磷醯胺固相合成過程中，前述第1官能團發生脫保護，隨後在偶聯反應條件下與核苷單體上的亞磷醯胺基團發生偶聯。

在一些實施方式中，前述第1官能團含有羥基或被保護的羥基；前述第2官能團含有經羧酸酯鍵連接的固相載體或經醯胺鍵連接的固相載體、或者經磷酸酯鍵連接的固相載體，如式(C1')或(C3')所示。此時，由式(321)化合物代替固相載體作為起始，按照亞磷醯胺固相合成方法依次連接核苷單體，獲得連接有綴合基團的siRNA的正義鏈或反義鏈。

在一些實施方式中，羧酸鹽可以表示為-COO^- M⁺ ，其中，M⁺ 是陽離子，例如選自金屬陽離子，銨陽離子NH₄ ⁺ ，有機銨陽離子中的一種。在一種實施方式中，前述金屬離子選自鹼金屬離子中的一種，如K⁺ 或Na⁺ 。出於提高溶解性、使反應順利進行的考慮，在一些實施方式中，有機銨離子為三級胺形成的銨陽離子或季銨陽離子，如，三乙胺形成的銨離子或N,N-二異丙基乙胺形成的銨離子。在一些實施方式中，羧酸鹽是三乙胺羧酸鹽或N,N-二異丙基乙胺羧酸鹽。

在一些實施方式中，R₄ 含有式(B9)、(B10)、(B9')、(B10')、(B11)、(B12)、(B11')或(B12')所示的結構：

、

， (B9) (B10)

、

， (B9') (B10')

、

， (B11) (B12)

、

， (B11') (B12') 其中，q₁ 為1-4的整數，q₂ 為1-10的整數，X為O或NH，M⁺ 為陽離子，R_k 為羥基保護基團，SPS表示固相載體，

表示基團共價連接的位點。在一些實施方式中，q₁ 為1或2。在一些實施方式中，q₂ 為1-5的整數。在一些實施方式中，R₄ 含有式(B9)或(B10)所示的結構。在一些實施方式中，R₄ 含有式(B11)或(B12)所示的結構。

在一些實施方式中，R_k 是Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-雙甲氧基三苯甲基)、TMTr(4,4',4''-三甲氧基三苯甲基)中的一種或多種。在一些實施方式中，R_k 可以是DMTr，即4,4'-雙甲氧基三苯甲基(4,4'-dimethoxytrityl)。

L₁ 的定義如前前述。

在一些實施方式中，L₁ 被用於將M₁ 靶向基團連接至含氮骨架上的N原子，從而為式(308)所示的siRNA綴合物提供肝靶向功能。在一些實施方式中，L₁ 包含A1-A26中的任一個或其組合。

根據上述描述，所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，相較於本領域習知的亞磷醯胺固相合成方法而言，可通過上述第1官能團以及任選的第2官能團，獲得將綴合分子連接至核苷酸序列的任意可能的位置的式(308)所示的siRNA綴合物，例如，綴合分子連接至核苷酸序列的端部，綴合分子連接至核苷酸序列的末端。相應地，除非另有說明，以下關於綴合物和/或綴合分子的製備的描述中，當提及“脫保護”、“偶聯”、“蓋帽”、“氧化”、“硫化”等反應時，應當理解為本領域習知的亞磷醯胺核酸固相合成方法中所關於的反應條件和試劑也同樣適用於這些反應。示例性的反應條件和試劑將在後文詳細描述。

在一些實施方式中，每個S₁ 獨立地是M₁ 。在一些實施方式中，每個S₁ 獨立地是M₁ 中至少一個活性羥基被羥基保護基團保護而形成的基團。在一些實施方式中，每個S₁ 獨立地是M₁ 中任何存在的活性羥基全部被羥基保護基團保護而形成的基團。在一些實施方式中，任何所屬技術領域具有通常知識者已知的羥基保護基團均可被用於保護M₁ 中的活性羥基。在一些實施方式中，被保護的羥基可以式YCOO-表示，其中，每個Y獨立地選自於由C₁ -C₁₀ 烷基和C₆ -C₁₀ 芳基所組成的組，前述C₁ -C₁₀ 烷基和C₆ -C₁₀ 芳基任選地被一個或多個取代基取代，前述取代基選自於由鹵素和C₁ -C₆ 烷基所組成的組。在一些實施方式中，每個Y獨立地選自於由以下基團所組成的組：甲基、三氟甲基、二氟甲基、單氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵苯基，以及C₁ -C₆ 烷基苯基。

在一些實施方式中，每個S₁ 各自獨立地選自於由式A46-A54所組成的組：

、

、

、 (A46) (A47) (A48)

、

、

、 (A49) (A50) (A51)

、

、

。 (A52) (A53) (A54)

在一些實施方式中，S₁ 為式A49或A50。

在一些實施方式中，每個Y獨立地選自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵代苯基以及烷基苯基中的一種；在一些實施方式中，Y為甲基。

如前前述，式(308)所示的siRNA綴合物的製備方法還包括以下步驟：合成siRNA的另一鏈(例如，當上述步驟合成了連接有綴合分子的siRNA正義鏈時，還包括按照固相合成方法合成siRNA的反義鏈，反之亦然)，分離正義鏈和反義鏈，以及退火。具體地，在分離步驟中，連接至核苷酸序列和/或綴合分子的固相載體被切割下來，同時必要的保護基團被脫除(此時，式(321)化合物中的各S₁ 基團轉化為對應的M₁ 靶向基團)，獲得連接有綴合分子的siRNA正義鏈(或反義鏈)以及對應的反義鏈(或正義鏈)，正義鏈與反義鏈退火形成雙鏈RNA結構，獲得式(308)所示的siRNA綴合物。

在一些實施方式中，式(308)所示的siRNA綴合物的製備方法包含以下步驟：在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式(321)所示的化合物與正義鏈或反義鏈的3'端的第一個核苷單體接觸，使式(321)所示的化合物連接上序列中第一個核苷酸，在亞磷醯胺固相合成的條件下，按照期望的正義鏈或反義鏈核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，合成siRNA的正義鏈或反義鏈；其中，式(321)化合物為R₄ 中含有第1官能團和第2官能團，第1官能團含有被保護的羥基，第2官能團具有如式(C1')或(C3')所示結構的化合物，與第一個核苷單體連接前，式(321)化合物經過脫保護；每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應；得到連接有綴合基團的核酸的正義鏈或反義鏈；在亞磷醯胺固相合成的條件下，按照反義鏈或正義鏈核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，合成核酸的反義鏈或正義鏈；每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應；脫除保護基並與固相載體切割，分離純化獲得正義鏈和反義鏈，退火。

在一些實施方式中，式(308)所示的siRNA綴合物的製備方法包含以下步驟：按照該雙鏈siRNA中正義鏈或反義鏈的核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，合成正義鏈和反義鏈，每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應，得到連接在固相載體上的正義鏈和連接在固相載體上的反義鏈；在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式(321)所示的化合物與連接在固相載體上的正義鏈或連接在固相載體上的反義鏈接觸，將式(321)化合物連接至正義鏈或反義鏈，其中，式(321)化合物是R₄ 中含有第1官能團，第1官能團為亞磷醯胺基團的式(321)化合物；脫除保護基並與固相載體切割，分別分離純化，獲得siRNA的正義鏈或反義鏈，退火，其中，前述siRNA的正義鏈或反義鏈上連接有綴合基團。

在一些實施方式中，式A59中的P原子連接至siRNA中的正義鏈的3'末端，式(308)所示的siRNA綴合物的製備方法包括： (1)脫除式(321)化合物(其中，式(321)化合物為R₄ 中含有第1官能團和第2官能團，第1官能團含有被保護的羥基OR_k ，第2官能團具有如式(C1')或(C3')所示結構的化合物)中的羥基保護基團R_k ；在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將脫保護得到的產物與核苷單體接觸，得到通過綴合分子連接至固相載體的核苷單體； (2)以該通過綴合分子連接至固相載體的核苷單體起始，按照3'-5'的方向通過亞磷醯胺固相合成方法合成siRNA的正義鏈； (3)通過亞磷醯胺固相合成方法，合成siRNA的反義鏈； (4)分離出siRNA的正義鏈和反義鏈並退火，獲得式(308)所示的siRNA綴合物。

其中，在步驟(1)中，脫除上述式(321)化合物中的保護基團R_k 的方法包括在脫保護條件下，將式(321)化合物與脫保護試劑接觸。脫保護條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為30-300秒，在一些實施方式中為50-150秒，脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中為二氯乙酸。脫保護試劑與式(321)化合物的莫耳比為10:1-1000:1，在一些實施方式中為50:1-500:1。

前述偶聯反應條件和偶聯試劑可使用任何適合於上述偶聯反應的條件和試劑。在一些實施方式中，可使用與所採用的固相合成方法中的偶聯反應相同的條件與試劑。

在一些實施方式中，前述偶聯反應的條件包括反應溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃。式(321)化合物與核苷單體的莫耳比為1:1-1:50，在一些實施方式中為1:2-1:5；式(321)化合物和偶聯試劑的莫耳比可以為1:1-1:50，在一些實施方式中為1:3-1:10，反應時間為200-3000秒，在一些實施方式中為500-1500秒。偶聯試劑選自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一種或多種，在一些實施方式中為5-乙硫基1H-四氮唑。前述偶聯反應可在有機溶劑中進行，前述有機溶劑選自無水乙腈、無水DMF、無水二氯甲烷中的一種或多種，在一些實施方式中為無水乙腈。相對於式(321)化合物，前述有機溶劑的用量為3-50L/mol，在一些實施方式中為5-20L/mol。

在步驟(2)中，通過亞磷醯胺核酸固相合成的方法，利用上述步驟製備的通過綴合分子連接至固相載體的核苷單體起始，按照3'-5'的方向合成siRNA綴合物的正義鏈SS。此時，綴合基團連接至所得到的正義鏈的3'末端。

步驟(2)和(3)中前述固相合成的其它條件，包括核苷單體脫保護條件，脫保護試劑種類和用量，偶聯反應條件，偶聯試劑的種類和用量，蓋帽反應的條件，蓋帽試劑的種類和用量，氧化反應條件，氧化試劑種類和用量，硫化反應條件，硫化試劑種類和用量採用本領域中常規使用的各種試劑、用量和條件。

例如，在一些實施方式中，步驟(2)和(3)中前述固相合成可使用如下條件：核苷單體脫保護條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為30-300秒，在一些實施方式中為50-150秒，脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸、中的一種或多種，在一些實施方式中為二氯乙酸。脫保護試劑與固相載體上4,4'-二甲氧基三苯甲基保護基的的莫耳比可以為2:1-100:1，在一些實施方式中為3:1-50:1。

偶聯反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，固相載體上連接的核酸序列與核苷單體的莫耳比可以為1:1-1:50，在一些實施方式中為1:5-1:15；固相載體上連接的核酸序列和偶聯試劑的莫耳比為1:1-1:100，在一些實施方式中為1:50-1:80，反應時間和偶聯試劑的選擇與前述相同。

蓋帽反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為5-500秒，在一些實施方式中為10-100秒，蓋帽試劑的選擇與前述相同。蓋帽試劑的總量與固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為1:100-100:1，在一些實施方式中為1:10-10:1。在蓋帽試劑使用等莫耳量的乙酸酐與N-甲基咪唑的情況下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可為1:1:10-10:10:1，在一些實施方式中為1:1:2-2:2:1。

氧化反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為1-100秒，在一些實施方式中為5-50秒，氧化試劑在一些實施方式中為碘(在一些實施方式中，以碘水的形式提供)。氧化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可以為1:1-100:1，在一些實施方式中為5:1-50:1。在一些實施方式中，前述氧化反應在四氫呋喃:水:吡啶=3:1:1-1:1:3的混合溶劑中進行。硫化反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為50-2000秒，在一些實施方式中為100-1000秒，硫化試劑在一些實施方式中為氫化黃原素。硫化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為10:1-1000:1，在一些實施方式中為10:1-500:1。在一些實施方式中，前述硫化反應在乙腈:吡啶=1:3-3:1的混合溶劑中進行。

在將所有核苷單體連接之後，退火之前，該方法還包括分離出siRNA的正義鏈和反義鏈。分離的方法為所屬技術領域具有通常知識者所習知，一般包括將合成得到的核苷酸序列從固相載體上切割下來，脫除鹼基上、磷酸基上和配體上的保護基團，純化和脫鹽。

將合成得到的核苷酸序列從固相載體上切割下來，並脫除鹼基上、磷酸基上和配體上的保護基團可按照siRNA合成中常規的切割和脫保護方法進行。例如，將得到的連接有固相載體的核苷酸序列與濃氨水接觸；在脫保護的過程中，A46-A54基團的保護基團YCOO-轉化為羥基，S₁ 基團轉化為相應的M₁ 基團，生成式(308)所示的siRNA綴合物。其中，前述濃氨水可以是25-30重量%的氨水，濃氨水的用量與目標siRNA序列相比可以為0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。

在所合成的核苷酸序列上存在至少一個2'-TBDMS保護時，前述方法還包括將脫除了固相載體的核苷酸序列與三乙胺三氫氟酸鹽接觸，以脫除該2'-TBDMS保護。此時，所得到的目標siRNA序列中的相應核苷酸具有游離的2'-羥基。三乙胺三氫氟酸鹽純品的用量與目標siRNA序列相比可以為0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。這樣即可得到式(308)所示的siRNA綴合物。

純化和脫鹽的方法是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。例如，可利用製備型離子色譜純化柱，通過NaBr或NaCl的梯度洗脫，完成核酸的純化；產品收集合併後，可採用反相色譜純化柱進行脫鹽。

這樣得到的式(308)所示的siRNA綴合物中，核苷酸之間的磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵中的非橋接氧原子或硫原子基本與鈉離子結合，式(308)所示的siRNA綴合物基本以鈉鹽形式存在。可以採用熟知的離子交換方法，用氫離子和/或其他陽離子取代前述鈉離子，得到其他形式的式(308)所示的siRNA綴合物。前述陽離子如前前述。

在合成過程中，可隨時對核酸序列的純度和分子量進行檢測，更好地控制合成品質，此類檢測的方法為所屬技術領域具有通常知識者所習知。例如，可通過離子交換色譜檢測核酸純度，並通過液質聯用色譜(LC-MS)測定分子量。

退火的方法也是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。例如，可簡單地將所合成的正義鏈(SS鏈)與反義鏈(AS鏈)以等莫耳比混合在注射用水中加熱至70-95℃，隨後室溫冷卻，使其通過氫鍵形成雙鏈結構。這樣即可得到式(308)所示的siRNA綴合物。

在獲得前述綴合物後，在一些實施方式中，還可利用例如液質聯用色譜等方法，通過分子量檢測等方式對所合成的式(308)所示的siRNA綴合物進行表徵，確定所合成的siRNA綴合物為目標設計的式(308)所示的siRNA綴合物，且所合成的siRNA的序列為期望的siRNA的序列，例如為表1a-1g中所列的序列之一。

