KR20210130854A - 당원병 Ia형 치료약 - Google Patents

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KR20210130854A
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마코토 고이즈미
요시유키 오니시
다케시 마스다
미츠히로 이와모토
유키코 세키구치
겐타로 이토
신노스케 츠지
마사후미 마츠오
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다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
각코우호우징 고베가쿠인
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Abstract

당원병 Ia형의 분자 치료법을 확립한다. c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 cDNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15∼30의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 82번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 상기 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물. 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 포함하는 의약(예를 들면, 당원병 Ia형 치료약).

Description

당원병 Ia형 치료약{THERAPEUTIC AGENT FOR GLYCOGEN STORAGE DISEASE TYPE IA}
본 발명은 당원병 Ia형 치료약에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 당원병 Ia형 환자 중, c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자를 mRNA 레벨에서 수복하고, 정상적인 G6PC 단백질을 발현시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 그것을 포함하는 의약에 관한 것이다.
당원병 Ia형은 글루코오스-6-인산 탈인산화 효소(G6PC)를 원인 유전자로 하는 상염색체 열성 유전의 대사이상증이며, 저혈당, 간종대, 신종대를 주된 증상으로 한다. 식사 요법에 의한 혈당 조절에 의해 생존 예후는 대폭 개선하였지만, 조절이 양호해도 그 과반수가 간선종, 알부민뇨를 나타낸다(비특허문헌 1). 당원병 Ia형 환자의 호발 변이는 몇개 보고되어 있고, 동아시아에 있어서는 스플라이싱(splicing) 이상을 일으키는 G6PC c.648G>T 변이가 호발 변이로서 알려져 있다(비특허문헌 2).
아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합가능한 리간드로서 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc) 등을 공유결합으로 결합한 핵산 의약(안티센스나 siRNA 등)과의 콘주게이트체가 간장의 간실질 세포에 올리고뉴클레오티드를 송달시키는 방법으로서 보고되어 있다(비특허문헌 3 및 특허문헌 1∼9). 1개의 올리고뉴클레오티드에 1 내지 3개의 GalNAc가 결합하고 있다. 또, GalNAc가 2개 결합하고 있는 예로는 비특허문헌 4에 기재가 있다.
국제공개 제2009/073809호 국제공개 제2014/076196호 국제공개 제2014/179620호 국제공개 제2015/006740호 국제공개 제2015/105083호 국제공개 제2016/055601호 국제공개 제2017/023817호 국제공개 제2017/084987호 국제공개 제2017/131236호
Eur J Pediatr. 2002년 161권 Suppl 1: S20-34 Hum Mutat. 2008년, 29권, p.921-930. Methods in Enzymology, 1999년, 313권, 297∼321페이지 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 3690-3693
본 발명은 당원병 Ia형의 분자 치료법을 확립하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 G6PC c.648G>T 변이를 갖는 당원병 Ia형 환자에 대해 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 투여함으로써, mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하고, 정상적인 G6PC 단백질의 생산을 유도하는 치료법을 확립하였다(도 1). G6PC c.648G>T 변이에서는 mRNA의 이상 스플라이싱이 생겨서 인트론(Intron) 4와 엑손(Exon) 5의 접합부(junction)로부터 엑손 5 부분의 91 염기가 결손하고, 프레임 시프트(frame shift)에 의한 효소의 실활이 일어난다. mRNA의 이상 스플라이싱이 시정된 경우, 이 번역되는 아미노산 서열은 정상형과 동일하게 되는 것을 기대할 수 있기 때문에(CUG(Leu)→CUU(Leu)), G6PC c.648G>T 변이를 갖는 환자에 있어서는 이 mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하는 치료법에 의해 활성을 갖는 정상적인 G6PC 단백질이 생산되어 당원병 Ia형 환자의 저혈당 발작의 리스크 경감, 장기 종대의 개선, 간선종 리스크의 경감이 가능하게 된다. 본 연구는 당원병 Ia형에 대한 세계 최초의 분자 치료의 개발 연구가 된다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 cDNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15∼30의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 82번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 상기 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(2) 염기수 15∼21의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 86번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(3) 염기수 15∼21의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(4) 염기수 15∼18의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(5) 염기수 18의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(6) 염기수 17의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(7) 염기수 16의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(8) 염기수 15의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(9) 서열번호 1∼32, 40∼42, 44∼48의 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(10) 추가로, 생체내에서 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드가 5' 말단 및/또는 3' 말단에 부가된 (1)∼(9)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(11) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당 및/또는 인산 디에스테르 결합의 적어도 1개가 수식되어 있는, (1)∼(10)의 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(12) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2' 위(位)의 수산기의 수식인, (1)∼(10)의 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(13) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-, 4'-가교화인, (1)∼(10)의 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(14) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-O, 4'-C-알킬렌화인, (1)∼(10)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(15) 인산 디에스테르 결합의 수식이 포스포로티오에이트인, (1)∼(14)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(16) 5' 말단 및/또는 3' 말단에 GalNAc 유닛이 결합한 (1)∼(15)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(17) 5' 말단에 GalNAc 유닛이 결합한 (1)∼(15)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(18) GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인, (16) 또는 (17)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
Figure pat00001
[식 중, Ra는 식
Figure pat00002
로 표시되는 기를 나타내고, Rb는 식
Figure pat00003
로 표시되는 기 또는 수소 원자를 나타내고, XX는 식
Figure pat00004
로 표시되는 기를 나타내고, G는 5-아세트아미드-2-히드록시메틸-3,4-디히드록시테트라히드로피란-6-일 기(GalNAc)를 나타내고, Z는 산소 원자 또는 유황 원자를 나타내고, L1 및 L2는 한 쪽이 메틸렌기(CH2)를 나타내고, 다른 쪽이 원자를 사이에 두지 않음을 나타내며, p, q, r, s, t 및 u는 서로 독립적으로 0 또는 1을 나타내고, n 및 n'는 서로 독립적으로 1∼15의 정수를 나타내고, m 및 m'는 서로 독립적으로 0∼5의 정수를 나타내고, Rb가 수소 원자가 아닐 때, v는 1을 나타내고, Rb가 수소 원자일 때, v는 1∼7을 나타낸다. 단, n이 1일 때 m은 0∼5의 정수이고, n이 2∼15의 정수일 때 m은 0이고, n'가 1일 때 m'는 1∼5의 정수이고, n'가 2∼15의 정수일 때 m'는 0이다. 인 원자로부터 먼 쪽의 결합손에는 수산기, XX 기, 또는 OG 기가 결합해도 된다].
(19) GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인, (16) 또는 (17)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
Figure pat00005
[식 중, G, Z, L1, L2, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다].
(20) GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인, (16) 또는 (17)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
Figure pat00006
[식 중, G, Z, L1, L2, q, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타내고, Ra'는 식
Figure pat00007
로 표시되는 기를 나타낸다].
(21) GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인, (16) 또는 (17)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
Figure pat00008
[식 중, G, Z, L1, L2, s, n, m 및 v는 상기와 동일한 의미를 나타내고, Rb'는 식
Figure pat00009
(식 중, n'및 m'는 상기와 동일한 의미를 나타낸다)로 표시되는 기 혹은 수소 원자를 나타낸다].
(22) GalNAc 유닛이, 또는, 하기 식으로 표시되는 기인, (16) 또는 (17)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
Figure pat00010
[식 중, G, Z, L1, L2, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다].
(23) GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인, (16) 또는 (17)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
Figure pat00011
[식 중, G, Z, L1, L2, n, m 및 Ra'는 상기와 동일한 의미를 나타낸다].
(24) 하기 식으로 표시되는, (1)에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
Figure pat00012
[식 중, R은 수소 원자, XX 기, 또는 G 기를 나타내고, T는 5' 말단에 수산기를 갖지 않은 올리고뉴클레오티드를 나타내고, Xg는 X1∼X6 및 X9∼X17로 이루어진 군으로부터 선택되는 GalNAc 유닛을 나타내거나, 또는, RO-Xg는 X7, X8, X18, X19, X20, X21 및 X22로 이루어진 군으로부터 선택되는 GalNAc 유닛을 나타내고, Xa, Xb, Xc, Xd, Xe 및 Xf는 서로 독립적으로 X1∼X6 및 X9∼X17 또는 그들의 광학이성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 GalNAc 유닛 또는 단일결합을 나타낸다].
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
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Figure pat00030
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Figure pat00032
Figure pat00033
Figure pat00034
(25) (1)∼(24)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 의약.
(26) (1)∼(24)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 당원병 Ia형 치료약.
(27) (1)∼(24)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 의약적으로 유효한 양으로 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 당원병 Ia형의 치료 방법.
(28) 당원병 Ia형의 치료 방법에 사용하기 위한, (1)∼(24) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
(29) (1)∼(24)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 경구 또는 비경구로 투여하기 위한 배합물.
(30) 의약으로서 사용하기 위한, (1)∼(24)의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
본 발명에 의해, 당원병 Ia형 환자에 있어서, 당원병 Ia형 환자 중, c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자를 mRNA 레벨에서 수복할 수 있고, 그 결과, G6PC 단백질을 발현하여, 당원병 Ia형 환자의 저혈당의 정상화, 간비대의 정상화, 간암으로의 진행을 억제하는 것이 가능해진다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 특원2018-43524 및 특원2018-128015의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
[도 1] (A) G6PC 유전자로부터 G6PC 단백질이 생성되는 과정을 설명하는 도면이다. (B) 당원병 Ia형 환자 중, c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 스플라이싱의 패턴을 나타내는 도면이다.
[도 2] 본 발명의 당원병 Ia형 치료약 ASO에 의한 치료 원리를 설명하는 모식도를 나타낸다.
[도 3] ASO(21e_001∼21e_012)가 c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 엑손 5에 결합할 수 있는 서열을 나타내는 도면이다.
[도 4] ASO(21m_001∼21m_012)가 c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 엑손 5에 결합할 수 있는 서열을 나타내는 도면이다.
[도 5] ASO를 이용하여 qRT-PCR에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. (A) ASO(21e_001∼21e_012)를 이용한 경우. (B) ASO(21m_001∼21m_012)를 이용한 경우. RQ: 상대적 정량화(Relative Quantification)
[도 6] ASO를 이용해 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하고 LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드를 생산하는 효과를 나타내는 도면이다. (A) ASO(21e_001∼21e_012)를 이용한 경우. (B) ASO(21m_001∼21m_012)를 이용한 경우.
[도 7] ASO를 이용해 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하고 G6PC 효소 활성을 나타내는 도면이다. (A) ASO(21e_001∼21e_012)를 이용한 경우. (B) ASO(21m_001∼21m_012)를 이용한 경우.
[도 8] ASO(21e_001∼21e_006 및 21e_013∼21e_022)가 c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 엑손 5상에 결합할 수 있는 서열을 나타내는 도면이다.
[도 9] ASO(21e_001∼21e_006 및 21e_013∼21e_022)를 이용하여 qRT-PCR에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화
[도 10] ASO(21e_001∼21e_006 및 21e_013∼21e_022)를 이용해 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하고, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드를 생산하는 효과를 나타내는 도면이다.
[도 11] ASO(18e_001∼18e_017)가 c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 엑손 5에 결합할 수 있는 서열을 나타내는 도면이다.
[도 12]ASO(18m_001∼18m_017)가 c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 엑손 5에 결합할 수 있는 서열을 나타내는 도면이다.
[도 13] (A) ASO(18e_001∼18e_017)를 이용하여 qRT-PCR에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. (B) ASO(18m_001∼18m_017)를 이용하여 qRT-PCR에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화
[도 14] (A) ASO(18e_001∼18e_017)를 이용해 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하고, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드를 생산하는 효과를 나타내는 도면이다. (B) ASO(18m_001∼18m_017)를 이용해 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하고, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드를 생산하는 효과를 나타내는 도면이다.
[도 15] ASO(18e_018∼18e_031)가 c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 엑손 5에 결합할 수 있는 서열을 나타내는 도면이다.
[도 16] (A) ASO(18e_018∼18e_031)를 이용하여 qRT-PCR에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. (B) ASO(18e_018∼18e_031)를 이용해 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱을 수복하고, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드를 생산하는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화
[도 17] ASO(21e_002, 18e_005, 21m_002, 18e_022, 18m_005, 15e_001, 15ed_001, 18e_008, 18e_025, 18m_008, 15e_002및 15ed_002)가 c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자의 mRNA의 엑손 5에 결합할 수 있는 서열을 나타내는 도면이다.
[도 18] ASO(21e_002, 18e_005, 21m_002, 18m_005, 18e_022, 15e_001, 15ed_001, 18e_008, 18e_025, 18m_008, 15e_002, 및 15ed_002)를 이용하여 qRT-PCR에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; Actn: β-엑틴
[도 19] 실시예 91 내지 95의 화합물을 헤테로 낙-인(knock-in) 마우스에 투여할 때의 qRT-PCR에 의한 간장 중의 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; Actn: β-엑틴; mpk: ㎎/㎏
[도 20] 실시예 91, 및 실시예 96 내지 103의 화합물을 헤테로 낙-인 마우스에 투여할 때의 qRT-PCR에 의한 간장 중의 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; Actn: β-엑틴; mpk: ㎎/㎏
[도 21] 실시예 83, 실시예 87 내지 91, 및 실시예 104 내지 107의 화합물을 헤테로 낙-인 마우스에 투여할 때의 qRT-PCR에 의한 간장 중의 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; Actn: β-엑틴; mpk: ㎎/㎏
[도 22] 실시예 104, 및 실시 108 내지 115의 화합물을 헤테로 낙-인 마우스에 투여할 때의 qRT-PCR에 의한 간장 중의 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; Actn: β-엑틴; mpk: ㎎/㎏
[도 23] 실시예 105, 113, 및 131 내지 137의 화합물을 헤테로 낙-인 마우스에 투여할 때의 qRT-PCR에 의한 간장 중의 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; Actn: β-엑틴; mpk: ㎎/㎏
[도 24] 실시예 1의 화합물에 의한 배양 세포에서의 이상 스플라이싱 수복 서열의 단편(fragment) 해석을 나타내는 도면이다.
[도 25] 실시예 133, 및 143 내지 149의 화합물을 헤테로 낙-인 마우스에 투여할 때의 qRT-PCR에 의한 간장 중의 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; mpk: ㎎/㎏
[도 26] 실시예 149, 및 152 내지 160의 화합물을 헤테로 낙-인 마우스에 투여할 때의 qRT-PCR에 의한 간장 중의 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱이 시정되는 효과를 나타내는 도면이다. RQ: 상대적 정량화; mpk: ㎎/㎏
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 당원병 Ia형 환자 중, c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자를 mRNA 레벨에서 수복하고, 정상적인 G6PC 단백질을 발현시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 cDNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15∼30의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 82번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어진다.
본 발명에 있어서, 당원병 Ia형 환자 중, c.648G>T 변이를 하는 환자를 대상으로 할 수 있다. c.648G>T 변이의 호모 접합의 환자 뿐만 아니라, c.648G>T 변이와 다른 변이의 복합 헤테로 접합의 환자도 대상으로 할 수 있다.
G6PC 유전자의 c.648G>T 변이는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 글루코오스-6-포스파타아제(glucose-6-phosphatase) 촉매 서브유닛(catalytic subunit) (G6PC), 전사 변이체(transcript variant) 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호(accession No.) NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로의 변이이다. 엑손 5의 5' 말단에서 86번째에 위치한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 86번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지면 되고, 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.
c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 cDNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15∼30의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 82번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 상기 올리고뉴클레오티드로는 서열번호 1∼32, 40∼42, 44∼48의 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t 또는 T는 u 또는 U이어도 되고, u 또는 U는 t 또는 T이어도 됨)의 전부 또는 일부를 포함하는 것을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서 「서열의 일부」란 통상 해당 서열 전체의 80% 이상이고, 적합하게는 85%이며, 더욱 적합하게는 90%이고, 가장 적합하게는 94%이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 염기수는 15∼30이 적당하고, 15∼21이 바람직하고, 15∼18이 보다 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)를 구성하는 뉴클레오티드는 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA의 키메라, 이들 수식체의 어느 것이어도 되지만, 적어도 1개가 수식 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
본 발명에서의 수식 뉴클레오티드로서는 당이 수식된 것(예를 들면, D-리보푸라노오스가 2'-O-알킬화된 것, D-리보푸라노오스가 2'-O, 4'-C-알킬렌화된 것, D-리보푸라노오스가 2'-, 4'-가교된 것), 인산 디에스테르 결합이 수식(예를 들면, 티오에이트화)된 것, 염기가 수식된 것, 그들을 조합시킨 것 등을 예시할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1개의 D-리보푸라노오스가 2'-O-알킬화된 것이나 2'-O, 4'-C-알킬렌화된 것은 RNA에 대한 결합력이 높은 것, 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 것으로부터, 천연형의 뉴클레오티드(즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA)보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 또, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1개의 인산 디에스테르 결합이 티오에이트화된 것도, 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 것으로부터, 천연형의 뉴클레오티드(즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA)보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 상기와 같은 수식된 당과 수식된 인산의 양자를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 내성이 보다 높은 것으로부터, 더욱 높은 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)에 있어서, 당의 수식의 예로는 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화(예를 들면, 2'-O-메틸화, 2'-O-아미노에틸화, 2'-O-프로필화, 2'-O-알릴화, 2'-O-메톡시에틸화, 2'-O-부틸화, 2'-O-펜틸화, 2'-O-프로파르길화 등), D-리보푸라노오스의 2'-O, 4'-C-알킬렌화(예를 들면, 2'-O, 4'-C-에틸렌화, 2'-O, 4'-C-메틸렌화, 2'-O, 4'-C-프로필렌화, 2'-O, 4'-C-테트라메틸렌화, 2'-O, 4'-C-펜타메틸렌화 등), D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C, 4'-C-메틸렌옥시메틸렌화, S-cEt(2',4'-constrained ethyl), AmNA(Amide-bridged nucleic acid), 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시 D-리보푸라노오스, 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시-2'-플루오르-D-리보푸라노오스 등을 들 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)에 있어서, 당의 2'-, 4'-가교 수식의 예로는 D-리보푸라노오스의 2'-O, 4'-C-알킬렌화(예를 들면, 2'-O, 4'-C-에틸렌화, 2'-O, 4'-C-메틸렌화, 2'-O, 4'-C-프로필렌화, 2'-O, 4'-C-테트라메틸렌화, 2'-O, 4'-C-펜타메틸렌화 등), D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C, 4'-C-메틸렌옥시메틸렌화, S-cEt(2',4'-constrained ethyl), AmNA 등을 들 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)에 있어서, 인산 디에스테르 결합의 수식의 예로는 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 결합, 메틸티오포스포네이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 포스포로아미데이트 결합 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 염기의 수식의 예로는 시토신의 5-메틸화, 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오드화, N4-메틸화, 티민의 5-데메틸화(우라실), 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오드화, 아데닌의 N6-메틸화, 8-브로모화, 구아닌의 N2-메틸화, 8-브로모화 등을 들 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 시판되는 합성기(예를 들면, 퍼킨 엘머사의 포스포로아미다이드법에 의한 모델 392) 등을 이용하고, 문헌(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))에 기재된 방법에 준해 합성할 수 있다. 그 때에 이용되는 포스포로아미다이트 시약은 천연형의 뉴클레오시드 및 2'-O-메틸 뉴클레오시드(즉, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸아데노신, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸우리딘)에 대해서는 시판되는 시약을 이용할 수 있다. 알킬기의 탄소수가 2∼6개인 2'-O-알킬구아노신, 아데노신, 시티딘 및 우리딘에 대해서는 이하와 같다.
2'-O-아미노에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 문헌(Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725)에 따라 합성할 수 있다.
2'-O-프로필구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 문헌(Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838)에 따라 합성할 수 있다.
2'-O-알릴구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 시판되는 시약을 이용할 수 있다.
2'-O-메톡시에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 특허(US6261840) 또는 문헌(Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504)에 따라 합성할 수 있다.
2'-O-부틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 문헌(Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838)에 따라 합성할 수 있다.
2'-O-펜틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 문헌(Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838)에 따라 합성할 수 있다.
2'-O-프로파르길구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 시판되는 시약을 이용할 수 있다.
2'-O, 4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO99/14226에 기재의 방법에 따라서, 알킬렌기의 탄소수가 2∼5개의 2'-O, 4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는 WO00/47599에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C, 4'-C-메틸렌옥시메틸렌화된 뉴클레오시드는 문헌(Wang,G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724)에 따라 합성할 수 있다.
S-cEt(constrained ethyl)는 문헌(Seth, P.P. et al. J. Org. Chem (2010), 75, 1569-1581)에 따라 합성할 수 있다.
AmNA는 문헌(Yahara, A. et al. Chem Bio Chem (2012), 13, 2513-2516) 또는 WO2014/109384에 따라 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 핵산 염기 서열은 아데닌을 (A) 또는 (a), 구아닌을 (G) 또는 (g), 시토신을 (C) 또는 (c), 티민을 (T) 또는 (t), 및 우라실을 (U) 또는 (u)로 각각 기재할 수 있다. 시토신 대신에 5-메틸시토신을 사용할 수 있다. 핵산 염기 중, 우라실 (U) 또는 (u)과 티민 (T) 또는 (t)은 호환성이 있다. 우라실 (U) 또는 (u)과 티민 (T) 또는 (t)의 어느 쪽도 상보쇄의 아데닌 (A) 또는 (a)과의 염기쌍 형성에 사용할 수 있다.
포스포로아미다이트 시약을 커플링한 후, 유황, 테트라에틸티우람디설피드(TETD, 어플라이드 바이오시스템사), Beaucage 시약(Glen Research사), 또는 크산탄하이드리드 등의 시약을 반응시킴으로써, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다(Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198).
합성기에서 이용하는 콘트롤드 포어 글라스(CPG)로는 2'-O-메틸 뉴클레오시드가 결합한 것은 시판되는 것을 이용할 수 있다. 또, 2'-O, 4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는 WO99/14226에 기재된 방법에 따라, 알킬렌기의 탄소수가 2∼5개인 2'-O, 4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는 WO00/47599에 기재된 방법에 따라 제조한 뉴클레오시드를 문헌(Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J. Gait, OXford University Press, 1984)에 따라 CPG에 결합할 수 있다. 수식된 CPG(일본 특개평7-87982의 실시예 12b에 기재)를 이용함으로써, 3' 말단에 2-히드록시에틸 인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 또, 3'-아미노-모디파이어(amino-Modifier) C3 CPG, 3'-아미노-모디파이어 C7 CPG, 글리세릴(Glyceryl) CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000(link technologies)을 사용하면 3' 말단에 히드록시알킬 인산기, 또는 아미노알킬 인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 GalNAc가 링커 및 인산부를 통해 결합하고 있어도 된다.
본 발명에서의 GalNAc 유닛이란 GalNAc가 결합한 링커가 결합한 인산기이며, 추가로 1개의 결합손을 갖고 있어도 된다. GalNAc 유닛의 인산기는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단과 결합할 수 있고, 적합하게는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 결합한다. GalNAc 유닛이 결합손을 갖는 경우, 해당 결합손은 수산기, GalNAc, GalNAc가 결합한 링커, 다른 GalNAc 유닛의 인산기, 또는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 인산기와 결합할 수 있다. 1개의 GalNAc 유닛에 결합하고 있는 GalNAc의 수로는 적합하게는 1 내지 7개이고, 보다 적합하게는 1 내지 5개이며, 특히 적합하게는 1 내지 3개이고, 최적 개수는 2개이다.
본 발명에서는 1개의 GalNAc 유닛이 올리고뉴클레오티드에 결합해도 되고, 복수의 GalNAc 유닛이 연속해 결합하여 올리고뉴클레오티드에 결합해도 된다. 1개의 올리고뉴클레오티드에 결합하는 GalNAc 유닛의 수로는 적합하게는 1 내지 7개이고, 보다 적합하게는 1 내지 5개이며, 특히 적합하게는 1 내지 3개이고, 최적 개수는 1개이다.
본 발명에서는 GalNAc 유닛과 결합하는 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 안티센스 올리고뉴클레오티드와는 상이한 염기 서열로서, 인산 디에스테르 결합으로 이루어지고 생체내에서 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고 있어도 된다. 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사슬 길이로는 1 내지 6 뉴클레오티드가 적합하고, 더욱 적합하게는 1 내지 3 뉴클레오티드이다. 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드는 절단될 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 모두가 DNA로 이루어지는 천연형 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 모두가 RNA로 이루어지는 천연형 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 염기 서열로는 절단될 수 있는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 5'-TCATCA-3', 5'-CATCA-3', 5'-ATCA-3', 5'-TCA-3', 5'-CA-3', 5'-A-3' 등을 들 수 있다.
본 발명의 GalNAc 유닛의 예로는, 예를 들면, 일반식
Figure pat00035
[식 중, Ra는 식
Figure pat00036
로 표시되는 기를 나타내고, Rb는 식
Figure pat00037
로 표시되는 기 또는 수소 원자를 나타내고, XX는 식
Figure pat00038
로 표시되는 기를 나타내고, G는 5-아세트아미드-2-히드록시메틸-3,4-디히드록시테트라히드로피란-6-일 기(GalNAc)를 나타내고, Z는 산소 원자 또는 유황 원자를 나타내고, L1 및 L2는 한 쪽이 메틸렌기(CH2)를 나타내고 다른 쪽이 원자를 사이에 두지 않음을 나타내며, p, q, r, s, t 및 u는 서로 독립적으로 0 또는 1을 나타내고, n 및 n'는 서로 독립적으로 1∼15의 정수를 나타내고, m 및 m'는 서로 독립적으로 0∼5의 정수를 나타내고, Rb가 수소 원자가 아닐 때 v는 1을 나타내고, Rb가 수소 원자일 때 v는 1∼7을 나타낸다. 단, n이 1일 때 m은 0∼5의 정수이고, n이 2∼15의 정수일 때 m은 0이고, n'가 1일 때 m'는 1∼5의 정수이고, n'가 2∼15의 정수일 때 m'는 0이다. 인 원자로부터 먼 쪽의 결합손에는 수산기, XX 기, 또는 OG 기가 결합해도 된다]로 표시되는 기이고, 적합하게는 식
Figure pat00039
[식 중, G, Z, L1, L2, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다]로 표시되는 기, 식
Figure pat00040
[식 중, G, Z, L1, L2, q, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타내고, Ra'는 식
Figure pat00041
로 표시되는 기를 나타낸다]로 표시되는 기, 식
Figure pat00042
[식 중, G, Z, L1, L2, s, n, m 및 v는, 상기와 동일한 의미를 나타내고, Rb'는 식
Figure pat00043
(식 중, n' 및 m'는 상기와 동일한 의미를 나타낸다)로 표시되는 기 혹은 수소 원자를 나타낸다]로 표시되는 기, 식
Figure pat00044
[식 중, G, Z, L1, L2, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다]로 표시되는 기, 또는 식
Figure pat00045
[식 중, G, Z, L1, L2, n, m 및 Ra'는 상기와 동일한 의미를 나타낸다]로 표시되는 기이다.
본 발명에 있어서, GalNAc 유닛이 결합한 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 식
Figure pat00046
[식 중, R은 수소 원자, XX 기, 또는 G 기를 나타내고, T는 5' 말단에 수산기를 갖지 않은 올리고뉴클레오티드를 나타내고, Xg는 결합손을 갖는 GalNAc 유닛을 나타내고, Xa, Xb, Xc, Xd, Xe 및 Xf는 서로 독립적으로 결합손을 갖는 GalNAc 유닛 또는 단일결합을 나타낸다]로 표시되는 올리고뉴클레오티드이다.
Xa, Xb, Xc, Xd, Xe, Xf 및 Xg에서의 「결합손을 갖는 GalNAc 유닛」으로는 다음과 같은 기를 들 수 있다.
Figure pat00047
Figure pat00048
Figure pat00049
Figure pat00050
Figure pat00051
Figure pat00052
Figure pat00053
Figure pat00054
Figure pat00055
Figure pat00056
Figure pat00057
Figure pat00058
Figure pat00059
Figure pat00060
Figure pat00061
또, 「결합손을 갖는 GalNAc 유닛」인 Xg, 및 R이 XX 기 또는 G 기로 이루어지는 RO-Xg-의 「GalNAc 유닛」으로는 다음과 같은 기를 들 수 있다.
Figure pat00062
Figure pat00063
Figure pat00064
Figure pat00065
Figure pat00066
Figure pat00067
Figure pat00068
본 발명의 GalNAc 유닛이 결합한 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 유닛을 함유하는 아미다이트를 뉴클레오시드의 아미다이트 시약과 동일하게 이용함으로써, 시판되는 합성기(예를 들면, 퍼킨 엘머사의 포스포로아미다이드법에 의한 모델 392) 등을 이용하고, 문헌(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))에 기재된 방법에 준해 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하는 경우에는 올리고뉴클레오티드의 부분의 쇄 신장을 종료한 후에 GalNAc 유닛을 함유하는 아미다이트를 커플링함으로써 합성할 수 있다. 또, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하는 경우에는 수식된 CPG(일본 특개평7-87982의 실시예 12b에 기재), 3'-아미노-모디파이어 C3 CPG, 3'-아미노-모디파이어 C7 CPG, 글리세릴 CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000(link technologies) 등을 사용해 GalNAc 유닛을 함유하는 아미다이트를 커플링하고, 그 후에 올리고뉴클레오티드의 부분의 쇄 신장을 함으로써, 3' 말단에 히드록시알킬 인산기, 또는 아미노알킬 인산기를 갖고, 추가로 GalNAc 유닛이 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
GalNAc 유닛 함유 아미다이트의 합성법
본 발명의 GalNAc 유닛 함유 아미다이트는 후술하는 A 법 내지 I 법에 따라 제조할 수 있다. A 법 내지 I 법에 있어서, 각 반응 종료 후, 각 반응의 목적 화합물은 상법에 따라 반응 혼합물로부터 채취된다. 예를 들면, 반응 혼합물을 적당히 중화하고, 또 불용물이 존재하는 경우에는 여과에 의해 제거한 후, 물과 아세트산에틸과 같은 혼화하지 않는 유기용매를 가하여 목적물을 포함하는 유기층을 분리하고, 물 등으로 세정 후, 무수 황산 나트륨 등으로 건조 후, 용제를 유거(留去)함으로써 얻을 수 있다. 얻어진 화합물은 필요하면 상법, 예를 들면 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리·정제할 수 있다. 혹은, 재침전, 재결정에 의해 정제할 수 있다.
A 법
A 법은 화합물(8)을 제조하기 위한 방법이다. 화합물(2)에 역으로 입체 배치된 것을 이용하면, 화합물(8)에 있어서 -P(R3) R4가 결합한 2급 수산기의 입체 배치도 역으로 된다.
Figure pat00069
식 중 R1은 수산기의 일반적인 보호기이고, R2는 4,4'-디메톡시트리틸기이다. 식 중, -P(R3) R4는 [R3 및 R4는 동일 또는 상이하고, 수산기, 보호된 수산기, 머캅토기, 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 4개의 알콕시기, 탄소수 1 내지 4개의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 5개의 시아노알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4개의 알킬기로 치환된 아미노기를 나타낸다]를 나타낸다. 식 중 X는 탄소 원자 또는 산소 원자이다. 식 중 n은 1∼15의 정수이고, m은 0∼5의 정수이다. 단, n이 1일 때 m은 0∼5의 정수이고, n이 2∼15의 정수일 때 m은 0이다.
공정 A-1은 화합물(3)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 산의 존재 하, 화합물(1)과 화합물(2)을 반응시켜, 에폭시드의 개환 시에 에테르 결합을 생성한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매로는, 예를 들면, 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화 탄화수소류, 에테르류, 아세토니트릴 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄이다.
상기 반응에 사용되는 산으로는, 예를 들면, 유기산류, 루이스산 등을 들 수 있다. 유기산으로는, 예를 들면, 트리플루오로메탄 설폰산 등을 들 수 있고, 루이스산으로는, 예를 들면, 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 트리플루오로메탄 설폰산이다.
반응 온도는 화합물(1) 및 화합물(2), 산, 불활성 용매 등에 의해 상이하지만, 통상 -20℃로부터 환류 온도이다. 바람직하게는 30℃ 내지 45℃이다.
반응 시간은, 화합물(1) 및 화합물(2), 산, 불활성 용매, 반응 온도 등에 의해 상이하지만, 통상, 15분간 내지 72시간, 바람직하게는 2시간 내지 24시간이다.
공정 A-2는 화합물(5)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 산의 존재 하, 화합물(3) 및 화합물(4)을 반응시켜 글리코시드 결합을 생성한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매로는, 예를 들면, 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화 탄화수소류, 에테르류, 아세토니트릴 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄이다.
상기 반응에 사용되는 산으로는, 예를 들면, 유기산류, 루이스산 등을 들 수 있다. 유기산으로는, 예를 들면, 트리플루오로메탄 설폰산 등을 들 수 있고, 루이스산으로는, 예를 들면, 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체 등을 들 수 있고, 바람직하게는 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체이다.
반응 온도는 화합물(3), 산, 불활성 용매 등에 의해 상이하지만, 통상 -20℃로부터 환류 온도이다. 바람직하게는 30℃ 내지 45℃이다.
반응 시간은 화합물(3), 산, 불활성 용매, 반응 온도 등에 의해 상이하지만, 통상 15분간 내지 72시간, 바람직하게는 2시간 내지 24시간이다.
공정 A-3은 화합물(6)을 제조하는 공정이며, 화합물(5)에서의 수산기의 보호기인 R1을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 A-4는 화합물(7)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드와 염기의 존재 하, 화합물(6)의 1급 수산기에 R2를 도입한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매로는, 예를 들면, 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화 탄화수소류, 에테르류, 아세토니트릴 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄 또는 피리딘이다.
상기 반응에 사용되는 염기로는, 예를 들면, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 피리딘이다.
반응 온도는 염기, 불활성 용매 등에 의해 상이하지만, 통상 -20℃로부터 환류 온도이다. 바람직하게는 10℃ 내지 30℃이다.
반응 시간은 염기, 불활성 용매, 반응 온도 등에 의해 상이하지만, 통상 15분간 내지 24시간, 바람직하게는 1시간 내지 4시간이다.
공정 A-5는 화합물(8)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트와 염기의 존재 하, 화합물(7)의 2급 수산기에 -P(R3) R4를 도입한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매로는, 예를 들면, 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화 탄화수소류, 에테르류, 아세토니트릴 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄이다.
상기 반응에 사용되는 염기로는, 예를 들면, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 N,N-디이소프로필에틸아민이다.
반응 온도는 염기, 불활성 용매 등에 의해 상이하지만, 통상 -20℃로부터 환류 온도이다. 바람직하게는 10℃ 내지 30℃이다.
반응 시간은 염기, 불활성 용매, 반응 온도 등에 의해 상이하지만, 통상 15분간 내지 24시간, 바람직하게는 1시간 내지 4시간이다.
B 법
B 법은 화합물(14) 또는 분기형의 화합물(19)을 제조하기 위한 방법이다. 화합물(2)에 역으로 입체 배치된 것을 이용하면, 화합물(14) 또는 분기형의 화합물(19)에 있어서 -P(R3) R4가 결합한 2급 수산기의 입체 배치도 역으로 된다.
Figure pat00070
식 중 R1, R2, R3, R4, X, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타내고, R5 및 R6은 아미노기의 일반적인 보호기이다.
B-1 공정은 화합물(10)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 산의 존재 하, 화합물(9)과 화합물(2)을 반응시켜, 에폭시드의 개환 시에 에테르 결합을 생성한다. 전술한 공정 A-1과 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-2는 화합물(11)을 제조하는 공정이며, 보호기인 R5를 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 B-3은 화합물(13)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(11) 및 화합물(12)을 아미드 축합한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매는 사용하는 축합제의 종류에 의해 적당히 선택할 수 있다. 예를 들면, 물, 알코올류, 비프로톤성 극성 용매 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄 또는 N,N-디메틸포름아미드이다.
상기 반응에 사용되는 염기로는, 예를 들면, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 N,N-디이소프로필에틸아민이다.
상기 반응에 사용되는 축합제로는, 예를 들면, 카르보디이미드계 축합제인 WSC(1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드), DIC(N,N'-디이소프로필카르보디이미드), 이미다졸계 축합제인 CDI(N,N'-카르보닐디이미다졸), 트리아진계 축합제인 DMT-MM(4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄=클로라이드 n수화물), 유로늄계 축합제인 HATU(O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로 인산염), TSTU(O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄테트라플루오로 붕산염), 포스포늄계 축합제인 PyBOP(1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로 인산염) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 WSC 또는 HATU이다. 또, 필요에 따라 첨가제인 HOAt(1-히드록시-7-아자벤조트리아졸), HOBt(1-히드록시벤조트리아졸), OXyma(에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트)를 가해도 된다.
반응 온도는 축합제, 염기, 용매 등에 의해 상이하지만, 통상 -20℃로부터 환류 온도이다. 바람직하게는 10℃ 내지 30℃이다.
반응 시간은 축합제, 염기, 용매, 반응 온도 등에 의해 상이하지만, 통상 15분간 내지 72시간, 바람직하게는 1시간 내지 24시간이다.
화합물(13)로부터 화합물(14)로의 변환은 전술한 A 법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-4는 보호기인 R1을 제거하는 공정으로, 공정 A-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-5는 1급 수산기에 R2를 도입하는 공정으로, 공정 A-4와 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-6은 2급 수산기에 -P(R3) R4를 도입하는 공정으로, 공정 A-4와 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-7은 화합물(16)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(11)과 화합물(15)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-8은 화합물(17)을 제조하는 공정이며, 보호기인 R6을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 B-9는 화합물(18)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(12)과 화합물(17)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(18)로부터 화합물(19)로의 변환은 전술한 A 법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-10은 보호기인 R1을 제거하는 공정으로, 공정 A-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-11은 1급 수산기에 R2를 도입하는 공정으로, 공정 A-4와 동일하게 행할 수 있다.
