TW202214855A - 雙鏈siRNA類似物的共軛物 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種利巴韋林衍生物嵌入的雙鏈siRNA類似物、包含其的共軛物，以及其鹽和用途。本發明的雙鏈siRNA類似物、包含其的共軛物以及其鹽可以有效抑制B型肝炎病毒DNA、pgRNA、S抗原、E抗原等多項病毒指標，為B型肝炎的治療提供了有效可行的方法。

Description

雙鏈siRNA類似物的共軛物
本發明主張如下優先權：CN202010529520.7，申請日2020年06月11日；CN202011524835.9，申請日2020年12月21日；CN202010524584.8，申請日2020年06月10日；PCT/CN2020/133982，申請日2020年12月4日；CN202010522407.6，申請日2020年6月10日；CN202011524307.3，申請日2020年12月21日。
本發明屬於生物醫藥領域，關於一種r’嵌入的siRNA類似物、雙鏈siRNA類似物、包含其的共軛物，以及其鹽和用途；所述用途具體為在製備治療B型病毒性肝炎的藥物中的用途。
B型病毒性肝炎，簡稱B肝，是一種由B型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，簡稱 HBV)感染機體後所引起的疾病。B型肝炎病毒是一種嗜肝病毒，主要存在於肝細胞內並損害肝細胞，引起肝細胞炎症、壞死、纖維化。B型病毒性肝炎分急性和慢性兩種。急性B型肝炎在成年人中大多數可通過其自身的免疫機制而自癒。但是慢性B型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)已成為全球健康保健所面臨的極大挑戰，同時也是引起慢性肝病，肝硬化(cirrhosis)和肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主要原因(Edward J. G., et al., The oral toll-like receptor-7 agonist GS-9620 in patients with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology (2015); 63: 320-328)。據估計，全球有20億人感染了慢性B型肝炎病毒，超過3億5千萬人口已發展成為了B型肝炎，每年近60萬人死於慢性B型肝炎的併發症(Edward J. G., et al., The oral toll-like receptor 7 agonist GS-9620 in patients with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology (2015))。中國是B肝高發區，B型肝炎累積病人多，危害嚴重。據資料顯示，中國現有B型肝炎病毒感染者約9300萬，而其中約2000萬患者確診為慢性B型肝炎，當中10%-20%可演變成肝硬化，1%-5%可發展成肝癌。（張春紅，干擾素在B型肝炎治療中的應用，中國醫藥指南 (2013)；11：475-476.）
B肝功能性治癒的關鍵是清除HBsAg（B型肝炎病毒表面抗原），產生表面抗體。HBsAg 量化是一個非常重要的生物指標。在慢性感染病人中，很少能觀察到HBsAg的減少和血清轉化，這是目前治療的終點。
目前被批准上市的抗HBV藥物主要是免疫調節劑（干擾素-α和聚乙二醇干擾素-α-2α）和抗病毒治療藥物(拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋、克拉夫定(Clevudine)等)。其中，抗病毒治療藥物屬於核苷酸類藥物，其作用機制是抑制HBV DNA的合成，並不能直接減少HBsAg程度。與延長治療一樣，核苷酸類藥物顯示HBsAg清除速度類似於自然觀察結果(Janssen et al. Lancet (2005), 365, 123-129; Marcellin et al. N. Engl.J.Med. (2004), 351, 1206- 1217; Buster et al. Hepatology (2007), 46, 388-394.)。
臨床已有療法降低HBsAg，但療效不佳。因此，若能從基因程度沉默病毒的基因表現，阻斷HBV的生成和複製，特別是HBsAg和HBeAg（B型肝炎S抗原和E抗原）的產生，可從根本上降低病毒代謝和對肝細胞的感染。小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)可基於RNA干擾(RNA interference，RNAi)這一機制，以序列特異性的方式抑制或阻斷靶標目的基因的表現，從mRNA翻譯至蛋白這一層次發揮抑制作用，從而達到治療疾病的目的(WO2016077321, WO2018195165)。這一最為理想的B肝治療手段，需要對siRNA進行穩定化修飾並輔以相應的傳遞系統靶向目的器官和細胞，提高代謝穩定性，但目前的siRNA尚不能有效地降低B肝病毒S抗原和E抗原含量。
同時，siRNA可以通過與某些mRNA片段部分互補配對，從而對該mRNA所對應基因的表現起到調控作用。特別地，siRNA模板股的5’端種子區(seed region)與非靶向基因的互補配對會部分或完全沉默該基因表現，這一現象是siRNA在體內體外出現脫靶效應的主要原因(Jackson et al. RNA (2006), 12, 1179-1187.)。治療B肝的siRNA在臨床與臨床前階段均暴露出該缺點(WO2020036862)。儘管通過一些對核苷酸的修飾可以降低脫靶風險(Iribe et al. ACS Omega (2017), 2, 2055-2064; Janas et al. Nat. Commun. 2018, 9, 723-73))，其沉默的有效性也有所降低，治療安全窗尚待提高。
本發明關於一種利巴韋林衍生物嵌入的雙鏈siRNA類似物、包含其的共軛物，以及其鹽和用途。本發明的雙鏈siRNA類似物、包含其的共軛物以及其鹽可以有效抑制B肝病毒DNA、S抗原、E抗原等多項病毒指標，為B型肝炎例如慢性B型肝炎的治療(例如功能性治癒)提供了有效可行的手段。
因此，在第一方面，本發明提供了一種雙鏈siRNA類似物，其包含編碼股和模板股，其中模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列，r為
Figure 02_image001
，其中所述siRNA類似物中的核苷酸和r中的每一個獨立地是經修飾的或未修飾的。
在一些實施方案中，所述siRNA類似物中的核苷酸和r中的一個或多個是經修飾的，而其它核苷酸和r是未修飾的。所述修飾包括例如甲氧基修飾、氟代修飾、硫代磷酸酯基連接或將核苷酸替換為( S)-甘油核酸等。
在一些實施方案中，所述siRNA類似物中的核苷酸和r中的一個或多個是經修飾的，而其它核苷酸和r是未修飾的。所述修飾包括例如甲氧基修飾、氟代修飾、硫代磷酸酯基連接、將核苷酸替換為( S)-甘油核酸或將核苷酸替換為(E)-乙烯基磷酸酯修飾等。
在一些實施方案中，所述siRNA類似物中的基本上所有的核苷酸和r都是經修飾的。在一些實施方案中，所述siRNA類似物中的所有核苷酸和r都是經修飾的。
在一些實施方案中，所述雙鏈siRNA類似物中的70%、75%、80%、85%、90%或95%以上的核苷酸和r都是經修飾的。在一些實施方案中，所述雙鏈siRNA類似物中的所有核苷酸和r都是經修飾的。
在一些實施方案中，所述SEQ ID NO: 2任選地包括在5’端和/或3’端的突出端。在一些實施方案中，所述SEQ ID NO: 2包括在5’端和/或3’端的0、1、2、3、4或5個核苷酸的突出端。
在一些實施方案中，所述SEQ ID NO:2包括在5’端和/或3’端的2個核苷酸的突出端時，末端的3個核苷酸之間任選地具有2個硫代磷酸酯基連接，其中該3個核苷酸中有2個核苷酸為突出端，另1個核苷酸為鄰接突出端的配對核苷酸。在一些實施方案中，所述突出端優選自經修飾的或未修飾的UU。在一些實施方案中，所述突出端優選自uu。在一些實施方案中，所述突出端uu與其鄰接的1個配對核苷酸之間具有2個硫代磷酸酯基連接。
在一些實施方案中，所述SEQ ID NO: 2包括在3’端的突出端，所述突出端優選自經修飾的或未修飾的UU。在一些實施方案中，所述SEQ ID NO: 2包括在3’端的突出端，所述突出端優選自uu。在一些實施方案中，所述SEQ ID NO: 2包括在3’端的突出端，所述突出端uu與其鄰接的1個配對核苷酸之間具有2個硫代磷酸酯基連接(例如c•u•u)。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列。例如，模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個核苷酸殘基的序列。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列。例如，模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個、兩個、三個、四個或五個核苷酸殘基的序列。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列，所述r替換發生在SEQ ID NO: 2的任意位置。優選地，所述r替換發生在SEQ ID NO: 2的5’端的第1~第21位或第1~第19位。例如，所述r替換發生在SEQ ID NO: 2的5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21位。優選地，所述r替換發生在SEQ ID NO: 2的5’端的第2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、16或18位。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的模板股包含如SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 35，或SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36所示的序列，或由其組成。在一些實施方案中，所述序列包括進一步核苷酸修飾，例如甲氧基修飾、氟代修飾、硫代磷酸酯基連接或將核苷酸替換為( S)-甘油核酸等。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的模板股包含如SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 35，SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 47、或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 48所示的序列，或由其組成。在一些實施方案中，所述序列包括進一步核苷酸修飾，例如甲氧基修飾、氟代修飾、硫代磷酸酯基連接、將核苷酸替換為( S)-甘油核酸或將核苷酸替換為(E)-乙烯基磷酸酯修飾等。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的編碼股包含如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28所示的序列，或由其組成。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的編碼股包含在如SEQ ID NO: 1所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列。例如，編碼股包含在如SEQ ID NO: 1所示的序列中使用r替換了一個核苷酸殘基的序列。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的編碼股包含在如SEQ ID NO: 1所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列。例如，編碼股包含在如SEQ ID NO:1所示的序列中使用r替換了1、2、3、4或5個核苷酸殘基的序列。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的編碼股包含在如SEQ ID NO: 1所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列，所述r替換發生在SEQ ID NO: 1的5’端的第1~第19位。例如，所述r替換發生在SEQ ID NO: 1的5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19位。優選地，所述r替換發生在SEQ ID NO: 1的5’端的第2、3、7、12、15、17或19位。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的編碼股的序列包含如SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 26，或SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 25所示的序列，或由其組成。在一些實施方案中，所述序列包括進一步核苷酸修飾，例如甲氧基修飾、氟代修飾、硫代磷酸酯基連接等。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的編碼股的序列包含如SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42、或SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 43所示的序列，或由其組成。在一些實施方案中，所述序列包括進一步核苷酸修飾，例如甲氧基修飾、氟代修飾、硫代磷酸酯基連接、將核苷酸替換為( S)-甘油核酸或將核苷酸替換為(E)-乙烯基磷酸酯修飾等。
在一些具體的實施方案中，雙鏈siRNA類似物中的編碼股和模板股包含在序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列，如模板股SEQ ID NO: 2所示的序列，所述r替換發生在SEQ ID NO: 2的5’端的第2位，編碼股SEQ ID NO: 1所示的序列，所述r替換發生在5’端的第7位。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物為S18~S28中的任意一種： S18：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S19：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19，S20：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20，S21：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21，S22：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22，S23：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S24：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24，S25：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 33，S26：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34，S27：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 35，S28：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物為S1~S17中的任意一種：S1：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S2：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S3：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19，S4：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19，S5：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20，S6：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20，S7：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21，S8：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21，S9：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22，S10：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22，S11：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S12：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S13：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24，S14：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24，S15：編碼股為SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 25、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S16：編碼股為SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 26、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S17：編碼股為SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 27、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物為S29~S35中的任意一種：S29：編碼股為SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S30：編碼股為SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 43、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S31：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 44，S32：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 45，S33：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 46，S34：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 47，S35：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 48。