式(321)所示化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在酯化反應條件下，以及在鹼和酯化催化劑存在下，將式(313)所示化合物與環狀酸酐接觸，離子交換，分離得到式(321)所示化合物：

式(313) 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 、R₁₅ 、L₁ _、 S₁ 各自的定義和可選擇的範圍如前前述； R₆ 為提供式(321)中R₄ 的基團；在一些實施方式中，R₆ 具有式(A61)所示的結構：

， (A61) 其中，R_i 為能夠實現與含氮骨架上的N原子連接、與R_k O連接並且連接有一個游離羥基的任意基團，R_k 為羥基保護基團。此時，所獲得的是R₄ 中含有作為羥基保護基團的第1官能團和第2官能團，前述第2官能團含有如式(C1)或(C2)所示結構的式(321)化合物。

前述酯化反應條件包括反應溫度為0-100℃，反應時間為8-48小時，在一些實施方式中，前述酯化反應條件為反應溫度為10-40℃，反應時間為20-30小時。

在一些實施方式中，前述有機溶劑包含環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，前述環氧類溶劑為二氧六環和/或四氫呋喃，前述醚類溶劑為乙醚和/或甲基叔丁基醚，前述鹵代烷類溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種。在一些實施方式中，前述有機溶劑為二氯甲烷。相對於前述式(313)所示化合物，前述有機溶劑的用量為3-50L/mol，在一些實施方式中為5-20L/mol。

在一些實施方式中，前述環狀酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或庚二酸酐中的一種，在一些實施方式中為丁二酸酐。前述環狀酸酐與前述式(313)所示化合物的莫耳比為1:1-10:1，在一些實施方式中為2:1-5:1。

前述酯化催化劑可以是任何對該酯化反應起到催化作用的催化劑，例如該催化劑可以是4-二甲氨基吡啶。前述催化劑與式(313)所示化合物的莫耳比為1:1-10:1，在一些實施方式中為2:1-5:1。

在一些實施方式中，前述鹼可以是任意的無機鹼，有機鹼或者它們的結合。考慮溶解性和產物穩定性，前述鹼可以是例如三級胺。在一些實施方式中，前述三級胺為三乙胺或N,N-二異丙基乙胺。前述三級胺與式(313)所示化合物的莫耳比為1:1-20:1，在一些實施方式中為3:1-10:1。

前述離子交換作用是將式(321)化合物轉化為期望的羧酸或羧酸鹽的形式，離子交換的方法為所屬技術領域具有通常知識者所習知，可以使用合適的離子交換溶液和交換條件，得到具有M⁺ 陽離子的綴合分子，在此不做詳述。在一些實施方式中，前述離子交換反應使用三乙胺磷酸鹽溶液進行，前述三乙胺磷酸鹽溶液的濃度為0.2-0.8M，在一些實施方式中，前述三乙胺磷酸鹽溶液的濃度為0.4-0.6M，相對於式(313)化合物，前述三乙胺磷酸鹽溶液的用量為3-6L/mol，在進一步的實施方式中為4-5L/mol。

可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(321)化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式(321)化合物，例如，可使用如下兩種色譜條件進行分離：(1)正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇=100:18-100:20梯度洗脫；或者(2)反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度洗脫。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(321)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式(321)化合物的製備方法還進一步包括在縮合反應條件下，在有機溶劑中，在縮合劑、縮合催化劑和三級胺的存在下，將上述離子交換反應得到的產物進一步與含有氨基或羥基的固相載體進行接觸。此時，所獲得的是R₄ 中含有第1官能團和第2官能團，第1官能團含有羥基保護基團，第2官能團含有如式(C1')所示結構的式(321)化合物。

前述固相載體為固相合成siRNA中所用的載體中的一種，其中的一些為所屬技術領域具有通常知識者所習知。例如,前述固相載體可以選自含有活性羥基或氨基官能團的固相載體，在一些實施方式中，前述固相載體為氨基樹脂或羥基樹脂。在一些實施方式中，前述氨基或羥基樹脂具有如下參數：粒徑100-400目(mesh)，表面氨基或羥基載量為0.2-0.5mmol/g。前述式(321)所示化合物與固相載體的用量比為10-400 μmol化合物/每克固相載體(μmol/g)。在一些實施方式中，前述式(321)所示化合物與固相載體的用量比為50-200μmol/g。

前述有機溶劑可以是所屬技術領域具有通常知識者已知的任何合適的溶劑或混合溶劑。在一些實施方式中，前述有機溶劑為乙腈、環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，前述環氧類溶劑為二氧六環和/或四氫呋喃，前述醚類溶劑為乙醚和/或甲基叔丁基醚，前述鹵代烷類溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種。在一些實施方式中，前述有機溶劑為乙腈。相對於式(321)化合物，前述有機溶劑的用量為20-200L/mol，在一些實施方式中為50-100L/mol。

在一些實施方式中，前述縮合劑可以是苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯/鹽(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate，PyBop)、3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one，DEPBT)和/或O-苯并三唑-四甲基脲六氟磷酸鹽/酯(O-benzotriazol-1-yl-tetramethyluronium hexafluorophosphate)，在一些實施方式中，前述縮合劑為O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽/酯。前述縮合劑與式(321)所示化合物的莫耳比為1:1-20:1，在其它實施方式中為1:1-5:1。

在一些實施方式中，前述三級胺為三乙胺和/或N,N-二異丙基乙胺，在一些實施方式中為N,N-二異丙基乙胺；前述三級胺與式(321)所示化合物的莫耳比為1:1-20:1，在一些實施方式中為1:1-5:1。

在一些實施方式中，式(321)化合物的製備方法還可以包括在蓋帽反應條件下，在有機溶劑中，將得到的縮合產物與蓋帽試劑和醯化催化劑接觸，分離得到式(321)所示化合物。前述蓋帽反應的作用在於除去任何尚未反應完全的活性反應官能團，以避免在後續反應中產生不必要的副產物。前述蓋帽反應的條件包括反應溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應的時間為1-10h，在一些實施方式中為3-6h。蓋帽試劑可以使用siRNA固相合成中所使用的蓋帽試劑，siRNA固相合成中所使用的蓋帽試劑為所屬技術領域具有通常知識者所習知。

在一些實施方式中，前述蓋帽試劑由蓋帽試劑1(cap1)和蓋帽試劑2(cap2)組成，其中，蓋帽試劑1為N-甲基咪唑，在一些實施方式中以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶與乙腈的體積比為1:10-1:1，在一些實施方式中為1:3-1:1，吡啶與乙腈的總體積與N-甲基咪唑的體積比為1:1-10:1，在一些實施方式中為3:1-7:1。前述蓋帽試劑2為乙酸酐。在一些實施方式中，前述蓋帽試劑2以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的體積比為1:1-1:10，在進一步的實施方式中為1:2-1:6。

在一些實施方式中，前述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的體積與式(321)化合物的品質之比為5ml/g-50ml/g，在一些實施方式中為15ml/g-30ml/g。前述乙酸酐的乙腈溶液的體積與式(321)化合物的品質之比為0.5ml/g-10ml/g，在一些實施方式中為1ml/g-5ml/g。

在一些實施方式中，蓋帽試劑使用等莫耳量的乙酸酐與N-甲基咪唑。在一些實施方式中，前述有機溶劑為乙腈、環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，前述有機溶劑為乙腈。相對於式(321)化合物，前述有機溶劑的用量為10-50L/mol，在一些實施方式中為5-30L/mol。

在一些實施方式中，前述醯化催化劑可以選自任何可用於酯化縮合或醯胺化化縮合的催化劑，例如鹼性雜環化合物。在一些實施方式中，前述醯化催化劑為4-二甲氨基吡啶。前述催化劑與式(321)所示化合物的品質之比為0.001:1-1:1，在一些實施方式中為0.01:1-0.1:1。

在一些實施方式中，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(321)化合物。在一些實施方式中，可通過以有機溶劑充分洗滌，並過濾，去除未反應的反應物、過量的蓋帽試劑及其它雜質，得到式(321)化合物，前述有機溶劑選自乙腈、二氯甲烷、甲醇，在一些實施方式中為乙腈。

在一些實施方式中，式(321)所示綴合分子的製備方法包括在有機溶劑中，在偶聯反應條件下，以及在偶聯試劑存在下，將式(313)所示化合物與亞磷醯二胺接觸，分離得到式(321)所示化合物。此時，所獲得的是R₄ 中含有第1官能團和第2官能團，第1官能團含有羥基保護基團，第2官能團含有如式(C3)所示結構的式(321)化合物。

在一些實施方式中，偶聯反應條件包括溫度可以為0-50℃，例如為15-35℃，式(313)化合物與亞磷醯二胺的莫耳比可以為1:1-1:50，例如為1:5-1:15；式(313)化合物和偶聯試劑的莫耳比可以為1:1-1:100，例如為1:50-1:80；反應時間可以為200-3000秒，例如為500-1500秒。前述亞磷醯二胺例如可使用雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，其可商購獲得或按照本領域中習知的方法合成獲得。偶聯試劑選自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一種或多種，例如為5-乙硫基1H-四氮唑。前述偶聯反應可在有機溶劑中進行，前述有機溶劑選自無水乙腈、無水DMF、無水二氯甲烷中的一種或多種，例如為無水乙腈。在一些實施方式中，相對於式(313)化合物，前述有機溶劑的用量為3-50L/mol，例如可以為5-20L/mol。通過進行該偶聯反應，式(313)化合物中的羥基與亞磷醯二胺反應形成亞磷醯胺基團。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(321)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式(321)化合物的製備方法還進一步包括以下步驟：在偶聯反應條件下，在有機溶劑中，以及在偶聯試劑存在下，將分離得到的產物進一步與含有羥基的固相載體進行接觸。隨後，經蓋帽反應、氧化反應，分離得到式(321)化合物。此時，所獲得的是R₄ 中含有第1官能團和第2官能團，第1官能團含有羥基保護基團，第2官能團具有如式(C3')所示結構的式(321)化合物。

在一些實施方式中，前述固相載體為本領域中習知的可用於核酸固相合成的固相載體，例如，可以是經脫保護反應後的市售的通用固相載體(NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，結構如式B80所示)：

(B80)。

脫保護反應為所屬技術領域具有通常知識者所習知。在一些實施方式中，脫保護條件包括溫度為0-50℃，例如為15-35℃；反應時間為30-300秒，例如為50-150秒。脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中，脫保護試劑為二氯乙酸。脫保護試劑與固定相上的-DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)保護基的莫耳比為2:1-100:1，例如為3:1-50:1。通過進行前述脫保護，在前述固相載體表面上獲得具有反應活性的游離羥基，便於進行後續的偶聯反應。

偶聯反應條件以及偶聯試劑的選擇可如上前述。通過進行該偶聯反應，脫保護反應中形成的游離羥基與亞磷醯胺基團反應形成亞磷酸酯連接。

在一些實施方式中，蓋帽反應條件包括溫度為0-50℃，例如為15-35℃，反應時間為5-500秒，例如為10-100秒，前述蓋帽反應在蓋帽試劑存在下進行。蓋帽試劑的選擇和用量可如上前述。

氧化反應條件包括溫度為0-50℃，例如可以為15-35℃，反應時間為1-100秒，例如可以為5-50秒，氧化試劑例如可以為碘(在一些實施方式中，以碘水的形式提供)。在一些實施方式中，氧化試劑與連接至固相載體的核酸序列的莫耳比為1:1-100:1，例如可以為5:1-50:1。在一些實施方式中，前述氧化反應在四氫呋喃:水:吡啶=3:1:1-1:1:3的混合溶劑中進行。

在一些實施方式中，R₆ 為式B7或B8基團中的一種，

、

， (B7) (B8) 其中q₂ _、 R_k 的定義如前前述，此時，式(313)所示化合物可以通過以下製備方法得到：在有機溶劑中，在醯胺化反應條件下，以及在醯胺化反應縮合劑和三級胺存在下，將式(314)所示化合物與式(A-1)所示化合物或式(A-2)化合物接觸，隨後進行分離：

式(314)

、

， (A-1) (A-2) 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 、R₁₅ 、L₁ 、S₁ 、q₂ 和R_k 各自的定義和可選擇的範圍如前前述。

前述醯胺化反應條件可包括反應溫度為0-100℃，反應時間為1-48小時，在一些實施方式中，前述醯胺化反應條件為反應溫度為10-40℃，反應時間為2-16小時。

在一些實施方式中，前述有機溶劑為醇類溶劑、環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。前述醇類溶劑在一些實施方式中為甲醇、乙醇、丙醇中的一種或多種，在一些實施方式中為乙醇。前述環氧類溶劑在一些實施方式中為二氧六環和/或四氫呋喃。前述醚類溶劑在一些實施方式中為乙醚和/或甲基叔丁基醚。前述鹵代烷類溶劑在一些實施方式中為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種。在一些實施方式中，前述有機溶劑為二氯甲烷。相對於式(314)化合物，有機溶劑用量為3-50L/mol，在進一步的實施方式中為3-20L/mol。

在一些實施方式中，前述醯胺化反應縮合劑為苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽/酯、3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽、2-乙氧基-1-乙氧碳醯基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽/酯，在進一步的實施方式中為3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮。前述醯胺化反應縮合劑與式(314)所示化合物的莫耳比可以為1:1-10:1，在一些實施方式中為2.5:1-5:1。

在一些實施方式中，前述三級胺為三乙胺或N,N-二異丙基乙胺，在進一步的實施方式中為N,N-二異丙基乙胺。前述三級胺與式(314)所示化合物的莫耳比為3:1-20:1，在一些實施方式中為5:1-10:1。

在一些實施方式中，式(A-1)和式(A-2)化合物可通過任何適當的方式製備。例如，當R_k 為DMTr基團時，可通過甘油酸鈣與DMTrCl反應製備式(A-1)化合物；類似地，可先將3-氨基-1,2-丙二醇與環狀酸酐接觸，隨後再與DMTrCl反應製備式(A-2)化合物，前述環狀酸酐可以是碳原子數為4-13、在一些實施方式中為4-8的環狀酸酐。所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，前述環狀酸酐的選擇對應於(A-2)化合物中q₂ 的不同值，例如，當前述環狀酸酐為丁二酸酐時，q₂ =1，當前述環狀酸酐為戊二酸酐時，q₂ =2，以此類推。

在一些變型中，也可通過使式(314)所示化合物依次與前述環狀酸酐、3-氨基-1,2-丙二醇和DMTrCl反應，製備式(313)化合物。所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，這些變型不會影響式(313)化合物的結構與功能，並且這些變型是所屬技術領域具有通常知識者在上述方法的基礎上容易實現的。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(313)化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式(313)化合物，例如，可使用如下兩種色譜條件進行分離：(1)正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲醯胺=1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脫；以及(2)反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度洗脫。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(313)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式(314)所示化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在醯胺化反應縮合劑和三級胺存在下，在縮合反應條件下，將式(320)所示化合物與式(316)所示化合物接觸，隨後進行分離：

