JP2020114886A - オリゴヌクレオチド−リガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチド−リガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、ｉＲＮＡ剤）のリガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法に関する。【解決手段】これらのリガンドは、主に、単糖に由来する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドのインビボでの送達に有用である。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／８４５，２７９号明細書の利益を主張するものである。
本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、ｉＲＮＡ剤）のリガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法に関する。これらのリガンドは、主に、単糖に由来する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドのインビボでの送達に有用である。
インビボでの細胞への効率的な送達は、特異的標的化および細胞外環境、特に、血清タンパク質からの実質的な保護を必要とする。特異的標的化を行う一方法は、標的化部分をｉＲＮＡ剤にコンジュゲートすることである。標的化部分は、ｉＲＮＡ剤を所要の標的部位に標的化するのに役立つ。標的化部分が送達を向上させ得る一方法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性によるものである。この取り込み機構は、膜構造の陥入または細胞膜による送達系の融合による、膜によって包まれる領域の内部への、膜受容体に結合されたｉＲＮＡ剤の移動を含む。このプロセスは、受容体への特異的リガンドの結合の後、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。ガラクトース、マンノース、マンノース−６−リン酸などの糖、ペプチドならびにトランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、ビタミンＢ１２、インスリンおよび上皮成長因子（ＥＧＦ）などのタンパク質を認識するものを含む、多くの受容体を介したエンドサイトーシス系が公知であり、研究されている。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は、肝細胞に非常に多く存在する高容量受容体（ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。ＡＳＧＰ−Ｒは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトシルアミン（ＧａｌＮＡｃ）に対してＤ−Ｇａｌより５０倍高い親和性を示す。過去の研究により、ｎＭ親和性を得るのに多価が必要とされる一方、糖間の間隔も重要であることが示されている。
最近、特定の糖質コンジュゲートが、ｓｉＲＮＡ送達のためのリポソームの代わりに有益な送達であることが示された。
本発明は、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質の向上した送達、より低い製造コストまたはより少ない製造上の問題、またはより良好な化学安定性などの１つ以上の有利な特性を有するオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質のリガンドコンジュゲートに関する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドおよび他の生物学的に活性な物質の有効な送達を提供する。
一実施形態において、本発明は、式Ｉ：
Figure 2020114886
 （式中、
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチｍｉＲ、アンタゴｍｉｒ、マイクロＲＮＡ模倣体、デコイ、免疫刺激、Ｇ−四量体、スプライシング変化、ｓｓＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、ステムループＲＮＡもしくはＤＮＡまたは任意の二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡの２つの鎖のうちの１つまたは二本鎖のより短い方のＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などのオリゴヌクレオチドであり；
生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
リンカーが、リガンドとオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり、ここで、リンカーが、表１または１Ａ中の連結基から選択されてもよく；および
リガンドが、糖に由来し、ここで、（ｉ）リガンドが、リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく、かつ（ｉｉ）コンジュゲートが、１〜１２個のリガンド（好ましくは、１〜５個または１〜３個のリガンド）を含有し、（ｉｉｉ）リガンドが、
（ａ）表２または２Ａ中のリガンド、
（ｂ）−Ｒ２−（Ｒ３）ｋ（ここで、
Ｒ２が、存在しないか（その場合、ｋ＝１）、またはＲ３基のための２つ以上の結合部位を有するスペーサ（リガンド骨格とも呼ばれる）であり、
Ｒ３が、表３から選択される標的化モノマーであり、かつｋが、１〜６（好ましくは、１〜５または１〜３）であり、各Ｒ３が、Ｒ２中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい）；および
（ｃ）表４または４Ａ中のリガンド
から選択されてもよい）
のオリゴヌクレオチド（例えば、ｉＲＮＡ剤）または他の生物学的に活性な物質のリガンド（例えば、糖質）コンジュゲートに関する。
コンジュゲートは、表１または１Ａまたは実施例からの少なくとも１個のリンカー、表２、２Ａ、４、または４Ａからの１個のリガンド、あるいは表３または３Ａからの１個の標的化モノマーを含む。例えば、実施例に記載されるヌクレオシドリンカーが、リンカーとして使用され得る。一実施形態において、コンジュゲートは、（ｉ）表１または１Ａまたは実施例からの少なくとも１個のリンカー、（ｉｉ）表２、２Ａ、４、または４Ａからの１個のリガンド、および（ｉｉｉ）表３または３Ａからの１個の標的化モノマーを含む。
Ｒ２が、アミノ酸−、ポリペプチド−（例えば、ジペプチドまたはトリペプチド）、ヘテロアリール−（例えば、トリアゾール）、または糖含有基であり得る。好ましい一実施形態において、各Ｒ３基が、アミド、エーテル、またはアミノ基を介してＲ２に結合される。一実施形態において、Ｒ３がアミド基を介して結合される。表２、２Ａ、４、および４Ａ中の各項目は、少なくとも１個の標的化モノマーに結合されたスペーサを示す。スペーサは、窒素原子などのヘテロ原子（スペーサの末端にある）を介して標的化モノマーに、またはアノマー炭素において、（以下に示されるような）標的化モノマーの糖基に結合される。表２、２Ａ、４、および４Ａに示される構造中のヘテロ原子結合点は、糖基（リガンドの左側）からリガンドの残りの部分（右側）へと、鎖に沿って移動する場合、第１の窒素原子である。表２Ａ中の２個のリガンドのためのスペーサが、以下の表に示される（矢印は、標的化モノマーＲ３のための結合点を示し、スペーサの右側は、リンカーに結合される）。好適なスペーサはまた、以下の表５に示される。
Figure 2020114886
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、（ｉ）オリゴヌクレオチドの３’または５’末端、（ｉｉ）位置に関係なくオリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの１つ以上の糖部分、または（ｉｉｉ）位置に関係なく存在するヌクレオシドの１つ以上の塩基部分を介して、リンカーに結合される。
一実施形態において、リガンドは、リンカーを介して二本鎖ｓｉＲＮＡの２つの鎖のうちの１つにコンジュゲートされる。
一実施形態において、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を標的にする。別の実施形態において、リガンドは、肝臓の実質細胞など、肝臓を標的にする。リガンドは、非修飾または修飾単糖、二糖、三糖、四糖、またはより高次の多糖であり得る。
オリゴヌクレオチドは、切断可能な基（例えば、ホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはアミド）または切断できない基（例えば、エーテル、カルバメート、もしくはＣ−Ｃ（例えば、２つの炭素原子間の結合または−ＣＨ２−ＣＨ２−））を介してリンカーに結合され得る。本明細書に記載されるように、切断可能なまたは切断できない基は、式Ｉのオリゴヌクレオチドの中にある。
一実施形態において、−リンカー−リガンドは、Ｌ９６（実施例に示される）でない。
本明細書に記載されるコンジュゲートの式（式（Ｉ）など）において、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）（ＰＥＧ−脂質またはカチオン性脂質など）またはポリマーの成分によって置換され得る。コンジュゲートされたＬＮＰ成分または共役ポリマーは、標的部位への生物学的に活性な物質の送達を促進するための送達物質として有用であり得る。
表１ − リンカー基ａ，ｂ
以下のリンカーが、保護基ＤＭＴｒとともに示される。コンジュゲートされるとき、ＤＭＴｒ基が除去され、隣接する酸素原子は、オリゴヌクレオチドへの（例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基への）リンカーの結合部位である。波線は、リガンドの結合点である。Ｘが、水素、脱離基、−ＯＨ、または−ＮＨ２であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Ｘが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体（例えば、
Figure 2020114886
 ）に結合された反応性ホスホロアミダイト（例えば、
Figure 2020114886
 ）であり得る。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
表１Ａ−リンカー基
表１Ａ中で以下に示されるリンカーは、それに１つ以上のオリゴヌクレオチドが結合された状態で示される。リンカーが、オリゴヌクレオチドを含まない化学的部分であることが、当業者に理解されるであろう。波線は、リガンドの結合点である。Ｘが、水素、脱離基、−ＯＨ、または−ＮＨ２であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Ｘが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体（例えば、
Figure 2020114886
 ）に結合された反応性ホスホロアミダイト（例えば、
Figure 2020114886
 ）であり得る。「オリゴヌクレオチド／ヌクレオチド」という語句は、単一のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指すことが意図される。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
リガンド
リガンドはまた、以下の２つの一般式
Figure 2020114886
 から選択することができ、式中、矢印が、オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示す（すなわち、リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される）。リガンドを導入するのに有用な中間体としては、上に示される化合物が挙げられる。上記の式中、変数は、以下に示される定義を有する：
Ｒ６が、ＨまたはＡｃであり；
Ｒ７が、−ＯＨまたは−ＮＨＲ９であり；
Ｒ８が、ＡｃまたはＲ９であり、ここで、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つが、窒素含有部分であり；
Ｒ９が、
Figure 2020114886
 であり；
Ｑ１が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、
Figure 2020114886
 であり；
Ｑ２が、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｘが、ＨまたはＭｅであり；
Ｙが、Ｈ、Ａｃ、またはＣＯＣＦ３であり；および
ｎが、１〜８（例えば、１〜４）である。
リガンドは、以下の表４または４Ａに示される式で表され得る。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
表２、２Ａ、３、３Ａ、４、および４Ａおよび糖部分に１つ以上の−ＯＡｃ置換基を含む他の式において、本発明の化合物は、示される１つ以上の−ＯＡｃの位置に−ＯＨ置換基を含有する同一の化合物を含む。一般に、アセチル（Ａｃ）基は、ヒドロキシル部分のための保護基として機能する。したがって、対応するヒドロキシ化合物が、本発明の範囲内にあり、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質とともに最終的なコンジュゲートに使用されることが意図されることが、当業者に理解されるであろう。
さらに、本発明の化合物は、糖部分における任意の−ＮＨＡｃ置換基が、ヒドロキシ基で置換される（例えば、その場合、糖部分の２位における−ＮＨＡｃ基が、２つの−ＯＨ基で置換される）ものも含む。一実施形態において、ヒドロキシ基による−ＮＨＡｃ基の置換に加えて、糖部分における任意の−ＯＡｃ置換基も、ヒドロキシ基で置換される。
一実施形態において、リガンドは、
Figure 2020114886
 から選択され、式中、
Ａが、リンカーへの結合点であり、リンカーに結合された結合または化学結合基（例えば、アミド、カルバメート、尿素、−Ｃ−Ｎ−（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−または−Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃが、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択される）、Ｃ＝ＮＨ、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、オキシム、またはヒドラジン）を表すことができ；
Ｙが、任意の官能基（例えば、二価基として使用されるとき、それは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、またはＳであり得、または、例えば、一価基として使用されるとき、それは、−ＯＨ、−ＳＨ、またはハロゲンであり得る）、−ＣＨ２−、保護基、または化学的に不活性なキャップであり；
Ｑが、ＯＨ、または本明細書に記載される糖のＣ６位に対する任意の修飾であり；および
ｎが、１〜６である。
さらに別の実施形態において、上記のリガンドまたは標的化モノマー（表２、２Ａ、３、３Ａ、４、および４Ａ中などの）のいずれかの糖部分は、以下の式ＩＩＩ
Figure 2020114886
 （式中、
Ｒ６のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり（例えば、ＨまたはＡｃ）；
Ｒ７およびＲ”が、独立して、−Ｚ−Ｒ１０、非置換および置換ヘテロアリール（例えば、トリアゾールまたはイミダゾール）、−Ｎ３、−ＣＮ、および置換および非置換アセチレンから選択され；
Ｚのそれぞれが、独立して、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；
Ｒ１０のそれぞれが、独立して、Ｈ、非置換または置換アルキル、非置換アシル（例えば、−ＣＯＣＨ３）、置換アシル（例えば、−ＣＯＣＦ３）、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１１、またはアミノ酸であり；および
Ｒ１１のそれぞれが、独立して、Ｈまたは非置換または置換アルキルであり、
ただし、（ｉ）Ｒ６がＨであるか、または（ｉｉ）Ｒ”が、ＯＨまたはＮＨＡｃであるとき、Ｒ７は、−ＯＨまたは−ＯＡｃでない）
の糖部分で置換され得る。
さらに別の実施形態は、式
Figure 2020114886
 の中間化合物であり、式中、
リガンドおよびリンカーが、上に定義されるとおりであり、
Ｘが、
Figure 2020114886
 （式中、球体が、固体担体を表す）、
Figure 2020114886
 、脱離基、Ｈ、−ＯＨ、または−ＮＨ２である。
これらの中間体は、本発明のオリゴヌクレオチド−リガンドコンジュゲートを調製するのに有用である。
さらに別の実施形態は、式ＩＩＩＡ
Figure 2020114886
 の中間化合物であり、式中、
Ｒ５２が、１〜１２個の原子の長さの二価化学基であり；
リンカーが、上に定義されるとおりであり；
Ｒ６のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり（例えば、ＨまたはＡｃ）；
Ｒ７およびＲ”が、独立して、−Ｚ−Ｒ１０、非置換および置換ヘテロアリール（例えば、トリアゾールまたはイミダゾール）、−Ｎ３、−ＣＮ、および置換および非置換アセチレンから選択され；
Ｚのそれぞれが、独立して、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；
Ｒ１０のそれぞれが、独立して、Ｈ、非置換または置換アルキル、非置換アシル（例えば、−ＣＯＣＨ３）、置換アシル（例えば、−ＣＯＣＦ３）、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１１、またはアミノ酸であり；
Ｒ１１のそれぞれが、独立して、Ｈまたは非置換または置換アルキルであり；および
Ｘが、
Figure 2020114886
 （式中、球体が、固体担体を表す）、
Figure 2020114886
 、脱離基、Ｈ、−ＯＨ、または−ＮＨ２であり、
ただし、（ｉ）Ｒ６がＨであるか、または（ｉｉ）Ｒ”が、ＯＨまたはＮＨＡｃであるとき、Ｒ７は、−ＯＨまたは−ＯＡｃでない。
好ましい一実施形態において、式ＩＩＩまたはＩＩＩＡ中の糖基の３位および４位における置換はそれぞれ、水平方向（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ）および軸方向（ａｘｉａｌ）である。
一実施形態において、式ＩＩＩまたはＩＩＩＡ中の糖は、α立体配置にある。別の実施形態において、糖は、β立体配置にある。
本発明は、式ＩＩＩＡ（式中、Ｘが、オリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載される他の生物学的に活性な物質で置換される）の化合物も含む。
本明細書に記載される同じ結合または結合の組合せは、２つ以上のリガンド／リンカー部分を、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質に結合するのに使用され得る。例えば、一実施形態において、本発明は、式ＩＶ
Figure 2020114886
 （式中、
リガンドおよびリンカーが、上に定義されるとおりであり；
オリゴヌクレオチド−１およびオリゴヌクレオチド−２が、上記のオリゴヌクレオチドと同じ定義を有し；
生物学的に活性な物質−１および生物学的に活性な物質−２が、上記の生物学的に活性な物質と同じ定義を有し；および
各リガンドが、同じであってもまたは異なっていてもよく、各オリゴヌクレオチドが、同じであってもまたは異なっていてもよい）
のオリゴヌクレオチド（例えば、ｉＲＮＡ剤）または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートに関する。
式ＩＶ中、リンカーは、２つの結合を介してオリゴヌクレオチドの２つの部分（オリゴヌクレオチド１および２）を結合する。オリゴヌクレオチドの各部分は、少なくとも１つのヌクレオシド部分を表す。
さらに別の実施形態は、式Ｖ：
Figure 2020114886
 （式中、
各オリゴヌクレオチド（または生物学的に活性な物質）およびリガンドが、独立して、本明細書に定義されるとおりであり；
各リンカーが、独立して、本明細書に記載されるいずれかのもの（例えば、表１または１Ａ中）であり得、または式
Figure 2020114886
 で表され得、式中、Ｒ４が、（例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基を介した）オリゴヌクレオチドの結合部位であり、ヒドロキシプロリンにおけるヒドロキシ基は、さらなる−リンカー−リガンド基の結合部位であり；および
ｔが、１〜６の範囲（例えば、１、２、３、４、５、または６）である）
のオリゴヌクレオチド（例えば、ｉＲＮＡ剤）または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートである。
好ましい一実施形態において、ｔが２である。
好ましい一実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート中のオリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。
一実施形態において、コンジュゲートは、式：
Figure 2020114886
 （式中、各Ｒが、独立して、リガンド（本明細書に記載されるものなど）である）で表されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートである。好ましい一実施形態において、リガンドＲは同じである。
本発明は、オリゴヌクレオチドのリガンドコンジュゲートであって、少なくとも１個のヌクレオシドが、（ｉ）ヌクレオシドの核酸塩基を介して、または（ｉｉ）ヌクレオシドの２’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされるリガンドコンジュゲートにも関する。
一実施形態は、オリゴヌクレオチドの糖質コンジュゲートであって、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドが、ヌクレオシドの核酸塩基中の窒素原子を介して、糖質含有リガンド（例えば、糖含有リガンド）にコンジュゲートされる糖質コンジュゲートである。本明細書に記載される任意のリガンドが使用され得る。一実施形態において、コンジュゲート中のヌクレオシドは、式ＶＩ：
Figure 2020114886
 （式中、
式ＶＩ中のヌクレオシドの５’および３’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され；
Ｒ６が、核酸塩基（例えば、ウラシル、シトシン、アデノシン、またはグアニン）であり、かつ任意選択的に、核酸塩基に結合された窒素含有部分を有し；
Ｒ７がリンカーであり、ここで、Ｒ７が、Ｒ６中の窒素原子（例えば、アミノ基）に結合され；および
各Ｒ８が、独立して、リガンドである）
のものである。各Ｒ８が、リンカーＲ７中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。リガンドＲ８は、例えば、−Ｒ２−Ｒ３または表２、２Ａ、４、および４Ａ中のリガンドであり得る。
一実施形態において、Ｒ６が、ウラシルであって、その５位においてアミド基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換されるウラシルであり、ここで、Ｒ７が、アミド基の窒素原子を介してＲ６に結合される。
別の実施形態において、Ｒ６が、シトシンであって、その５位においてアミド基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換されるシトシンであり、ここで、Ｒ７が、アミド基の窒素原子を介してＲ６に結合される。
別の実施形態は、オリゴヌクレオチドの糖質コンジュゲートであって、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドが、その２’位においてリガンド（例えば、糖含有リガンド）にコンジュゲートされる糖質コンジュゲートである。本明細書に記載される任意のリガンドが使用され得る。一実施形態において、コンジュゲート中のヌクレオシドは、式ＶＩＩ：
Figure 2020114886
 （式中、
式ＶＩＩ中のヌクレオシドの５’および３’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され；
Ｒ６が核酸塩基であり；
Ｒ７がリンカーであり；
各Ｒ８が、独立して、リガンドである）
のものである。各Ｒ８が、リンカーＲ７中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスフェートを介して３’末端および／またはホスホロチオエートを介して５’末端でリンカーに結合されてもよく、または逆もまた同様である。
リガンド部分（例えば、糖質部分）は、標的部位へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。リガンド部分が送達を向上させ得る一方法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性によるものである。特定の理論によって制約されるものではないが、この取り込み機構は、膜構造の陥入または細胞膜による送達系の融合による、膜によって包まれる領域の内部への、膜受容体に結合されたオリゴヌクレオチドの移動を含むものと考えられる。このプロセスは、受容体への特異的リガンドの結合の後、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。受容体を介したエンドサイトーシス系は、ガラクトースなどの糖を認識するものを含む。したがって、リガンド部分は、上述されるものなどの、１つ以上の単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類を含み得る。好ましい一実施形態において、リガンド部分は、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＰＲ２）などの、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）によって認識される部分であり得る。このような糖質部分は、例えば、糖（例えば、ガラクトースまたはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトシルアミン）を含み得る。
さらに別の実施形態は、２つ以上のヌクレオチドがそれぞれ−リンカー−リガンド部分を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド中の−リンカー−リガンド部分は、同じであってもまたは異なっていてもよい。一実施形態において、５’末端から１番目、３番目、および５番目のヌクレオチドがそれぞれ、−リンカー−リガンド部分にコンジュゲートされる。別の実施形態において、３’末端から１番目、３番目、および５番目のヌクレオチドがそれぞれ、−リンカー−リガンド部分にコンジュゲートされる。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端から１番目、３番目、および５番目のヌクレオチドがそれぞれ、−リンカー−リガンド部分にコンジュゲートされる。
さらに別の実施形態は、本発明のｉＲＮＡ剤のコンジュゲートを調製することによって治療用ＲＮＡを製剤化する方法であって、ｉＲＮＡ剤の鎖が治療用ＲＮＡを含む方法である。
さらに別の実施形態は、本発明のｉＲＮＡ剤のコンジュゲートを患者に投与することによって、治療用ＲＮＡを、それを必要とする患者に送達する方法であって、ｉＲＮＡ剤の鎖が治療用ＲＮＡを含む方法である。好ましい投与経路としては、皮下および静脈内経路が挙げられる。
実施例３３中の手順にしたがった、対照マウスと比べた、マウスにおけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの投与の４８および１４４時間後のＴＴＲタンパク質レベルを示す棒グラフである。 実施例３４中の手順にしたがった、対照マウスと比べた、マウスにおけるＡＴ３ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの投与後のＡＴ３タンパク質レベルを示す棒グラフである。 実施例６２中の手順にしたがった、マウスへのコンジュゲート５７７２７、６３１８９、６３１９２、６３１９０および６３１９１の単回の皮下投与の７２時間後のｍＴＴＲタンパク質レベルを示す棒グラフである。 実施例６２中の手順にしたがった、マウスへのコンジュゲート５７７２７、６３１８９、６３１９２、６３１９０および６３１９１の単回の皮下投与の１４４時間後のｍＴＴＲタンパク質レベルを示す棒グラフである。 実施例４２におけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート５６７１８〜５６７２７、５６７２９および５５７２７の結合親和性（Ｋｉ）の棒グラフである。 実施例４２におけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート５６７２７、５６７２９および５５７２７についての様々な濃度での中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフ（結合親和性曲線）である。 実施例４２におけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート５６７２１、５６７２２、５６７２３および５５７２７についての様々な濃度での中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。 実施例４２におけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート５６７２４、５６７２５、５６７２６、５６７１８、５６７１９、５６７２０および５５７２７についての様々な濃度での中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。 実施例４４におけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート５６８７６、６６８７５、５６８７４、５４９４４および５６８７７についての様々な濃度での中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。 実施例４４におけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート６６８７８、５６８８０、５６８７９、５４９４４、５６８８１および５６８８２についての様々な濃度での中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。 実施例４５に記載されるような、対照マウスと比べたマウスにおけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート４３５２７、６０１２６、６０１３８、６０１２８、６０１２７、６０３１６、および６０１２３（１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量で）の投与の４８および１４４時間後のＴＴＲタンパク質レベルを示す棒グラフである。 実施例４６に記載されるような、対照マウスと比べたマウスにおけるＡＴ３ ｓｉＲＮＡコンジュゲート５４９４４、５６８８１および５８１３７の投与後のＡＴ３タンパク質レベルを示す棒グラフである。 実施例４６に記載されるような、対照マウスと比べたマウスにおけるｍＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート５５７２７、５８１３８および５８１３９の投与後のｍＴＴＲタンパク質レベルを示す棒グラフである。 実施例６１におけるＴＴＲ ｓｉＲＮＡコンジュゲート６１６９６、６１６９５、６１６９２、６１６９４、６１６９７、６１６９３、４３５２７および６１６９８についての様々な濃度での中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。
定義
「オリゴヌクレオチド」という用語は、約１００ヌクレオチド未満（例えば、約５０ヌクレオチド未満の長さを有する化学的に修飾されたまたは非修飾の核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。核酸は、例えば、（ｉ）一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、（ｉｉ）ヘアピンループを有する二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、または（ｉｉｉ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＲＮＡの非限定的な例としては、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約５０ヌクレオチド（約１０〜約５０ヌクレオチドなど）の範囲の長さを有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１５〜約３０ヌクレオチドなどの約６〜約３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１８〜約２３ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
「ＧａｌＮＡｃ」という用語は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを指す。
本明細書において使用される際の「固体担体」という用語は、特に、オリゴヌクレオチドの合成が起こる任意の粒子、ビーズ、または表面を表す。本明細書に記載される方法の異なる実施形態において使用され得る固体担体は、例えば、無機担体および有機担体から選択され得る。無機担体は、好ましくは、シリカゲルおよび制御多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）から選択される。有機担体は、好ましくは、高度に架橋されたポリスチレン、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（ポリエチレングリコール（ＰＥＧまたはＰＯＥ）がグラフト化される低架橋ポリスチレンマトリックスからなるグラフト化コポリマー）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマー、アミノポリエチレングリコールおよびセルロースから選択される。本発明に適した好ましい固体担体としては、疎水性であるものが挙げられる。本発明の好ましい実施形態は、ポリスチレン系固体担体を用いる。多くの他の固体担体が、市販されており、本発明に適している。
本明細書において使用される際の「ヒドロキシ保護基」という用語は、合成手順の際の好ましくない反応からヒドロキシル基を保護する不安定な化学的部分を指す。合成手順の後、ヒドロキシ保護基は、選択的に除去され得る。当該技術分野において公知のヒドロキシ保護基は、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に一般に記載されている。ヒドロキシル保護基の例としては、以下に限定はされないが、ベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−ブロモベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、メトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２−フルフリルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、アセチル、ホルミル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、メチル、ｔ−ブチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、３−メチル−３−ブテニル、アリル、ベンジル、パラ−メトキシベンジルジフェニルメチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロフリル、メトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、メタンスルホニル、パラ−トルエンスルホニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、およびトリイソプロピルシリルが挙げられる。本発明のための好ましいヒドロキシル保護基は、アセチル（Ａｃまたは−−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）、ベンゾイル（Ｂｚまたは−−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５）、およびトリメチルシリル（ＴＭＳまたは−−Ｓｉ（ＣＨ３）３）である。
本明細書において使用される際の「アミノ保護基」という用語は、合成手順の際の好ましくない反応からアミノ基を保護する不安定な化学的部分を指す。合成手順の後、本明細書に記載されるアミノ保護基は、選択的に除去され得る。当該技術分野において公知のアミノ保護基は、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に一般に記載されている。アミノ保護基の例としては、以下に限定はされないが、アセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、およびベンジルオキシカルボニルが挙げられる。
「カルボン酸保護基」という用語は、化合物の他の機能的部位に関与する反応が行われながら、カルボン酸官能基をブロックまたは保護するのに用いられるカルボン酸保護基を指す。このようなカルボキシ保護基は、対応するカルボン酸への加水分解方法によるかまたは水素化分解方法による切断の容易さで知られている。カルボン酸エステル保護基の例としては、以下に限定はされないが、メチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、４−メトキシベンジル、Ｃ２〜Ｃ６アルカノイルオキシメチル、２−ヨードエチル、４−ニトロベンジル、ジフェニルメチル（ベンズヒドリル）、フェナシル、４−ハロフェナシル、ジメチルアリル、２，２，２−トリクロロエチル、トリ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）シリル、スクシンイミドメチルおよび類似のエステル形成部分が挙げられる。カルボキシ基のエステル保護に加えて、このような基はまた、第三級アミン塩基の存在下で、塩化アセチル、塩化プロピオニル、塩化イソブチリルおよび他の酸塩化物とともに形成されるものなどの混合無水物として保護され得る。Ｅ．Ｈａｓｌａｍ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（上掲），Ｃｈａｐｔｅｒ ５に記載されるものなどの他の公知のカルボキシ保護基が好適である。エステル形成保護基が好ましい。
上記の定義において、ヒドロキシおよびカルボキシ保護基は、網羅的に定義されていない。このような基の機能は、調製工程中の反応性官能基を保護し、次に、分子の残りの部分を中断せずに、後のある時点で除去されることである。多くの保護基が、当該技術分野で公知であり、本明細書において上で特に言及されていない他の保護基の使用が同様に適用可能である。
好適なペプチド結合試薬としては、以下に限定はされないが、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ジ−ｐ−トルオイルカルボジイミド、ＢＤＰ（１−ベンゾトリアゾールジエチルホスフェート−１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニルエチル）カルボジイミド）、ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル−３−エチル−カルボジイミド塩酸塩）、フッ化シアヌル、塩化シアヌル、ＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＤＰＰＡ（アジドリン酸ジフェニル）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１−Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５，６］−ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド）、ＢＯＰ−Ｃｌ（ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド）、ＰｙＢＯＰ（（１−Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムテトラフルオロホスフェート）、ＢｒＯＰ（ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＤＥＰＢＴ（３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）ＰｙＢｒＯＰ（ブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）が挙げられる。ＥＤＣ、ＨＯＡＴ、ＢＯＰ−ＣｌおよびＰｙＢｒＯＰが、好ましいペプチド結合試薬である。ペプチド結合試薬の量は、約１．０〜約１０．０当量の範囲である。アミド結合形成反応に使用され得る任意選択の試薬としては、約１．０〜約１０．０当量の範囲の量の、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）またはＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＡＴ（ヒドロキシアザベンゾトリアゾール）、ＨＯＳｕ（ヒドロキシスクシンイミド）、ＨＯＮＢ（ｅｎｄｏ−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキサミド）などの活性なエステル試薬が挙げられる。
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のうちのいずれかの基を指す。
「アルキル」という用語は、Ｎ、Ｏ、またはＳで任意選択的に介在され得る、示された数の炭素原子（これらとしては、以下に限定はされないが、プロピル、アリル、またはプロパルギルが挙げられる）を含有する、直鎖状または分枝鎖状であり得る飽和および不飽和の非芳香族炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１０は、基が、その中に１つ以上１０個以下の炭素原子を有し得ることを示す。「アルキレン」という用語は、二価のアルキル（すなわち、−Ｒ−）を指す。
「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を指す。
「アルキレンジオキソ」という用語は、構造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−（式中、Ｒがアルキレンを表す）の二価の種を指す。
「アミノアルキル」という用語は、アミノ基で置換されるアルキルを指す。
「メルカプト」という用語は、−ＳＨ基を指す。
「チオアルコキシ」という用語は、−Ｓ−アルキル基を指す。
「アリール」という用語は、各環の０、１、２、３、または４つの原子が置換基で置換され得る、６−炭素単環式または１０−炭素二環式芳香環系を指す。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
「アリールアルキル」および「アラルキル」という用語は、アリールで置換されるアルキルを指す。
「アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されるアルコキシを指す。
本明細書において用いられる際の「シクロアルキル」という用語は、３〜１２個の炭素、例えば、３〜８個の炭素、例えば、３〜６個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和の環状炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、任意選択的に置換され得る。シクロアルキル基としては、以下に限定はされないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合１〜３つのヘテロ原子、二環式の場合１〜６つのヘテロ原子、または三環式の場合１〜９つのヘテロ原子を有する芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を指し、ここで、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１〜３つ、１〜６つ、または１〜９つの、Ｎ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、各環の０、１、２、３、または４つの原子が、置換基で置換され得る。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、およびチアゾリルが挙げられる。
「ヘテロアリールアルキル」および「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルキルを指す。
「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルコキシを指す。
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合１〜３つのヘテロ原子、二環式の場合１〜６つのヘテロ原子、または三環式の場合１〜９つのヘテロ原子を有する非芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を指し、ここで、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１〜３つ、１〜６つ、または１〜９つの、Ｎ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、各環の０、１、２または３つの原子が、置換基で置換され得る。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、およびテトラヒドロフラニルが挙げられる。
「オキソ」という用語は、炭素に結合されるとカルボニルを形成し、窒素に結合されるとＮ−オキシドを形成し、硫黄に結合されるとスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、そのいずれも、１つ以上の置換基でさらに置換され得る。
「ＤＭＴｒ」という用語は、特に規定されない限り、４，４’−ジメトキシトリチルを指す。
「置換」という用語は、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族を含むがそれらに限定されない規定される置換基のラジカルによる、所与の構造中の１つ以上の水素ラジカルの置換を指す。置換基は、さらに置換され得ることが理解される。