공정 B-12는 2급 수산기에 -P(R3) R4를 도입하는 공정으로, 공정 A-5와 동일하게 행할 수 있다.
C 법
C 법은 화합물(26) 또는 분기형의 화합물(30)을 합성하여 제조하기 위한 방법이다. 화합물(23)의 2급 수산기에서 역으로 입체 배치된 것을 이용하면, 화합물(26) 혹은 분기형의 화합물(30)에 있어서 -P(R3) R4가 결합한 2급 수산기의 입체 배치도 역으로 된다.
Figure pat00071
식 중 R2, R3, R4, X, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타내고, R8은 수산기의 일반적인 보호기이며, R7 및 R9는 동일 또는 상이하고, 아미노기의 일반적인 보호기이다.
C-1 공정은 화합물(21)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 산의 존재 하, 화합물(20)과 화합물(4)을 반응시켜서 글리코시드 결합을 생성한다. 전술한 공정 A-2와 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-2는 화합물(22)을 제조하는 공정이며, 화합물(21)의 아미노기의 보호기인 R7을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 C-3은 화합물(24)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 활성화제, 염기의 존재 하, 화합물(23)을 활성 에스테르로 변환 후, 화합물(22)과 반응시켜 카르바메이트화한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매로는, 예를 들면, 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화 탄화수소류, 에테르류 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄이다.
상기 반응에 사용되는 활성화제로는 활성화 에스테르를 형성하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 탄산 비스(펜타플루오로페닐), 탄산 비스(4-니트로페닐), 4-니트로페닐클로로포르메이트 등을 들 수 있다. 바람직하게는 4-니트로페닐클로로포르메이트다.
상기 반응에 사용되는 염기로는, 예를 들면, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 활성 에스테르를 조제할 때에는 피리딘을 이용하고, 이어서 아민과 반응시킬 때에는 N,N-디이소프로필에틸아민을 추가한다.
반응 온도는 활성화제, 염기, 불활성 용매 등에 의해 상이하지만, 통상 -20℃로부터 환류 온도이다. 바람직하게는 10℃ 내지 30℃이다.
반응 시간은 활성화제, 염기, 불활성 용매, 반응 온도 등에 의해 상이하지만, 통상 15분간 내지 24시간, 바람직하게는 1시간 내지 4시간이다.
공정 C-4는 화합물(25)을 제조하는 공정이며, 화합물(24)의 수산기의 보호기인 R8을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
화합물(25)로부터 화합물(26)로의 변환은 전술한 A 법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-5는 1급 수산기에 R2를 도입하는 공정으로, 공정 A-4와 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-6은 2급 수산기에 -P(R3) R4를 도입하는 공정으로, 공정 A-5와 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-7은 화합물(28)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(22)과 화합물(27)을 아미드 축합한다. 전술한 B 법의 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(28)로부터 화합물(29)로의 변환은 전술한 방법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-8은 화합물(28)의 아미노기의 보호기인 R9를 제거하는 공정이며, 공정 C-2와 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-9는 카르바메이트화하는 공정이며, 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-10은 보호기인 R8을 제거하는 공정으로, 공정 C-4와 동일하게 행할 수 있다.
화합물(29)로부터 화합물(30)로의 변환은 전술한 A 법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-11은 1급 수산기에 R2를 도입하는 공정으로, 공정 A-4와 동일하게 행할 수 있다.
공정 C-12는 2급 수산기에 -P(R3) R4를 도입하는 공정으로, 공정 A-5와 동일하게 행할 수 있다.
D 법
D 법은 화합물(35)을 제조하기 위한 방법이다. 2회인 아미드 축합의 순서를 변경하거나, 각 화합물의 보호기의 상태에 따라 적당한 공정을 선택할 수 있다. 화합물(23)의 2급 수산기에서 역으로 입체 배치된 것을 이용하면, 화합물(35)에 있어서 -P(R3) R4가 결합한 2급 수산기의 입체 배치도 역으로 된다.
Figure pat00072
식 중 R2, R3, R4, R8, X, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타내고, R10은 아미노기의 일반적인 보호기이다.
공정 D-1은 화합물(32)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(31)과 화합물(12)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 D-2는 화합물(33)을 제조하는 공정이며, 화합물(32)의 아미노기의 보호기인 R10을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 D-3은 화합물(34)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 활성화제, 염기의 존재 하, 화합물(23)을 활성 에스테르로 변환 후, 화합물(33)과 반응시켜 카르바메이트화한다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(34)로부터 화합물(35)로의 변환은 전술한 C 법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 D-4는 보호기인 R8을 제거하는 공정으로, 공정 C-4와 동일하게 행할 수 있다.
공정 D-5는 1급 수산기에 R2를 도입하는 공정으로, 공정 C-5와 동일하게 행할 수 있다.
공정 D-6은 2급 수산기에 -P(R3) R4를 도입하는 공정으로, 공정 C-6과 동일하게 행할 수 있다.
공정 D-7은 화합물(36)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 활성화제, 염기의 존재 하, 화합물(23)을 활성 에스테르로 변환 후, 화합물(31)과 반응시켜 카르바메이트화한다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 D-8은 화합물(36)의 아미노기의 보호기인 R10만을 제거해 화합물(37)을 제조하거나, 또는 수산기의 보호기인 R8과 아미노기의 보호기인 R10을 동시에 제거해 화합물(38)을 제조한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 D-9는 화합물(34)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(37)과 화합물(12)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 D-10은 화합물(39)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(38)과 화합물(12)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(39)로부터 화합물(35)로의 변환은 공정 D-5 및 D-6에 의해 행할 수 있다.
E 법
E 법은 D 법에서 사용한 화합물(31)이나 합성한 중간체(38)를 이용하여 분기형의 화합물(44)을 제조하기 위한 방법이다. 2회인 아미드 축합의 순서를 변경하거나, 각 화합물의 보호기의 상태에 따라 적당한 공정을 선택할 수 있다. 화합물(23)의 2급 수산기에서 역으로 입체 배치된 것을 이용하면, 화합물(44)에 있어서 -P(R3) R4가 결합한 2급 수산기의 입체 배치도 역으로 된다.
Figure pat00073
식 중 R2, R3, R4, R6, R8, R10, X, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다.
공정 E-1은 화합물(40)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(31)과 화합물(15)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-2는 화합물(40)의 아미노기의 보호기인 R6만을 제거해 화합물(41)을 제조한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 E-3은 화합물(42)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(41)과 화합물(12)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(42)로부터 화합물(43)로의 변환은 전술한 D 법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-4는 화합물(42)의 아미노기의 보호기인 R10을 제거하는 공정으로, 전술한 공정 D-2와 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-5는 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 D-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(43)로부터 화합물(44)로의 변환은 전술한 C 법과 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-6은 화합물(43)의 수산기의 보호기인 R8을 제거하는 공정으로, 공정 C-4와 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-7은 1급 수산기에 R2를 도입하는 공정으로, 공정 C-5와 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-8은 2급 수산기에 -P(R3) R4를 도입하는 공정으로, 공정 C-6과 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-9는 화합물(45)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(38)과 화합물(15)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(45)로부터 화합물(46)로의 변환은 전술한 공정 E-2및 E-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 E-10은 화합물(45)의 아미노기의 보호기인 R6을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 E-11은 화합물(15)을 아미드 축합으로 도입하는 공정이다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
화합물(46)로부터 화합물(44)로의 변환은 공정 E-7및 E-8에 의해 행할 수 있다.
F 법
F 법은 A 법에서 합성한 중간체(3)를 이용하여 분기형의 화합물(49)을 제조하기 위한 방법이다. 화합물(3)의 2급 수산기에서 역으로 입체 배치된 것을 이용하면, 화합물(49)에 있어서 GalNAc가 결합한 2급 수산기의 입체 배치도 역으로 된다.
Figure pat00074
식 중 R1, R3, R4, X, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다.
공정 F-1은 화합물(47)을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 산의 존재 하, 화합물(3)과 화합물(4)을 반응시켜 글리코시드 결합을 2개 생성한다. 전술한 공정 A-2와 동일하게 행할 수 있다.
공정 F-2는 화합물(48)을 제조하는 공정이며, 화합물(47)의 수산기의 보호기인 R1을 제거한다. 전술한 공정 A-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 F-3은 화합물(49)을 제조하는 공정이며, 수산기에 -P(R3) R4를 도입한다. 전술한 공정 A-5와 동일하게 행할 수 있다.
G 법
G 법은 C 법에서 사용한 중간체(22)를 이용하여 분기형의 화합물(55)을 제조하기 위한 방법이다. 화합물(52) 혹은 화합물(56)의 2급 수산기에서 역으로 입체 배치된 것을 이용하면, 화합물(55)에 있어서 GalNAc가 결합한 2급 수산기의 입체 배치도 역으로 된다.
Figure pat00075
식 중 R3, R4, X, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타내고, r은 0 또는 1을 나타내며, R11은 아미노기의 일반적인 보호기이고, R12 및 R13은 수산기의 일반적인 보호기이다.
공정 G-1은 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(22)과 화합물(50)을 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 G-2는 보호기인 R11을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 G-3은 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다. 단, r=0일 때에는 화합물(22)을 카르바메이트화하고, r=1일 때에는 화합물(52)을 카르바메이트화한다.
공정 G-4는 보호기인 R12를 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 G-5는 화합물(55)을 제조하는 공정이며, 수산기에 -P(R3) R4를 도입한다. 전술한 공정 A-5와 동일하게 행할 수 있다.
공정 G-6은 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다. 단, r=0일 때에는 화합물(22)을 카르바메이트화하고, r=1일 때에는 화합물(52)을 카르바메이트화한다.
공정 G-7은 보호기인 R13을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 G-8은 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 C-3과 동일하게 행할 수 있다.
H 법
H 법은 C 법에서 사용한 중간체(22) 혹은 G 법에서 사용한 중간체(51)를 이용하여 분기형의 화합물(61)을 제조하기 위한 방법이다. 화합물(52) 혹은 화합물(56)의 입체 배치는 한정하지 않는다.
Figure pat00076
식 중 R3, R4, X, n, m, r, R12 및 R13은 상기와 동일한 의미를 나타낸다.
공정 H-1은 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다. 단, r=0일 때에는 화합물(22)을 카르바메이트화하고, r=1일 때에는 화합물(51)을 카르바메이트화한다.
공정 H-2는 보호기인 R13을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 H-3은 화합물(61)을 제조하는 공정이며, 수산기에 -P(R3) R4를 도입한다. 전술한 공정 A-5와 동일하게 행할 수 있다.
공정 H-4는 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다. 단, r=0일 때에는 화합물(22)을 카르바메이트화하고, r=1일 때에는 화합물(52)을 카르바메이트화한다.
공정 H-5는 보호기인 R12를 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 H-6은 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다.
I 법
I 법은 분기형의 화합물(73), 및 화합물(74)을 제조하기 위한 방법이다. 예를 들면, 화합물(70)을 이용함으로써, GalNAc 부분의 6위 수산기의 보호기를 적당히 선택할 수 있다. R14가 아세틸기인 경우, 화합물(70)로서 C 법에서 합성할 수 있는 화합물(22)을 사용한다. R14가 4,4'-디메톡시트리틸기인 경우, 화합물(70)로서 예를 들면 후술하는 참고예에 따라 합성할 수 있는 화합물을 사용한다.
Figure pat00077
(식 중, R12 및 R13은 수산기의 일반적인 보호기이지만, 바람직하게는 벤질기이다. 식 중 R14는 수산기의 일반적인 보호기이지만, 바람직하게는 아세틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기이다. 식 중 R15는 카르보닐기의 일반적인 보호기이지만, 바람직하게는 벤질기이다. 식 중, -P(R3) R4는 [R3 및 R4는 동일 또는 상이하고, 수산기, 보호된 수산기, 머캅토기, 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 4개의 알콕시기, 탄소수 1 내지 4개의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 5개의 시아노알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4개의 알킬기로 치환된 아미노기를 나타낸다]를 나타낸다. 식 중 X는 탄소 혹은 산소이다. 식 중 n은 1∼15의 정수이고, m은 0∼5의 정수이다. 단, n이 1일 때 m은 0∼5의 정수이고, n이 2∼15의 정수일 때 m은 0이다. 식 중 R은 독립적으로 0이나 1이다. 식 중 v는 1∼7이다.
공정 I-1은 카르바메이트화하는 공정이다. 전술한 공정 C-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 I-2는 보호기인 R12 혹은 R13과 R15를 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들면, 문헌(T.H. Greene, P.G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc.) 등에 기재된 방법과 같은 상법에 따라 행할 수 있다.
공정 I-3은 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재 하, 화합물(22)과 아미드 축합한다. 전술한 공정 B-3과 동일하게 행할 수 있다.
공정 I-4는 화합물(73) 혹은 화합물(74)을 제조하는 공정이며, 수산기에 -P(R3) R4를 도입한다. 전술한 공정 A-5와 동일하게 행할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 의약으로서 특히 당원병 Ia형의 치료에 이용할 수 있다. 치료에는 예방 및 사후 치료의 모두가 포함된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 약리상 허용되는 염의 형태로 이용해도 된다. 「약리상 허용되는 염」이란 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)의 염을 말하고, 그러한 염으로는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염; 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬 에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸 암모늄염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염; 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염; 메탄 설폰산염, 트리플루오로메탄 설폰산염, 에탄 설폰산염과 같은 저급 알칸 설폰산염, 벤젠 설폰산염, p-톨루엔 설폰산염과 같은 아릴 설폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염; 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루타민산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있고, 바람직하게는 알칼리 금속염이며, 보다 바람직하게는 나트륨염이다. 이들 염은 공지의 방법으로 제조할 수 있다.
또, 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 및 그의 약리상 허용되는 염은 용매화물(예를 들면, 수화물)로서도 존재하는 경우가 있고, 그러한 용매화물이어도 된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드), 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 당원병 Ia의 치료에 사용하는 경우에는 그 자체 혹은 적당한 약리상 허용되는 부형제, 희석제 등과 혼합하여, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 혹은 시럽제 등에 의해 경구적으로, 혹은 주사제, 좌제, 첨부제 혹은 외용제 등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다.
이들 제제는 부형제(예를 들면, 유당, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비톨과 같은 당 유도체; 옥수수 전분, 감자 전분, α 전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체; 결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 아라비아 고무; 덱스트란; 플루란과 같은 유기계 부형제; 경질 무수 규산, 합성 규산알루미늄, 규산칼슘, 메타규산알루민산마그네슘과 같은 규산염 유도체; 인산수소칼슘과 같은 인산염; 탄산칼슘과 같은 탄산염; 황산칼슘과 같은 황산염 등의 무기계 부형제 등), 활택제(예를 들면, 스테아르산; 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘과 같은 스테아르산 금속염; 탈크; 콜로이드 실리카; 비즈 왁스, 경랍과 같은 왁스류; 붕산; 아디프산; 황산나트륨과 같은 황산염; 글리콜; 푸마르산; 벤조산 나트륨; DL 루이신; 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산마그네슘과 같은 라우릴 황산염: 무수 규산, 규산 수화물과 같은 규산류; 상기 전분 유도체 등), 결합제(예를 들면, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 마크로골, 상기 부형제와 동일한 화합물 등), 붕괴제(예를 들면, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 내부 가교 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 카르복시메틸 녹말, 카르복시메틸 녹말 나트륨, 가교 폴리비닐피롤리돈과 같은 화학 수식된 전분·셀룰로오스류 등), 유화제(예를 들면, 벤토나이트, 비검과 같은 콜로이드성 점토; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 금속 수산화물; 라우릴 황산나트륨, 스테아르산칼슘과 같은 음이온 계면활성제; 염화 벤잘코늄과 같은 양이온 계면활성제; 폴리옥시에틸렌알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르와 같은 비이온 계면활성제 등), 안정제(메틸파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥시벤조산 에스테르류; 클로로부탄올, 벤질 알코올, 페닐에틸 알코올과 같은 알코올류; 염화벤잘코늄; 페놀, 크레졸과 같은 페놀류; 티메로살; 데히드로아세트산; 소르브산 등), 교미교취제(예를 들면, 통상 사용되는 감미료, 산미료, 향료 등), 희석제 등의 첨가제를 이용해 주지의 방법으로 제조된다.
본 발명의 치료약은 0.1∼250 μmoles/㎖의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)를 함유하면 되고, 바람직하게는 1∼50 μmoles/㎖의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드), 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물, 0.02∼10% w/v의 탄수화물 또는 다가 알코올 및 0.01∼0.4% w/v의 약리상 허용되는 계면활성제를 함유하게 해도 된다.
상기 탄수화물로는 단당류 또는 이당류가 특히 바람직하다. 이들 탄수화물 및 다가 알코올의 예로는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 락토오스, 말토오스, 만니톨 및 소르비톨을 들 수 있다. 이들은 단독으로 이용해도, 병용해도 된다.
또, 본 발명에서의 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노∼트리-에스테르, 알킬페닐폴리옥시에틸렌, 나트륨타우로콜레이트, 나트륨콜레이트, 및 다가 알코올 에스테르를 들 수 있다. 이 중 특히 바람직한 것은 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노∼트리-에스테르이고, 여기에 있어서 에스테르로서 특히 바람직한 것은 올레에이트, 라우레이트, 스테아레이트 및 팔미테이트이다. 이들은 단독으로 이용해도, 병용해도 된다.
또, 본 발명의 치료약은 더욱 바람직하게는 0.03∼0.09 M의 약리상 허용되는 중성염, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨 및/또는 염화칼슘을 함유하게 해도 된다.
또, 본 발명의 치료약은 더욱 바람직하게는 0.002∼0.05 M의 약리상 허용되는 완충제를 함유할 수 있다. 바람직한 완충제의 예로는 시트르산나트륨, 나트륨 글리시네이트, 인산나트륨, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 들 수 있다. 이들 완충제는 단독으로 이용해도, 병용해도 된다.
또한, 상기의 치료약은 용액 상태로 공급해도 된다. 그러나, 어느 기간 보존할 필요가 있는 경우 등을 위하여, 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)를 안정화하여 치료 효과의 저하를 방지하는 목적으로 통상은 동결건조해 두는 것이 바람직하고, 그 경우에는 사용 시에 용해액(주사용 증류수 등)으로 재구성(reconstruction)하여, 즉 투여되는 액체 상태로 하여 이용하면 된다. 따라서, 본 발명의 치료약은 각 성분이 소정의 농도 범위가 되도록 용해액으로 재구성해 사용하기 위한 것, 동결건조된 상태의 것도 포함한다. 동결건조물의 용해성을 촉진하는 목적으로, 알부민, 글리신 등의 아미노산을 추가로 함유하게 해도 된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 국제공개 제2015/005253에 기재되어 있는 지질 등을 이용해 봉입하고, 국제공개 제2015/005253 등에 기재되어 있는 핵산 지질 나노 입자 혹은 리포솜으로서 투여해도 된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드), 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 인간에게 투여하는 경우에는, 예를 들면, 성인 1일 당 약 0.01∼100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.1∼20 ㎎/㎏(체중)의 투여량으로, 1회 또는 수회로 나누어 피하 주사, 점적 정맥주사, 또는 정맥주사하면 되지만, 그 투여량이나 투여 횟수는 질환의 종류, 증상, 연령, 투여 방법 등에 따라 적당히 변경할 수 있다.
당원병 Ia형 환자에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드), 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물의 투여는, 예를 들면, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드), 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 통상의 기술자에게 주지의 방법으로 제조하고, 이것을 상법에 의해 멸균 처리하여, 예를 들면 125 ㎎/㎖의 주사용 용액을 조제한다. 이 용액을 환자 정맥 내에 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)의 투여량이 체중 1 ㎏ 당 예를 들면 10 ㎎이 되도록, 예를 들면 수액의 형태로 점적 투여한다. 투여는, 예를 들면 1주간의 간격으로 행하고, 그 후에도 혈당 값, 혈중 락트산 값, CT에 의한 간종대·간글리코겐 값 등에 의해 치료 효과의 확인을 하면서, 적당히 이 치료를 반복한다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해서 구체적으로 설명한다. 아울러, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1∼11)
HO-Ae2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Am1s-Am1s-Ae2s-Am1s-Um1s-Ce2s-Cm1s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Ge2s-Cm1s-Gm1s-Ae2-sAm1s-Ge2T-H (21e_002) (서열번호 1)
핵산 자동 합성기(「ABI 394 DNA/RNA Synthesizer」Applied Biosystems제)를 이용해 포스포로아미다이트법(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))를 이용하여 합성을 행하였다. 시약으로는 액티베이터(activator) 용액-3(0.25 mol/L 5-벤질티오-1H-테트라졸·아세토니트릴 용액, 와코준야쿠코교제, 제품 번호 013-20011), CAP A for AKTA(1-메틸이미다졸·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L040050), Cap B1 for AKTA(무수 아세트산·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L050050), Cap B2 for AKTA(피리딘·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L050150), DCA Deblock(디클로로아세트산·톨루엔 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L023050)를 이용하였다. 포스포로티오에이트 결합을 형성하기 위한 티오화 시약으로서, 0.2 M이 되도록 페닐아세틸디설피드(CARBOSYNTH제, 제품 번호 FP07495)를 아세토니트릴(탈수, 칸토카가쿠제, 제품 번호 01837-05), 피리딘(탈수, 칸토카가쿠제, 제품 번호 11339-05) 1: 1(v/v) 용액을 이용해 용해해 이용하였다. 아미다이트 시약으로는 2'-O-Me 뉴클레오시드의 포스포로아미다이트(아데노신체 제품 번호 ANP-5751, 시티딘체 제품 번호 ANP-5752, 구아노신체 제품 번호 ANP-5753, 우리딘체 제품 번호 ANP-5754)는 ChemGenes제의 것을 이용하였다. 비천연형의 포스포로아미다이트는 일본 특개2000-297097의 실시예 14(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O, 4'-C-에틸렌-6-N-벤조일아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트), 실시예 27(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O, 4'-C-에틸렌-2-N-이소부티릴구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트), 실시예 22(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O, 4'-C-에틸렌-4-N-벤조일-5-메틸시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트), 실시예 9(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O, 4'-C-에틸렌-5-메틸우리딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트)의 화합물을 이용하였다. 고상 담체로서 Glen Unysupport 0.1μmol(GlenResearch제)를 이용해 표기의 화합물을 합성하였다. 프로그램은 핵산 자동 합성기에 부속되어 있는 0.2 μmol 스케일용을 이용하고, 단 아미다이트체의 축합에 필요로 하는 시간은 600초로 하고, 티오화에 필요로 하는 시간은 150초로 하였다.
목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 300 ㎕의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라내는 동시에, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼었다. Clarity QSP(PhenomeneX제)를 이용하여, 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 정제하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 112번째에 상보적인 서열이다.
실시예 2 내지 11의 화합물도 실시예 1과 동일하게 합성하였다. 실시예 1의 데이터, 및 실시예 2 내지 11에 대해 표 1에 기재한다.
[표 1]
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실시예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
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1 21e_002 AgaTaaAauCcgAugGcgAaG 112 92 7544.86　　1
2 21e_003 TaaAauCcgAugGcgAagCuG 109 89 7512.84　　2
3 21e_004 AauCcgAugGcgAagCugAaA 106 86 7520.89　　3
4 21e_005 CcgAugGcgAagCugAaaAgG 103 83 7575.87　　4
5 21e_006 AugGcgAagCugAaaAggAaG 100 80 7610.88　　5
6 21e_007 GcgAagCugAaaAggAagAaG 97 77 7633.90　　6
7 21e_008 AagCugAaaAggAagAagGuA 94 74 7618.89　　7
8 21e_009 CugAaaAggAagAagGuaAuG 91 71 7595.86　　8
9 21e_010 AaaAggAagAagGuaAugAgA 88 68 7628.89　　9
10 21e_011 AggAagAagGuaAugAgaAaA 85 65 7628.88 　10
11 21e_012 AagAagGuaAugAgaAaaTaT 82 62 7578.93 　11
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　표 중의 서열에 있어서 대문자는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산, 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산의 C는 5-메틸시토신이다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부(負)이온 ESI 질량 분석에 의해 동정 하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(실시예 12∼22)
HO-Am1s-Gm1s-Am1s-Um1s-Am1s-Am1s-Am1s-Am1s-Um1s-Cm1s-Cm1s-Gm1s-Am1s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Cm1s-Gm1s-Am1s-AGm1t-H (21m_002) (서열번호 1)
핵산 자동 합성기(BioAutomation제 MerMade 192 X)를 이용하여 실시예 1과 동일하게 합성 및 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 112번째에 상보적인 서열이다.
실시예 13 내지 22의 화합물도 실시예 12와 동일하게 합성하였다. 실시예 12의 데이터, 및 실시예 13 내지 22에 대해 표 2에 기재한다.
[표 2]
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실시예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
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12 21m_002 agauaaaauccgauggcgaag 112 92 7416.86　　1
13 21m_003 uaaaauccgauggcgaagcug 109 89 7369.80　　2
14 21m_004 aauccgauggcgaagcugaaa 106 86 7368.81　　3
15 21m_005 ccgauggcgaagcugaaaagg 103 83 7423.81　　4
16 21m_006 auggcgaagcugaaaaggaag 100 80 7475.89　　5
17 21m_007 gcgaagcugaaaaggaagaag 97 77 7494.86　　6
18 21m_008 aagcugaaaaggaagaaggua 94 74 7483.90　　7
19 21m_009 cugaaaaggaagaagguaaug 91 71 7456.82　　8
20 21m_010 aaaaggaagaagguaaugaga 88 68 7503.86　　9
21 21m_011 aggaagaagguaaugagaaaa 85 65 7527.88　 10
22 21m_012 aagaagguaaugagaaaauau 82 62 7453.87 　11
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　표 중의 서열에 있어서 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(실시예 23∼50)
HO-Ge2s-Am1s-Um1s-Ae2s-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2T-H (21e_015) (서열번호 12)
실시예 12와 동일하게 합성 및 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 91번째에서 111번째에 상보적인 서열이다.
실시예 24 내지 50의 화합물도 실시예 23과 동일하게 합성하였다. 실시예 23의 데이터, 및 실시예 24 내지 50에 대해 표 3에 기재한다.
[표 3]
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실시예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
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23 21e_015 GauAaaAucCgaTggCgaAgC 111 91 7544.88 　12
24 21e_016 AuaAaaTccGauGgcGaaGcT 110 90 7477.80 　13
25 21e_017 AaaAucCgaTggCgaAgcTgA 108 88 7544.87 　14
26 21e_018 AaaTccGauGgcGaaGcuGaA 107 87 7506.86 　15
27 21e_019 AucCgaTggCgaAgcTgaAaA 105 85 7544.86 　16
28 21e_020 TccGauGgcGaaGcuGaaAaG 104 84 7518.81 　17
29 21e_021 CgaTggCgaAgcTgaAaaGgA 102 82 7623.82 　18
30 21e_022 GauGgcGaaGcuGaaAagGaA 101 81 7591.85 　19
31 21e_002m01 Agauaaaauccgauggcgaag 112 92 7432.84　　1
32 21e_002m02 agauaaaauccgauggcgaaG 112 92 7432.84　　1
33 21e_002m03 AgauaaaauccgauggcgaaG 112 92 7440.85　　1
34 21e_002m04 AgauaaaauccgAuggcgaaG 112 92 7452.86　　1
35 21e_002m05 AgauaaaauCcgauggcgaaG 112 92 7466.86　　1
36 21e_002m06 AgaTaaaauccgauggcgAaG 112 92 7482.86　　1
37 21e_002m07 AgauaaaauCcgAuggcgaaG 112 92 7478.83　　1
38 21e_002m08 AgauaaaauCcgaugGcgaaG 112 92 7478.84　　1
39 21e_002m09 AgaTaaAauccgAuggcgaaG 112 92 7490.83　　1
40 21e_002m10 AgauaaAauccgaugGcgAaG 112 92 7476.81　　1
41 21e_002m11 AgauaaAauccgAugGcgaaG 112 92 7481.84　　1
42 21e_002m12 AgauaaAauCcgaugGcgaaG 112 92 7490.85　　1
43 21e_002m13 AgaTaaAauccgAuggcgAaG 112 92 7502.82　　1
44 21e_002m14 AgaTaaaauCcgAuggcgAaG 112 92 7516.85　　1
45 21e_002m15 AgauaaAauCcgAugGcgaaG 112 92 7502.82　　1
46 21e_002m16 AgaTaaAauCcgAuggcgAaG 112 92 7533.87　　1
47 21e_002m17 AgaTaaaauCcgAugGcgAaG 112 92 7528.84　　1
48 21e_002m18 AgaTaAaaTcCgaTgGcgAaG 112 92 7584.91　　1
49 21e_002m19 AgAuaAaAuCcGaTgGcgAaG 112 92 7564.84　　1
50 21e_002m20 AgAuAaAaTcCgAuGgCgAaG 112 92 7594.88　　1
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　표 중의 서열에 있어서 대문자는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산, 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산의 C는 5-메틸시토신이다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(실시예 51∼69)
HO-Um1s-Ae2s-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (18e_005) (서열번호 20)
실시예 12와 동일하게 합성을 행하였다. 목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 450 ㎕의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라내는 동시에, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼었다. 올리고머의 혼합 용액을 Clarity QSP DNA 로딩 버퍼(Loading Buffer) (PhenomeneX제) 300 ㎕를 혼합하고, Clarity SPE 96 웰 플레이트(PhenomeneX제) 상에 충진하였다. Clarity QSP DNA 로딩 버퍼: 물 = 1:1 용액 1 ㎖, 물 3 ㎖, 3% 디클로로아세트산(DCA) 수용액 3 ㎖, 물 6 ㎖의 순서로 첨가한 후, 20 mM Tris 수용액: 아세토니트릴 = 9:1 용액에서 추출되는 성분을 모았다. 용매 유거(留去) 후, 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 91번째에서 109번째에 상보적인 서열이다.
실시예 52 내지 69의 화합물도 실시예 51과 동일하게 합성하였다. 실시예 51의 데이터, 및 실시예 52 내지 69에 대해 표 4에 기재한다.
[표 4]
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실시예 서열 명칭 서열(5'-3') 개 시 종료 분자량 서열번호
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51 18e_005 uAaaAucCgaTggCgaAg 109 92 6437.79 　20
52 18e_006 aAaaTccGauGgcGaaGc 108 91 6408.78 　21
53 18e_007 aAauCcgAugGcgAagCu 107 90 6399.76 　22
54 18e_008 aAucCgaTggCgaAgcTg 106 89 6443.80 　23
55 18e_009 aTccGauGgcGaaGcuGa 105 88 6401.74 　24
56 18e_010 uCcgAugGcgAagCugAa 104 87 6415.75 　25
57 18e_011 cCgaTggCgaAgcTgaAa 103 86 6466.81 　26
58 18e_012 cGauGgcGaaGcuGaaAa 102 85 6434.76 　27
59 18e_013 gAugGcgAagCugAaaAg 101 84 6488.79 　28
60 18e_014 aTggCgaAgcTgaAaaGg 100 83 6516.82 　29
61 18e_015 uGgcGaaGcuGaaAagGa 99 82 6474.78 　30
62 18e_016 gGcgAagCugAaaAggAa 98 81 6511.81 　31
63 18e_017 gCgaAgcTgaAaaGgaAg 97 80 6525.84 　32
64 18e_022 TaaaauCCgaTggCgaag 109 92 6453.82 　20
65 18e_023 aaaauCCgaTggCgaagC 108 91 6452.84 　21
66 18e_024 aaauCCgaTggCgaagCT 107 90 6455.83 　22
67 18e_025 aauCCgaTggCgaagCTg 106 89 6471.82 　23
68 18e_026 auCCgaTggCgaagCTga 105 88 6471.83 　24
69 18e_031 TaAaaTccgauGgcGaag 109 92 6411.77 　20
---------------------------------------------------------------------
　표 중의 서열에 있어서 대문자는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산, 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산의 C는 5-메틸시토신이다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(실시예 70∼82)
HO-Um1s-Am1s-Am1s-Am1s-Am1s-Um1s-Cm1s-Cm1s-Gm1s-Am1s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Cm1s-Gm1s-Am1s-Am1s-Gm1t-H (18m_005) (서열번호 20)
핵산 자동 합성기(BioAutomation제 MerMade 192 X)를 이용하여 실시예 12와 동일하게 합성 및 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 109번째에 상보적인 서열이다.
실시예 71 내지 82의 화합물도 실시예 70과 동일하게 합성하였다. 실시예 70의 데이터, 및 실시예 71 내지 82에 대해 표 5에 기재한다.
[표 5]
---------------------------------------------------------------------
실시예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
---------------------------------------------------------------------
70 18m_005 uaaaauccgauggcgaag 109 92 6323.74 　20
71 18m_006 aaaauccgauggcgaagc 108 91 6322.76 　21
72 18m_007 aaauccgauggcgaagcu 107 90 6299.74 　22
73 18m_008 aauccgauggcgaagcug 106 89 6315.73 　23
74 18m_009 auccgauggcgaagcuga 105 88 6315.73 　24
75 18m_010 uccgauggcgaagcugaa 104 87 6315.73 　25
76 18m_011 ccgauggcgaagcugaaa 103 86 6338.75 　26
77 18m_012 cgauggcgaagcugaaaa 102 85 6362.76 　27
78 18m_013 gauggcgaagcugaaaag 101 84 6402.77 　28
79 18m_014 auggcgaagcugaaaagg 100 83 6402.77 　29
80 18m_015 uggcgaagcugaaaagga 99 82 6402.77 　30
81 18m_016 ggcgaagcugaaaaggaa 98 81 6425.79 　31
82 18m_017 gcgaagcugaaaaggaag 97 80 6425.80 　32
---------------------------------------------------------------------
표 중의 서열에 있어서 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(참고예 1)
HO-Ae2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Am1s-Am1s-Ae2s-Am1s-Um1s-Ce2s-Cm1s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Ge2s-Cm1s-Gm1s-Ae2-sAm1s-Ge2T-H (21e_001) (서열번호 33)
실시예 1과 동일하게 합성, 정제하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 95번째에서 115번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7520.85).
(참고예 2∼3)
HO-Ge2s-Cm1s-Am1s-Ge2s-Am1s-Um1s-Ae2s-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2T-H (21e_013) (서열번호 34)
실시예 12와 동일하게 합성 및 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 94번째에서 114번째에 상보적인 서열이다.
참고예 3의 화합물도 참고예 2와 동일하게 합성하였다. 참고예 2의 데이터, 및 참고예 3에 대해 표 6에 기재한다.
[표 6]
---------------------------------------------------------------------
참고예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
---------------------------------------------------------------------
2 21e_013 GcaGauAaaAucCgaTggCgA 114 94 7530.86 　34
3 21e_014 CagAuaAaaTccGauGgcGaA 113 93 7505.88 　35
---------------------------------------------------------------------
표 중의 서열에 있어서 대문자는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산, 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산의 C는 5-메틸시토신이다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(참고예 4∼15)
HO-Cm1s-Ae2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Am1s-Am1s-Ae2s-Am1s-Um1s-Ce2s-Cm1s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Ge2s-Cm1t-H (18e_001) (서열번호 36)
실시예 51과 동일하게 합성 및 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 96번째에서 113번째에 상보적인 서열이다.
참고예 5 내지 15의 화합물도 참고예 4와 동일하게 합성하였다. 참고예 4의 데이터, 및 참고예 5 내지 15에 대해 표 7에 기재한다.
[표 7]
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참고예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
---------------------------------------------------------------------
4 18e_001 cAgaTaaAauCcgAugGc 113 96 6383.77 　36
5 18e_002 aGauAaaAucCgaTggCg 112 95 6437.79 　37
6 18e_003 gAuaAaaTccGauGgcGa 111 94 6409.76 　38
7 18e_004 aTaaAauCcgAugGcgAa 110 93 6407.78 　39
8 18e_018 CagaTaaaauCCgaTggC 113 96 6439.82 　36
9 18e_019 agaTaaaauCCgaTggCg 112 95 6453.82 　37
10 18e_020 gaTaaaauCCgaTggCga 111 94 6453.82 　38
11 18e_021 aTaaaauCCgaTggCgaa 110 93 6437.83 　39
12 18e_027 CaGauAaaaucCgaTggc 113 96 6385.78 　36
13 18e_028 AgAuaAaauccGauGgcg 112 95 6383.74 　37
14 18e_029 GaTaaAauccgAugGcga 111 94 6397.76 　38
15 18e_030 AuAaaAuccgaTggCgaa 110 93 6395.78 　39
---------------------------------------------------------------------
표 중의 서열에 있어서 대문자는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산, 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산의 C는 5-메틸시토신이다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(참고예 16∼20)
HO-Cm1s-Am1s-Gm1s-Am1s-Um1s-Am1s-Am1s-Am1s-Am1s-Um1s-Cm1s-Cm1s-Gm1s-Am1s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Cm1t-H (18m_001) (서열번호 36)
실시예 70과 동일하게 합성 및 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 96번째에서 113번째에 상보적인 서열이다.
참고예 17 내지 20의 화합물도 참고예 16과 같게 합성하였다. 참고예 16의 데이터, 및 참고예 17 내지 20에 대해 표 8에 기재한다.
[표 8]
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참고예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
---------------------------------------------------------------------
16 18m_001 cagauaaaauccgauggc 113 96 6283.74　36
17 18m_002 agauaaaauccgauggcg 112 95 6323.74　37
18 18m_003 gauaaaauccgauggcga 111 94 6323.75　38
19 18m_004 auaaaauccgauggcgaa 110 93 6307.75　39
20 21m_001 agcagauaaaauccgauggcg 115 95 7396.88　33
---------------------------------------------------------------------
표 중의 서열에 있어서 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(실시예 83∼86)
HO-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (15e_001) (서열번호 40)
AKTA Oligopilot를 이용하고, 고상 담체로서 Primer Support 5G Unylinker 350, 100 μmol(GE Healthcare제)을 이용하여, 실시예 1과 동일하게 합성을 행하였다. 목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 25 ㎖의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라내는 동시에, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼었다. 올리고머의 혼합 용액을 phenomeneX Clarity QSP 5 g를 이용하여 탈보호, 정제를 행하고, 용매 유거 후, 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다.
실시예 84 내지 86의 화합물도 실시예 83과 동일하게 합성하였다. 실시예 83의 데이터, 및 실시예 84 내지 86에 대해 표 9에 기재한다.
[표 9]
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실시예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
---------------------------------------------------------------------
83 15e_001 aAucCgaTggCgaAg 106 92 5371.68 　40
84 15e_002 cCgaTggCgaAgcTg 103 89 5377.68 　41
85 15ed_001 aAtcCgaTggCgaAg 106 92 5099.59 　40
86 15ed_002 cCgaTggCgaAgcTg 103 89 5105.60 　41
---------------------------------------------------------------------