式(316)

式(320) 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 、R₁₅ 各自的定義和可選擇的範圍如前前述。

式(316)化合物可使用例如J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961中所公開的化合物，或者，式(316)化合物可由所屬技術領域具有通常知識者通過各種方法製備，例如，可參照美國專利US 8,106,022 B2實施例1中所公開的方法製備某些式(316)化合物，以引用的方式將以上文獻的全部內容整體併入本文。

在一些實施方式中，前述縮合反應條件包括反應溫度為0-100℃，反應時間為0.1-24小時，在一些實施方式中為反應溫度為10-40℃，反應時間為0.5-16小時。

考慮到期望產物式(314)化合物的結構，前述式(316)所示化合物與前述式(320)所示化合物的莫耳比應當基於與式(320)中n1與n3的和而確定。在一些實施方式中，例如，當n1+n3=3時，為了保證反應完全而不過度，式(316)所示化合物與前述式(320)所示化合物的莫耳比可以為3:1-3.5:1，在一些實施方式中為3.01:1-3.15:1。

在一些實施方式中，前述有機溶劑為乙腈、環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種，前述環氧類溶劑在一些實施方式中為二氧六環和/或四氫呋喃，前述醚類溶劑在一些實施方式中為乙醚和/或甲基叔丁基醚，前述鹵代烷類溶劑在一些實施方式中為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，前述有機溶劑為二氯甲烷。相對於式(320)化合物，前述有機溶劑的用量為3-50L/mol，在一些實施方式中為5-20L/mol。

在一些實施方式中，前述醯胺化反應縮合劑為苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽/酯、3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽/酯、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽或1-羥基苯并三唑中的一種或多種，在進一步的實施方式中為苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽/酯和1-羥基苯并三唑的混合物，其中苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽/酯和1-羥基苯并三唑為等莫耳用量。前述總的醯胺化反應縮合劑與式(316)所示化合物的莫耳比可以為1:1-3:1，在一些實施方式中為1.05:1-1.5:1。

前述三級胺可以為N-甲基嗎啉、三乙胺或N,N-二異丙基乙胺，在一些實施方式中為N-甲基嗎啉；前述三級胺與式(316)所示化合物的莫耳比可以為2:1-10:1，在一些實施方式中為2:1-5:1。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(314)化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式(314)化合物例如，可使用如下兩種色譜條件進行分離：(1)正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用二氯甲烷:甲醇=100:5-100:7梯度洗脫；以及(2)反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度洗脫。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(314)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

式(320)化合物可商購獲得，或者由所屬技術領域具有通常知識者使用已知的方法獲得。例如，當m1=m2=m3=3，n1=1，n3=2，且每個R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 、R₁₅ 均為H時，式(320)化合物可自阿法埃莎公司商購獲得。

本發明的siRNA綴合物也可以與藥學上可接受的其它輔料聯用，該輔料可以為本領域常規採用的各種製劑或化合物的一種或多種，詳情可參見上文關於本發明的藥物組合物的描述。 [本發明的siRNA、藥物組合物及綴合物的應用]

在一些實施方式中，本發明提供了一種預防和/或治療由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況的方法，該方法包括將有效量的本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物給予有需要的受試者。

通過將本發明的siRNA活性成分給予有需要的受試者，可以通過RNA干擾的機制達到預防和/或治療由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況的目的。因此，本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物可用於預防和/或治療由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況，或用於製備用於預防和/或治療由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況的藥物。

在一些實施方式中，由PCSK9基因異常表達引起的疾病或生理狀況指高膽固醇血症，以及由此引發的動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等心血管疾病。

本文所使用的術語“給藥/給予”是指通過使得至少部分地將本發明的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物定位於期望的位點以產生期望效果的方法或途徑，將本發明的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物放置入受試者體內。適於本發明方法的給藥途徑包括局部給藥和全身給藥。一般而言，局部給藥導致與受試者體循環相比將更多siRNA綴合物遞送至特定位點；而全身給藥導致將本發明的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物遞送至受試者的基本體迴圈。考慮到本發明可以提供預防和/或治療高膽固醇血症的手段，在一些實施方式中採用能夠將藥物遞送至肝臟的給藥方式。

可通過本領域已知的任何合適途徑向受試者給藥，前述途徑包括但不僅限於：口服或胃腸外途徑，如靜脈內給藥、肌肉內給藥、皮下給藥、經皮給藥、氣道給藥(氣霧劑)、肺部給藥、鼻部給藥、直腸給藥和局部給藥(包括口腔含化給藥和舌下給藥)。給藥頻率可以是每天、每週、每兩周、每三周、每個月、每兩個月、每三個月、每半年或每年1次或多次。

本發明記載之siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物的使用劑量可為本領域常規的劑量，前述劑量可以根據各種參數、尤其是受試者的年齡、體重和性別來確定。可在細胞培養或實驗動物中通過標準藥學程式測定毒性和療效，例如測定LD₅₀ (使50%的群體死亡的致死劑量)、ED₅₀ (在量反應中指能引起50%最大反應強度的劑量，在質反應中指能引起50%實驗物件出現陽性反應時的劑量)或IC₅₀ (量反應被抑制一半時抑制劑/藥物的濃度)。可基於由細胞培養分析和動物研究得到的資料得出人用劑量的範圍。

在給予本發明記載之siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物時，例如，對於雄性或雌性、3-5歲齡、體重2-6kg的食蟹猴，以siRNA的量計：(i)對於siRNA綴合物，其siRNA用量可以為0.001-100mg/kg體重，在一些實施方式中為0.01-50mg/kg體重，在一些實施方式中為0.05-20mg/kg體重，另一些實施方式中為0.1-15mg/kg體重，另一些實施方式中為0.1-10mg/kg體重；(ii)對於siRNA與藥學上可接受的載體形成的藥物組合物，其siRNA用量可以為0.001-50mg/kg體重，在一些實施方式中為0.01-10mg/kg體重，在一些實施方式中為0.05-5mg/kg體重，在一些實施方式中為0.1-3mg/kg體重。

在一些實施方式中，本發明提供了一種抑制肝細胞中PCSK9基因表達的方法，該方法包括將有效量的本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物與前述肝細胞接觸，將本發明的siRNA和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物導入前述肝細胞，通過RNA干擾的機制達到抑制肝細胞中PCSK9基因表達的目的。前述肝細胞可以選自SMMC-7721、HepG2、Huh7等肝癌細胞系或分離的肝原代細胞。在一些實施方式中，前述細胞為HepG2肝癌細胞。

採用本發明提供的方法抑制PCSK9基因在細胞中表達，所提供的修飾的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物中的siRNA用量一般是這樣的量：其足以減少靶基因的表達，並導致在靶細胞表面處1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或0.05nM至約5nM的細胞外濃度。達到該局部濃度所需的量將隨各種因素而變化，前述因素包括遞送方法、遞送部位、在遞送部位和靶細胞或組織之間的細胞層的數目、遞送途徑(局部還是全身)等。在遞送部位處的濃度可以顯著高於在靶細胞或組織的表面處的濃度。 [試劑盒]

本發明提供了一種試劑盒，前述試劑盒包含有效量的本發明的修飾的siRNA、藥物組合物和siRNA綴合物的至少一種。

在一些實施方式中，本文記載之試劑盒可在一個容器中提供修飾的siRNA。在一些實施方式中，本文記載之試劑盒可包含一個提供藥學上可接受的賦形劑的容器。在一些實施方式中，前述試劑盒中還可包含其它成分，如穩定劑或防腐劑等。在一些實施方式中，本文記載之試劑盒可在不同於提供本文前述修飾的siRNA的容器以外的其它容器中包含至少一種其它治療劑。在一些實施方式中，前述試劑盒可包含用於將修飾的siRNA與藥學上可接受的載體和/或輔料或其它成分(若有的話)進行混合的說明書。

在本發明的試劑盒中，前述修飾的siRNA和藥學上可接受的載體和/或輔料以及前述修飾的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物和/或綴合物，和/或藥學上可接受的輔料可以任何形式提供，例如液體形式、乾燥形式或凍乾形式。在一些實施方式中，前述修飾的siRNA和藥學上可接受的載體和/或輔料以及前述藥物組合物和/或綴合物和任選的藥學上可接受的輔料基本上純淨和/或無菌。在一些實施方式中，可在本發明的試劑盒中提供無菌水。

下面將通過實施例來進一步說明本發明，但是本發明並不因此而受到任何限制。 [實施例]

除非特別說明，以下實施例中所用到的試劑、培養基均為市售商品，所用到的核酸電泳、real-time PCR等操作均參照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))所記載的方法進行。

本發明合成的針對PCSK9基因的siRNA、siRNA綴合物或作為陰性對照的siRNA、siRNA綴合物轉染細胞時，使用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)作為轉染試劑，具體操作參照製造商提供的說明書。

若無其它說明，以下提供的試劑比例均按體積比(v/v)計算。實驗資料均以

(平均值±標準誤差)表示，資料分析採用Graphpad prism 6.0統計分析軟體。利用One-way ANOVA進行分析，分析方法選用Tukey進行組間比較，判斷組間差異是否具有顯著性，在One-way ANOVA方法下如果沒有顯著性差異，當總體P＜0.05時，利用T-test進行雙尾檢測，當p＜0.05時，兩組之間具有顯著性差異。 [製備例1 綴合物1的製備]

本製備例合成了表3中所示的綴合物1，其編號為L10-siPCSKa1M1S。該綴合物中所綴合的siRNA具有表3中對應於綴合物1的正義鏈和反義鏈序列。 [(1-1)L-10化合物的合成]

按照以下方法，合成了L-10化合物：

(1-1-1)綴合末端段GAL-5的合成

(1-1-1a)GAL-2的合成

將100.0g GAL-1(N-乙醯-D-半乳糖胺鹽酸鹽，CAS號：1772-03-8，購自寧波弘翔生化公司，463.8 mmol)溶於1000ml無水吡啶，冰水浴下加入540ml乙酸酐(購自Enox公司，5565.6mmol)，室溫攪拌反應1.5小時。將反應液倒入10L冰水中，減壓抽濾，濾餅用2L冰水洗滌後，加乙腈/甲苯混合溶劑(體積比乙腈:甲苯=1:1)至完全溶解，蒸乾溶劑，得到白色固體產品GAL-2 130.0g。 [(1-1-1b)GAL-3的合成]

將步驟(1-1-1a)中獲得的GAL-2(35.1g，90.0mmol)溶解於213ml無水1,2-二氯乙烷中，在冰水浴且氮氣保護條件下，加入24.0g三氟甲磺酸三甲基矽酯(TMSOTf，CAS號：27607-77-8，購自麥克林公司，108.0mmol)，室溫反應過夜。

在反應液中加入400ml二氯甲烷稀釋，以矽藻土過濾，再加入1L飽和碳酸氫鈉水溶液，攪拌均勻，分出有機相，水相用二氯乙烷萃取兩次，每次300ml，合併有機相，分別用300ml飽和碳酸氫鈉水溶液和300ml飽和食鹽水洗滌，分出有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到淺黃色黏稠糖稀狀產品GAL-3 26.9g。 [(1-1-1c)GAL-4的合成]

將步驟(1-1-1b)中獲得的GAL-3(26.9g，81.7mmol)溶於136ml無水1,2-二氯乙烷中，加入乾燥的4Å分子篩粉末30g，再加入9.0g 5-己烯-1-醇(CAS號：821-41-0，購自Adamas-beta公司，89.9mmol)，室溫下攪拌30分鐘，冰浴和氮氣保護下加入9.08g TMSOTf(40.9mmol)，室溫下攪拌反應過夜。過濾除去4 Å分子篩粉末，濾液中加入300ml二氯甲烷稀釋，以矽藻土過濾，再加入500ml飽和碳酸氫鈉水溶液攪拌10分鐘洗滌，分出有機相，水相用300ml二氯乙烷萃取一次，合併有機相並分別用300ml飽和碳酸氫鈉水溶液和300ml飽和食鹽水洗滌，分出有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到黃色糖稀狀產品GAL-4 41.3g，不進行純化直接進行下一步氧化反應。 [(1-1-1d)GAL-5的合成]

將按照步驟(1-1-1c)中描述的方法得到的GAL-4(14.9g，34.7mmol，)溶於77ml二氯甲烷和77ml乙腈的混合溶劑中，分別加入103ml去離子水和29.7g高碘酸鈉(CAS號：7790-28-5，購自阿拉丁公司，138.8mmol)，冰水浴下攪拌10分鐘，加入三氯化釕(CAS號：14898-67-0，購自安耐吉公司，238mg，1.145mmol)，室溫反應過夜。反應液加入300ml水稀釋攪拌，加飽和碳酸氫鈉調pH約為7.5，分出並棄去有機相，水相用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，棄去有機相。水相用檸檬酸固體調節pH約為3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到白色泡沫狀固體產品GAL-5 6.85g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.01 (br, 1H), 7.83 (d,J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 4.96 (dd,J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.49 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.07 – 3.95 (m, 3H), 3.92 – 3.85 (m, 1H), 3.74 – 3.67 (m, 1H), 3.48 – 3.39 (m, 1H), 2.20 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.55 – 1.45 (m, 4H).