在一些實施方案中，所述雙鏈siRNA類似物選自：編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 4、編碼股為SEQ ID NO: 5和模板股為SEQ ID NO: 4、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 6、編碼股為SEQ ID NO: 5和模板股為SEQ ID NO: 6、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 7、編碼股為SEQ ID NO: 5和模板股為SEQ ID NO: 7、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 8、編碼股為SEQ ID NO: 5和模板股為SEQ ID NO: 8、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 9、編碼股為SEQ ID NO: 5和模板股為SEQ ID NO: 9、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 10、編碼股為SEQ ID NO: 5和模板股為SEQ ID NO: 10、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 11、編碼股為SEQ ID NO: 5和模板股為SEQ ID NO: 11、編碼股為SEQ ID NO: 12和模板股為SEQ ID NO: 4、編碼股為SEQ ID NO: 13和模板股為SEQ ID NO: 4、編碼股為SEQ ID NO: 14和模板股為SEQ ID NO: 4、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 4、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 6、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 7、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 8、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 9、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 10、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 11、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 29、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 30、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 31、編碼股為SEQ ID NO: 1和模板股為SEQ ID NO: 32、編碼股為SEQ ID NO: 37和模板股為SEQ ID NO: 10、編碼股為SEQ ID NO: 38和模板股為SEQ ID NO: 10、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 39、編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 10、或編碼股為SEQ ID NO: 3和模板股為SEQ ID NO: 40，所述雙鏈siRNA類似物中的核苷酸和r中的每一個獨立地是經修飾的或未修飾的。
在一些實施方案中，所述雙鏈siRNA類似物選自：
序號 SEQ ID NO 編碼股序列（5’-3’） SEQ ID NO 模板股序列（5’-3’）
1 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU
2 5 GUrUGCACUUCGCUUCACA 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU
3 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 6 UrUGAAGCGAAGUGCACACUU
4 5 GUrUGCACUUCGCUUCACA 6 UrUGAAGCGAAGUGCACACUU
5 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 7 UGrGAAGCGAAGUGCACACUU
6 5 GUrUGCACUUCGCUUCACA 7 UGrGAAGCGAAGUGCACACUU
7 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 8 UGUrAAGCGAAGUGCACACUU
8 5 GUrUGCACUUCGCUUCACA 8 UGUrAAGCGAAGUGCACACUU
9 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 9 UGUGrAGCGAAGUGCACACUU
10 5 GUrUGCACUUCGCUUCACA 9 UGUGrAGCGAAGUGCACACUU
11 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU
12 5 GUrUGCACUUCGCUUCACA 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU
13 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 11 UGUGAAGrGAAGUGCACACUU
14 5 GUrUGCACUUCGCUUCACA 11 UGUGAAGrGAAGUGCACACUU
15 12 GUGUGCrCUUCGCUUCACA 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU
16 13 GUGUGCACUUCGCUUCrCA 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU
17 14 GUGUGCACUUCGCUUCACr 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU
18 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU
19 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 6 UrUGAAGCGAAGUGCACACUU
20 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 7 UGrGAAGCGAAGUGCACACUU
21 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 8 UGUrAAGCGAAGUGCACACUU
22 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 9 UGUGrAGCGAAGUGCACACUU
23 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU
24 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 11 UGUGAAGrGAAGUGCACACUU
25 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 29 UGUGAAGCGrAGUGCACACUU
26 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 30 UGUGAAGCGArGUGCACACUU
27 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 31 UGUGAAGCGAAGUGCrCACUU
28 1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 32 UGUGAAGCGAAGUGCACrCUU
29 37 GrGUGCACUUCGCUrCACA 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU
30 38 GrGUGCACUUCrCUUCACA 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU
31 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 39 UGUrAArCGAAGUGCACACUU
32 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU
33 3 GrGUGCACUUCGCUUCACA 40 UGUGAAGCGAArUGCACACUU
所述雙鏈siRNA類似物中的核苷酸和r中的每一個獨立地是經修飾的或未修飾的。
在一些實施方案中，所述雙鏈siRNA類似物選自：編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 17、編碼股為SEQ ID NO: 18和模板股為SEQ ID NO: 17、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 19、編碼股為SEQ ID NO: 18和模板股為SEQ ID NO: 19、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 20、編碼股為SEQ ID NO: 18和模板股為SEQ ID NO: 20、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 21、編碼股為SEQ ID NO: 18和模板股為SEQ ID NO: 21、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 22、編碼股為SEQ ID NO: 18和模板股為SEQ ID NO: 22、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 23、編碼股為SEQ ID NO: 18和模板股為SEQ ID NO: 23、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 24、編碼股為SEQ ID NO: 18和模板股為SEQ ID NO: 24、編碼股為SEQ ID NO: 25和模板股為SEQ ID NO: 17、編碼股為SEQ ID NO: 26和模板股為SEQ ID NO: 17、編碼股為SEQ ID NO: 27和模板股為SEQ ID NO: 17、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 17、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 19、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 20、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 21、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 22、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 23、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 24、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 33、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 34、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 35、編碼股為SEQ ID NO: 28和模板股為SEQ ID NO: 36、編碼股為SEQ ID NO: 42和模板股為SEQ ID NO: 23、編碼股為SEQ ID NO: 43和模板股為SEQ ID NO: 23、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 44、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 45、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 46、編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 47、或編碼股為SEQ ID NO: 16和模板股為SEQ ID NO: 48。
在一些實施方案中，所述雙鏈siRNA類似物選自：
序號 SEQ ID NO 編碼股序列（5’-3’） SEQ ID NO 模板股序列（5’-3’）
1 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
2 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucaca 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
3 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 19 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
4 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucaca 19 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
5 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
6 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucaca 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
7 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 21 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u
8 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucaca 21 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u
9 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 22 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u
10 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucaca 22 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u
11 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
12 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucaca 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
13 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 24 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u