표 중의 서열에 있어서 대문자는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산, 소문자는 2'-OMe-RNA, 소문자에 밑줄친 것은 DNA를 나타낸다. 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산의 C는 5-메틸시토신이다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(실시예 87∼90)
HO-Am1s-Ae2s-Um1s-Ce2s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (15e_001.1) (서열번호 40)
실시예 1과 동일하게 합성을 행하였다. 단, 고상 담체로서 Primer Support 5G Unylinker 350, 10 μmol(GE Healthcare제)를 이용하고, 10 μmol의 프로그램을 이용하였다. 실시예 83과 동일하게 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다.
실시예 88 내지 90의 화합물도 실시예 87과 동일하게 합성하였다. 실시예 87의 데이터, 및 실시예 88 내지 90에 대해 표 10에 기재한다.
[표 10]
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실시예 서열 명칭 서열(5'-3') 개시 종료 분자량 서열번호
---------------------------------------------------------------------
87 15e_001.1 aAuCCgATggCgaAg 106 92 5409.71 　40
88 15e_001.2 aAucCgATggCgAAg 106 92 5395.69 　40
89 15e_001.3 aAuCCgaTggCgAAg 106 92 5409.71 　40
90 15e_001.4 aAuCCgATggCgAAg 106 92 5421.70 　40
---------------------------------------------------------------------
표 중의 서열에 있어서 대문자는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산, 소문자는 2'-OMe-RNA를 나타낸다. 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산의 C는 5-메틸시토신이다. 개시 및 종료에 대해서는 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터의 번호를 나타낸다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하고, 표 중에 실측 값을 나타낸다.
(실시예 91)
HO-X-X-X-Ap-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 42)
실시예 1과 동일하게 합성을 행하였다. 단, 고상 담체로서 Primer Support 5G Unylinker 350, 10 μmol(GE Healthcare제)를 이용하고, 10μmol의 프로그램을 이용하였다. X 부분은 문헌(Bioorg. Med. Chem. (2016) 24, 26-32) 기재의 GalNAc phosphoramidite unit 1을 이용해 3회 축합하였다. 실시예 83과 동일하게 정제를 행하여 목적 화합물을 얻었다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 107번째에 상보적인 서열을 갖고 있다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7131.24).
(실시예 92)
HO-X-X-X-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6818.18).
(실시예 93)
HO-X-X-X-Tp-Cp-Ap-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 43)
실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 107번째에 상보적인 서열을 갖고 있다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7738.35).
(실시예 94)
HO-X-X-X-Ap-Am1s-Ae2s-Um1s-Ce2s-Cm1s-Ge2s-Am1s-Te2s-Gm1s-Ge2s-Cm1s-Ge2s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 42)
실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 107번째에 상보적인 서열을 갖고 있다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7141.22).
(실시예 95)
HO-X-X-X-Ap-Ae2s-Am1s-Te2s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Ge2s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Am1s-Ge2T-H (서열번호 42)
실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 107번째에 상보적인 서열을 갖고 있다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7167.24).
(참고예 21)
(21A)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-(벤질옥시카르보닐아미노)펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 21A)의 합성
Figure pat00078
문헌 기지(旣知) 화합물인 N-벤질옥시카르보닐-1-히드록시펜틸-5-아민(J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 4058-4073) (8.05 g, 33.9 mmol)과 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(WO2011053614) (12.0 g, 30.8 mmol)의 디클로로메탄(200 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(450 ㎕, 5.23 mmol)을 가하고 45℃에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 유거해 농축하고, 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수/인산 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조(粗)생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여, 비결정질 상(狀)의 목적물 21A(17.0 g, 수율 94%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.37-7.32 (5H, m), 5.69 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.35 (1H, d, J = 2.4 Hz), 5.29 (1H, d, J = 11.5 Hz), 5.10 (2H, s), 4.94 (1H, br), 4.68 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.20-4.09 (2H, m), 3.97-3.86 (3H, m), 3.49-3.44 (1H, m), 3.20-3.17 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.93 (3H, s), 1.66-1.34 (6H, m).
Calcd for C27H38N2O11: [M+H]+ 567, Found 567.
(21B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-(5-아미노펜톡시)테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 21B)의 합성
Figure pat00079
공정(21A)에서 합성한 화합물 21A(17.0 g, 30.0 mmol)를 에탄올(200 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 목적물 21B(12.64 g, 수율 97%)의 조생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.78 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.36-5.32 (2H, m), 4.72 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.21-4.09 (2H, m), 3.96-3.88 (3H, m), 3.52-3.47 (1H, m), 2.70 (2H, t, J = 6.7 Hz), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.75-1.36 (6H, m).
Calcd for C19H32N2O9: [M+H]+ 433, Found 433.
(21C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(4S)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메톡시카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 21C)의 합성
Figure pat00080
(R)-(-)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올(1.68 g, 12.8 mmol), 트리에틸아민(3.22 ㎖, 23.1 mmol)를 디클로로메탄(100 ㎖)에 용해시켰다. 4-니트로페닐클로로포르메이트(2.56 g, 12.7 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 이어서, 트리에틸아민(5 ㎖, 36 mmol), 공정(21B)에서 합성한 화합물 21B(5.0 g, 11.56 mmol)의 디클로로메탄 용액(20 ㎖)을 가하고, 45℃에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 21C(3.46 g, 수율 51%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.75 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.36 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.30 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.97 (1H, br), 4.71 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.33-4.29 (1H, m), 4.23-3.88 (8H, m), 3.74-3.72 (1H, m), 3.49-3.46 (1H, m), 3.19-3.14 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.63-1.53 (6H, m), 1.44 (3H, s), 1.37 (3H, s).
Calcd for C26H42N2O13: [M+H]+ 591, Found 591.
(21D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(2S)-2,3-디히드록시프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 21D)의 합성
Figure pat00081
공정(21C)에서 합성한 화합물 21C(4.38 g, 7.42 mmol)에 순수(純水)(2 ㎖), 트리플루오로아세트산(6 ㎖)을 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 추가로, 톨루엔 공비함으로써 물을 제거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 21D(2.47 g, 수율 61%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.75 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.22 (1H, dd, J = 11.5, 3.0 Hz), 5.13 (1H, br s), 4.61 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.23-3.87 (7H, m), 3.67-3.60 (3H, m), 3.49-3.46 (1H, m), 3.22-3.16 (2H, m), 2.16 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.97 (3H, s), 1.61-1.50 (6H, m).
Calcd for C23H38N2O13: [M+H]+ 551, Found 551.
(21E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 21E)의 합성
Figure pat00082
공정(21D)에서 합성한 화합물 21D(2.47 g, 4.52 mmol)를 피리딘(15 ㎖)에 용해하였다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(1.82 g, 5.38 mmol)를 가하고, 실온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v, 그 후 아세트산에틸:메탄올 = 95:5, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 21E(1.84 g, 수율 48%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.43-7.42 (2H, m), 7.32-7.29 (6H, m), 7.24-7.19 (1H, m), 6.84-6.81 (4H, m), 5.74 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.26 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.94 (1H, br), 4.65 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.22-4.09 (4H, m), 3.97-3.91 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.47-3.43 (1H, m), 3.18-3.15 (4H, m), 3.00 (1H, d, J = 4.8 Hz), 2.14 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.99 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.65-1.34 (6H, m).
Calcd for C44H56N2O15: [M+Na]+ 875, Found 875.
(21F)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 21F)의 합성
Figure pat00083
공정(21E)에서 합성한 화합물 21E(1.84 g, 2.16 mmol)를 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하 공비한 후에 디클로로메탄(21 ㎖)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(2.25 ㎖, 12.9 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.96 ㎖, 4.31 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 21F(1.87 g, 수율 82%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46-7.40 (2H, m), 7.35-7.17 (7H, m), 6.82-6.80 (4H, m), 5.73-5.63 (1H, m), 5.37-5.35 (1H, m), 5.30-5.26 (1H, m), 4.97-4.94 (0.5H, m), 4.72-4.68 (1H, m), 4.42-4.40 (0.5H, m), 4.22-4.10 (4H, m), 3.99-3.43 (14H, m), 3.18-3.12 (4H, m), 2.67-2.62 (1H, m), 2.46-2.44 (1H, m), 2.14 (3H, s), 2.01-1.96 (9H, m), 1.65-0.97 (18H, m).
(실시예 96)
HO-X1-X1-X1-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X1로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X1 부분은 참고예 21에서 합성한 화합물 21F를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6830.15).
(참고예 22)
(22A)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(4R)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메톡시카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 22A)의 합성
Figure pat00084
(S)-(+)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올(1.68 g, 2.54 mmol), 트리에틸아민(3.22 ㎖, 23.1 mmol)을 디클로로메탄(100 ㎖)에 용해시켰다. 4-니트로페닐클로로포르메이트(2.56 g, 12.72 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 이어서, 트리에틸아민(5 ㎖, 36 mmol), 공정(21B)에서 합성한 화합물 21B(5.2 g, 13 mmol)를 가하고, 45℃에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 22A(3.82 g, 수율 54%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.71 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.36 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.31 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.97 (1H, br), 4.71 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.33-4.30 (1H, m), 4.22-3.99 (5H, m), 3.95-3.89 (3H, m), 3.74-3.71 (1H, m), 3.50-3.46 (1H, m), 3.19-3.14 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.69-1.47 (6H, m), 1.44 (3H, s), 1.37 (3H, s).
Calcd for C26H42N2O13: [M+H]+ 591, Found 591.
(22B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 22B)의 합성
Figure pat00085
공정(22A)에서 합성한 화합물 22A(3.82 g, 6.47 mmol)에 순수(2 ㎖), 트리플루오로아세트산(6 ㎖)을 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 추가로, 톨루엔 공비함으로써 물을 제거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 22B(2.49 g, 수율 70%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.98 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.37-5.20 (3H, m), 4.63 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.21-3.88 (7H, m), 3.69-3.57 (3H, m), 3.51-3.44 (1H, m), 3.21-3.14 (2H, m), 2.16 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.97 (3H, s), 1.66-1.34 (6H, m).
Calcd for C23H38N2O13: [M+H]+ 551, Found 551.
(22C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 22C)의 합성
Figure pat00086
공정(22B)에서 합성한 화합물 22B(2.49 g, 4.52 mmol)를 피리딘(15 ㎖)에 용해하였다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(1.84 g, 5.43 mmol)를 가하고, 실온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v, 그 후 아세트산에틸:메탄올 = 95:5, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 22C(2.1 g, 수율 54%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.32-7.16 (6H, m), 6.83 (4H, d, J = 9.1 Hz), 5.74 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.93 (1H, br), 4.66 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.25-4.11 (4H, m), 4.01-3.89 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.50-3.43 (1H, m), 3.21-3.13 (4H, m), 2.98 (1H, br), 2.13 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.99 (3H, s), 1.94 (3H, s), 1.65-1.34 (6H, m).
Calcd for C44H56N2O15: [M+Na]+ 875, Found 875.
(22D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 22D)의 합성
Figure pat00087
공정(22C)에서 합성한 화합물 22C(2.10 g, 2.50 mmol)를 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하 공비한 후에 디클로로메탄(20 ㎖)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(2.6 ㎖, 15 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(1.L1 ㎖, 4.9 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 22D(1.63 g, 수율 63%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46-7.40 (2H, m), 7.35-7.17 (7H, m), 6.85-6.78 (4H, m), 5.70-5.57 (1H, m), 5.38-5.34 (1H, m), 5.32-5.24 (1H, m), 4.96-4.91 (0.5H, m), 4.73-4.65 (1H, m), 4.44-4.38 (0.5H, m), 4.23-4.08 (4H, m), 4.00-3.41 (14H, m), 3.27-3.03 (4H, m), 2.68-2.60 (1H, m), 2.49-2.42 (1H, m), 2.14 (3H, s), 2.07-1.91 (9H, m), 1.65-0.97 (18H, m).
(실시예 97)
HO-X2-X2-X2-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X2로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X2 부분은 참고예 22에서 합성한 화합물 22D를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6830.14).
(참고예 23)
(23A)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[8-(벤질옥시카르보닐아미노)옥톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 23A)의 합성
Figure pat00088
문헌 기지 화합물인 벤질 N-(8-히드록시옥틸)카르바메이트(J. Med. Chem, 1993, 36, 3721-3726) (6.5 g, 23 mmol)와 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리옥시테트라히드로피란-2-일]메틸(WO2011053614) (8.2 g, 21 mmol)의 디클로로메탄(150 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(310 ㎕, 3.6 mmol)을 가하고, 45℃에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 유거해 농축하고, 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수/인산 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 23A(12.68 g, 수율 99%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.29 (5H, m), 5.65 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.29 (1H, dd, J = 11.5, 3.0 Hz), 5.10 (2H, s), 4.83 (1H, br), 4.68 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.20-4.09 (2H, m), 3.99-3.85 (3H, m), 3.50-3.42 (1H, m), 3.22-3.15 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.62-1.27 (12H, m).
Calcd for C30H44N2O11: [M+H]+ 609, Found 609.
(23B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-(8-아미노옥톡시)테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 23B)의 합성
Figure pat00089
공정(23A)에서 합성한 화합물 23A(12.68 g, 20.83 mmol)를 에탄올(200 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 목적물 23B(10.1 g)의 조생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C22H38N2O9: [M+H]+ 475, Found 475.
(23C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[8-[[(4S)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메톡시카르보닐아미노]옥톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 23C)의 합성
Figure pat00090
(R)-(-)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올(1.6 g, 12 mmol), 트리에틸아민(3.1 ㎖, 22 mmol)를 디클로로에탄(30 ㎖)에 용해시켰다. 4-니트로페닐클로로포르메이트(2.2 g, 12 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 이어서, 트리에틸아민(4.5 ㎖, 32 mmol), 공정(23B)에서 합성한 화합물 23B(5.1 g, 11 mmol)를 가하고, 45℃에서 4시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 23C(2.45 g, 수율 36%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.64 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.36 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.29 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.85 (1H, br), 4.69 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.35-3.86 (9H, m), 3.76-3.70 (1H, m), 3.50-3.43 (1H, m), 3.20-3.12 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.65-1.28 (12H, m), 1.44 (3H, s), 1.37 (3H, s).
Calcd for C29H48N2O13: [M+H]+ 633, Found 633.
(23D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[8-[[(2S)-2,3-디히드록시프로폭시]카르보닐아미노]옥톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 23D)의 합성
Figure pat00091
공정(23C)에서 합성한 화합물 23C(2.45 g, 3.87 mmol)에 순수(2 ㎖), 트리플루오로아세트산(6 ㎖)을 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 추가로, 톨루엔 공비함으로써 물을 제거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 23D(1.18 g, 수율 51%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.87 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 5.07 (1H, br), 4.66 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.27-3.86 (7H, m), 3.70-3.57 (2H, m), 3.50-3.43 (2H, m), 3.24-3.13 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.67-1.24 (12H, m).
Calcd for C26H44N2O13: [M+H]+ 593, Found 593.
(23E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[8-[[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]옥톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 23E)의 합성
Figure pat00092
공정(23D)에서 합성한 화합물 23D(1.18 g, 1.99 mmol)를 피리딘(20 ㎖)에 용해하였다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(0.81 g, 2.39 mmol)를 가하고, 실온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v, 그 후 아세트산에틸:메탄올 = 95:5, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 23E(0.6 g, 수율 34%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.44-7.40 (2H, m), 7.33-7.19 (7H, m), 6.85-6.81 (4H, m), 5.61 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.29 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.79 (1H, br), 4.69 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.24-4.09 (4H, m), 4.00-3.86 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.50-3.43 (1H, m), 3.21-3.12 (4H, m), 2.14 (3H, s), 2.04 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.63-1.26 (12H, m).
Calcd for C47H62N2O15: [M+Na]+ 917, Found 917.
(23F)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[8-[[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]옥톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 23F)의 합성
Figure pat00093
공정(23E)에서 합성한 화합물 23E(0.60 g, 0.67 mmol)를 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하 공비한 후에 디클로로에탄(5 ㎖)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(0.70 ㎖, 4.0 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.30 ㎖, 1.3 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 23F(0.51 g, 수율 69%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46-7.40 (2H, m), 7.34-7.17 (7H, m), 6.84-6.78 (4H, m), 5.56-5.48 (1H, m), 5.37-5.34 (1H, m), 5.32-5.28 (1H, m), 4.87-4.80 (0.5H, m), 4.73-4.68 (1H, m), 4.43-4.37 (0.5H, m), 4.23-4.08 (4H, m), 3.97-3.43 (14H, m), 3.26-3.06 (4H, m), 2.66-2.61 (1H, m), 2.47-2.41 (1H, m), 2.14 (3H, s), 2.06-1.93 (9H, m), 1.64-1.23 (12H, m), 1.21-0.98 (12H, m).
(실시예 98)
HO-X3-X3-X3-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X3으로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X3 부분은 참고예 23에서 합성한 화합물 23F를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6957.27).
(참고예 24)
(24A)
7-[(2S)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]헵탄-1-올(화합물 24A)의 합성
Figure pat00094
벤질 (S)-(+)-글리시딜 에테르(5.0 g, 30 mmol)를 디클로로메탄(150 ㎖)에 용해하였다. 1,7-헵탄디올(6.0 g, 45 mmol), 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.76 ㎖, 6.1 mmol)를 가하고, 실온으로 2일간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50, v/v)로 정제하여 무색 유상(油狀)의 목적물 24A(3.3 g, 수율 37%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.28 (5H, m), 4.57 (2H, s), 4.02-3.96 (1H, m), 3.67-3.61 (2H, m), 3.59-3.43 (6H, m), 2.48 (1H, d, J = 4.2 Hz), 1.61-1.52 (4H, m), 1.37-1.30 (6H, m).
Calcd for C17H28O4: [M+Na]+ 319, Found 319.
(24B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2S)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 24B-1)의 합성
Figure pat00095
및, 아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[7-[(2S)-2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-3-벤질옥시프로폭시]헵톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 24B-2)의 합성
Figure pat00096
공정(24A)에서 합성한 화합물 15A(3.3 g, 11 mmol)와 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(WO2011053614) (4.0 g, 10 mmol)의 디클로로메탄(200 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(0.15 ㎖, 1.7 mmol)을 가하고, 45℃에서 3일간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 유거해 농축하고, 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하여, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수/인산 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 24B-1(4.5 g, 수율 70%) 및 24B-2(1.9 g, 수율 20%)를 얻었다.
(화합물 24B-1)
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.28 (5H, m), 5.51 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.37-5.29 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.56 (2H, s), 4.20-4.09 (2H, m), 4.03-3.85 (4H, m), 3.58-3.41 (7H, m), 2.58 (1H, d, J = 4.2 Hz), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.63-1.52 (4H, m), 1.36-1.29 (6H, m).
Calcd for C31H47NO12: [M+H]+ 626, Found 626.
(화합물 24B-2)
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41-7.28 (5H, m), 5.65 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.48 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.42-5.23 (4H, m), 4.84 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.72 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.59-4.49 (2H, m), 4.20-3.38 (17H, m), 2.19-1.92 (24H, m), 1.61-1.47 (4H, m), 1.38-1.26 (6H, m).
Calcd for C45H66N2O20: [M+H]+ 955, Found 955.
(24C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 24C)의 합성
Figure pat00097
공정(24B)에서 합성한 화합물 24B-1(4.5 g, 7.2 mmol)를 에탄올(100 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 5시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비 후, 적량의 피리딘을 가해 공비하여 목적물 24C의 조생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.55 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.37-5.27 (2H, m), 4.69 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.21-4.09 (2H, m), 3.99-3.42 (11H, m), 2.69 (1H, d, J = 5.4 Hz), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.65-1.52 (4H, m), 1.40-1.29 (6H, m).
Calcd for C24H41NO12: [M+H]+ 536, Found 536.
(24D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 24D)의 합성
Figure pat00098
공정(24C)에서 합성한 화합물 24C의 조생성물을 피리딘(30 ㎖)에 용해하였다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(2.7 g, 7.9 mmol)를 가하고, 실온에서 13시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 50:50-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 24D(3.0 g, 수율 2 steps 49%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.45-7.41 (2H, m), 7.34-7.20 (7H, m), 6.85-6.80 (4H, m), 5.50 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.37-5.29 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.20-4.09 (2H, m), 3.98-3.85 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.55-3.40 (5H, m), 3.22-3.13 (2H, m), 2.51 (1H, d, J = 4.2 Hz), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.93 (3H, s), 1.60-1.52 (4H, m), 1.35-1.27 (6H, m).
Calcd for C45H59NO14: [M+Na]+ 860, Found 860.
(24E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에틸(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 24E)의 합성
Figure pat00099
공정(24D)에서 합성한 화합물 24D(3.0 g, 3.6 mmol)를 적량의 피리딘으로 공비한 후에 디클로로메탄(50 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(2.5 ㎖, 14 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.88 ㎖, 3.9 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 24E(3.0 g, 수율 82%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.48-7.41 (2H, m), 7.36-7.15 (7H, m), 6.85-6.77 (4H, m), 5.59-5.41 (1H, m), 5.38-5.26 (2H, m), 4.75-4.68 (1H, m), 4.20-4.07 (2H, m), 3.97-3.06 (21H, m), 2.67-2.40 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.04 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.92 (3H, s), 1.64-1.46 (4H, m), 1.37-1.22 (6H, m), 1.22-0.97 (12H, m).
(실시예 99)
HO-X4-X4-X4-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X4로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X4 부분은 참고예 24에서 합성한 화합물 24E를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6785.22)
(참고예 25)
(25A)
7-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]헵탄-1-올(화합물 25A)의 합성
Figure pat00100
벤질 (R)-(-)-글리시딜 에테르(5.0 g, 30 mmol)를 디클로로메탄(150 ㎖)에 용해하였다. 1,7-헵탄디올(6.0 g, 45 mmol), 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.76 ㎖, 6.1 mmol)를 가하고, 실온으로 2일간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50, v/v)로 정제하여 무색 유상의 목적물 25A(4.0 g, 수율 44%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.27 (5H, m), 4.56 (2H, s), 4.04-3.94 (1H, m), 3.67-3.59 (2H, m), 3.58-3.40 (6H, m), 2.51 (1H, d, J = 4.2 Hz), 1.63-1.49 (4H, m), 1.41-1.30 (6H, m).
Calcd for C17H28O4: [M+Na]+ 319, Found 319.
(25B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 25B-1)의 합성
Figure pat00101
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[7-[(2R)-2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-3-벤질옥시프로폭시]헵톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 25B-2)의 합성
Figure pat00102
공정(25A)에서 합성한 화합물 25A(4.0 g, 14 mmol)와 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸 (WO2011053614) (4.8 g, 12 mmol)의 디클로로메탄(200 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(0.18 ㎖, 2.1 mmol)을 가하고, 45℃에서 3일간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 유거해 농축하고, 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하여 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수/인산 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 25B-1(4.8 g, 수율 62%) 및 25B-2(1.9 g, 수율 16%)를 얻었다.
(화합물 25B-1)
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.27 (5H, m), 5.50 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.37-5.28 (2H, m), 4.70 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.57 (2H, s), 4.20-4.08 (2H, m), 4.03-3.85 (4H, m), 3.58-3.42 (7H, m), 2.58 (1H, d, J = 4.2 Hz), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.64-1.50 (4H, m), 1.38-1.29 (6H, m).
Calcd for C31H47NO12: [M+H]+ 626, Found 626.
(화합물 25B-2)
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.28 (5H, m), 5.85-5.21 (6H, m), 4.90-4.73 (2H, m), 4.53 (2H, s), 4.22-3.38 (17H, m), 2.20-1.91 (24H, m), 1.63-1.51 (4H, m), 1.41-1.30 (6H, m).
Calcd for C45H66N2O20: [M+H]+ 955, Found 955.
(25C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2S)-2,3-디히드록시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 25C)의 합성
Figure pat00103
공정(25B)에서 합성한 화합물 25B-1(4.8 g, 7.7 mmol)를 에탄올(100 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 5시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비 후, 적량의 피리딘을 가해 공비하여 목적물 25C의 조생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.62 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.38-5.26 (2H, m), 4.69 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.21-4.09 (2H, m), 4.00-3.43 (11H, m), 2.74 (1H, br s), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.68-1.50 (4H, m), 1.41-1.29 (6H, m).
Calcd for C24H41NO12: [M+H]+ 536, Found 536.
(25D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 25D)의 합성
Figure pat00104
공정(25C)에서 합성한 화합물 25C의 조생성물을 피리딘(30 ㎖)에 용해하였다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(2.7 g, 8.0 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 25D(4.5 g, 수율 2 steps 70%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46-7.40 (2H, m), 7.34-7.18 (7H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 5.50 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.37-5.28 (2H, m), 4.70 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.20-4.08 (2H, m), 3.98-3.84 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.55-3.39 (5H, m), 3.21-3.14 (2H, m),2.51 (1H, d, J = 4.2 Hz), 2.14 (3H, s), 2.04 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.94 (3H, s), 1.65-1.47 (4H, m), 1.36-1.27 (6H, m).
Calcd for C45H59NO14: [M+Na]+ 860, Found 860.
(25E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[7-[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에틸(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]헵톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 25E)의 합성
Figure pat00105
공정(25D)에서 합성한 화합물 25D(4.5 g, 5.4 mmol)를 적량의 피리딘으로 공비한 후에 디클로로메탄(50 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(3.7 ㎖, 21 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(1.3 ㎖, 5.9 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 25E(4.5 g, 수율 81%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.48-7.40 (2H, m), 7.36-7.16 (7H, m), 6.84-6.77 (4H, m), 5.58-5.42 (1H, m), 5.37-5.27 (2H, m), 4.74-4.68 (1H, m), 4.20-4.07 (2H, m), 3.97-3.06 (21H, m), 2.67-2.39 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.92 (3H, s), 1.63-1.45 (4H, m), 1.36-1.23 (6H, m), 1.21-0.98 (12H, m).
(실시예 100)
HO-X5-X5-X5-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X5로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X5 부분은 참고예 16에서 합성한 화합물 25E를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6785.21).
(참고예 26)
(26A)
13-[(2S)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]트리데칸-1-올(화합물 26A)의 합성
Figure pat00106
벤질 (S)-(+)-글리시딜 에테르(4.0 g, 24 mmol)를 디클로로메탄(150 ㎖)에 용해하였다. 트리데칸-1,13-디올(7.6 g, 35 mmol), 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.61 ㎖, 4.9 mmol)를 가하고, 실온으로 2일간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50, v/v)로 정제하여 무색 유상의 목적물 26A(3.8 g, 수율 41%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.27 (5H, m), 4.56 (2H, s), 4.02-3.94 (1H, m), 3.69-3.39 (8H, m), 2.49 (1H, d, J = 4.2 Hz), 1.61-1.50 (4H, m), 1.39-1.21 (18H, m).
Calcd for C23H40O4: [M+H]+ 381, Found 381.
(26B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[13-[(2S)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]트리데콕시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 26B)의 합성
Figure pat00107
공정(26A)에서 합성한 화합물 26A(3.8 g, 9.9 mmol)와 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸 (WO2011053614) (3.5 g, 9.0 mmol)의 디클로로메탄(60 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(0.13 ㎖, 1.5 mmol)을 가하고, 45℃에서 17시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 유거해 농축하고, 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 가하여 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수/인산 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 26B(3.7 g, 수율 58%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.27 (5H, m), 5.39-5.30 (3H, m), 4.72 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.57 (2H, s), 4.20-4.09 (2H, m), 4.02-3.85 (4H, m), 3.58-3.40 (7H, m), 2.48 (1H, d, J = 4.2 Hz), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.63-1.51 (4H, m), 1.37-1.21 (18H, m).
Calcd for C37H59NO12: [M+H]+ 710, Found 710.
(26C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[13-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]트리데콕시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 26C)의 합성
Figure pat00108
공정(26B)에서 합성한 화합물 26B(3.7 g, 5.2 mmol)를 에탄올(100 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 5시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:메탄올 = 100:0-90:10, v/v)로 정제하여 무색 유상의 목적물 26C(1.4 g, 수율 43%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.42-5.29 (3H, m), 4.57 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.21-4.09 (2H, m), 3.95-3.44 (11H, m), 2.60 (1H, d, J = 4.8 Hz), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.64-1.51 (4H, m), 1.37-1.22 (18H, m).
Calcd for C30H53NO12: [M+Na]+ 642, Found 642.
(26D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[13-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-히드록시프로폭시]트리데콕시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 26D)의 합성