(1-1-2)L-8的合成：

。

將J-0(9.886g，52.5mmol，商購自阿法埃沙公司)和步驟(1-1-1)中得到的GAL-5(72.819g，162.75mmol，由多批次產物合併而得)溶於525ml二氯甲烷，加入二異丙基乙胺(DIEA，44.782g，346.50mmol)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽/酯(PyBOP，90.158g，173.25mmol)和羥基苯并三唑(HOBt，23.410g，173.25mmol)，室溫下反應4h，加入20ml飽和碳酸氫鈉和200ml飽和食鹽水進行洗滌，水相用二氯甲烷萃取2次，每次100ml，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品。純化使用200-300目正相矽膠，以10wt%三乙胺中和矽膠酸性，1wt‰三乙胺平衡管柱，以二氯甲烷:甲醇=100:25-100:40梯度洗脫，收集產物洗脫液，減壓蒸乾溶劑得到純品L-8 38.8g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.84 (d,J = 9.0 Hz, 3H), 7.27 – 7.23 (m, 1H), 7.13 – 7.18 (m, 1H), 5.22 (d,J = 3.1 Hz, 3H), 4.97 (dd,J = 11.3, 3.1 Hz, 3H), 4.48 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.09 – 3.98 (m, 9H), 3.88 (dd,J = 19.3, 9.3 Hz, 3H), 3.75 – 3.66 (m, 3H), 3.44 – 3.38 (m, 3H), 3.17 – 3.30 (m, 4H), 3.10 – 2.97 (m, 4H), 2.35 – 2.20 (m, 6H), 2.15 – 2.08 (m, 9H), 2.07 – 1.98 (m, 13H), 1.94 – 1.87 (m, 9H), 1.81 – 1.74 (m, 9H), 1.65 – 1.42 (m, 18H). MS m/z：C₈₅ H₁₁₉ N₇ O₃₀ ，[M+H]⁺ ，理論：1477.59，實測：1477.23。 [(1-1-3a)A-1的合成]

。

將DMTrCl(4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯，101.65g，300mmol)溶於1000ml無水吡啶中，加入DL-甘油酸鈣水合物(28.63g，100mmol)，在45℃反應20h，將反應液過濾，濾餅用200ml DCM洗滌，濾液減壓濃縮至乾，剩餘物用500ml二氯甲烷重新溶解，0.5M三乙胺磷酸鹽(pH=7-8)洗滌2次，每次200ml，水相以二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸乾溶劑，200-300目正相矽膠柱純化，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.35-1:1:1:0.55梯度洗脫，收集產物洗脫液，減壓蒸乾溶劑，600ml二氯甲烷重新溶解，以200ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌1次，水相用200ml二氯甲烷萃取1次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸乾溶劑，真空油泵減壓下過夜，得到白色固體產品A-1 50.7g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (ddd, J = 6.5, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.40 – 7.28 (m, 7H), 6.89 – 6.81 (m, 4H), 4.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.36 – 4.24 (m, 1H), 4.29 (s, 6H), 3.92 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.67 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 2.52 (q, J = 6.3 Hz, 6H), 1.03 (t, J = 6.3 Hz, 9H). MS m/z：C₂₄ H₂₃ O₆ ，[M-H]^- ，理論：407.15，實測：406.92。

(1-1-3b)L-7的合成：

。

將步驟(1-1-2)中獲得的L-8(40g，27.09mmol，由多批次產物合併而得)和步驟(1-1-3a)中獲得的A-1(41.418g，81.27mmol)混合，溶於271ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)(24.318g，81.37mmol)，再加入二異丙基乙胺(21.007g，162.54mmol)，25℃下攪拌反應1.5h，用800ml飽和碳酸氫鈉洗滌有機相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次50ml，以150ml飽和食鹽水洗滌有機相，水相以50ml二氯甲烷萃取1次，合併有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，真空油泵發泡乾燥過夜，得到粗品。柱純化使用2kg 200-300目正相矽膠，以200ml三乙胺中和矽膠酸性，以含1wt%三乙胺的石油醚平衡管柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲醯胺=1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脫，收集產物洗脫液，減壓蒸乾溶劑得到純品L-7 40.4g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.90 – 7.78 (m, 4H), 7.75 – 7.64 (m, 1H), 7.38 – 7.18 (m, 9H), 6.91 – 6.83 (m, 4H), 5.25 – 5.10 (m, 4H), 4.97 (dd,J = 11.2, 3.2 Hz, 3H), 4.48 – 4.30 (m, 4H), 4.02 (s, 9H), 3.93 – 3.84 (m, 3H), 3.76 – 3.66 (m, 9H), 3.45 – 3.35 (m, 3H), 3.24 – 2.98 (m, 10H), 2.30 – 2.20 (m, 2H), 2.11 – 1.88 (m, 31H), 1.80 – 1.40 (m, 28H). MS m/z：C₉₀ H₁₂₈ N₇ O₃₅ ，[M-DMTr]⁺ ，理論：1564.65，實測：1564.88。

(1-1-4)L-9的合成：

。

將步驟(1-1-3b)中獲得的L-7(40g，21.4247mmol)、丁二酸酐(4.288g，42.8494mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，5.235g，42.8494mmol)混合溶於215ml二氯甲烷，再加入二異丙基乙胺(DIEA，13.845g，107.1235mmol)，25℃下攪拌24h，800ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌反應液，水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合併有機相減壓蒸乾得到粗品。柱純化使用1kg 200-300目正相矽膠，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷平衡管柱，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇=100:18-100:20梯度洗脫，收集產物洗脫液，減壓蒸乾溶劑得到純品L-9綴合分子 31.0g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.58 (d,J = 4.2 Hz, 1H), 7.94 – 7.82 (m, 3H), 7.41 – 7.29 (m, 5H), 7.22 (d,J = 8.1 Hz, 5H), 6.89 (d,J = 8.3 Hz, 4H), 5.49 – 5.37 (m, 1H), 5.21 (d,J = 3.0 Hz, 3H), 4.97 (d,J = 11.1 Hz, 3H), 4.49 (d,J = 8.2 Hz, 3H), 4.02 (s, 9H), 3.88 (dd,J = 19.4, 9.4 Hz, 3H), 3.77 – 3.65 (m, 9H), 3.50 – 3.39 (m, 6H), 3.11 – 2.90 (m, 5H), 2.61 – 2.54 (m, 4H), 2.47 – 2.41 (m, 2H), 2.26 – 2.17 (m, 2H), 2.15 – 1.95 (m, 22H), 1.92 – 1.84 (m, 9H), 1.80 – 1.70 (m, 10H), 1.65 – 1.35 (m, 17H), 1.31 – 1.19 (m, 4H), 0.96 (t,J = 7.1 Hz, 9H). MS m/z：C₉₄ H₁₃₂ N₇ O₃₈ ，[M-DMTr]⁺ ，理論：1664.72，實測：1665.03。

(1-1-5)L-10化合物的合成：

。

此步驟中，通過將L-9綴合分子連接至固相載體，製備了L-10化合物。

將步驟(1-1-4)中獲得的L-9綴合分子(22.751g，11mmol)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽/酯(HBTU，6.257g，16.5mmol)和二異丙基乙胺(DIEA，2.843g，22mmol)混合，溶於900ml乙腈，室溫攪拌5分鐘，向反應液中加入氨甲基樹脂(88g，100-200目，氨基載量400μmol/g，購自南開和成公司)，25℃下進行搖床反應，轉速150轉/分鐘，反應18h後過濾，濾餅以DCM洗滌2次，每次300ml，乙腈洗滌3次，每次300ml，真空油泵乾燥18h，隨後再按照表2中示出的投料配比加入原料(CapA、CapB、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和乙腈)進行蓋帽反應。25℃下置於搖床上，轉速150轉/分鐘，反應5h，反應液過濾，濾餅用乙腈洗滌3次，每次300ml，減壓蒸發溶劑至乾，真空油泵減壓下乾燥過夜，得到L-10化合物(即，連接固相載體的L-9綴合分子)102g，載量90.8μmol/g。

表2 蓋帽反應投料配比

原料	用量	規格	批號	生產廠家
CapA	1980ml	——	——	——
CapB	220ml	——	——	——
DMAP	1.100g	分析純	I1422139	Aladdin
乙腈	220ml	光譜純	O15161001	上海星可

其中，CapA和CapB為蓋帽試劑溶液，CapA為20體積% N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶與乙腈的體積比為3:5；CapB為20體積%乙酸酐的乙腈溶液。 [(1-2)合成綴合物1的正義鏈]

通過固相亞磷醯胺法，利用上述步驟製備的L-10化合物起始迴圈，按照正義鏈核苷酸排布順序自3'-5'方向逐一連接核苷單體，合成表3中的siRNA綴合物1的正義鏈。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應。其中，兩個核苷酸之間採用磷酸酯連接時，連接後一個核苷單體時，包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化四步反應。兩個核苷酸之間採用硫代磷酸酯連接時，連接後一個核苷單體時，包括保護、偶聯、蓋帽、硫化四步反應。合成條件給定如下：核苷單體以0.1M濃度的乙腈溶液提供，每一步的脫保護反應的條件相同，即溫度為25℃，反應時間為70秒，脫保護試劑為二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3% v/v)，二氯乙酸與固相載體上4,4'-二甲氧基三苯甲基保護基的莫耳比為5:1。

每一步偶聯反應條件均相同，包括溫度為25℃，固相載體上連接的核酸序列與核苷單體的莫耳比為1:10，固相載體上連接的核酸序列和偶聯試劑的莫耳比為1:65，反應時間為600秒，偶聯試劑為5-乙硫基-1H-四氮唑(5-(Ethylthio)-1H-tetrazole，ETT)的0.5M乙腈溶液。

每一步蓋帽條件均相同，包括溫度為25℃，反應時間為15秒。蓋帽試劑溶液為莫耳比為1:1的CapA和CapB的混合溶液，蓋帽試劑與固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為乙酸酐:N-甲基咪唑:固相載體上連接的核酸序列=1:1:1。

每一步氧化反應條件相同，包括溫度為25℃，反應時間為15秒，氧化試劑為濃度為0.05M的碘水。碘與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為30:1。反應在四氫呋喃:水:吡啶=3:1:1的混合溶劑中進行。

每一步硫化反應的條件相同，包括溫度為25℃，反應時間為300秒，硫化試劑為氫化黃原素。硫化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為120:1。反應在乙腈:吡啶=1:1的混合溶劑中進行。

待最後一個核苷單體連接完成後，依次對固相載體上連接的核酸序列進行切割、脫保護、純化、脫鹽，隨後凍乾獲得正義鏈，其中，切割和脫保護條件如下：將合成的連接有載體的核苷酸序列加入濃度為25wt%的氨水中，氨水用量為0.5ml/μmol，在55°C反應16h，過濾去除剩餘載體，將上清液真空濃縮至乾。

純化與脫鹽條件如下：利用製備型離子色譜純化柱(Source 15Q)，通過NaCl的梯度洗脫，實現核酸的純化。具體而言為：洗脫劑A：20mM磷酸鈉(pH 8.1)，溶劑為水/乙腈=9:1(體積比)；洗脫劑B：1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉(pH 8.1)，溶劑為水/乙腈=9:1(體積比)；洗脫梯度：洗脫劑A:洗脫劑B=100:0-50:50梯度洗脫。收集產品洗脫液後合併，採用反相色譜純化柱進行脫鹽，具體條件包括採用葡聚糖凝膠柱進行脫鹽，填料為葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)，以去離子水洗脫。

檢測方法如下：使用離子交換色譜(IEX-HPLC)檢測上述正義鏈的純度，使用液質聯用(LC-MS)分析分子量。實測值與理論值相符，表明所合成的是3'末端綴合了L-9綴合分子的正義鏈SS。 [(1-3)合成綴合物1的反義鏈]

通過固相亞磷醯胺法，利用通用固相載體(UnyLinker™ loaded NittoPhase^® HL Solid Supports，Kinovate Life Sciences公司)起始迴圈，合成表3中綴合物1的反義鏈。固相合成方法中的脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化反應條件，切割和脫保護，純化與脫鹽條件與合成正義鏈相同。隨後凍乾獲得反義鏈。反義鏈的純度採用離子交換色譜(IEX-HPLC)進行檢測，分子量採用液質聯用(LC-MS)進行分析。其結果，實測值與理論值相符，表明所合成的是具有目標序列的反義鏈AS。 [(1-4)合成綴合物1]

對於綴合物1，將正義鏈與反義鏈分別溶於注射用水中，得到40mg/mL的溶液，以等莫耳比混合，50°C加熱15min，室溫冷卻後，得到退火後的產品，凍乾，得到凍乾粉。使用超純水(Milli-Q超純水儀，電阻率18.2MΩ*cm(25℃))將綴合物稀釋至濃度為0.2mg/mL後，利用液質聯用儀(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，購於Waters公司，型號：LCT Premier)進行分子量檢測。實測值與理論值一致，說明所合成的siRNA綴合物1是目標設計的帶有L-9綴合分子的雙鏈核酸序列。其結構如式(403)所示，所綴合的siRNA序列如表3中所示的對應於綴合物1(又稱L10-siPCSKa1M1S)的序列。 [製備例2 綴合物2-7的製備]

採用與製備例1相同的方法，合成了表3中所示的綴合物2-7，並進行分子量檢測，不同的是，合成中所依據的正義鏈和反義鏈序列分別為表3所示的對應於綴合物2、綴合物3、綴合物4、綴合物5、綴合物6或綴合物7中所綴合的siRNA的正義鏈和反義鏈的序列。從而分別得到綴合物2-7。

表3列出了綴合物編號和siRNA序列組成。

表3 siRNA綴合物

綴合物	編號	序列方向5'- 3'	SEQ ID NO
綴合物1	L10-siPCSKa1M1S	正義鏈	AmsAmsGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm	25
反義鏈	GmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm	26
綴合物2	L10-siPCSKb1M1S	正義鏈	UmsUmsUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm	85
反義鏈	UmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm	86
綴合物3	L10-siPCSKc1M1S	正義鏈	GmsCmsCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm	145
反義鏈	UmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm	146
綴合物4	L10-siPCSKd1M1S	正義鏈	CmsUmsGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm	205
反義鏈	AmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm	206
綴合物5	L10-siPCSKe1M1S	正義鏈	GmsGmsUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm	265
反義鏈	AmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm	266
綴合物6	L10-siPCSKf1M1S	正義鏈	GmsUmsGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm	325
反義鏈	UmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm	326
綴合物7	L10-siPCSKg4M5S	正義鏈	CmsUmsAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm	397
反義鏈	AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAmCmAfGmGfUmCfUmAmGmsAmsAm	398

[製備例3 合成siRNA序列]

採用與製備例1相同的方法合成表4中所示的siRNA 1，不同在於： 1)對於正義鏈，利用通用固相載體(UnyLinker^™ loaded NittoPhase^® HL Solid Supports，Kinovate Life Sciences公司)起始迴圈； 2)對於反義鏈，siRNA 1的序列與綴合物1中所綴合的siRNA反義鏈序列相比，siRNA 1的反義鏈在5'-末端第一個核苷酸處具有5'-磷酸。因此，在按照固相亞磷醯胺法製備反義鏈的過程中，連接反義鏈最後一個核苷單體後，再經脫保護、偶聯、蓋帽、氧化四步反應將CPR-I單體(蘇州吉瑪，貨號Cat#13-2601-XX)連接至反義鏈5'末端，形成5'-磷酸酯修飾。

(CPR-I)

該連接中，使用的脫保護、偶聯、蓋帽、氧化反應條件，切割和脫保護，純化與脫鹽條件與合成正義鏈相同。

採用與製備siRNA 1 相同的方法，製備siRNA 2，不同在於，合成中所依據的siRNA正義鏈和反義鏈的核酸序列分別為如表4所示的對應於siRNA 2的正義鏈和反義鏈序列，從而得到siRNA 2。

採用與製備siRNA 1相同的方法，製備siRNA 3-6，不同在於，合成中所依據的siRNA正義鏈和反義鏈的核酸序列分別為如表4所示的對應於siRNA 3、siRNA 4、siRNA 5或siRNA 6的正義鏈和反義鏈序列，其中這些siRNA的反義鏈5'-末端第一個核苷酸處具有5'-硫代磷酸酯修飾。因此，在連接CPR-I單體時，以硫化反應條件代替上述氧化反應條件，可制得具有5'-硫代磷酸酯修飾的反義鏈。從而分別得到siRNA 3、siRNA 4、siRNA 5或siRNA 6。