「単糖」という用語は、アロース、アルトロース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ−フシトール、Ｌ−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸、グロースグリセルアルデヒド、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノス−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロースおよびキシルロースのラジカルを包含する。単糖は、Ｄ−またはＬ−立体配置にあり得る。単糖はさらに、デオキシ糖（水素で置換されたアルコールヒドロキシ基）、アミノ糖（アミノ基で置換されたアルコールヒドロキシ基）、チオ糖（チオールで置換されたアルコールヒドロキシ基、またはＣ＝Ｓで置換されたＣ＝Ｏ、または硫黄で置換された環状形態の環酸素）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（窒素で置換された環炭素）、イミノ糖（窒素で置換された環酸素）、ホスファノ糖（リンで置換された環酸素）、ホスファ糖（リンで置換された環炭素）、Ｃ−置換単糖（炭素で置換された、非末端炭素原子における水素）、不飽和単糖、アルジトール（ＣＨＯＨ基で置換されたカルボニル基）、アルドン酸（カルボキシ基で置換されたアルデヒド基）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などであり得る。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換され得ることが理解される。
「二糖」、「三糖」および「多糖」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレジトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリマイシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α−トレハロース、トレハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロースなどのラジカルを包含する。さらに、「二糖」、「三糖」および「多糖」などは、さらに置換され得ることが理解される。二糖は、アミノ糖およびそれらの誘導体、特に、Ｃ−４’位で誘導体化されたミカミノースまたはＣ−６’位で誘導体化された４デオキシ−３−アミノ−グルコースも含む。
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチマイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣体、アンチｍｉＲ、アンタゴｍｉｒ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、アプタマー、免疫刺激、デコイオリゴヌクレオチド、スプライシング変化オリゴヌクレオチド、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、Ｇ−四量体またはアンチセンスであり得る。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤である。
ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＵＮＡ（ロックされていない（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸）ヌクレオチドである１つ以上のモノマーを含む。ＵＮＡは、ロックされていない非環状核酸を指し、ここで、糖の結合の少なくとも１つが、除去されており、ロックされていない「糖」残基を形成する。一例において、ＵＮＡは、Ｃ１’〜Ｃ４’の間の結合（すなわち、Ｃ１’−Ｃ４’炭素の間の炭素−酸素−炭素共有結合）が除去されているモノマーも包含する。別の例において、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’およびＣ３’炭素の間の炭素−炭素共有結合）が除去されている（参照により本明細書に援用されるＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照）。
「ｉＲＮＡ剤」という用語は、標的遺伝子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、好ましくは、内因性または病原体標的ＲＮＡの発現を下方制御することができるＲＮＡ剤（またはＲＮＡ剤へと切断され得る）を指す。理論によって制約されるのを望むものではないが、ｉＲＮＡ剤は、標的ｍＲＮＡ（当該技術分野においてＲＮＡｉと呼ばれる）の転写後切断、または転写前または翻訳前機序を含むいくつかの機序のうちの１つ以上によって作用し得る。ｉＲＮＡ剤は、一本鎖を含むことができ、または２本以上の鎖を含むことができ、例えば、ｉＲＮＡ剤は、二本鎖ｉＲＮＡ剤であり得る。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合、ｉＲＮＡ剤は、１つ以上のリン酸基またはリン酸基の１つ以上の類似体を含む５’修飾を含み得る。好ましい一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は二本鎖である。
ｉＲＮＡ剤は、典型的に、標的遺伝子に十分に相同な領域を含み、ヌクレオチドに関して十分な長さを有し、それによって、ｉＲＮＡ剤、またはその断片は、標的遺伝子の下方制御を媒介し得る。ｉＲＮＡ剤は、少なくとも部分的に、ある実施形態において完全に、標的ＲＮＡに相補的である領域であるかまたはそれを含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間の完全な相補性がある必要はないが、ｉＲＮＡ剤、またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断によって、配列特異的なサイレンシングを指令することが可能であるほど一致が十分であるのが好ましい。
ｉＲＮＡ剤中のヌクレオチドは、修飾されてもよく（例えば、１つ以上のヌクレオチドは、２’−Ｆまたは２’−ＯＣＨ３基を含み得る）、またはヌクレオチドサロゲートであってもよい。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、修飾されてもよく、またはヌクレオシドサロゲートを含んでいてもよく、例えば、非対合領域またはヘアピン構造の領域、例えば、２つの相補的な領域を結合する領域は、修飾またはヌクレオシドサロゲートを有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の３’末端または５’末端を安定化させる修飾。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサ（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、ホスホロアミダイトとして生じ、別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成の際の複数の結合を可能にする特殊なビオチンまたはフルオレセイン試薬を含み得る。修飾は、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基における修飾の使用、例えば、デオキシリボヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチドの代わりにデオキシチミジンの使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾も含み得る。ある実施形態において、異なる鎖が、異なる修飾を含む。
ある実施形態において、鎖は、ｉＲＮＡ剤が分子の一端または両端で一本鎖または非対合領域を含むように選択されるのが好ましい。二本鎖ｉＲＮＡ剤は、好ましくは、オーバーハング、例えば、１つまたは２つの５’または３’オーバーハング（好ましくは、少なくとも、２〜３個のヌクレオチドの３’オーバーハング）と対合される鎖を有する。好ましいｉＲＮＡ剤は、各末端で１つまたは好ましくは、２つまたは３つのヌクレオチド長の一本鎖オーバーハング、好ましくは、３’オーバーハングを有する。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長いことの結果、または同じ長さの２つの鎖が互い違いに交差されることの結果であり得る。
ｉＲＮＡ剤の鎖の間の二本鎖領域の好ましい長さは、６〜３０ヌクレオチド長である。好ましい二本鎖領域は、１５〜３０、最も好ましくは、１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。他の好ましい二本鎖領域は、６〜２０ヌクレオチド、最も好ましくは、６、７、８、９、１０、１１および１２ヌクレオチド長である。
オリゴヌクレオチドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００９／０２３９８１４号明細書、同第２０１２／０１３６０４２号明細書、同第２０１３／０１５８８２４号明細書、または同第２００９／０２４７６０８号明細書に記載されているものであり得る。
本明細書において使用される際の「一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」は、単一の分子から構成されるｓｉＲＮＡ化合物である。それは、鎖内対合によって形成される二本鎖領域を含んでいてもよく、例えば、それは、ヘアピンまたはフライパンの柄の構造であるかまたはそれを含み得る。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、標的分子に対してアンチセンスであり得る。
一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、ＲＩＳＣに入り、標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣを介した切断に関与することができるのに十分に長くなり得る。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、少なくとも１４ヌクレオチド長、他の実施形態において、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、２００、１００、または６０ヌクレオチド長未満である。
ヘアピンｓｉＲＮＡ化合物は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対以上の二本鎖領域を有する。二本鎖領域は、２００、１００、または５０長以下であり得る。特定の実施形態において、二本鎖領域の範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。ヘアピンは、一本鎖オーバーハングまたは末端の非対合領域を有し得る。特定の実施形態において、オーバーハングは、２〜３ヌクレオチド長である。ある実施形態において、オーバーハングは、ヘアピンのセンス側にあり、ある実施形態において、ヘアピンのアンチセンス側にある。
本明細書において使用される際の「二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」は、鎖間ハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成し得る、２つ以上、場合によっては２つの鎖を含むｓｉＲＮＡ化合物である。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６ １７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長以上であり得る。それは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であり得る。範囲は、１７〜２５、１９〜２３、１９〜２１ヌクレオチド長であり得る。本明細書において使用される際、「アンチセンス鎖」という用語は、標的分子、例えば標的ＲＮＡに対して十分に相補的なｓｉＲＮＡ化合物の鎖を意味する。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のセンス鎖は、１４、１５、１６ １７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長以上であり得る。それは、２００、１００、または５０、ヌクレオチド長以下であり得る。範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長であり得る。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の二本鎖部分は、１４、１５、１６ １７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド対の長さ以上であり得る。それは、２００、１００、または５０、ヌクレオチド対の長さ以下であり得る。範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対の長さであり得る。
多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物は、より小さいｓｉＲＮＡ化合物、例えば、ｓｉＲＮＡ剤を産生するように、内因性分子によって、例えば、Ｄｉｃｅｒによって切断され得るほど十分に大きい。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物が、分子の一端または両端で一本鎖または非対合領域を含むように選択され得る。したがって、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、１〜３個のヌクレオチドのオーバーハング、例えば、１つまたは２つの５’または３’オーバーハング、または３’オーバーハングを含有するように対合されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有し得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長いことの結果、または同じ長さの２つの鎖が互い違いに交差されることの結果であり得る。ある実施形態は、少なくとも１つの３’オーバーハングを有する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の両端は、３’オーバーハングを有する。ある実施形態において、オーバーハングは、２個のヌクレオチドである。
特定の実施形態において、二本鎖領域の長さは、例えば、上述されるｓｓｉＲＮＡ化合物の範囲内で、１５〜３０、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓｓｉＲＮＡ化合物は、天然のＤｉｃｅｒによって長いｄｓｉＲＮＡからプロセシングされた産物と長さおよび構造が類似し得る。ｓｓｉＲＮＡ化合物の２つの鎖が結合される、例えば、共有結合される実施形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および３’オーバーハングを提供する他の一本鎖構造も考えられる。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物および一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を含む本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写産物のサイレンシングを媒介することができる。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書においてサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。このような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内因性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡも標的にされ得る。
本明細書において使用される際、「ＲＮＡｉを媒介する」という語句は、配列特異的に、標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論によって制約されるのを望むものではないが、サイレンシングは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ、例えば、２１〜２３個のヌクレオチドのｓｓｉＲＮＡ化合物を使用するものと考えられる。
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物が、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに対して「十分に相補的」であり、それによって、ｓｉＲＮＡ化合物は、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングする。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡに対して「正確に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ化合物は、例えば、正確な相補性の領域においてワトソン・クリック塩基対のみから構成されるハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的」な標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して正確に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含み得る。さらに、特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物は、具体的に、単一のヌクレオチドの違いを識別する。この場合、ｓｉＲＮＡ化合物は、正確な相補性が、単一のヌクレオチドの違いがある（例えば、７ヌクレオチド内の）領域に見られる場合のみ、ＲＮＡｉを媒介する。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない小さいＲＮＡ分子の高度に保存された種類である。プロセシングされるｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、発達、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の主要調節因子として認識されている一本鎖約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。それらは、特定のｍＲＮＡの３’−不飽和領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に役割を果たすものと考えられる。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写産物切断、またはその両方によって、遺伝子発現の下方制御を媒介する。ＲＩＳＣは、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
これまでに同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は、多数であり、ますます増加しており、その例示的な例が、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１；およびさらにｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／に見られる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態において、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的化ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択される配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば標的遺伝子ｍＲＮＡの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なｍＲＮＡに結合することによって遺伝子発現を阻害するものと考えられる。標的ｍＲＮＡへの結合は、それに結合することによって相補的なｍＲＮＡ鎖の翻訳を防ぐことによって、または標的ｍＲＮＡの分解をもたらすことによって、遺伝子発現の阻害をもたらし得る。アンチセンスＤＮＡは、特定の、相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的にするのに使用され得る。結合が起こる場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅ Ｈによって分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは、約１５〜約３０個のヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の標的遺伝子に対して正確に相補的でないことがあり得るアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、非標的特異的活性がアンチセンスで見られる場合、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途に最も好ましい場合が想定される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、タンパク質合成の有効な標的化阻害剤であることが実証されており、その結果、標的化遺伝子によってタンパク質合成を特異的に阻害するのに使用され得る。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼおよびムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（それぞれが参照により援用される米国特許第５，７３９，１１９号明細書および米国特許第５，７５９，８２９号明細書）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体およびヒトＥＧＦで実証されている（それぞれが参照により援用される、Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号明細書；米国特許第５，７８９，５７３号明細書；米国特許第５，７１８，７０９号明細書および米国特許第５，６１０，２８８号明細書）。さらに、アンチセンス構築物が、様々な異常な細胞増殖、例えば癌を阻害し、それを治療するのに使用され得ることも記載されている（それぞれが参照により援用される、米国特許第５，７４７，４７０号明細書；米国特許第５，５９１，３１７号明細書および米国特許第５，７８３，６８３号明細書）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを産生する方法が、当該技術分野において公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するように容易に適合され得る。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択される標的配列の分析ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二量体、ヘアピン、または宿主細胞中の標的ｍＲＮＡへの特異的な結合を減少させるかまたは妨げ得る他の二次構造を形成するそれらの相対的な能力の低さに基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンにおけるまたはその近くの領域およびｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造の分析および標的部位の選択判断は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を用いて行われ得る。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、ＲＮＡｓｅ保護ならびに向上した組織および細胞取り込みなどの薬理学的特性のための様々な修飾を有するＲＮＡ様のオリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖、ホスホロチオエート骨格および、例えば、３’末端におけるコレステロール部分の完全な２’−Ｏ−メチル化によって、通常のＲＮＡと異なる。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒおよび内因性ｍｉＲＮＡを含む二本鎖を形成し、それによって、ｍｉＲＮＡに誘発される遺伝子サイレンシングを防ぐことによって、内因性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングするのに使用され得る。アンタゴｍｉｒを介したｍｉＲＮＡサイレンシングの例は、全体が参照により本明細書に明示的に援用されるＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９に記載されるｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。アンタゴｍｉｒ ＲＮＡは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用いて合成され得る。米国特許出願公開第２００７／０１２３４８２号明細書および同第２００７／０２１３２９２号明細書（それぞれが参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
アンタゴｍｉｒは、オリゴヌクレオチド合成のためのリガンドがコンジュゲートされたモノマーサブユニットおよびモノマーを含み得る。例示的なモノマーが、全体が参照により援用される米国特許出願公開第２００５／０１０７３２５号明細書に記載されている。アンタゴｍｉｒは、全体が参照により援用される国際公開第２００４／０８０４０６号に記載されるようなＺＸＹ構造を有し得る。アンタゴｍｉｒは、両親媒性部分と複合体を形成し得る。オリゴヌクレオチド作用物質とともに使用するための例示的な両親媒性部分は、全体が参照により援用される国際公開第２００４／０８０４０６号に記載されている。
アプタマー
アプタマーは、高い親和性および特異性を有する該当する特定の分子に結合する核酸またはペプチド分子である（それぞれ、全体が参照により援用される、Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８（１９９０））。大きいタンパク質から小さい有機分子まで多くの様々な実体に結合するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーの産生が成功している。それぞれ、全体が参照により援用される、Ｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１０−１６（１９９７）、Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：３２４−９（１９９９）、およびＨｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０−５（２０００）を参照されたい。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡベースであってもよく、リボスイッチを含み得る。リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合することができ、標的の結合が遺伝子の活性に影響を与えるｍＲＮＡ分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するｍＲＮＡが、その標的分子の存在または非存在に応じて、それ自体の活性を調節するのに直接関与する。一般に、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織および生物などの様々な分子標的に結合するための反復するインビトロでの選択または同等に、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））によって操作される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。アプタマーは、合成、組み換え、および精製方法を含む任意の公知の方法によって調製されてもよく、単独で、または同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用され得る。さらに、本明細書により詳細に記載されるように、「アプタマー」という用語は、具体的に、２つ以上の公知のアプタマーを所与の標的と比較することから導かれるコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
リボザイム
別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子は、リボザイムと結合される。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ分子錯体である（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムは、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断する高度な特異性で、リン酸エステル転移反応を加速する（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ ａｎｄ Ｓｈｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、化学反応の前に、基質が塩基対形成相互作用によってリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する必要があることに起因するとされている。
天然の酵素的ＲＮＡの少なくとも６つの基本的な種が現在知られている。それぞれが、生理的条件下で、トランスでＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように機能する分子の酵素部分に近接して保たれる酵素的核酸の標的結合部分によって起こる。したがって、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡを認識し、次に、相補的な塩基対形成によって標的ＲＮＡに結合し、正確な部位に結合されると、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質の合成を指令するその能力を損なうであろう。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合し、そのＲＮＡ標的を切断した後、別の標的を探すためにそのＲＮＡから放出され、新たな標的との結合および切断を繰り返すことができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス、グループＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と結合されている）またはアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳ ＲＮＡモチーフで形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体例が、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ Ｓｅｐ １１；２０（１７）：４５５９−６５によって記載されている。ヘアピンモチーフの例が、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（欧州特許出願公開第ＥＰ０３６０２５７号明細書）、Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号明細書によって記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例が、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２によって記載され；ＲＮａｓｅＰモチーフの例が、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７によって記載され；アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフが、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）によって記載され；グループＩイントロンの例が、米国特許第４，９８７，０７１号明細書に記載されている。使用される酵素的核酸分子の重要な特性は、それらが、標的遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡ領域の１つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有すること、およびそれらが、分子にＲＮＡ切断活性を与える基質結合部位の内部または周囲にヌクレオチド配列を有することである。したがって、リボザイム構築物は、本明細書に記載される特定のモチーフに限定される必要はない。
任意のポリヌクレオチド配列に標的化されるリボザイムを産生する方法は、当該技術分野において公知である。リボザイムは、それぞれが具体的に参照により本明細書に援用される国際特許出願公開国際公開第９３／２３５６９号および国際公開第９４／０２５９５号に記載されるように設計され、それらの文献に記載されるように、インビトロおよびインビボで試験されるように合成され得る。
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変更するか、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する修飾（例えば、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に行われ得る様々な化学修飾を記載する、国際特許出願公開国際公開第９２／０７０６５号、国際公開第９３／１５１８７号、および国際公開第９１／０３１６２号；欧州特許出願公開第９２１１０２９８．４号明細書；米国特許第５，３３４，７１１号明細書；および国際特許出願公開国際公開第９４／１３６８８号を参照）、細胞におけるそれらの有効性を高める修飾、およびＲＮＡ合成時間を短縮し、化学的条件を減少させるためのステムＩＩ塩基の除去を有するリボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
免疫刺激オリゴヌクレオチド
哺乳動物または他の患者であり得る被験体に投与されるとき、免疫応答を誘発することが可能な免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）を含む、脂質粒子と結合される核酸は、免疫刺激性であり得る。ＩＳＳは、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定のパリンドローム（全体が参照により援用されるＹａｍａｍｏｔｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６を参照）、またはＣｐＧモチーフ、ならびに他の公知のＩＳＳの特徴（多重Ｇドメインなど、全体が参照により援用される国際公開第９６／１１２６６号を参照）を含む。
免疫応答は、自然免疫応答または適応免疫応答であり得る。免疫系は、脊椎動物のさらなる自然免疫系、および獲得適応免疫系に分けられ、後者は、体液性細胞成分にさらに分けられる。特定の実施形態において、免疫応答は、粘膜性であり得る。
特定の実施形態において、免疫刺激核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与される場合にのみ免疫刺激性であり、その「遊離形態」で投与される場合、免疫刺激性でない。このようなオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性であるとみなされる。
免疫刺激核酸は、免疫応答を誘発するために、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、標的ポリヌクレオチドの発現を低下させる必要がない場合、非配列特異的であるとみなされる。したがって、特定の免疫刺激核酸は、天然の遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含み得るが、それでもなお非配列特異的免疫刺激核酸とみなされ得る。
一実施形態において、免疫刺激核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくてもまたはメチル化されていてもよい。別の実施形態において、免疫刺激核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１個のＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態において、核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、前記ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンがメチル化される。代替的な実施形態において、核酸は、少なくとも２個のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、ＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１個のシトシンがメチル化される。さらなる実施形態において、配列中に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンがメチル化される。別の実施形態において、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、前記ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つが、メチル化シトシンを含む。
リンカー
リンカーは、オリゴヌクレオチドをリガンドに結合するための任意の好適な基であり得る。リンカーの他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第２００９／０８２６０７号および米国特許出願公開第２００９／０２３９８１４号明細書、同第２０１２／０１３６０４２号明細書、同第２０１３／０１５８８２４号明細書、または同第２００９／０２４７６０８号明細書に記載されている。
リンカーへのオリゴヌクレオチドの結合点
オリゴヌクレオチドは、両者を結合するための任意の好適な基を介してリンカーに結合され得る。基は、切断可能であるかまたは切断不可能であり得る。リンカーおよび好適な結合基の例が、本明細書に記載される。結合基の他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第２００９／０８２６０７号および米国特許出願公開第２００９／０２３９８１４号明細書、同第２０１２／０１３６０４２号明細書、同第２０１３／０１５８８２４号明細書、または同第２００９／０２４７６０８号明細書に記載されている。好適な結合基としては、例えば、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨまたは以下に限定はされないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの、原子の鎖が挙げられ、そのそれぞれが、置換または非置換であってもよく、１つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、または置換または非置換複素環式によって介在または終端され得、ここで、Ｒ８が、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
切断可能な基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞中に入ると切断されて、基が結合している２つの部分を放出する基である。好ましい実施形態において、切断可能な基は、被験体の血液中、または（例えば、血液または血清中で見られる条件を模倣するかまたは表すように選択され得る）第２の参照条件下より少なくとも１０倍以上、好ましくは、少なくとも１００倍以上速く、標的細胞または（例えば、細胞内条件を模倣するかまたは表すように選択され得る）第１の参照条件下で切断される。
切断可能な基は、切断因子、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断因子は、血清または血液中より細胞内でより高いレベルまたは活性で、より広くまたはより多く見られる。このような分解因子の例としては、例えば、酸化還元で切断可能な基を還元によって分解することができる、細胞内に存在するメルカプタンなどの酸化もしくは還元酵素または還元剤を含む、特定の基質のために選択されるかまたは基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を生じさせることが可能な薬剤、例えば、５以下のｐＨを生じさせる薬剤；一般酸として作用することによって酸で切断可能な基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、およびホスファターゼが挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能な基は、ｐＨの影響を受けやすいことがある。ヒト血清のｐＨは、７．４である一方、平均の細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な基を有し、それによって、細胞内のリガンドから、または細胞の所望の区画中に、カチオン性脂質を放出する。
コンジュゲートは、特定の酵素によって切断することができる切断可能な基を含み得る。コンジュゲート中に組み込まれる切断可能な基のタイプは、標的にされる細胞に応じて決まる。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含む化学的部分を介してカチオン性脂質に結合され得る。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、基は、エステラーゼが豊富でない細胞型中より効率的に肝細胞中で切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含む結合基が、肝細胞および滑膜細胞などの、ペプチダーゼが豊富な細胞型を標的にする場合に使用され得る。
一般に、候補の切断可能な基の好適性は、候補の基を切断する分解因子の能力（または条件）を試験することによって評価され得る。血液中でのまたは他の非標的組織と接触したときの切断に抵抗する能力についても候補の切断可能な基を試験することも望ましい。このように、第１の条件と第２の条件との間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、ここで、第１の条件は、標的細胞内での切断を示すように選択され、第２の条件は、他の組織または生体液、例えば、血液または血清中での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系で、細胞で、細胞培養で、器官もしくは組織培養で、または動物全体で行われ得る。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下）と比較して少なくとも２、４、１０または１００倍速く、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下）で切断される。
ｉ．酸化還元で切断可能な基
切断可能な基の１つの種類は、還元または酸化により切断される酸化還元で切断可能な基である。還元で切断可能な基の例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。候補の切断可能な基が、好適な「還元で切断可能な連結基」であるか、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化剤とともに使用するのに好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または細胞内、例えば、標的細胞内で観察される切断の速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を用いた他の還元剤を用いたインキュベーションによって評価され得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価され得る。好ましい実施形態において、候補の化合物は、血液中で１０％以下切断される。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下）と比較して少なくとも２、４、１０または１００倍速く、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下）で分解される。候補の化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択され、細胞外媒体を模倣するように選択される条件と比較される条件下で標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され得る。
ｉｉ．ホスフェート系の切断可能な基
ホスフェート系の切断可能な基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、および−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
ｉｉｉ．酸で切断可能な基
酸で切断可能な基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸で切断可能な基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、またはそれを下回る）のｐＨを有する酸性環境において、または一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低いｐＨの細胞小器官が、酸で切断可能な連結基のための切断環境を提供することができる。酸で切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸で切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合される炭素（アルコキシ基）がアリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
ｉｖ．エステル系の基