14 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucaca 24 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u
15 25 g•u•gu Gcr CUucgcuucaca 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
16 26 g•u•gu Gc ACUucgcuucrca 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
17 27 g•u•gu Gc ACUucgcuucacr 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
18 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
19 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 19 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
20 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
21 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 21 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u
22 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 22 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u
23 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
24 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 24 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u
25 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 33 u• G•uga(Agn)g CGragu Gc Acac•u•u
26 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 34 u• G•uga(Agn)g CGargu Gc Acac•u•u
27 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 35 u• G•uga(Agn)g CGaagu Gcrcac•u•u
28 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucaca 36 u• G•uga(Agn)g CGaagu Gc Acrc•u•u
29 42 g•r•gu Gc ACUucgcurcaca 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
30 43 g•r•gu Gc ACUucrcuucaca 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
31 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 44 u• G•ura Ar CGaagu Gc Acac•u•u
32 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 45 u• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u
33 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 46 u• G•uga(Agn)g CGaaru Gc Acac•u•u
35 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 47 VPu• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
36 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucaca 48 VPu• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u
在第二方面，本發明提供了雙鏈siRNA類似物的共軛物，其包含根據本發明的第一方面的雙鏈siRNA類似物，以及與雙鏈siRNA類似物共軛的藥學上可接受的共軛基團。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物的共軛物中的藥學上可接受的共軛基團含有1至5個GalNAc（N-乙醯半乳糖胺）基團。優選地，所述藥學上可接受的共軛基團含有1、2、3、4或5個GalNAc基團。更優選地，所述藥學上可接受的共軛基團含有3或4個GalNAc基團。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物的共軛物中的藥學上可接受的共軛基團包含化合物基團D
Figure 02_image003
。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物的共軛物中的藥學上可接受的共軛基團連接至雙鏈siRNA類似物的編碼股的3’末端。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物或雙鏈siRNA類似物的共軛物的硫代磷酸酯部分包括(R)-和(S)-鏡像異構物、非鏡像異構物、和/或其外消旋混合物。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物的共軛物選自：
序號 編碼股序列（5’-3’）-共軛基團 SEQ ID NO: 模板股序列（5’-3’） SEQ ID NO:
1 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 17
2 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 18 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 17
3 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 19
4 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 18 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 19
5 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 20
6 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 18 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 20
7 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u 21
8 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 18 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u 21
9 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u 22
10 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 18 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u 22
11 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 23
12 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 18 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 23
13 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u 24
14 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 18 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u 24
15 g•u•gu Gcr CUucgcuucacaD 25 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 17
16 g•u•gu Gc ACUucgcuucrcaD 26 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 17
17 g•u•gu Gc ACUucgcuucacrD 27 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 17
18 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 17
19 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 19
20 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 20
21 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u 21
22 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u 22
23 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 23
24 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u 24
25 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•uga(Agn)g CGragu Gc Acac•u•u 33
26 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•uga(Agn)g CGargu Gc Acac•u•u 34
27 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•uga(Agn)g CGaagu Gcrcac•u•u 35
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 28 u• G•uga(Agn)g CGaagu Gc Acrc•u•u 36
29 g•r•gu Gc ACUucgcurcacaD 42 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 23
30 g•r•gu Gc ACUucrcuucacaD 43 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 23
31 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•ura Ar CGaagu Gc Acac•u•u 44
32 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u 45
33 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 u• G•uga(Agn)g CGaaru Gc Acac•u•u 46
34 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 VPu• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 47
35 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 16 VPu• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u 48
所述D如前所示。
在協力廠商面，本發明提供了根據本發明的第一方面的雙鏈siRNA類似物或根據本發明的第二方面的雙鏈siRNA類似物的共軛物的鹽。
在一些實施方案中，如上所述的鹽選自鹼加成鹽、酸加成鹽及其組合。
在一些實施方案中，鹼加成鹽選自鈉、鉀、鈣、銨、有機胺、鎂鹽及其組合，酸加成鹽選自無機酸鹽、有機酸鹽及其組合。
在一些實施方案中，無機酸選自鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸及其組合，有機酸選自乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸及其組合。
在第四方面，本發明提供了藥物組合物，其包含根據本發明的第一方面的雙鏈siRNA類似物，根據本發明的第二方面的雙鏈siRNA類似物的共軛物，或根據本發明的協力廠商面的鹽，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
在第五方面，本發明提供了根據本發明的第一方面的雙鏈siRNA類似物，根據本發明的第二方面的雙鏈siRNA類似物的共軛物，或根據本發明的協力廠商面的鹽，或根據本發明的第四方面的藥物組合物，其在製備用於治療B型肝炎的藥物中的用途。
在一些實施方案中，本發明提供了根據本發明的第一方面的雙鏈siRNA類似物，根據本發明的第二方面的雙鏈siRNA類似物的共軛物，或根據本發明的協力廠商面的鹽，或根據本發明的第四方面的藥物組合物，其用於治療受試者中的B型肝炎。
在第六方面，本發明提供了治療受試者中B型病毒肝炎的方法，其包括將根據本發明的第一方面的雙鏈siRNA類似物，根據本發明的第二方面的雙鏈siRNA類似物的共軛物，或根據本發明的協力廠商面的鹽，或根據本發明的第四方面的藥物組合物施用於受試者的步驟。
在第七方面，本發明提供了用於治療受試者中的B型肝炎的根據本發明的第一方面的雙鏈siRNA類似物，根據本發明的第二方面的雙鏈siRNA類似物的共軛物，或根據本發明的協力廠商面的鹽，或根據本發明的第四方面的藥物組合物。
在本發明的一些實施方案中，所述B型肝炎可以處於疾病的任意階段。例如急性B型肝炎、慢性B型肝炎，或由B型肝炎病毒感染引起的肝硬化或肝癌。在一些實施方案中，所述B型肝炎是慢性B型肝炎。
除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照本發明所屬領域中具有通常知識者所理解的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。
本發明中，除非另有說明，否則術語「包含、包括和含有」或等同物為開放式表述，意味著除所列出的要素、組分或步驟外，還可涵蓋其他未指明的要素、組分或步驟。
本發明中，HBV基因是指DNA序列如Genbank註冊號NC_003977.1所示的基因。如Genbank註冊號NC_003977.1所示的基因是HBV的完整基因組。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物可以靶向HBV的X開放閱讀框(X opening reading frame，X ORF)。
本發明中，雙鏈siRNA類似物是指核糖核酸分子的複合體，其具有雙鏈結構，包含兩條反向平行的且基本上互補的核酸鏈，其相對於靶RNA具有「正義」和「反義」定向。在本發明中，「互補」具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。嘌呤鹼基腺嘌呤(A)始終與嘧啶鹼基尿嘧啶(U)相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤(C)始終與嘧啶鹼基胞嘧啶(G)相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的尿嘧啶配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。
在本發明中，如無特別說明，大寫字母C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成。小寫字母c、g、u、a分別表示其相應大寫字母所代表的核苷酸被甲氧基修飾；底線表示大寫字母代表的核苷酸被氟代修飾；間隔號「•」表示與間隔號「•」左右相鄰的兩個核苷酸殘基之間為硫代磷酸酯基連接；VP表示該字母VP右側的一個核苷酸為( E)-乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸。例如，「a•g」表示a和g殘基之間通過硫代磷酸酯基連接。
本發明中所述核苷酸的「修飾」包括但不限於甲氧基修飾、氟代修飾、( E)-乙烯基磷酸酯修飾、硫代磷酸酯基連接或將核苷酸替換為( S)-甘油核酸等。本發明所述的序列可以包括如下表1中「進一步修飾的序列」所列。
本發明所述氟代修飾的核苷酸指核苷酸的核糖基2’位的羥基被氟取代形成的核苷酸，所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2’-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
本發明所述( E)-乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸表示以下結構單元：
Figure 02_image005
，其中，E選自