表4列出了siRNA編號和siRNA序列組成。

表4 siRNA序列

siRNA	編號	序列方向5'- 3'	SEQ ID NO
siRNA 1	siPCSKa1M1SP	正義鏈	AmsAmsGmCmAmAmGfCfAfGmAmCmAmUmUmUmAmUmCm	361
反義鏈	PGmsAfsUmAmAmAfUmGmUmCmUmGmCmUfUmGfCmUmUmsGmsGm	362
siRNA 2	siPCSKb1M1SP	正義鏈	UmsUmsUmGmUmAmGfCfAfUmUmUmUmUmAmUmUmAmAm	363
反義鏈	PUmsUfsAmAmUmAfAmAmAmAmUmGfCmUfAmCmAmAmAmsAmsCm	364
siRNA 3	siPCSKc1M1SPs	正義鏈	GmsCmsCmUmGmGmAfGfUfUmUmAmUmUmCmGmGmAmAm	365
反義鏈	PsUmsUfsCmCmGmAfAmUmAmAmAmCmUmCfCmAfGmGmCmsCmsUm	366
siRNA 4	siPCSKd1M1SPs	正義鏈	CmsUmsGmUmUmUmUfGfCfUmUmUmUmGmUmAmAmCmUm	367
反義鏈	PsAmsGfsUmUmAmCfAmAmAmAmGmCmAmAfAmAfCmAmGmsGmsUm	368
siRNA 5	siPCSKe1M1SPs	正義鏈	GmsGmsUmUmUmUmGfUfAfGmCmAmUmUmUmUmUmAmUm	369
反義鏈	PsAmsUfsAmAmAmAfAmUmGmCmUmAmCmAfAmAfAmCmCmsCmsAm	370
siRNA 6	siPCSKf1M1SPs	正義鏈	GmsUmsGmAmCmUmUfUfUfUmAmAmAmAmUmAmAmAmAm	371
反義鏈	PsUmsUfsUmUmAmUfUmUmUmAmAmAmAmAfGmUfCmAmCmsCmsAm	372

[實驗例1 siRNA在體外psiCHECK系統中的抑制活性及脫靶效應檢測]

本實驗例通過在體外psiCHECK系統中檢測siRNA 1-6各個反義鏈對其在靶質粒的表達抑制，各個siRNA正義鏈、反義鏈種子區或正義鏈種子區對其脫靶質粒的表達抑制，評價本發明的siRNA的在靶活性及脫靶效應。

根據Kumico Ui-Tei et.al., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151描述的方法，構建檢測質粒，將前述檢測質粒與待測siRNA共轉染至HEK293A細胞中，通過雙螢光素酶報告基因的表達水平，來反映siRNA的在靶活性及脫靶效應。具體步驟如下：

[1] 構建檢測質粒

採用psiCHECK^TM -2(Promega^TM )質粒構建了4類檢測質粒，其中GSCM表示在靶質粒，PSCM、GSSM、PSSM表示脫靶質粒：

(1)GSCM，用於檢測siRNA反義鏈的在靶活性，GSCM含有一段目標序列，該目標序列含有與待測siRNA反義鏈序列完全互補的區域，其中，siRNA 1、2、4、5和6對應的GSCM中的目標序列如SEQ ID NO: 373所示： 5'-GGCGTGCCTGCCAAGCTCACACAGCAGGAACTGAGCCAGAAACGCAGATTGGGCTGGCTCTGAAGCCAAGCCTCTTCTTACTTCACCCGGCTGGGCTCCTCATTTTTACGGGTAACAGTGAGGCTGGGAAGGGGAACACAGACCAGGAAGCTCGGTGAGTGATGGCAGAACGATGCCTGCAGGCATGGAACTTTTTCCGTTATCACCCAGGCCTGATTCACTGGCCTGGCGGAGATGCTTCTAAGGCATGGTCGGGGGAGAGGGCCAACAACTGTCCCTCCTTGAGCACCAGCCCCACCCAAGCAAGCAGACATTTATCTTTTGGGTCTGTCCTCTCTGTTGCCTTTTTACAGCCAACTTTTCTAGACCTGTTTTGCTTTTGTAACTTGAAGATATTTATTCTGGGTTTTGTAGCATTTTTATTAATATGGTGACTTTTTAAAATAAAAACAAACAAACGTTGTCCTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO: 373)；

siRNA 3對應的GSCM中的目標序列如SEQ ID NO: 374所示： 5'-GCGTGGCCAAGGGTGCCAGCATGCGCAGCCTGCGCGTGCTCAACTGCCAAGGGAAGGGCACGGTTAGCGGCACCCTCATAGGCCTGGAGTTTATTCGGAAAAGCCAGCTGGTCCAGCCTGTGGGGCCACTGGTGGTGCTGCTGCCCCTGGCGGGTGGGTACAGCCGCGTCCTCAACGCCGCCTGCCAGCGCCTGGCGAGGGCTGGGGTCGTGCTGGTCACCGCTGCCGGCAACTTCCGGGACGATGCCTGCCTCTACTCCCCAGCCTCAGCTCCCGAGGTCATCACAGTTGGGGCCACCAATGCCCAAGACCAGCCGGTGACCCTGGGGACTTTGGGGACCAACTTTGGCCGCTGTGTGGACCTCTTTGCCCCAGGGGAGGACATCATTGGTGCCTCCAGCGACTGCAGCACCTGCTTTGTGTCACAGAGTGGGACATCACAGGCTGCTGCCCACGTGGCTGGCATTGCAGCCATGATGCTGTCTGCCGAGCCGGAGCTCACCCTGGCCGAGTTGAGGCAGAGACTGATCCACTTCTCTGCCAAAGATGTCATCAATGAGGCCTGGTTCCCTGAGGACCAGCGGGTACTG-3'(SEQ ID NO: 374)。

(2)PSCM，用於檢測正義鏈的脫靶效應，含有與待測siRNA反義鏈序列完全一致的目標序列，各siRNA對應的PSCM中的目標序列如表5a所示：

表5a siRNA對應的PSCM中的目標序列

siRNA	PSCM目標序列(序列方向5'- 3')	SEQ ID NO
siRNA 1	GATAAATGTCTGCTTGCTTGG	375
siRNA 2	TTAATAAAAATGCTACAAAAC	376
siRNA 3	TTCCGAATAAACTCCAGGCCT	377
siRNA 4	AGTTACAAAAGCAAAACAGGT	378
siRNA 5	ATAAAAATGCTACAAAACCCA	379
siRNA 6	TTTTATTTTAAAAAGTCACCA	380

(3)GSSM，用於檢測反義鏈種子區的脫靶效應，各siRNA對應的GSSM中的目標序列如表5b所示：

表5b siRNA對應的GSSM中的目標序列

siRNA	GSSM目標序列(序列方向5'- 3')	SEQ ID NO
siRNA 1	AACCTACCTACTCCATTTATC	381
siRNA 2	TGGGGTGCTACGGTTTATTAA	382
siRNA 3	CTTAAGTTCTGGGATTCGGAA	383
siRNA 4	CAAGTGGGGTAGGTTGTAACT	384
siRNA 5	GTTTGGGGTGCTAATTTTTAT	385
siRNA 6	GTTGTCAGGGGGCAAATAAAA	386

(4)PSSM，用於檢測正義鏈種子區的脫靶效應，各siRNA對應的PSSM中的目標序列如表5c所示：

表5c siRNA對應的PSSM中的目標序列

siRNA	PSSM目標序列(序列方向5'- 3')	SEQ ID NO
siRNA 1	TCGCCCGTGAGGCTTGCTTTT	387
siRNA 2	GGCCGCCCCCGGCTACAAACA	388
siRNA 3	GGAATCCGCCCCTCCAGGCAG	389
siRNA 4	CTGGCACCCCTCAAAACAGTG	390
siRNA 5	CGCCCCCGTAGACAAAACCAC	391
siRNA 6	GGGGCGGGGCCAAAGTCACAC	392

將上述目標序列單一拷貝分別選殖到psiCHECK^TM -2質粒的Xho I/Not I位點。

[2] 細胞培養及轉染

(1)共轉染GSCM和siRNA 1。

用含有10%的胎牛血清(FBS，HyClone公司)及0.2體積%的青鏈黴素雙抗(Penicillin-Streptomycin，HyClone公司)的H-DMEM完全培養基(HyClone公司)，於37℃在含5% CO₂ /95%空氣的培養箱中培養HEK293A細胞(購自南京科佰生物科技有限公司)。

將HEK293A細胞以8 × 10³ 細胞/孔接種於96孔板中，16h後細胞生長密度達到70-80%時，吸盡培養孔中H-DMEM完全培養基，每孔加入80μl Opti-MEM培養基(GIBCO公司)繼續培養1.5h。

用DEPC化水將GSCM檢測質粒稀釋成200 ng/μl的檢測質粒工作液；用DEPC化水將siRNA 1分別配置成1000 nM、333 nM、111 nM、37.0 nM、12.3 nM、4.12 nM、1.37 nM、0.46 nM、0.15 nM、0.05 nM和0.017 nM共11個不同濃度的siRNA工作液。

分別配置A1-A11溶液，每份A1-A11溶液依次含有上述11個濃度的siRNA工作液1μl、檢測質粒工作液0.05 μl(含檢測質粒10 ng)和10μl Opti-MEM培養基。

配製B溶液，每份B溶液含有0.2 μl Lipofectamine™ 2000和10μl Opti-MEM培養基。

配製C溶液，每份C溶液含有檢測質粒工作液0.05 μl(含檢測質粒10 ng)和10μl Opti-MEM培養基。

分別將一份B溶液依次與一份A1-A11溶液和一份C溶液混合，室溫下培養20min，得到12個轉染複合物X1-X12。每個轉染複合物配置3份。

在培養孔中，分別加入轉染複合物X1-X11，均勻混合，加入量為20μl/孔，相同siRNA濃度的3份轉染複合物分別加入三個不同的培養孔中，得到siRNA終濃度分別為10nM、3.33nM、1.11 nM、0.37 nM、0.123 nM、0.0412 nM、0.0137 nM、0.0046 nM、0.0015nM、0.0005nM和0.00017nM的共轉染混合物，記為測試組1-11。

在另外三個培養孔中，分別加入轉染複合物X12，得到不含siRNA的轉染混合物，加入量為20μl/孔，記為對照組。

將含siRNA的共轉染混合物和不含siRNA的轉染混合物在培養孔中轉染4h後，每孔補加100μl 含20% FBS的H-DMEM完全培養基。將96孔板置於CO₂ 培養箱繼續培養24h。

(2)共轉染其它siRNA和質粒。

採用與共轉染GSCM和siRNA 1相同的方法共轉染GSCM和siRNA 2-6，不同的是依次用siRNA 2-6代替siRNA1。

採用與共轉染GSCM和siRNA 1-6相同的方法共轉染PSCM和siRNA 1-6，不同的是用PSCM代替GSCM。

採用與共轉染GSCM和siRNA 1-6相同的方法共轉染GSSM和siRNA 1-6，不同的是用GSSM代替GSCM。

採用與共轉染GSCM和siRNA 1-6相同的方法共轉染PSSM和siRNA 1-6，不同的是用PSSM代替GSCM。

[3] 檢測

吸去培養孔中的培養基，每孔加入150μl的Dual-Glo^® Luciferase試劑與H-DMEM混合溶液(體積比1:1)，充分混勻，室溫培養10min後，轉移120μl混合液到96孔酶標板上，使用Synergy II多功能酶標儀(BioTek公司)讀取酶標板各孔中Firefly化學發光值(Fir)；再向酶標板各孔加入60μl Dual-Glo^® Stop & Glo^® 試劑，充分混勻，室溫培養10min後，按照讀取Fir的排布方式，使用酶標儀讀取酶標板各孔中Renilla 的化學發光值(Ren)。

計算酶標板各孔發光比值Ratio = Ren / Fir，各測試組或對照組的發光比值Ratio(測試)或Ratio(對照)為三個培養孔Ratio的平均值；以對照組的發光比值為基準，對各測試組的發光比值進行歸一化，獲得Ratio(測試)/Rati(對照)的比值R，以此表示Renilla 報告基因的表達水平，即相對殘留活性。siRNA的抑制率為(1-R) × 100%。

依據轉染了不同的siRNA (siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3、siRNA 4、siRNA 5或siRNA 6)後，psiCHECK系統中報告基因Renilla 的相對殘留活性，利用Graphpad 5.0軟體的非線性回歸分析功能擬合log(inhibitor) vs. response—Variable slope (four parameters)劑量-效應曲線，圖1A-1F依次為siRNA 1-6的劑量-效應曲線。其中以siRNA濃度的對數值(lg nM)為橫坐標，以Renilla 的相對殘留活性(%)為縱坐標，每個圓點代表相對於對照組而言，測試組3個培養孔中Renilla 的相對殘留活性的平均值。

根據擬合的劑量-效應曲線對應的函數，計算待測siRNA靶向GSCM的IC₅₀ 值，前述函數如下，

式中： Y是比值R，即Renilla 的相對殘留活性， X為轉染siRNA濃度的對數值， Bot是穩態期底部的Y值， Top是穩態期頂部的Y值， X'是當Y在底部到頂部之間一半時對應的X值，而HillSlope則是曲線在X'處的斜率。

由該劑量-效應曲線和對應的函數，確定當Y=50%時對應的X₅₀ 值，計算獲得各siRNA的IC₅₀ 值=10^X₅₀ (nM)，IC₅₀ 值及R² 值總結於表6中。

表6 siRNA對GSCM的IC₅₀ 及R² 值

siRNA	編號	IC₅₀	R²
siRNA 1	siPCSKa1M1SP	0.0544nM	0.9993
siRNA 2	siPCSKb1M1SP	0.0291 nM	0.9979
siRNA 3	siPCSKc1M1SPs	0.0341 nM	0.9995
siRNA 4	siPCSKd1M1SPs	0.0194 nM	0.9974
siRNA 5	siPCSKe1M1SPs	0.0561 nM	0.9956
siRNA 6	siPCSKf1M1SPs	0.0400 nM	0.9927

從表6及圖1A-1F可以看出，本發明提供的siRNA在體外HEK293A細胞中有較高的抑制活性，IC₅₀ 在0.0194-0.0561 nM之間。

採用上述相同的方法，依次獲得siRNA 1-6對其各自對應的PSCM、GSSM和PSSM的劑量-效應曲線，不同的是，分別用PSCM、GSSM和PSSM代替GSCM。結果表明，每一個siRNA在各個濃度下，對其對應的脫靶質粒PSCM、GSSM和PSSM均沒有抑制作用。

上述結果表明本發明的siRNA具有良好的靶向特異性，正義鏈、反義鏈種子區及正義鏈種子區均沒有明顯的脫靶效應。 [實驗例2 siRNA綴合物在非人靈長類(NHP)中的藥效評價]