エステル系の切断可能な基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルで切断可能な連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）−で表される。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
ｖ．ペプチド系の切断基
ペプチド系の切断可能な基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−で表され、式中、ＲＡおよびＲＢが、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。本明細書において使用される際、「糖質」は、酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、少なくとも６つの炭素原子を有する１つ以上の単糖単位（直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る）から構成されるそれ自体糖質である化合物；または酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、それぞれが少なくとも６つの炭素原子を有する１つ以上の単糖（直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る）から構成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な糖質としては、糖（単糖、二糖、三糖および約４〜９つの単糖単位を含有するオリゴ糖）、ならびにでんぷん、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖類が挙げられる。具体的な単糖としては、Ｃ５以上（好ましくは、Ｃ５〜Ｃ８）糖が挙げられ；二糖および三糖としては、２つまたは３つの単糖単位（好ましくは、Ｃ５〜Ｃ８）を有する糖が挙げられる。
リガンド
リガンドは、本明細書に記載される任意のリガンドであり得る。
他の好適なリガンドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００９／０２３９８１４号明細書、同第２０１２／０１３６０４２号明細書、同第２０１３／０１５８８２４号明細書、または同第２００９／０２４７６０８号明細書に記載されている。
製剤
本明細書に記載されるコンジュゲートは、被験体に投与するために製剤化され得る。説明しやすくするために、この項における製剤、組成物および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤のコンジュゲートに関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法が、他のオリゴヌクレオチド、例えば、修飾されたｉＲＮＡ剤のコンジュゲートで実施することができ、このような実施が本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
製剤化されたｉＲＮＡコンジュゲートは、様々な状態をとり得る。ある例において、コンジュゲートは、少なくとも部分的に結晶性、均一の結晶性、および／または無水（例えば、８０、５０、３０、２０、または１０％未満の水）である。別の例において、ｉＲＮＡコンジュゲートは、水相中、例えば、水を含む溶液中にある。
水相または結晶性コンジュゲートは、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に、水相の場合）または粒子（例えば、結晶性組成物に適切であり得るように、微小粒子）中に組み込まれ得る。一般に、ｉＲＮＡコンジュゲートは、意図される投与方法と適合する方法で製剤化される。ｉＲＮＡコンジュゲートは、核酸脂質ナノ粒子中に組み込まれ得る。一実施形態において、各ナノ粒子は、コンジュゲート、カチオン性脂質（例えば、約５〜約７などの約４〜約１１の範囲のｐＫａを有するカチオン性脂質）、非カチオン性脂質（中性脂質など）、凝集還元剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ修飾脂質など）、および任意選択的にステロール（例えば、コレステロール）を含む。
特定の実施形態において、組成物は、以下の方法、すなわち、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、またはこれらの技術の組合せ；または脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、凝縮および他の自己集合のうちの少なくとも１つによって調製される。
ｉＲＮＡコンジュゲートは、別の薬剤、例えば、別の治療剤またはｉＲＮＡを安定させる薬剤、例えば、ｉＲＮＡと複合体を形成して、ｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤化され得る。さらに他の薬剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広い特異性のＲＮＡｓｅ阻害剤）などが挙げられる。
一実施形態において、ｉＲＮＡ組成物は、少なくとも１つの第２の治療剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の薬剤）を含む。例えば、ウイルス性疾患、例えば、ＨＩＶの治療用のｉＲＮＡ組成物は、公知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）を含んでいてもよい。別の例において、癌の治療用のｉＲＮＡ組成物は、化学療法剤をさらに含んでいてもよい。
ｉＲＮＡコンジュゲートは、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みに影響を与える（例えば、増加させる）薬剤とともに製剤化されてもよい。薬剤は、ｉＲＮＡ剤が投与される前、その後、またはそれと同時に投与され得る。薬剤はまた、ｉＲＮＡ剤に共有結合され得る。薬剤は、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。薬剤は、細胞に一過性の影響を与え得る。
一実施形態において、使用される薬剤は、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間体フィラメントを破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増加させる。薬剤は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
薬剤はまた、例えば、炎症反応を活性化することによって、細胞中へのｉＲＮＡコンジュゲートの取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的な薬剤としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、実施例は、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参照文献、係属中の特許出願および公開特許の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
略語：ＴＢＡＨＳは、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩であり；ＤＣＭは、ジクロロメタンであり；ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドであり；ＤＩＥＡは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり；ＥＤＣは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。
実施例１：非環状リンカー−１による三本鎖ＧａｌＮＡｃモノマーの合成
三本鎖ＧａｌＮＡｃ部分２１１ａ〜ｄを、以下のスキーム１に示されるように合成する。
Figure 2020114886
ｉ．（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタン−１，２−ジオール２０１の合成
メタノール（６０ｍＬ）中の市販の（Ｒ）−メチル２−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−２−ヒドロキシアセテート２００（１．９ｇ）の撹拌溶液に、固体水素化ホウ素ナトリウム（０．４ｇ）を、０〜５℃で加え、添加後、反応混合物を室温に温め、２０分間撹拌する。反応混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈し、ジクロロメタンで抽出する。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物（１．６ｇ）を単離し、それをさらに精製せずに次の工程にそのまま使用する。
ｉｉ．（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−２−ヒドロキシエチルメタンスルホネート２０２の合成
ジクロロメタン（６０ｍＬ）中のアルコール２０１（１．６ｇ）の溶液に、トリエチルアミン（１．５ｍＬ）を加え、混合物を撹拌しながら冷却する。この撹拌溶液に、ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のメタンスルホニルクロリド（１．３ｇ）を滴下して加え、混合物を室温で２時間撹拌し、その後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）、続いて塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた後、濃縮する。このように得られた粗生成物を、シリカゲルを用いて精製すると、純粋な生成物が得られた。
ｉｉｉ．２０３ａ〜ｄの合成のための一般的な手順
一般的な手順において、核酸塩基（２当量）を、１１０℃で無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、この撹拌溶液に、固体ＣｓＣＯ３（２ｇ）およびヨウ化ナトリウム（２ｇ）を加え、混合物を激しく撹拌する。この撹拌溶液に、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のメシレート２０２（１当量）の溶液を滴下して加える。反応混合物を、１１０℃でさらに３０分間撹拌した後、減圧下で濃縮する。残渣を酢酸エチルに溶解させ、有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させる（無水Ｎａ２ＳＯ４）。有機層の濃縮により、粗生成物が得られ、それを、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物２０３ａ〜ｄを単離する。
ｉｖ．２０４ａ〜ｄの合成
アルコール２０３ａ〜ｄを、トリエチルアミンの存在下で、炭酸ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）で最初に処理して、スクシンイミジルエステルを得て、それを、ピリジンの存在下で、モノフタルイミド保護されたヘキサンジアミンで処理したところ、カラム精製の後、アミン置換された生成物２０４ａ〜ｄが得られる。
ｖ．２０５ａ〜ｄの合成
２０４ａ〜ｄ中のアセトニド保護を、報告される条件下で、酢酸で処理することによって除去したところ、２０５ａ〜ｄが得られ、それを次の工程にそのまま使用する。
ｖｉ．２０６ａ〜ｄの合成
ピリジン中のＤＭＴｒＣｌによるジオール２０５ａ〜ｄの処理により、モノＤＭＴ保護されたアルコール２０６ａ〜ｄが得られるであろう。
ｖｉｉ．２０７ａ〜ｄの合成
フタルイミド保護されたアミン２０６ａ〜ｄを、室温で一晩、メタノール（２０倍）中のメチルアミンの溶液で処理する。反応混合物の濃縮、続いてカラム精製により、脱保護アミン２０７ａ〜ｄが得られる。
ｖｉｉｉ．２０８ａ〜ｄの合成
ＥＤＣおよびヒューニッヒ塩基を用いた、アミン２０７ａ〜ｄによる一本鎖ＧａｌＮＡｃ含有カルボン酸の結合により、リガンドがコンジュゲートされたモノマー２０８ａ〜ｄが生じ得る。
ｉｘ．２０９ａ〜ｄの合成
同様の結合手順を用いて、アミン２０７ａ〜ｄによる、三本鎖ＧａｌＮＡｃ含有カルボン酸の結合により、三本鎖ＧａｌＮＡｃがコンジュゲートされたモノマー２０９ａ〜ｄが生じ得る。
ｘ．２１０ａ〜ｄおよび２１１ａ〜ｄの合成
ＣＨ２Ｃｌ２中のヒューニッヒ塩基の存在下における、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いた、アルコール２０８ａ〜ｄおよび２０９ａ〜ｄのリン酸化により、対応するアミダイト２１０ａ〜ｄおよび２１１ａ〜ｄが、フラッシュカラム精製後に得られた。
実施例２：非環状リンカー−２を用いた三本鎖ＧａｌＮＡｃモノマーの合成
三本鎖ＧａｌＮＡｃ部分２１９を、以下のスキーム２に示されるように合成する。
Figure 2020114886
実施例３：非環状リンカー−３を用いた三本鎖ＧａｌＮＡｃモノマーの合成
三本鎖ＧａｌＮＡｃ部分２１５を、以下のスキーム３に示されるように合成する。
Figure 2020114886
ｉ．２２２の合成
市販の（Ｒ）−グリシドールを、文献に報告されるようにＯＤＭＴｒ保護されたエポキシド２２０に転化した。３０分間にわたるマイクロ波照射下での、１１０℃での１，６−ジメチルアミノヘキサン２２１（６ｍｍｏｌ、２当量）によるエポキシド２２０（１．１２ｇ、３ｍｍｏｌ）の処理により、エポキシド開環生成物２２２が９０％の収率で得られた。
ｉｉ．２２４の合成
カルボン酸２２３とのアミン２２２の結合により、結合された生成物２２４が良好な収率で得られた。
ｉｉｉ．２２５の合成
ＣＨ２Ｃｌ２中のヒューニッヒ塩基の存在下における２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いたアルコール２２４のリン酸化により、フラッシュカラム精製の後、対応するアミダイト２２５が得られた。
実施例４：三本鎖α−アノマー−コンジュゲート構成単位の一般構造
下式で表される三本鎖α−アノマーを調製する。
Figure 2020114886
例えば、Ｒ、Ｒ’、およびＲ”が、独立して、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０複素環式芳香族、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、または糖（例えば、ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ）であり得る。
下式で表される三本鎖α−アノマーも調製する。
Figure 2020114886
例えば、Ｒ、Ｒ’、およびＲ”が、独立して、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０複素環式芳香族、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、または糖（例えば、ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ）であり得る。
実施例５：三本鎖β−アノマー−コンジュゲート構成単位の一般構造
下式で表される三本鎖β−アノマーを調製する。
Figure 2020114886
例えば、Ｒ、Ｒ’、およびＲ”が、独立して、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０複素環式芳香族、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、または糖（例えば、ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ）であり得る。
実施例６：二本鎖α−アノマー−コンジュゲート構成単位の一般構造
下式で表される二本鎖α−アノマーを調製する。
Figure 2020114886
例えば、Ｒ、Ｒ’、およびＲ”が、独立して、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０複素環式芳香族、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、または糖（例えば、ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ）であり得る。
実施例７：モノ−、ビ−およびトリ−コンジュゲート構成単位の合成
モノ−、ビ−およびトリ−コンジュゲート構成単位が、以下に示されるように、アジド中間体から調製され得る。
Figure 2020114886
実施例８：ＡＳＧＰＲリガンドの中間体（スキーム４〜８）の合成
ＡＳＧＰＲリガンドを調製するのに有用な中間体が、以下のスキーム４〜８に示されるように合成され得る。
Figure 2020114886
化合物９の合成：Ｎ−アセチルグルコサミン（５０ｇ、２２６ｍｍｏｌ）を、アリルアルコールに取り込み、９０℃で２４時間加熱する。反応混合物を室温に冷まし、アリルアルコールを蒸留によって除去する。残渣をピリジンに溶解させ、塩化ピバロイルと反応させたところ、化合物３が得られる。ピバロイルエステルを、２時間にわたってピリジン中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させ、混合物を、水を加えることによってクエンチする。混合物を、９０℃で２４時間加熱したところ、生成物４が得られる。エステル基を、ナトリウムメトキシドによる処理によって除去し、化合物５を単離する。ヒドロキシル基をジメトキシプロパンによって保護したところ、生成物６が得られる。次に、それをＤＭＦ中の塩化トシルおよびアジ化ナトリウムと反応させたところ、化合物７が得られる。化合物７を、クリック付加環化（Ｃｌｉｃｋ ｃｙｌｃｏ−ａｄｄｉｔｉｏｎ）およびＭＣＰＢＡによるエポキシ化に供したところ、化合物９が生成される。
Figure 2020114886
化合物１３の合成：エポキシド１３を、ＬｉＣｌＯ４の存在下でアンモニアと反応させたところ、アミノアルコール１０が生成される。これを、ペプチド結合条件下で、Ｎ−Ｃｂｚアミノヘキサン酸と結合させたところ、化合物１１が得られる。アセトニド保護の除去およびヒドロキシル基のベンゾイル化により、化合物１２が生成される。ＭｅＯＨ中のＰｄ／Ｃを用いた化合物１２の水素化により、アミン１３がＴＦＡ塩として生成される。
Figure 2020114886
化合物１７の合成：ペプチド結合条件下で、アミン１３を、トリカルボン酸１４と反応させたところ、化合物１５が生成される。水素化により、化合物１６が得られ、次に、それを、モノベンジルドデカン二酸と反応させたところ、保護された三本鎖中間体１７が得られる。
Figure 2020114886
ヒドロキシプロリン中間体２０の合成：化合物１７を、バルーン圧力下で水素化したところ、カルボン酸１８が得られ、次に、それをアミン１９と反応させたところ、ペプチド結合条件下で化合物２０が生成される。
Figure 2020114886
固体担体２１の合成：ヒドロキシプロリン２０を、無水コハク酸およびＤＭＡＰと反応させたところ、スクシネート誘導体が生成される。このスクシネート誘導体を、ペプチド結合条件を用いて固体担体上に充填したところ、担体２１が得られる。
実施例９：三本鎖β−アノマー−コンジュゲート構成単位の合成（スキーム９〜１０）
Figure 2020114886
カルボン酸２９の合成：化合物２２を、ＤＣＥ中のＴＭＳＯＴｆの存在下で、アルコール２３と反応させたところ、カルボキシレート２４が生成される。アセテート基を、ＭｅＯＨ中のＴＥＡによって除去したところ、化合物２５が得られる。ＤＭＴｒをＯ−６位に導入し、ヒドロキシル基をベンゾイル化したところ、化合物２６が得られる。酸性条件下でのＤＭＴｒ基の除去およびＭｓ−Ｃｌとの反応により、メシル誘導体が生成される。このメシル誘導体とアジ化ナトリウムとの反応により、Ｃ−６アジド誘導体２７が得られる。クリック反応およびメチルエステルの脱保護により、カルボン酸２９が得られる。
Figure 2020114886
固体担体３２の合成：カルボン酸２９を、ペプチド結合条件下で三本鎖アミンと反応させたところ、三本鎖誘導体３１が生成される。これを水素化し、カルボン酸をヒドロキシプロリンと反応させる。この中間体を無水コハク酸と反応させ、スクシネートを固体担体上に充填したところ、化合物３２が得られる。
実施例１０：二本鎖α−アノマー−コンジュゲート構成単位の合成（スキーム１１〜１４）
Figure 2020114886
カルボン酸３６の合成：ヒドロキシプロリン誘導体３３を、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを用いてモノベンジルヘキサン二酸と反応させたところ、カルボキシレート３５が生成され、それをさらに水素化したところ、カルボン酸３６が得られる。
Figure 2020114886
二本鎖固体担体４１の合成：Ｎ−Ｂｏｃグルタミン酸を、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを用いてアミン１３と反応させたところ、化合物３８が得られる。Ｂｏｃ保護基の脱保護およびカルボン酸３６とこのアミンとの反応により、ヒドロキシプロリン誘導体３９が得られる。ＴＢＤＭＳの除去および無水コハク酸とこのヒドロキシル基との反応により、スクシネート誘導体が生成される。これを固体担体上に充填したところ、二本鎖固体担体４１が得られる。
同様に、化合物５４が、以下のスキーム１３および１４に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
実施例１１：三本鎖α−アノマー構成単位の合成
三本鎖α−アノマー構成単位５５は、以下のスキーム１５によって調製され得る。
Figure 2020114886
実施例１２：三本鎖α−アノマーｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成：
前述されるコンジュゲート構成単位２１（スキーム８を参照）を用いて、公知の手順にしたがって、ＲＮＡを、センス鎖の３’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
Figure 2020114886
実施例１３：三本鎖β−アノマーｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成：
前述されるコンジュゲート構成単位３２（スキーム１０を参照）を用いて、公知の手順にしたがって、ＲＮＡを、センス鎖の３’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
Figure 2020114886
実施例１４：二本鎖α−アノマーｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成：
前述されるコンジュゲート構成単位４１（スキーム１２を参照）を用いて、公知の手順にしたがって、ＲＮＡを、センス鎖の３’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。
Figure 2020114886
実施例１５：オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのためのモノ−ＧａｌＮＡｃ構成単位の合成
モノ−ＧａｌＮＡｃ構成単位１０４および１０５を、スキーム１６に示されるように調製する。
Figure 2020114886
１０２の合成：ＧａｌＮＡｃ酸１００（８．３９ｇ、１８．７１ｍｍｏｌ）およびヒドロキシプロリンアミン（１０．００ｇ、１８．７７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン中で合わせた。ＨＢＴＵ（１０．６８ｇ、２８．１２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．８０ｍＬ、３当量）を加え、混合物を周囲温度で２時間撹拌した。生成物をＴＬＣで調べ、反応混合物を分液漏斗に移し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶媒としてジクロロメタンおよびＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物１０２が淡黄色のふんわりした固体（１１．７７ｇ、６３％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９−７．０９（ｍ，９Ｈ）、６．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０、５．４、２．１Ｈｚ、４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．０３−４．８３（ｍ，２Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１−４．０７（ｍ，２Ｈ）、４．０４−３．９５（ｍ，３Ｈ）、３．８６（ｄｔ，Ｊ＝１１．２、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９−３．６８（ｍ，６Ｈ）、３．６８−３．３６（ｍ，３Ｈ）、３．２１−２．８８（ｍ，５Ｈ）、２．２６−２．１４（ｍ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．８７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５３−１．２９（ｍ，７Ｈ）。
１０４の合成：ヒドロキシプロリン誘導体１０２（６．００ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。ＤＩＥＡ（２．２０ｍＬ、３当量）およびクロロアミダイト試薬を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、ＴＬＣで調べた。それを分液漏斗に移し、水および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶離剤としてジクロロメタンおよびＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物が白色のふんわりした固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６８（ｓ，１Ｈ）、７．４２−７．０６（ｍ，８Ｈ）、７．０１−６．７３（ｍ，４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｓ，１Ｈ）、４．０１（ｓ，３Ｈ）、３．８６（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ、９Ｈ）、３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝３７．０、２３．３、１６．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．９９（ｄｄ，Ｊ＝１２．３、６．４Ｈｚ、３Ｈ）、２．７４（ｄｄ，Ｊ＝９．２、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．２１（ｓ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０５−１．９５（ｍ，５Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５２−１．１６（ｍ，１１Ｈ）、１．１６−１．０２（ｍ，１１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ δ＝１５１．７８、１５１．６１、１５１．５０、１５１．３０。
１０５の合成：化合物１０２（２．１０ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解させた。この混合物に、無水コハク酸（０．４４１ｇ、４．３６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．５３２ｇ、当量）、続いてＴＥＡ（１ＭＬ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。そのＴＬＣを調べ、反応混合物を水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルの小さいパッドに通してろ過した。溶媒を除去し、この材料を次の反応に使用した。上記の反応からのスクシネートを無水アセトニトリルに溶解させた。ＨＢＴＵ（１．５９ｇ、４．２０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．１０ｍｌ）を加え、混合物を５分間回転させた。ポリスチレン固体担体を反応混合物に加え、混合物を周囲温度で一晩振とうした。固体担体をろ過し、洗浄し、無水酢酸／Ｐｙ混合物を用いてキャッピングした。固体担体を、ジクロロメタン、ＭｅＯＨ／ＤＣＭおよびエーテル（２７．１０ｇ、５５ｕｍｏｌ／ｇ）で再度洗浄した。
実施例１６：一本鎖αアノマーｓｉＲＮＡの合成：
前述されるコンジュゲート構成単位１０４および１０５（スキーム１６を参照）を用いて、公知の手順にしたがって、ＲＮＡを、センス鎖の３’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
Figure 2020114886
実施例１７：合成後コンジュゲーションのためのトリフルオロアセトアミド誘導体の合成
中間化合物８を、以下のスキーム１７に示されるように調製する。
Figure 2020114886
化合物２の合成：Ｚ−アミノカプロン酸（２２．２ｇ、８２．５０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５０ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（４４．４ｍＬ、２７５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４０．４ｇ、１０６．７ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢＴ（３０．０ｇ、２２０ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌した後、４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩（２０．０ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、酢酸エチル（２５０ｍＬ）を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物２（Ｒｆ＝１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ中０．５、２４．３０ｇ）が得られた。不純物を除去するために、まず２％のメタノール／ジクロロメタン、続いて５％のメタノール／ジクロロメタンで溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物２を精製したところ、２１．３６ｇ（６５％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：環におけるアミド結合による観察される回転異性体。δ７．３５（ｍ，５Ｈ）、５．１５（ｄ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．９９（ｓ，２Ｈ）、４．２７（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｍ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，１Ｈ）３．２０−３．４７（ｍ，５Ｈ）、２．９４−３．０２（ｍ，２Ｈ）、２．１０−２．３２（ｍ，２Ｈ）、１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３５−１．４（ｍ，４Ｈ）、１．２２−１．２８（ｍ，４Ｈ）。
化合物３の合成：化合物２（２１．３６ｇ、５４．４３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、水素化ホウ素リチウム（１．１９ｇ、５４．４３ｍｍｏｌ）を、０℃で２０分間にわたって溶液に加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を０℃に冷却した。過剰な水素化ホウ素リチウムを、５ＭのＮａＯＨ（３０ｍＬ）でクエンチした。３０分間撹拌した後、反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加えた。有機層を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物３（Ｒｆ＝１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ中０．４、３５．８８ｇ）が得られた。不純物を除去するために、３％のメタノール／ジクロロメタン、続いて５％のメタノール／ジクロロメタンで溶離することによってカラムクロマトグラフィーによって化合物３を精製したところ、９．２１ｇ（４９％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：環におけるアミド結合による観察される回転異性体。δ７．３５（ｍ，５Ｈ）、４．９９（ｓ，Ｈ）、４．９１（ｄ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．７７（ｔ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．２７（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｍ，１Ｈ）、３．２０−３．４７（ｍ，５Ｈ）、２．９４−３．０２（ｍ，２Ｈ）、２．１０−２．３２（ｍ，２Ｈ）、１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３５−１．４（ｍ，４Ｈ）、１．２２−１．２８（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ｍＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．４、１７１．１（回転異性体のために小さい）、１５６．１、１３７．３、１２８．９、１２８．３、１２８．２、１２７．７、１２５．３、６８．２、６７．４、６５．１、６３．４、６２．０、５７．６、５５．１、５４．９、５３．３、４０．１、３９．９、３９．７、３９．５、３９．３、３９．１、３８．９、３７．４、３６．１、３４．２、３２．６、２９．３、２６．１、２６．０、２４．６、２４．１、２１．０。
化合物４の合成：化合物３（９．２１ｇ、２５．２７ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（８０ｍＬ）と２回同時蒸発させた。次に、化合物を、一晩、高真空下に置いて乾燥させた。化合物３を高真空から取り出し、無水ピリジン（２００ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、触媒量のジメチルアミノピリジン（０．３５ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、０℃で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、ＤＭＴ−Ｃｌ（９．０ｇ、２６．５３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。過剰なＤＭＴ−Ｃｌを、メタノール（１５ｍＬ）の添加によってクエンチした。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣に、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物４（Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中０．６、１４．０２ｇ）が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中５０％の酢酸エチル（１％のＴＥＡ）、続いて１００％の酢酸エチル（１％のＴＥＡ）で溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物４を精製したところ、１２．３６ｇ（７３．４％）が白色の発泡体状の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．１７−７．３３（ｍ，１４Ｈ）、４．９９（ｓ，２Ｈ）、４．９１（ｄ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．３７（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）３．５６（ｍ，１Ｈ）３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．１４（ｍ，１Ｈ）、２．９３−３．０２（ｍ，４Ｈ）、２．１８（ｍ，２Ｈ）１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３７−１．４１（ｍ，６Ｈ）。
化合物５の合成：化合物４（１２．３６ｇ、１８．５４ｍｍｏｌ）を、１０％のメタノール／酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Ｄｅｇｕｓｓａタイプ（１．３ｇ）に担持された１０重量％のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で２回パージし、次に、水素を、１０秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、セライトが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで２回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物５（Ｒｆ＝．０５ １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、９．１６ｇ、９３％）が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．１５−７．３１（ｍ，９Ｈ）、６．８６（ｍ，４Ｈ）４．９９（ｓ，１Ｈ）、４．３７（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）３．５６（ｍ，１Ｈ）３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．１４（ｍ，１Ｈ）、２．９３−３．０２（ｍ，２Ｈ）、２．４５（ｍ，２Ｈ）、２．１８（ｍ，２Ｈ）１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３７−１．４１（ｍ，３Ｈ）１．１３−１．３８（ｍ，４Ｈ）。
化合物６の合成：化合物５（９．１６ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン（４．８０ｍＬ、３４．４ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル（３．０５ｍＬ、２５．８ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物６（Ｒｆ＝０．６ １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、１０．８９ｇ）が得られた。５％のメタノール／ジクロロメタン（１％のＴＥＡ）で溶離することによってカラム精製すると、化合物６（８．７６ｇ、８１％）が黄色の発泡体状の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．５６−７．０９（ｍ，９Ｈ）、７．０１−６．５２（ｍ，４Ｈ）、５．３４−５．０４（ｍ，１Ｈ）、４．９９−４．７８（ｍ，１Ｈ）、４．４８−４．２５（ｍ，２Ｈ）、３．８３−３．６７（ｍ，６Ｈ）、３．６０−３．５０（ｍ，１Ｈ）、３．４９−３．１８（ｍ，２Ｈ）、３．１６−２．９１（ｍ，２Ｈ）、２．８９−２．５６（ｍ，２Ｈ）、２．５４−２．３２（ｍ，２Ｈ）、２．３２−１．６９（ｍ，３Ｈ）、１．５９−１．０３（ｍ，４Ｈ）．１９Ｆ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：−７７．１４（ｓ，３Ｆ）。
化合物７の合成：化合物６（８．７６ｇ、１３．９３ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（５．１０ｇ、４１．７９ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３．９０ｍＬ、２７．８６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸（２．８０ｇ、２７．８６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、わずかに飽和した塩化ナトリウムの溶液で２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物７（Ｒｆ＝０．９ １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、１０．８７ｇ、９４％）が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物８の合成：化合物７（２．００ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．６８ｍＬ、９．６４ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１．８３ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間にわたって振とうした。ＣＰＧ（２７ｇ）をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。ＣＰＧ化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、１％のトリエチルアミン／ジクロロメタンで洗浄し、続いて、１０％のメタノール／ジクロロメタンで２回洗浄し、１％のトリエチルアミン／ジクロロメタン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。ＣＰＧ化合物を１時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、２時間にわたって高真空下に置いた。ＣＰＧ化合物（５．０ｍｇ）を脱ブロック（ｄｅ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）へと送った。残りのＣＰＧ化合物に、２５％の無水酢酸／ピリジン（１００ｍＬ）を加え、混合物を一晩振とうした。ＣＰＧ化合物および反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。ＣＰＧ化合物を１時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、２時間にわたって高真空下に置いた。ＣＰＧ化合物（７．１ｍｇ）を脱ブロックへと送った。分光光度計：キャッピング前．９８９２Ａｂｓ（５０２．０ｎｍ）６５マイクロモル／ｇ、キャッピング後１．４４０３（５０２．０ｎｍ）６７マイクロモル／ｇ。
化合物９の合成：化合物６（８．８９ｇ、１４．１４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４．９３ｍＬ、２８．２８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（６０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホロアミド酸塩化物（５．６３ｍＬ、１６．２６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。反応混合物を、室温で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応の完了がＴＬＣによって観察された。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物９（Ｒｆ＝０．４４ ５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、１１．０２ｇ）が得られた。３％のメタノール／ジクロロメタン（１％のＴＥＡ）で溶離することによってカラム精製すると、化合物９（６．３１ｇ、５４％）が黄色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．３７（ｓ，１Ｈ）、７．６３（ｄ １Ｈ）、７．４２−６．９８（ｍ，８Ｈ）、６．９２−６．７７（ｍ，４Ｈ）、４．２５−３．９０（ｍ，２Ｈ）、３．７８−３．６４（ｍ，７Ｈ）、３．４８（ｄ，３Ｈ）、３．２９（ｄ，１Ｈ）、３．２３−２．９２（ｍ，４Ｈ）、２．８６（ｄ，１Ｈ）、２．７３（ｔ，１Ｈ）、２．５８（ｔ，１Ｈ）、２．５３−２．４７（ｍ，４Ｈ）、２．３３−１．８７（ｍ，４Ｈ）、１．５５−０．９７（ｍ，１２Ｈ）。３１Ｐ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１５１．６８（ｄ，１Ｐ）。
実施例１８：合成後コンジュゲーションのためのカルバメートリンカーの合成
Figure 2020114886
４−Ｚ−アミノブタノール１３：４−アミノブタン−１−オール（２６ｍＬ、２８０ｍｍｏｌ）およびＣｂｚ−Ｏスクシネート（１０４．７ｇ、４２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、１０℃で、アルゴン下で反応混合物を撹拌し続けながら、トリエチルアミン（７８ｍＬ、５６０ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物２（Ｒｆ＝０．５ １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、７１．９７ｇ）が白色の固体として得られた。これをさらに精製せずに次の工程に使用した。
ＤＳＣで活性化された４−Ｚ−アミノブタノール１４：粗化合物１３（６．０ｇ）およびＤＳＣ（１０．３３ｇ ４０．３１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、０℃で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。トリエチルアミン（７．８８ｍＬ、５３．７４ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を、０℃で５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。有機層を、水、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物１４（Ｒｆ＝０．８５ １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、１１．１４ｇ）が淡褐色の固体として得られた。これをさらに精製せずに次の工程に使用した。