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
和
Figure 02_image015
；X選自OCH 3和F。
本發明所述( S)-甘油核酸(Agn)表示以下結構單元：
Figure 02_image017
；
(Agn)和其他核苷酸殘基通過磷酸酯或硫代磷酸酯互相連接，如「a•(Agn)」表示a和(Agn)殘基之間通過硫代磷酸酯基連接，「a(Agn)」表示a和(Agn)殘基之間通過磷酸酯基連接。
在一些實施方案中，雙鏈siRNA類似物包含編碼股或r’嵌入的編碼股和r’嵌入的模板股。編碼股、r’嵌入的編碼股和r’嵌入的模板股均含有核苷酸基團作為基本結構單元。本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知，核苷酸基團含有磷酸基團、核糖基團和鹼基，在此不再贅述。
本發明所述r’嵌入的序列是指所述序列中存在至少一個核苷酸殘基與r相連接，包括如在序列（如SEQ ID NO: 2）中使用r替換了一個核苷酸殘基的序列。本發明所述r’嵌入的序列包括但不限於：r’嵌入的雙鏈siRNA、r’嵌入的編碼股和r’嵌入的模板股。例如，5’-aGUrrA•C-3’、5’-rGgAAC-3’和5’-AG•UrAAcCuCr-3’都屬於r’嵌入的情形。
本發明所述r’嵌入的雙鏈siRNA是指雙鏈siRNA中存在至少一個核苷酸殘基與r相連接，包括如在雙鏈siRNA的序列中使用r替換了一個核苷酸殘基的雙鏈siRNA。本發明所述r’嵌入的編碼股是指編碼股中存在至少一個核苷酸殘基與r相連接，包括如編碼股中的一個或者多個核苷酸被r替換。本發明所述r’嵌入的模板股是指模板股中存在至少一個核苷酸殘基與r相連接，包括如模板股中的一個或者多個核苷酸被r替換。
本發明所述r’為
Figure 02_image019
（其中，X選自SH和OH），為天然核苷酸鹼基的類似物，不同於任何公開專利的天然核苷酸鹼基，在核酸序列的引入帶來不可預料的活性。
本發明所述r表示以下結構單元：
Figure 02_image021
； r和其他核苷酸殘基通過磷酸酯或硫代磷酸酯互相連接，如「a•r」表示a和r殘基之間通過硫代磷酸酯基連接，「ar」表示a和r殘基之間通過磷酸酯基連接。
本發明所述「多個」指大於等於2的整數，包括但不限於2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個，至多可達所述siRNA類似物的理論上限。
本發明中，所述雙鏈siRNA類似物的編碼股或模板股也可以包括「突出端」，例如不直接參與RNA雙螺旋結構的未配對突出核苷酸，其中RNA雙螺旋結構通常由本文定義的「編碼股」和「模板股」對形成。這樣的突出端可以包括一個或多個修飾的或未修飾的U、T和A。例如，所述SEQ ID NO: 2可以在5’和/或3’段包括修飾的或未修飾的UU突出端。
本發明中，雙鏈siRNA類似物的共軛物是雙鏈siRNA類似物和藥學上可接受的共軛基團連接形成的化合物，並且雙鏈siRNA類似物和藥學上可接受的共軛基團共價連接。
本發明中，藥學上可接受的共軛基團可連接至雙鏈siRNA類似物的編碼股或者r’嵌入的編碼股的3’末端。
一般來說，藥學上可接受的共軛基團包含藥學上可接受的靶向分子和任選的鏈接(linker)。示例性的共軛基團、接頭、靶向分子的種類可參見WO2015006740A2的公開內容。示例性的共軛基團包括但不限於L96或化合物基團D。
在本發明的上下文中，除非另有說明，「共軛」是指兩個或多個各自具有特定功能的化學部分之間以共價連接的方式彼此連接；相應地，「共軛物」是指該各個化學部分之間通過共價連接而形成的化合物。
本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構物形式。本發明設想所有的這類化合物，包括( R)-和( S)-鏡像異構物、非鏡像異構物，及其外消旋混合物和其他混合物，例如鏡像異構物或非鏡像異構物富集的混合物，所有這些混合物都屬於本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構物以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。
除非另有說明，術語「鏡像異構物」或者「旋光異構物」是指互為鏡像關係的立體異構物。
除非另有說明，術語「非鏡像異構物」是指分子具有兩個或多個手性中心，並且分子間為非鏡像的關係的立體異構物。
除非另有說明，用楔形實線鍵（
Figure 02_image023
）和楔形虛線鍵（
Figure 02_image025
）表示一個立體中心的絕對組態，用直形實線鍵（
Figure 02_image027
）和直形虛線鍵（
Figure 02_image029
）表示立體中心的相對組態，用波浪線（
Figure 02_image031
）表示楔形實線鍵（
Figure 02_image023
）或楔形虛線鍵（
Figure 02_image025
），或用波浪線（
Figure 02_image031
）表示直形實線鍵（
Figure 02_image027
）和/或直形虛線鍵（
Figure 02_image029
）。
除非另有說明，術語「富含一種異構物」、「異構物富集」、「富含一種鏡像異構物」或者「鏡像異構物富集」指其中一種異構物或鏡像異構物的含量小於100%，並且，該異構物或鏡像異構物的含量大於等於60%，或者大於等於70%，或者大於等於80%，或者大於等於90%，或者大於等於95%，或者大於等於96%，或者大於等於97%，或者大於等於98%，或者大於等於99%，或者大於等於99.5%，或者大於等於99.6%，或者大於等於99.7%，或者大於等於99.8%，或者大於等於99.9%。
除非另有說明，術語「異構物過量」或「鏡像異構物過量」指兩種異構物或兩種鏡像異構物相對百分數之間的差值。例如，其中一種異構物或鏡像異構物的含量為90%，另一種異構物或鏡像異構物的含量為10%，則異構物或鏡像異構物過量（ee值）為80%。
可以通過的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的( R)-和( S)-異構物以及 D和 L異構物。如果想得到本發明某化合物的一種鏡像異構物，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非鏡像異構物混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需鏡像異構物。或者，當分子中含有鹼性官能團（如氨基）或酸性官能團（如羧基）時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非鏡像異構物的鹽，然後通過本發明所屬領域所公知的常規方法進行非鏡像異構物拆分，然後回收得到純的鏡像異構物。此外，鏡像異構物和非鏡像異構物的分離通常是通過使用色層分析法完成的，所述色層分析法採用手性固定相，並任選地與化學衍生法相結合（例如由胺生成氨基甲酸鹽）。本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚( 3H)，碘-125( 125I)或C-14( 14C)。又例如，可用重氫取代氫形成氘代藥物，氘與碳構成的鍵比普通氫與碳構成的鍵更堅固，相比於未氘化藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。
術語「鹽」是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或鹼製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的鹼與這類化合物接觸的方式獲得鹼加成鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機胺或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括胺基酸（如精氨酸等）的鹽，以及如葡糖醛酸等有機酸的鹽。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一鹼或酸加成鹽。
本發明的鹽可由含有酸根或鹼基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由游離酸或鹼形式的這些化合物與化學計量的適當的鹼或酸反應來製備。
本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。
本發明所使用的溶劑可經市售獲得。
如無特殊說明，本發明管柱層析、製備薄層矽膠層析所用溶劑配比均為體積比。
縮寫詞清單
Ac 乙醯基
Boc 叔丁氧羰基
DMSO 二甲亞碸
DMT/DMTr 4,4’-二甲氧基三苯基甲基
dsRNA 雙鏈核糖核酸
EC 50 半最大效應濃度
EDTA 乙二胺四乙酸二鈉
i-Pr 異丙基
Me 甲基
Ms 甲烷磺醯基
Ph 苯基
p-HPLC 製備高效液相色譜，用於化合物的純化
RNA 核糖核酸
RNAi 核糖核酸干擾技術
siRNA 小干擾核糖核酸
t-Bu 叔丁基
Tris 三羥甲基氨基甲烷
化合物依據本發明所屬技術領域常規命名原則或者使用ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。
下面通過實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本發明的化合物可以通過本發明所屬領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬領域中具有通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。對本發明所屬領域中具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。
實施例1  亞磷醯胺單體的合成
Figure 02_image033
步驟A：(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯氨基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-爪基三醋酸鹽（即式1-1）（30克，94.26毫莫耳）與1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯（11.98克，94.26毫莫耳）溶於乙酸甲酯（220毫升）的溶液，在90攝氏度油浴中於1bar的壓力下濃縮至接近完全乾燥。將三氟甲烷磺酸（141.46毫克，0.94毫莫耳）的乙酸甲酯溶液（2毫升）加入混合液中，並於30mbar的壓力下在125攝氏度的油浴中攪拌4小時。反應液冷卻至70攝氏度，加入乙醇（70毫升），在70攝氏度下攪拌直至形成均一的溶液，並停止攪拌冷卻至50攝氏度。生成沉澱後，靜置冷卻至25攝氏度並將反應液在0攝氏度下放置16小時。反應液通過布氏漏斗過濾，濾餅用乙醇180毫升（60毫升x3）淋洗，真空乾燥得1-2。 1H NMR (400 MHz,CDCl 3)：δ 8.40(s,1H), 6.04(d, J= 3.42Hz,1H), 5.69-5.81(m,1H), 5.54(t, J= 5.38Hz,1H), 4.42-4.51(m，2H)，4.16-4.30(m,1H)，3.98(s,3H)，2.05-2.18(m,9H)。
步驟B：將式1-2（15克，38.93毫莫耳）所示化合物與三乙胺（4.14克，40.87毫莫耳）溶於甲醇（100毫升）。混合液在氮氣保護下於50攝氏度攪拌17小時。反應液減壓濃縮得1-3。 1H NMR (400 MHz, CD 3OD)：δ 8.87 (s，1H)，5.93(d, J= 3.42Hz，1H)，4.48(dd, J= 3.48，4.83 Hz，1H)，4.33(t, J= 5.26Hz, 1H)，4.10-4.16(m,1H)，3.95(s, 3H)，3.84(dd, J= 3.24, 12.29Hz, 1H)，3.70(dd, J= 4.46, 12.29 Hz,1H)。
步驟C：將式1-3（10克，38.58毫莫耳）所示化合物溶於吡啶（250毫升）於0攝氏度滴加1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷（12.29克，38.97毫莫耳）。混合液逐漸升溫至25攝氏度攪拌16小時。反應液減壓濃縮，將濃縮物懸浮在乙酸乙酯（250毫升）中，通過布氏漏斗過濾。濾液用3M鹽酸750毫升（250毫升x3）和飽和食鹽水250毫升（250毫升x1）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經管柱層析（SiO 2，石油醚/二氯甲烷/乙酸乙酯=3/1/1）純化後得1-4。 1H NMR (400MHz，CDCl 3)：δ 8.43(s，1H)，5.95(s，1H)，4.73(dd， J= 4.75，8.00Hz，1H)，4.41(d， J= 4.75Hz，1H)，4.09-4.19(m，2H)，3.94-4.03(m，4H)，2.71-3.34(m，1H)，1.01-1.15(m，28H)。
步驟D：向含有式1-4（8.23克，16.40毫莫耳）所示化合物，碳酸鉀（11.34克，82.02毫莫耳）和氧化銀(I)（19.01克，82.02毫莫耳）的 N, N-二甲基甲醯胺（50毫升）的混合液中加入碘甲烷（11.64克，82.02毫莫耳），並於25攝氏度下攪拌3小時。反應液用乙酸乙酯（300毫升）稀釋，通過布氏漏斗過濾。濾液用硫代硫酸鈉水溶液250毫升（250毫升x1）、水250毫升（250毫升x1）和飽和食鹽水250毫升（250毫升x1）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經管柱層析（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯=5/1）純化後得1-5。 1H NMR (400 MHz，CDCl 3)：δ 8.58(s，1H)，5.91(s，1H)，4.46(dd， J= 4.22，9.35Hz，1H)，4.17-4.28(m，2H)，3.96-4.06(m，5H)，3.68(s，3H)，0.99-1.13(m，28H)。
步驟E：在0攝氏度下，向式1-5（3.27克，6.34毫莫耳）所示化合物的四氫呋喃（50毫升）溶液中滴加三乙胺三氫氟酸鹽（2.25克，13.95毫莫耳），混合液逐漸升溫至25攝氏度並攪拌16小時。反應液減壓濃縮得初產物。經管柱層析（SiO 2，二氯甲烷/甲醇=20/1）純化後得1-6。 1H NMR (400 MHz，CD 3OD)：δ 8.88(s，1H)，6.04(d， J= 3.26Hz，1H)，4.44(t， J= 5.33Hz，1H)，4.20(dd， J=3.33，4.83Hz，1H)，4.07-4.14(m，1H)，3.96(s，3H)，3.84(dd， J=3.20，12.36Hz，1H)，3.69(dd， J=4.39，12.30Hz，1H)，3.52(s，3H)。
步驟F：在0攝氏度下，向式1-6（1.30克，4.76毫莫耳）所示化合物的吡啶（20毫升）溶液中加入4,4-二甲氧基三苯甲基氯（2.42克，7.14毫莫耳），並於25攝氏度下攪拌16小時。反應液用乙酸乙酯（70毫升）稀釋後，於25攝氏度用飽和碳酸氫鈉水溶液（20毫升）淬滅並用水（40毫升）稀釋。分液後合併的有機相用水60毫升（60毫升x1）和飽和食鹽水60毫升（60毫升x1）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經 p-HPLC純化(分離柱：Phenomenex luna C18（規格：250mm x50mm，粒徑：10μm）；流動相： [水(10 mM碳酸氫銨)-乙腈]；洗脫梯度：35%-65%，20min)得1-7。 1H NMR (400 MHz，CDCl 3)：δ 8.44(s，1H)，7.38-7.45(m，2H)，7.28-7.34(m，5H)，7.18-7.27(m，2H)，6.70-6.92(m，4H)，5.97(d， J=2.88 Hz，1H)，4.37-4.43(m，1H)，4.33(dd， J=2.88，5.00 Hz，1H)，4.19-4.25(m，1H)，3.98(s，3H)，3.80(s，6H)，3.58(s，3H)，3.43-3.49(m，1H)，3.33-3.40(m，1H)，2.55(d， J=6.88 Hz，1H)。LCMS (ESI) m/z：574.2 [M-H] -。
步驟G：在0攝氏度下，向式1-7（1.10克，1.91毫莫耳）所示化合物的二氯甲烷（8毫升）溶液中加入2-氰乙基- N, N-二異丙基氯亞磷醯胺（678.45毫克，2.87毫莫耳）和 N, N-二異丙基乙胺，並於20攝氏度下攪拌0.5小時。反應液減壓濃縮得初產物。經柱層析（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯=50/1至1/2）純化後得式1化合物。LCMS (ESI) m/z：776.3 [M+H] +。
實施例2  D01的合成
Figure 02_image035
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
Figure 02_image043
步驟A：將11-十二炔-1-醇（25克，137.14毫莫耳）和三乙胺（16.65克，164.56毫莫耳）溶於二氯甲烷（250毫升），於0攝氏度加入甲烷磺醯氯（18.85克，164.56毫莫耳）。混合液在0攝氏度攪拌2小時。反應液用水（400毫升）稀釋，二氯甲烷800毫升（400毫升x2）萃取。合併的有機相用水400毫升（200毫升x2）和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得2-2。
步驟B：式2-3（20克，67.26毫莫耳）所示化合物溶於 N, N-二甲基甲醯胺（200毫升）於0攝氏度加入氫化鈉（60%純度，4.04克，100.89毫莫耳），接著加入式2-2（19.27克，73.99毫莫耳）所示化合物。混合液在25攝氏度攪拌16小時。反應液用水（1升）淬滅，並用二氯甲烷1.6升（800毫升x2）萃取。合併的有機相用飽和食鹽水800毫升（800毫升x1）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得2-4。 1H NMR (400 MHz，DMSO- d 6)：δ 7.63-6.89(m，10H)，5.64-5.52(m，2H)，4.27-4.01(m，2H)，3.98-3.77(m，2H)，3.72-3.18(m，4H)，2.23-2.14(m，2H)，1.98-1.92(m，1H)，1.54-1.23(m，16H)。