Figure pat00109
공정(26C)에서 합성한 화합물 26C(1.4 g, 2.3 mmol)를 피리딘(10 ㎖)에 용해하였다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(0.84 g, 2.5 mmol)를 가하고, 실온에서 15시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50-20: 80, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 26D(1.9 g, 수율 91%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.45-7.41 (2H, m), 7.34-7.18 (7H, m), 6.85-6.80 (4H, m), 5.40-5.30 (3H, m), 4.72 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.20-4.09 (2H, m), 3.97-3.84 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.56-3.40 (5H, m), 3.22-3.13 (2H, m),2.43 (1H, d, J = 4.8 Hz), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.63-1.50 (4H, m), 1.35-1.21 (18H, m).
Calcd for C51H71NO14: [M+Na]+ 944, Found 944.
(26E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[13-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-[2-시아노에틸(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]트리데콕시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 26E)의 합성
Figure pat00110
공정(26D)에서 합성한 화합물 26D(1.9 g, 2.1 mmol)를 적량의 피리딘으로 공비한 후에 디클로로메탄(50 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(1.4 ㎖, 8.0 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.49 ㎖, 2.2 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 26E(1.7 g, 수율 75%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.48-7.41 (2H, m), 7.36-7.16 (7H, m), 6.84-6.78 (4H, m), 5.41-5.30 (3H, m), 4.72 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.20-4.09 (2H, m), 3.95-3.07 (21H, m), 2.66-2.40 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.63-1.45 (4H, m), 1.35-1.21 (18H, m), 1.21-0.99 (12H, m).
(실시예 101)
HO-X6-X6-X6-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X6으로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X6 부분은 참고예 26에서 합성한 화합물 26E를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7037.48).
(참고예 27)
(27A)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[7-[(2R)-2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-3-히드록시프로폭시]헵톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 27A)의 합성
Figure pat00111
공정(24B)에서 합성한 화합물 24B-2(1.9 g, 2.0 mmol)를 에탄올(60 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비 후, 적량의 피리딘을 가해 공비하여 목적물 27A의 조생성물(1.3 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.84 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.69 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.41-5.14 (4H, m), 4.85 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.70 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.22-3.40 (17H, m), 2.86-2.81 (1H, m), 2.20-1.93 (24H, m), 1.65-1.49 (4H, m), 1.39-1.23 (6H, m).
Calcd for C38H60N2O20: [M+H]+ 865, Found 865.
(27B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[7-[(2S)-2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-3-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]헵톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 27B)의 합성
Figure pat00112
공정(27A)에서 합성한 화합물 27A의 조생성물(1.3 g)을 디클로로메탄(50 ㎖)에 용해하였다. 디이소프로필에틸아민(1.0 ㎖, 5.8 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.36 ㎖, 1.6 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 추가로, 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.36 ㎖, 1.6 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세토니트릴 = 100:0-90:10, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 27B(0.56 g, 수율 2 steps 26%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.04-5.69 (2H, m), 5.39-5.06 (4H, m), 4.86-4.69 (2H, m), 4.25-3.40 (21H, m), 2.80-2.67 (2H, m), 2.21-1.92 (24H, m), 1.66-1.48 (4H, m), 1.38-1.15 (18H, m).
(실시예 102)
HO-X7-X4-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X4와 X7로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X4 부분은 참고예 15에서 합성한 화합물 24E를 이용해 1회 축합하였다. X7 부분은 참고예 27에서 합성한 화합물 27B를 이용해 1회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6517.17).
(참고예 28)
(28A)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[7-[(2S)-2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-3-히드록시프로폭시]헵톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 28A)의 합성
Figure pat00113
공정(25B)에서 합성한 화합물 25B-2(1.9 g, 2.0 mmol)를 에탄올(60 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 5시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비 후, 적량의 피리딘을 가해 공비하여 목적물 28A의 조생성물(1.8 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.93 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.71 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.42-5.22 (4H, m), 4.82-4.73 (2H, m), 4.23-3.35 (17H, m), 2.98-2.92 (1H, m), 2.21-1.92 (24H, m), 1.66-1.48 (4H, m), 1.42-1.23 (6H, m).
Calcd for C38H60N2O20: [M+H]+ 865, Found 865.
(28B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[7-[(2R)-2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-3-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]헵톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 28B)의 합성
Figure pat00114
공정(28A)에서 합성한 화합물 28A의 조생성물(1.8 g)을 디클로로메탄(50 ㎖)에 용해하였다. 디이소프로필에틸아민(1.5 ㎖, 8.4 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.51 ㎖, 2.3 mmol)를 가하고, 실온으로 5.5시간 교반하였다. 추가로, 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.51 ㎖, 2.3 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세토니트릴 = 100:0-90:10, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 28B(1.5 g, 수율 2 steps 71%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.91-5.67 (2H, m), 5.41-5.18 (4H, m), 4.91-4.72 (2H, m), 4.26-3.35 (21H, m), 2.79-2.63 (2H, m), 2.20-1.92 (24H, m), 1.67-1.50 (4H, m), 1.40-1.13 (18H, m).
(실시예 103)
HO-X8-X5-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X5와 X8로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X5 부분은 참고예 25에서 합성한 화합물 25E를 이용해 1회 축합하였다. X8 부분은 참고예 28에서 합성한 화합물 28B를 이용해 1회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6517.10).
(참고예 29)
(29A)
(2R)-1-벤질옥시-3-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]프로판-2-올(화합물 29A)의 합성
Figure pat00115
트리에틸렌 글리콜(6.9 g, 46 mmol), 벤질 (S)-(+)-글리시딜 에테르(5.0 g, 30 mmol)를 디클로로메탄(75 ㎖)에 용해시키고, 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.77 ㎖, 6.1 mmol)를 가하고, 실온에서 16시간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획(fraction)을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 디클로로메탄에 용해시키고, 유기층을 포화 식염수, 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 유상의 목적물 29A(5.6 g, 수율 58%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.37-7.25 (5H, m), 4.55 (2H, s), 4.05-3.97 (1H, m), 3.65-3.56 (16H, m).
Calcd for C16H26O6: [M+H]+ 315, Found 315.
(29B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 29B)의 합성
Figure pat00116
공정(29A)에서 합성한 화합물 29A(5.6 g, 18 mmol)와 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(WO2011053614) (6.3 g, 16 mmol)의 디클로로메탄(100 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(0.24 ㎖, 2.8 mmol)을 가하고, 45℃에서 16시간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 아세트산에틸에 용해시키고, 유기층을 포화 식염수, 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 비결정질 상의 목적물 29B(4.9 g, 수율 47%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.27 (5H, m), 6.69 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.28 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.02 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.77 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.56 (2H, s), 4.29-3.47 (21H, m), 2.15 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.97 (3H, s), 1.96 (3H, s).
Calcd for C30H45NO14: [M+H]+ 644, Found 644.
(29C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 29C)의 합성
Figure pat00117
공정(29B)에서 합성한 화합물 29B(4.9 g, 7.6 mmol)를 에탄올(100 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (4.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비하여 유상의 목적물 29C(4.0 g, 수율 95%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.83-6.76 (1H, m), 5.32 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.11 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.79 (1H, d, J = 9.1 Hz), 4.27-4.08 (3H, m), 3.97-3.53 (18H, m), 2.16 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.97 (3H, s).
Calcd for C23H39NO14: [M+H]+ 554, Found 554.
(29D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 29D)의 합성
Figure pat00118
공정(29C)에서 합성한 화합물 29C(4.0 g, 7.2 mmol)에 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하, 공비하였다. 피리딘(30 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(2.7 g, 8.0 mmol)를 가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후, 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 29D(3.5 g, 수율 57%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.44-7.40 (2H, m), 7.33-7.18 (7H, m), 6.85-6.80 (4H, m), 6.59 (1H, d, J = 9.7 Hz), 5.29 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.00 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.77 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.27-4.07 (3H, m), 4.00-3.82 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.71-3.49 (12H, m), 3.20-3.10 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.93 (6H, s).
Calcd for C44H57NO16: [M+Na]+ 878, Found 878.
(29E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 29E)의 합성
Figure pat00119
공정(29D)에서 합성한 화합물 29D(3.5 g, 4.1 mmol)를 적량의 피리딘으로 공비한 후에 디클로로메탄(40 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(2.8 ㎖, 16 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(1.1 ㎖, 4.9 mmol)를 가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 29E(2.2 g, 수율 51%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.40 (2H, m), 7.35-7.16 (7H, m), 6.85-6.77 (4H, m), 6.40 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.33-5.28 (1H, m), 5.03-4.93 (1H, m), 4.81-4.74 (1H, m), 4.28-4.08 (3H, m), 3.96-3.46 (26H, m), 3.27-3.04 (2H, m), 2.69-2.41 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.97-1.90 (6H, m), 1.30-0.98 (12H, m).
(실시예 104)
HO-X9-X9-X9-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X9로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X9 부분은 참고예 29에서 합성한 화합물 29E를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6839.16).
(참고예 30)
(30A)
(2R)-1-벤질옥시-3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판-2-올(화합물 30A의 합성)
Figure pat00120
테트라에틸렌글리콜(8.87 g, 45.7 mmol), 벤질 (S)-(+)-글리시딜 에테르(4.66 ㎖, 30.5 mmol)를 디클로로메탄(75 ㎖)에 용해시키고, 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.76 ㎖, 6.1 mmol)를 가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 디클로로메탄에 용해시키고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 유상의 목적물 30A(5.3 g, 수율 49%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.37-7.23 (5H, m), 4.56 (2H, s), 4.01 (1H, br), 3.75-3.41 (20H, m).
Calcd for C18H30O7: [M+H]+ 359, Found 359.
(30B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 30B의 합성)
Figure pat00121
공정 30A에서 합성한 화합물(5.3 g, 15 mmol)과 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(WO2011053614) (5.2 g, 13 mmol)의 디클로로메탄(100 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(0.2 ㎖, 2.3 mmol)을 가하고, 45℃에서 22시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거해 농축하고, 아세트산에틸을 가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 디클로로메탄에 용해시키고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 비결정질 상의 목적물 30B(4.5 g, 수율 49%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.24 (5H, m), 6.72 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.29 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.00 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.76 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.56 (2H, s), 4.31-4.21 (1H, m), 4.18-3.46 (24H, m), 2.15 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.97 (6H, s).
Calcd for C32H49NO15: [M+H]+ 688, Found 688.
(30C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[2-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(30C의 합성)
Figure pat00122
공정(30B)에서 합성한 화합물 30B(4.5 g, 6.5 mmol)를 에탄올(80 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (4 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 목적물 30C(3.9 g, 수율 quant.)의 조생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.85 (1H, d, J = 9.7 Hz), 5.32 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.10 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.74 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.32-4.09 (2H, m), 3.99-3.56 (23H, m), 2.16 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.99 (3H, s).
Calcd for C25H43NO15: [M+H]+ 598, Found 598.
(30D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 30D의 합성)
Figure pat00123
공정(30C)에서 합성한 화합물 30C(3.9 g, 6.5 mmol)에 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하, 공비하였다. 피리딘(22 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(2.4 g, 7.2 mmol)를 가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후, 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 30D(3.12 g, 수율 53%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.44-7.40 (2H, m), 7.33-7.18 (7H, m), 6.85-6.79 (4H, m), 6.63 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.29 (1H, d, J = 3.0 Hz), 4.96 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.75 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.29-4.21 (1H, m), 4.17-4.07 (2H, m), 4.00-3.81 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.71-3.58 (14H, m), 3.53-3.43 (2H, m), 3.21-3.10 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.02 (3H, s), 1.95 (6H, s).
Calcd for C46H61NO17: [M+Na]+ 922, Found 922.
(30E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 30E의 합성)
Figure pat00124
공정(30D)에서 합성한 화합물 30D(3.12 g, 3.47 mmol)에 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하 공비한 후에 디클로로메탄(35 ㎖)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(2.42 ㎖, 13.9 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.93 ㎖, 4.16 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 감압 하 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 30E(2.98 g, 수율 78%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46-7.40 (2H, m), 7.35-7.17 (7H, m), 6.84-6.78 (4H, m), 6.43 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.31 (1H, br), 5.00-4.93 (1H, m), 4.78 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.29-4.08 (3H, m), 3.91-3.48 (30H, m), 3.27-3.04 (2H, m), 2.67-2.62 (1H, m), 2.46-2.41 (1H, m), 2.15 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.97-1.94 (6H, m), 1.30-0.99 (12H, m).
(실시예 105)
HO-X10-X10-X10-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X10으로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X10 부분은 참고예 30에서 합성한 화합물 30E를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6971.21).
(참고예 31)
(31A)
(2R)-1-벤질옥시-3-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]프로판-2-올(화합물 31A의 합성)
Figure pat00125
디에틸렌글리콜(5.0 g, 30.5 mmol), 벤질 (S)-(+)-글리시딜 에테르(6.5, 60.9 mmol)를 디클로로메탄(75 ㎖)에 용해시키고, 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.76 ㎖, 6.1 mmol)를 가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 디클로로메탄에 용해시키고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 유상의 목적물 31A(5.3 g, 수율 64%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.27 (5H, m), 4.56 (2H, s), 4.05-3.97 (1H, m), 3.77-3.48 (12H, m), 2.85-2.82 (1H, m), 2.47-2.42 (1H, m).
Calcd for C14H22O5: [M+ Na]+ 293, Found 293.
(31B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 31B의 합성)
Figure pat00126
공정 31A에서 합성한 화합물(4.0 g, 15 mmol)과 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(WO2011053614) (5.2 g, 13 mmol)의 디클로로메탄(100 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(0.2 ㎖, 2.3 mmol)를 가하고, 45℃에서 22시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거해 농축하고, 아세트산에틸을 가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 디클로로메탄에 용해시키고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 비결정질 상의 목적물 31B(4.15 g, 수율 52%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.37-7.28 (5H, m), 6.71 (1H, d, J = 9.7 Hz), 5.30 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.12 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.77 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.57 (2H, s), 4.27-4.05 (1H, m), 3.93-3.45 (16H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 1.98 (3H, s), 1.95 (3H, s).
Calcd for C28H41NO13: [M+ Na]+ 622, Found 622.
(31C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 31C의 합성)
Figure pat00127
공정(31B)에서 합성한 화합물 31B(4.15 g, 6.9 mmol)를 에탄올(80 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (4 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 추가로, 10% 팔라듐/탄소(wet) (1 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 50℃에서 4시간 격렬하게 교반하였다. 추가로, 10% 팔라듐/탄소(wet) (1 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 50℃에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 목적물 31C(3.0 g, 수율 86%)의 조생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.58 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.32-5.30 (1H, m), 5.16 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.78 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.26-4.09 (2H, m), 3.95-3.58 (15H, m), 2.16 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.98 (3H, s).
Calcd for C21H35NO13: [M+H]+ 510, Found 510.
(31D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 31D)의 합성
Figure pat00128
공정(31C)에서 합성한 화합물 31C(3.0 g, 5.9 mmol)에 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하, 공비하였다. 피리딘(25 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(2.2 g, 6.5 mmol)를 가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후, 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 31D(1.7 g, 수율 36%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.42 (2H, m), 7.35-7.18 (7H, m), 6.86-6.80 (4H, m), 6.73 (1H, d, J = 9.7 Hz), 5.31 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.14 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.76 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.28-4.09 (3H, m), 4.07-3.83 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.72-3.49 (8H, m), 3.26 (1H, d, J = 3.6 Hz), 3.18-3.13 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.94 (3H, s), 1.90 (3H, s).
Calcd for C42H53NO15: [M+Na]+ 834, Found 834.
(31E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 31E)의 합성
Figure pat00129
공정(31D)에서 합성한 화합물 31D(1.7 g, 2.1 mmol)를 적량의 피리딘으로 공비한 후에 디클로로메탄(20 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(1.5 ㎖, 8.4 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.56 ㎖, 2.5 mmol)를 가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후에 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 31E(1.5 g, 수율 71%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.40 (2H, m), 7.37-7.17 (7H, m), 6.86-6.77 (4H, m), 6.08-5.95 (1H, m), 5.34-5.29 (1H, m), 5.16-5.06 (1H, m), 4.76-4.69 (1H, m), 4.20-4.02 (3H, m), 3.95-3.47 (22H, m), 3.31-3.08 (2H, m), 2.69-2.40 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.04-2.02 (3H, m), 1.97-1.94 (3H, m), 1.91-1.88 (3H, m), 1.21-1.01 (12H, m).
(실시예 106)
HO-X11-X11-X11-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X11로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X11 부분은 참고예 31에서 합성한 화합물 31E를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6708.09).
(참고예 32)
(32A)
(2S)-1-벤질옥시-3-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]프로판-2-올(화합물 32A)의 합성
Figure pat00130
트리에틸렌 글리콜(9.2 g, 61 mmol), 벤질 (R)-(-)-글리시딜 에테르(5.0 g, 30 mmol)를 디클로로메탄(75 ㎖)에 용해시키고, 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.77 ㎖, 6.1 mmol)를 가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 디클로로메탄에 용해시키고, 유기층을 포화 식염수, 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 유상의 목적물 32A(6.4 g, 수율 67%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.25 (5H, m), 4.56 (2H, s), 4.19-3.45 (17H, m).
Calcd for C16H26O6: [M+H]+ 315, Found 315.
(32B)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 32B)의 합성
Figure pat00131
공정(32A)에서 합성한 화합물 32A(6.4 g, 20 mmol)와 문헌 기지 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸 (WO2011053614) (7.2 g, 18 mmol)의 디클로로메탄(200 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(0.28 ㎖, 3.1 mmol)를 가하고, 45℃에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 목적물을 아세트산에틸에 용해시키고, 유기층을 포화 식염수, 포화 식염수/포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 비결정질 상의 목적물 32B(5.6 g, 수율 47%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.25 (5H, m), 6.68 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.33-5.27 (1H, m), 5.07-4.95 (1H, m), 4.78 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.55 (2H, s), 4.25-3.24 (21H, m), 2.15 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.97 (3H, s), 1.96 (3H, s).
Calcd for C30H45NO14: [M+H]+ 644, Found 644.
(32C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-2,3-디히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 32C)의 합성
Figure pat00132
공정(32B)에서 합성한 화합물 32B(5.6 g, 8.7 mmol)를 에탄올(100 ㎖)에 용해하였다. 20% 수산화팔라듐/탄소(wet) (1.5 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 50℃에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비하여 유상의 목적물 32C(4.1 g, 수율 85%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.80 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.34-5.30 (1H, m), 5.15-5.03 (1H, m), 4.81 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.33-4.08 (3H, m), 3.99-3.48 (18H, m), 2.16 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.98 (3H, s).
Calcd for C23H39NO14: [M+H]+ 554, Found 554.
(32D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-히드록시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 32D)의 합성
Figure pat00133
공정(32C)에서 합성한 화합물 32C(4.1 g, 7.4 mmol)에 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하, 공비하였다. 피리딘(30 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(2.8 g, 8.2 mmol)를 가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후, 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 32D(1.9 g, 수율 30%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.44-7.40 (2H, m), 7.35-7.18 (7H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 6.67 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.29 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.03 (1H, dd, J = 11.2, 3.0 Hz), 4.77 (1H, d, J = 9.1 Hz), 4.26-4.06 (3H, m), 4.00-3.81 (4H, m), 3.79 (6H, s), 3.75-3.50 (12H, m), 3.23-3.11 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.94 (6H, s).
Calcd for C44H57NO16: [M+Na]+ 878, Found 878.
(32E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 32E)의 합성
Figure pat00134
공정(32D)에서 합성한 화합물 32D(1.9 g, 2.2 mmol)를 적량의 톨루엔으로 공비한 후에 디클로로메탄(22 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(1.6 ㎖, 9.0 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.59 ㎖, 2.7 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=50:50-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 32E(1.5 g, 수율 64%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.40 (2H, m), 7.36-7.16 (7H, m), 6.85-6.78 (4H, m), 6.45-6.38 (1H, m), 5.33-5.28 (1H, m), 5.03-4.94 (1H, m), 4.80-4.75 (1H, m), 4.27-4.08 (3H, m), 3.93-3.45 (26H, m), 3.28-3.04 (2H, m), 2.69-2.40 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.97-1.92 (6H, m), 1.21-1.01 (12H, m).
(실시예 107)
HO-X12-X12-X12-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X12로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X12 부분은 참고예 32에서 합성한 화합물 32E를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6839.16).
(실시예 108)
HO-X9-X9-X9-X9-X9-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X9로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X9 부분은 참고예 29에서 합성한 화합물 29E를 이용해 5회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7817.33).
(실시예 109)
HO-X9-X9-X9-X9-X9-X9-X9-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X9로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X9 부분은 참고예 29에서 합성한 화합물 29E를 이용해 7회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 8796.73).
(참고예 33)
(33A)
9H-플루오렌-9-일메틸 N-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에틸]카르바메이트(화합물 33A)의 합성
Figure pat00135
문헌 기지 화합물인 9H-플루오렌-9-일메틸 N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]카르바메이트(Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, 755-761) (3.11 g, 10 mmol)와 벤질 (S)-(+)-글리시딜 에테르(0.8 g, 5 mmol)를 디클로로메탄(30 ㎖)에 용해시키고, 삼불화붕소-디에틸 에테르 착체(0.1 ㎖, 1 mmol)를 가하고, 실온에서 16시간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 80:20-0:100, v/v)로 정제하여 유상의 목적물 33A(0.74 g, 수율 30%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.76 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.42-7.37 (2H, m), 7.35-7.27 (7H, m), 5.40 (1H, s), 4.53 (2H, s), 4.39 (2H, d, J = 6.7 Hz), 4.25-4.19 (1H, m), 4.04-3.97 (1H, m), 3.69-3.35 (12H, m).
Calcd for C29H33NO6: [M+H]+ 492, Found 492.
(33B)
(2R)-1-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]-3-벤질옥시-프로판-2-올, 트리플루오로아세트산염(화합물 33B)의 합성
Figure pat00136
공정(33A)에서 합성한 화합물 33A(13.8 g, 28.1 mmol)를 에탄올/테트라히드로푸란(50 ㎖/50 ㎖)에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액(100 ㎖)을 가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 유기용매를 감압 유거하고, 1 N 염산(100 ㎖)을 가하였다. 생성된 고형물을 여과에 의해 제거하였다. 통과액인 수층에 포함되는 부생성물을 아세트산에틸로 추출하고, 감압 유거한 후에 얻어지는 잔사에 아세토니트릴을 가하고, 여과 하였다. 통과액을 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하여 유상의 목적물 33B(7.1 g, 수율 66%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.27 (5H, m), 4.55 (2H, s), 4.07-3.99 (1H, m), 3.77-3.48 (10H, m), 2.96-2.88 (2H, m).
(33C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트레히드로피란-2-일]메틸(화합물 33C)의 합성
Figure pat00137
문헌 기지 화합물인 2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시 아세트산(WO2012037254) (6 g, 14.8 mmol), 1-(-3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(3.4 g, 17.8 mmol), 3H-1,2,3-트리아졸[4,5-b]피리딘-3-올(2.0 g, 14.8 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(9.0 ㎖, 51.8 mmol), 공정(33B)에서 합성한 화합물 33B(6.7 g, 17.5 mmol)를 디클로로메탄(130 ㎖)에 용해하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 종료 후, 유기층을 1 N 염산, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:메탄올 = 100:0-90:10, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 33C(7.9 g, 수율 81%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.28 (5H, m), 7.00-6.93 (1H, m), 6.50-6.44 (1H, m), 5.33-5.29 (1H, m), 5.16 (1H, dd, J = 11.5, 3.6 Hz), 4.63-4.53 (3H, m), 4.34 (1H, d, J = 15.1 Hz), 4.22-3.83 (5H, m), 3.73-3.26 (13H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 1.99 (6H, s).
Calcd for C30H44N2O14: [M+H]+ 657, Found 657.
(33D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 33D)의 합성
Figure pat00138
공정(33C)에서 합성한 화합물 33C(7.9 g, 12 mmol)를 에탄올(80 ㎖)에 용해하였다. 20% 수산화팔라듐/탄소(wet) (2.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 50℃에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 비결정질 상의 목적물 33D(6.7 g, 수율 98%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.03-6.98 (1H, m), 6.43 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.3 Hz), 5.15 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.58 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.35 (1H, d, J = 15.7 Hz), 4.28-3.82 (5H, m), 3.77-3.34 (13H, m), 2.18 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.01 (3H, s).
Calcd for C23H38N2O14: [M+H]+ 568, Found 568.
(33E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 33E)의 합성
Figure pat00139
공정(33D)에서 합성한 화합물 33D(6.8 g, 12 mmol)에 적량의 피리딘을 가하과, 감압 하, 공비하였다. 피리딘(40 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(4.5 g, 13 mmol)를 가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 적량의 톨루엔을 가해 공비한 후, 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 33E(6.9 g, 수율 66%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.33-7.19 (7H, m), 7.01-6.94 (1H, m), 6.83 (4H, d, J = 9.1 Hz), 6.37 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.33 (1H, d, J = 3.3 Hz), 5.15 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.58 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.32 (1H, d, J = 15.7 Hz), 4.22-3.86 (5H, m), 3.79 (6H, s), 3.66-3.12 (13H, m), 2.13 (3H, s), 2.03 (3H, s), 1.97 (3H, s), 1.95 (3H, s).
Calcd for C44H56N2O16: [M+Na]+ 893, Found 892.
(33F)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 33F)의 합성
Figure pat00140
공정(33E)에서 합성한 화합물 33E(6.9 g, 7.9 mmol)를 적량의 톨루엔으로 공비한 후에 디클로로메탄(80 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(5.5 ㎖, 32 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(2.1 ㎖, 9.5 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 33F(6.6 g, 수율 78%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.40 (2H, m), 7.35-7.17 (7H, m), 6.98-6.91 (1H, m), 6.85-6.78 (4H, m), 6.05-5.89 (1H, m), 5.37-5.33 (1H, m), 5.17-5.07 (1H, m), 4.59-4.49 (1H, m), 4.37-4.30 (1H, m), 4.23-3.06 (28H, m), 2.69-2.42 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.02-1.98 (3H, m), 1.97-1.94 (3H, m), 1.30-1.00 (12H, m).
(실시예 110)
HO-X13-X13-X13-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X13으로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X13 부분은 참고예 33에서 합성한 화합물 33F를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6878.11).
(실시예 111)
HO-X13-X13-X13-X13-X13-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X13으로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X13의 부분은 참고예 33에서 합성한 화합물 33F를 이용해 5회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7882.43).
(실시예 112)
HO-X13-X13-X13-X13-X13-X13-X13-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X13으로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X13 부분은 참고예 33에서 합성한 화합물 33F를 이용해 7회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 다음의 HPLC 조건으로 분석하였다. 분석 컬럼은 Clarity Oligo-MS C18 (PhenomeneX제) (2.6 μm, 50 X 2.1mm), 이동상 A는 100 mM 헥사 플루오로이소프로판올, 8 mM 트리에틸아민 수용액, 이동상 B는 메탄올을 사용하고, 이동상 B가 4분간에 10%에서 25%로 변화하는 구배(gradient), 유속 0.5 ㎖/분, 60℃에서 분석하였다. 화합물의 HPLC 유지 시간은 3.0분이었다.
(참고예 34)
(34A)
tert-부틸 N-[(5S)-6-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-6-옥소-헥실]카르바메이트(화합물 34A)의 합성
Figure pat00141
(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산산(1.7 g, 4.9 mmol), 1-(-3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(1.3 g, 6.9 mmol), 3H-1,2,3-트리아졸[4,5-b]피리딘-3-올(0.67 g, 4.9 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(3.0 ㎖, 17 mmol), 공정(33B)에서 합성한 화합물 33B(2.1 g, 5.4 mmol)를 디클로로메탄(40 ㎖)에 용해하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 추가로, 1-(-3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디아미드 염산염(1.3 g, 6.9 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(1.0 ㎖, 5.7 mmol)을 가하고, 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 유기층을 1 N 염산, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거 하여 화합물 34A를 포함하는 조생성물(3.1 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고, 전량을 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C30H51N3O9: [M+H]+ 599, Found 599.