化合物１７：化合物１６（５．００ｇ、７．４８ｍｍｏｌ）を、１０％のメタノール／酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Ｄｅｇｕｓｓａタイプ（０．５ｇ）に担持された１０重量％のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で２回パージし、次に、水素を、１０秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで２回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物１７（Ｒｆ＝．０３ ５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、３．４ｇ、８７％）が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．４１−７．１４（ｍ，９Ｈ）、６．９９−６．７２（ｍ，４Ｈ）、４．９６（ｄ，１Ｈ）、４．３０（ｓ，１Ｈ）、４．０４−３．５８（ｍ，６Ｈ）、３．４６−３．２５（ｍ，１Ｈ）、３．２１−２．８１（ｍ，３Ｈ）、２．５２−２．４６（ｍ，２Ｈ）、１．９７（ｄ，３Ｈ）、１．６３−１．４２（ｍ，４Ｈ）。
化合物１８：化合物１７（３．２ｇ、５．９８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１１．９６ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル（１．０６ｍＬ、８．９７ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物１８（Ｒｆ＝０．４５ ５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、３．３３ｇ、８８％）が黄色の発泡体状の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．４６−７．０３（ｍ，９Ｈ）、６．８６（ｄ，４Ｈ）、４．９３（ｓ，１Ｈ）、４．２９（ｓ，１Ｈ）、４．１１−３．６３（ｍ，２Ｈ）、３．５３−２．７９（ｍ，５Ｈ）、２．５３（ｄ，２Ｈ）、２．３０（ｄ，２Ｈ）、１．９９（ｄ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，１Ｈ）、１．３６（ｔ，４Ｈ）．１９Ｆ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：−７７．１１（ｓ，３Ｆ）。
化合物１９：化合物１８（２．０ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．１６ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（０．８８ｍＬ、６．３４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸（０．６３ｇ、６．３４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、わずかに飽和した塩化ナトリウムの溶液で２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物１９（Ｒｆ＝０．９ １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、３．２３ｇ）が得られた。５％のメタノール／ジクロロメタン（１％のＴＥＡ）で溶離することによってカラム精製すると、化合物１２（２．５８ｇ、９８％）が白色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．４３（ｄ，１Ｈ）、７．４５−７．０４（ｍ，９Ｈ）、７．０２−６．７１（ｍ，４Ｈ）、５．５１−４．９１（ｍ，２Ｈ）、４．１６−２．９５（ｍ，９Ｈ）、２．６７（ｑ，４Ｈ）、２．５８−２．３６（ｍ，６Ｈ）、２．３１−２．０２（ｍ，２Ｈ）、１．３３（ｄ，４Ｈ）。
化合物２０：化合物１９（２．０３ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．６７ｍＬ、９．６４ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１．８２ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間にわたって振とうした。ＣＰＧ（２７ｇ）をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。ＣＰＧ化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、１％のトリエチルアミン／ジクロロメタンで洗浄し、続いて、１０％のメタノール／ジクロロメタンで２回洗浄し、１％のトリエチルアミン／ジクロロメタン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。ＣＰＧ化合物を１時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、２時間にわたって高真空下に置いた。ＣＰＧ化合物（６．７ｍｇ）を脱ブロックへと送った。残りのＣＰＧ化合物に、２５％の無水酢酸／ピリジン（１５０ｍＬ）を加え、混合物を一晩振とうした。ＣＰＧ化合物および反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。ＣＰＧ化合物を１時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、２時間にわたって高真空下に置いた。ＣＰＧ化合物（６．９ｍｇ）を脱ブロックへと送った。分光光度計：キャッピング前１．８３９６Ａｂｓ（５０２．０ｎｍ）９０．３マイクロモル／ｇ、キャッピング後１．８７９８Ａｂｓ（５０２．０ｎｍ）８９．６マイクロモル／ｇ。
化合物２１：化合物１８（４．２６ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（２．３５ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホロアミド酸塩化物（１．７３ｍＬ、７．７６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。反応混合物を、室温で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応の完了がＴＬＣによって観察された。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物１４（Ｒｆ＝０．４４ ５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、１１．０２ｇ）が得られた。３％のメタノール／ジクロロメタン（１％のＴＥＡ）で溶離することによってカラム精製すると、化合物１４（６．３１ｇ、５４％）が黄色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．４１−６．９９（ｍ，８Ｈ）、６．８５（ｄ，４Ｈ）、４．１０−３．６２（ｍ，２Ｈ）、３．５９−３．２４（ｍ，７Ｈ）、３．１３（ｄ，３Ｈ）、２．７５−２．６８（ｍ，１Ｈ）、２．５９−２．４５（ｍ，４Ｈ）、２．１０（ｄ，１Ｈ）、１．３７（ｔ，１Ｈ）、１．２５−１．００（ｍ，１０Ｈ）。
実施例１９：ピリミジン、プリン、および脱塩基部位におけるＧａｌＮＡｃコンジュゲーション（スキーム１９〜３３）
パラジウムの結合の化学的作用を用いて、ＧａｌＮＡｃリガンドおよびカチオン性分子が、２’位に様々な置換基を有するピリミジンヌクレオシドのＣ−５位に導入され得る。以下のスキーム（スキーム１９〜スキーム２７）に示されるように、ヌクレオシド構成単位がそれに応じて合成され得る。スキーム２８および２９において、ＧａｌＮＡｃリガンドを含有する設計されたプリンヌクレオシド類似体が示される。スキーム３０において、ＧａｌＮＡｃリガンドが、Ｃ−１’位に導入される。クリックの化学的作用を用いて、スキーム３１および３２に示されるように、ＧａｌＮＡｃが、脱塩基部位に導入され得る。スキーム３３は、プリン環上のＣ−２位にＧａｌＮＡｃリガンドを導入するための交換可能なヌクレオシド手法を示す。
Figure 2020114886
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ｉ．化合物１０３（Ｒ＝Ｆ）の合成
ピリジン（７０ｍＬ）中の１０２（Ｒ＝Ｆ；１１．２ｇ、３０．１ｍｍｏｌ；Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１０，２１，１５−３１）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（１１．２ｇ、３２．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１４時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２３）によって精製したところ、化合物１０３（１７．８ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、８８％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ１１．８１（ｓ，１Ｈ）、８．０７（ｓ，１Ｈ）、７．４６−７．１４（ｍ，１０Ｈ）、６．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．９、１．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．８３（ｄ，Ｊ＝２０．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．６０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．１６（ｄｄ，Ｊ＝５３．４、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．４３−４．２０（ｍ，１Ｈ）、４．０８−３．９０（ｍ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，７Ｈ）、３．２３（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ、２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１６０．６８、１５８．０９、１５８．０７、１４９．８９、１４５．１３、１４４．７２、１３６．１２、１３５．４６、１３５．３７、１２９．７１、１２７．９３、１２７．６７、１２６．７０、１２３．９０、８５．６１、８１．３０、６９．７５、６２．４７、５５．０６、５５．０３。
ｉｉ．化合物１０４（Ｒ＝Ｆ）の合成
ＣＨ３ＣＮ（７５ｍＬ）中の化合物１０３（Ｒ＝Ｆ；６．４０ｇ、９．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ２（ＰｈＣＮ）２（７３ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（２．６５ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）およびＣＦ３ＣＨ２ＯＨ（６．９１ｍＬ、９４．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、ＣＯガス雰囲気下で、６０℃で撹拌した。蒸発後、残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。ろ液を濃縮し、得られた粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５％のＭｅＯＨ）によって精製したところ、１０４（４．３０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ、６７％、Ｒｆ＝ＣＨ２Ｃｌ２中５％のＭｅＯＨによって展開される０．３２）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．７８（ｓ，１Ｈ）、８．５２（ｓ，１Ｈ）、７．４１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４−７．１６（ｍ，８Ｈ）、６．９３−６．８０（ｍ，４Ｈ）、５．９０（ｄ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．６３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．２６（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５０−４．１７（ｍ，３Ｈ）、４．０７（ｄｄ，Ｊ＝７．３、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７３（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ、７Ｈ）、３．３１−３．１７（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１６０．７０、１５８．９６、１５８．０８、１５８．０６、１４９．１８、１４８．８９、１４４．７６、１３５．４７、１３５．３３、１２９．７０、１２９．６６、１２７．８０、１２７．６１、１２６．６６、１２４．６２、１２１．８６、１０２．５７、９４．１０、９２．２７、９０．６８、９０．３２、８５．５６、８１．３６、６８．１１、６７．９５、６２．３６、５９．２６、５８．９１、５４．９８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ−７４．９４、−７４．９６、−７４．９９、−２０１．８１、−２０１．８６、−２０１．８７、−２０１．９３、−２０１．９５、−２０２．０１、−２０２．０７．Ｃ３３Ｈ３０Ｆ４Ｎ２ＮａＯ９についての分子量（Ｍ＋Ｎａ）＋計算値６９７．１７８５、実測値６９７．２。
ｉｉｉ．化合物１０５（Ｒ＝Ｆ）の合成
化合物１０４（Ｒ＝Ｆ；４．１５ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）を、室温で一晩、３−（ジメチルアミノ）−１−プロピルアミン（２５ｍＬ）で処理した。反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させたところ、粗材料１０５が得られた。Ｃ３６Ｈ４２ＦＮ４Ｏ８についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６７７．２９８７、実測値６７７．１。
実施例２０．リボース環におけるＧａｌＮＡｃコンジュゲーション（スキーム３４〜４４）
ＧａｌＮＡｃおよびその誘導体を、ヌクレオシド中のリボース環にコンジュゲートするための合成手法が以下に示される。スズ−修飾ヌクレオシドが、臭化アルキルと結合されて、２’−および３’−結合生成物が生成され得る。得られた第一級アミンまたは活性化エステルならびに末端アルケンのそれぞれが、適切な反応条件を用いて、ＧａｌＮＡｃリガンドと結合され得る。これらの構成単位は、標準的なホスホロアミダイトの化学的作用を用いて、オリゴヌクレオチド中に組み込まれる。ＧａｌＮＡｃリガンドはまた、合成後手法によって、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ得る。
Figure 2020114886
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２’−および３’−Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジン（２ａ、２ｂ）。ＤＭＦ（１０５ｍＬ）中の、報告されるように得られた２’，３’−Ｏ−ジブチルスタンニレン−５−メチルウリジン（２８ｇ、５７．２４ｍｍｏｌ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７４，２４−３０）、６−ブロモヘキシルフタルイミド（３５．５ｇ、１１４．４８ｍｍｏｌ）およびＮａＩ（１．７２ｇ、１１．４５ｍｍｏｌ）の溶液を、３．５時間にわたってマイクロ波中で、１００℃で加熱した。ＤＭＦを除去した後、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝ＣＨ２Ｃｌ２中５％のＭｅＯＨ中の０．２６）によって精製したところ、Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジンの２’−および３’−異性体が、分離できない混合物（１０．１ｇ、２０．７ｍｍｏｌ、３６％）として得られた。ＭＳ ｍ／ｚ ４８８．０（Ｍ＋Ｈ）＋、５１０．２（Ｍ＋Ｎａ）＋、４８６．２（Ｍ−Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．２９（ｓ，１Ｈ）、７．８８−７．７９（ｍ，４Ｈ）、７．７８−７．７０（ｍ，１Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．７２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２５（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．００（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．１４（ｄｄ，Ｊ＝１１．３、５．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．０７（ｄｄ，Ｊ＝１０．１、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．８９−３．７９（ｍ，２Ｈ）、３．７６−３．７２（ｍ，１Ｈ）、３．６３（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．１、８．８、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．５９−３．４７（ｍ，４Ｈ）、３．４１（ｄｔ，Ｊ＝１１．６、６．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．２８（ｓ，１Ｈ）、１．７５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、３Ｈ）、１．６４−１．４１（ｍ，５Ｈ）、１．２７（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ、５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１６７．９９、１６７．９７、１６３．７８、１６３．７３、１５０．７９、１５０．５７、１３６．２２、１３６．０７、１３４．４０、１３１．６０、１３１．５６、１２３．０２、１０９．３８、１０９．２６、８７．７３、８５．８９、８５．０７、８２．７１、８０．８２、７７．４９、７２．４３、６９．６９、６９．５１、６８．３８、６０．８６、６０．６１、５４．９２、３７．３９、３７．３５、２９．２３、２８．９６、２７．９３、２７．７６、２６．１５、２６．０７、２５．７６、２５．３９、２５．１６、２４．９６、２１．２７、１２．２６。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジン（３ａ）。２ａおよび２ｂの混合物（１０．１１ｇ、２０．７３ｍｍｏｌ）を、ピリジン（５０ｍＬ）と同時蒸発させ、次に、ピリジン（８０ｍＬ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却した。この混合物に、ジメトキシトリチルクロリド（７．７３ｇ、２２．８０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を、０℃で２時間、次に、室温で１時間撹拌した。さらなる０．４当量のジメトキシトリチルクロリドを加え、反応物を一晩撹拌した。反応をＭｅＯＨ（５ｍＬ）でクエンチし、次に、減圧下で蒸発させた。反応混合物をＤＣＭで希釈し、塩水で２回洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、次に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、４．４８ｇの３ａ（２７．４％、５．６７ｍｍｏｌ；Ｒｆ＝ヘキサン中６０％のＥｔＯＡｃ中の０．３５）が得られた。ＭＳ ｍ／ｚ ８１２．３（Ｍ＋Ｎａ）＋、７８８．３（Ｍ−Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３５（ｓ，１Ｈ）、７．８７−７．７７（ｍ，４Ｈ）、７．４８（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２３（ｄｄ，Ｊ＝１２．１、８．１Ｈｚ、５Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、４Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．１８（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．０、１１．２、５．９Ｈｚ、３Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６２−３．４６（ｍ，４Ｈ）、３．２１（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．９、１０．７、３．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．６０−１．４４（ｍ，５Ｈ）、１．３８（ｓ，３Ｈ）、１．３５−１．１９（ｍ，５Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、０．８７（ｄｄ，Ｊ＝１０．１、４．７Ｈｚ、１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７０．３３、１６７．９２、１６３．６１、１５８．１９、１５８．１６、１５０．４１、１４４．６７、１３５．４５、１３５．３２、１３５．１１、１３４．３３、１３１．５８、１２９．７４、１２７．９３、１２７．６５、１２６．８４、１２２．９７、１１３．２７、１０９．６０、８６．４６、８５．９１、８３．０９、８０．５３、６９．６３、６８．７６、６３．４８、６３．１９、５９．７５、５５．０６、３７．３１、３０．１６、２８．８９、２７．９２、２６．０７、２４．９５、２０．７６、２０．７２、１８．６０、１４．０８、１３．５５、１１．６６。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジン（３ｂ）。３’−異性体（３ｂ）を、カラムクロマトグラフィー（３．３６ｇ、２０．５％、４．２６ｍｍｏｌ；Ｒｆ＝ヘキサン中６０％のＥｔＯＡｃ中の０．１８）によって単離した。ＭＳ ｍ／ｚ ８１２．０（Ｍ＋Ｎａ）＋、７８８．３（Ｍ−Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３４（ｓ，１Ｈ）、７．８８−７．７６（ｍ，４Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３３−７．１５（ｍ，７Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．７５−５．６９（ｍ，１Ｈ）、５．３７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５、５．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５−３．９４（ｍ，２Ｈ）、３．９１（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５６（ｄｄｄ，Ｊ＝２２．７、１１．８、６．７Ｈｚ、３Ｈ）、３．２１（ｄｄｄ，Ｊ＝２４．１、１０．８、３．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．６０−１．３７（ｍ，７Ｈ）、１．３４−１．１３（ｍ，５Ｈ）、０．９４−０．８３（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７０．４１、１６７．９３、１６３．６９、１５８．１７、１５８．１６、１５０．５７、１４４．６３、１３５．７３、１３５．３０、１３５．１７、１３４．３５、１３１．５８、１２９．７１、１２７．９１、１２７．６３、１２６．８２、１２２．９７、１１３．２４、１０９．３７、８８．６９、８５．９１、８０．６０、７７．２７、７２．１８、６９．６７、６３．４９、６２．９５、５９．７６、５５．０３、５４．９０、３７．３３、３０．１７、２９．０９、２７．８８、２６．０８、２５．０８、２０．７６、２０．７２、１８．８７、１８．６１、１４．０９、１３．５５、１１．７４。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−５−メチルウリジン（４ａ）。３ａ（１５．０ｇ、１８．９９ｍｍｏｌ）を１９０ｍＬのＭｅＯＨに溶解させた。ヒドラジン（３．０４ｇ、９４．５２ｍｍｏｌ）を不均一混合物に加え、３．５時間にわたって加熱還流させた（６６℃）。混合物を室温に冷まし、減圧下で蒸発させたところ、白色の粉末が得られた。生成物をＤＣＭに溶解させ、水酸化アンモニウムおよび飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、１１．８ｇが得られた。粗材料を次の工程に使用した。（Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．０２）。ＭＳ ｍ／ｚ ６６０．２（Ｍ＋Ｈ）＋、６８２．１（Ｍ＋Ｎａ）＋、６５８．１（Ｍ−Ｈ）−．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．４８（ｓ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ、５Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ）、４．１９（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６３−３．４５（ｍ，３Ｈ）、３．２７−３．１５（ｍ，３Ｈ）、１．４８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｓ，３Ｈ）、１．３４−１．１８（ｍ，６Ｈ）。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−５−メチルウリジン（５ａ）。粗材料４ａ（６．００ｇ）を、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（３．８ｍＬ、２７．３０ｍｍｏｌ）に溶解させ、１０分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃ−Ｃ５−ＮＨＳエステル（７．３１ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、塩水で洗浄し、次に、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗材料を、カラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．３６）によって精製したところ、５ａ（９．５６ｇ、７．４９ｍｍｏｌ、８３％）が得られた。ＭＳ ｍ／ｚ １２９８．３（Ｍ＋Ｎａ）＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３６（ｓ，１Ｈ）、７．９９−７．８６（ｍ，５Ｈ）、７．７３−７．５２（ｍ，８Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、３Ｈ）、７．４１−７．３４（ｍ，４Ｈ）、７．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、８．１Ｈｚ、４Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、４Ｈ）、５．８３（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５０−４．３９（ｍ，２Ｈ）、４．３８−４．１４（ｍ，４Ｈ）、３．９５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．８２−３．６８（ｍ，７Ｈ）、３．６３−３．４３（ｍ，４Ｈ）、３．２８−３．１５（ｍ，３Ｈ）、２．９８（ｄｄ，Ｊ＝１２．９、６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０３（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｓ，６Ｈ）、１．４０−１．１５（ｍ，９Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．７３、１６９．４０、１６５．２０、１６５．１６、１６４．８６、１６３．６２、１５８．１８、１５８．１５、１５０．４１、１４４．６４、１３５．３１、１３５．１０、１３３．５０、１２９．７３、１２９．１６、１２９．００、１２８．７０、１２８．５９、１２７．９１、１２７．６４、１２６．８２、１１３．２６、１０９．５９、１００．８９、８５．９１、８３．０９、８０．６０、７１．８６、６９．９７、６９．７４、６８．７７、６７．９２、６３．１９、６２．０３、５５．０４、４９．７４、３５．０３、２９．１７、２９．０４、２８．５９、２６．２５、２５．１２、２２．６９、２１．８５、１１．６６。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−３’−Ｏ−スクシネート−５−メチルウリジン（６ａ）。５ａ（２．００ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させた。ＤＭＡＰ（５７４ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（３１３ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を、室温で１７時間撹拌した。生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ＝４．２ｃｍ×１５ｃｍ）によって精製し、ＤＣＭ中２％のＴＥＡで処理した。生成物を、ＤＣＭ中の０〜５％のＭｅＯＨおよび２〜５％のＴＥＡで溶離し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、２．１１ｇ（９１％、１．４３ｍｍｏｌ）の６ａがＴＥＡ塩（Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ／５％のＴＥＡ中の０．４１）として得られた。ＭＳ ｍ／ｚ １３９７．４（Ｍ＋Ｎａ）＋、１３７３．４（Ｍ−Ｈ）−．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．４４（ｓ，１Ｈ）、８．１１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．９０（ｄｄ，Ｊ＝１０．２、４．１Ｈｚ、４Ｈ）、７．７５（ｓ，１Ｈ）、７．７２−７．５２（ｍ，７Ｈ）、７．５１−７．４４（ｍ，３Ｈ）、７．３４（ｄｄｄ，Ｊ＝２４．０、１３．７、７．９Ｈｚ、６Ｈ）、７．２２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、５Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、４Ｈ）、５．８３（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７３（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．２６−５．２２（ｍ，１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７−４．４０（ｍ，２Ｈ）、４．３７−４．２２（ｍ，３Ｈ）、４．１２（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８３−３．６９（ｍ，６Ｈ）、３．５３−３．１９（ｍ，１５Ｈ）、２．９７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６８（ｓ，２Ｈ）、１．５６−１．１１（ｍ，１５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７３．４０、１７１．７６、１７１．６３、１６９．３９、１６５．２０、１６５．１５、１６４．８６、１６３．５０、１５８．２２、１５０．５０、１４４．４８、１３５．１２、１３４．９５、１３３．４８、１２９．７０、１２９．１６、１２９．０３、１２８．７０、１２８．５８、１２７．９５、１２７．６１、１１３．３０、１１０．１６、１００．９１、８６．１３、６９．９７、６７．９１、６２．０４、５５．０４、４９．７３、４５．４８、４０．１２、３９．９２、３９．７１、３９．５０、３９．２９、３９．０８、３８．８７、３８．３３、３４．９８、２９．１３、２８．９３、２６．１９、２５．０８、２２．６８、２１．８２、１１．６９、１０．４８。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−３’−Ｏ−ＣＰＧ−５−メチルウリジン（７ａ）。アセトニトリル（１００ｍＬ）中の６ａ（２．０１ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（１．０３ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（５２８ｍｇ、４．０８ｍｍｏｌ）およびＣＰＧ（１６．０ｇ、１３０μｍｏｌ／ｇ、５４０Å）を加え、混合物を２４時間にわたって振とうした。ＣＰＧをろ過して取り除き、ＤＣＭ、ＤＣＭ中２０％のＭｅＯＨ、次にエーテルで洗浄した。次に、ＣＰＧを、１時間にわたってピリジン（７５ｍＬ）およびＴＥＡ（１ｍＬ）中の無水酢酸（２５ｍＬ）で処理した。ＣＰＧをろ過して取り除き、上記と同じ溶媒で洗浄した。充填量（ｌｏａｄｉｎｇ）を、分光光度計を用いて２回測定し、平均充填量を計算した（７３．１μｍｏｌ／ｇ）。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチルホスホロアミダイト−５−メチルウリジン（８ａ）。５ａ（２．９０ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリルと２回同時蒸発させ、次に、完全なアルゴン雰囲気下に置いた。５ａを無水ＤＣＭ（３５ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３７ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）を、撹拌している混合物に加えた後、ＤＣＩ（２６８ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、０℃で２０分間、次に室温で１７時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、次に、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ＝４．２ｃｍ×１９ｃｍ；Ｒｆ＝ＥｔＯＡｃ中０．３９）によって精製したところ、３．２０ｇの８ａ（９５％、２．１７ｍｍｏｌ）が得られた。ＭＳ ｍ／ｚ １４９８．３（Ｍ＋Ｎａ）＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３９（ｓ，１Ｈ）、８．０６−７．８４（ｍ，５Ｈ）、７．７８−７．１６（ｍ，２１Ｈ）、６．９３−６．８２（ｍ，４Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５０−４．２０（ｍ，５Ｈ）、４．１０（ｄｄ，Ｊ＝１２．８、７．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．７４（ｔ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ、７Ｈ）、３．６６−３．４４（ｍ，６Ｈ）、３．２９−３．１８（ｍ，２Ｈ）、２．９８（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．７６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．５７（ｄｄ，Ｊ＝１０．０、５．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．４９（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ、５Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５９−１．０３（ｍ，２９Ｈ）、０．９９−０．８１（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．６０、１６９．２６、１６５．０７、１６５．０３、１６４．７３、１６３．４８、１５８．１０、１５８．０７、１５０．２４、１５０．２２、１４４．３９、１４４．３４、１３５．３２、１３５．０８、１３４．９９、１３４．９７、１３４．８７、１３４．８０、１３３．６４、１３３．３７、１３３．３４、１２９．６５、１２９．０７、１２９．０３、１２８．９０、１２８．８８、１２８．８７、１２８．８３、１２８．５６、１２８．４５、１２７．７５、１２７．５６、１２７．５０、１２６．７４、１１８．７２、１１８．５７、１１３．０８、１０９．６３、１０９．５４、１００．７６、８７．０２、８６．６２、８５．９２、８５．９０、８２．１３、７９．８９、７１．７２、６９．８４、６８．６１、６７．７８、６２．５７、６２．２３、６１．８９、５８．４３、５７．８１、５７．６５、５４．９１、４９．６０、４６．０５、４５．５３、４２．４２、３４．８８、２９．０２、２８．９７、２８．４５、２６．１７、２５．０４、２４．１９、２４．１３、２４．０３、２２．５５、２１．７１、１１．５０．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５４．０１、１５３．６５。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−５−メチルウリジン（４ｂ）。３ｂ（３．６４ｇ、４．６１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨに溶解させた。ヒドラジン（７３８ｍｇ、２３．０４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５．５時間にわたって還流させた。４ａについて記載されるのと同じ手順にしたがったところ、２．９３ｇの粗製の４ｂが得られた。（Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．０２）。ＭＳ ｍ／ｚ ６６０．２（Ｍ＋Ｈ）＋、６８２．１（Ｍ＋Ｎａ）＋、６５８．１（Ｍ−Ｈ）−。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．４３−７．１６（ｍ，９Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．７３（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．２９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２−３．８９（ｍ，３Ｈ）、３．４６−３．１５（ｍ，５Ｈ）、２．２４−２．１６（ｍ，１Ｈ）、２．０５（ｓ，１Ｈ）、１．５８−１．１０（ｍ，１３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１６３．７３、１５８．０４、１５８．０２、１５０．５８、１４４．４９、１３５．５４、１３５．１８、１３５．０６、１２９．５６、１２７．７８、１２７．５０、１２６．６９、１１３．１１、１０９．２３、８８．４９、８５．７８、８０．４７、７７．２０、７２．０２、６９．６２、６２．８４、５４．９１、４１．４４、３３．１２、２９．１７、２６．２４、２６．１１、２５．３１、１１．６２。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−５−メチルウリジン（５ｂ）。ＤＣＭ（４５ｍＬ）およびＴＥＡ（１．８ｍＬ）中の４ｂ（２．８５ｇ、４．３２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＧａｌＮＡｃ−ＮＨＳエステル（３．４７ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）を加えた。さらなる０．２当量のＧａｌＮＡｃ−ＮＨＳエステルを加える前に、反応物を２時間撹拌し、次に、さらに１時間撹拌した。５ａについて記載されるのと同じ手順にしたがったところ、３．６２ｇの５ｂ（２．８４ｍｍｏｌ、６６％）が得られた。（Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．２４）。ＭＳ ｍ／ｚ １２９７．４（Ｍ＋Ｎａ）＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３５（ｓ，１Ｈ）、８．０２−７．８７（ｍ，５Ｈ）、７．７４−７．４４（ｍ，１１Ｈ）、７．４１−７．３４（ｍ，４Ｈ）、７．３３−７．１９（ｍ，７Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．７４（ｄｄ，Ｊ＝５．９、４．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．４１−５．３３（ｍ，２Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、４．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝１６．９、１２．６、７．９Ｈｚ、３Ｈ）、４．０３−３．９５（ｍ，１Ｈ）、３．９１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．８３−３．７５（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６３−３．４５（ｍ，２Ｈ）、３．２２（ｄｄ，Ｊ＝７．８、２．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．９９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．８７（ｓ，１Ｈ）、２．７２（ｓ，１Ｈ）、２．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．１４（ｍ，１４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．７４、１６９．４０、１６５．２０、１６５．１６、１６４．８６、１６３．６５、１６２．２７、１５８．１６、１５０．５７、１４４．５８、１３５．７０、１３５．３２、１３５．１７、１３３．７４、１３３．４５、１２９．６８、１２９．１５、１２９．０１、１２８．９４、１２８．６７、１２８．５７、１２７．８９、１２７．６３、１２６．８１、１１３．２３、１０９．３７、１００．８９、８８．５８、８５．９１、８０．６４、７７．３６、７２．１７、７１．８４、６９．９８、６９．７３、６８．７４、６７．９２、６２．９８、６２．０３、５５．０２、５４．８５、４９．７５、４０．３３、４０．０５、３９．７７、３９．４９、３９．２１、３８．９４、３８．６６、３８．３４、３５．７４、３５．０２、３０．７４、２９．２３、２９．１２、２８．５８、２６．２６、２５．２１、２２．６６、２１．８４、１１．６８。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−２’−Ｏ−スクシネート−５−メチルウリジン（６ｂ）。ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の５ｂ（１．１０ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（３１５ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（１７２ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、２３時間撹拌し、次に、６ａと同様の方法で精製し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、１．０３ｇの６ｂ（８１％、０．７０ｍｍｏｌ）が得られた。（Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．１８）。ＭＳ ｍ／ｚ １３９７．４（Ｍ＋Ｎａ）＋、１３７３．４（Ｍ−Ｈ）−．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．０９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、４Ｈ）、７．７６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｄｄ，Ｊ＝１１．３、７．５Ｈｚ、３Ｈ）、７．６５−７．５１（ｍ，５Ｈ）、７．４７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３３（ｍ，４Ｈ）、７．３２−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．８５（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．４８−５．４１（ｍ，１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．２９（ｓ，１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９−４．３９（ｍ，２Ｈ）、４．３８−４．１９（ｍ，４Ｈ）、３．２８（ｄｄｄ，Ｊ＝３７．９、１２．７、５．４Ｈｚ、１１Ｈ）、３．０８−２．９０（ｍ，３Ｈ）、２．６９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、５Ｈ）、２．６０−２．５２（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．７６（ｓ，１Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５６−０．９４（ｍ，２８Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７３．６３、１７３．４４、１７２．７９、１７１．９２、１７１．５２、１６９．５４、１６５．２９、１６５．２４、１６４．９４、１６３．７８、１５８．２３、１５０．３３、１４４．５７、１３６．１８、１３５．２７、１３５．１８、１３３．８４、１３３．５８、１２９．７７、１２９．２４、１２９．０５、１２８．７６、１２８．６５、１２７．９６、１２７．７０、１２６．９０、１１３．２９、１０９．７３、１００．９８、８５．９７、８０．７５、７３．３１、７１．９６、７０．４８、６２．４０、５５．１０、５２．０６、５１．３６、４５．４５、３５．０４、３３．３５、２９．２０、２９．０９、２８．９５、２８．７７、２２．７０、２１．８９、１１．８１、１０．０５、７．２６、７．１７。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−２’−Ｏ−ＣＰＧ−５−メチルウリジン（７ｂ）。アセトニトリル（５０ｍＬ）中の６ｂ（９７０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（４９７ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（３３９ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）およびＣＰＧ（８．２０ｇ、１３０μｍｏｌ／ｇ、５４０Å）を加え、混合物を２１時間にわたって振とうした。ＣＰＧをろ過し、洗浄し、キャッピングし、７ａと同じように測定したところ、５６．１μｍｏｌ／ｇの平均充填量でＣＰＧ ７ｂが得られた。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−２’−Ｏ−（シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト−５−メチルウリジン（８ｂ）。５ｂ（１．９８ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を、８ａについて記載されるのと同じように処理し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、１．８９ｇ（８３％、１．２８ｍｍｏｌ）の８ｂが得られた。（Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中の０．４３）。ＭＳ ｍ／ｚ １４９７．４（Ｍ＋Ｎａ）＋、１４７４．３（Ｍ−Ｈ）−．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３８（ｓ，１Ｈ）、８．００−７．８７（ｍ，５Ｈ）、７．７５−７．１８（ｍ，２２Ｈ）、６．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．９、２．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．８８（ｄｄ，Ｊ＝９．２、５．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．６１−４．５０（ｍ，１Ｈ）、４．４９−４．４０（ｍ，２Ｈ）、４．３８−４．２３（ｍ，２Ｈ）、４．０１（ｄｄｄ，Ｊ＝１９．３、１１．６、４．８Ｈｚ、３Ｈ）、３．８５−３．４７（ｍ，１４Ｈ）、２．９８（ｓ，２Ｈ）、２．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．６、８．９、３．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．１０−１．９５（ｍ，４Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５７−０．９９（ｍ，３１Ｈ）、０．９４−０．８３（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．７２、１６９．３７、１６５．１８、１６５．１４、１６４．８５、１６３．５８、１６３．５０、１５８．１８、１５８．１６、１５０．４８、１５０．４３、１４４．５２、１３５．１５、１３４．９８、１３３．７４、１３３．４８、１３３．４４、１２９．６６、１２９．１４、１２９．０１、１２８．９９、１２８．９８、１２８．９３、１２８．６７、１２８．５６、１２７．９１、１２７．８８、１２７．５７、１２６．８４、１１８．８１、１１８．７１、１１３．２５、１１３．２１、１０９．７２、１０９．６８、１００．８６、８６．１７、８６．０２、７１．８２、６９．９５、６９．８６、６８．７２、６７．８８、６３．４５、６２．００、５５．００、４９．７２、３９．８０、３９．６３、３９．４６、３９．３０、３９．１３、３８．９６、３８．３３、３５．００、３０．１２、３０．０３、２９．２６、２９．１４、２９．１１、２８．５６、２６．２９、２５．２７、２５．２５、２４．２８、２４．２２、２４．０８、２４．０２、２２．６５、２１．８４、２０．６７、１９．８０、１９．７５、１９．６７、１９．６２、１８．５６、１４．０４、１３．５０、１１．６８、１１．５５．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５５．０８、１５４．６０。