步驟C：將式2-4（48克，103.98毫莫耳）所示化合物溶於甲醇（870毫升），加入氯化氫甲醇溶液（4莫耳每升，400毫升，1.6莫耳）。混合液在30攝氏度攪拌2小時。向反應液加入氯化氫甲醇溶液（4莫耳每升，350毫升，1.4莫耳）。混合液在30攝氏度攪拌16小時。反應液減壓濃縮，加入三氯甲烷200毫升（100毫升x2），減壓濃縮直至出現白色固體。加入甲苯（130毫升）和石油醚（130毫升），混合液在15攝氏度攪拌16小時。反應液經過布氏漏斗過濾，收集濾餅經真空乾燥得白色固體。白色固體溶於二氯甲烷（50毫升），加入氫氧化鈉（6.59克，164.66毫莫耳）的水溶液（50毫升），在20攝氏度攪拌1小時。反應液用水（500毫升）稀釋，並用二氯甲烷1升（500毫升x2）萃取。合併的有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得2-5。
步驟D：向式2-5（23克，80.58毫莫耳）所示化合物和氫氧化鈉（322.31毫克，8.06毫莫耳）的二甲亞碸（70毫升）和水（6毫升）的混合液中加入丙烯酸叔丁酯（22.72克，177.28毫莫耳），在氮氣保護下於25攝氏度攪拌16小時。反應液用水（500毫升）稀釋，並用乙酸乙酯1升（500毫升x2）萃取。合併的有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經管柱層析（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯/乙醇（含0.1%氨水）=36/3/1至16/3/1）純化後得2-6。 1H NMR (400 MHz，DMSO- d 6)：δ 3.60-3.54(m，4H)，3.32(br s，5H)，3.15(s，5H)，2.74-2.66(m，1H)，2.40(t， J=6.0Hz，4H)，2.18-2.11(m，2H)，1.58-1.38(m，22H)，1.34-1.23(m，12H)。
步驟E：向式2-6（24.5克，45.22毫莫耳）所示化合物的二氯甲烷（250毫升）溶液中加入三乙胺（9.15克，90.45毫莫耳）和丁二酸酐（6.79克，67.83毫莫耳），於20攝氏度攪拌16小時。反應液加入二氯甲烷（1升）和鹽酸（1莫耳每升，1升），分液後的有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得2-7。 1H NMR (400 MHz，CDCl 3)：δ 6.49-6.37(m，1H)，3.72(s，2H)，3.70-3.57(m，8H)，3.37(t， J= 6.7Hz，2H)，2.69-2.51(m，4H)，2.50-2.36(m，4H)，2.22-2.13(m，2H)，1.96-1.90(m，1H)，1.57-1.47(m，4H)，1.46-1.40(m，18H)，1.40-1.31(m，2H)，1.30-1.21(m，10H)。
步驟F：將式2-7（27.4克，42.69毫莫耳）所示化合物溶於甲酸（140毫升），混合液在氮氣保護下於20攝氏度攪拌16小時。反應液減壓濃縮，加入甲苯300毫升（150毫升x2），減壓濃縮得2-8。 1H NMR (400MHz，CDCl 3)：δ 9.79-9.22(m，3H)，6.44-6.23(m，1H)，3.88-3.43(m，10H)，3.39-3.20(m，2H)，2.77-2.31(m，8H)，2.15-2.06(m，2H)，1.87(t， J=2.6Hz，1H)，1.48-1.28(m，6H)，1.26-1.12(m，10H)。
步驟G：將式2-8（22.6克，42.67毫莫耳）所示化合物、 N, N-二異丙基乙胺（33.09克，256.03毫莫耳）和 O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)- N, N, N, N-四甲基脲六氟磷酸鹽（51.92克，136.55毫莫耳）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（250毫升），加入 N-（3-氨基丙基）氨基甲酸叔丁酯（29.74克，170.69毫莫耳）。混合液在20攝氏度攪拌16小時。反應液加入二氯甲烷（1升）和鹽酸（1莫耳每升，1升），分液後的有機相用水1升（1升x1）、碳酸氫鈉水溶液1升（1升x1）和飽和食鹽水1升（1升x1）依次洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經管柱層析（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯/乙醇=40/3/1至10/3/1）純化後得2-9。 1H NMR (400 MHz，CDCl 3)：δ 7.22-6.79(m，3H)，6.77-6.44(m，1H)，5.45-5.00(m，3H)，3.86-3.73(m，2H)，3.72-3.63(m，4H)，3.62-3.45(m，4H)，3.41-3.32(m，2H)，3.32-3.20(m，6H)，3.19-3.03(m，6H)，2.56-2.47(m，4H)，2.47-2.39(m，4H)，2.21-2.12(m，2H)，1.95-1.90(m，1H)，1.70-1.57(m，6H)，1.56-1.47(m，4H)，1.46-1.38(m，29H)，1.30-1.25(m，10H)。
步驟H：式2-9（15克，15.03毫莫耳）所示化合物溶於二氯甲烷（114毫升）加入三氟乙酸（38毫升），混合液於20攝氏度攪拌16小時。反應液減壓濃縮，加入甲苯/乙腈=3/1混合液600毫升（250毫升x3）減壓濃縮得2-10（（（三（三氟乙酸鹽）））。
步驟I：式2-11（22.15克，49.50毫莫耳）所示化合物， N, N-二異丙基乙胺（7.75克，60.00毫莫耳），1-羥基-7-氮雜苯並三唑（6.12克，45.00毫莫耳）和 O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)- N, N, N, N-四甲基脲六氟磷酸鹽（20.53克，54.00毫莫耳）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（90毫升），向該混合液加入式2-10（三（三氟乙酸鹽），15.6克，15.00毫莫耳）所示化合物和 N, N-二異丙基乙胺（21.32克，165.00毫莫耳）的 N, N-二甲基甲醯胺（120毫升）溶液。混合液在20攝氏度攪拌16小時。反應液加入二氯甲烷（1.2升）和鹽酸（1莫耳每升，1升），分液後的有機相用水1升（1升x1）、碳酸氫鈉水溶液1升（1升x1）和飽和食鹽水1升（1升x1）依次洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經管柱層析（SiO 2，二氯甲烷/甲醇=100/1至10/1至二氯甲烷/乙醇=1/1）純化後得2-12。 1H NMR(400 MHz，DMSO- d 6)：δ 7.87-7.66(m，9H)，7.09(s，1H)，5.21(d， J=3.4Hz，3H)，4.96(dd， J=3.4，11.3Hz，3H)，4.48(d， J=8.5Hz，3H)，4.06-3.98(m，9H)，3.91-3.82(m，3H)，3.74-3.66(m，3H)，3.58-3.46(m，12H)，3.31(br s，3H)，3.07-2.98(m，12H)，2.71(t， J=2.6Hz，1H)，2.33-2.22(m，8H)，2.16-2.12(m，2H)，2.10(s，9H)，2.04(br t， J=7.1Hz，6H)，1.99(s，9H)，1.89(s，9H)，1.81-1.74(m，9H)，1.54-1.39(m，22H)，1.32(br dd， J=4.5，6.7Hz，2H)，1.24(s，10H)。
步驟J：將式2-12（1.00克，0.50毫莫耳）所示化合物和 N-甲基- N, N, N-三正辛基氯化銨（20.35毫克，50.35微莫耳）溶於乙酸（2.7毫升）和正戊烷（6.3毫升）的混合液，於0攝氏度向該混合液滴入高錳酸鉀（0.40克，2.52毫莫耳）的水（9毫升）溶液。混合液在0至15攝氏度攪拌2小時。反應用亞硫酸氫鈉（1.27克）淬滅，加入鹽酸（2莫耳每升，5毫升）和水（30毫升），並用三氯甲烷/異丙醇=3/1混合液120毫升（40毫升x3）萃取。合併的有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮，加入甲苯/乙腈=1/1混合液180毫升（30毫升x6），減壓濃縮得2-13。 1H NMR(400 MHz，CD 3OD)：δ 5.34(d， J=2.9Hz，3H)，5.06(dd， J=3.3，11.2 Hz，3H)，4.56(d， J=8.4Hz，3H)，4.19-4.06(m，9H)，4.04-3.98(m，3H)，3.87(td， J=5.7，9.9Hz，4H)，3.72-3.64(m，9H)，3.57-3.50(m，3H)，3.39(br t， J=6.4Hz，2H)，3.22(q， J=6.4Hz，12H)，2.51-2.40(m，9H)，2.21(br t， J=7.3Hz，6H)，2.14(s，9H)，2.03(s，9H)，1.94(d， J=7.9Hz，18H)，1.72-1.57(m，22H)，1.39(br s，12H)。
步驟K：向式2-13（1.00克，0.50毫莫耳）所示化合物的 N, N-二甲基甲醯胺（10毫升）溶液加入 N, N-二異丙基乙胺（0.26克，1.99毫莫耳）和 O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)- N, N, N, N-四甲基脲六氟磷酸鹽（0.23克，0.60毫莫耳）。混合液攪拌後，加入式2-14（0.23克，0.55毫莫耳）所示化合物。混合液在15攝氏度攪拌16小時。反應液加入二氯甲烷（50毫升）和水（50毫升），分液後的有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液50毫升（50毫升x1）、水50毫升（50毫升x1）和飽和食鹽水50毫升（50毫升x1）依次洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經管柱層析（SiO 2，二氯甲烷/甲醇（含0.1%三乙胺）=20/1至10/1）純化後得2-15。 1H NMR(400 MHz，DMSO- d 6)： δ 7.90-7.82(m，6H)，7.78(br d， J=4.8Hz，3H)，7.40-7.26(m，10H)，6.91(br dd， J=3.1，9.0Hz，4H)，5.26(d， J=3.4Hz，3H)，5.03-4.99(m，3H)，4.53(d， J=8.4Hz，3H），4.43(br d， J=3.8Hz，1H)，4.23-4.14(m，1H)，4.12-4.02(m，9H)，3.92(td， J=9.0，11.0Hz，3H)，3.78(s，6H)，3.77-3.71(m，3H)，3.66-3.51(m，13H)，3.49-3.41(m，4H)，3.11-3.01(m，16H)，2.38-2.37(m，1H)，2.32(br s，9H)，2.14(s，9H)，2.08(br t， J=6.9Hz，7H)，2.04(s，9H)，1.93(s，9H)，1.82(s，9H)，1.57-1.46(m，22H)，1.31-1.26(m，12H)。
步驟L：向式2-15（0.80克，0.33毫莫耳）所示化合物的二氯甲烷（8毫升）溶液依次加入三乙胺（67.24毫克，0.64毫莫耳），4- N, N-二甲基氨基吡啶（0.12克，1.00毫莫耳）和丁二酸酐（83.13毫克，0.83毫莫耳）。混合液在10攝氏度攪拌16小時。反應液加入二氯甲烷（50毫升），水（30毫升）和飽和食鹽水（30毫升），分液後的有機相用水30毫升（30毫升x1）和飽和食鹽水30毫升（30毫升x1）依次洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮得初產物。經 p-HPLC純化(分離柱：Waters Xbridge C18（規格：150mm x 50mm，粒徑：10μm）；流動相： [水(10 mM碳酸氫銨)-乙腈]；洗脫梯度：27%-57%，11min)得實施例2（化合物D01）。 1H NMR(400MHz，DMSO- d 6)：δ 7.96-7.69(m，9H)，7.33-7.09(m，10H)，6.90-6.78(m，4H)，5.21(d， J=3.3Hz，3H)，4.97(dd， J=3.3，11.2Hz，3H)，4.49(d， J=8.4Hz，3H)，4.06-3.97(m，9H)，3.91-3.83(m，3H)，3.79-3.66(m，11H)，3.63-3.45(m，18H)，3.02(br d， J=4.6Hz，14H)，2.46-2.37(m，4H)， 2.35-2.14(m，12H)，2.10(s，9H)，2.04(br t， J=7.0Hz，6H)，1.99(s，9H)，1.88(s，9H)，1.77(s，9H)，1.57-1.37(m，22H)，1.22(br s，12H)。
實施例3  雙鏈siRNA類似物或其共軛物的合成
含D的單鏈寡核糖核苷酸的合成：按照亞磷醯胺固相合成技術合成寡核糖核苷酸。在可控多孔玻璃（氨基CPG，500Å）與D01通過共價鍵連接製成的固體支持物上進行合成。所有的2’-修飾的RNA亞磷醯胺(phosphoramidite)和輔助試劑均為商品化可得試劑。所有的醯胺溶於無水乙腈中並且加入分子篩(3 Å)，使用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑的偶合時間為5分鐘。使用50mM 3-（（二甲基氨基-亞甲基）氨基）-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮（DDTT）的無水乙腈/吡啶（v/v=1/1）溶液產生硫代磷酸酯鍵，反應時間3分鐘。所有序列在最後脫除DMT基團後即合成。
不含D的單鏈寡核糖核苷酸的合成：按照亞磷醯胺固相合成技術合成寡核糖核苷酸。在通用可控多孔玻璃CPG(500Å)上進行合成。所有的2’-修飾的RNA亞磷醯胺(phosphoramidite)和輔助試劑均為商品化可得試劑。所有的醯胺溶於無水乙腈中並且加入分子篩(3Å)，使用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑的偶合時間為5分鐘。使用50mM 3-（（二甲基氨基-亞甲基）氨基）-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)的無水乙腈/吡啶(v/v=1/1)溶液產生硫代磷酸酯鍵，反應時間3分鐘。所有序列在最後脫除DMT基團後即合成。
CPG上結合的低聚物的切割和去保護：在固相合成終止後，通過用含20%二乙胺的乙腈溶液處理30分鐘去除保護基，而沒有從CPG上切下寡核苷酸。隨後，乾燥的CPG在40攝氏度度下用濃氨水處理18小時。在離心之後，上清液被轉移至新的管中並且用氨水洗滌CPG。濃縮合併的溶液得到固體混合物。
單鏈寡核糖核苷酸的純化：通過使用NanoQ陰離子交換經HPLC純化的低聚體。緩衝液A是10 mM過氯酸鈉溶液，20mM Tris，1mM EDTA，pH 7.4和含有乙腈20%，以及緩衝液B，500 mM 過氯酸鈉，20 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.4和含有乙腈20%。分離得到目標產物，並用反相C18柱脫鹽。
單鏈寡核糖核苷酸的退火產生siRNA：把待退火的單鏈寡核糖核苷酸用無菌RNase Free H 2O（無RNA水解酶）配製成200μM。如下設置退火反應體系，將總體積為100μL的混合液，10nmol放置95℃水浴鍋10分鐘（≥100 nmol需求量需要高溫20分鐘）→迅速放入60℃水浴，自然降溫→退火完成後的溶液不可放置在高溫中儲存。通過合併等莫耳的單鏈寡核糖核苷酸溶液形成互補鏈。 表1  靶向B型肝炎病毒基因的雙鏈siRNA類似物、包含其的共軛物和它們對應的核心序列
核心序列 r’嵌入的序列 ** 進一步修飾的序列
SEQ ID NO 編碼股序列（5’-3’） SEQ ID NO 模板股序列（5’-3’） SEQ ID NO 編碼股序列（5’-3’） *** SEQ ID NO 模板股序列（5’-3’） SEQ ID NO 編碼股序列（5’-3’） *** SEQ ID NO 模板股序列（5’-3’）