(34B)
(2S)-2,6-디아미노-N-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에틸]헥산아미드 TFA염(화합물 34B)의 합성
Figure pat00142
공정(34A)에서 합성한 화합물 34A를 포함하는 조생성물(3.1 g)을 디클로로메탄(24 ㎖)/트리플루오로아세트산(6 ㎖)에 용해시키고, 실온에서 90분간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하고, 적량의 디클로로메탄을 가해 다시 용매를 감압 유거하였다. 이어서, 적량의 아세토니트릴/증류수(4/1)를 가하고, 다시 용매를 감압 유거하였다. 과잉의 트리플루오로아세트산을 제거할 수 있을 때까지 상기 조작을 반복하였다. 화합물 34B를 포함하는 조생성물(3.8 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고, 전량을 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C20H35N3O5: [M+H]+ 399, Found 398.
(34C)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[2-[[(5S)-5-[[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-6-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-히드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-2-옥소-에톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 34C)의 합성
Figure pat00143
문헌 기지 화합물인 2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시 아세트산(WO2012037254) (3.5 g, 8.6 mmol), 1-(-3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(2.3 g, 12 mmol), 3H-1,2,3-트리아졸[4,5-b]피리딘-3-올(1.3 g, 9.6 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(10 ㎖, 59 mmol), 공정(34B)에서 합성한 화합물 34B를 포함하는 조생성물을 디클로로메탄(80 ㎖)에 용해하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 유기층을 1 N 염산, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:메탄올 = 100:0-70:30, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 34C(3.5 g, 수율 62%(3 공정))를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.50-7.44 (1H, m), 7.39-7.28 (5H, m), 7.17-7.11 (2H, m), 6.94-6.88 (1H, m), 6.30-6.26 (1H, m), 5.37-5.32 (2H, m), 5.09-4.99 (2H, m), 4.57 (2H, s), 4.56-3.11 (30H, m), 2.18 (3H, s), 2.16 (3H, s), 2.07-1.99 (15H, m), 1.97 (3H, s), 1.96-1.34 (6H, m).
Calcd for C52H77N5O25: [M+H]+ 1172, Found 1173.
(34D)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[2-[[(5S)-5-[[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-6-[2-[2-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-2-옥소-에톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 34D)의 합성
Figure pat00144
공정(34C)에서 합성한 화합물 34C(3.5 g, 3.0 mmol)를 에탄올(40 ㎖)에 용해하였다. 20% 수산화팔라듐/탄소(wet) (1.2 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 50℃에서 8시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 비결정질 상의 목적물 34D(3.14 g, 수율 97%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.72-7.67 (1H, m), 7.16 (2H, d, J = 9.1 Hz), 7.04-6.98 (1H, m), 6.27 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.36 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.10-4.99 (2H, m), 4.67-3.07 (30H, m), 2.18 (3H, s), 2.17 (3H, s), 2.08-2.00 (15H, m), 1.98 (3H, s), 1.93-1.33 (6H, m).
Calcd for C45H71N5O25: [M+H]+ 1082, Found 1083.
(34E)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[2-[[(5S)-5-[[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-6-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-2-옥소-에톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 34E)의 합성
Figure pat00145
공정(34D)에서 합성한 화합물 34D(3.14 g, 2.9 mmol)에 적량의 피리딘을 가하고, 감압 하, 공비하였다. 피리딘(10 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(1.1 g, 3.2 mmol)를 가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 톨루엔(20 ㎖), 에탄올(1 ㎖), N,N-디이소프로필에틸아민(1 ㎖)을 가하고, 용매를 감압 유거한 후, 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 34E(2.5 g, 수율 62%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.60-7.55 (1H, m), 7.43 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.35-7.20 (7H, m), 7.17-7.10 (2H, m), 6.92-6.87 (1H, m), 6.83 (4H, d, J = 9.1 Hz), 6.30 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.36-5.30 (2H, m), 5.09-4.95 (2H, m), 4.60-3.07 (36H, m), 2.19-2.14 (6H, m), 2.06-1.99 (15H, m), 1.97 (3H, s), 1.70-1.34 (6H, m).
Calcd for C66H89N5O27: [M+Na]+ 1407, Found 1407.
(34F)
아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[2-[[(5S)-5-[[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-6-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-2-옥소-에톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸(화합물 34F)의 합성
Figure pat00146
공정(34E)에서 합성한 화합물 34E(2.5 g, 1.8 mmol)를 적량의 톨루엔/디클로로메탄(3/1)으로 공비한 후에 디클로로메탄(18 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(1.3 ㎖, 7.2 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.48 ㎖, 2.2 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 34F(2.1 g, 수율 73%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.41 (2H, m), 7.35-7.05 (10H, m), 6.89-6.78 (5H, m), 6.35-6.25 (1H, m), 5.37-5.34 (2H, m), 5.11-4.98 (2H, m), 4.55-3.08 (40H, m), 2.70-2.45 (2H, m), 2.18 (3H, s), 2.17 (3H, s), 2.07-1.99 (15H, m), 1.98-1.94 (3H, m), 1.91-1.31 (6H, m), 1.21-1.02 (12H, m).
(실시예 113)
HO-X14-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X14로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X14 부분은 참고예 34에서 합성한 화합물 34F를 이용해 1회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6263.04).
(실시예 114)
HO-X14-X14-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X14로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X14 부분은 참고예 34에서 합성한 화합물 34F를 이용해 2회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7154.36).
(실시예 115)
HO-X14-X14-X14-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X14로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X14 부분은 참고예 34에서 합성한 화합물 34F를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 8046.64).
(실시예 116∼127) 올리고뉴클레오티드를 봉입한 핵산 지질 입자의 조제
디스테아로일포스파티딜콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: 이하, 'DSPC'로 표기, NOF CORPORATION), 콜레스테롤(Cholesterol: 이하, 'Chol'로 표기, Sigma-Aldrich,Inc), 국제공개 제2015/005253에 기재되어 있는 실시예 8의 화합물('LP'로 함), 및 N-[메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민(이하, 'PEG-C-DMA'로 표기, NOF CORPORATION))을 DSPC:Chol:LP:PEG-C-DMA = 10:48:40:2의 몰비에서 에탄올 중, 총 지질 농도 5 mM이 되도록 지질 용액을 조제하였다.
올리고뉴클레오티드(21e_002, 18e_005, 21m_002, 18e_005, 18m_022, 15e_001, 15ed_001, 18e_008, 18e_025, 18m_008, 15e_002,및, 15ed_002)를 각각 시트르산 완충액(20 mM, Citrate Buffer, pH 4.0)에 용해하여 올리고뉴클레오티드 용액을 조제하였다.
상기의 지질 용액과 올리고뉴클레오티드 용액을 LP 유래의 질소 원자(N)와 올리고뉴클레오티드 유래의 인 원자(P)의 비율(N/P)이 3이 되도록, NanoAssemblr Benchtop(등록상표. Precision Nanosystems)를 이용해 부속하는 마이크로 유로 카트리지 내에서 혼합하여(유속: 12 ㎖/분, 혼합 부피 비율:지질 용액:올리고뉴클레오티드 용액 = 1:3, 온도: 실온) 핵산 지질 입자의 분산액을 얻었다. 이어서, 핵산 지질 입자의 분산액을 약 2 L의 인산 완충액(pH 7.4)에서 12-18시간 투석(Float-A-Lyzer G2, MWCO: 1000kD, Spectra/Por)함으로써, 에탄올 제거 및 중화를 행하고, 올리고뉴클레오티드를 봉입한 핵산 지질 입자의 정제된 분산액을 얻었다. 적당히 농도를 조정하기 위하여, 한외여과(Amicon-Ultra, MWCO: 100kD, MILLIPORE)에 의해 핵산 지질 입자의 분산액을 농축하였다.
실시예 116∼127의 올리고뉴클레오티드 봉입 핵산 지질 입자의 특성 평가를 행하였다. 각각의 특성 평가의 방법에 대해 이하에 설명한다.
(1) 올리고뉴클레오티드의 봉입율
올리고뉴클레오티드의 봉입율은 Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit(Invitrogen)를 이용하여 첨부 문서에 준해 측정하였다. 즉, 0.015% Triton X-100 계면활성제 존재 하 및 비존재 하에 있어서, 핵산 지질 입자의 분산액 중의 올리고뉴클레오티드를 정량하고, 아래의 식에 의해 봉입율을 산출하였다.
{[계면활성제 존재 하에서의 올리고뉴클레오티드량]-[계면활성제 비존재 하에서의 올리고뉴클레오티드량]}/[계면활성제 존재 하에서의 올리고뉴클레오티드량]}×100(%)
(2) 올리고뉴클레오티드와 지질의 비율
핵산 지질 입자의 분산액 중의 인 지질량을 인 지질 C-테스트 와코(와코준야쿠코교 주식회사)를 이용하여 첨부 문서에 준해 측정하였다. 즉, 1% Triton X-100 계면활성제 존재 하에 있어서, 시료 중의 인 지질을 정량하였다.
핵산 지질 입자의 분산액 중의 콜레스테롤 및 LP 양을 역상 크로마토그래피에서 측정하였다(System: Agilent 1100 series, Column: Chromolith Performance RP-18 endcapped 100-3 monolithic HPLC-column(Merck), 버퍼 A: 0.01% 트리플루오로아세트산, 버퍼 B: 0.01% 트리플루오로아세트산, 메탄올, Gradient(B%): 82-97%(0-17 min), Flow Rate: 2 ㎖/분, Temperature: 50℃, Detection: 205 nm).
인 지질량, 콜레스테롤량, 및 LP 양과 리포솜을 구성하는 지질 성분의 조성 비로부터 총 지질량을 산출하고, 상술한 (1)의 「계면활성제 존재 하에서의 올리고뉴클레오티드량」으로부터, 아래의 식에 의해 올리고뉴클레오티드와 지질의 비율을 산출하였다.
[계면활성제 존재하에서의 올리고뉴클레오티드 농도]/[총지질 농도] (wt/wt)
(3) 평균 입자 지름
리포솜의 입자 지름은 Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380 ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)에서 측정하였다. 표 중의 평균 입자 지름은 부피 평균 입자 지름을 나타내고, ± 이하는 편차를 나타낸다.
결과를 표 11에 나타낸다.
[표 11]
--------------------------------------------------------------
핵산 지질 입자　ASO 　　　봉입율　　ASO/지질 　　입자 지름
　　　　　　　　　　　　　　(%) 　　(wt/wt)*　 　　(nm)
--------------------------------------------------------------
실시예 116　　21e_002 　　　98　　　　12　　　　　60±35
실시예 117　　18e_005 　　　98　　　　12　　　　　69±36
실시예 118　　21m_002 　　　98　　　　13　　　　　67±33
실시예 119　　18e_005 　　　98　　　　12　　　　　61±31
실시예 120　　18m_022 　　　98　　　　13　　　　　59±21
실시예 121　　15e_001 　　　98　　　　13　　　　　57±20
실시예 122　　15ed_001　　　99　　　　15　　　　　58±19
실시예 123　　18e_008 　　　97　　　　14　　　　　62±36
실시예 124　　18e_025 　　　98　　　　14　　　　　58±25
실시예 125　　18m_008 　　　98　　　　13　　　　　62±28
실시예 126　　15e_002 　　　98　　　　13　　　　　62±33
실시예 127　　15ed_002　　　98　　　　14　　　　　54±21
--------------------------------------------------------------
* ASO/지질(wt/wt): 올리고뉴클레오티드와 지질의 중량비.
이상의 결과로부터, 올리고뉴클레오티드가 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 그러한 핵산 지질 입자는 약 50 nm로부터 약 70 nm의 평균 입자 지름을 갖고 있음이 명확하였다.
(실시예 128)
HO-X14-Am1s-Te2s-Cm1s-Cm1s-Ge2s-Am1s-Um1s-Ge2s-Gm1s-Cm1s-Ge2s-Am1s-Am1s-Ge2s-Cm1t-H (서열번호 44)
실시예 113에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005를 이용하여 실시예 113과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6210.94).
(실시예 129)
HO-X14-Um1s-Ce2s-Cm1s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Ge2s-Cm1s-Gm1s-Ae2s-Am1s-Gm1s-Ce2s-Um1t-H (서열번호 45)
실시예 113에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_006을 이용하여 실시예 113과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 90번째에서 104번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6201.95).
(실시예 130)
HO-X14-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Cm1s-Te2s-Gm1t-H (서열번호 41)
실시예 113에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_002를 이용하여 실시예 113과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 89번째에서 103번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6268.98).
(참고예 35)
(35A) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[3-(tert-부톡시아르보닐아미노)프로필아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 35A)의 합성
Figure pat00147
문헌 기지 화합물인 2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시 아세트산(WO2012037254) (10 g, 24.7 mmol), N-(3-아미노프로필)카르바민산 tert-부틸 에스테르(4.7 ㎖, 27.1 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(70 ㎖) 용액에 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(11.3 g, 29.6 mmol)와 N,N-디이소프로필에틸아민(8.6 ㎖, 49.3 mmol)을 가하고, 실온에서 40분 교반하였다. 반응 종료 후, 아세트산에틸을 가하고, 유기층을 15% 식염수, 0.5 N 염산, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 용매를 감압 유거하여 표기 목적물을 포함하는 조생성물 약 14 g을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
(35B) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-(3-아미노프로필아미노)-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트 TFA염(화합물 35B)의 합성
Figure pat00148
공정(35A)에서 합성한 조생성물(14 g)을 디클로로메탄(40 ㎖)에 용해시키고, 반응이 종료할 때까지 트리플루오로아세트산을 합계 16 ㎖ 가하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 적량의 디에틸 에테르를 가하고, 디캔테이션하였다. 적량의 아세토니트릴을 가하고, 감압 유거하였다. 추가로, 적량의 디클로로메탄을 가하고, 감압 유거하였다. 표기 목적물을 포함하는 조생성물을 약 15.9 g 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C19H31N3O10: [M+H]+ 462, Found 462.
(35C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[3-[[(4R)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메톡시카르보닐아미노]프로필아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 35C)의 합성
Figure pat00149
(S)-(+)-1,2-이소프로필리덴글리세롤(6.53 g, 49.4 mmol), 클로로포름산 4-니트로페닐(9.96 g, 49.4 mmol)을 디클로로메탄(200 ㎖)에 용해시키고, 피리딘(7.95 ㎖, 98.8 mmol)을 가하고, 실온에서 30분 교반하였다. 이 반응액에 공정(35B)에서 합성한 조생성물(15.9 g)의 디클로로메탄(100 ㎖) 용액, 트리에틸아민(20.5 ㎖, 148 mmol)을 가하고, 실온에서, 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 유기층을 0.5 N 염산, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:메탄올 = 100:0-65: 35, v/v)로 정제하여 목적물 35C(9.0 g, 수율 59%(3 공정))를 고체로서 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.09-7.01 (1H, m), 6.16 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.53-5.46 (1H, m), 5.37 (1H, d, J = 3.6 Hz), 5.22-5.14 (1H, m), 4.53 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.41-3.99 (9H, m), 3.96-3.89 (1H, m), 3.79-3.71 (1H, m), 3.44-3.15 (4H, m), 2.17 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.98 (3H, s), 1.80-1.58 (2H, m), 1.43 (3H, s), 1.37 (3H, s).
Calcd for C26H41N3O14: [M+Na]+ 642, Found 642.
(35D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[3-[[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]카르보닐아미노]프로필아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 35D)의 합성
Figure pat00150
공정(35C)에서 합성한 화합물(7.87 g, 12.7 mmol)의 메탄올 용액(160 ㎖)에 p-톨루엔 설폰산(0.242 g, 1.27 mmol)을 가하고, 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 표기 목적물을 포함하는 조생성물 7.36 g을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C23H37N3O14: [M+H]+ 580, Found 580, [M+Na]+ 602, Found 602.
(35E) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[3-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]프로필아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 35E)의 합성
Figure pat00151
공정(35D)에서 합성한 조생성물(7.36 g)에 디클로로메탄(150 ㎖), 피리딘(10 ㎖)을 가하고, 용매를 감압 유거하였다. 그 후, 피리딘(60 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(5.59 g, 16.5 mmol)를 가하고, 실온에서 30분 교반하였다. 반응 종료 후, 메탄올(1.03 ㎖, 25.4 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(4.42 ㎖, 25.4 mmol) 용매를 감압 유거하였다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 목적물 35E(4.51 g, 수율 40%)를 고체로서 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.45-7.39 (2H, m), 7.34-7.28 (6H, m), 7.24-7.18 (1H, m), 7.07-6.99 (1H, m), 6.86-6.80 (4H, m), 6.21 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.48-5.41 (1H, m), 5.36 (1H, d, J = 3.6 Hz), 5.19-5.13 (1H, m), 4.52 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.39-3.88 (9H, m), 3.79 (6H, s), 3.50-3.12 (6H, m), 2.92 (1H, d, J = 4.8 Hz), 2.16 (3H, s), 2.05 (3H, s), 1.99 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.80-1.54 (2H, m).
Calcd for C44H55N3O16: [M+Na]+ 904, Found 904.
(35F) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[3-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]프로필아미노]-2-옥소-에톡시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 35F)의 합성
Figure pat00152
공정(35E)에서 합성한 화합물 35E(4.51 g, 5.11 mmol)를 적량의 아세트산에틸/톨루엔(1/4)으로 공비한 후에 디클로로메탄(90 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(3.56 ㎖, 20.5 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(1.57 ㎖, 5.63 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-50:50, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 목적물 35F(3.97 g, 수율 72%)를 고체로서 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.38 (2H, m), 7.35-7.16 (7H, m), 7.12-7.04 (1H, m), 6.86-6.76 (4H, m), 6.25-6.12 (1H, m), 5.58-5.18 (3H, m), 4.61-4.53 (1H, m), 4.46-3.42 (19H, m), 3.39-3.02 (6H, m), 2.68-2.41 (2H, m), 2.19-2.13 (3H, m), 2.08-2.02 (3H, m), 2.01-1.91 (6H, m), 1.78-1.54 (2H, m), 1.31-0.94 (12H, m).
(참고예 36)
(36A) [(4R)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메틸 N-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]카르바메이트(화합물 36A)의 합성
Figure pat00153
(S)-(+)-1,2-이소프로필리덴글리세롤(5.0 g, 37.5 mmol), 클로로포름산 4-니트로페닐(7.55 g, 37.5 mmol)을 디클로로메탄(150 ㎖)에 용해시키고, 피리딘(5.0 ㎖, 61.8 mmol)을 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 이 반응액에 N-(2-아미노에틸)카르바민산 tert-부틸(6 g, 37.5 mmol)의 디클로로메탄 용액(40 ㎖), 트리에틸아민(8.8 ㎖, 63.7 mmol)을 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응 종료 후, 유기층을 0.5 N 염산, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 목적물을 포함하는 조생성물(10.6 g)을 고체로서 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
(36B) [(2R)-2,3-디히드록시프로필] N-(2-아미노에틸)카르바메이트 TFA염(화합물 36B)의 합성
Figure pat00154
공정(36A)에서 합성한 조생성물(10.6 g)에 트리플루오로아세트산(16.6 ㎖), 순수(5.55 ㎖)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 이어서, 아세토니트릴을 가하고, 감압 유거하였다. 추가로, 아세토니트릴/순수(4/1)를 가하고, 용매를 감압 유거한 후에 감압 하 건조하였다. 목적물을 포함하는 오일상의 조생성물(14.3 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
(36C) 벤질 N-[(5S)-5-(벤질옥시카르보닐아미노)-6-[2-[[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]카르보닐아미노]에틸아미노]-6-옥소-헥실]카르바메이트(화합물 36C)의 합성
Figure pat00155
N,Nㅄ-디-Cbz-L-리신(13.7 g)의 N,N-디메틸포름아미드(100 ㎖) 용액에 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(15.0 g, 40 mmol)와 N,N-디이소프로필에틸아민(12 ㎖, 66 mmol)를 가하였다. 추가로, 공정(36B)에서 합성한 조생성물(9.7 g)과 N,N-디이소프로필에틸아민(12 ㎖, 66 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(20 ㎖) 용액을 가하고, 실온에서 40분 교반하였다. 반응 종료 후, 아세트산에틸을 가하고, 유기층을 15% 식염수, 0.5 N 염산, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 고형물을 얻었다. 이 고형물을 1 N 염산, 순수로 세정 후, 디클로로메탄, 디에틸 에테르로 세정한 후에 감압 하 건조하여 목적물을 포함하는 조생성물(10.5 g)을 얻었다.
Calcd for C28H38N4O9: [M+H]+ 575, Found 575.
(36D) [(2R)-2,3-디히드록시프로필] N-[2-[[(2S)-2,6-디아미노헥사노일]아미노]에틸]카르바메이트 염산염(화합물 36D)의 합성
Figure pat00156
공정(36C)에서 합성한 조생성물(9.5 g)을 테트라히드로푸란/1규정 염산(36 ㎖)에 용해시키고, 10% 팔라듐 탄소(2.0 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 여과를 하였다. 용매를 감압 유거한 후에 고속 농축 장치 V-10(바이오타지)으로 감압 하 건조하였다. 표기 목적 화합물의 조생성물(6.4 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
(36E) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[2-[[(5S)-5-[[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-6-[2-[[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]카르보닐아미노]에틸아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-2-옥소-에톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 36E)의 합성
Figure pat00157
문헌 기지 화합물인 2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시 아세트산(WO2012037254) (2.64 g, 6.5 mmol), 공정(36D)에서 합성한 조생성물(1.37 g, 3.6 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(30 ㎖) 용액에 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(3.0 g, 8.0 mmol)와 N,N-디이소프로필에틸아민(3.8 ㎖, 21.7 mmol)을 가하고, 실온에서 40분 교반하였다. 반응 종료 후, 디에틸 에테르(500 ㎖)를 가하고, 침전된 잔사를 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 비결정질 상의 목적물(2.23 g, 수율 57%)을 얻었다.
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 8.14-8.08 (1H, m), 8.03-7.91 (2H, m), 7.33-7.22 (2H, m), 7.16-7.10 (1H, m), 5.27-5.23 (2H, m), 5.01-4.93 (2H, m), 4.59-4.52 (2H, m), 4.26-3.55 (17H, m), 3.36-3.30 (2H, m), 3.18-2.86 (7H, m), 2.14-2.06 (6H, m), 2.04-1.98 (6H, m), 1.94-1.89 (6H, m), 1.88-1.79 (6H, m), 1.71-1.48 (2H, m), 1.47-1.35 (2H, m), 1.32-1.15 (2H, m).
Calcd for C44H68N6O25: [M+H]+ 1081, Found 1081.
(36F) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[2-[[(5S)-5-[[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-6-[2-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]에틸아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-2-옥소-에톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 36F)의 합성
Figure pat00158
공정(36E)에서 합성한 화합물(7.36 g, 2.1 mmol)에 피리딘(10 ㎖)을 가하고, 용매를 감압 유거하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 그 후, 피리딘(10 ㎖)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(0.77 g, 2.3 mmol)를 가하고, 실온에서 30분 교반하였다. 반응 종료 후, 에탄올(1.0 ㎖), N,N-디이소프로필에틸아민(1.0 ㎖)을 가하고, 용매를 감압 유거하였다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물(1.17 g, 수율 41%)을 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.38 (2H, m), 7.36-6.95 (10H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 6.33-6.27 (1H, m), 5.53-4.99 (4H, m), 4.57-3.07 (30H, m), 2.21-2.14 (6H, m), 2.08-1.94 (18H, m), 1.92-1.07 (6H, m).
Calcd for C65H86N6O27: [M+Na]+ 1406, Found 1406.
(36G) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[2-[[(5S)-5-[[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-6-[2-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에틸(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]에틸아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-2-옥소-에톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 36G)의 합성
Figure pat00159
공정(36F)에서 합성한 화합물 36F(1.17 g, 0.85 mmol)를 적량의 디클로로메탄/톨루엔(1/4)으로 공비한 후에 디클로로메탄(8 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(0.59 ㎖, 3.4 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(0.23 ㎖, 1.0 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:아세트산에틸/메탄올(5/1) = 100:0-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 36G(0.81 g, 수율 61%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47-7.40 (2H, m), 7.36-7.10 (11H, m), 6.95-6.86 (1H, m), 6.85-6.78 (4H, m), 6.34-6.28 (1H, m), 5.56-5.33 (2H, m), 5.12-4.98 (2H, m), 4.52-3.04 (36H, m), 2.72-2.46 (2H, m), 2.20-2.15 (6H, m), 2.08-1.94 (18H, m), 1.93-1.81 (2H, m), 1.67-1.52 (2H, m), 1.46-1.34 (2H, m), 1.22-0.98 (12H, m).
(참고예 37)
(37A) [(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[3-(벤질옥시카르보닐아미노)프로폭시]테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 37A)의 합성
Figure pat00160
N-(3-히드록시프로필)카르바민산 벤질(6.4 g, 30.8 mmol)과 문헌 기지 화합물인 [(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(WO2011053614) (10 g, 25.7 mmol)의 디클로로메탄(200 ㎖) 현탁 용액에 트리플루오로메탄 설폰산(450 ㎕, 5.1 mmol)를 가하고, 45℃에서 4시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 유거해 농축하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이소프로필 에테르(100 m)를 가하고, 3시간 교반하였다. 얻어진 고형물을 여과하여 목적물 37A(11.9 g)를 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.43-7.29 (5H, m), 6.26 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.36-5.29 (1H, m), 5.12 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.08 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.03-4.95 (2H, m), 4.33 (1H, d, J = 9.1 Hz), 4.21-4.06 (3H, m), 4.01-3.93 (1H, m), 3.80-3.73 (1H, m), 3.62-3.49 (1H, m), 3.44-3.35 (1H, m), 3.14-3.04 (1H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.88-1.75 (1H, m), 1.69-1.56 (1H, m).
Calcd for C25H34N2O11: [M+H]+ 539, Found 539.
(37B) [(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-(3-아미노프로폭시)테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트 염산염(화합물 37B)의 합성
Figure pat00161
공정(37A)에서 합성한 화합물 37A(10 g, 18.6 mmol)를 테트라히드로푸란(200 ㎖)/1 N 염산(20 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (1 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 1시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 목적물 37B를 포함하는 조생성물(8.97 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C17H28N2O9: [M+H]+ 405, Found 405.
(37C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[(3S)-4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미드]-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-4-옥소부타노일]아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 37C)의 합성
Figure pat00162
N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-아스파라긴산(1.7 g, 4.78 mmol), 공정(37B)에서 합성한 화합물(5.48 g, 12.4 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(15 ㎖) 용액에 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(4.7 g, 12.4 mmol)와 N,N-디이소프로필에틸아민(5.8 ㎖, 33.5 mmol)을 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 아세트산에틸을 가하고, 유기층을 15% 식염수, 0.5 N 염산, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 고형물을 얻었다. 이 고형물을 이소프로필 에테르로 세정 후, 감압 하 건조하여 목적물 37C를 포함하는 조생성물(5.4 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C53H69N5O22: [M+H]+ 1128, Found 1129, [M+Na]+ 1151, Found 1151.
(37D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[(3S)-4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-아미노-4-옥소부타노일]아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트 TFA염(화합물 37D)의 합성
Figure pat00163
공정(37C)에서 합성한 화합물(5.4 g, 4.8 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(25 ㎖) 용액에 피페리딘(0.57 ㎖,5.7 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 트리플루오로아세트산(0.31 ㎖)을 가하였다. 반응액을 적량의 디에틸 에테르에 첨가하고, 침전한 잔사를 얻었다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC(GL 사이언스, Inertsil ODS-3)에서 분리 정제를 행하고, 목적물이 포함되는 분획을 모으고, 용매를 감압 유거하였다. 비결정질 상의 목적물(2.7 g, 수율 55%)를 얻었다.
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 8.34-8.26 (1H, m), 8.14-8.05 (4H, m), 7.90-7.82 (2H, m), 5.25-5.21 (2H, m), 5.00-4.92 (2H, m), 4.50-4.45 (2H, m), 4.08-3.82 (5H, m), 3.80-3.63 (3H, m), 3.51-3.39 (3H, m), 3.19-3.02 (4H, m), 2.70-2.53 (2H, m), 2.14-2.05 (6H, m), 2.04-1.96 (6H, m), 1.93-1.86 (6H, m), 1.84-1.75 (6H, m), 1.69-1.57 (4H, m).
Calcd for C38H59N5O20: [M+H]+ 905, Found 906.
(37E) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[(3S)-4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-[[(4R)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메톡시카르보닐아미노]-4-옥소부타노일]아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 37E)의 합성
Figure pat00164
공정(37D)에서 합성한 화합물(2.7 g, 2.6 mmol)을 이용하고, 공정(35C)과 동일하게 하여, 비결정질 상의 목적물(0.77 g, 수율 27%)을 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.19-7.12 (1H, m), 6.96-6.85 (2H, m), 6.83-6.75 (1H, m), 6.16 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.41-5.34 (2H, m), 5.25-5.08 (2H, m), 4.66 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.51-3.87 (16H, m), 3.79-3.72 (1H, m), 3.64-3.14 (6H, m), 3.01-2.91 (1H, m), 2.68-2.57 (1H, m), 2.22-2.14 (6H, m), 2.10-1.93 (18H, m), 1.90-1.63 (4H, m), 1.42 (3H, s), 1.35 (3H, s).
Calcd for C45H69N5O24: [M+Na]+ 1086, Found 1086.
(37F) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[(3S)-4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-[[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]카르보닐아미노]-4-옥소부타노일]아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 37F)의 합성
Figure pat00165
공정(37E)에서 합성한 화합물(0.77 g, 0.72 mmol)을 이용하고, 공정(35D)과 동일하게 하여, 목적물 37F를 포함하는 조생성물(0.74 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C42H65N5O24: [M+H]+ 1024, Found 1024.
(37G) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[(3S)-4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]-4-옥소부타노일]아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 37G)의 합성
Figure pat00166
공정(37F)에서 합성한 화합물(0.74 g)을 이용하고, 공정(35E)과 동일하게 하여, 비결정질 상의 목적물(0.63 g, 수율 66%(2 공정))을 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.44-7.38 (2H, m), 7.33-7.09 (9H, m), 6.86-6.69 (6H, m), 6.22 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.38-5.33 (2H, m), 5.23-5.09 (2H, m), 4.66 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.54-4.42 (2H, m), 4.24-3.87 (16H, m), 3.79 (6H, s), 3.57-3.14 (8H, m), 2.97-2.87 (1H, m), 2.66-2.50 (1H, m), 2.19-2.13 (6H, m), 2.08-1.91 (10H, m), 1.87-1.65 (4H, m).
Calcd for C63H83N5O26: [M+Na]+ 1349, Found 1349.
(37H) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[(3S)-4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-[[(2R)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]-4-옥소부타노일]아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 37H)의 합성
Figure pat00167
공정(37G)에서 합성한 화합물(0.63 g, 0.48 mmol)을 이용하고, 공정(35F)과 동일하게 하여, 비결정질 상의 목적물(0.52 g, 수율 71%)을 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.45-7.38 (2H, m), 7.34-6.95 (9H, m), 6.88-6.62 (6H, m), 6.18-6.10 (1H, m), 5.39-5.32 (2H, m), 5.24-5.05 (2H, m), 4.69-4.60 (1H, m), 4.52-4.41 (2H, m), 4.34-2.90 (32H, m), 2.68-2.42 (3H, m), 2.20-2.14 (6H, m), 2.09-1.91 (18H, m), 1.87-1.66 (4H, m), 1.21-0.97 (12H, m).
(참고예 38)
(38A) 벤질 N-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필]카르바메이트(화합물 38A)의 합성
Figure pat00168
공정(37A)에서 합성한 화합물(12.4 g, 23 mmol)의 에틸 알코올(200 ㎖) 현탁 용액에 28% 나트륨메톡사이드메탄올 용액(0.85 ㎖)을 가하고, 실온에서 교반하였다. 반응의 진행에 따라 한층 선명한 용액이 된다. 60분간 방치하면 침전물이 얻어졌다. 침전물을 여과하고, 에틸 알코올, 디이소프로필 에테르로 세정한 후에 감압 하 건조하였다. 목적물 38A를 포함하는 조생성물(10 g)을 고체로서 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.60 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.40-7.17 (5H, m), 5.01 (2H, s), 4.62-4.55 (2H, m), 4.49 (1H, d, J = 4.2 Hz), 4.20 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.76-3.27 (6H, m), 3.08-2.99 (2H, m), 1.81 (3H, s), 1.66-1.56 (2H, m).
Calcd for C19H28N2O8: [M+Na]+ 435, Found 435.
(38B) N-[(2R,3R,4R,5R,6R)-2-(3-아미노프로폭시)-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-3-일]아세트아미드 염산염(화합물 38B)의 합성
Figure pat00169
공정(38A)에서 합성한 화합물(22.8 g, 55.3 mmol)을 테트라히드로푸란(280 ㎖)/1 N 염산(61 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (5.56 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 3.5시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하였다. 적량의 에틸 알코올을 가하고, 생성된 고형물을 여과하고, 에틸 알코올, 디에틸 에테르로 세정 후, 감압 하 건조하였다. 목적물 38B를 포함하는 조생성물(17 g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (D2O) δ: 4.27 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.90-3.50 (8H, m), 2.93 (2H, t, J = 7.0 Hz), 1.89 (3H, s), 1.82-1.75 (2H, m).
(38C) 9H-플루오렌-9-일메틸 N-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필]카르바메이트(화합물 38C)의 합성
Figure pat00170
공정(38B)에서 합성한 화합물(16.4 g, 52.1 mmol)을 테트라히드로푸란(200 ㎖)/순수(50 ㎖)에 용해하고, N,N-디이소프로필에틸아민(12.7 ㎖, 72.9 mmol)를 가하였다. 빙냉(氷冷) 하, N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐옥시]숙신이미드(21.1 g, 62.5 mmol)를 가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 디에틸 에테르(100 ㎖)를 가하고, 1시간 교반하였다. 고형물을 에틸 알코올, 아세트산에틸, 디에틸 에테르로 차례로 세정한 후에 감압 하 건조하여 목적물 38C를 포함하는 조생성물(22.9 g)을 얻었다.
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.89 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.69 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.61 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.42 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.33 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.24 (1H, t, J = 5.7 Hz), 4.60-4.57 (2H, m), 4.49 (1H, d, J = 4.2 Hz), 4.31-4.18 (4H, m), 3.76-3.28 (8H, m), 3.05-2.97 (2H, m), 1.81 (3H, s), 1.62-1.57 (2H, m).
Calcd for C26H32N2O8: [M+Na]+ 523, Found 523.
(38D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-6-[3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로폭시]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 38D)의 합성
Figure pat00171
공정(38C)에서 합성한 화합물(1.56 g, 3.1 mmol)의 피리딘(20 ㎖) 현탁액에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(1.27 g, 3.7 mmol)를 가하고, 실온에서 30분 교반하였다. 이어서, 무수 아세트산(1.18 ㎖, 12.5 mmol)을 가하고, 실온에서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, N,N-디이소프로필에틸아민(1.1 ㎖, 6.2 mmol), 에틸 알코올(2 ㎖)을 가하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 75:25-0:100, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 38D(2.8 g, quant.)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.77 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.62 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.43-7.18 (13H, m), 6.83-6.79 (4H, m), 6.03 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.55 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.14-5.03 (2H, m), 4.46-4.43 (3H, m), 4.24-4.04 (2H, m), 3.97-3.91 (1H, m), 3.85-3.82 (1H, m), 3.77 (6H, s), 3.72-3.71 (1H, m),3.54-3.33 (3H, m), 3.09-3.04 (2H, m), 2.03 (3H, s), 1.89 (6H, s), 1.65-1.56 (2H, m).
Calcd for C52H55NO12: [M+Na]+ 908, Found 909.