実施例２１．Ｓ−およびＣ−結合ＧａｌＮＡｃ誘導体および構成単位の合成（スキーム４５〜５１）
Figure 2020114886
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Figure 2020114886
Figure 2020114886
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化合物の合成（スキーム４５〜５１）
化合物１（１５．６ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＥ中のＴＭＳＯＴｆ（７．９８ｍＬ、４４．１ｍｍｏｌ）で処理したところ、化合物２が得られた。Ｃ１４Ｈ２０ＮＯ８についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値３３０．１２、実測値３３０．０。
化合物３の合成：ＤＣＥ中の化合物２（１．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル５−メルカプトペンタノエート（１．０ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）を、ＴＭＳＯＴｆ（０．１８１ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）で一晩処理した。水性後処理（ａｑｕｅｏｕｓ ｗｏｒｋ−ｕｐ）およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物３（３８０ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ、１５％）が得られた。Ｃ２３Ｈ３７ＮＮａＯ１０Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５４２．２０、実測値５４２．１。
化合物７の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の化合物３（３８０ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を０℃で加えた。混合物を、０℃で２時間、次に室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をトルエンと同時蒸発させたところ、粗化合物７が得られた。この材料を、精製せずに次の工程に使用した。Ｃ１９Ｈ３０ＮＯ１０Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値４６４．１５９０、実測値４６４．１。
化合物８の合成：前の工程からの化合物７（約０．７３１ｍｍｏｌ）を、１４時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のＥＤＣＩ（２８０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．７６４ｍＬ、４．３８ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１６８ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物８（２８４ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、２工程にわたって６９％）が得られた。Ｃ２３Ｈ３３Ｎ２Ｏ１２Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５６１．１７５４、実測値５６１．１。
臭化アルキンによる化合物６のＳ−アルキル化により、化合物９が得られる。同様に、化合物１４は、化合物１１から調製される（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２，６７，２９９５−２９９９）。酸１２は、報告される手順にしたがって調製される。
化合物１３の合成：化合物１２（２．４０ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を、１４時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中のＥＤＣＩ（１．１９ｇ、６．２２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２．７０ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７１６ｍｇ、６．２２ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物１３（１．８３ｇ、３．２６ｍｍｏｌ、６３％）が得られた。Ｃ２３Ｈ３３Ｎ２Ｏ１２Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５６１．１７５４、実測値５６１．２。
化合物１６を、報告される手順を用いて調製した（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，３６１９−３６２２；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，３０９，３１９−３３０）。
化合物２２の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の化合物１６（１．９４ｇ、５．２２ｍｍｏｌ）、４−ペンテン酸ベンジル（２．９９ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）および第二世代グラブス触媒（４３３ｍｇ、０．５２２ｍｍｏｌ）を、４０℃で４０時間加熱した。溶媒を除去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２２（１．８７ｇ、３．５０ｍｍｏｌ、６７％）が得られた。Ｃ２７Ｈ３６ＮＯ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５３４．２３３９、実測値５３４．２。
化合物２３の合成：ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中の化合物２２（１．８５ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）の溶液に、パラジウム炭素を加えた（Ａｌｄｒｉｃｈ：３３０１０８−５０Ｇ、１０重量％、ＤｅｇｕｓｓａタイプＥ１０１ ＮＥ／Ｗ：１８５ｍｇ）。反応混合物を、１４時間にわたってＨ２雰囲気下で撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅに通したろ過の後、ろ液を減圧下で除去した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２３（９０３ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ、５９％）が得られた。Ｃ２０Ｈ３２ＮＯ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値４４６．２０２６、実測値４４６．１。
化合物２４の合成：化合物２３（３２６ｍｇ、０．７３２ｍｍｏｌ）を、１４時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のＥＤＣＩ（２１１ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．３８３ｍＬ、２．２０ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２７ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物２４（３００ｍｇ、０．５５３ｍｍｏｌ、７６％）が得られた。Ｃ２４Ｈ３５Ｎ２Ｏ１２についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５４３．２１９０、実測値５４３．２。
１６の酸化的切断により、アルデヒド２５が得られる。それをアルコールに還元し、ベンジル−保護されたトリフレートによるＯ−アルキル化、続いて、脱保護およびエステル化に供したところ、２８が得られる。２５の還元的アミノ化により、酸２９が得られ、その後、エステル化により、３０が得られる。
化合物３５は、文献に報告されるのと同様の方法で合成され得る（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，６４４２−６４４５）。スキーム４８について上述されるように、化合物３８、４２、および４４を調製する。
活性化エステル８、１３、２４、３８、２８、４２、３０、４４を、トリアミン−（４５）またはモノアミン−（４８）を含有するヒドロキシプロリノールと結合したところ、それぞれ４６および４９が得られる。これらの化合物を、それらの対応するホスホロアミダイトに転化するかまたは固体担体上に充填する。
ＤＭＴｒ−保護されたジ−アジド５３を、クリック化学作用を用いてアルキン含有ＧａｌＮＡｃ誘導体と結合したところ、化合物５４が得られる。それを、その対応するホスホロアミダイトに転化するかまたは固体担体上に充填したところ、５５が得られる。
実施例２２．ＡＳＧＰＲ結合のためのＣ２−誘導体化されたガラクトサミン類似体の合成（スキーム５２〜５３）
Ｃ２−誘導体化されたガラクトサミン類似体が、以下のスキーム５２および５３に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
化合物５８を、報告される手順と同様の方法で調製する（例えば、国際公開第９６／３９４１１号を参照）。Ｏ−アルキル化、続いて、アセチル基の選択的切断により、化合物６０および６３が得られる。ＮＨＳエステル６１および６４を、標準的なエステル化によって調製する。６５のアセチル基を選択的に除去し、得られたヒドロキシル基を、ベンジル基によって保護したところ、６６が得られる。末端アルケンの酸化的切断により、６７が得られる。エステル化、続いて水素化により、６１／６４が得られる。
Figure 2020114886
トリフルオロメチルアセトアミド−（ＴＦＡ−）保護されたガラクトサミン（ＧａｌＮ−ＴＦＡ）ＮＨＳエステルを、合成後手法において、アミン含有オリゴヌクレオチド（６９／７１）と結合して、Ｇａｌ−ＴＦＡ含有オリゴヌクレオチド（７０／７２）を生成する。
実施例２３．プソイドウリジン骨格を含有するＡＳＧＰＲリガンド模倣体の合成（スキーム５５〜５６）
プソイドウリジンリガンドが、スキーム５５および５６に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
化合物４５２：１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５、７８０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（９４０ｍＬ）中のプソイドウリジン４５１（２０ｇ、８１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、アクリル酸メチル（２３５ｍＬ、２．６１ｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を１６時間撹拌した。溶媒の除去の後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２３）によって精製したところ、化合物４５２（２６．６ｇ、８０．５ｍｍｏｌ、９８％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４、４００ＭＨｚ）：δ７．７７（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５８（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８−４．０２（ｍ，２Ｈ）、３．９１−３．９４（ｍ，１Ｈ）、３．８０（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．６７（ｓ，３Ｈ）、３．６６（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．７３−２．７７（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ１７３．１、１６５．４、１５２．５、１４５．８、１１２．９、８５．６、８１．５、７５．６、７２．６、６３．３、５２．５、４６．２、３３．７．Ｃ１３Ｈ１９Ｎ２Ｏ８についてのＭＷ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値３３０．１１、実測値３３１．０。
化合物４５３：ＤＭＦ（６５ｍＬ）中の化合物４５２（１１．６７ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルシリルビス（トリフルオロメタンスルホネート）（１５．４６ｍＬ、４２．４ｍｍｏｌ）を、０℃で撹拌しながら滴下して加えた。反応混合物を０℃で３０分間撹拌し続け、イミダゾール（１２．０ｇ、１７６．５ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を、０℃で１０分間、次に室温で３０分間撹拌した。ＴＢＤＭＳＣｌ（７．９８ｇ、５３．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７５℃で６時間加熱した。反応混合物を、Ｅｔ２Ｏおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１、Ｒｆ＝０．５０）によって精製したところ、化合物４５３（１５．０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ、７３％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ１１．３９（ｓ，１Ｈ）、７．５４（ｓ，１Ｈ）、４．５５（ｓ，１Ｈ）、４．３４−４．３８（ｍ，１Ｈ）、４．１８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８６−４．００（ｍ，５Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、２．６７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．０２（ｓ，９Ｈ）、０．９９（ｓ，９Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ）、０．１３（ｓ，３Ｈ）、０．０８７（ｓ，３Ｈ）．Ｃ２７Ｈ４９Ｎ２Ｏ８Ｓｉ２についてのＭＷ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５８５．３０、実測値５８５．２。
化合物４５４：化合物４５３（１．２４ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を、室温で２時間にわたってエチレンジアミン（１０ｍＬ）で処理した。エチレンジアミンを蒸発によって除去し、残渣を減圧下で乾燥させた。粗材料をＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮したところ、４５４が白色の固体（１．１６ｇ、１．８９ｍｍｏｌ、８９％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ−ｄ４、４００ＭＨｚ）：δ７．４９（ｓ，１Ｈ）、４．６３（ｓ，１Ｈ）、４．３９−４．４１（ｍ，１Ｈ）、４．２９（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．００−４．０４（ｍ，５Ｈ）、３．１８−３．２６（ｍ，２Ｈ）、２．６９（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．５６−２．６１（ｍ，２Ｈ）、１．０７（ｓ，９Ｈ）、１．０４（ｓ，９Ｈ）、０．９４（ｓ，９Ｈ）、０．１７（ｓ，３Ｈ）、０．１３（ｓ，３Ｈ）．Ｃ２８Ｈ５３Ｎ４Ｏ７Ｓｉ２についてのＭＷ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６１３．３５、実測値６１３．２。
化合物４５５：ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＧａｌＮＡｃ酸（９３０ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（７８９ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１．６５ｍＬ、９．４５ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の化合物４５４を溶液に加え、一晩撹拌した。反応混合物を、Ｅｔ２Ｏおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。蒸発後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４３）によって精製したところ、化合物４５５（１．８３ｇ、１．７６ｍｍｏｌ、９３％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ１１．３６（ｓ，１Ｈ）、７．９８（ｓ，１Ｈ）、７．８２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７、（ｓ，１Ｈ）、７．５１（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５３（ｓ，１Ｈ）、４．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．３３−４．３６（ｍ，１Ｈ）、４．１８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５−４．０２（ｍ，９Ｈ）、３．６７−３．７３（ｍ，１Ｈ）、３．３７−３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．０４（ｓ，４Ｈ）、２．３９−２．４４（ｍ，２Ｈ）、２．１０（ｓ，３Ｈ）、２．０２−２．０５（ｍ，２Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．７７（ｓ，３Ｈ）、１．４６−１．４９（ｍ，４Ｈ）、１．０１（ｓ，９Ｈ）、０．９９（ｓ，９Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ）、０．１２（ｓ，３Ｈ）、０．０８０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）：δ１７２．０、１６９．８、１６９．７、１６９．５、１６９．２、１６２．３、１５０．３、１４３．４、１１０．６、１００．８、８３．４、７６．２、７４．７、７３．１、７０．３、６９．７、６８．５、６７．５、６６．６、６１．３、５４．９、５４．８、４９．３、４４．６、３８．３、３８．０、３４．９、３３．９、２８．５、２７．３、２６．７、２５．７、２５．６、２２．６、２２．０、２１．６、２０．４、２０．３、１９．８、１７．８、−４．５、−５．１．Ｃ４７Ｈ７９Ｎ５ＮａＯ１７Ｓｉ２についてのＭＷ（Ｍ＋Ｎａ）＋計算値１０６４．４９、実測値１０６４．２。
化合物４５６：フッ化水素−ピリジン（約７０％のＨＦ、０．１６５ｍＬ、６．３４ｍｍｏｌ）を、冷却しながらピリジン（２ｍＬ）で希釈した。得られた溶液を、０℃でＣＨ２Ｃｌ２中の化合物４５５の溶液に加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。蒸発後、粗材料を減圧下で乾燥させたところ、白色の発泡体が得られた。ピリジン（１５ｍＬ）中のこの材料の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（５９６ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５７）によって精製したところ、化合物４５６（１．６５ｇ、１．３７ｍｍｏｌ、７８％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ１１．３３（ｓ，１Ｈ）、７．９２（ｓ，１Ｈ）、７．８１（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７５、（ｓ，１Ｈ）、７．４２−７．４４（ｍ，３Ｈ）、７．１９−７．３２（ｍ，７Ｈ）、６．８７−６．９０（ｍ，４Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２−４．０７（ｍ，４Ｈ）、３．８１−３．９１（ｍ，３Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．６８−３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．５３−３．６３（ｍ，１Ｈ）、３．２３−３．４０（ｍ，２Ｈ）、３．０２−３．１４（ｍ，５Ｈ）、２．３２−２．３５（ｍ，２Ｈ）、２．１０（ｓ，３Ｈ）、２．００−２．０４（ｍ，２Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．４４−１．４７（ｍ，４Ｈ）、０．８７（ｓ，９Ｈ）、０．０６４（ｓ，３Ｈ）、０．０４１（ｓ，３Ｈ）．Ｃ６０Ｈ８１Ｎ５ＮａＯ１９ＳｉについてのＭＷ（Ｍ＋Ｎａ）＋計算値１２２６．５２、実測値１２２６．４。
化合物４５７：ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の化合物４５６（１．８６ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．４７ｍＬ、４．６３ｍｍｏｌ）および４，５−ジシアノイミダゾール（１８２ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。反応混合物を、アルゴン雰囲気下で２０時間にわたって室温で撹拌した。反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。ろ液を濃縮し、得られた粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次に、ＣＨ２Ｃｌ２中０〜３％のＭｅＯＨ）によって精製したところ、４５７（１．８０ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、８３％、Ｒｆ＝ＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨによって展開される０．４３）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３４（ｓ，０．５Ｈ）、１１．３３（ｓ，０．５Ｈ）、７．９１（ｓ，１Ｈ）、７．８１（ｄ，Ｊ＝９．２、１Ｈ）、７．７５（ｓ，１Ｈ）、７．５６（ｓ，０．５Ｈ）、７．５２（ｓ，０．５Ｈ）、７．４３（ｔ，Ｊ＝８．２、２Ｈ）、７．１９−７．３２（ｍ，７Ｈ）、６．８５−６．９０（ｍ，４Ｈ）、５．２１（ｓ，０．５Ｈ）、５．２１（ｓ，０．５Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．４、１Ｈ）、４．４７−４．５１（ｍ，２Ｈ）、４．３６−４．４１（ｍ，１Ｈ）、４．０２−４．０７（ｍ，５Ｈ）、３．８３−３．９０（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，３Ｈ）、３．７２（ｓ，３Ｈ）、３．６９−３．７１（ｍ，３Ｈ）、３．３１−３．６０（ｍ，ｘｘＨ）、３．０４−３．２６（ｍ，６Ｈ）、２．６９−２．７３（ｍ，１Ｈ）、２．３５（ｔ，Ｊ＝６．３、２Ｈ）、２．１０（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｍ，２Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．７７（ｓ，３Ｈ）、１．４５−１．４８（ｍ，４Ｈ）、０．９１−１．０８（ｍ，１２Ｈ）、０．８５（ｓ，９Ｈ）、０．０６３（ｓ，１．５Ｈ）、０．０４６（ｓ，１．５Ｈ）、０．０３５（３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１６２ＭＨｚ）δ１４７．９２、１４７．７０．Ｃ６９Ｈ９８Ｎ７ＮａＯ２０ＰＳｉについてのＭＷ（Ｍ＋Ｎａ）＋計算値１４２６．６３、実測値１４２６．５。
Figure 2020114886
化合物４５８：ピリジン（４００ｍＬ）中の４５２（２１．５ｇ、６５．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（１．５９ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＴｒＣｌ（２２．１ｇ、６５．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、ＥｔＯＡｃおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．３０）によって精製したところ、４５８（３６．２ｇ、５７．２ｍｍｏｌ、８８％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ１１．３７（ｓ，１Ｈ）、７．４８（ｓ，１Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７−７．３２（ｍ，６Ｈ）、７．２０−７．２３（ｍ，１Ｈ）、６．８７−６．９０（ｍ，４Ｈ）、５．０６（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．８０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５４（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．８４−３．９３（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５６−３．６９（ｍ，２Ｈ）、３．５３（ｓ，３Ｈ）、３．１５−３．１７（ｍ，２Ｈ）、２．５８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４、１００ＭＨｚ）：δ１７２．７、１６５．５、１６０．２、１５２．７、１４６．４、１４４．５、１３７．４、１３７．３、１３１．５、１３１．４、１２９．６、１２８．９、１２８．０、１１４．２、１１４．０、８７．５、８３．０、８１．１、７６．２、７２．４、６４．７、５５．８、５２．４、４６．２、３３．５．Ｃ３４Ｈ３６Ｎ２ＮａＯ１０についてのＭＷ（Ｍ＋Ｎａ）＋計算値６５５．２３、実測値６５５．２。
化合物４５９：化合物４５８（１３．９ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を、室温で１８時間にわたってエチレンジアミン（７５ｍＬ）で処理した。エチレンジアミンを蒸発によって除去し、トルエンと同時蒸発させた。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１８０ｍＬ／２０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５０ｍＬ）で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次に濃縮した。粗材料を、ヘキサンおよびＣＨ２Ｃｌ２で結晶化させたところ、４５９が淡黄色の固体（１１．７ｇ、１７．７ｍｍｏｌ、８０％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ−ｄ４、４００ＭＨｚ）：δ７．５７（ｓ，１Ｈ）、７．２１−７．４８（ｍ，９Ｈ）、６．８６−６．８８（ｍ，４Ｈ）、４．７１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２−４．１７（ｍ，３Ｈ）、３．７９−３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ）、３．３１−３．３６（ｍ，３Ｈ）、３．１５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．６３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．４１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）．Ｃ３５Ｈ４０Ｎ４ＮａＯ９についてのＭＷ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６８３．２７、実測値６８３．２。
化合物４６０：ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のＧａｌＮＡｃ酸（５．６０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（４．７０ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０．３ｍＬ、５９．３ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物４５９を溶液に加え、一晩撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃおよびＨ２Ｏで抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。蒸発後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５０）によって精製したところ、化合物４６０（６．８５ｇ、６．２８ｍｍｏｌ、５９％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ１１．３３（ｓ，１Ｈ）、７．９３（ｓ，１Ｈ）、７．８１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７５、（ｓ，１Ｈ）、７．４１−７．４４（ｍ，３Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，６Ｈ）、７．１８−７．２２（ｍ，１Ｈ）、６．８７−６．８９（ｍ，４Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．０３（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５１（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２（ｍ，３Ｈ）、３．８２−３．９２（ｍ，４Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５４−３．７０（ｍ，３Ｈ）、３．３６−３．４２（ｍ，１Ｈ）、３．０２−３．２１（ｍ，６Ｈ）、２．３５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．４３−１．４９（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）：δ１７２．０、１６９．９、１６９．８、１６９．５、１６９．４、１６９．２、１６２．６、１５７．９、１５０．３、１４４．９、１４３．２、１３５．７、１３５．６、１２９．７、１２７．７、１２６．５、１１３．０、１１１．３、１００．９、８５．２、８０．７、７９．８、７３．５、７０．８、７０．４、６９．７、６８．５、６６．６、６４．１、６１．３、５４．９、５４．８、４９．３、４８．５、４４．８、３８．３、３８．１、３４．９、３３．９、２８．５、２２．７、２１．６、２０．４、２０．３．Ｃ５４Ｈ６７Ｎ５ＮａＯ１９についてのＭＷ（Ｍ＋Ｎａ）＋計算値１１１２．４３、実測値１１１２．２。
化合物４６１：ピリジン（１０ｍＬ）中の化合物４６０（１．５５ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＤＭＳＣｌ（２１４ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（２９０ｍｇ、４．２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。蒸発後、残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．１５）によって精製したところ、化合物４６１（５５０ｍｇ、０．４５７ｍｍｏｌ、３２％）およびその２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ異性体４５６（３９０ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ、２３％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ１１．３２（ｓ，１Ｈ）、７．９４（ｓ，１Ｈ）、７．８２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７５、（ｓ，１Ｈ）、７．５４（ｓ，１Ｈ）、７．４０−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．２１−７．３２（ｍ，７Ｈ）、６．８７−６．８９（ｍ，４Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７−４．４９（ｍ，２Ｈ）、３．９５−４．０２（ｍ，５Ｈ）、３．８３−３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６８−３．７１（ｍ，３Ｈ）、３．３８−３．４１（ｍ，１Ｈ）、３．０３−３．１９（ｍ，６Ｈ）、２．３９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．１０（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．７７（ｓ，３Ｈ）、１．４５−１．５０（ｍ，４Ｈ）、０．７４（ｓ，９Ｈ）、−０．０３４、（ｓ，３Ｈ）、−０．１１（ｓ，３Ｈ）．Ｃ６０Ｈ８１Ｎ５ＮａＯ１９ＳｉについてのＭＷ（Ｍ＋Ｎａ）＋計算値１２２６．５２、実測値１２２７．４。
化合物４６２：ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）中の化合物４６１（２．２８ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（６９３ｍｇ、５．６７ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（３７８ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。水性後処理を伴わない粗混合物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中１０％のＭｅＯＨ／１０％のＥｔ３Ｎ、Ｒｆ＝０．４４）により、化合物４６２が対応するトリエチルアンモニウム塩（２．５０ｇ、１．７８ｍｍｏｌ、９４％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：δ８．４２（ｓ，１Ｈ）、８．１８（ｓ，１Ｈ）、８．０５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｓ，１Ｈ）、７．４８−７．５０（ｍ，２Ｈ）、７．２９−７．４０（ｍ，７Ｈ）、６．９５−６．９７（ｍ，４Ｈ）、５．２８−５．３０（ｍ，２Ｈ）、５．０７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．６０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．３７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０９−４．１３（ｍ，３Ｈ）、３．９１−３．９７（ｍ，２Ｈ）、３．８１（ｓ，６Ｈ）、３．７８−３．８５（ｍ，３Ｈ）、３．４２−３．４９（ｍ，２Ｈ）、３．２７−３．３０（ｍ，１Ｈ）、３．１０−３．１６（ｍ，５Ｈ）、２．４３−２．５３（ｍ，５Ｈ）、２．１８（ｓ，３Ｈ）、２．１２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、１．９７（ｓ，３Ｈ）、１．８５（ｓ，３Ｈ）、１．５２−１．５７（ｍ，４Ｈ）、０．７９（ｓ，９Ｈ）、０．００（ｓ，３Ｈ）、−０．０７５（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）：δ１７３．８、１７２．２、１７２．１、１７１．５、１６９．９、１６９．６、１６９．５、１６９．３、１６２．５、１５８．１、１５０．４、１４４．７、１４４．６、１３５．５、１３５．４、１２９．７、１２７．７、１２６．６、１１３．１、１０９．５、１００．９、８５．６、８１．６、７７．５、７４．２、７１．０、７０．５、６９．８、６８．５、６６．７、６３．６、６１．４、５２．０、４９．３、３８．４、３８．２、３４．９、３４．０、３０．０、２９．５、２８．５、２５．８、２５．５、２５．４、２２．７、２１．６、２１．４、２０．５、２０．４、１７．５、１４．７、７．１、−５．１、−５．４．Ｃ６４Ｈ８４Ｎ５Ｏ２２ＳｉについてのＭＷ（Ｍ−Ｈ）−計算値１３０２．５４、実測値１３０２．４。
化合物４６３：ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物４６２（９８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（３０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０６１ｍＬ、０．３５ｍｍｏｌ）、およびアミノメチルポリスチレン担体（ＡＲＴＶＩＳＩＯＮ、７０ｍｏｌ／ｇ、１．１０ｇ、０．０７７ｍｍｏｌであると考えられる）を連続して加えた。混合物を２４時間にわたって振とうし、次にろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧下で乾燥させた。残りのアミノ基を、ピリジン（１５ｍＬ）、無水酢酸（５ｍＬ）、およびトリエチルアミン（１ｍＬ）とともに１時間振とうすることによってキャッピングした。ろ過後、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）、次に５０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させたところ、化合物４６３（１．１２ｇ）が得られた。充填量：４７ｍｏｌ／ｇ。
実施例２４．Ｎ−グリコシド結合を含有するＡＳＧＰＲリガンド模倣体の合成（スキーム５７〜６３）
Ｎ−グリコシド結合を含有するＡＳＧＰＲリガンドが、スキーム５７〜６３に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
実施例２５．ＡＳＧＰＲリガンド模倣体（スキーム６４〜７３）
以下のＡＳＧＰＲリガンドが、スキーム６４〜７３に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
実施例２６．リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするためのアミノリンカー（スキーム７４〜７６）
リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするためのアミノリンカーが、以下のスキーム７４〜７６によって調製され得る。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
実施例２７．ＡＳＧＰＲリガンド模倣体 − 糖質骨格
以下のＡＳＧＰＲリガンドが、スキーム７７に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
実施例２８．プリン塩基のＣ２へのＧａｌＮＡｃリガンドのコンジュゲーション
ＧａｌＮＡｃリガンドが、以下のスキーム７８に示されるように、プリン塩基のＣ２位に調製され得る。
Figure 2020114886
ＱＡおよびＱＢが、本明細書に記載されるＡＳＧＰＲリガンドのいずれかである。
実施例２９．ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート
ＲＮＡ合成および二本鎖アニーリング
１．オリゴヌクレオチド合成
全てのオリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置またはＡＢＩ ３９４合成装置で合成した。特に規定されない限り、市販の制御多孔質ガラス固体担体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−−イソブチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。２’−Ｆホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホロアミダイトを、（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入した。１０％のＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍの濃度で使用したグアノシンを除いて、全てのホスホロアミダイトを、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度で使用した。１６分間の結合／再利用時間を使用した。活性剤は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ−酸化については、ヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ−酸化については、２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中のＰＡＤＳ（２％）を使用した。