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD* 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD* 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 5 GUrUGCACUUCGCUUCACAD 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 6 UrUGAAGCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 19 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 5 GUrUGCACUUCGCUUCACAD 6 UrUGAAGCGAAGUGCACACUU 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 19 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 7 UGrGAAGCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 5 GUrUGCACUUCGCUUCACAD 7 UGrGAAGCGAAGUGCACACUU 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 8 UGUrAAGCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 21 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 5 GUrUGCACUUCGCUUCACAD 8 UGUrAAGCGAAGUGCACACUU 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 21 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 9 UGUGrAGCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 22 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 5 GUrUGCACUUCGCUUCACAD 9 UGUGrAGCGAAGUGCACACUU 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 22 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 5 GUrUGCACUUCGCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 11 UGUGAAGrGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 24 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 5 GUrUGCACUUCGCUUCACAD 11 UGUGAAGrGAAGUGCACACUU 18 g•u•ru Gc ACUucgcuucacaD 24 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 12 GUGUGCrCUUCGCUUCACAD 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU 25 g•u•gu Gcr CUucgcuucacaD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 13 GUGUGCACUUCGCUUCrCAD 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU 26 g•u•gu Gc ACUucgcuucrcaD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 14 GUGUGCACUUCGCUUCACrD 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU 27 g•u•gu Gc ACUucgcuucacrD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 4 UGUGArGCGAAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 6 UrUGAAGCGAAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 19 u•r•uga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 7 UGrGAAGCGAAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 8 UGUrAAGCGAAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 21 u• G•ura Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 9 UGUGrAGCGAAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 22 u• G•ugr Ag CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 11 UGUGAAGrGAAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 24 u• G•uga Agr Gaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 29 UGUGAAGCGrAGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 33 u• G•uga(Agn)g CGragu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 30 UGUGAAGCGArGUGCACACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 34 u• G•uga(Agn)g CGargu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 31 UGUGAAGCGAAGUGCrCACUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 35 u• G•uga(Agn)g CGaagu Gcrcac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 1 GUGUGCACUUCGCUUCACAD 32 UGUGAAGCGAAGUGCACrCUU 28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 36 u• G•uga(Agn)g CGaagu Gc Acrc•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 37 GrGUGCACUUCGCUrCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 42 g•r•gu Gc ACUucgcurcacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 38 GrGUGCACUUCrCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 43 g•r•gu Gc ACUucrcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 39 UGUrAArCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 44 u• G•ura Ar CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 45 u• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 40 UGUGAAGCGAArUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 46 u• G•uga(Agn)g CGaaru Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 47 VPu• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 48 VPu• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u
1 GUGUGCACUUCGCUUCACA 2 UGUGAAGCGAAGUGCACAC 3 GrGUGCACUUCGCUUCACAD 10 UGUGAArCGAAGUGCACACUU 15 g•u•gu Gc ACUucgcuuracaD 41 VPu• G•uga(Agn)g CGargu Gc Acac•u•u
*：D為小分子片段D01進行化學反應後的殘基，通過共價鍵與核酸結合，其結構如下：
Figure 02_image045
。
**：r’嵌入的序列的模板股序列是在核心序列的具有3’端UU的模板股序列的基礎上進行r’嵌入得到的。例如，SEQ ID NO: 4是在具有3’端UU的SEQ ID NO: 2的基礎上進行r’嵌入得到的。
***：當序列含有D時，所述D用於指代共軛物基團D的連接位置。例如g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD(5’-3’)表示如SEQ ID NO: 16所示的序列g•r•gu Gc ACUucgcuucaca在3’端與D連接。
實施例3 HBV體外測試
1. 實驗目的：
通過酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)檢測HepG2-NTCP細胞培養上清中HBV抗原 (HBsAg和HBeAg) 含量，以化合物的EC 50值為指標，來評價化合物對HBV的抑制活性；同時通過Cell-titer Glo檢測細胞活性，來評價化合物的細胞毒性。
2. 實驗材料:
2.1細胞系：HepG2-NTCP細胞
HepG2-NTCP細胞培養基 (DMEM，Invitrogen-11330032；10%血清，Invitrogen-10099141；100 units/ml青黴素和100 µg/ml鏈黴素，Hyclone-SV30010；1% 非必需胺基酸，Invitrogen-11140050；2mM L-穀氨醯胺，Invitrogen-25030081；1mM丙酮酸鈉，Gibco-11360-070；500μg/ml Geneticin， Invitrogen-10131027)
2.2試劑：
胰酶(nvitrogen-25300062)；DPBS(Corning-21031CVR)；DMSO(Sigma-D2650-100ML)；Cell-titer Glo(Promega- G7573)；B型肝炎表面抗原定量檢測試劑盒（安圖生物-CL 0310）；B型肝炎e抗原定量檢測試劑盒（安圖生物-CL 0312）。
2.3耗材與儀器：
96孔細胞培養板(Corning-3599)；CO 2培養箱(HERA-CELL-240) 微量盤檢測儀(BioTek Synergy 2)
3. 實驗步驟和方法：
3.1第0天，種HepG2-NTCP（7.5×10 4細胞/孔）細胞到48孔板，在37℃，5 % CO 2培養過夜。
3.2第1天，更換含1% DMSO的培養基。
3.3第2天，用D型HBV（從HepG2.2.15細胞培養上清濃縮）感染HepG2-NTCP（2000GE/細胞）。
3.4第3天，吸掉感染液，加入新鮮的含1% DMSO的培養基。
3.5第6天，根據Lipofectamine ®RNAiMax (Invitrogen公司)的使用說明，轉染siRNA共軛物。共軛物5倍梯度稀釋7個濃度，三複孔，終濃度為0.16pM。化合物為編碼股、模板股的組合，為單一化學實體，最大濃度為2.5nM。
3.6第12天，收取培養孔中的上清，ELISA測定HBV表面抗原和e抗原。待收集上清後，加入Cell-titer Glo測定細胞活性。
3.7 ELISA測定B肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)，具體步驟參照該產品說明書，步驟簡述如下：取50µl樣品和標準品分別加入到反應板中，再每孔分別加入50µl酶結合物，震盪混勻，37℃孵育60分鐘，然後用洗液洗板5次，再每孔加入50µl發光底物，混勻，室溫避光反應10分鐘，最後用微量盤檢測儀檢測化學發光強度。
3.8資料分析：
計算細胞活性百分比：
% viability = (樣品的發光值-培養基對照發光值) / (DMSO對照的發光值-培養基對照發光值)×100。
計算HBV表面抗原和e抗原的抑制百分比：
% Inh. =（1-樣品中的抗原值/DMSO對照抗原值）×100。
計算CC 50和EC 50：使用GraphPad Prism軟體計算化合物的CC 50和對HBV的50%抑制濃度(EC 50)值。
4. 實驗結果：見表2。 表2測試的序列在細胞中降低HBsAg和HBeAg程度實驗結果
測試的序列 實驗結果
SEQ ID NO 編碼股序列 （5’-3’） SEQ ID NO 模板股序列 （5’-3’） HBsAg EC 50(pM) HBeAg EC 50(pM) 細胞活性 CC 50(nM)
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 13.75 20.84 ＞2.5
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 17.40 34.21 ＞2.5
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 12.44 21.07 ＞2.5
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 13.09 22.68 ＞2.5
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 20 u• G•rga Ag CGaagu Gc Acac•u•u 14.69 28.90 ＞2.5
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 14.99 34.72 ＞2.5
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 34 u• G•uga(Agn)g CGargu Gc Acac•u•u 30.72 52.56 ＞2.5
*測試的樣品是雙鏈siRNA類似物的共軛物。
實施例4：重組8型腺相關病毒載體介導的B型肝炎病毒小鼠模型(AAV-HBV)中抗B肝病毒活性與安全性研究
實驗目的：
AAV載體介導的HBV轉染小鼠模型是一種快速、高效的HBV模型。利用AAV8載體的高度嗜肝性，用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關病毒(rAAV8-1.3HBV)經小鼠尾靜脈注射，可將所攜帶的1.3拷貝HBV基因組高效導入肝細胞。由於AAV病毒載體的特性，其介導的載體可以持續表現很長時間，應用AAV/HBV模型可以在小鼠肝臟內持續複製HBV DNA並表現HBsAg和HBeAg。
通過運用AAV/HBV小鼠模型，檢測受試化合物治療後的小鼠血清中HBsAg、HBeAg、DNA、pgRNA和小鼠體重，以評價其體內抗HBV效果與安全性。
實驗材料：
C57BL/6小鼠、PBS(RNase free)為溶劑、受試化合物、重組病毒rAAV8-1.3HBV。本項目主要試劑包括QIAamp96 DNA試劑盒(Qiagen，51162)、FastStart Universal Probe Master (Rox)(Roche, 04914058001)、B型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒（安圖生物，CL0310）、B型肝炎病毒e抗原檢測試劑盒（安圖生物，CL0918）、PureLink TMPro 96 Viral RNA/DNA kit(Invitrogen, 12280-096A)和FastQuant RT Kit (with gDNase)(TIANGEN, KR106-02)。主要儀器包括：離心機(Beckman Allegra X-15R)、多功能微量盤檢測儀(BioTek, Synergy 2)、螢光定量PCR儀(Applied Biosystems, 7900HT Fast Real-time PCR system)、微量盤檢測儀(Molecular Devices, SpectraMax 340PC384)。
實驗方法：
a）鼠在病毒注射後第34天開始皮下注射給藥，將該天設為第0天。給藥前所有小鼠頜下採血收集血漿。具體給藥方案見表3。
b）鼠給藥後第 0，14，21，28天和32天經頜下靜脈採血收集血漿，收集的血液用K 2-EDTA抗凝，在4℃，7000g/分鐘條件下離心10分鐘後收集血漿。具體採血時間見表3。
c）35天或第42天，所有小鼠經頜下靜脈採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，經心臟採血收集血漿樣品，並收集肝臟樣品。
d）血漿樣品送至檢測。 表3  體內實驗方案
小鼠隻數 給藥設計 非終點採血方案 實驗終點
測試化合物 給藥量（mg/kg） 給藥體積（mL/kg） 給藥方案
5 溶劑 / 5 病毒注射第34天設為第0天，第0、29天經皮下注射各給藥一次。 病毒注射後第34天設為第0天，採血時間為第0、7、14、21、28、32、35天。 給藥後第35天，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，心臟採血收集血漿樣品，並收集肝臟樣品。
5 WRG01 *1 3
5 WR007 *2 3 病毒注射第34天設為第0天，第0天經皮下注射給藥一次。 /
5 WR012 *3 3
*1：WRG01為共軛物，其編碼股為SEQ ID NO：16，模板股為SEQ ID NO：23，共軛物基團為D。
*2：WR007為共軛物，其編碼股為SEQ ID NO：42，模板股為SEQ ID NO：23，共軛物基團為D。
*3：WR012為共軛物，其編碼股為SEQ ID NO：16，模板股為SEQ ID NO：47，共軛物基團為D。
/：尚未到終點。
樣品分析：
ELISA檢測小鼠血清中HBsAg、HBeAg的含量：實驗步驟參照HBsAg ELISA（安圖生物，CL 0310）和HBeAg ELISA（安圖生物，CL0918）試劑盒說明書。