將3-4歲的普通級食蟹猴(體重2.4 - 3.1 kg)按照體重分為2組，每組4隻，雌雄各半，分別向各組食蟹猴單次皮下注射綴合物4或5。

將4-5歲的普通級食蟹猴(體重4.0 - 5.5 kg)按照體重分為3組，每組3隻，皆為雄性，分別向各組食蟹猴單次皮下注射綴合物1、2或7。

各綴合物分別用無菌氯化鈉注射液配置成9mg/ml(以siRNA計，下同)的溶液，每隻動物給藥體積1ml/kg，給藥劑量為9mg/kg。給藥前n天定義為D-n，給藥當日定義為D1，給藥後第n日定義為Dn。 [(2-1)肝組織中PCSK9 mRNA檢測]

在D-7和D15分別對各組施予了綴合物1、綴合物2、綴合物4、綴合物5或綴合物7的食蟹猴實施肝臟穿刺術，每次採集肝臟組織約2×2×8 mm³ ，保存於含1ml RNAlater保存液(Sigma Aldrich公司)的1.5mL無菌EP管中，在4℃冰箱放置24 h後，轉移到-80℃保存。

隨後用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根據說明書總RNA提取的操作步驟提取得到肝組織總RNA。

對於每個動物肝組織提取的總RNA，分別取1μg總RNA作為反轉錄的範本，使用反轉錄試劑盒Goldenstar^TM RT6 cDNA Synthesis Kit(購自北京擎科新業生物技術有限公司，貨號TSK301M)提供的試劑，其中選取Goldenstar^TM Oligo (dT)₁₇ 作為引子（primer），按試劑盒說明書中反轉錄操作步驟配置反轉錄反應體系20μl，對上述各個肝臟的總RNA進行反轉錄。反轉錄的條件為：將各反轉錄反應體系置於50℃培養50min，然後85℃培養5min，最後4℃培養30s，反應結束後，向各反轉錄反應體系加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。

對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl作為qPCR的範本，使用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒(購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B)提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因PCSK9和內參基因GAPDH的PCR引子序列如表7所示，每條引子的終濃度為0.25μM。將各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為95℃預變性10min，然後95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因PCSK9和內參基因GAPDH的產物W。產物W隨即依次經過95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s的培養，即時螢光定量PCR儀分別收集產物W中目標基因PCSK9和內參基因GAPDH的溶解曲線，得到目標基因PCSK9和內參基因GAPDH的Ct值。

表7 引子序列

基因	上游引子 (5'-3'方向)	下游引子 (5'-3'方向)
猴PCSK9	GAAGGGGAACACAGACCAGG(SEQ ID NO: 393)	CTCCATCAGGCCACAGTGAA(SEQ ID NO: 394)
猴GAPDH	GGGAGCCAAAAGGGTCATCA(SEQ ID NO: 395)	CGTGGACTGTGGTCATGAGT(SEQ ID NO: 396)

採用比較Ct(ΔΔCt)法，對D15和D-7目標基因PCSK9的表達量進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(D15) = Ct(D15目標基因) – Ct(D15內參基因) ΔCt(D-7) = Ct(D-7目標基因) – Ct(D-7內參基因) ΔΔCt(D15) = ΔCt(D15) - ΔCt(D-7平均) ΔΔCt(D-7) = ΔCt(D-7) - ΔCt(D-7平均) 其中，ΔCt(D-7平均)是給藥前各個動物的ΔCt(D-7)的算術平均值。從而，每個動物均對應一個ΔΔCt(D15)和ΔΔCt(D-7)。

以一個動物的D-7為基準，對該動物D15 PCSK9 mRNA的表達水平進行歸一化，定義D-7 PCSK9 mRNA表達水平為100%， PCSK9 mRNA相對表達水平 = 2^(-ΔΔCt(D15)) × 100%，綴合物對PCSK9 mRNA的抑制率 = (1 - 2^(-ΔΔCt(D15))) × 100%，對於施予相同綴合物的組，綴合物對PCSK9 mRNA的抑制率為本組中各動物對應的抑制率的算術平均值。

各綴合物對肝臟PCSK9 mRNA的抑制率如表8所示。

表8 綴合物對PCSK9 mRNA的抑制率

綴合物	編號	抑制率 %
綴合物1	L10-siPCSKa1M1S	79 ± 4
綴合物2	L10-siPCSKb1M1S	68 ± 11
綴合物4	L10-siPCSKd1M1S	81 ± 6
綴合物5	L10-siPCSKe1M1S	65 ± 18
綴合物7	L10-siPCSKg4M5S	56 ± 22

由表8可以看出，單次給藥9 mg/kg，相對於給藥前第7天，給藥後第15天，siRNA綴合物對PCSK9 mRNA的抑制率均高於56%，其中綴合物1和綴合物4對NHP肝組織中PCSK9 mRNA的抑制率分別高達79%和81%。 [(2-2)血清中PCSK9蛋白含量的檢測]

對於施予綴合物4的NHP，在給藥前D-15、D-9和D1各取一次靜脈血，在給藥後D3、D8、D14、D22和D29各採集一次靜脈血，之後每週採血一次，持續採血18周至D127。

對於施予綴合物1或7的NHP，在給藥前D-14、D-7和D1各取一次靜脈血，在給藥後D4、D8、D15、D22和D29各採集一次靜脈血，之後每週採血一次，持續採血12周至D85。

採得各血樣在室溫下分離出血清。

(2-2-1)施與綴合物4的食蟹猴血清中PCSK9蛋白含量的檢測

選取施予綴合物4後D-9、D8、D14、D85、D92、D99、D106和D120的血清，使用Human Proprotein Convertase 9/PCSK9 Quantikine ELISA Kit(美國R&D Systems公司，貨號DPC900)中的Calibrator Diluent RD5P(1:5稀釋)試劑，將上述各時間點下獲得的血清稀釋25倍，按照試劑盒說明書的操作步驟，使用全自動酶標儀(SYNERGY^TM MX，Biotek公司)檢測450nm處各稀釋血清的吸光度值。根據試劑盒中標準品各稀釋濃度與其對應的吸光度值，利用Graphpad 5.0軟體的線性回歸功能建立標準曲線，並獲得對應的線性方程式：Y = aX + b，其中a是擬合的直線斜率，b是當X = 0時對應的Y值(截距)。將測得的各稀釋血清的吸光度值帶入上述方程式，可以計算出稀釋血清中PCSK9蛋白含量，根據稀釋倍數，獲得各時間點血清中PCSK9蛋白含量。

標準化的PCSK9蛋白水平 = (給藥後PCSK9蛋白含量/給藥前PCSK9蛋白含量)。

PCSK9蛋白表達的抑制率＝(1-給藥後PCSK9蛋白含量/給藥前PCSK9蛋白含量)× 100%。

其中，給藥前PCSK9蛋白含量為D-9的PCSK9蛋白含量。

以給藥前為基準，對給藥後各時間點PCSK9蛋白含量進行歸一化；定義給藥前PCSK9蛋白水平為100%，在圖2中以D0表示；對食蟹猴單次皮下注射9mg/kg的綴合物4後，不同時間點下的血清中標準化的PCSK9蛋白水平展示於圖2中。 [(2-2-2)施與綴合物1或7的食蟹猴血清中PCSK9蛋白含量的檢測]

採用與(2-2-1)相同的方法，檢測施與綴合物1或7的食蟹猴血清中PCSK9蛋白含量。不同在於，(1)選取了D-14、D-7、D8、D15、D22、D29、D36、D43、D50、D57、D64和D85的血清；(2)給藥前PCSK9蛋白含量為D-14和D-7兩個PCSK9蛋白含量的算術平均值。對食蟹猴單次皮下注射9mg/kg的綴合物1或7後，不同時間點下的血清中標準化的PCSK9蛋白水平展示於圖2中。

由圖2可以看出，單次給藥後第14天，綴合物4對NHP血清中PCSK9蛋白表達的抑制率高於90%，直至給藥後第12周，綴合物4對PCSK9蛋白表達的抑制率始終維持在50%以上。

對於綴合物7，單次給藥後第22天，NHP血清中PCSK9蛋白表達的抑制率為82%，直至給藥後第9周，綴合物7對PCSK9蛋白表達的抑制率始終維持在66%以上。

對於綴合物1，單次給藥後第15天，NHP血清中PCSK9蛋白表達的抑制率為83%，直至給藥後第7周，綴合物7對PCSK9蛋白表達的抑制率始終維持在65%以上。 [(2-3)血清中血脂(LDL-c和CHO)含量的檢測] [(2-3-1)施予了綴合物4的食蟹猴血清中血脂(LDL-c和CHO)含量的檢測]

選取(2-2)中施予綴合物4後各個時間點下獲得的血清，分別使用LDL-C測定試劑盒(DENUO CH7538，上海執誠生物科技有限公司)或CHOL測定試劑盒(DENUO CH7532，上海執誠生物科技有限公司)，按其說明書的操作方法，在全自動生化儀(日立7060)上檢測各時間點下血清中血脂(LDL-c或CHO)的含量。

標準化的血脂水平=(給藥後血脂含量/給藥前血脂含量)× 100%。

血脂的抑制率＝(1-給藥後血脂含量/給藥前血脂含量)× 100%。

其中，給藥前血脂含量為給藥前D-15、D-9和D1三次血脂的算術平均值；血脂指LDL-c或CHO。

以給藥前為基準，對給藥後各時間點血脂含量進行歸一化；定義給藥前的血脂水平為100%，在圖3和圖4中以D0表示。

對食蟹猴單次皮下注射9mg/kg的綴合物4後，不同時間點下的血清中標準化的LDL-c水平和標準化的CHO水平分別展示於圖3、圖4中。 [(2-3-2)施予了綴合物7的食蟹猴血清中血脂(LDL-c和CHO)含量的檢測]

採用與(2-3-1)相同的方法，檢測施與綴合物7的食蟹猴血清中血脂(LDL-c和CHO)含量。不同在於，(1)選取(2-2)中施予綴合物7後各個時間點下獲得的血清進行血脂檢測；(2)給藥前血脂含量為給藥前D-14、D-7和D1三次血脂的算術平均值。對食蟹猴單次皮下注射9mg/kg的綴合物7後，不同時間點下的血清中標準化的LDL-c水平和標準化的CHO水平分別展示於圖3、圖4中。

從圖3可以看出，單次給藥後第14天起，綴合物4對LDL-c有顯著抑制，其中給藥後第22天，綴合物4對LDL-c的抑制率高達64%；從給藥後的第2周至第11周期間，綴合物4對LDL-c的抑制率始終維持在50%以上；在長達127天的觀察週期內，施予綴合物4的NHP的血清LDL-c水平始終低於給藥前。

對於綴合物7，單次給藥後第22天，LDL-c的抑制率為36%；從給藥後的第2周至第4周期間，LDL-c的抑制率維持在30%左右；在長達11周的觀察期內，施予綴合物7的NHP的血清LDL-c水平始終低於給藥前。

從圖4可以看出，單次給藥後第14天起，綴合物4對CHO也有顯著抑制，其中給藥後第22天，綴合物4對CHO抑制率達38%；從給藥後的第2周至第8周期間，綴合物4對CHO的抑制率始終維持在30%以上；在長達127天的觀察週期內，施予綴合物4的NHP的血清CHO水平始終低於給藥前。

對於綴合物7，單次給藥後第22天，CHO的抑制率為38%；從給藥後的第2周至第8周期間，CHO的抑制率基本維持在30%以上；在長達11周的觀察期內，施予綴合物7的NHP的血清CHO水平始終低於給藥前。 [(2-4)肝臟穿刺術前後的血常規與凝血功能檢測]

在肝臟穿刺術的前後，對施予綴合物4或5的動物進行靜脈取血。分別使用全自動五分類血液分析儀(ADVIA 2120/ ADVIA 2120i，德國西門子公司)和全自動血凝分析儀(CA-7000/CS-2000i，日本希森美康公司)檢測血常規和凝血功能。結果表明，給藥後相對於給藥前，各綴合物對血常規和凝血功能的影響無顯著性差異，表現出本發明提供的siRNA綴合物具有較好的生物安全性。 [實驗例3 siRNA綴合物在大小鼠中的毒性評價]

本實驗例通過觀察分別施予綴合物1、4或7的大鼠或小鼠的臨床毒性反應，檢測肝重、血常規、血生化、血脂等指標，並進行大體解剖與組織病理學檢測，評價本發明的siRNA綴合物在小動物體內的毒性反應。 [(3-1)大鼠毒性評價] [(3-1-1)施予綴合物1或4的SD大鼠毒性檢測]

選取6-9周齡，體重210-250g的SPF級SD大鼠(購於北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京) 2016-0011或SCXK(京) 2016-0006)，皆為雄性，按照體重分為3組，每組5隻，分別皮下注射綴合物1、綴合物4或1×PBS(pH 7.4)對照。根據體重計算藥量，各綴合物用1×PBS(pH 7.4)配置成60mg/ml的溶液，給藥體積為5ml/kg，給藥劑量為300mg/kg。

單次皮下給藥後，檢測如下指標：（1）一般狀態觀察：每天2次一般狀態觀察；（2）體重：給藥前D1、給藥後D3、D6、D10、D14及解剖日D15分別測定體重；（3）攝食量：D2-3、D6-7、D12-13，分別測定攝食量；（4）血液學：解剖前D15，自大鼠腹主動脈採血1.9ml，其中1.0 mL血液樣品以EDTA-K2抗凝，全血直接進樣檢測下述血液細胞學指標(包括紅細胞計數(RBC)、白細胞計數(WBC)、血小板計數(PLT)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞容積(HCT)、平均紅細胞容積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、網織紅細胞計數(RET)、網織紅細胞百分比(RET%)、中性粒細胞(NEU)計數及百分比、淋巴細胞(LYM)計數及百分比、單核細胞(MONO)計數及百分比、嗜酸性粒細胞(EOS)計數及百分比、以及嗜鹼性粒細胞(BASO)計數及百分比)；剩餘0.9 mL血液樣品以枸櫞酸鈉抗凝，15~25℃下離心力1800×g離心10分鐘，分離血漿，用以檢測凝血時間(凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血酶時間(APTT))；（5）血生化：給藥後D2自大鼠頸靜脈採血0.6ml，D15解剖前自大鼠腹主動脈採血3ml，均不抗凝，15~25℃下離心力1800×g離心10分鐘，分離血清進行檢測鹼性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、γ-穀氨醯轉移酶(GGT)、脲素(Urea)、肌酐(Crea)、鈉離子濃度(Na⁺ )、鉀離子濃度(K⁺ )、氯離子(Cl^- )、血糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和白球比(A/G)血生化指標；（6）大體解剖及組織病理學檢測：D15進行動物解剖，對各臟器進行稱重，及組織病理學檢測。 [(3-1-2)施予綴合物7的SD大鼠毒性檢測]