リガンドがコンジュゲートされた鎖を、対応するリガンドを含有する固体担体を用いて合成した。例えば、配列の３’末端における糖質部分／リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃの場合）の導入を、対応する糖質固体担体を用いて合成を開始することによって行った。同様に、３’末端のコレステロール部分を、コレステロール担体上で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分を、前の実施例に記載される最適なテザーを介してトランス−４−ヒドロキシプロリノールに連結して、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を得た。次に、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を、スクシネートリンカーを介して固体担体に結合するか、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホロアミダイトに転化して、所望の糖質コンジュゲート構成単位を得た。フルオロフォア標識ｓｉＲＮＡを、対応するホスホロアミダイトまたは固体担体（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した）から合成した。オレイルリトコール酸（ＧａｌＮＡｃ）３ポリマー担体を、３８．６μｍｏｌ／グラムの充填量で、社内で作製した。マンノース（Ｍａｎ）３ポリマー担体も、４２．０μｍｏｌ／グラムの充填量で、社内で作製した。
所望の位置、例えば配列の５’末端における最適なリガンドのコンジュゲーションを、特に規定されない限り、標準的なホスホロアミダイト結合条件下で、対応するホスホロアミダイトを成長鎖に結合することによって行った。固体に結合されたオリゴヌクレオチドに対する、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性剤の存在下における無水ＣＨ３ＣＮ中のホスホロアミダイトの０．１Ｍの溶液の延長された１５分間の結合。（１）Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．（２００８）Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，１１，２０３−２１６；（２）Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．，Ｗｏｌｆ，Ｊ．ａｎｄ Ｉｖａｎｏｖ，Ｓ．Ａ．（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ．Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，１，２９３−３０７および（３）Ｘｉａ，Ｊ．，Ｎｏｒｏｎｈａ，Ａ．，Ｔｏｕｄｊａｒｓｋａ，Ｉ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｂｒａｉｃｈ，Ｒ．，Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｅｇｌｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ａ Ｒｉｂｏ−ｄｉｆｌｕｏｒｏｔｏｌｕｙｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１，１７６−１８３に報告されるように標準的なヨウ素−水を用いて、またはコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの１０分間の酸化待ち時間を伴う、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いた処理によって、ヌクレオチド間ホスファイトからホスフェートへの酸化を行った。ＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した）、ＰＡＤＳおよびまたはボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬などの硫黄移動剤を用いることによって、ホスホロチオエートを、ホスファイトからホスホロチオエートの酸化によって導入した。コレステロールホスホロアミダイトを、社内で合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度で使用した。コレステロールホスホロアミダイトの結合時間は、１６分間であった。
２．脱保護−Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成の完了の後、担体を、１００ｍｌのガラス瓶（ＶＷＲ）に移した。５５℃で６．５時間にわたって、８０ｍＬの、エタノールアンモニアの混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］を用いて、塩基およびリン酸基を同時に脱保護しながら、オリゴヌクレオチドを、担体から切断した。瓶を、氷上で短時間冷却し、次に、エタノールアンモニア混合物をろ過して、新たな２５０ｍｌの瓶に入れた。ＣＰＧを、２×４０ｍＬの分量のエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄した。次に、混合物の体積を、ロータリーエバポレータ（ｒｏｔｏ−ｖａｐ）によって約３０ｍｌまで減少させた。次に、混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバック（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）で、減圧下で乾燥させた。
３．脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥した残渣を、２６ｍｌのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁させ、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次に、反応を、５０ｍｌの２０ｍＭの酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調整し、精製するまで冷凍庫で貯蔵した。
４．分析
精製の前に、オリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートされるリガンドの性質によって決まる。
５．ＨＰＬＣ精製
リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、逆相分取ＨＰＬＣによって精製した。コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドを、社内で充填したＴＳＫゲルカラムで、アニオン交換ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、１０％のＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）および１０％のＣＨ３ＣＮ、１ＭのＮａＢｒ中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）であった。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させた。約０．１５ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを、水で１５０μｌに希釈し、次に、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析用の特殊なバイアル中にピペットで取った。化合物を、最後に、ＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥによって分析した。
６．ＲＮＡｉ剤の調製
ＲＮＡｉ剤の調製のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、９５℃で５分間にわたって１×ＰＢＳ中で加熱し、ゆっくりと室温に冷ました。二本鎖の完全性を、ＨＰＬＣ分析によって確認した。以下の表１は、合成されたＲＮＡｉ剤を示している。
実施例３０：合成後方法を用いたｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートの合成
所望のアミノリンカーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドを、実施例３０（スキーム７９）に記載される固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護条件に適合する対応するアミノリンカーモノマーを用いて合成した。脱保護の後、アミノが結合されたオリゴヌクレオチドを、スキーム７９の下の表に示されるリガンドのＮＨＳエステルと反応させた後、アンモニアによる処理およびＨＰＬＣ精製を行った。各精製されたリガンドがコンジュゲートされた一本鎖オリゴヌクレオチドを、相補的な鎖の等モル混合物でアニールしたところ、表５に示されるｓｉＲＮＡが得られた。スキーム７９および表５に示される（１＋１＋１）設計が、アミノリンカーホスホロアミダイトをアミノリンカー固体担体に連続して結合し（２つの合成サイクル）、その後、実施例２９に記載されるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーを連続して結合することによって得られた。
オリゴヌクレオチドへのリガンドの合成後コンジュゲーション
Figure 2020114886
各コンジュゲート中のＴＴＲ ｓｉＲＮＡは同じであった。同様に、各コンジュゲート中のＡＴ３ ｓｉＲＮＡは同じであった。以下のリガンドを、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の３’末端への結合部位を示す。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
実施例３１：ＲＮＡｉ剤のインビトロスクリーニング
細胞培養およびトランスフェクション
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞またはラットＨ．ＩＩ．４．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が補充されたＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、５％のＣＯ２の雰囲気下、３７℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によってプレートから解放した。ウェル当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）を、９６ウェルプレート内のウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で１５分間インキュベートした。次に、約２×１０４個のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質を有さない８０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を２４時間または１２０時間インキュベートした。１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で単回投与実験を行い、１０ｎＭの最終二本鎖濃度の最大用量で、８、４倍連続希釈を用いて用量応答実験を行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ＃：６１０−１２）を用いた総ＲＮＡ単離
細胞を採取し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中に溶解させ、次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、プロセス全体を通して同一であった）。１０マイクロリットルの磁気ビーズおよび８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、１分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに加え、５分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を加え、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁石上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を除去し、別の９６ウェルプレートに加えた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
反応当たり、１μｌの１０倍緩衝液、０．４μｌの２５倍ｄＮＴＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤および１．６μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、５μｌの総ＲＮＡに加えた。以下の工程によって、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーモサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）中で、ウェル当たり、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ（ヒト）Ｃａｔ＃４３０８３１３（げっ歯類））、０．５μｌのＴＴＲ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＨＳ００１７４９１４＿ｍ１（ヒト）ｃａｔ＃Ｒｎ００５６２１２４＿ｍ１（ラット））および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。Ｒｏｃｈｅ ＬＣ ４８０リアルタイムＰＣＲ機械（Ｒｏｃｈｅ）中でリアルタイムＰＣＲを行った。特に断りのない限り、各二本鎖を少なくとも２つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、各トランスフェクションを２回アッセイした。
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いて、リアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、または疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを用いて４パラメータフィットモデルを用いてＩＣ５０を計算し、同じ用量範囲にわたる非標的特異的な対照でトランスフェクトした細胞または未感作細胞、またはそれ自体の最も少ない用量に対して正規化した。ＩＣ５０を、それぞれの個々のトランスフェクションに対してならびに組み合わせて計算し、ここで、１つのＩＣ５０を、両方のトランスフェクションからのデータにフィッティングした。
実施例３２：ＴＴＲを標的にする化学修飾されたＲＮＡｉ剤のインビトロでのサイレンシング活性
以下の実験は、ＴＴＲを標的にするＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性に対する、ＧａｌＮＡｃ３リガンドとともに三重項反復モチーフの導入を含む化学修飾の有益な効果を実証した。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＩＣ５０の評価のためのプロトコル
各修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いて標準的な逆トランスフェクションによって、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中で決定した。簡潔に述べると、５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを、ウェル当たり１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび０．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）とともに、９６ウェルプレート内のウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることにより逆トランスフェクションを行い、室温で１５〜２０分間インキュベートした。インキュベーションの後、次に、１２，０００〜１５，０００個のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質を有さない１００μＬの完全増殖培地を、各ウェルに加えた。細胞を、溶解ならびにｂＤＮＡ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）によるＴＴＲおよびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの分析の前に、５％のＣＯ２の雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。１０ｎＭ〜０．６ｐＭの範囲の７つの異なるｓｉＲＮＡ濃度を、ＩＣ５０の決定のために評価し、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞のＴＴＲ／ＧＡＰＤＨを、１０ｎＭのＬｕｃ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。
自由取り込み（ｆｒｅｅ−ｕｐｔａｋｅ）ＩＣ５０の評価のためのプロトコル
初代カニクイザルまたはマウス肝細胞における自由取り込みサイレンシングを、４時間または２４時間にわたるＴＴＲ ｓｉＲＮＡを用いたインキュベーションの後に評価した。サイレンシングを、最初の曝露から２４時間の時点で測定した。
実施例３３：マウスにおけるＴＴＲ ｍＲＮＡサイレンシングおよびＴＴＲタンパク質抑制
ＲＮＡｉ剤の有効性を評価するために、これらの薬剤をマウスに投与した。ＲＮＡｉ剤またはＰＢＳ対照を、５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの単回の皮下投与でマウスに投与した。約４８時間後、マウスを２００μｌのケタミンで麻酔をかけ、次に、右尾動脈を切断することによって放血させた。全血を単離し、血漿を単離し、アッセイまで−８０℃で貯蔵した。肝組織を採取し、急速冷凍し、プロセシングまで−８０℃で貯蔵した。
処置の有効性を、（ｉ）投与の４８および１４４時間後の時点での肝臓中のＴＴＲ ｍＲＮＡの測定、および（ｉｉ）放血前および投与の４８／１４４時間後の時点での血漿中のＴＴＲタンパク質の測定によって評価した。ＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ−ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ｃａｔ＃：ＱＳ００１１）を用いてアッセイした。簡潔に述べると、マウス肝臓試料をすり潰し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物（最終濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるような、１容量の溶解混合物、２容量のヌクレアーゼを含まない水および１０ｕｌのプロテイナーゼ−Ｋ／ｍｌの混合物）を、６５℃で３５分間インキュベートした。次に、２０μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ（遺伝子標的のためのＴＴＲプローブおよび内在性コントロールのためのＧＡＰＤＨ）および８０ｕｌの組織溶解物を、捕捉プレート（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ）に加えた。捕捉プレートを、５５℃±１℃（約１６〜２０時間）インキュベートした。翌日、捕捉プレートを、１倍の洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含まない水、緩衝液成分１および洗浄緩衝液成分２）で３回洗浄し、次に、２４０ｇで１分間遠心分離することによって乾燥させた。１００μｌの前置増幅器作動試薬（ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）を、アルミニウム箔で封止した捕捉プレートに加え、５５℃±１℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、洗浄工程を繰り返し、次に、１００μｌの増幅器作動試薬（Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）を加えた。１時間後、洗浄および乾燥工程を繰り返し、１００μｌのＬａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅを加えた。捕捉プレートを、５０℃±１℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを、１倍の洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、１００μｌの基質を捕捉プレートに加えた。捕捉プレートを、５〜１５分間のインキュベーションの後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて読み取った。各３つの試料から平均バックグラウンドを減算し、得られた３つのＧＡＰＤＨ（対照プローブ）およびＴＴＲ（実験プローブ）値を平均し、次に、（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）の比率を計算することによって、ｂＤＮＡデータを分析した。
血漿ＴＴＲレベルを、製造業者のガイドラインにしたがって、市販のキットを用いてアッセイした。簡潔に述べると、マウス血漿を、１倍の混合物希釈剤中で１：１０，０００に希釈し、キット標準とともに予め被覆されたプレートに加え、室温で２時間インキュベートした後、キット洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０マイクロリットルのビオチン化プレアルブミン抗体を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０マイクロリットルのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを各ウェルに加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした後、上述されるように洗浄した。反応物を、５０μｌ／ウェルのクロモゲン基質の添加によって発色させ、室温で１０分間インキュベートし、５０μｌ／ウェルの停止溶液の添加によって反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で読み取り、データを、Ｓｏｆｔｍａｘ ４．６ソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて分析した。
代表的なｓｉＲＮＡ−コンジュゲートの有効性の結果が、図１に示される。アノマー結合修飾リガンドのほとんどが、５ｍｇ／ｋｇの用量で同様のＴＴＲタンパク質抑制を示した。
実施例３４：インビトロおよびインビボでのＡＴ３ ｍＲＮＡサイレンシング
マウスにおけるＡＴ３のインビボでの遺伝子サイレンシングを、インビボでのＴＴＲ遺伝子サイレンシングについて実施例３３に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって、ＡＴ３ ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートの単回皮下投与によって決定した。インビトロでの遺伝子サイレンシングを、実施例３１および３２に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって評価した。
ｓｉＲＮＡコンジュゲート５４９４４および５６８８１を、３つの異なる単回用量レベル：５、１０および２５ｍｇ／ｋｇで、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに皮下投与し、ＰＢＳ対照と比較したＡＴ３タンパク質レベルを、投与の７２時間後に測定した。結果が図２に示される。コンジュゲート５４９４４および５６８８１は、上記および図２中で、それぞれ７０００１および７０００２と呼ばれる。
実施例３５：オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのためのモノ−ＧａｌＮＡｃ構成単位の合成
示されるモノ−ＧａｌＮＡｃ構成単位は、スキーム８０に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
１０２の合成：ＧａｌＮＡｃ酸１００（８．３９ｇ、１８．７１ｍｍｏｌ）およびヒドロキシプロリンアミン（１０．００ｇ、１８．７７ｍｍｏｌ）を一緒にジクロロメタンに入れた。ＨＢＴＵ（１０．６８ｇ、２８．１２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．８０ｍＬ、３当量）を加え、混合物を周囲温度で２時間撹拌した。ＴＬＣを調べ、反応混合物を分液漏斗に移し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶媒としてジクロロメタンおよびＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物１０２が淡黄色のふんわりした固体（１１．７７ｇ、６３％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９−７．０９（ｍ，９Ｈ）、６．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０、５．４、２．１Ｈｚ、４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．０３−４．８３（ｍ，２Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１−４．０７（ｍ，２Ｈ）、４．０４−３．９５（ｍ，３Ｈ）、３．８６（ｄｔ，Ｊ＝１１．２、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９−３．６８（ｍ，６Ｈ）、３．６８−３．３６（ｍ，３Ｈ）、３．２１−２．８８（ｍ，５Ｈ）、２．２６−２．１４（ｍ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．８７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５３−１．２９（ｍ，７Ｈ）。
１０４の合成：ヒドロキシプロリン誘導体１０２（６．００ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。それに、ＤＩＥＡ（２．２０ｍＬ、３当量）およびクロロアミダイト試薬を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、ＴＬＣによって調べた。それを分液漏斗に移し、水および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶離剤としてジクロロメタンおよびＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物が白色のふんわりした固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６８（ｓ，１Ｈ）、７．４２−７．０６（ｍ，８Ｈ）、７．０１−６．７３（ｍ，４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｓ，１Ｈ）、４．０１（ｓ，３Ｈ）、３．８６（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ、９Ｈ）、３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝３７．０、２３．３、１６．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．９９（ｄｄ，Ｊ＝１２．３、６．４Ｈｚ、３Ｈ）、２．７４（ｄｄ，Ｊ＝９．２、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．２１（ｓ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０５−１．９５（ｍ，５Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５２−１．１６（ｍ，１１Ｈ）、１．１６−１．０２（ｍ，１１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ δ＝１５１．７８、１５１．６１、１５１．５０、１５１．３０。
１０５の合成：化合物１０２（２．１０ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解させた。この混合物に、無水コハク酸（０．４４１ｇ、４．３６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．５３２ｇ、当量）、続いてＴＥＡ（１ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物のＴＬＣを調べ、反応混合物を水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルの小さいパッドに通してろ過した。溶媒を除去し、この材料を次の反応に使用した。上記の反応からのスクシネートを、無水アセトニトリルに溶解させた。ＨＢＴＵ（１．５９ｇ、４．２０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．１０ｍｌ）を加え、混合物を５分間回転させた。ポリスチレン固体担体を反応混合物に加え、混合物を周囲温度で一晩振とうした。固体担体をろ過し、洗浄し、無水酢酸／Ｐｙ混合物を用いてキャッピングした。固体担体を、ジクロロメタン、ＭｅＯＨ／ＤＣＭおよびエーテル（２７．１０ｇ、５５ｕｍｏｌ／ｇ）で再度洗浄した。
実施例３６：オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのためのモノ−ＧａｌＮＡｃ ＮＨＳエステルの合成
オリゴヌクレオチドコンジュゲーションに有用なモノ−ＧａｌＮＡｃ ＮＨＳエステルが、以下のスキーム８１〜８６に示されるように調製され得る。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
実施例３７：オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのためのアミドおよびカルバメートが結合された構成単位の合成
Figure 2020114886
化合物５００１の合成：ＤＣＭ中の化合物５０００（２３．２２ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮａＮ３（１２．４ｇ、１９０．８ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＨＳ（２１．６ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）を加えた後、１５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた。得られた混合物を１４時間撹拌した。次に、反応混合物を、酢酸エチル（３×２５０ｍｌ）で抽出し、水、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料が得られた。この材料を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解させた後、１５０ｍＬのヘキサンを加えたところ、白色の固体としての生成物の沈殿が生じた。固体を減圧下で乾燥させたところ、化合物５００１（１６．２ｇ、６８．４％）が得られた。化合物５００１についてのＬＣＭＳ：計算値：３７２．３３（Ｍ＋）、実測値：４０７．１（Ｍ−＋Ｃｌ−）。
化合物５００２の合成：ＴＨＦ（６００ｍＬ）中の化合物５００１（１３．２ｇ、３５．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＰｔＯ２（０．６ｇ）を加え、反応混合物を、室温で１４時間にわたって水素雰囲気下で撹拌した。触媒をろ過によって除去した。溶媒の濃縮により、化合物５００２（１３．０ｇ）が得られた。
化合物５００３の合成：ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の化合物５００２（１０．０ｇ、２８．８９ｍｍｏｌ）およびグルタル酸無水物（３．２９ｇ、２８．８９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピリジン（４．６ｇ）およびＤＭＡＰ（０．１７６ｇ）を加えた。反応混合物を１４時間撹拌した。得られた混合物を濃縮し、次に、ろ過カラム（ｆｉｌｔｅｒ ｃｏｌｕｍｎ）にかけたところ、化合物５００３（１１．４５ｇ、８６％）が得られた。化合物５００３についてのＬＣＭＳ：計算値：４６０．４３（Ｍ＋）、実測値：４５９．３（Ｍ−−１）、４９５．０（Ｍ−＋Ｃｌ−）。
化合物５００４の合成：ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の化合物５００３（７．６ｇ、１６．５１ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（２．０９ｇ、１８．１６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（３．８ｇ、１９．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＥＡ（７．１６ｍＬ、４１．２７ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。得られた混合物を１４時間撹拌した。次に、１００ｍＬの水を加え、生成物を、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出し、クエン酸（２０％）、飽和ＮａＨＣＯ３、塩水で洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、化合物５００４（６ｇ、６５％）が得られた。化合物５００４についてのＬＣＭＳ：計算値：５５７．５（Ｍ＋）、実測値：５５８．０（Ｍ＋＋１）。
Figure 2020114886
化合物５００５の合成：アセトニトリル（５０ｍＬ）中の化合物５００２（３．０ｇ、８．６６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＳＣ（２．２２ｇ、８．６６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で一晩（１４時間）撹拌した。溶媒を濃縮し、次に、生成物を、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、水、１０％のクエン酸、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、化合物５００５（３．８ｇ、９５％）が得られた。Ｃ１９Ｈ２５Ｎ３Ｏ１２についてのＬＣＭＳ計算値：４８７．４１（Ｍ＋）、実測値：４８８．１（Ｍ＋＋１）、５１０．１（Ｍ＋＋Ｎａ＋）。
化合物５００６の合成：ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の化合物５００５（０．６６３ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アミン（０．５２６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．４ｍＬ）を加えた。溶媒を濃縮し、次に、生成物を、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、水、１０％のクエン酸、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、化合物５００６（０．７ｇ、９３％）が得られた。Ｃ２５Ｈ３３Ｎ３Ｏ１１についてのＬＣＭＳ計算値５５１．５４（Ｍ＋）、実測値：５５２．２（Ｍ＋＋１）、５７４．２（Ｍ＋＋Ｎａ＋）。
化合物５００７の合成：ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中の化合物５００５（０．７ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加え、得られた混合物を一晩（１４時間）水素雰囲気下で撹拌した。触媒を、セライト上でのろ過によって除去し、混合物をＥｔＯＨ（９５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮したところ、生成物が得られ、それを精製せずに次の工程に使用した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の上記の酸の撹拌溶液に、ＥＤＣ（４８８ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（７３０ｍｇ、６．３５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．８８ｍＬ、５．０７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物の濃縮、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物５００７（２５０ｍｇ、３５％）が得られた。Ｃ２２Ｈ３０Ｎ４Ｏ１３についてのＬＣＭＳ計算値：５５８．４９（Ｍ＋）、実測値：５５９．２（Ｍ＋＋１）、５８１．１（Ｍ＋＋Ｎａ＋）。
実施例３８：Ｓ−およびＣ−結合ＧａｌＮＡｃ誘導体および構成単位の合成
Figure 2020114886
化合物５０１２の合成：化合物４９９９（１５．６ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＥ中のＴＭＳＯＴｆ（７．９８ｍＬ、４４．１ｍｍｏｌ）で処理したところ、化合物５０１１が得られた。Ｃ１４Ｈ２０ＮＯ８についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値３３０．１２、実測値３３０．０。ＤＣＥ中の化合物５０１１（１．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル５−メルカプトペンタノエート（１．０ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）を、ＴＭＳＯＴｆ（０．１８１ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）で一晩処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物５０１２（３８０ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ、１５％）が得られた。Ｃ２３Ｈ３７ＮＮａＯ１０Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５４２．２０、実測値５４２．１。
化合物５０１３の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の化合物５０１２（３８０ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。混合物を、０℃で２時間、次に、室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をトルエンと同時蒸発させたところ、粗化合物５０１３が得られた。この材料を、精製せずに次の工程に使用した。Ｃ１９Ｈ３０ＮＯ１０Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値４６４．１５９０、実測値４６４．１。
化合物５０１４の合成：前の工程からの化合物５０１３（約０．７３１ｍｍｏｌ）を、１４時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のＥＤＣＩ（２８０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．７６４ｍＬ、４．３８ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１６８ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物５０１４（２８４ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、２工程にわたって６９％）が得られた。Ｃ２３Ｈ３３Ｎ２Ｏ１２Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５６１．１７５４、実測値５６１．１。
臭化アルキンによる化合物５００９のＳ−アルキル化により、化合物５０１０が得られる。
Figure 2020114886
化合物５０１６は、化合物５０１５から調製される（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７，２９９５−２９９９，２００２を参照）。酸５０１７は、報告される手順にしたがって調製される。
化合物５０１８の合成：化合物５０１７（２．４０ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を、１４時間にわたって、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中のＥＤＣＩ（１．１９ｇ、６．２２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２．７０ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７１６ｍｇ、６．２２ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物５０１８（１．８３ｇ、３．２６ｍｍｏｌ、６３％）が得られた。Ｃ２３Ｈ３３Ｎ２Ｏ１２Ｓについての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５６１．１７５４、実測値５６１．２。
Figure 2020114886
化合物５０２４を、報告される手順を用いて調製した（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，７１，３６１９−３６２，２００６およびＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０９，３１９−３３０，１９９８を参照）。
化合物５０２５の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の化合物５０２４（１．９４ｇ、５．２２ｍｍｏｌ）、４−ペンテン酸ベンジル（２．９９ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）および第二世代グラブス触媒（４３３ｍｇ、０．５２２ｍｍｏｌ）を４０℃で４０時間加熱した。溶媒を除去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物５０２５（１．８７ｇ、３．５０ｍｍｏｌ、６７％）が得られた。Ｃ２７Ｈ３６ＮＯ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５３４．２３３９、実測値５３４．２。
化合物５０２８の合成：ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中の化合物５０２５（１．８５ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）の溶液に、パラジウム炭素（Ａｌｄｒｉｃｈ：３３０１０８−５０Ｇ、１０重量％、ＤｅｇｕｓｓａタイプＥ１０１ ＮＥ／Ｗ：１８５ｍｇ）を加えた。反応混合物を、１４時間にわたって水素の雰囲気下で撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅに通したろ過の後、ろ液を減圧下で除去した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物５０２８（９０３ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ、５９％）が得られた。Ｃ２０Ｈ３２ＮＯ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値４４６．２０２６、実測値４４６．１。
化合物５０３１の合成：化合物５０２８（３２６ｍｇ、０．７３２ｍｍｏｌ）を、１４時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のＥＤＣＩ（２１１ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．３８３ｍＬ、２．２０ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２７ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物５０３１（３００ｍｇ、０．５５３ｍｍｏｌ、７６％）が得られた。Ｃ２４Ｈ３５Ｎ２Ｏ１２についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５４３．２１９０、実測値５４３．２。
化合物５０２４の酸化的切断により、アルデヒド５０２６が得られる。それをアルコールに還元し、次に、ベンジル−保護されたトリフレートによるＯ−アルキル化、続いて、脱保護およびエステル化により、化合物５０３２が得られる。化合物５０２６の還元的アミノ化により、酸化合物５０３０が得られ、それをエステル化したところ、化合物５０３３が得られる。
Figure 2020114886
化合物５０３８を、文献に報告されるのと同様の方法で調製した（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６１，６４４２−６４４５，１９９６を参照）。化合物５０４６、５０４７、および５０４８は、スキーム９１に示されるのと類似の方法で調製される。
実施例３９
Figure 2020114886
化合物５０５０の合成：Ｎ−アセチルグルコサミン（１０ｇ）を、ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏの存在下で、ヘキサノール（過剰）を用いて還流させたところ、化合物５０５０が得られた。
化合物５０５２の合成：化合物５０５０を、文献に報告されるように塩化ピバロイルで処理した。このピバロイルエステルを、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、続いて、還流状態で、水で処理したところ、化合物５０５２が得られた。
化合物５０５５の合成：化合物５０５２を、まず、水酸化ナトリウムで処理して、ピバロイルエステルを除去し、次に、得られたトリヒドロキシル誘導体を、無水安息香酸で処理したところ、化合物５０５４が得られた。二重結合を後に酸化させたところ、カルボン酸５０５５が得られた。