(38E) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-4-아세톡시-6-(3-아미노프로폭시)-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 38D)의 합성
Figure pat00172
공정(38D)에서 합성한 화합물(2.49 g, 2.8 mmol)의 디클로로메탄(8 ㎖) 용액에 피페리딘(0.45 ㎖, 4.5 mmol)을 가하고, 실온에서 교반하였다. 반응이 완료되지 않는 경우에는 적당히 피페리딘을 추가하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 NH-실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 100:0-85:15, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 38E(1.48 g, 수율 79%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.18 (9H, m), 6.83-6.80 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.51 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.64 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.98-3.90 (2H, m), 3.84-3.82 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.75-3.74 (1H, m), 3.58-3.56 (1H, m), 3.35 (1H, dd, J = 9.1, 5.4 Hz), 3.07 (1H, t, J = 8.5 Hz), 2.82-2.74 (4H, m), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.89 (3H, s), 1.74-1.69 (2H, m).
Calcd for C37H45NO10: [M+Na]+ 687, Found 687.
(참고예 39)
(39A) 벤질 2-[[2-벤질옥시-3-[(2-벤질옥시-2-옥소-에틸)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]아세테이트(화합물 39A)의 합성
Figure pat00173
2-벤질옥시-1,3-프로판디올(2.5 g, 14 mmol), 클로로포름산 4-니트로페닐(5.8 g, 29 mmol)을 테트라히드로푸란(100 ㎖)에 용해시키고, 피리딘(5.0 ㎖, 61.8 mmol)을 가하고, 실온에서 20분 교반하였다. 석출한 고체를 여과한 후에 테트라히드로푸란(70 ㎖)을 가하였다. 이어서, 글리신벤질 에스테르 TFA염(9.2 g, 33 mmol)과 N,N-디이소프로필에틸아민(9.6 ㎖, 55 mmol)을 가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 = 100:0-40:60, v/v)로 정제하여 검(gum) 상의 목적물 39A(6.5 g, 수율 84%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.37-7.33 (15H, m), 5.48 (2H, t, J = 5.4 Hz), 5.18 (4H, s), 4.64 (2H, s), 4.23 (4H, d, J = 5.4 Hz), 3.99 (4H, d, J = 5.4 Hz), 3.84 (1H, t, J = 5.4 Hz).
Calcd for C30H32N2O9: [M+H]+ 565, Found 565, [M+Na]+ 587, Found 587
(39B) 2-[[3-(카르복시메틸카르바모일옥시)-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]아세트산(화합물 39B)의 합성
Figure pat00174
공정(39A)에서 합성한 화합물 39A(7.3 g, 2.8 mmol)의 테트라히드로푸란(200 ㎖)/순수(50 ㎖)에 용해하였다. 20% 수산화팔라듐-활성탄소(약 50% 함수)(3 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 5시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 목적물 39B를 포함하는 조생성물(3.2g)을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
1H-NMR (D2O) δ: 4.21-4.14 (5H, m), 3.86 (4H, s).
(39C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐 l-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 39C)의 합성
Figure pat00175
공정(39B)에서 합성한 화합물 39B(0.31 g, 1.05 mmol), 공정(38E)에서 합성한 화합물 38E(1.47 g, 2.21 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(0.91 ㎖, 5.27 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(9 ㎖) 용액에 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(11.3 g, 29.6 mmol)를 가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 디에틸 에테르(합계 185 ㎖)에 적하하였다. 상징(上澄)의 용매를 제거한 후에 얻어진 젤리 상의 조생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 100:0-15:85, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 목적물 39C(1.05 g, 수율 63%)를 고체로서 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.17 (18H, m), 6.83-6.80 (8H, m), 6.70-6.27 (2H, m), 5.56-5.54 (2H, m), 5.10 (2H, d, J = 10.9 Hz), 4.49-3.02 (44H, m), 2.01 (6H, s), 1.96 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.80-1.63 (4H, m).
Calcd for C81H98N6O27: [M+Na]+ 1611, Found 1611
(39D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 39D)의 합성
Figure pat00176
공정(39C)에서 합성한 화합물 39C(0.47 g, 0.30 mmol)를 적량의 아세트산에틸/톨루엔(1/1)으로 공비한 후에 디클로로메탄(3 ㎖)에 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(210 ㎕, 1.18 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(79 ㎕, 0.36 mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 추가로, 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미다이트(20 ㎕, 0.09 mmol)를 가하고, 실온에서 15분간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:메탄올 = 100:0-85:15, v/v, 1% 트리에틸아민 함유)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 39D(0.34 g, 수율 64%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.17 (18H, m), 6.87-6.70 (8H, m), 6.29-6.06 (2H, m), 5.55 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.11 (2H, d, J = 10.9 Hz), 4.47-3.02 (47H, m), 2.63 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.02 (6H, s), 1.96 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.80-1.64 (4H, m), 1.17 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(40A) 벤질 2-[[3-벤질옥시-2-[(2-벤질옥시-2-옥소-에틸)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]아세테이트(화합물 40A)의 합성
Figure pat00177
2-벤질옥시-1,3-프로판디올 대신에 (+/-)-3-벤질옥시-1,2-프로판디올(1.0 g, 5.5 mmol)를 이용하고, 공정(39A)과 동일하게 하여, 목적물 40A(2.8 g, 수율 90%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.30 (15H, m), 5.37-5.35 (2H, m), 5.17-5.12 (5H, m), 4.56-4.51 (2H, m), 4.33-4.30 (2H, m), 4.03-3.94 (4H, m), 3.61 (2H, d, J = 5.4 Hz).
Calcd for C30H32N2O9: [M+Na]+ 587, Found 587
(40B) 2-[[2-(카르복시메틸카르바모일옥시)-3-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]아세트산(화합물 40B)의 합성
Figure pat00178
화합물 39A 대신에 화합물 40A(2.8 g, 5.0 mmol)를 이용하고, 공정(39B)과 동일하게 하여, 목적물 40B를 포함하는 조생성물(1.2 g)을 얻었다.
1H-NMR (D2O) δ: 4.32-4.19 (3H, m), 3.94-3.87 (4H, m), 3.81-3.71 (2H, m).
(40C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-3-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 40C)의 합성
Figure pat00179
화합물 39B 대신에 화합물 40B(0.31 g, 1.05 mmol)를 이용하고, 공정(39C)과 동일하게 하여, 목적물 40C(0.74 g, 수율 44%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.40-7.18 (18H, m), 6.81 (8H, dd, J = 9.1, 3.0 Hz), 6.70-6.50 (1H, m), 6.16-6.02 (1H, m), 5.56-5.54 (2H, br), 5.11-5.00 (2H, m), 4.53-2.99 (44H, m), 2.01 (6H, s), 1.95 (6H, s), 1.88 (6H, s), 1.77-1.68 (4H, m).
Calcd for C81H98N6O27: [M+Na]+ 1611, Found 1611
(40D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-3-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 40D)의 합성
Figure pat00180
화합물 39C 대신에 화합물 40C(0.31 g, 1.05 mmol)를 이용하고, 공정(39D)과 동일하게 하여, 목적물 40D(0.60 g, 수율 72%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.18 (18H, m), 7.13-6.97 (1H, m), 6.83-6.81 (8H, m), 6.58-6.36 (1H, m), 5.56-5.52 (2H, m), 5.10-5.04 (2H, m), 4.46-2.97 (47H, m), 2.65-2.63 (2H, m), 2.02 (6H, s), 1.95 (3H, s), 1.94 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.89 (3H, s), 1.77-1.67 (4H, m), 1.20-1.16 (12H, m).
(실시예 131)
HO-X16-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H) (서열번호 40)
X 부분을 X16으로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X16 부분은 참고예 36에서 합성한 화합물 36G를 이용해 1회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6261.97)
(실시예 132)
HO-X15-X15-X15-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X15로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X15 부분은 참고예 35에서 합성한 화합물 35F를 이용해 3회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6917.09)
(실시예 133)
X18-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X18로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X18 부분은 참고예 39에서 합성한 화합물 39D를 이용해 1회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6247.96)
(실시예 134)
HO-X15-X15-X15-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 44)
실시예 132에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.1을 이용하여 실시예 132와 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6919.09)
(실시예 135)
HO-X15-X15-X15-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-Ce2s-Um1t-H (서열번호 45)
실시예 132에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_006.1을 이용하여 실시예 132와 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 90번째에서 104번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6884.07)
(실시예 136)
HO-X15-X15-X15-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 42)
실시예 132에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 16e_001을 이용하여 실시예 132와 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 107번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7276.10)
(실시예 137)
HO-X15-X15-X15-Am1s-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 46)
실시예 132에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 17 e_001을 이용하여 실시예 132와 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 108번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 7636.19)
(실시예 138)
X18-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 44)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.1을 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6250.00)
(실시예 139)
X18-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2s-Um1t-H (서열번호 45)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_006.1을 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 90번째에서 104번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6214.96)
(실시예 140)
X18-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 42)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 16e_001을 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 107번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6607.02)
(실시예 141)
X18-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 47)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 16e_002를 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6609.03)
(실시예 142)
X18-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2s-Um1t-H (서열번호 48)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 16e_003을 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 90번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6586.00)
(실시예 143)
X18-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_001.5를 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6233.97)
(실시예 144)
X18-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 44)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5를 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6235.97)
(실시예 145)
X18-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2s-Um1t-H (서열번호 45)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_006.5를 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 90번째에서 104번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6200.94)
(실시예 146)
X18-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 42)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 16e_001.5를 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 107번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6593.02)
(실시예 147)
X18-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 47)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 16e_002.5를 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6595.01)
(실시예 148)
X18-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2s-Um1t-H (서열번호 48)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 16e_003.5를 이용하여 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 90번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6571.98)
(실시예 149)
HO-X16-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
실시예 131에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_001.5를 이용하여 실시예 131과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6247.99)
(실시예 150)
X19-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X19로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X19 부분은 참고예 40에서 합성한 화합물 40D를 이용해 1회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6247.99)
(실시예 151)
X17-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X 부분을 X17로 치환하고, 실시예 91과 동일하게 합성을 행하였다. X17 부분은 참고예 37에서 합성한 화합물 37H를 이용해 1회 축합하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6204.97)
(참고예 41)
(41A) 3-[[2-벤질옥시-3-[(3-벤질옥시-3-옥소-프로필)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]프로판산 벤질 에스테르(화합물 41A)의 합성
Figure pat00181
공정(39A)에서 사용한 글리신벤질 에스테르 TFA염 대신에 3-아미노 프로판산 벤질 에스테르 TFA염(2.4 g, 8.17 mmol)을 이용하고, 공정(39A)과 동일하게 하여, 목적물 41A(1.62 g, 수율 80%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.27 (15H, m), 5.21 (2H, br s), 5.14 (4H, s), 4.63 (2H, s), 4.24-4.10 (4H, m), 3.79-3.74 (1H, m), 3.48-3.44 (4H, m), 2.59 (4H, t, J = 6.0 Hz).
Calcd for C32H36N2O9: [M+H]+ 593, Found 593, [M+Na]+ 615, Found 615
(41B) 3-[[3-(2-카르복시에틸카르바모일옥시)-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]프로판산(화합물 41B)의 합성
Figure pat00182
공정(39B)에서 사용한 화합물 39A 대신에 화합물 41A(1.62 g, 2.73 mmol)를 이용하고, 공정(39B)과 동일하게 하여, 목적물 41B(0.89 g, quant.)를 얻었다.
1H-NMR (D2O) δ: 4.22-4.04 (5H, m), 3.46-3.32 (4H, m), 2.57 (4H, t, J = 6.7 Hz).
(41C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 41C)의 합성
Figure pat00183
공정(39C)에서 사용한 화합물 39B 대신에 화합물 41B(300 ㎎, 0.93 mmol)를 이용하고, 공정(39C)과 동일하게 하여, 목적물 41C(950 ㎎, 수율 63%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.32-7.24 (18H, m), 6.82-6.80 (8H, m), 6.64-6.61 (1H, br), 6.27-6.24 (1H, br), 5.91-5.88 (1H, br), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.10 (2H, d, J = 11.5 Hz), 4.46-3.05 (43H, m), 2.47-2.37 (4H, m), 2.02 (6H, s), 1.98 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.78-1.67 (4H, m).
Calcd for C83H102N6O27: [M+Na]+ 1638, Found 1638
(41D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 41D)의 합성
Figure pat00184
공정(39D)에서 사용한 화합물 39C 대신에 화합물 41C(945 ㎎, 0.58 mmol)를 이용하고, 공정(39D)과 동일하게 하여, 목적물 41D(638 ㎎, 수율 60%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.18 (18H, m), 6.85-6.78 (8H, m), 6.73-6.64 (1H, m), 6.40-6.23 (1H, m), 5.83-5.72 (1H, m), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.13-5.04 (2H, m), 4.45-4.35 (2H, m), 4.22-3.30 (40H, m), 3.22-3.03 (4H, m), 2.64 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.54-2.32 (4H, m), 2.02 (6H, s), 2.00-1.95 (6H, m), 1.90 (6H, s), 1.83-1.59 (4H, m), 1.20-1.10 (12H, m).
(참고예 42)
(42A) 4-[[2-벤질옥시-3-[(4-벤질옥시-4-옥소-부틸)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]부탄산 벤질 에스테르(화합물 42A)의 합성
Figure pat00185
공정(39A)에서 사용한 글리신 벤질 에스테르 TFA염 대신에 4-아미노 부탄산 벤질 에스테르 TFA염(1.30 g, 4.21 mmol)를 이용하고, 공정(39A)과 동일하게 하여, 목적물 42A(0.85 g, 수율 78%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.27 (15H, m), 5.11 (4H, s), 4.80 (2H, br s), 4.63 (2H, s), 4.19-4.15 (4H, m), 3.77-3.75 (1H, m), 3.23-3.18 (4H, m), 2.40 (4H, t, J = 7.3 Hz), 1.88-1.81 (4H, m).
Calcd for C34H40N2O9: [M+H]+ 621, Found 622, [M+Na]+ 643, Found 644
(42B) 4-[[3-(3-카르복시프로필카르바모일옥시)-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]부탄산(화합물 42B)의 합성
Figure pat00186
공정(39B)에서 사용한 화합물 39A 대신에 화합물 42A(0.85 g, 1.4 mmol)를 이용하고, 공정(39B)과 동일하게 하여, 목적물 42B(0.49 g, quant.)를 얻었다.
1H-NMR (D2O) δ: 4.19-4.05 (5H, m), 3.19-3.12 (4H, m), 2.36-2.27 (4H, m), 1.83-1.73 (4H, m).
(42C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[4-[[3-[[4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-4-옥소-부틸]카르바모일옥시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]부타노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 42C)의 합성
Figure pat00187
공정(39C)에서 사용한 화합물 39B 대신에 화합물 42B(300 ㎎, 0.86 mmol)를 이용하고, 공정(39C)과 동일하게 하여, 목적물 42C(1.16 g, 수율 82%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.31-7.24 (18H, m), 6.82-6.80 (8H, m), 6.68-6.65 (3H, m), 5.91-5.84 (1H, m), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.10 (2H, d, J = 10.9 Hz), 4.45 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.23-3.12 (40H, m), 2.31-2.22 (4H, m), 2.01 (6H, s), 1.98 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.81-1.68 (8H, m).
Calcd for C85H106N6O27: [M+Na]+ 1666, Found 1667
(42D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-4-옥소-부틸]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]부타노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라히드로피란-3-일]아세테이트(화합물 42D)의 합성
Figure pat00188
공정(39D)에서 사용한 화합물 39C 대신에 화합물 42C(1.16 g, 0.71 mmol)를 이용하고, 공정(39D)과 동일하게 하여, 목적물 42D(795 ㎎, 수율 61%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.40-7.17 (18H, m), 6.85-6.77 (8H, m), 6.72-5.65 (5H, m), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.11-5.03 (2H, m), 4.46-4.35 (2H, m), 4.25-3.02 (42H, m), 2.65 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.39-2.16 (4H, m), 2.02 (6H, s), 1.99-1.94 (6H, m), 1.90 (6H, s), 1.87-1.59 (8H, m), 1.18 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(참고예 43)
(43A) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-(5-아미노펜톡시)테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트 염산염(화합물 43A)의 합성
Figure pat00189
공정(21A)에서 합성한 화합물 21A(3.87 g, 6.83 mmol)를 테트라히드로피란(32 ㎖)/1 N 염산(8 ㎖)에 용해하였다. 10% 팔라듐/탄소(wet) (2 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 목적물 43A(3.1 g, 수율 97%)의 조생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 이용하였다.
Calcd for C19H32N2O9: [M+H]+ 433, Found 433.
(43B) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜틸카르바모일옥시]-2-벤질옥시프로폭시]카르바모일아미노]펜톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 43B)의 합성
Figure pat00190
2-벤질옥시-1,3-프로판디올(600 ㎎, 3.29 mmol), 클로로포름산 4-니트로페닐(1.39 g, 6.91 mmol)를 테트라히드로푸란(22 ㎖)에 용해시키고, 피리딘(1.1 ㎖, 13.2 mmol)을 가하고, 실온에서 15분 교반하였다. 석출한 고체를 여과한 후에 테트라히드로푸란(16 ㎖)을 가하였다. 이어서, 공정(43A)에서 합성한 화합물(43A) (3.09 g, 6.59 mmol)의 테트라히드로푸란(15 ㎖)/디클로로메탄(5 ㎖) 용액과 N,N-디이소프로필에틸아민(3.4 ㎖, 19.8 mmol)을 가하고, 40℃에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 유거하였다. 디클로로메탄을 가하고, 유기층을 0.5 N 염산, 포화 식염수, 0.2 N 수산화나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 100:0-90:10, v/v)로 정제하여 목적물 43B를 메인에 포함하는 혼합물(2.1 g)을 얻었다.
Calcd for C50H74N4O23: [M+H]+ 1099, Found 1099. [M+Na]+ 1121, Found 1121.
(43C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜틸카르바모일옥시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 43C)의 합성
Figure pat00191
공정(43B)에서 얻어진 43B를 포함하는 혼합물(2.1 g)을 테트라히드로피란(20 ㎖)/순수(1 ㎖)에 용해하였다. 1 N 염산(0.38 ㎖), 10% 팔라듐/탄소(wet) (1 g)를 가하고, 수소 분위기 하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 유거하여 조생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸:메탄올 = 100:0-90: 15, v/v)로 정제하여 목적물 43C(1.38 g,수율 72%)를 고체로서 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.10-5.96 (1H, m), 5.38-4.94 (6H, m), 4.70-4.64 (2H, m), 4.23-3.44 (19H, m), 3.20-3.15 (4H, m), 2.15 (6H, s), 2.05 (6H, s), 2.01 (6H, s), 1.97 (6H, s), 1.67-1.38 (12H, m).
Calcd for C43H68N4O23: [M+H]+ 1009, Found 1009. [M+Na]+ 1031, Found 1031.
(43D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜틸카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르바모일아미노]펜톡시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 43D)의 합성
Figure pat00192
공정(39D)에서 사용한 화합물 39C 대신에 화합물 43C(1.38 g, 1.37 mmol)를 이용하고, 공정(39D)과 동일하게 하여, 목적물 43D(850 ㎎, 수율 51%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.95-5.89 (1H, m), 5.38-5.26 (4H, m), 5.20-5.16 (1H, m), 5.00-4.95 (1H, m), 4.71-4.68 (2H, m), 4.36-3.44 (22H, m), 3.15 (4H, q, J = 6.4 Hz), 2.67 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.15 (6H, s), 2.05 (6H, s), 2.01 (6H, s), 1.96 (6H, s), 1.67-1.33 (12H, m), 1.18 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(참고예 44)
(44A) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-히드록시프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 44A)의 합성
Figure pat00193
공정(41B)에서 합성한 화합물 41B(200 ㎎, 0.62 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(2 ㎖) 용액에 O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄테트라플루오로붕산염(411 ㎎, 1.37 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(0.32 ㎖, 1.86 mmol)을 가하고, 실온에서 20분 교반하였다. 이 반응액을 공정(37B)에서 합성한 화합물 37B(657 ㎎, 1.49 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(2 ㎖) 용액에 가한 후에 N,N-디이소프로필에틸아민(0.32 ㎖, 1.86 mmol)을 가하고, 실온에서 60분 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 디에틸 에테르(합계 80 ㎖)에 적하하였다. 상징의 용매를 제거한 후에 얻어진 젤리 상의 조생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 100:0-75:25, v/v)로 정제하여 비결정질 상의 목적물 44A(408 ㎎, 수율 60%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.76 (2H, br), 6.69-6.63 (2H, m), 5.96 (1H, br), 5.36 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.13-5.08 (2H, m), 4.53 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.25-3.07 (27H, m), 2.51-2.44 (4H, m), 2.17 (6H, s), 2.06 (6H, s), 2.02 (6H, s), 2.00 (6H, s), 1.86-1.73 (4H, m).
Calcd for C45H70N6O25: [M+H]+ 1095, Found 1096. [M+Na]+ 1117, Found 1117.
(44B) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시테트라히드로피란-2-일]메틸아세테이트(화합물 44B)의 합성
Figure pat00194
공정(39D)에서 사용한 화합물 39C 대신에 화합물 44A(1.53 g, 1.40 mmol)를 이용하고, 공정(39D)과 동일하게 하여, 목적물 44B(510 ㎎, 수율 28%)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.60-6.44 (4H, m), 5.76-5.68 (1H, m), 5.36 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.09-5.05 (2H, m), 4.50-4.45 (2H, m), 4.26-3.37 (28H, m), 3.17 (2H, br), 2.67 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.52-2.42 (4H, m), 2.17 (6H, s), 2.05 (6H, s), 2.02 (6H, s), 1.99 (6H, s), 1.81-1.70 (4H, m), 1.18 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(실시예 152)
X20-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 143과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_001.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6261.98)
(실시예 153)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 44)
X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 144와 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_005.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6264.00)
(실시예 154)
X20-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 42)
X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 146과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 16e_001.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 107번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6621.04)
(실시예 155)
X20-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 47)
X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 147과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 16e_002.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6623.05)
(실시예 156)
X21-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X18 부분을 X21로 치환하고, 실시예 143과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_001.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6290.02)
(실시예 157)
X22-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 40)
X18 부분을 X22로 치환하고, 실시예 143과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_001.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6175.96)
(실시예 158)
X22-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 44)
X18 부분을 X22로 치환하고, 실시예 144와 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_005.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6177.98)
(실시예 159)
X22-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열번호 42)
X18 부분을 X22로 치환하고, 실시예 146과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 16e_001.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 107번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6535.03)
(실시예 160)
X22-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 47)
X18 부분을 X22로 치환하고, 실시예 147과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 16e_002.5이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6537.05)
(시험예 1) 배양 세포를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가
293A 세포(인간 태아 신장 세포)의 배양
이하와 같이 하여 293A 세포(R705-07 invitrogen)의 배양을 행하였다.
293A 세포를 유지 배지(DMEM, 10% FBS)에서 유지 배양하였다. 실험에서는 6 웰 플레이트에 2×105 세포/웰, 12 웰 플레이트에 1×105 세포/웰의 밀도로 세포를 파종하고, 다음날 후술한 것과 같이 실시예의 화합물, 및 플라스미드 벡터를 동시에 도입하여 평가에 이용하였다.
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터 제작
이하와 같이 하여 인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC, pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)를 제작하였다.
인간 복수 조직 cDNA 패널을 주형으로 하고, 하기 G6PC cDNA 증폭 프라이머를 이용하여 G6PC cDNA를 증폭 후, 추가로 G6PC cDNA IF 프라이머로 증폭하였다. 증폭한 단편을 InFusion System에 의해 pcDNA3.1의 BamHI 사이트에 삽입하였다(pcDNA hG6PC).
G6PC cDNA 증폭 프라이머:
포워드(forward) 프라이머 5'-ATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCC-3' (서열번호 49)
리버스(reverse) 프라이머 5'-ATTCCACGACGGCAGAATGGATGGC-3' (서열번호 50)
G6PC IF 프라이머:
포워드 프라이머 5'-TACCGAGCTCGGATCCACCACCAAGCCTGGAATAACTGC-3' (서열번호 51),
리버스 프라이머 5'-CTGGACTAGTGGATCCTGGCATGGTTGTTGACTTTAAAC-3' (서열번호 52)
인간 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 G6PC Int4 증폭 프라이머를 이용하여 G6PC 인트론 4와 엑손 5를 일부 포함하는 영역을 증폭하고, 추가로 G6PC 인트론 4를 G6PC Int4 IF 프라이머로 증폭하였다. 또, STEP1-1 작성의 pcDNA hG6PC를 하기 hG6PC 벡터 IF 프라이머를 이용해 증폭하였다. 또한, InFusion 프라이머에는 엑손 5 내의 c.648G>T 변이를 도입하였다. 양 단편을 InFusion System에 의해 연결하고, pcDNA hG6PC 내에 G6PC 인트론 4 서열을 삽입하였다(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4).
G6PC Int4 증폭 프라이머:
포워드 프라이머 5'-TCTGGGCTGTGCAGCTGAATGTCTG-3' (서열번호 53)
리버스 프라이머 5'-GTAGGGGATGACACTGACGGATGCC-3' (서열번호 54)
G6PC Int4 IF 프라이머:
포워드 프라이머 5'-CTGGAGTCCTGTCAGGTATGGGC-3' (서열번호 55)
리버스 프라이머 5'-AGCTGAAAAGGAAGAAGGTAATGAG-3' (서열번호 56)
hG6PC 벡터 IF 프라이머:
포워드 프라이머 5'-TCTTCCTTTTCAGCTTCGCCATCGG-3' (서열번호 57)
리버스 프라이머 5'-CTGACAGGACTCCAGCAACAAC-3' (서열번호 58)
실시예의 화합물, 및 플라스미드 벡터의 동시형질감염
이하와 같이 하여, 실시예의 화합물, 및 플라스미드 벡터를 동시형질감염 하였다.
하기 A 액과 B 액을 제작 후, 혼합하였다.
6 웰 플레이트에서 실시한 경우, 1 웰 당 A 액으로서 250 ㎕ Opti-MEM Medium(gibco), 0.50 ㎕ 플라스미드 벡터(1 ㎎/㎖), 4.0 ㎕(최종: 20 nM) 실시예에서 제조한 화합물(12.5 μM)을 준비하고, B 액으로서 250 ㎕ Opti-MEM Medium(gibco), 6.0 ㎕ Lipofectamine2000(Invitrogen)을 준비하고, A 액과 B 액을 혼합하였다. 12 웰 플레이트에서 실시한 경우, 1 웰 당 A 액으로서 125 ㎕ Opti-MEM Medium(gibco), 0.25 ㎕ 플라스미드 벡터(1 ㎎/㎖), 2.0 ㎕(최종: 20 nM) 실시예에서 제조한 화합물(12.5 μM), B 액으로서 125 ㎕ Opti-MEM Medium(gibco), 3.0 ㎕ Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 준비하고, A 액과 B 액을 혼합하였다.
상기의 혼합액을 20분간 실온에서 인큐베이션 후, 계대 다음날의 세포에 첨가하였다(동시형질감염). 첨가 6시간 후에 신선한 유지 배지와 교환하고, 상기 혼합액 첨가로부터 24시간 CO2 인큐베이터로 인큐베이션하였다.
RNA 추출(in vitro)
이하와 같이 하여 RNA의 추출을 행하였다.
동시형질감염 후 24시간 인큐베이션한 세포를 냉각 PBS에서 1회 세정하였다. RNeasy 미니 키트 혹은 RNeasy 96 키트(Qiagen)의 세포 용해액을 1 웰에 대해 300 ㎕씩 가하고, 실온에서 5분간 인큐베이션 후 회수하였다. 회수액에 대하여, DNase 처리를 포함하는 키트의 프로토콜에 따라 RNA 정제를 행하였다. DNase 처리에는 RNase-Free DNase 세트(Qiagen 89254)를 이용하였다. 정제·용출한 RNA는 후술하는 역전사 반응을 행하였다.
역전사 반응
이하와 같이 하여 역전사 반응을 행하였다.
추출 RNA를 25∼100 ㎎/㎖로 조정 후, High Capacity RNA-to-cDNA 키트(Applied biosystems)를 이용하여 1 샘플 당 10 ㎕ 버퍼 믹스, 1 ㎕ 효소 믹스, 9 ㎕ 정제수, +추출 RNA가 되도록 혼합하여 역전사 반응을 행하였다(37℃ 60 분, 95℃ 5 분, 4℃ Hold).
역전사 반응 산물 20 ㎕에 대해 정제수 80 ㎕로 5배 희석하여 -30℃에서 보존하였다.
qRT-PCR(SYBR Green)
하기와 같이 qRT PCR 프라이머(SYBR Green)를 설계하였다.
수복(repaired) hG6PC 프라이머(SYBR):
포워드 프라이머 5'-TTGTGGTTGGGATTCTGGGC-3' (서열번호 59)
리버스 프라이머 5'-ATGCTGTGGATGTGGCTGAA-3' (서열번호 60)
hActin 프라이머(SYBR):
포워드 프라이머 5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3' (서열번호 61)
리버스 프라이머 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3' (서열번호 62)
또 PCR 반응액을 1 웰 당 5 ㎕ 2X FAST SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems), 2 ㎕ 정제수, 1 ㎕ 프라이머 믹스(10 μM), 2 ㎕ cDNA(5배 희석제)를 현탁하고, viia7(Applied Biosystems)으로 PCR 반응을 행하였다(프로그램: SYBR Green Regents, FAST, include Melt curve)).
qRT-PCR(Taqman assay)
하기와 같이 수복 hG6PC 프라이머 세트, 총 hG6PC 프라이머 세트를 설계하고, 20X 프라이머 프로브 믹스(프라이머 농도: 1000 nM, 프로브 농도: 250 nM)를 조정하였다. hActin 프라이머 세트, mActin 프라이머 세트는 원액인 채로 사용하였다.
수복 hG6PC 프라이머 세트(Taqman):
포워드 프라이머 5'-GCTGCTCATTTTCCTCATCAAGTT-3' (서열번호 63)
리버스 프라이머 5'-TGGATGTGGCTGAAAGTTTCTGTA-3' (서열번호 64)
프로브 5'-TCCTGTCAGGCATTGC-3' FAM (서열번호 65)
hActin 프라이머 세트(Taqman): ABI Hs01060665_g1 FAM
mActin 프라이머 세트(Taqman): ABI Mm02619580_g1 FAM
18s 프라이머 세트(Taqman): ABI Hs99999901_s1 FAM
또 1 웰 당 5 ㎕ 2X Taqman Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems), 2.5 ㎕ 정제수, 0.5 ㎕ 20X 프라이머 프로브 믹스(10 μM), 2 ㎕ cDNA(5배 희석제)를 현탁하여 PCR 반응액을 조정(1 튜브 당)하고, viia7 또는 Quantstadio7(Applied Biosystems사)으로 PCR 반응을 행하였다(프로그램: Taqman regents, FAST).
LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 정량
이하와 같이 하여 단백질의 추출 및 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 LC-MS/MS 정량을 행하였다.
단백질 용해물(lysate)의 추출, 조정
동시형질감염 후 24시간 인큐베이션한 세포를 냉각 PBS에서 1회 세정하였다. RIPA 버퍼(나카라이테스크)를 1 웰에 대해 100 ㎕씩 가하고, 빙상(氷上)에서 인큐베이션 후 회수하였다. 회수액에 대하여, 빙상에서 20분간 인큐베이트 후, 10000 g, 10분, 4℃에서 원심하여 상청(上淸)을 회수하였다. 상청에 대해 총 단백질량을 측정하고, 0.4 ㎎/㎖가 되도록 조정하여 단백질 용해물로 하였다.
시약의 조정
DS264_100u: 안정 동위체 표지 펩티드 GLGVD(L*) LWT(L*) EK(Scrum, L*: L-루이신-13C6, 15N)를 50% cn(정제수/아세토니트릴)로 100 μM로 조정하였다.
DS266_100u: 안정 동위체 표지 펩티드 WCEQPEW(V*) HIDTTPFAS(L*) LK(L*: L-루이신-13C6, 15N, V*: L-발린-13C5, 15N)를 50% cn(정제수/아세토니트릴)로 100 μM로 조정하였다.
DS268_100u: 안정 동위체 표지 펩티드 NLGTLFG(L*) GLA(L*) NSSMYR(Scrum, L*: L-루이신-13C6, 15N)를 50% cn(정제수/아세토니트릴)로 100 μM로 조정하였다.
IS 용액-1: 50 ㎖ 아세토니트릴, 0.5 ㎖ 트리프루오로아세트산(나카라이), 20 ㎕ DS264_100u, 20 ㎕ DS266_100u, 20 ㎕ DS268_100u를 현탁하였다.
IS 용액-2: 50 ㎖ 아세토니트릴, 50 ㎖ 정제수, 0.5 ㎖ 트리프루오로아세트산(나카라이), 20 ㎕ DS264_100u, 20 ㎕ DS266_100u, 20 ㎕ DS268_100u를 현탁하였다.
0.1 M Tris-HCl: 5 ㎖ 1M Tris-HCl 버퍼 용액(pH 8.0)을 45 ㎖의 정제수에 첨가 현탁하였다.
우레아(Urea)/EDTA 용액: 2.4 g 우레아(나카라이), 100 ㎕ 0.5 M EDTA(sigma-aldrich)를 4.9 ㎖ 0.1 M Tris-HCl에 첨가, 현탁하였다.
DTT 용액(20 ㎎/㎖): 20 ㎎ DTT(디티오트레이톨) (Wako)를 1 ㎖의 정제수에 첨가 현탁하였다.
IAA 용액(50 ㎎/㎖): 50 ㎎ IAA(아이오도아세트아미드) (sigma-aldrich)를 1 ㎖ 정제수에 첨가 현탁하였다.
트립신/LysC 믹스 용액(200 ㎍/㎖): 20 ㎍ 트립신/Lys-C 믹스(1 바이알) (Promega)를 100 ㎕ 재현탁 버퍼(Promega)에 첨가 현탁하였다.
소화(消化) 처리
하기에 따라 효소 소화 반응을 실시하고, LC-MS 인젝션 샘플을 조정하였다(1 샘플 당).
20 ㎕ 우레아/EDTA 용액, 10 ㎕ 단백질 용해물, 10 ㎕ DTT 용액을 현탁하고, 60분간 실온에서 정치한 후, 2.5 ㎕ IAA 용액을 첨가 현탁하고, 60분간 실온에서 정치 하였다. 그 후, 현탁액에 대하여 112.5 ㎕ 0.1M Tris-HCl와 2.5 ㎕ 트립신/LysC 믹스 용액을 첨가 현탁하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 150 ㎕ IS 용액-1, 300 ㎕ IS 용액-2를 첨가하여 LC-MS 인젝션 샘플로 하였다.
LC-MS 분석, 시료 중 농도 측정
Ultimate 3000(Thermo Fisher), Q Exactive plus(Thermo Fisher)를 이용하여 LC-MS 인젝션 샘플의 LC-MS 분석을 실시하였다. 내부 표준법을 이용하여 질량 범위(Mass range) 820.0632-820.0782(m/z)에 의해 하기 펩티드(DS265)의 시료 중 농도를 산출하였다.
DS265: WCEQPEWVHIDTTPFASLLK (서열번호 66)
G6PC 효소 활성의 측정
하기와 같이 추출한 각 검체의 미크로솜 화분(畵分)의 G6PC의 활성 측정을 실시하였다.
(1) 시약의 조제
버퍼 A: 100 mM BIS-TRIS 버퍼, pH 6.5 37℃
180 ㎖ 정제수에 4.2 g BIS-TRIS(Sigma-Aldrich)를 첨가. 염산, 정제수를 이용하여 pH 6.5, 37℃, 200 ㎖로 조정.
버퍼 B: HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, 수크로오스 250 mM(4℃ 보존)
180 ㎖ 정제수에 4.0 ㎖ 1.0 M HEPES(Gibco), 0.4 ㎖ 0.5 M EDTA(USB), 17 g 수크로오스(Wako)를 첨가. 정제수를 200 ㎖로 조정 후, 0.22 μm 필터의 투과 처리.
기질: 200 mM 글루코오스 6-포스페이트(4℃ 보존)
88.65 ㎖ 정제수에 5 ㎎ D-글루코오스 6-포스페이트 나트륨염(Sigma-Aldrich)을 첨가.
TCA: 20% 트리클로로아세트산(실온, 차광 보존)
40 ㎖ 정제수에 10 ㎖ 트리클로로아세트산 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가.
표준물: 인 표준 용액, 20 ㎍/㎖(Sigma-Aldrich) (4℃ 보존)
5 M 황산 용액(실온, 차광 보존)
67 ㎖ 정제수에 25 ㎖ 황산(Aldrich 258105)을 첨가.
TSCR: Taussky-Shorr Color Reagent(사용시 조제)
5 M 황산 용액 20 ㎖에 2.4 ㎎ 암모늄 몰리브데이트 테트라히드레이트(Sigma-Aldrich) 첨가, 용해액을 140 ㎖의 정제수에 첨가. 추가로, 10 g 황산제일철 칠수화물(Sigma-Aldrich)을 첨가하고, 용해할 때까지 교반 후, 정제수로 200 ㎖까지 메스 업.
(2) 미크로솜 화분의 정제
하기 절차에 따라 미크로솜 화분을 정제, 조정하였다.
실시예 화합물, 및 플라스미드 벡터의 동시형질감염을 행한 293A 세포(6 웰 플레이트 내)를 빙냉 PBS로 세척한 후, 빙냉 버퍼 B를 각 웰에 첨가, 세포 스크레이퍼로 회수하였다. 회수한 세포를 빙상에서 다운스 호모게나이저를 이용해 충분히 균질화한 후, 1000 g 10분 4℃에서 원심하여 상청을 회수하였다. 그 상청을 13000 g 60분 4℃에서 원심하여 상청을 제거, 펠렛(pellet)을 버퍼 B로 현탁하였다. 현탁액의 단백 농도가 일정하게 되도록(0.3∼1.0 ㎎/㎖가 되도록) 버퍼 B로 조정을 행하였다.
(3) G6PC 효소 활성 측정
단백 농도를 조정한 미크로솜 화분(샘플)의 G6PC 효소 활성을 하기 방법으로 측정하였다. 시약의 호칭은 (1)에 준하였다.