採用與(3-1-1)相同的方法，檢測施予了綴合物7的SD大鼠毒性，不同的是，用綴合物7代替綴合物4，綴合物7用1×PBS(pH 7.4)分別配置成20mg/ml和6mg/ml的溶液，給藥體積為5ml/kg，給藥劑量分別為100mg/kg和30mg/kg。對於指標(5)血生化，分別在給藥後D8和D15解剖前採血。

結果表明，各綴合物在大鼠上均未表現出明顯的毒性。 [(3-2)小鼠毒性評價]

選取5-6周齡的SPF級ICR小鼠(購自斯貝福(北京)生物技術有限公司)，雌雄各半，每組10隻，分別皮下注射綴合物1、綴合物4或綴合物7。給藥頻率為每週一次、連續2周，共給藥3次，分別在D1、D8和D15給藥。根據體重計算藥量，各綴合物用1×PBS(pH 7.4)配置成30 mg/ml的溶液，給藥體積為10ml/kg，給藥劑量為300mg/kg。

3次給藥後，檢測如下指標：（1）一般狀態觀察：每天1次一般狀態觀察；（2）體重：D1、D8、D15給藥前及解剖日D16分別測定體重；（3）攝食量：每週測定一次；（4）血生化：解剖日D16經摘眼球採血1ml，不抗凝，先於37℃培養60min，再於4℃，3000 rpm下離心15min獲得血清，進行血生化檢測，檢測指標與上述大鼠毒性檢測的血生化指標相同。（5）大體解剖及組織病理學檢測：D16進行動物解剖，對各臟器進行稱重，及組織病理學檢測。