化合物５０５６の合成：化合物５０５５（５０２ｍｇ、０．７３２ｍｍｏｌ）を、１４時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のＥＤＣＩ（２１１ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．３８３ｍＬ、２．２０ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２７ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物５０５６（４００ｍｇ、０．５５３ｍｍｏｌ、７６％）が得られた。Ｃ３８Ｈ３８Ｎ２Ｏ１３についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値７３０．２４、実測値７３０．２５。
実施例４０：合成後方法を用いた新規なＧａｌＮＡｃコンジュゲートの合成
Figure 2020114886
Figure 2020114886
以下の表中のＧａｌＮＡｃ基を、上記のスキーム９４、９５または９６に記載される手順によってｓｉＲＮＡにコンジュゲートした。
Figure 2020114886
実施例４１：ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート
ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは同じであり、ＴＴＲを標的にしていた。以下のリガンドを、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の３’末端への結合部位を示す。
Figure 2020114886
ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート４３５２７、６０１４８、６０１４６、６０１４２、６０１３３、６０１３９、６０１３４、６０１３２および／または６０１２５は、実施例３３に記載されるように、マウス中で試験される。結果が、図１に示される。
実施例４２：ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート
ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは、ＴＴＲを標的にしていた。以下のリガンドを、示される位置でｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合した。
Figure 2020114886
図４〜７は、ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート５６７１８〜５６７２７、５６７２９および５５７２７の結合親和性を示す。
実施例４３：ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート
以下の表中のｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは同じであり、ＡＴ３を標的にしていた。以下のリガンドを、示されるように各ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合した。
Figure 2020114886
実施例４４：
表中のｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは同じであり、ＡＴ３を標的にしていた。リガンドを、表に示される位置でセンス鎖に結合した。
図８および９は、ＳｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート５６８７６、６６８７５、５６８７４、６６８７８、５６８８０、５６８７９、５４９４４、５６８７７、５６８８１および／または５６８８２の結合親和性を示す。これらのコンジュゲートのＫｉ値が、以下に報告される。
Figure 2020114886
実施例４５：異なるＧａｌＮＡｃリガンドを有するｓｉＲＮＡ（三本鎖誘導体）
ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは同じであり、ＴＴＲを標的にしていた。以下のリガンドを、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の３’末端への結合部位を示す。
Figure 2020114886
図１０は、７２および１４４時間後の、三本鎖ＧａｌＮＡｃリガンド４３５２７、６０１２６、６０１３８、６０１２８、６０１２７、６０３１６、および６０１２３（１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量での）のインビボでの有効性を示す。
実施例４６：異なるＧａｌＮＡｃリガンドを有するｓｉＲＮＡ（三本鎖誘導体（１＋１＋１））
ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは同じであり、ＴＴＲを標的にしていた。以下のリガンドを、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の３’末端への結合部位を示す。
Figure 2020114886
ＡＴ３に向けられたｓｉＲＮＡコンジュゲート（そのうちの２つが実施例３０および３４に記載される）を調製し、試験した。５８１３７の構造が以下に示される。各コンジュゲートは、同じＡＴ３ ｓｉＲＮＡ配列を有していた。図１１は、三本鎖ＧａｌＮＡｃリガンド５４９４４、５６８８１および５８１３７［（１＋１＋１）設計］のインビボでの有効性を示す。
Figure 2020114886
ＴＴＲに向けられたｓｉＲＮＡコンジュゲートを調製し、試験した。各コンジュゲートは、同じＴＴＲ ｓｉＲＮＡ配列を有していた。以下のリガンドを、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の３’末端への結合部位を示す。図１２は、三本鎖ＧａｌＮＡｃリガンド５５７２７、５８１３８および５８１３９［（１＋１＋１）設計］のインビボでの有効性を示す。二本鎖５５７２７、５８１３８および５８１３９のためのリガンド設計が、以下に示される。
Figure 2020114886
実施例４７
Figure 2020114886
化合物１０２の合成：ＧａｌＮＡｃ酸１００（８．３９ｇ、１８．７１ｍｍｏｌ）およびヒドロキシプロリンアミン（１０．００ｇ、１８．７７ｍｍｏｌ）を一緒にジクロロメタンに入れた。ＨＢＴＵ（１０．６８ｇ、２８．１２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．８０ｍＬ、３当量）を加え、混合物を周囲温度で２時間撹拌した。生成物を、薄層クロマトグラフィーによって調べ、反応混合物を分液漏斗に移し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶媒としてジクロロメタンおよびＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物１０２が淡黄色のふんわりした固体（１１．７７ｇ、６３％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９−７．０９（ｍ，９Ｈ）、６．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０、５．４、２．１Ｈｚ、４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．０３−４．８３（ｍ，２Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１−４．０７（ｍ，２Ｈ）、４．０４−３．９５（ｍ，３Ｈ）、３．８６（ｄｔ，Ｊ＝１１．２、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９−３．６８（ｍ，６Ｈ）、３．６８−３．３６（ｍ，３Ｈ）、３．２１−２．８８（ｍ，５Ｈ）、２．２６−２．１４（ｍ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．８７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５３−１．２９（ｍ，７Ｈ）。
化合物１０４の合成：ヒドロキシプロリン誘導体１０２（６．００ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。ＤＩＥＡ（２．２０ｍＬ、３当量）および２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、薄層クロマトグラフィーによって調べた。混合物を分液漏斗に移し、水および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶離剤としてジクロロメタンおよびＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物が白色のふんわりした固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６８（ｓ，１Ｈ）、７．４２−７．０６（ｍ，８Ｈ）、７．０１−６．７３（ｍ，４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｓ，１Ｈ）、４．０１（ｓ，３Ｈ）、３．８６（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ、９Ｈ）、３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝３７．０、２３．３、１６．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．９９（ｄｄ，Ｊ＝１２．３、６．４Ｈｚ、３Ｈ）、２．７４（ｄｄ，Ｊ＝９．２、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．２１（ｓ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０５−１．９５（ｍ，５Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５２−１．１６（ｍ，１１Ｈ）、１．１６−１．０２（ｍ，１１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ：δ１５１．７８、１５１．６１、１５１．５０、１５１．３０。
化合物１０５の合成：化合物１０２（２．１０ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解させた。この混合物に、無水コハク酸（０．４４１ｇ、４．３６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．５３２ｇ、当量）、続いてＴＥＡ（１ＭＬ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応物を、薄層クロマトグラフィーによって調べ、次に、反応混合物を水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルの小さいパッドに通してろ過した。溶媒を除去し、この材料を次の反応に使用した。上記の反応からのスクシネートを、無水アセトニトリルに溶解させた。ＨＢＴＵ（１．５９ｇ、４．２０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．１０ｍｌ）を加え、混合物を５分間回転させた。ポリスチレン固体担体を反応混合物に加え、混合物を周囲温度で一晩振とうした。固体担体をろ過し、洗浄し、無水酢酸／ピリジン混合物を用いてキャッピングした。固体担体を、ジクロロメタン、ＭｅＯＨ／ＤＣＭおよびエーテル（２７．１０ｇ、５５μｍｏｌ／ｇ）で再度洗浄した。
実施例４８：合成後コンジュゲーションのためのアミノリンカーの合成
Figure 2020114886
化合物１０１：Ｚ−アミノカプロン酸（２２．２ｇ、８２．５０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５０ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（４４．４ｍＬ、２７５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４０．４ｇ、１０６．７ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢＴ（３０．０ｇ、２２０ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌した後、４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩（２０．０ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、酢酸エチル（２５０ｍＬ）を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物１０１（Ｒｆ＝１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ中０．５、２４．３０ｇ）が得られた。不純物を除去するために、まず２％のメタノール／ジクロロメタン、続いて５％のメタノール／ジクロロメタンで溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物１０１を精製したところ、２１．３６ｇ（６５％）の生成物が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．３５（ｍ，５Ｈ）、５．１５（ｄ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．９９（ｓ，２Ｈ）、４．２７（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｍ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，１Ｈ）３．２０−３．４７（ｍ，５Ｈ）、２．９４−３．０２（ｍ，２Ｈ）、２．１０−２．３２（ｍ，２Ｈ）、１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３５−１．４（ｍ，４Ｈ）、１．２２−１．２８（ｍ，４Ｈ）。
化合物１０２：化合物１０１（２１．３６ｇ、５４．４３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、水素化ホウ素リチウム（１．１９ｇ、５４．４３ｍｍｏｌ）を、０℃で２０分間にわたって溶液に加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を０℃に冷却した。過剰な水素化ホウ素リチウムを、５ＭのＮａＯＨ（３０ｍＬ）でクエンチした。３０分間撹拌した後、反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加えた。有機層を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物１０２（Ｒｆ＝１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ中０．４、３５．８８ｇ）が得られた。不純物を除去するために、３％のメタノール／ジクロロメタン、続いて５％のメタノール／ジクロロメタンで溶離することによってカラムクロマトグラフィーによって化合物１０２を精製したところ、９．２１ｇ（４９％）の生成物が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．３５（ｍ，５Ｈ）、４．９９（ｓ，２Ｈ）、４．９１（ｄ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．７７（ｔ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．２７（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｍ，１Ｈ）、３．２０−３．４７（ｍ，５Ｈ）、２．９４−３．０２（ｍ，２Ｈ）、２．１０−２．３２（ｍ，２Ｈ）、１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３５−１．４（ｍ，４Ｈ）、１．２２−１．２８（ｍ，４Ｈ）。
化合物１０３：化合物１０２（９．２１ｇ、２５．２７ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（８０ｍＬ）と２回同時蒸発させた。次に、化合物を、一晩、高真空下に置いて乾燥させた。化合物１０２を、高真空から取り出し、無水ピリジン（２００ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、触媒量のジメチルアミノピリジン（０．３５ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、０℃で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、ＤＭＴ−Ｃｌ（９．０ｇ、２６．５３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。過剰なＤＭＴ−Ｃｌを、メタノール（１５ｍＬ）の添加によってクエンチした。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣に、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物１０３（Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中０．６、１４．０２ｇ）が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中５０％の酢酸エチル（１％のＴＥＡ）、続いて１００％の酢酸エチル（１％のＴＥＡ）で溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物１０３を精製したところ、１２．３６ｇ（７３．４％）の生成物が白色の発泡体状の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．１７−７．３３（ｍ，１４Ｈ）、４．９９（ｓ，２Ｈ）、４．９１（ｄ，ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．３７（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）３．５６（ｍ，１Ｈ）３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．１４（ｍ，１Ｈ）、２．９３−３．０２（ｍ，４Ｈ）、２．１８（ｍ，２Ｈ）１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３７−１．４１（ｍ，６Ｈ）。
化合物１０４：化合物１０３（１２．３６ｇ、１８．５４ｍｍｏｌ）を、１０％のメタノール／酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Ｄｅｇｕｓｓａタイプ（１．３ｇ）に担持された１０重量％のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で２回パージし、次に、水素を、１０秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、セライトが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで２回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物１０４（溶離剤ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、９．１６ｇ、９３％）が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．１５−７．３１（ｍ，９Ｈ）、６．８６（ｍ，４Ｈ）４．９９（ｓ，１Ｈ）、４．３７（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）３．５６（ｍ，１Ｈ）３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．１４（ｍ，１Ｈ）、２．９３−３．０２（ｍ，２Ｈ）、２．４５（ｍ，２Ｈ）、２．１８（ｍ，２Ｈ）１．７４−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．３７−１．４１（ｍ，３Ｈ）１．１３−１．３８（ｍ，４Ｈ）。ＭＳ：５３３．４（＋Ｈ）、５５５．３（＋Ｎａ）。
化合物１０５：化合物１０４（９．１６ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン（４．８０ｍＬ、３４．４ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル（３．０５ｍＬ、２５．８ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を、１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物１０５（Ｒｆ＝０．６ ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、１０．８９ｇ）が得られた。５％のメタノール／ジクロロメタン（１％のＴＥＡ）で溶離することによってカラム精製すると、化合物１０５（８．７６ｇ、８１％）が黄色の発泡体状の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．５６−７．０９（ｍ，９Ｈ）、７．０１−６．５２（ｍ，４Ｈ）、５．３４−５．０４（ｍ，１Ｈ）、４．９９−４．７８（ｍ，１Ｈ）、４．４８−４．２５（ｍ，２Ｈ）、３．８３−３．６７（ｍ，６Ｈ）、３．６０−３．５０（ｍ，１Ｈ）、３．４９−３．１８（ｍ，２Ｈ）、３．１６−２．９１（ｍ，２Ｈ）、２．８９−２．５６（ｍ，２Ｈ）、２．５４−２．３２（ｍ，２Ｈ）、２．３２−１．６９（ｍ，３Ｈ）、１．５９−１．０３（ｍ，４Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：−７７．１４（ｓ，３Ｆ）．ＭＳ：６２７．３（−Ｈ）、６６３．３（＋Ｃｌ）。
化合物１０６：化合物１０５（８．７６ｇ、１３．９３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５．１０ｇ、４１．７９ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３．９０ｍＬ、２７．８６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸（２．８０ｇ、２７．８６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を飽和塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物１０６（Ｒｆ＝０．９ ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、１０．８７ｇ、９４％）が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。ＭＳ：７２７．２（−Ｈ）、７６３．２（＋Ｃｌ）。このように得られたスクシネート（２．００ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．６８ｍＬ、９．６４ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１．８３ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間にわたって振とうした。長鎖アミノアルキル制御多孔質ガラス担体（ＣＰＧ）（２７ｇ）をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。ＣＰＧ化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、１％のトリエチルアミン／ジクロロメタンで洗浄し、続いて、ジクロロメタン中１０％のメタノールで２回洗浄し、ジクロロメタン中１％のトリエチルアミン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。ＣＰＧ化合物を１時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、２時間にわたって高真空下に置いた。ＣＰＧを、ピリジン（１００ｍＬ）中２５％の無水酢酸でキャッピングし、混合物を４時間振とうした。洗浄手順を上記のように繰り返し、化合物を減圧下で乾燥させたところ、ＣＰＧ １０６（２８ｇ、６７μｍｏｌ／ｇ）が得られた。
化合物１０７：化合物１０５（８．８９ｇ、１４．１４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４．９３ｍＬ、２８．２８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（６０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（５．６３ｍＬ、１６．２６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。反応混合物を、室温で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈した。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物１０７（Ｒｆ＝０．４４ ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、１１．０２ｇ）が得られた。ＤＣＭ中３％のメタノール（１％のＴＥＡ）で溶離することによってカラム精製すると、化合物１０７（６．３１ｇ、５４％）が黄色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．３７（ｓ，１Ｈ）、７．６３（ｄ １Ｈ）、７．４２−６．９８（ｍ，８Ｈ）、６．９２−６．７７（ｍ，４Ｈ）、４．２５−３．９０（ｍ，２Ｈ）、３．７８−３．６４（ｍ，７Ｈ）、３．４８（ｄ，３Ｈ）、３．２９（ｄ，１Ｈ）、３．２３−２．９２（ｍ，４Ｈ）、２．８６（ｄ，１Ｈ）、２．７３（ｔ，１Ｈ）、２．５８（ｔ，１Ｈ）、２．５３−２．４７（ｍ，４Ｈ）、２．３３−１．８７（ｍ，４Ｈ）、１．５５−０．９７（ｍ，１２Ｈ）．３１Ｐ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１５１．６８（ｄ，１Ｐ）。
Figure 2020114886
化合物１１８：セリノール１１６（２．０５ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）および化合物１１７（８．０３ｇ、２４．７５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でＤＭＦ（１２０ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン（５．０ｍＬ、６７．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、それを室温で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣を酢酸エチル（１２０ｍＬ）に溶解させた。次に、それを、水（３０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物（５．３３ｇ、Ｒｆ＝０．２１ ＤＣＭ中１５％のＭｅＯＨ）を、溶離剤としてジクロロメタン中１０％のメタノールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物１１８（４．９８ｇ、７８％）が白色の発泡体として得られた。ｍ／ｚ：３２４．１３（＋Ｎａ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．３９（ｓ，２ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、３．３４−３．０６（ｍ，７Ｈ）、３．０６−２．９１（ｍ，２ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、２．３０−２．００（ｍ，２Ｈ）、１．９７−０．８６（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ１７２．１８（ｓ）、１５６．４１（ｓ）、１１７．５０（ｓ）、６０．３０（ｓ）、５２．８５（ｓ）、３８．８８（ｓ）、３５．３５（ｓ）、２８．１１（ｓ）、２５．９０（ｓ）、２５．２９（ｓ）。
化合物１１９：化合物１１８（３．７０ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（３０ｍＬ）と２回同時蒸発させ、次に、高真空下で一晩乾燥させた。次に、それを無水ピリジン（９０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、触媒量のＤＭＡＰ（０．１５ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、０℃で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。ＤＭＴｒ−Ｃｌ（４．３８ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を、０℃で溶液に加え、室温で２時間撹拌し続けた。次に、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解させ、水（２×１００ｍＬ）、続いて飽和塩化ナトリウム（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物（６．８３ｇ、Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．４４）を、まずジクロロメタン（１％のＴＥＡを含む）、続いてジクロロメタン中３％のメタノール（１％のＴＥＡを含む）で溶離することによって、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物１１９（２．３２ｇ、２３％）が白色の発泡体として得られた。ｍ／ｚ：６０１．２（−１）、６３７．２（＋Ｃｌ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．３８（ｓ，２ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．３１−７．１３（ｍ，７Ｈ）、６．８６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ、６Ｈ）、４．６０（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５４−３．２３（ｍ，６Ｈ）、２．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝３６．９、８．８、５．８Ｈｚ、１ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、２．０８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．４７（ｔｔ、Ｊ＝１４．６、７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．３４−１．１２（ｍ，４Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ１７２．８３（ｓ）、１５８．９７（ｓ）、１５７．２８（ｓ）、１５６．９３（ｓ）、１４６．１３（ｓ）、１３６．８２（ｓ）、１３６．５２（ｓ）、１３０．７０（ｓ）、１２８．６８（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）、１２７．４９（ｓ）、１１８．４１（ｓ）、１１５．５４（ｓ）、１１４．０２（ｓ）、８６．０８（ｓ）、６３．６６（ｓ）、６１．８４（ｓ）、５５．９３（ｓ）、５１．７７（ｓ）、４６．６８（ｓ）、４０．９９（ｄ，Ｊ＝２１．０Ｈｚ）、４０．７２（ｓ）、４０．６８（ｓ）、４０．４７（ｓ）、４０．２６（ｓ）、４０．０５（ｓ）、３９．８４（ｓ）、３６．３１（ｓ）、２９．０４（ｓ）、２６．８５（ｓ）、２５．９５（ｓ）。
化合物１２０：化合物１１９（１．０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６２０ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（０．５ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸（３４０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和塩化ナトリウム（２×２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物（Ｒｆ＝０．３ Ｈｅｘ中５０％のＥｔＯＡｃ）１．０１ｇ（９８％）が白色の固体として得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。ＭＳ：７０２．３（−Ｈ）、７３７．５（＋Ｃｌ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．４２（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、２ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．８７（ｓ，１ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．４７−７．１５（ｍ，７Ｈ）、６．９９−６．７４（ｍ，６Ｈ）、４．３２−３．９４（ｍ，３Ｈ）、３．９０−３．４２（ｍ，８Ｈ）、３．３１−２．７２（ｍ，６Ｈ）、２．５７−２．２９（ｍ，２Ｈ）、１．３０−０．８７（ｍ，６Ｈ）。
化合物１２１：スクシネート１２０（１．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．１５ｍＬ、５．６ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１．２６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。ＣＰＧ（１４ｇ）をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。ＣＰＧをろ過し、ジクロロメタン、ジクロロメタン中１０％のメタノール、ジクロロメタンおよび無水ジエチルエーテルで連続して洗浄した。ＣＰＧを１時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、２時間にわたって高真空下に置いた。充填されたＣＰＧを、３時間にわたって２５％の無水酢酸／ピリジン（１００ｍＬ）でキャッピングした。ＣＰＧをろ過し、前述されるのと同じ洗浄手順を繰り返した。ＣＰＧを１時間にわたって真空乾燥させ、高真空下で一晩乾燥させたところ、化合物１２０（１４ｇ、７７μｍｏｌ／ｇ）が得られた。
Figure 2020114886
化合物１２２：Ｌ−トレオニノール（３．５４ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）および化合物１１７（１２．０ｇ、３７．１ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でＤＭＦ（９０ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン（１４．０ｍＬ、１０１．１ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、それを室温で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣を酢酸エチル（１２０ｍＬ）に溶解させた。次に、それを、水（５０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物（３．６０ｇ、Ｒｆ＝０．４３ ヘキサン中５０％のＥｔＯＡｃ）を、溶離剤として、ヘキサン中５０％の酢酸エチル、続いて、１００％の酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物１２２（３．２０ｇ、８７％）が黄色の発泡体として得られた。ｍ／ｚ：３１５．１（＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．７６（ｔ，２ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）３．９３−３．２１（ｍ，１Ｈ）、３．２１−３．０１（ｍ，２ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、３．０５−２．８３（ｍ，３Ｈ）、２．７５−２．５１（ｍ，１Ｈ）、２．５５−２．３７（ｍ，１Ｈ）、２．２０−１．９８（ｍ，２Ｈ）、１．７０−１．３９（ｍ，７Ｈ）、１．２８−１．０６（ｍ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７６．１（ｓ）、１５６．３（ｓ）、１５８．３３（ｓ）、６５．３６（ｓ）、６４．２０（ｓ）、６０．５１、３８．８８（ｓ）、３６．３４（ｓ）、２７．９８（ｓ）、２５．７９（ｓ）、２５．７０−２４．３３（ｍ）、２０．０５（ｓ）。
化合物１２３：化合物１２２（３．００ｇ、９．６０ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（１５ｍＬ）と２回同時蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させた。次に、それを無水ピリジン（９０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、触媒量のＤＭＡＰ（０．１２ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、０℃で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。ＤＭＴｒ−Ｃｌ（３．３９ｇ、１０．０８ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加え、室温で２時間にわたって撹拌を続けた。次に、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解させ、水（２×１００ｍＬ）、続いて飽和塩化ナトリウム（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物（７．０２ｇ、Ｒｆ＝ヘキサン中２５％のＥｔＯＡｃ中の０．６）を、まずヘキサン中５％の酢酸エチル（１％のＴＥＡを含む）、続いてヘキサン中１５％の酢酸エチル（１％のＴＥＡを含む）で溶離することによって、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物１２３（７００ｍｇ、１１％）が白色の発泡体として得られた。ｍ／ｚ：６１５．２（−１）、６５１．２（＋Ｃｌ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．７６（ｔ，２ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）７．８７−６．９３（ｍ，７Ｈ）、６．９３−６．６３（ｍ，６Ｈ）、４．１９−３．６３（ｍ，１０Ｈ）、３．６１（ｍ，１ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、２．７４−１．９８（ｍ，４Ｈ）、１．７１−１．１０（ｍ，６Ｈ）、１．０８−０．７６（ｍ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７２．１２（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）、１５７．８８（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ）、１４５．１３（ｓ）、１４０．２２（ｓ）、１３５．８６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、１３１．０７−１３０．０３（ｍ）、１３０．０３−１２９．２８（ｍ）、１２８．９０（ｓ）、１２７．６６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、１２７．３８（ｓ）、１２６．４５（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ）、１１２．８９（ｄ，Ｊ＝３０．１Ｈｚ）、８５．０８（ｓ）、６５．００（ｓ）、６３．２２（ｄ，Ｊ＝４８．５Ｈｚ）、５４．９７（ｓ）、５３．７２（ｓ）、４５．５６（ｓ）、４０．０２（ｄ，Ｊ＝２１．０Ｈｚ）、３９．８５−３９．８０（ｍ）、３９．７１（ｓ）、３９．５０（ｓ）、３９．２９（ｓ）、３９．０８（ｓ）、３８．８８（ｓ）、３５．２４（ｓ）、２８．０２（ｓ）、２５．８６（ｓ）、２５．１３（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ）、２１．１５（ｓ）、２０．２０（ｓ）、１０．３５（ｓ）。
化合物１２４：化合物１２３（６００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４２０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸（２３０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、飽和塩化ナトリウム（２×２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物１２４（Ｒｆ＝０．６ ヘキサン中２５％のＥｔＯＡｃ）７６０ｍｇ（９９％）が灰色の発泡体として得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。ＭＳ：７１５．３（−Ｈ）。
化合物１２５：化合物１２４（７６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．７４ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（８００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。ＣＰＧ（１０ｇ）をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。ＣＰＧをろ過し、ジクロロメタン、ジクロロメタン中１０％のメタノール、ジクロロメタンおよび無水ジエチルエーテルで連続して洗浄した。ＣＰＧを１時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、２時間にわたって高真空下に置いた。充填されたＣＰＧを、３時間にわたってピリジン（１００ｍＬ）中２５％の無水酢酸でキャッピングした。ＣＰＧをろ過し、前述されるのと同じ洗浄手順を繰り返した。ＣＰＧを１時間にわたって真空乾燥させ、高真空下で一晩乾燥させたところ、化合物１２５（１０．２ｇ、．７１μｍｏｌ／ｇ）が得られた。
Figure 2020114886
 化合物１２７：５−ヘキセノール（６．０ｍＬ、５０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１２０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（１４ｍＬ、１５１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、０℃で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（１８ｇ、５３．０ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で４時間にわたってアルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を、水で２回、続いて飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、化合物１２７（Ｒｆ＝ヘキサン中２５％のＥｔＯＡｃ中の０．８５）（１８．９ｇ、９５％）が黄色の油として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．４２−７．０３（ｍ，７Ｈ）、７．０１−６．７４（ｍ，６Ｈ）、５．８５−５．６３（ｍ，１Ｈ）、５．０５−４．７７（ｍ，２Ｈ）、３．９３−３．４７（ｍ，６Ｈ）、２．９３（ｄｄ，Ｊ＝２１．１、１４．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．４９（ｄｄ，Ｊ＝３．５、１．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．６６−１．４７（ｍ，４Ｈ）。
化合物１２８：化合物１２７（５．０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（４．２ｇ、２５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中で混合した。反応混合物を室温で５分間撹拌した。次に、メタクロロ過安息香酸（１６ｇ、３１．２５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を、重亜硫酸ナトリウム（５００ｍｇ）の添加によってクエンチし、室温で３０分間撹拌させた。反応混合物を、水、飽和重炭酸塩溶液、水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、化合物１２８（Ｒｆ＝０．２５ ヘキサン中５％のＥｔＯＡｃ）（５．０６ｇ、９７．３％）が黄色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．４８−７．０８（ｍ，７Ｈ）、６．８８（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、６Ｈ）、３．７４（ｄ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ、３Ｈ）、３．３２（ｓ，６Ｈ）、３．０４−２．７７（ｍ，１Ｈ）、２．６５−２．３５（ｍ，２Ｈ）、１．６９−１．０９（ｍ，６Ｈ）。
化合物１２９：化合物１２８（５．０ｇ、９．５６ｍｍｏｌ）をエタノール（１５ｍＬ）に溶解させた。水（３ｍＬ）中３０％の水酸化アンモニウムを反応混合物に加え、それを、一晩、圧力容器中の油浴中で、８５℃で撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、次に、トルエン（１０ｍＬ）と２回同時蒸発させた。次に、化合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）と同時蒸発させたところ、粗化合物１２９（Ｒｆ＝０．１ ヘキサン中２５％のＥｔＯＡｃ、５．４８ｇ）が褐色の油として得られ、それを精製せずに使用した。