각 샘플에 대해 테스트(Test)와 블랭크(Blank)를 제작하였다. 테스트에서는 150 ㎕ 버퍼 A, 50 ㎕ 기질을 현탁하고, 5분간 37℃에서 인큐베이트하였다. 거기에 5 ㎕의 샘플을 첨가, 현탁하고, 정확하게 5분간 37℃에서 인큐베이트한 후, 45 ㎕ TCA를 첨가하였다. 잘 현탁한 후, 5분간 25℃에서 인큐베이트하였다. 블랭크에서는 150 ㎕ 버퍼 A, 50 ㎕ 기질을 현탁하고, 5분간 37℃에서 인큐베이트하였다. 거기에 5 ㎕의 샘플, 45 ㎕ TCA를 현탁하고, 25℃에서 인큐베이트한 것을 첨가하였다. 각 샘플의 테스트와 블랭크를 4000 g, 10분간, 실온에서 원심하고, 그 상청을 별도의 튜브에 분주하였다. 각 상청 100 ㎕에 대하여 100 ㎕의 TSCR를 첨가, 실온에서 5분간 인큐베이트한 후, 660 nm의 흡광도를 플레이트 리더(Spectra MaX M4 Molecular Devices)로 측정하였다. 표준물의 희석 계열을 이용하여 산출한 검량선, 각 샘플의 테스트와 블랭크의 흡광도, 샘플의 단백 농도로부터 G6PC 효소 활성(U/㎎: 샘플 중의 총 단백질 1 ㎎가 1분간에 분해하는 G6P 양(μmol))을 산출하였다.
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)를 이용한 실시예 화합물에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 수복 평가 (1)
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)와 올리고뉴클레오티드(21e_001∼012, 및 21m_001∼012)의 동시형질감염을 행하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(SYBR Green)에서 평가하였다. 도 5A 및 5B에 나타낸 것과 같이, 21e_002∼012, 및 21m_002∼012의 화합물로 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다. 또, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산을 조사한 결과, 도 6A 및 6B에 나타낸 것과 같이, 21e_002∼012, 및 21m_002∼012의 화합물에 있어서, 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산이 확인되었다. 추가로, G6PC 효소 활성 측정한 결과, 도 7A 및 7B에 나타낸 것과 같이, 21e_002∼012, 및 21m_002∼012의 화합물에 있어서, G6PC 효소 활성이 확인되었다.
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)를 이용한 실시예 화합물에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 수복 평가 (2)
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)와 올리고뉴클레오티드(21e_001∼006, 및 21e_013∼022)의 동시형질감염을 행하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(SYBR Green)로 평가하였다. 도 9에 나타낸 것과 같이, 21e_002∼006, 및 21e_015∼022의 화합물로 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다. 또, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산을 조사한 결과, 도 10에 나타낸 것과 같이, 21e_002∼006, 및 21e_015∼022의 화합물에 있어서, 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산이 확인되었다.
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)를 이용한 실시예 화합물에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 수복 평가 (3)
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)와 올리고뉴클레오티드(18e_001∼017, 및 18m_001∼017)의 동시형질감염을 행하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(SYBR Green)로 평가하였다. 도 13A 및 13B에 나타낸 것과 같이, 18e_005∼017, 및 18m_005∼017의 화합물로 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다. 또, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산을 조사한 결과, 도 14A 및 14B에 나타낸 것과 같이, 18e_005∼017, 및 18m_005∼017의 화합물에 있어서, 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산이 확인되었다.
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)를 이용한 실시예 화합물에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 수복 평가 (4)
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)와 올리고뉴클레오티드(18e_018∼031)의 동시형질감염을 행하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(SYBR Green)로 평가하였다. 도 16A에 나타낸 것과 같이, 18e_022∼026, 및 18e_031의 화합물로 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다. 또, LC-MS/MS에 의한 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산을 조사한 결과, 도 16B에 나타낸 것과 같이, 18e_022∼026, 및 18e_031의 화합물에 있어서, 정상 인간 G6PC 특이적 펩티드의 생산이 확인되었다.
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)를 이용한 실시예 화합물에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 수복 평가 (5)
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)와 올리고뉴클레오티드(21e_002, 18e_005, 21m_002, 18e_005, 18m_022, 15e_001, 15ed_001, 18e_008, 18e_025, 18m_008, 15e_002, 15ed_002, 및 대조군으로서 국제공개 제2004/048570의 실시예 93의 화합물)의 동시형질감염을 행하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(SYBR Green)로 평가하였다. 도 18에 나타낸 것과 같이, 21e_002, 18e_005, 21m_002, 18e_005, 18m_022, 15e_001, 15ed_001, 18e_008, 18e_025, 18m_008, 15e_002, 및 15ed_002의 화합물로 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
(시험예 2) 모델 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가
마우스의 작출
벡터의 작성
하기 절차에 따라 G6PC KI 벡터를 제작하였다.
마우스 게놈 DNA를 주형으로 하기 mG6PC 5' arm 증폭 프라이머를 이용하여 G6PC 5' arm 영역을 증폭하였다. 추가로, mG6PC 5' arm IF 프라이머로 증폭 후, pBluescriptII(+/-)의 XhoI 사이트에 삽입하였다(G6PC 5' arm 벡터).
mG6PC 5' arm 증폭 프라이머:
포워드 프라이머 5'-GGGAAACATGCATGAAGCCCTGGGC-3' (서열번호 67)
리버스 프라이머 5'-TCCCTTGGTACCTCAGGAAGCTGCC-3' (서열번호 68)
mG6PC 5' arm IF 프라이머:
포워드 프라이머 5'-CGGGCCCCCCCTCGAAAACTAGGCCTGAAGAGATGGC-3' (서열번호 69)
리버스 프라이머 5'-TACCGTCGACCTCGAGGGTTGGCCTTGATCCCTCTGCTA-3' (서열번호 70)
다음에 마우스 게놈 DNA를 주형으로 하기 mG6PC 3' arm 증폭 프라이머를 이용하여 G6PC 3' arm 영역을 증폭하였다. 추가로, mG6PC 3' arm IF 프라이머로 증폭 후, G6PC 5' arm 벡터의 NotI 사이트에 삽입하였다(G6PC 5'+3' arm 벡터).
mG6PC 3' arm 증폭 프라이머:
포워드 프라이머 5'-GGTTGAGTTGATCTTCTACATCTTG-3' (서열번호 71)
리버스 프라이머5'-GCAAGAGAGCCTTCAGGTAGATCCC-3' (서열번호 72)
mG6PC 3' arm IF 프라이머:
포워드 프라이머 5'-AGTTCTAGAGCGGCCGCCCATGCAAAGGACTAGGAACAAC-3' (서열번호 73)
리버스 프라이머 5'-ACCGCGGTGGCGGCCAATGTTGCCTGTCTTCCTCAATC-3' (서열번호 74)
전술한 pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4를 주형으로 하고, 하기 hG6PC + Int4 IF 프라이머를 이용하여 hG6PC (c.648G>T) + 인트론 4를 증폭하였다. 또, G6PC 5'+3' arm 벡터를 주형으로 하고, 하기 Arm 벡터 IF 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 양 단편을 InFusion System을 이용해 연결하여 G6PC KI 벡터를 작성하였다.
hG6PC + Int4 IF 프라이머:
포워드 프라이머 5'-GGCCAACCCTGGAATAACTGCAAGGGCTCTG-3' (서열번호 75)
리버스 프라이머 5'-TTGCATGGTTGTTGACTTTAAACACCGAAGA-3' (서열번호 76)
Arm 벡터 IF 프라이머:
포워드 프라이머 5'-TCAACAACCATGCAAAGGACTAGGAACAAC-3' (서열번호 77)
리버스 프라이머 5'-ATTCCAGGGTTGGCCTTGATCCCTCTGCTA-3' (서열번호 78)
pSPgRNA(addgene)의 gRNA 서열 도입 영역에 하기 KI 5' gRNA, KI 3' gRNA 서열을 도입하여 pSPgRNA(KI 5'), pSPgRNA(KI 3')를 제작하였다.
KI 5' gRNA: 5'-GGGATCAAGGCCAACCGGCTGG-3' (서열번호 79)
KI 3' gRNA: 5'-TAAAGTCAACCGCCATGCAAAGG-3' (서열번호 80)
마이크로인젝센(microinjection)
각종 벡터를 멸균 증류수를 이용하여 최종 농도가 G6PC KI 벡터 10 ng/㎕, pSPgRNA(KI 5') 5 ng/㎕, pSPgRNA(KI 3') 5 ng/㎕, pSPCas9(addgene) 5 ng/㎕가 되도록 조정한 후, MILLEX-GV 주사기 여과기(밀리포어)를 통과한 것을 C57BL/6J 마우스 수정란의 전핵 충분히 팽창한 정도까지(약 2 pL) 인젝션하였다. 그 수정란을 수용체(recipient) C57BL/6 J마우스의 난관에 이식하여 F0 마우스를 취득하였다.
지노타이핑(Genotyping), F1 계통화
이하의 절차로 지노타이핑을 실시, F1 계통화를 행하였다.
F0 마우스의 꼬리 조직으로부터 핵산 자동 추출 장치(PI-200 쿠라보우) 및 전용 키트를 이용해 게놈 DNA를 추출하였다. 추출 DNA를 Amplitaq Gold Master 믹스(Thermo fisher)를 이용하고, 또한 하기 KI 스크리닝 프라이머를 이용하여 증폭하였다(95℃ 10 분, (95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초) 35 사이클, 72℃ 2 분, 4℃ 유지).
KI 스크리닝 프라이머:
포워드 프라이머 5'-TACGTCCTCTTCCCCATCTG-3' (서열번호 81),
리버스 프라이머 5'-CTGACAGGACTCCAGCAACA-3' (서열번호 82)
상기 PCR 산물에 대하여 겔 전기영동을 실시하고, 433 bp 부근에 밴드를 확인한 개체의 게놈 DNA를 주형으로 하여, PrimeSTAR GXL(takara) 및 하기 KI 지노타이핑 프라이머를 이용해 증폭하였다(98℃ 2분, (95℃ 15초, 68℃ 5분) 38 사이클, 68 ℃ 7분, 15℃ 유지).
KI 지노타이핑 프라이머(5'):
포워드 프라이머 5'-TTCCTTCCAAAGCAGGGACTCTCTATGT-3' (서열번호 83 동일함(1))
리버스 프라이머 5'-CTTGCAGAAGGACAAGACGTAGAAGACC-3' (서열번호 84 동일함(2))
KI 지노타이핑 프라이머(3'):
포워드 프라이머 5'-GAGTCTATATTGAGGGCAGGCTGGAGTC-3' (서열번호 85),
리버스 프라이머 5'-TAGTCTGCCTGCTCACTCAACCTCTCCT-3' (서열번호 86)
상기 PCR 산물에 대하여 겔 전기영동을 실시하였다. KI 지노타이핑 프라이머(5') 및 KI 지노타이핑 프라이머(3')의 어느 것 도 기대된 서열 길이(4705 bp, 4026 bp)로 증폭을 확인한 개체의 게놈 DNA의 KI 지노타이핑 프라이머(5')를 이용한 PCR 산물을 Gentetic analyzer(Lifetechnology) 및 하기 KI 시퀀스 프라이머를 이용해 직접 시퀀싱을 행하였다. 기대한 서열의 KI를 확인할 수 있는 것을 KI 양성 F0으로 하였다.
KI 시퀀스 프라이머(5'): 5'-GAGTCTATATTGAGGGCAGGCTGGAGTC-3' (서열번호 87)
KI 양성 F0와 C57BL/6 J를 교배하여 F1를 취득하였다. F1의 귓바퀴 조직으로부터 DNeasy 96 Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, PrimeSTAR GXL(takara) 및 전술한 KI 지노타이핑 프라이머(5')를 이용하여 증폭하였다(98℃ 2분, (95℃ 15초, 68℃ 5분) 38 사이클, 68℃ 7 분, 15℃ 유지).
상기 PCR 산물에 대하여 겔 전기영동을 실시하고, 기대된 서열 길이(4705 b)로 증폭을 확인한 개체를 KI 양성 F1로 하였다. KI 양성 F1 중에서 선별한 1 라인을 번식하여 hG6PC (c.648G>T) + Int4 KI 계통으로 하였다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 계통의 지노타이핑
귓바퀴 조직으로부터 DNeasy 96 Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, KOD FX(TOYOBO) 및 하기 KI 지노타이핑 프라이머, mG6PC WT 프라이머를 이용하여 멀티플렉스(multiprex) 증폭하였다(98℃ 2분, (95℃ 15초, 68℃ 5.5분) 32 사이클, 68℃ 5분, 4℃ 유지).
KI 지노타이핑 프라이머(5'):
포워드 프라이머 5'-TTCCTTCCAAAGCAGGGACTCTCTATGT-3' (서열번호 83 동일함(1))
리버스 프라이머 5'-CTTGCAGAAGGACAAGACGTAGAAGACC-3' (서열번호 84 동일함(2))
mG6PC WT 프라이머:
포워드 프라이머 5'-TAAATTTGACCAATGAGCACTGGAGGTC-3' (서열번호 88)
리버스 프라이머 5'-AAAATCATGTGTATGCGTGCCTTTCCTA-3' (서열번호 89)'
상기 PCR 산물에 대하여 겔 전기영동을 실시하고, 4705 b 근방의 증폭을 KI 대립형질(allele), 2536 bp 근방의 증폭을 mG6PC WT 대립형질로 하여 산자의 지노타이핑(WT, Ht, Homo)을 판별하였다.
마우스의 채재(採材)
이하와 같이 하여 마우스의 채재를 행하였다.
채재의 전날 저녁에 분식을 피하기 위한 상망을 설치한 다음, 절식을 개시하였다. 다음날, 마취 도입 하에 개복하고, 충분히 탈혈 후, 간장, 신장을 적출하였다. 각 장기는 빙냉 PBS로 세정 후, 적절한 크기로 트리밍하고, 미리 균질화 비즈(닛카토)를 넣은 튜브에 보존하였다. 각 장기는 액체 질소에서 순간 냉각한 후 -80℃에서 보관하였다.
RNA 추출(in vivo)
이하와 같이 하여 RNA의 추출을 행하였다.
조직 보존 튜브 당, RNeasy 미니 키트 혹은 Qiacube 시스템(Qiagen)의 세포 용해액을 600 ㎕씩 가하고, 조직 lyserII (Qiagen)에서 25 kHz 2분으로 균질화를 하였다. 빙냉 하에서 10분간 인큐베이션 후, 8000 G, 10분간, 실온에서 원심하여 상청을 회수하였다. 상청에 대하여, DNase 처리를 포함하는 각 키트의 프로토콜에 따라 RNA 정제를 행하였다. DNase 처리에는 RNase-Free DNase 세트(Qiagen)를 이용하였다. 정제·용출한 RNA는 전술한 역전사 반응을 행하고, 전술한 qRT-PCR(Taqman assay)에 따라 수복 G6PC mRNA의 정량을 행하였다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (1)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 116 내지 127의 화합물을 PBS에 용해하고, 3 ㎎/㎏이 되도록 꼬리 정맥 투여를 실시할 수 있다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직을 채취하여 G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가할 수 있다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (2)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 91 내지 95의 화합물을 오오츠카생식주에 용해하고, 25 ㎎/㎏이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직을 채취하여 G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가한 결과, 도 19에 나타낸 것과 같이, 실시예 91 내지 95의 화합물로 hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (3)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 91, 92, 및 96 내지 103의 화합물을 오오츠카생식주에 용해하고, 25 ㎎/㎏이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직을 채취하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가한 결과, 도 20에 나타낸 것과 같이, 실시예 91, 92, 및 96 내지 103의 화합물로 hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (4)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 83 내지 91, 및 104 내지 107의 화합물을 오오츠카생식주에 용해하고, 30 ㎎/㎏이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직의 채취하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가한 결과, 도 21에 나타낸 것과 같이, 실시예 83 내지 91, 및 104 내지 107의 화합물로 hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (5)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 104, 및 108 내지 115의 화합물을 오오츠카생식주에 용해하고, 30 ㎎/㎏이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직의 채취하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가한 결과, 도 22에 나타낸 것과 같이, 실시예 83 내지 91, 및 104 내지 107의 화합물로 hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (6)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 105, 113, 및 131 내지 137의 화합물을 오오츠카생식주에 용해하고, 30 ㎎/㎏이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직의 채취하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가한 결과, 도 23에 나타낸 것과 같이, 실시예 105, 113, 및 131 내지 137의 화합물로 hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
(시험예 3) 이상 스플라이싱 수복 서열의 단편 해석
PCR 반응과 단편 서열 해석
이하와 같이 하여 PCR 반응과 단편 서열 해석을 행하였다.
하기와 같이 hG6PC 스플라이싱 검증(validation) 프라이머를 설계하였다.
hG6PC 스플랑이싱 검증 프라이머:
포워드 프라이머 5'-TTGTGGTTGGGATTCTGGGC-3' (서열번호 90)
리버스 프라이머 5'-TCCAGAGTCCACAGGAGGTC -3' (서열번호 91)
이하와 같이 PCR 반응액을 조정하여 PCR 반응을 행하였다.
23 ㎕ PlatinumTM PCR SuperMix High Fidelity(thermo fisher), 2 ㎕ 프라이머 믹스(10 μM), 1 ㎕ cDNA(5배 희석제)를 현탁하여 PCR 반응을 행하였다(95℃ 5분, (95℃ 30초, 62℃ 30초, 68℃ 30초) 36 사이클, 68℃ 4분, 4℃ 유지).
PCR 산물은 E-Gel(등록상표) 아가로오즈 겔 전기영동 시스템을 이용하여 E-gel Ex 2% 아가로오즈(Invitrogen)에서 전기영동하고, 해석하였다. 각 단편은 NucleoSpin(등록상표) Gel and PCR Clean-up(MACHEREY-NAGEL)에서 겔로부터 추출하고, G6PC 시퀀스 프라이머를 첨가 후, BigDye v3.1을 이용하여 시퀀싱 반응을 행하였다. Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer(Life technologies)를 이용하여 염기 서열을 확인하였다(도 24).
G6PC 시퀀스 프라이머 5'-GCTGTGCAGCTGAATGTCTG-3' (서열번호 92)
실시예 1의 화합물(21e_002)에 의한 배양 세포에서의 이상 스플라이싱 수복 서열의 단편 해석
인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)를 이용한 실시예 화합물에 의한 G6PC mRNA의 이상 스플라이싱의 수복 평가 (1)에 있어서 작성한 인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)만을 형질감염한 검체, 인간 G6PC 전장 플라스미드 벡터(pcDNA hG6PC (c.648G>T) + Int4)와 올리고뉴클레오티드(21e_002)를 동시형질감염한 검체로부터 작성한 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR 반응과 단편 서열 해석을 행하였다. 도 24에 나타낸 것과 같이, 실시예 1의 화합물(21e_002)에 의해 91 염기가 결손하는 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
(시험예 4) 모델 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가
시험예 2와 동일하게 실시예 화합물에 대하여 모델 마우스를 이용해 평가를 하였다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (7)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 133 및, 143 내지 149의 화합물을 오오츠카생식주에 용해하고, 30 ㎎/㎏이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직의 채취하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가한 결과, 도 25에 나타낸 것과 같이, 실시예 133 및, 143 내지 149의 화합물로 hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스를 이용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가 (8)
hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 149 및, 152 내지 160의 화합물을 오오츠카생식주에 용해하고, 30 ㎎/㎏이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7일 후에 하룻밤 절식 조건 하에서 마우스의 간장 조직의 채취하고, G6PC (c.648G>T)에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR(Taqman)로 평가한 결과, 도 26에 나타낸 것과 같이, 실시예 149 및, 152 내지 160의 화합물로 hG6PC (c.648G>T) + Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
(실시예 161)
X20-Am1s-Am1s-Te2s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Am1s-Gm1t-H (서열번호 93)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_001.6을 이용하여, X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6278.03)
(실시예 162)
X20-Am1s-Te2s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Am1s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 94)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.6을 이용하여, X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6280.03)
(실시예 163)
X20-Am1s-Am1s-Te2s-Ce2s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Am1s-Gm1t-H (서열번호 93)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_001.7을 이용하여, X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 92번째에서 106번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6304.04)
(실시예 164)
X20-Am1s-Te2s-Ce2s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Am1s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 94)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.7을 이용하여, X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6306.03)
(실시예 165)
X20-Am1s-Um1s-Cm1s-Cm1s-Gm1s-Am1s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Cm1s-Gm1s-Am1s-Am1s-Gm1s-Cm1t-H (서열번호 95)
실시예 133에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.8을 이용하여, X18 부분을 X20으로 치환하고, 실시예 133과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6149.93)
(실시예 166)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 153에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.01을 이용하여 실시예 153과 동일하게 합성을 행하였다. 단, 핵산 자동 합성기로 사용하는 시약 중, 표기 서열 합성에 필요한 부분의 산화제로서 OXDIZER 0.05M(Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L560250-04), 혹은 0.02M이 되도록 옥소(칸토카가쿠제, 제품 번호 20035-00)를 테트라히드로푸란(탈수, 칸토카가쿠제, 제품 번호 40993-05), 피리딘(탈수, 칸토카가쿠제, 제품 번호 11339-05), 증류수 78:20 2 (v/v/v) 용액을 이용해 용해하고, 적당히 사용하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 167)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.02를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 168)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.03을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6247.99)
(실시예 169)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.04를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 170)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.05를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 171)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.06을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 172)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.07을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 173)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.08을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 174)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.09를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.01)
(실시예 175)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.10을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_005.5.10이다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.01)
(실시예 176)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.11을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6216.00)
(실시예 177)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.12를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6216.03)
(실시예 178)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.13을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6216.02)
(실시예 179)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.14를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6216.03)
(실시예 180)
X20-Ae2s-Um1p-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1p-Gm1p-Gm1s-Ce2s-Gm1p-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.15를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6200.06)
(실시예 181)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.16을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6247.99)
(실시예 182)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1p-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.17을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.01)
(실시예 183)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.18을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 184)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1p-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.19를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.01)
(실시예 185)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.20을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 186)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1p-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.21을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.01)
(실시예 187)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.22를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 188)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1p-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.23을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 189)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.24를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 190)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1p-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.25를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6248.00)
(실시예 191)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.26을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.01)
(실시예 192)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.27을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6216.03)
(실시예 193)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.28을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6216.03)
(실시예 194)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.29를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6200.06)
(실시예 195)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.30을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6200.06)
(실시예 196)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.31을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6184.11)
(실시예 197)
X20-Ae2p-Um1p-Cm1p-Ce2p-Gm1p-Ae2p-Um1p-Gm1p-Gm1p-Ce2p-Gm1p-Am1p-Ae2p-Gm1p-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.32를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6040.30)
(실시예 198)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.33을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 199)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.34를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.01)
(실시예 200)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.35를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.04)
(실시예 201)
X20-Ae2p-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.36을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.03)
(실시예 202)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.37을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 203)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.38을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.01)
(실시예 204)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.39를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 205)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2p-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.40을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 206)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.41을 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6232.02)
(실시예 207)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2p-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2p-Gm1s-Am1s-Ae2p-Gm1s-Ce2t-H (서열번호 95)
실시예 166에서 사용한 서열 대신에 상기의 서열인 15e_005.5.42를 이용하여 실시예 166과 동일하게 합성을 행하였다.
본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 서브유닛(G6PC), 전사 변이체 1, mRNA(NCBI-GenBank 기탁 번호 NM_000151.3)의 뉴클레오티드 번호 728의 G로부터 T로 변이하고 있는 c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단에서 91번째에서 105번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(실측 값: 6216.00)
또한, 본 명세서에 있어서, At, Gt, 5meCt, Ct, Tt, Ut, Ap, Gp, 5meCp, Cp, Tp, Up, As, Gs, 5meCs, Cs, Ts, Us, Am1t, Gm1t, Cm1t, 5meCm1t, Um1t, Am1p, Gm1p, Cm1p, 5meCm1p, Um1p, Am1s, Gm1s, Cm1s, 5meCm1s, Um1s, Ae2t, Ge2t, Ce2t, Te2t, Ae2p, Ge2p, Ce2p, Te2p, Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2s, A1t, G1t, C1t, T1t, Ae1p, Ge1p, Ce1p, Te1p, Ae1s, Ge1s, Ce1s, Te1s, Am2t, Gm2t, 5meCm2t, Tm2t, Am2p, Gm2p, 5meCm2p, Tm2p, Am2s, Gm2s, 5meCm2s, Tm2s, X, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18, X19, X20, X21, X22는 하기에 나타내는 구조를 갖는 기이다.
Figure pat00195
Figure pat00196
Figure pat00197
Figure pat00198
Figure pat00199
Figure pat00200
Figure pat00201
Figure pat00202
Figure pat00203
Figure pat00204
Figure pat00205
Figure pat00206
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
본 발명은 당원병 Ia형의 치료에 이용할 수 있다.
＜서열번호 1∼48, 93∼95＞ 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA의 키메라, 이들 수식체의 어느 것이어도 되지만, 적어도 1개가 수식 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
＜서열번호 49∼65, 67∼92＞ 프라이머의 서열을 나타낸다.
＜서열번호 66＞ 펩티드의 서열을 나타낸다.
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED KOBE GAKUIN UNIVERSITY <120> Drug for treatment of glycogen storage disease type Ia <130> 2021-FPA-1016D <150> JP2018-43524 <151> 2018-03-09 <150> JP2018-128015 <151> 2018-07-05 <160> 95 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 1 agataaaauc cgauggcgaa g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 2 taaaauccga uggcgaagcu g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonuleotide <400> 3 aauccgaugg cgaagcugaa a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 4 ccgauggcga agcugaaaag g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 5 auggcgaagc ugaaaaggaa g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 6 gcgaagcuga aaaggaagaa g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 7 aagcugaaaa ggaagaaggu a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 8 cugaaaagga agaagguaau g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 9 aaaaggaaga agguaaugag a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 10 aggaagaagg uaaugagaaa a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 11 aagaagguaa ugagaaaata t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 12 gauaaaaucc gatggcgaag c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 13 auaaaatccg auggcgaagc t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 14 aaaauccgat ggcgaagctg a 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 15 aaatccgaug gcgaagcuga a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 16 auccgatggc gaagctgaaa a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 17 tccgauggcg aagcugaaaa g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 18 cgatggcgaa gctgaaaagg a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 19 gauggcgaag cugaaaagga a 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 20 uaaaauccga tggcgaag 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 21 aaaatccgau ggcgaagc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 22 aaauccgaug gcgaagcu 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 23 aauccgatgg cgaagctg 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 24 atccgauggc gaagcuga 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 25 uccgauggcg aagcugaa 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 26 ccgatggcga agctgaaa 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 27 cgauggcgaa gcugaaaa 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 28 gauggcgaag cugaaaag 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 29 atggcgaagc tgaaaagg 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 30 uggcgaagcu gaaaagga 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 31 ggcgaagcug aaaaggaa 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 32 gcgaagctga aaaggaag 18 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 33 agataaaauc cgauggcgaa g 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 34 gcagauaaaa uccgatggcg a 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 35 cagauaaaat ccgauggcga a 21 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 36 cagataaaau ccgauggc 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 37 agauaaaauc cgatggcg 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 38 gauaaaatcc gauggcga 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 39 ataaaauccg auggcgaa 18 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 40 aauccgatgg cgaag 15 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 41 ccgatggcga agctg 15 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 42 aaauccgatg gcgaag 16 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 43 tcaaauccga tggcgaag 18 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 44 atccgauggc gaagc 15 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 45 uccgauggcg aagcu 15 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 46 aaaauccgat ggcgaag 17 <210> 47 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 47 aauccgatgg cgaagc 16 <210> 48 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 48 auccgatggc gaagcu 16 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 atagcagagc aatcaccacc aagcc 25 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 attccacgac ggcagaatgg atggc 25 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 taccgagctc ggatccacca ccaagcctgg aataactgc 39 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ctggactagt ggatcctggc atggttgttg actttaaac 39 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 tctgggctgt gcagctgaat gtctg 25 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gtaggggatg acactgacgg atgcc 25 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ctggagtcct gtcaggtatg ggc 23 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 agctgaaaag gaagaaggta atgag 25 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 tcttcctttt cagcttcgcc atcgg 25 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ctgacaggac tccagcaaca ac 22 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ttgtggttgg gattctgggc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 atgctgtgga tgtggctgaa 20 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 tggcacccag cacaatgaa 19 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ctaagtcata gtccgcctag aagca 25 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gctgctcatt ttcctcatca agtt 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 tggatgtggc tgaaagtttc tgta 24 <210> 65 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 tcctgtcagg cattgc 16 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 66 Trp Cys Glu Gln Pro Glu Trp Val His Ile Asp Thr Thr Pro Phe Ala 1 5 10 15 Ser Leu Leu Lys 20 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 gggaaacatg catgaagccc tgggc 25 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 tcccttggta cctcaggaag ctgcc 25 <210> 69 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 cgggcccccc ctcgaaaact aggcctgaag agatggc 37 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 taccgtcgac ctcgagggtt ggccttgatc cctctgcta 39 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ggttgagttg atcttctaca tcttg 25 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 gcaagagagc cttcaggtag atccc 25 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 agttctagag cggccgccca tgcaaaggac taggaacaac 40 <210> 74 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 accgcggtgg cggccaatgt tgcctgtctt cctcaatc 38 <210> 75 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 ggccaaccct ggaataactg caagggctct g 31 <210> 76 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ttgcatggtt gttgacttta aacaccgaag a 31 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 tcaacaacca tgcaaaggac taggaacaac 30 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 attccagggt tggccttgat ccctctgcta 30 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 gggatcaagg ccaaccggct gg 22 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 taaagtcaac cgccatgcaa agg 23 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 tacgtcctct tccccatctg 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 ctgacaggac tccagcaaca 20 <210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ttccttccaa agcagggact ctctatgt 28 <210> 84 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 cttgcagaag gacaagacgt agaagacc 28 <210> 85 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 gagtctatat tgagggcagg ctggagtc 28 <210> 86 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 tagtctgcct gctcactcaa cctctcct 28 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 gagtctatat tgagggcagg ctggagtc 28 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 taaatttgac caatgagcac tggaggtc 28 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 aaaatcatgt gtatgcgtgc ctttccta 28 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 ttgtggttgg gattctgggc 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 tccagagtcc acaggaggtc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 gctgtgcagc tgaatgtctg 20 <210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 93 aatccgatgg cgaag 15 <210> 94 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 94 atccgatggc gaagc 15 <210> 95 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 95 auccgauggc gaagc 15