qPCR檢測小鼠血漿中HBV DNA含量：提取血漿中HBV DNA，實驗步驟參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書，qPCR檢測小鼠血漿中HBV DNA的含量。
RT-qPCR檢測小鼠血漿中HBV pgRNA含量：提取血漿中HBV pgRNA，實驗步驟參照PureLink™ Pro 96 Viral RNA/DNA Kit說明書。消化DNA，並使用含有B型肝炎病毒特異性序列的3'RACE引子將RNA反轉錄為cDNA，實驗步驟參照FastQuant RT Kit (with gDNase)的說明書。最後，qPCR定量檢測cDNA的含量，即檢測小鼠血漿中HBV pgRNA的含量。
每組小鼠樣品的平均值±標準誤表示，除特別說明外，n=5。用Student’s t-test進行統計分析。
實驗結果：
a）血清中HBsAg含量評價受試化合物在AAV/HBV小鼠模型中抗HBV活性。結果見表4、表4-1、圖1和圖6。小鼠血漿HBsAg含量由ELISA法測定。誤差線顯示標準誤。第0天：第一次給所有小鼠施用媒介物或化合物。第29天：對實驗組WRG01小鼠和該次空白對照組小鼠第二次接種媒介物或化合物。 表4  小鼠給藥後不同日期的Log 10[HBsAg (IU/mL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WRG01 (SC)
0 4.70 4.72
7 4.82 2.90
14 4.43 2.90
21 4.94 3.28
28 4.84 3.77
35 4.78 2.83
表4-1  小鼠給藥後不同日期的Log 10[HBsAg (IU/mL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WR007 (SC) WR012 (SC)
0 4.58 4.19 4.47
7 4.15 1.92 2.00
14 4.57 2.29 2.20
21 4.41 2.63 2.36
28 4.76 2.94 3.10
35 4.62 3.31 3.19
b）血清中HBeAg含量評價受試化合物在AAV/HBV小鼠模型中抗HBV活性。結果見表5、表5-1、圖2和圖7。小鼠血漿HBeAg含量由ELISA法測定。誤差線顯示標準誤差。第0天：第一次給所有小鼠施用媒介物或化合物。 表5  小鼠給藥後不同日期的Log 10[HBeAg (PEIU/mL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WRG01 (SC)
0 3.56 3.51
7 3.37 2.89
14 3.56 3.06
21 3.66 3.22
表5-1  小鼠給藥後不同日期的Log 10[HBeAg (PEIU/mL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WR007 (SC) WR012 (SC)
0 3.44 3.35 3.40
7 3.24 2.49 2.53
14 3.57 2.80 2.89
21 3.32 2.81 2.82
28 3.38 2.95 2.91
35 3.37 3.09 3.02
c）血清中DNA含量評價受試化合物在AAV/HBV小鼠模型中抗HBV活性。結果見表6、表6-1、圖3和圖8。小鼠血漿HBV DNA含量由定量PCR法測定。誤差線顯示標準誤差。第0天：第一次給所有小鼠施用媒介物或化合物。第29天：對所有小鼠第二次接種媒介物或化合物。 表6  小鼠給藥後不同日期的Log 10[DNA (拷貝數/μL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WRG01 (SC)
0 5.27 4.84
7 5.39 3.93
14 5.51 3.97
21 5.63 4.37
表6-1  小鼠給藥後不同日期的Log 10[DNA (拷貝數/μL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WR007 (SC) WR012 (SC)
0 5.53 / /
7 4.98 / /
14 5.34 3.44 3.95
21 5.45 3.71 4.21
28 5.63 4.08 4.66
35 5.26 4.42 4.78
/：未得到資料。
d）中pgRNA含量評價受試化合物在AAV/HBV小鼠模型中抗HBV活性。結果見表7和圖4。小鼠血漿HBV pgRNA 含量由定量PCR法測定。誤差線顯示標準誤差。第0天：第一次給所有小鼠施用媒介物或化合物。第29天：對所有小鼠第二次接種媒介物或化合物。 表7  小鼠給藥後不同日期的Log 10[pgRNA (拷貝數/μL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WRG01 (SC)
0 4.92 4.56
7 4.96 3.28
14 4.93 3.26
21 5.02 3.50
28 5.06 4.13
35 5.17 3.37
e）體重變化見圖5。以第0天的體重作為基準進行比較，根據IACUC規定，以20%體重下降作為人道終點，任何小鼠體重下降超過20%，需從實驗中移除。此實驗中無小鼠因體重下降而移除。
實驗結論：
在本實驗中，受試化合物在AAV/HBV小鼠模型實驗中，能夠顯著降低HBsAg、DNA和pgRNA。同時，受試化合物對HBeAg也有一定抑制作用。受試化合物治療過程中，小鼠表現出良好的耐受性，體重逐漸上升。
實施例5  HepG2.2.15細胞HBV體外測試
1.實驗目的：
通過即時定量qPCR試驗(real time-qPCR)檢測HepG2.2.15細胞培養上清的HBV DNA含量，及酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)檢測HBV表面抗原和e抗原含量；qRT-PCR檢測細胞內HBV RNA含量，以化合物的EC50值為指標，來評價化合物對HBV的抑制作用，同時應用CCK8法檢測受試化合物對細胞活性影響。
2.實驗材料:
2.4胞系：HepG2.2.15細胞
HepG2.2.15 細胞培養基(DMEM/F12，Invitrogen-11330032；10%血清，Hyclone-SV30087.0；100units/ml青黴素和100 µg/ml鏈黴素，Hyclone-SV30010；1% 非必需胺基酸，Invitrogen-11140050；2mM L-GLUTAMINE，Invitrogen-25030081；300 µg/ml Geneticin，Invitrogen-10131027)。
2.5試劑
Opti-MEM(Gibco-31985-070)；Lipofectamine® RNAiMAX(Invitrogen -13778-150)； CCK8(李記- AC11L057)；高通量DNA純化試劑盒(QIAamp 96 DNA Blood Kit，Qiagen-51162)；RNA製備RNEASY試劑盒(RNeasy 96 Kit (12)，Qiagen-74182)；定量快速啟動通用探針試劑(FastStart Universal Probe Master，Roche-04914058001)；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(TianGen-KR106-02)；B型肝炎表面抗原定量檢測試劑盒（安圖生物，CL 0310）；B型肝炎e抗原定量檢測試劑盒（安圖生物，CL 0312）。
2.6耗材與儀器：
Collagen I 96 Well White/Clear Flat Bottom TC-Treated Microplate(Corning BioCoat-356650)；CO 2培養箱(HERA-CELL-240)；螢光定量PCR儀(Applied Biosystems-7900 real time PCR system)；螢光定量PCR儀(Applied Biosystems- QuantStudio 6 Flex；微量盤檢測儀(Molecular Device- SpectraMax  M2e)；微量盤檢測儀(BioTek - Synergy 2)。
3.實驗步驟和方法：
3.1第一天，轉染siRNA和細胞鋪板同時進行，方法簡述如下：取HepG2.2.15細胞，先用DPBS洗滌後，0.05%胰蛋白酶進行消化，用含10% FBS的DMEM/F12培養基終止消化，離心後重新懸浮，將細胞輕輕吹打至單個細胞後計數。按比例配置所需轉染試劑體積（表8），室溫孵育15分鐘。表8  Lipofectamine® RNAiMAX配置
試劑名稱 比例（配置一個孔為例）
Lipofectamine® RNAiMAX 1.5
Opti-MEM 23.5
梯度稀釋siRNA，共8個濃度，3倍梯度稀釋，雙複孔，取15μL RNAiMAX/Opti-MEM 的混合液，與15μL不同濃度的siRNA混勻，室溫孵育15分鐘。先取10μL上述混合溶液加入到96孔細胞培養板中，再加入90 μl細胞懸液，細胞終密度為15,000細胞/孔，最終體積為100μL/孔，細胞置於5% CO 2、37 °C孵箱中培養。
3.2第四天，更換含有化合物的新鮮培養液，轉染方式同第一天。
3.3第七天收取培養孔中的培養液，取部分樣品ELISA測定B肝病毒S抗原和e抗原的含量；取部分樣品使用高通量DNA純化試劑盒(Qiagen-51162)提取DNA；待收集上清後，參照CCK-8試劑盒說明書測定細胞活性，用微量盤檢測儀(SpectraMax M2e)檢測各孔的吸光值(450nm/650nm)；使用RNeasy 96 kit提取試劑盒(Qiagen-74182)，參照試劑盒說明書提取細胞培養內HBV RNA。
3.4 PCR反應液的配製如表9所示： 表9  PCR 反應液的配製
項目 配置1個孔所需體積 (微升) 配置100個孔所需體積 (微升)
定量快速啟動通用探針試劑 5 500
前引子 (10微莫耳) 0.4 40
後引子 (10微莫耳) 0.4 40
探針 (10微莫耳) 0.2 20
AE 2 200
在96孔PCR板中每孔加入8µl的反應混合液，然後每孔加入2µL的樣品DNA或HBV DNA的標準品。
PCR的反應條件為：95℃加熱10分鐘，然後95℃變性15秒，60℃延伸1分鐘，共40個迴圈。
3.5 ELISA測定B肝病毒S抗原和e抗原的含量，具體步驟參照該產品說明書，步驟簡述如下：取50µL樣品和標準品分別加入到反應板中，再每孔分別加入50 µL酶結合物，震盪混勻，37℃溫浴60分鐘，然後用洗液洗板5次，再每孔加入50µL發光底物，混勻，室溫避光反應10分鐘，最後用微量盤檢測儀檢測化學發光強度。
3.6使用RNeasy 96 kit 提取試劑盒(Qiagen，74182)，參照試劑盒說明書提取細胞培養內HBV RNA。加150µL RLT裂解細胞，最終用50µL 無RNase水洗脫RNA。參照反轉錄試劑盒（天根，KR106）說明書，加入隨機引子反轉錄成cDNA，然後HBV特異性引子檢測樣品中的total RNA，同時，GAPDH引子和探針特異性檢測GAPDH cDNA，qPCR法定量樣品中的HBV cDNA。
qPCR反應：95℃，10分鐘；95℃，15秒，60℃，1分鐘，40個迴圈。依據各樣品的Ct值計算樣品中的HBV RNA含量。
每個樣品目的基因HBV mRNA的表現程度通過ΔΔCt相對定量法進行計算。目的基因相對表現量用2-ΔΔCT表示，計算公式如下：
ΔCT=目的基因平均Ct值-內參基因平均Ct值；
ΔΔCT=ΔCT(加藥組)組-ΔCT（RNAiMAX對照組）；
HBV mRNA相對表現量=2-ΔΔCT
3.7資料分析：
計算抑制百分比：
% Inh. =（1-樣品中的值/PBS對照值）x100。
細胞存活率%= (樣品檢測值-培養液本底平均檢測值)/(對照組平均檢測值-培養液本底平均檢測值)×100
計算EC 50和CC 50：使用GraphPad Prism軟體計算化合物對HBV的50%抑制濃度(EC 50)值和50%細胞死亡時的藥物濃度(CC 50)值。 表10  測試的序列在細胞中降低HBsAg、HBeAg、DNA和RNA程度實驗結果
測試的序列 實驗結果
SEQ ID NO 編碼股序列（5’-3’） SEQ ID NO 模板股序列（5’-3’） HBsAg EC 50(nM) HBeAg EC 50(nM) DNA EC 50(nM) RNA EC 50(nM) 細胞活性 CC 50(nM)
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 0.179 0.755 0.14 0.87 ＞50
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 17 u• G•ugarg CGaagu Gc Acac•u•u 0.105 0.37 0.16 0.567 ＞50
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 0.079 0.587 0.135 3.197 ＞50
28 g•u•gu Gc ACUucgcuucacaD 34 u• G•uga(Agn)g CGargu Gc Acac•u•u 0.263 1.268 0.553 0.963 ＞50
42 g•r•gu Gc ACUucgcurcacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 0.07 0.389 0.019 0.65 ＞50
43 g•r•gu Gc ACUucrcuucacaD 23 u• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 0.231 / / / ＞50
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 44 u• G•ura Ar CGaagu Gc Acac•u•u 0.072 2.202 0.06 / ＞50
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 45 u• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u 0.054 3.707 0.15 / ＞50
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 46 u• G•uga(Agn)g CGaaru Gc Acac•u•u 0.497 / / / ＞50
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 47 VPu• G•uga Ar CGaagu Gc Acac•u•u 0.082 0.205 0.037 0.68 ＞50
16 g•r•gu Gc ACUucgcuucacaD 48 VPu• G•uga(Agn)r CGaagu Gc Acac•u•u 0.104 3.83 0.105 / ＞50
/：尚未得到資料。
*測試的樣品是雙鏈siRNA類似物的共軛物。
實施例6：AAV-HBV小鼠模型中抗B肝病毒活性藥效劑量探索
通過運用AAV/HBV小鼠模型，檢測接受不同劑量受試化合物治療後的小鼠血清中HBsAg，以評價其體內抗HBV效果。
實驗材料：
C57BL/6小鼠、PBS(RNase free)為溶劑、受試化合物、重組病毒rAAV8-1.3HBV。本項目主要試劑包括FastStart Universal Probe Master (Rox)(Roche, 04914058001)、B型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒（安圖生物，CL0310）。主要儀器包括：離心機(Beckman Allegra X-15R)、多功能微量盤檢測儀(BioTek, Synergy 2)、微量盤檢測儀(Molecular Devices, SpectraMax 340PC384)。
實驗方法：
a）所有小鼠在病毒注射後第34天開始皮下注射給藥，將該天設為第0天。給藥前所有小鼠頜下採血收集血漿。第0天給藥一次。具體給藥方案見表14。
b）所有小鼠給藥後第 0、14、21、28天和35天經頜下靜脈採血收集血漿，收集的血樣用K 2-EDTA抗凝，在4℃，7000 g/分鐘條件下離心10分鐘後收集血漿。具體採血時間見表11。
c）第42天，所有小鼠經頜下靜脈採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，經心臟採血收集血漿樣品，並收集肝臟樣品。
d）所有血漿樣品送至檢測。 表11  體內實驗方案
小鼠隻數 給藥設計 非終點採血 方案 實驗終點
測試 化合物 給藥量（mg/kg） 給藥體積（mL/kg） 給藥方案
5 溶劑 / 5 病毒注射第34天設為第0天，第0天經皮下注射給藥一次。 病毒注射後第34天設為第0天，採血時間為第0、7、14、21、28、35天。  
5 WRG01* 0.3 給藥後第42天，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，心臟採血收集血漿樣品，並收集肝臟樣品。
5 1
5 3 /
5 10 /
*：WRG01為共軛物，其編碼股為SEQ ID NO：16，模板股為SEQ ID NO：23，共軛物基團為D。
/：尚未到終點。
樣品分析：
ELISA檢測小鼠血清中HBsAg的含量：實驗步驟參照HBsAg ELISA（安圖生物，CL 0310）試劑盒說明書。
每組小鼠樣品的平均值±標準誤表示，除特別說明外，n=5。用Student’s t-test進行統計分析。
實驗結果：
檢測血清中HBsAg含量評價受試化合物在AAV/HBV小鼠模型中抗HBV活性。結果見表12和圖9。小鼠血漿HBsAg含量由ELISA法測定。誤差線顯示標準誤。第0天：第一次給所有小鼠施用媒介物或化合物。 表12  小鼠給藥後不同日期的Log 10[HBsAg (IU/mL)]
檢測天數（天） 空白 (SC) WRG01, 0.3 mpk (SC) WRG01, 1 mpk (SC) WRG01, 3 mpk (SC) WRG01, 10 mpk (SC)  
0 4.58 4.49 4.53 4.31 4.56  
7 4.15 3.67 2.93 2.19 1.98  
14 4.57 4.18 3.60 2.26 2.12
21 4.41 4.46 3.80 2.48 2.17