結果表明，各綴合物在小鼠上均未表現出明顯的毒性。

上述結果說明，本發明的綴合物具有較好的生物安全性。

以上詳細描述了本發明的一些實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。

另外需要說明的是，在上述一些實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。

無。

圖1A-1F依次為依據轉染了不同的siRNA(siRNA 1-6)後，psiCHECK系統中報告基因Renilla 的相對殘留活性而擬合的劑量-效應曲線。

圖2為對食蟹猴單次皮下注射9mg/kg的綴合物1、4或7後，不同時間點下的血清中標準化的PCSK9蛋白水平圖。

圖3為分別對食蟹猴單次皮下注射9mg/kg的綴合物4或7後，不同時間點下的血清中標準化的LDL-c水平圖。

圖4為分別對食蟹猴單次皮下注射9mg/kg的綴合物4或7後，不同時間點下的血清中標準化的CHO水平圖。

Claims

一種siRNA綴合物，其中，前述綴合物具有式(308)所示的結構：
式(308)，其中， n1為選自1-3的整數，n3為選自0-4的整數；每個m1、m2或m3各自獨立地為選自2-10的整數；R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 或R₁₅ 各自獨立地為H，或選自於由以下基團所組成的組：C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基以及C₁ -C₁₀ 烷氧基； R₃ 為式A59所示結構的基團：
(A59) 其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ， Nu為siRNA，前述siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，其中，前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II選自如下i)-vi)所示序列中的一組： i)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- AAGCAAGCAGACAUUUAUZ₁ -3'(SEQ ID NO: 1)； 5'- Z₂ AUAAAUGUCUGCUUGCUU -3'(SEQ ID NO: 2)，其中，Z₁ 為C，Z₂ 為G，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁ 的核苷酸Z₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂ 的核苷酸Z₄ ，前述Z₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； ii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- UUUGUAGCAUUUUUAUUAZ₅ -3' (SEQ ID NO: 61)； 5'- Z₆ UAAUAAAAAUGCUACAAA -3' (SEQ ID NO: 62)，其中，Z₅ 為A，Z₆ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₅ 的核苷酸Z₇ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₆ 的核苷酸Z₈ ，前述Z₈ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； iii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 121所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GCCUGGAGUUUAUUCGGAZ₉ -3' (SEQ ID NO: 121)； 5'- Z₁₀ UCCGAAUAAACUCCAGGC -3' (SEQ ID NO: 122)，其中，Z₉ 為A，Z₁₀ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₉ 的核苷酸Z₁₁ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₀ 的核苷酸Z₁₂ ，前述Z₁₂ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； iv)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 181所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CUGUUUUGCUUUUGUAACZ₁₃ -3' (SEQ ID NO: 181)； 5'- Z₁₄ GUUACAAAAGCAAAACAG -3' (SEQ ID NO: 182)，其中，Z₁₃ 為U，Z₁₄ 為A，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₃ 的核苷酸Z₁₅ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₄ 的核苷酸Z₁₆ ，前述Z₁₆ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； v)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 241所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GGUUUUGUAGCAUUUUUAZ₁₇ -3' (SEQ ID NO: 241)； 5'- Z₁₈ UAAAAAUGCUACAAAACC -3' (SEQ ID NO: 242)，其中，Z₁₇ 為U，Z₁₈ 為A，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₇ 的核苷酸Z₁₉ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₈ 的核苷酸Z₂₀ ，前述Z₂₀ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸；並且 vi)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 301所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GUGACUUUUUAAAAUAAAZ₂₁ -3' (SEQ ID NO: 301)； 5'- Z₂₂ UUUAUUUUAAAAAGUCAC -3' (SEQ ID NO: 302)，其中，Z₂₁ 為A，Z₂₂ 為U，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₂₁ 的核苷酸Z₂₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂₂ 的核苷酸Z₂₄ ，前述Z₂₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸； R₂ 是長度為1-20個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中R₂ 可任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ 、-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；每個L₁ 各自獨立地是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，L₁ 可任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ 、-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；
表示基團共價連接的位點；M₁ 表示靶向基團。
如請求項1記載之siRNA綴合物，其中，每個L₁ 獨立地選自於由(A1)-(A26)基團及其任意組合所組成的組：
、
、
、
、 (A1)                    (A2)                   (A3)                   (A4)
、
、
、
、 (A5)                   (A6)                     (A7)                       (A8)
、
、
、 (A9)                      (A10)                                  (A11)
、
、
、 (A12)                          (A13)                          (A14)
、
、
、 (A15)                          (A16)                                    (A17)
、
、
、
、 (A18)                 (A19)                   (A20)                    (A21)
、
、
、 (A22)                            (A23)                             (A24)
、
； (A25)                          (A26) 其中，每個j1獨立地為1-20的整數；每個j2獨立地為1-20的整數；每個R'獨立地為C₁ -C₁₀ 烷基；每個Ra獨立地選自於由式(A27)-(A45)所示的基團或其任意組合所組成的組：
、
、
、
、
、
、 (A27)     (A28)         (A29)               (A30)                   (A31) (A32)
、
、
、
、
、 (A33)         (A34)        (A35)            (A36)      (A37)
、
、
、
、
、 (A38)           (A39)         (A40)           (A41)             (A42)
、
或
； (A43)     (A44)           (A45) 每個Rb獨立地為C₁ -C₁₀ 烷基；或者L₁ 選自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一種或多種的連接組合；或者L₁ 選自A1、A4、A8、A10和A11中至少2個的連接組合；或者，L₁ 選自A1、A8、A10中至少2個的連接組合；或者，L₁ 的長度為3-25個原子；或者，L₁ 的長度為4-15個原子；
表示基團共價連接的位點。
如請求項2記載之siRNA綴合物，其中，j1為2-10的整數，j2為2-10的整數，R'為C₁ -C₄ 烷基，Ra為A27、A28、A29、A30和A31中的一種，Rb為C₁ -C₅ 烷基；或者j1為3-5的整數，j2為3-5的整數，R'為甲基、乙基和異丙基中的一種，Ra為式(A27)所示的基團或式(A28)所示的基團，Rb為甲基、乙基、異丙基和丁基中的一種。
如請求項1至3中任一項記載之siRNA綴合物，其中，n1為1-2的整數，n3為0-1的整數，且n1+n3=2-3。
如請求項1至4中任一項記載之siRNA綴合物，其中，每個m1、m2或m3各自獨立地為2-5的整數，和/或m1=m2=m3。
如請求項1至5中任一項前述之siRNA綴合物，其中，每個前述靶向基團獨立地為與哺乳動物肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體具有親合力的配體；或者，每個前述靶向基團獨立地為去唾液酸糖蛋白或糖；或者，每個前述靶向基團獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺、N-三氟乙醯半乳糖胺、N-丙醯半乳糖胺、N-正丁醯半乳糖胺、N-異丁醯半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-去氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二去氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-去氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-去氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一種；或者，至少一個或每個前述靶向基團為半乳糖或N-乙醯半乳糖胺。
如請求項1至6中任一項記載之siRNA綴合物，其中，R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 或R₁₅ 獨立地為H、甲基或乙基；或者R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 、R₁₃ 、R₁₄ 或R₁₅ 均為H。
如請求項1至7中任一項記載之siRNA綴合物，其中，R₂ 上同時含有與含氮骨架上的N連接的連接位點和與R₃ 中的P原子連接的連接位點；或者R₂ 上前述與含氮骨架上的N連接的位點與N形成醯胺鍵，前述與R₃ 中的P原子連接的位點與P形成磷酸酯鍵；或者R₂ 選自式(B5)、(B6)、(B5')或(B6')所示的基團，
、
； (B5) (B6)，
、
； (B5') (B6')，其中，
表示基團共價鍵連接的位點； q₂ 的取值範圍可以是1-10的整數。
如請求項1至8中任一項記載之siRNA綴合物，其中，該綴合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的結構：
式(403)
式(404)
式(405)
式(406)
式(407)
式(408)
式(409)
式(410)
式(411)
式(412)
式(413)
式(414)
式(415)
式(416)
式(417)
式(418)
式(419)
式(420)
式(421)
式(422)。
如請求項1至9中任一項記載之siRNA綴合物，其中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈或反義鏈的端部，前述端部指前述正義鏈或反義鏈中從其一端起算的前4個核苷酸；或者式A59中的P原子連接到前述siRNA正義鏈或反義鏈的末端；或者式A59中的P原子連接到前述siRNA正義鏈的3'末端；或者式A59中的P原子通過磷酸二酯鍵連接至前述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。
如請求項1記載之siRNA綴合物，其中， i)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 ii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 iii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 121所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 iv)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 181所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 v)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 241所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 vi)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 301所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
如請求項1或11記載之siRNA綴合物，其中， i)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₄ 位置處的差異，且Z₄ 選自A、U或C；或者 ii)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₈ 位置處的差異，且Z₈ 選自A、C或G；或者 iii)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₁₂ 位置處的差異，且Z₁₂ 選自A、C或G；或者 iv)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₁₆ 位置處的差異，且Z₁₆ 選自U、C或G；或者 v)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₀ 位置處的差異，且Z₂₀ 選自U、C或G；或者 vi)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₄ 位置處的差異，且Z₂₄ 選自A、C或G。
如請求項12記載之siRNA綴合物，其中，Z₃ 是與Z₄ 互補的核苷酸；或者Z₇ 是與Z₈ 互補的核苷酸；或者Z₁₁ 是與Z₁₂ 互補的核苷酸；或者Z₁₅ 是與Z₁₆ 互補的核苷酸；或者Z₁₉ 是與Z₂₀ 互補的核苷酸；或者Z₂₃ 是與Z₂₄ 互補的核苷酸。
如請求項1至13中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；前述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個的鹼基錯配；前述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
如請求項11至14中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自獨立地為1-4個核苷酸，前述核苷酸序列III連接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV連接在核苷酸序列II的3'末端，前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或完全反向互補；前述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
如請求項15記載之siRNA綴合物，其中， i)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列；且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為C；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CCC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為ACCC；或者 ii)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 63所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 64所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為U；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GU；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GGU；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GGGU；或者 iii)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 123所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 124所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為G；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UAG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AUAG；或者 iv)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 183所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 184所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為C；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GAC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AGAC；或者 v)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 243所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 244所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為G；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CUG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UCUG；或者 vi)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 303所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 304所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為G；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AUG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UAUG。
如請求項16記載之siRNA綴合物，其中，前述核苷酸序列III和IV完全反向互補。
如請求項1至17中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述反義鏈還含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的長度為1至3個核苷酸，連接在前述反義鏈的3'末端，構成反義鏈的3'垂懸末端；或者前述核苷酸序列V的長度為2個核苷酸；或者前述核苷酸序列V為連續的兩個胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸或連續的兩個脲嘧啶核糖核苷酸；或者前述核苷酸序列V與靶mRNA相應位置的核苷酸互補。
如請求項1至18中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 66所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 67所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 68所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 125所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 126所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 127所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 128所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 185所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 186所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 187所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO:188所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 245所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 246所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 247所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 248所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 305所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 306所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 307所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 308所示的核苷酸序列。
如請求項11至19中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述siRNA具有siPCSKa1、siPCSKa2、siPCSKb1、siPCSKb2、siPCSKc1、siPCSKc2、siPCSKd1、siPCSKd2、siPCSKe1、siPCSKe2、siPCSKf1或siPCSKf2所示的核苷酸序列。
如請求項1至20中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述正義鏈或前述反義鏈中的至少一個核苷酸為修飾的核苷酸，和/或至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基。
如請求項21記載之siRNA綴合物，其中，前述正義鏈和前述反義鏈中的每一個核苷酸獨立地為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸；或者前述氟代修飾的核苷酸位於核苷酸序列I和核苷酸序列II中，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述核苷酸序列I中至少第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，前述核苷酸序列II中至少第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸；或者按照5'末端到3'末端的方向，在前述正義鏈中，前述核苷酸序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述正義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在前述反義鏈中，前述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述反義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸。
如請求項21或22記載之siRNA綴合物，其中，每一個非氟代修飾的核苷酸獨立地選自核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物中的一種；或者核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸選自2'-烷氧基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-經取代的氨基修飾的核苷酸、2'-去氧核苷酸中的一種；核苷酸類似物選自異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一種；或者每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸，前述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
如請求項21至23中任一項記載之siRNA綴合物，其中，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的正義鏈中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的正義鏈的其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的反義鏈中核苷酸序列II的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的反義鏈其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；或者按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的正義鏈中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的正義鏈的其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的反義鏈中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的反義鏈其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；或者按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的正義鏈中核苷酸序列I的第7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的正義鏈的其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，並且，按照5'末端到3'末端的方向，前述siRNA的反義鏈中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，siRNA的反義鏈其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸。
如請求項1至24中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述siRNA為siPCSKa1-M1、siPCSKa2-M1、siPCSKa1-M2、siPCSKa2-M2、siPCSKa1-M3、siPCSKa2-M3、siPCSKb1-M1、siPCSKb2-M1、siPCSKb1-M2、siPCSKb2-M2、siPCSKb1-M3、siPCSKb2-M3、siPCSKc1-M1、siPCSKc2-M1、siPCSKc1-M2、siPCSKc2-M2、siPCSKc1-M3、siPCSKc2-M3、siPCSKd1-M1、siPCSKd2-M1、siPCSKd1-M2、siPCSKd2-M2、siPCSKd1-M3、siPCSKd2-M3、siPCSKe1-M1、siPCSKe2-M1、siPCSKe1-M2、siPCSKe2-M2、siPCSKe1-M3、siPCSKe2-M3、siPCSKf1-M1、siPCSKf2-M1、siPCSKf1-M2、siPCSKf2-M2、siPCSKf1-M3或siPCSKf2-M3中的任意一種。
如請求項21前述之siRNA綴合物，其中，前述具有修飾基團的磷酸酯基為磷酸酯基中的磷酸二酯鍵中的至少一個氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；或者前述具有修飾基團的磷酸酯基為具有如式(1)所示結構的硫代磷酸酯基：
式(1)。
如請求項26記載之siRNA綴合物，其中，前述siRNA中，硫代磷酸酯基連接存在於由以下位置組成的組中的至少一處：前述正義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述正義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述正義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述正義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述反義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述反義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述反義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及前述反義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
如請求項1至27中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述siRNA為siPCSKa1-M1S、siPCSKa2-M1S、siPCSKa1-M2S、siPCSKa2-M2S、siPCSKa1-M3S、siPCSKa2-M3S、siPCSKb1-M1S、siPCSKb2-M1S、siPCSKb1-M2S、siPCSKb2-M2S、siPCSKb1-M3S、siPCSKb2-M3S、siPCSKc1-M1S、siPCSKc2-M1S、siPCSKc1-M2S、siPCSKc2-M2S、siPCSKc1-M3S、siPCSKc2-M3S、siPCSKd1-M1S、siPCSKd2-M1S、siPCSKd1-M2S、siPCSKd2-M2S、siPCSKd1-M3S、siPCSKd2-M3S、siPCSKe1-M1S、siPCSKe2-M1S、siPCSKe1-M2S、siPCSKe2-M2S、siPCSKe1-M3S、siPCSKe2-M3S、siPCSKf1-M1S、siPCSKf2-M1S、siPCSKf1-M2S、siPCSKf2-M2S、siPCSKf1-M3S或siPCSKf2-M3S中的任意一種。
如請求項1至28中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述siRNA反義鏈的5'末端核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸；或者前述5'-磷酸核苷酸為具有如式(2)所示結構的核苷酸，前述5'-磷酸類似物修飾的核苷酸選自結構如式(3)-式(6)中任意一個所示的核苷酸，
式(2) 式(3) 式(4) 式(5) 式(6) 其中，R選自H、OH、甲氧基或氟；Base表示鹼基，選自A、U、C、G或T。
如請求項1至29中任一項記載之siRNA綴合物，其中，前述siRNA為siPCSKa1-M1P1、siPCSKa1-M2P1、siPCSKa1-M3P1、siPCSKa2-M1P1、siPCSKa2-M2P1、siPCSKa2-M3P1、siPCSKa1-M1SP1、siPCSKa1-M2SP1、siPCSKa1-M3SP1、siPCSKa2-M1SP1、siPCSKa2-M2SP1、siPCSKa2-M3SP1、siPCSKb1-M1P1、siPCSKb1-M2P1、siPCSKb1-M3P1、siPCSKb2-M1P1、siPCSKb2-M2P1、siPCSKb2-M3P1、siPCSKb1-M1SP1、siPCSKb1-M2SP1、siPCSKb1-M3SP1、siPCSKb2-M1SP1、siPCSKb2-M2SP1、siPCSKb2-M3SP1、siPCSKc1-M1P1、siPCSKc1-M2P1、siPCSKc1-M3P1、siPCSKc2-M1P1、siPCSKc2-M2P1、siPCSKc2-M3P1、siPCSKc1-M1SP1、siPCSKc1-M2SP1、siPCSKc1-M3SP1、siPCSKc2-M1SP1、siPCSKc2-M2SP1、siPCSKc2-M3SP1、siPCSKd1-M1P1、siPCSKd1-M2P1、siPCSKd1-M3P1、siPCSKd2-M1P1、siPCSKd2-M2P1、siPCSKd2-M3P1、siPCSKd1-M1SP1、siPCSKd1-M2SP1、siPCSKd1-M3SP1、siPCSKd2-M1SP1、siPCSKd2-M2SP1、siPCSKd2-M3SP1、siPCSKe1-M1P1、siPCSKe1-M2P1、siPCSKe1-M3P1、siPCSKe2-M1P1、siPCSKe2-M2P1、siPCSKe2-M3P1、siPCSKe1-M1SP1、siPCSKe1-M2SP1、siPCSKe1-M3SP1、siPCSKe2-M1SP1、siPCSKe2-M2SP1、siPCSKe2-M3SP1、siPCSKf1-M1P1、siPCSKf1-M2P1、siPCSKf1-M3P1、siPCSKf2-M1P1、siPCSKf2-M2P1、siPCSKf2-M3P1、siPCSKf1-M1SP1、siPCSKf1-M2SP1、siPCSKf1-M3SP1、siPCSKf2-M1SP1、siPCSKf2-M2SP1或siPCSKf2-M3SP1中的任意一種。
一種siRNA，前述siRNA含有正義鏈和反義鏈，前述正義鏈和前述反義鏈中的每一個核苷酸獨立地為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸；前述正義鏈含有一段核苷酸序列I，前述反義鏈含有一段核苷酸序列II，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，前述氟代修飾的核苷酸位於核苷酸序列I和核苷酸序列II中，並且，按照5'末端到3'末端的方向，在前述正義鏈中，前述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述正義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在前述反義鏈中，前述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，前述反義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸，並且， i)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁ 的核苷酸Z₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂ 的核苷酸Z₄ ，前述Z₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸；或者 ii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₅ 的核苷酸Z₇ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₆ 的核苷酸Z₈ ，前述Z₈ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸；或者 iii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 121所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₉ 的核苷酸Z₁₁ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₀ 的核苷酸Z₁₂ ，前述Z₁₂ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸；或者 iv)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 181所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₃ 的核苷酸Z₁₅ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₄ 的核苷酸Z₁₆ ，前述Z₁₆ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸；或者 v)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 241所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₁₇ 的核苷酸Z₁₉ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₁₈ 的核苷酸Z₂₀ ，前述Z₂₀ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸；或者 vi)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 301所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，前述核苷酸序列I中包含位置對應於Z₂₁ 的核苷酸Z₂₃ ，前述核苷酸序列II中包含位置對應於Z₂₂ 的核苷酸Z₂₄ ，前述Z₂₄ 是前述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。
如請求項31記載之siRNA，其中，每一個非氟代修飾的核苷酸獨立地選自核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物中的一種。
如請求項32記載之siRNA，其中，核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸選自2'-烷氧基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-經取代的氨基修飾的核苷酸、2'-去氧核苷酸中的一種；核苷酸類似物選自異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一種。
如請求項31至33中任一項記載之siRNA，其中，每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸，前述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
如請求項31至34中任一項記載之siRNA，其中， i)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 ii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 iii)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 121所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 iv)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 181所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 v)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 241所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異；或者 vi)前述核苷酸序列I與SEQ ID NO: 301所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
如請求項31至35中任一項記載之siRNA，其中， i)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₄ 位置處的差異，且Z₄ 選自A、U或C；或者 ii)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 62所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₈ 位置處的差異，且Z₈ 選自A、C或G；或者 iii)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 122所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₁₂ 位置處的差異，且Z₁₂ 選自A、C或G；或者 iv)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 182所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₁₆ 位置處的差異，且Z₁₆ 選自U、C或G；或者 v)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 242所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₀ 位置處的差異，且Z₂₀ 選自U、C或G；或者 vi)前述核苷酸序列II與SEQ ID NO: 302所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z₂₄ 位置處的差異，且Z₂₄ 選自A、C或G。
如請求項36記載之siRNA，其中，Z₃ 是與Z₄ 互補的核苷酸；或者Z₇ 是與Z₈ 互補的核苷酸；或者Z₁₁ 是與Z₁₂ 互補的核苷酸；或者Z₁₅ 是與Z₁₆ 互補的核苷酸；或者Z₁₉ 是與Z₂₀ 互補的核苷酸；或者Z₂₃ 是與Z₂₄ 互補的核苷酸。
如請求項31至37中任一項記載之siRNA，其中，前述核苷酸序列I和前述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；前述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個的鹼基錯配；前述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
如請求項31至38中任一項記載之siRNA，其中，前述正義鏈還含有核苷酸序列III，前述反義鏈還含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自獨立地為1-4個核苷酸，前述核苷酸序列III連接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV連接在核苷酸序列II的3'末端，前述核苷酸序列III和前述核苷酸序列IV長度相等並且實質上反向互補或完全反向互補；前述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
如請求項31至39中任一項記載之siRNA，其中， i)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列；且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為C；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CCC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為ACCC；或者 ii)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 63所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 64所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為U；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GU；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GGU；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GGGU；或者 iii)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 123所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 124所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為G；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UAG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AUAG；或者 iv)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 183所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 184所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為C；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為GAC；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AGAC；或者 v)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 243所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 244所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為G；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為CUG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UCUG；或者 vi)前述核苷酸序列I為SEQ ID NO: 303所示的核苷酸序列，前述核苷酸序列II為SEQ ID NO: 304所示的核苷酸序列；並且前述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，前述核苷酸序列III的鹼基為G；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為AUG；或者，前述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的鹼基組成為UAUG。
如請求項40記載之siRNA，其中，前述核苷酸序列III和IV完全反向互補。
如請求項31至41中任一項記載之siRNA，其中，前述反義鏈還含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的長度為1至3個核苷酸，連接在前述反義鏈的3'末端，構成反義鏈的3'垂懸末端；或者前述核苷酸序列V的長度為2個核苷酸；或者前述核苷酸序列V為連續的兩個胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸或連續的兩個脲嘧啶核糖核苷酸；或者前述核苷酸序列V與靶mRNA相應位置的核苷酸互補。
如請求項31至42中任一項記載之siRNA，其中，前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 66所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 67所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 68所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 125所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 126所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 127所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 128所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 185所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO: 186所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 187所示的核苷酸序列，前述反義鏈含有如SEQ ID NO:188所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 245所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 246所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 247所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 248所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 305所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 306所示的核苷酸序列；或者前述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO: 307所示的核苷酸序列，前述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO: 308所示的核苷酸序列。
如請求項31至43中任一項記載之siRNA，其中，前述siRNA具有siPCSKa1、siPCSKa2、siPCSKb1、siPCSKb2、siPCSKc1、siPCSKc2、siPCSKd1、siPCSKd2、siPCSKe1、siPCSKe2、siPCSKf1或siPCSKf2所示的核苷酸序列。
如請求項31至44中任一項記載之siRNA，其中，前述siRNA為siPCSKa1-M1、siPCSKa2-M1、siPCSKb1-M1、siPCSKb2-M1、siPCSKc1-M1、siPCSKc2-M1、siPCSKd1-M1、siPCSKd2-M1、siPCSKe1-M1、siPCSKe2-M1、siPCSKf1-M1或siPCSKf2-M1中的任意一種。
如請求項31至45中任一項記載之siRNA，其中，前述正義鏈或前述反義鏈中的至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基。
如請求項46記載之siRNA，其中，前述具有修飾基團的磷酸酯基為磷酸酯基中的磷酸二酯鍵中的至少一個氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；或者前述具有修飾基團的磷酸酯基為具有如式(1)所示結構的硫代磷酸酯基：
式(1)。
如請求項47記載之siRNA，其中，前述siRNA中，硫代磷酸酯基連接存在於由以下位置組成的組中的至少一處：前述正義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述正義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述正義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述正義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述反義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；前述反義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；前述反義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及前述反義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
如請求項31至48中任一項記載之siRNA，其中，前述siRNA為siPCSKa1-M1S、siPCSKa2-M1S、siPCSKb1-M1S、siPCSKb2-M1S、siPCSKc1-M1S、siPCSKc2-M1S、siPCSKd1-M1S、siPCSKd2-M1S、siPCSKe1-M1S、siPCSKe2-M1S、siPCSKf1-M1S或siPCSKf2-M1S中的任意一種。
如請求項31至49中任一項記載之siRNA，其中，前述siRNA反義鏈的5'末端核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸；或者前述5'-磷酸核苷酸為具有如式(2)所示結構的核苷酸，前述5'-磷酸類似物修飾的核苷酸選自結構如式(3)-式(6)中任意一個所示的核苷酸，
式(2) 式(3) 式(4) 式(5) 式(6) 其中，R選自H、OH、甲氧基或氟；Base表示鹼基，選自A、U、C、G或T。
如請求項31至50中任一項記載之siRNA，其中，前述siRNA為siPCSKa1-M1P1、siPCSKa2-M1P1、siPCSKa1-M1SP1、siPCSKa2-M1SP1、siPCSKb1-M1P1、siPCSKb2-M1P1、siPCSKb1-M1SP1、siPCSKb2-M1SP1、siPCSKc1-M1P1、siPCSKc2-M1P1、siPCSKc1-M1SP1、siPCSKc2-M1SP1、siPCSKd1-M1P1、siPCSKd2-M1P1、siPCSKd1-M1SP1、siPCSKd2-M1SP1、siPCSKe1-M1P1、siPCSKe2-M1P1、siPCSKe1-M1SP1、siPCSKe2-M1SP1、siPCSKf1-M1P1、siPCSKf2-M1P1、siPCSKf1-M1SP1或siPCSKf2-M1SP1中的任意一種。
如請求項31至51中任一項記載之siRNA，其中前述siRNA為siPCSKa1-M1SP、siPCSKb1-M1SP、siPCSKc1-M1SP、siPCSKd1-M1SP、siPCSKe1-M1SP或siPCSKf1-M1SP中的任意一種。
一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有請求項31至52中任一項記載之siRNA；和藥學上可接受的載體。
一種siRNA綴合物，前述siRNA綴合物含有請求項31至52中任一項記載之siRNA；以及綴合連接至該siRNA的綴合基團。
一種請求項1至30以及54中任一項記載之siRNA綴合物、請求項31至52中任一項記載之siRNA和/或請求項53記載之藥物組合物在製備用於治療和/或預防由PCSK9基因異常表達引發的疾病或生理狀況的藥物中的用途。
一種治療和/或預防由PCSK9基因異常表達引發的疾病或生理狀況的方法，其中，前述方法包括將有效量的請求項1至30以及54中任一項記載之siRNA綴合物、請求項31至52中任一項記載之siRNA和/或請求項53記載之藥物組合物給予患有該疾病或生理狀況的受試者。
一種抑制肝細胞中PCSK9基因表達的方法，該方法包括將有效量的請求項1至30以及54中任一項記載之siRNA綴合物、請求項31至52中任一項記載之siRNA和/或請求項53記載之藥物組合物與前述肝細胞接觸。
一種試劑盒，其中，該試劑盒含有請求項1至30以及54中任一項記載之siRNA綴合物、請求項31至52中任一項記載之siRNA和/或請求項53記載之藥物組合物。