Claims (30)

  1. c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 cDNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15∼30의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 82번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 상기 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    염기수 15∼21의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 86번째 내지 92번째의 어느 하나의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    염기수 15∼21의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    염기수 15∼18의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    염기수 18의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    염기수 17의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    염기수 16의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    염기수 15의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5의 5' 말단으로부터 92번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 1∼32, 40∼42, 44∼48의 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 하나의 항에 있어서,
    추가로 생체내에서 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드가 5' 말단 및/또는 3' 말단에 부가된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 하나의 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 구성하는 당 및/또는 인산 디에스테르 결합의 적어도 1개가 수식되어 있는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  12. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 하나의 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2' 위(位)의 수산기의 수식인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 하나의 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-, 4'-가교화인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  14. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 하나의 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-O, 4'-C-알킬렌화인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 하나의 항에 있어서,
    인산 디에스테르 결합의 수식이 포스포로티오에이트인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 있어서,
    5' 말단 및/또는 3' 말단에 GalNAc 유닛이 결합한 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  17. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 있어서,
    5' 말단에 GalNAc 유닛이 결합한 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  18. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pat00207

    [식 중, Ra는 식
    Figure pat00208

    로 표시되는 기를 나타내고, Rb는 식
    Figure pat00209

    로 표시되는 기 또는 수소 원자를 나타내고, XX는 식
    Figure pat00210

    로 표시되는 기를 나타내고, G는 5-아세트아미드-2-히드록시메틸-3,4-디히드록시테트라히드로피란-6-일 기(GalNAc)를 나타내고, Z는 산소 원자 또는 유황 원자를 나타내고, L1 및 L2는 한 쪽이 메틸렌기(CH2)를 나타내고, 다른 쪽이 원자를 사이에 두지 않음을 나타내며, p, q, r, s, t 및 u는 서로 독립적으로 0 또는 1을 나타내고, n 및 n'는 서로 독립적으로 1∼15의 정수를 나타내고, m 및 m'는 서로 독립적으로 0∼5의 정수를 나타내고, Rb가 수소 원자가 아닐 때, v는 1을 나타내고, Rb가 수소 원자일 때, v는 1∼7을 나타낸다. 단, n이 1일 때 m은 0∼5의 정수이고, n이 2∼15의 정수일 때 m은 0이며, n'가 1일 때 m'는 1∼5의 정수이고, n'가 2∼15의 정수일 때 m'는 0이다. 인 원자로부터 먼 쪽의 결합손에는 수산기, XX 기, 또는 OG 기가 결합해도 된다].
  19. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pat00211

    [식 중, G, Z, L1, L2, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다].
  20. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pat00212

    [식 중, G, Z, L1, L2, q, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타내고, Ra'는 식
    Figure pat00213

    로 표시되는 기를 나타낸다].
  21. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pat00214

    [식 중, G, Z, L1, L2, s, n, m 및 v는 상기와 동일한 의미를 나타내고, Rb'는 식
    Figure pat00215

    (식 중, n' 및 m'는 상기와 동일한 의미를 나타낸다)로 표시되는 기 또는 수소 원자를 나타낸다].
  22. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    GalNAc 유닛이, 또는, 하기 식으로 표시되는 기인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pat00216

    [식 중, G, Z, L1, L2, n 및 m은 상기와 동일한 의미를 나타낸다].
  23. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    GalNAc 유닛이 하기 식으로 표시되는 기인 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pat00217

    [식 중, G, Z, L1, L2, n, m 및 Ra'는상기와 동일한 의미를 나타낸다].
  24. 청구항 1에 있어서,
    하기 식으로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pat00218

    [식 중, R은 수소 원자, XX 기, 또는 G 기를 나타내고, T는 5' 말단에 수산기를 갖지 않은 올리고뉴클레오티드를 나타내고, Xg는 X1∼X6 및 X9∼X17로 이루어진 군으로부터 선택되는 GalNAc 유닛을 나타내고, 또는, RO-Xg는 X7, X8, X18, X19, X20, X21 및 X22로 이루어진 군으로부터 선택되는 GalNAc 유닛을 나타내고, Xa, Xb, Xc, Xd, Xe 및 Xf는 서로 독립적으로 X1∼X6 및 X9∼X17 또는 그들의 광학이성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 GalNAc 유닛 또는 단일결합을 나타낸다]
    Figure pat00219

    Figure pat00220

    Figure pat00221

    Figure pat00222

    Figure pat00223

    Figure pat00224

    Figure pat00225

    Figure pat00226

    Figure pat00227

    Figure pat00228

    Figure pat00229

    Figure pat00230

    Figure pat00231

    Figure pat00232

    Figure pat00233

    Figure pat00234

    Figure pat00235

    Figure pat00236

    Figure pat00237

    Figure pat00238

    Figure pat00239

    Figure pat00240
    .
  25. 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 의약.
  26. 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 당원병 Ia형 치료약.
  27. 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 의약적으로 유효한 양으로 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 당원병 Ia형의 치료 방법.
  28. 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 하나의 항에 있어서,
    당원병 Ia형의 치료 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
  29. 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 하나의 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 경구 또는 비경구로 투여하기 위한 배합물.
  30. 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 하나의 항에 이어서,
    의약으로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 그의 약리상 허용되는 염 또는 용매화물.
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