28 4.76 4.76 4.25 3.22 2.99
35 4.62 4.65 4.31 3.40 3.12
實驗結論：
在本實驗中，受試化合物WRG01在AAV/HBV小鼠模型實驗中，對於降低HBsAg展現出良好的劑量依賴性，即隨著用藥劑量上升降低HBsAg活性增加，並展現出長期抑制HBsAg效力。
實施例7：小鼠血漿、肝臟、腎臟藥物濃度測試
本研究對C57BL/6小鼠單次皮下注射給藥，在給藥後的不同時間點收集血漿和組織樣品，通過SL-qPCR檢測血漿和組織中siRNA程度評價化合物在小鼠體內的代謝程度。 表13  體內實驗方案
小鼠隻數 給藥設計 非終點外周血採集方案 實驗終點
測試化合物 給藥量（mg/kg） 給藥體積（mL/kg） 給藥方案
3 WRG01* 3 5 第0天經皮下注射給藥一次。 採血時間為給藥後0.083小時。 給藥後0.5小時，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，收集肝臟、腎臟樣品。
3 3 採血時間為給藥後0.25小時。 給藥後1小時，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，收集肝臟、腎臟樣品。
3 3 / 給藥後2小時，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，收集肝臟、腎臟樣品。
3 3 / 給藥後4小時，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，收集肝臟、腎臟樣品。
3 3 / 給藥後8小時，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，收集肝臟、腎臟樣品。
3 3 / 給藥後32小時，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，收集肝臟、腎臟樣品。
3 3 採血時間為給藥後48小時和96小時。 給藥後168小時，小鼠經頜下靜脈叢採血收集血漿，之後小鼠經CO 2吸入安樂死，收集肝臟、腎臟樣品。
*：WRG01為共軛物，其編碼股為SEQ ID NO：16，模板股為SEQ ID NO：23，共軛物基團為D。
/：沒有在「非終點」的時間採血，只在終點採血。
實驗結果：
使用SL-qPCR法（參考文獻：Nair et al. Nucleic Acids Research (2017), 45, 10969-10977）檢測小鼠給藥後不同時間節點血漿、肝臟、腎臟中siRNA程度，結果見圖10。
實驗結論：
在本實驗中，受試化合物WRG01在C57BL/6小鼠模型實驗中具有良好的組織分佈與代謝穩定性。WR-G01肝暴露量大、半衰期長，肝血比超過500倍，證明WRG01代謝穩定，具有高度肝靶向性。
實施例8：FRG-KO人源化肝臟小鼠血生化測試
人源化FRG小鼠是最常用的人源化肝臟模型之一，通常人源化比例高達70%。因為在小鼠肝臟中定植的是人類肝臟細胞，可以更好模擬人體HBV自然感染和cccDNA複製過程，同時對於人體藥物代謝動力學與肝臟毒性有著良好的預測作用。
本研究對人源化FRG小鼠多次給藥，在給藥後的不同時間點收集血漿樣品，通過檢測血漿中ALT、AST和膽紅素程度評價化合物對小鼠的肝臟毒副作用影響。在本實驗中，受試化合物對人源化肝臟未產生明顯的炎症反應，預示人體中安全性良好。 表14  體內實驗方案
小鼠隻數 給藥設計 非終點外周血採集方案 實驗終點
測試化合物 給藥量（mg/kg） 給藥體積（mL/kg） 給藥方案
3 溶劑 / 5 第0、21、28、35、42天經皮下注射給藥各一次。 採血時間為給藥前1天，給藥後第7、14、21、28、35、42天。 /
3 WRG01* 15
3 50
*：WRG01為共軛物，其編碼股為SEQ ID NO：16，模板股為SEQ ID NO：23，共軛物基團為D。
/：尚未到終點。
本發明展現出不可預料的優秀的HBsAg和HBeAg抑制劑活性，同時可以有效抑制HBV DNA和pgRNA表現，其說明了可使B肝病毒的活躍度受到抑制，同時具有良好的組織分佈與代謝穩定性，具有高度肝靶向性，預計對小鼠肝功能影響小，將為臨床中B型肝炎例如慢性B型肝炎提供了一種高效的治療手段。
無
圖1. WRG01對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。 圖2. WRG01對AAV/HBV小鼠血漿HBeAg的影響。 圖3. WRG01對AAV/HBV小鼠血漿HBV DNA的影響。 圖4. WRG01對AAV/HBV小鼠血漿HBV pgRNA的影響。 圖5. 給予WRG01後小鼠體重變化。 圖6. WR007和WR012對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。 圖7. WR007和WR012對AAV/HBV小鼠血漿HBeAg的影響。 圖8. WR007和WR012對AAV/HBV小鼠血漿HBV DNA的影響。 圖9. 不同劑量WRG01對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。 圖10. WRG01在小鼠血漿、肝臟、腎臟的濃度。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 110120681-A0101-11-0002-1

Claims (20)

  1. 一種雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其包含編碼股和模板股，其中所述模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列，所述r為
    Figure 03_image001
    ，其中所述siRNA類似物中的核苷酸和r中的每一個獨立地是經修飾的或未修飾的。
  2. 如請求項1所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述雙鏈siRNA類似物中的70%、75%、80%、85%、90%或95%以上的核苷酸和r都是經修飾的；任選地，所述雙鏈siRNA類似物中的所有核苷酸和r都是經修飾的。
  3. 如請求項1或2所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述修飾包括甲氧基修飾、氟代修飾、硫代磷酸酯基連接、將核苷酸替換為( S)-甘油核酸或將核苷酸替換(E)-乙烯基磷酸酯。
  4. 如請求項1至3任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個、兩個、三個、四個或五個核苷酸殘基的序列；任選地，所述模板股包含在如SEQ ID NO: 2所示的序列中使用r替換了一個核苷酸殘基的序列。
  5. 如請求項1至4任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述r替換發生在所述SEQ ID NO: 2的任意位置。
  6. 如請求項1至5任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述SEQ ID NO: 2任選地包括在5’端和/或3’端的突出端；任選地，所述SEQ ID NO: 2包括在5’端和/或3’端的0、1、2、3、4或5個核苷酸的突出端；任選地，所述SEQ ID NO: 2包括在3’端的突出端，所述突出端選自經修飾的或未修飾的UU。
  7. 如請求項1至6任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述模板股包含如SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 35、或SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 47、或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 48所示的序列，或由其組成。
  8. 如請求項1至7任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述編碼股包含如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28所示的序列，或由其組成。
  9. 如請求項1至8任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述編碼股包含在如SEQ ID NO: 1所示的序列中使用r替換了一個或多個核苷酸殘基的序列；任選地，所述編碼股包含在如SEQ ID NO:1所示的序列中使用r替換了一個、兩個、三個、四個或五個核苷酸殘基的序列。
  10. 如請求項1至9任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述r替換發生在SEQ ID NO: 1的5’端的第1~第19位。
  11. 如請求項1至10任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述編碼股的序列包含如SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42、或SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 43所示的序列，或由其組成。
  12. 如請求項1至11任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述雙鏈siRNA類似物為S18~S28中的任意一種：S18：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S19：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19，S20：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20，S21：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21，S22：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22，S23：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S24：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24，S25：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 33，S26：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34，S27：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 35，S28：編碼股為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 28、模板股為SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36，或者，其中所述雙鏈siRNA類似物為S1~S17中的任意一種：S1：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S2：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S3：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19，S4：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19，S5：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20，S6：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 20，S7：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21，S8：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21，S9：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22，S10：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 22，S11：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S12：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S13：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24，S14：編碼股為SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18、模板股為SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24，S15：編碼股為SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 25、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S16：編碼股為SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 26、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，S17：編碼股為SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 27、模板股為SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 17，或者，其中所述雙鏈siRNA類似物為S29~S35中的任意一種：S29：編碼股為SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 42、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S30：編碼股為SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 43、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 23，S31：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 44，S32：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 45，S33：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 46，S34：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 47，S35：編碼股為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16、模板股為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 48。
  13. 如請求項1至12任一項所述之雙鏈siRNA類似物的共軛物或其鹽，其中所述雙鏈siRNA類似物和藥學上可接受的共軛基團連接，所述藥學上可接受的共軛基團包括GalNAc基團；任選地，所述藥學上可接受的共軛基團含有1至5個GalNAc基團。
  14. 如請求項1至13任一項所述之雙鏈siRNA類似物的共軛物或其鹽，其中所述雙鏈siRNA類似物和藥學上可接受的共軛基團連接，所述藥學上可接受的共軛基團包含化合物基團D
    Figure 03_image003
    。
  15. 如請求項13或14所述之雙鏈siRNA類似物的共軛物或其鹽，其中所述藥學上可接受的共軛基團連接至所述雙鏈siRNA類似物的編碼股的3’末端。
  16. 如請求項1至15任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述雙鏈siRNA類似物或其共軛物的硫代磷酸酯部分包括 (R)- 和 (S)-鏡像異構物、非鏡像異構物、和/或其外消旋混合物。
  17. 如請求項1至16任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，其中所述鹽選自鹼加成鹽、酸加成鹽及其組合；任選地，所述鹼加成鹽選自鈉、鉀、鈣、銨、有機胺、鎂鹽及其組合，所述酸加成鹽選自無機酸鹽、有機酸鹽及其組合；任選地，所述無機酸選自鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸及其組合，所述有機酸選自乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸及其組合。
  18. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至17任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽，任選地包括藥學上可接受的載體或賦形劑。
  19. 一種如請求項1至17任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽、或如請求項18所述之藥物組合物在製備用於治療B型肝炎的藥物中的用途。
  20. 一種治療受試者中B型肝炎的方法，其包括將如請求項1至17任一項所述之雙鏈siRNA類似物、其共軛物或其鹽、或如請求項18所述之藥物組合物施用於所述受試者的步驟。
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