化合物１３０：化合物１２９（５．４８ｇ、粗材料）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン（４．０ｍＬ、１９．１ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル（５．０ｍＬ、２８．７ｍｍｏｌ）を１０℃で滴下して加えた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。次に、反応混合物を、水で２回、続いて飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物１３０（Ｒｆ＝０．４３ ５０％のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、６．１２ｇ）が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中５％の酢酸エチル（１％のＴＥＡ）、続いて、さらなる不純物から生成物を溶離するために、ヘキサン中１０％の酢酸エチル（１％のＴＥＡ）で溶離することによる、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる化合物１３０の精製により、１．５１ｇ（化合物１２９から３０％）が白色の発泡体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．６９−７．１２（ｍ，７Ｈ、１ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．１０−６．７０（ｍ，６Ｈ）、４．１２−３．４８（ｍ，９Ｈ、１ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、３．２９（ｄｄ，Ｊ＝１９．７、１２．９Ｈｚ、２Ｈ）、２ １．５７−１．１７（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１５７．９７（ｓ）、１５６．５６（ｓ）、１５６．２０（ｓ）、１４５．２７（ｓ）、１３６．０８（ｓ）、１２９．５８（ｓ）、１２７．６９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、１２６．５１（ｓ）、１１７．４５（ｓ）、１１４．５８（ｓ）、１１３．０９（ｓ）、８５．１５（ｓ）、６７．９３（ｓ）、６２．７８（ｓ）、５４．９６（ｓ）、４５．６７（ｓ）、４０．１３（ｓ）、３９．９２（ｓ）、３９．７１（ｓ）、３９．５０（ｓ）、３９．３０（ｓ）、３９．０９（ｓ）、３８．８８（ｓ）、３４．２８（ｓ）、２９．５１（ｓ）、２１．９２（ｓ）。
化合物１３１：化合物１３０（１．４９ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．０２ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（０．８ｍＬ、５．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸（６００ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、次に、２回分の５０ｍＬの分量のわずかに飽和した塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物１３１（Ｒｆ＝０．２４ ヘキサン中２５％のＥｔＯＡｃ）（１．７７ｇ、９９％）が白色の発泡体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物１３２：化合物１３１（１．７７ｇ、２．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２０ｍＬ）に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．９５ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（２．１３、５．６ｍｍｏｌ）を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。ＣＰＧ（２６ｇ）をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。反応混合物を、焼結漏斗上にデカントし、１％のトリエチルアミン／ジクロロメタンで洗浄し、続いて、ジクロロメタン中１０％のメタノールで２回洗浄し、ジクロロメタン中１％のトリエチルアミン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。ＣＰＧを１時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、２時間にわたって高真空下に置き、次に、それを、ピリジン（２００ｍＬ）中２５％の無水酢酸でキャッピングし、混合物を３時間にわたって振とうした。次に、反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。ＣＰＧを１時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、一晩、高真空下に置いた。（２７ｇ、８３μｍｏｌ／ｇ）。
Figure 2020114886
化合物１３４：５−ヘキセノール（６．０ｍＬ、５０．５ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（１７ｇ、２５２．５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１２０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン（１４ｍＬ、１５１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、メタンスルホニルクロリド（４．２５ｍＬ、５０．５ｍｍｏｌ）を、２０分間にわたって溶液に滴下して加えた。室温で２日間にわたってアルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を氷水中にデカントし、次に、それを、５×５０ｍＬの分量のジエチルエーテルで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物１３４（Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ中の０．６７、６．０ｇ）が得られた。不純物を除去するために、まずジクロロメタン、続いて２％のメタノール／ジクロロメタンで溶離することによる、カラムクロマトグラフィーによる化合物１３４の精製により、４．６ｇ（７２％）の透明の液体が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ５．７８（ｄｄｔ，Ｊ＝１６．９、１０．２、６．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．１６−４．７４（ｍ，２Ｈ）、２．６８−２．１４（ｍ，２Ｈ）、１．６４−１．２７（ｍ，４Ｈ）、１．２４−０．９２（ｍ，２Ｈ）。
化合物１３５：化合物１３４（４．５ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を、耐圧瓶（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅ）中でＤＭＦ（１００ｍＬ）に取り込んだ。この混合物に、ＮａＮ３（１０ｇ）を加え、混合物を８０℃で一晩加熱した。次に、固体をろ過によって除去した。揮発性物質を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去したところ、化合物１３４１３４が淡黄色の液体（３．６ｇ、８２％）として得られた。ｍ／ｚ：１３２．１（−Ｎ２）。
化合物１３６：化合物１３５（２．０ｇ、１６ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（２．２５ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を、アセトン（６０ｍＬ）中１０％の水に溶解させた。反応物を室温で５分間撹拌した。次に、アセトン（１．３ｍＬ、０．１６ｍｍｏｌ）中１０％の水中の四酸化オスミウムを加え、混合物を室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物をＣｅｌｉｔｅ上にデカントし、２回分の５０ｍＬの分量のアセトンで洗浄した。反応混合物を蒸発乾固させ、次に、１００ｍＬの酢酸エチルに溶解させた。有機層を、５０ｍＬの分量の１ＮのＨＣｌで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、化合物１３６ １．７０ｇ（６７％）が褐色の液体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物１３７：化合物１３６（１．５ｇ、９．４０ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（１０ｍＬ）と２回同時蒸発させた。次に、化合物を、一晩、高真空下に置いて乾燥させた。次に、化合物を高真空から取り出し、無水ピリジン（６０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、触媒量のＤＭＡＰ（０．１１ｇ、．９４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、０℃で３０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、ＤＭＴ−Ｃｌ（３．３５ｇ、１０．０６ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、１．５時間にわたって室温で、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣に、ジクロロメタン（１００ｍＬ）を加えた。有機層を、水で２回、続いて飽和塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物１３７（Ｒｆ＝０．８ １：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、５．３．３ｇ）がオレンジ色の油として得られ、それを精製せずに使用した。
化合物１３８：化合物１３７（３．３ｇ、粗材料）およびトリフェニルホスフィン（１．７ｇ、６．４８ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフランに溶解させた。反応混合物を室温で５分間撹拌した。次に、水（１ｍＬ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌し続けた。反応の完了がＴＬＣによって観察されたら、反応混合物を蒸発乾固させ、次に、トルエンと同時蒸発させた。反応混合物をジクロロメタン（６０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン（１．５ｍＬ、１０．７５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で２０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル（６．５ｍＬ、５４．０ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を１０℃で１０分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和重炭酸塩溶液、水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物１３８（Ｒｆ＝０．５ ５０％のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、３．４０ｇ）が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中５％の酢酸エチル、続いてヘキサン中１５％の酢酸エチルで溶離することによる、カラムクロマトグラフィーによる化合物の精製により、２．１ｇ（化合物１３６から４２％）が黄色の油として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．３６（ｓ，１ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．４７−７．１４（ｍ，７Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、６Ｈ）、３．８６−３．４８（ｍ，７Ｈ）、３．３３（ｓ，１ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）、３．１３（ｄｄ，Ｊ＝１２．１、６．４Ｈｚ、４Ｈ）、１．５４−１．０６（ｍ，６Ｈ）．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ−８２．５４（ｓ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１６１．４２（ｓ）、１５９．７３（ｓ）、１５９．３７（ｓ）、１４８．６５（ｓ）、１３９．４１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、１３６．６５（ｓ）、１３５．７４−１３５．３０（ｍ）、１３４．９２（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）、１３３．１６（ｓ）、１３２．１８（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ）、１３１．１８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、１２９．９６（ｓ）、１１６．５１（ｓ）、８８．５０（ｓ）、７２．３９（ｓ）、７１．１０（ｓ）、６３．２０（ｓ）、５８．４３（ｓ）、４３．５８（ｓ）、４３．３７（ｓ）、４３．１６（ｓ）、４２．９５（ｓ）、４２．８０−４２．５３（ｍ）、４２．３３（ｓ）、３６．８８（ｓ）、３１．７９（ｓ）、２５．６７（ｓ）、１７．５１（ｓ）。
化合物１３９：化合物１３８（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７００ｍｇ、５．７ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（０．５５ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、５分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸（３８０ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、次に、２回分の２５ｍＬの分量のわずかに飽和した塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物１３９（溶離剤１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）１．１８ｇ（９９％）がピンク色の油として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物１４０：化合物１３９（１．１８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６０ｍＬ）に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．３ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１．４３ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。ＣＰＧ（１２ｇ）をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。ＣＰＧ化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、ジクロロメタン中１％のトリエチルアミンで洗浄し、続いて、１０％のメタノール／ジクロロメタンで２回洗浄し、ジクロロメタン中１％のトリエチルアミン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。ＣＰＧを１時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、２時間にわたって高真空下に置いた。ＣＰＧを、２５％の無水酢酸／ピリジン（１００ｍＬ）でキャッピングし、混合物を３時間にわたって振とうした。反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。このように得られたＣＰＧ １４０を、１時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、一晩、高い真空下に置いた（１２ｇ、７７μｍｏｌ／ｇ）。
Figure 2020114886
化合物１４２：ＤＣＭ中の（Ｒ）−グリシドール（２．３ｇ、３１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリエチルアミン（５ｍＬ、３６．５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温でＤＣＭ中のＤＭＴｒＣｌ（１０．６６ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）の１Ｍの溶液を加えた。ＴＬＣによって示される出発材料がなくなるまで、反応物を撹拌させた。数滴のＭｅＯＨを加えて、未反応のＤＭＴｒＣｌを加水分解し、混合物を１０分間撹拌した。生成物を、Ｈ２Ｏ、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。生成物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９：１）の勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、６ｇ（５２％）の純粋な生成物１４２が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．３８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７−７．１２（ｍ，５Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、４Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．２４（ｄｄ，Ｊ＝１０．９、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．１５−３．０８（ｍ，１Ｈ）、２．８６（ｄｄ，Ｊ＝１０．９、６．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．７０（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．５４（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１５８．０７、１４４．７５、１３５．４８、１３５．４５、１２９．６０、１２７．８５、１２７．５９、１２６．６９、１１３．４６、１１３．２１、８５．４６、６４．５２、５５．０１、５０．３７、４３．５９。
化合物１４４：ＤＭＦに溶解され、９０℃に加熱されたＮ１，Ｎ６−ジメチルヘキサン−１，６−ジアミン１４３（４．２２５ｇ、２９ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（０．１５ｇ、１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、化合物１４２（５．０６ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。化合物１４２が残らなくなるまで反応混合物を一晩撹拌した。反応を氷でクエンチし、ＤＣＭで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ＤＣＭ（２．５％のＮＥｔ３）ＭｅＯＨ（３０％）の勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、７．８ｇ（６３％）の純粋な化合物１４４が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．４０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．３５−７．１４（ｍ，７Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、４Ｈ）、４．１２（ｓ，１Ｈ）、３．８０−３．６４（ｓ，６Ｈ）、３．３７（ｍ，２Ｈ）、３．１１−２．８９（ｍ，５Ｈ）、２．８５（ｄｔ，Ｊ＝１５．１、７．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．８２−２．７６（ｍ，２Ｈ）、２．６９（ｓ，３Ｈ）、２．４８−２．３８（ｓ，３Ｈ）、１．６１（ｍ，４Ｈ）、１．２８（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１５８．０３、１４４．８２、１３５．５４、１３５．４８、１２９．７２、１２７．７９、１２７．６９、１２６．６３、１１３．１５、８５．４１、６５．７７、６４．７４、５８．４９、５５．０３、５４．９２、５２．０２、４７．８３、４５．１７、４０．００、３９．９２、３９．８３、３９．７６、３９．６６、３９．５０、３９．３３、３９．１６、３９．００、３２．１１、２５．５０、２５．４０、２４．９９、２３．２９、８．３７、７．２３。
化合物１４６：（ＯＢｚ）ＧａｌＮＡｃ酸１４５（６．９５ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．５９ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５．０４ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（５ｍＬ、２８．５ｍｍｏｌ）を、１５分間にわたって無水ＤＭＦ（８０ｍＬ）中で撹拌した。この溶液に、化合物１４４を加えた。出発材料が残らなくなるまで、混合物を４５分間撹拌した。生成物を酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解させ、有機層を、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次に、ＥｔＯＡｃ（１％のＮＥｔ３）：ＭｅＯＨ（１５％）の勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、５．３５ｇ（３６％）の純粋な化合物１４６が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．０８−７．８５（ｍ，４Ｈ）、７．８２−７．１１（ｍ，２０Ｈ）、６．８６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｔ，Ｊ＝２６．７、１３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．６１−４．４０（ｍ，３Ｈ）、４．３２（ｄｄｄ，Ｊ＝２５．２、１６．９、９．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．８８−３．６０（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．６３−３．４５（ｍ，１Ｈ）、３．１８（ｄｄ，Ｊ＝１４．６、７．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．０３−２．８１（ｍ，４Ｈ）、２．７４（ｓ，３Ｈ）、２．４２−２．２９（ｍ，１Ｈ）、２．３１−２．１２（ｍ，５Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．６０−０．９９（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７１．４５、１７１．３７、１７０．３６、１７０．２９、１６９．３２、１６５．１９、１６５．１４、１６４．８６、１５７．９１、１４５．２３、１４５．２２、１３６．０１、１３５．９８、１３３．７５、１３３．４９、１３３．４５、１２９．７０、１２９．５７、１２９．２０、１２９．１５、１２９．０２、１２８．９９、１２８．９５、１２８．６８、１２８．５７、１２７．７８、１２７．６２、１２６．４５、１１３．１０、１１２．９８、１００．８５、８５．０１、７１．８８、６９．９８、６８．８０、６８．７３、６７．９４、６７．７２、６６．３９、６３．４５、６２．０８、６０．７２、５９．７２、５７．６８、５７．６４、５４．９６、５４．８８、４９．７２、４８．８９、４６．６０、４２．８３、４０．０９、４０．００、３９．９２、３９．８３、３９．７６、３９．６７、３９．５９、３９．５０、３９．３３、３９．１７、３９．００、３４．６７、３２．６９、３２．１７、３１．５１、３０．１４、２８．６５、２８．５４、２７．９０、２６．７６、２６．７４、２６．４８、２６．２２、２６．０６、２２．６７、２１．４１、２１．１１、２０．７３、２０．６９、１８．５８、１４．０６、１３．５２。
化合物１４７：ＤＣＭ中の化合物１４６（１．１３６ｇ、１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１ｍＬ、６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、無水コハク酸（２２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を加えた。出発材料が残らなくなるまで、反応物を一晩撹拌した。生成物を、Ｈ２Ｏ、次に塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させたところ、８５０ｍｇ（６９％）の化合物１４７が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．１１（ｄｄ，Ｊ＝１５．３、９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９８−７．８４（ｍ，４Ｈ）、７．７３−７．１６（ｍ，１９Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．０１（ｓ，１Ｈ）、４．７６（ｄｄ，Ｊ＝８．５、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｍ，２Ｈ）、４．３７−４．２３（ｍ，２Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５４（ｄｄ，Ｊ＝１３．７、１０．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２１−３．０２（ｍ，４Ｈ）、３．０２−２．９３（ｍ，４Ｈ）、２．８７（ｓ，２Ｈ）、２．７３（ｓ，１Ｈ）、２．５５−２．３０（ｍ，８Ｈ）、２．３０−２．１２（ｍ，５Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．５８−１．０７（ｍ，８Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１７３．８３、１７２．０３、１７１．４５、１７１．３８、１６９．３１、１６５．１９、１６５．１３、１６４．８５、１５８．０１、１４４．８４、１３５．５４、１３３．７４、１３３．４５、１２９．５７、１２９．１９、１２９．１４、１２９．０２、１２８．９９、１２８．９４、１２８．６７、１２８．５６、１２７．７５、１２７．５９、１２６．５９、１１３．１０、１００．８４、８５．１４、７１．９２、７０．７３、６９．９７、６８．７２、６７．９３、６３．１６、６２．０９、５７．３９、５７．３３、５６．９０、５４．９７、４９．６９、４８．８９、４７．８６、４６．５９、４２．６５、４０．００、３９．９２、３９．８３、３９．７６、３９．６７、３９．５９、３９．５０、３９．３３、３９．１６、３９．００、３８．２３、３４．６８、３２．７２、３２．６８、３２．１５、３１．４９、３０．０９、２９．８９、２９．８４、２８．６２、２８．５３、２７．８９、２６．７２、２６．３４、２６．１６、２６．０１、２２．６６、２１．４０、２１．０９、２０．４６、１６．６４。
化合物１４８：化合物１４７（０．８５ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、ＣＰＧ（５ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．４８５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．４ｍＬ、２ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解させ、２時間にわたって振とうした。生成物をろ過し、ＤＣＭ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１）の溶液で洗浄し、次に乾燥させた。次に、固体を、キャッピングのために３時間にわたってピリジン：無水酢酸（３５％）の溶液を用いて振とうした。生成物をろ過し、ＤＣＭ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１）、ヘキサン、ＤＣＭで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させたところ、５．２ｇ（７０．４μｍｏｌ／ｇの充填量）の化合物１４８が得られた。
化合物１４９：化合物１４６（２．３ｇ、２．０２５ｍｍｏｌ）を、ピリジン中で（３回）共沸して、全ての水分を確実に除去し、この時点以降、アルゴン下に保った。使用される全ての溶媒をアルゴンで脱気した。０℃でピリジン中の化合物４およびＤＩＰＥＡ（１．３ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＬＣが全ての出発材料の消失を示すまで混合物を撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ：ＮＥｔ３（１％）：ＤＣＭ（２０％）の溶液に溶解させ、全ての塩をろ過して取り除くために、ＥｔＯＡｃ：ＮＥｔ３（３％）：ＤＣＭ（２５％）を用いたシリカゲルの急速ろ過カラムに通した。ろ液を濃縮し、ＥｔＯＡｃに再度溶解させ、生成物がオイルアウト（ｏｉｌｅｄ ｏｕｔ）するまでヘプタンを加えた。上清層をデカントし、生成物を濃縮した。生成物をＥｔＯＡｃに再度溶解させ、生成物が沈殿するまで０℃のヘプタンの溶液に滴下して加えた。ヘプタンをデカントし、固体を乾燥させたところ、２．２ｇ（７９％）の化合物１４９が得られた。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）δ１４８．０３、１４７．９４。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ８．００−７．９５（ｍ，４Ｈ）、７．８０−７．７６（ｍ，２Ｈ）、７．６９−７．４２（ｍ，１０Ｈ）、７．３８−７．１８（ｍ，１０Ｈ）、６．８９−６．６６（ｍ，５Ｈ）、５．８３（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．４５−５．３７（ｍ，１Ｈ）、４．８０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．５１（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．７、６．４、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１−４．３１（ｍ，３Ｈ）、３．７７−３．７５（ｍ，５Ｈ）、３．３１−３．０７（ｍ，４Ｈ）、２．９３−２．３４（ｍ，８Ｈ）、２．３２−２．１８（ｍ，５Ｈ）、２．１４（ｍ，４Ｈ）、１．９４（ｄｔ，Ｊ＝４．９、２．５Ｈｚ、３Ｈ）、１．７７−１．７３（ｍ，３Ｈ）、１．６４−１．５６（ｍ，４Ｈ）、１．３６−１．１０（ｍ，１６Ｈ）、１．０９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、０．９９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ１７３．１６、１７１．０９、１６６．７６、１６６．７１、１６６．４３、１５９．８０、１５９．７５、１４６．１１、１３７．１９、１３６．９８、１３６．９３、１３４．７４、１３４．４５、１３４．３６、１３１．１２、１３１．０６、１３０．８７、１３０．５９、１３０．５６、１３０．５０、１３０．４６、１３０．３８、１２９．９４、１２９．６６、１２９．５９、１２９．１６、１２９．０７、１２８．９７、１２８．９０、１２８．８４、１２８．７８、１２７．９６、１２７．９０、１１８．７３、１１８．３７、１１４．１９、１１４．１４、１１４．０６、１１４．０１、１０１．９８、８７．４５、８７．１５、７３．１３、７１．７５、７０．１３、６９．２１、６３．２２、５９．００、５６．００、５５．９８、５１．７０、５０．４２、４８．０２、４６．０６、４３．０１、４２．７９、３５．７０、３３．５６、３２．９３、３２．６９、２９．８４、２９．７５、２９．１９、２８．２５、２８．０９、２７．９６、２７．８７、２７．５０、２７．３６、２５．１２、２３．４８、２３．３１、２３．１８、２２．５５、２２．２８、２０．９４、２０．８９、２０．６６、１４．４７、２．２１、２．０２、１．８１、１．６１、１．４０、１．１９、０．９９、０．８９、０．７８。
実施例４９
Figure 2020114886
３，４−ジ−アセチル−６−メシルＧａｌＮＡｃエステル２：無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の６−ヒドロキシ誘導体１（２．００ｇ、４．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ａｒ雰囲気下でＤＩＥＡ（１．２ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）、および塩化メシル（０．５ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を連続して加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次に、５％のＮａＣｌ水溶液（６０ｍＬ）の添加によってクエンチした。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。残渣を、無水ＡＣＮと１回同時蒸発させ、残りの発泡体状の非晶質固体を、高真空下で一晩乾燥させたところ、２．３８ｇ（定量的）の粗化合物２が得られ、それをさらに精製せずに次の工程に使用した。ＭＳ（ＡｃＯＥｔ中）：（＋）モード：４８４（Ｍ−ｔ−Ｂｕ）；（−）モード：５９８（Ｍ＋ＡｃＯＨ）。１Ｈ１ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＤＭＳＯ−ｄ６、Ｊ（Ｈｚ）：１．３８（ｓ，９Ｈ）；１．４７（ｍ，４Ｈ）；１．７６（ｓ，３Ｈ）；１．８８（ｓ，３Ｈ）；２．１０（ｓ，３Ｈ）；２．１６（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．１）；３．１８（ｓ，３Ｈ）；３．４１（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｍ，１Ｈ）；３．８７（ｑ，１Ｈ、Ｊ＝８．９）；４．１０（ｍ，１Ｈ）；４．１９（ｍ，２Ｈ）；４．５０（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．５）；４．９６（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝３．４、Ｊ２＝１１．２）；５．２５（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝２．８）；１．８０（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９．２）。
非保護６−メシルＧａｌＮＡｃエステル３：無水ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の３，４−ジアセチル誘導体２（１．２９ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の低温の（０℃）溶液に、アルゴン雰囲気下で、ＭｅＯＨ（０．０５ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）中のＭｅＯＮａの２５重量％の溶液を加えた。混合物を０℃で２．５時間撹拌し、トリエチルアミン塩酸塩（３４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の添加によってクエンチし、減圧下で蒸発させたところ、１．２０ｇ（定量的）の粗化合物３が得られ、それをさらに精製せずに次の工程に使用した。ＭＳ（ＭｅＯＨ中）：（＋）モード：４００（Ｍ−ｔ−Ｂｕ）；（−）モード：４９０（Ｍ＋Ｃｌ）。Ｈ１ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＤＭＳＯ−ｄ６、Ｊ（Ｈｚ）：１．３７（ｓ，９Ｈ）；１．４６（ｍ，４Ｈ）；１．７８（ｓ，３Ｈ）；２．１６（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．５）；３．１７（ｓ，３Ｈ）；３．３６（ｍ，１Ｈ）、３．４６（ｍ，１Ｈ）；３．６７（ｍ，４Ｈ）；４．２８（ｍ，３Ｈ）；４．７２（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝６．２）；４．８５（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝４．０）；７．６３（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９．０）。
３，４−イソプロピリデン−６−メシルＧａｌＮＡｃエステル４：粗化合物３（１．２０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を含有する前の工程からの残渣を、２，２−ジメトキシプロパン（１０ｍＬ）とアセトン（２ｍＬ）との混合物に溶解させた後、メタンスルホン酸（２滴）を加えた。混合物を室温で２．５時間撹拌し、トリエチルアミン（４滴）の添加によって中和し、酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウムとに分液した。有機相を分離し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、残渣を無水ＡＣＮと同時蒸発させ、高真空下で乾燥させたところ、１．１０ｇ（定量的）の粗化合物４が得られ、それをさらに精製せずに次の工程に使用した。ＭＳ（ＡｃＯＥｔ中）：（＋）モード：４９６（Ｍ）、４４０（Ｍ−ｔ−Ｂｕ）；（−）モード：５３０（Ｍ＋Ｃｌ）、５５４（Ｍ＋ＡｃＯＨ）；Ｈ１ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＤＭＳＯ−ｄ６、Ｊ（Ｈｚ）：１．２３（ｓ，３Ｈ）；１．３８（ｓ，９Ｈ）；１．４０（ｓ，３Ｈ）；１．４６（ｍ，４Ｈ）；１．７９（ｓ，３Ｈ）；２．１６（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．０）；３．２１（ｓ，３Ｈ）；３．６７（ｍ，１Ｈ）、３．５５（ｍ，１Ｈ）；３．６８（ｍ，１Ｈ）；４．１４（ｍ，３Ｈ）；４．２７（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝８．４、Ｊ２＝１０．７）；４．３６（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．７）；４．４２（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝３．３、Ｊ２＝１０．９）；７．８６（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９．０）。
６−（１−イミダゾリル）エステル５ａ：無水ＤＭＡ（３ｍＬ）中のメシレート化合物４（２００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１３６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、およびＤＢＵ（０．０７５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、２３時間にわたって１４０℃でおよびアルゴン雰囲気下で加熱した。混合物を室温に冷まし、飽和塩化アンモニウムと水（４０ｍＬ）との１：１混合物で希釈し、ＡｃＯＥｔで抽出した。有機相を分離し、飽和塩水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させ、残渣を、ＡｃＯＥｔ中のＭｅＯＨ（０〜５０％）の勾配を用いてシリカゲルのカラム上でクロマトグラフィーにかけたところ、７４ｍｇ（４０％）の化合物５ａが得られた。ＭＳ（ＡｃＯＥｔ中）：（＋）モード：４６８（Ｍ）；（−）モード：５０２（Ｍ＋Ｃｌ）、５２６（Ｍ＋ＡｃＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＡＣＮ−ｄ３、Ｊ（Ｈｚ）：１．２９（ｓ，３Ｈ）；１．４１（ｓ，９Ｈ）；１．４８（ｓ，３Ｈ）；１．５０（ｍ，４Ｈ）；１．８５（ｓ，３Ｈ）；２．１６（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．０）；３．３１（ｄｔ，１Ｈ、Ｊ１＝６．２、Ｊ２＝１０．０）；３．６４（ｍ，２Ｈ）；３．９９（ｍ，１Ｈ）；４．０３（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝２．０、Ｊ２＝５．１）；４．２０（ｍ，３Ｈ）；４．３０（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．８）；６．６７（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９．２）；６．９２（ｓスプリット，１Ｈ）；７．０８（ｓスプリット，１Ｈ）；７．５２（ｓスプリット，１Ｈ）。
６−（３−［３−メトキシフェニル］−イミダゾリル−１）エステル５ｂ：無水ＤＭＡ（４ｍＬ）中のメシレート化合物４（３００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、２−（３−メトキシフェニル）イミダゾール（５２０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、およびＤＢＵ（０．１４ｍＬ、０．９ｍｍｏｌ）の溶液を、７６時間にわたってアルゴン雰囲気下で、１４０℃で加熱した。混合物を室温に冷まし、飽和塩化アンモニウムと水（４０ｍＬ）との１：１混合物で希釈し、ＡｃＯＥｔで抽出した。有機相を分離し、５％のＮａＣｌ水溶液、飽和ＮａＣｌで連続して洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、ＡｃＯＥｔ中のＭｅＯＨ（０〜３０％）の勾配を用いてシリカゲルのカラム上でクロマトグラフィーにかけたところ、６３ｍｇ（１８％）の化合物５ｂが得られた。ＭＳ（ＡｃＯＥｔ中）：（＋）モード：５７４（Ｍ）；（−）モード：６０８（Ｍ＋Ｃｌ）、５３２（Ｍ＋ＡｃＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＡＣＮ−ｄ３、Ｊ（Ｈｚ）：１．３１（ｓ，３Ｈ）；１．４０（ｓ，９Ｈ）；１．４７（ｍ，４Ｈ）；１．５０（ｓ，３Ｈ）；１．８５（ｓ，３Ｈ）；２．１３（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．１）；３．３３（ｍ，１Ｈ）；３．６５（ｍ，２Ｈ）；３．８０（ｓ，３Ｈ）；４．０３（ｍ，１Ｈ）；４．０８（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝２．１、Ｊ２＝５．２）；４．２０（ｍ，３Ｈ）；４．３２（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．８）；６．４８（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９．２）；６．７７（ｄｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝１．２、Ｊ２＝２．５、Ｊ３＝８．１）；７．５２（ｔ，１Ｈ、Ｊ＝８．２）；７．３３（ｍ，２Ｈ）；７．４８（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝１．３）；７．５６（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝１．３）。
脱保護されたイミダゾリル誘導体６ａおよび６ｂ：保護された誘導体５ａまたは５ｂ（０．１１ｍｍｏｌ）を９８％のギ酸（２ｍＬ）に溶解させ、水（０．０５ｍＬ）を加えた。溶液を室温で一晩置いておき、ギ酸を減圧下で蒸発させ、残渣を、エタノールとトルエン（６ｍＬ）との１：１混合物と２回同時蒸発させた。残渣をメタノール（３ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（０．１５ｍＬ）を加え、溶液を６５℃で４時間撹拌した。メタノールを減圧下で除去し、残渣を、３ｍＬのピリジンと３回同時蒸発させたところ、それぞれ４９および７３ｍｇの粗化合物６ａおよび６ｂが得られた。生成物を、アセトニトリル−メタノール混合物からの結晶化によってさらに精製した。６ａ：ＭＳ（ＭｅＯＨ中）：（＋）モード：４７２（ＭＨ＋）；（−）モード：３７０（Ｍ−Ｈ＋）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＤＭＳＯ−ｄ６、Ｊ（Ｈｚ）：１．４４（ｍ，４Ｈ）；１．７８（ｓ，３Ｈ）；２．１７（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．０）；３．２６（ｍ，１Ｈ）；３．４３（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝３．０、Ｊ２＝１０．６）；３．５１（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝２．８）；３．５７（ｍ，２Ｈ）；３．７０（ｑ，１Ｈ、Ｊ＝１０．４）；４．１１（ｍ，２Ｈ）；４．１８（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．４）；６．８６（ｓ，１Ｈ）；７．１４（ｓ，１Ｈ）；７．５９（ｍ，２Ｈ）；１２．０（ｓブロード，ＣＯＯＨ）．６ｂ：ＭＳ（ＭｅＯＨ中）：（＋）モード：４７８（ＭＨ＋）；（−）モード：４７６（Ｍ−Ｈ＋）．Ｈ１ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＤＭＳＯ−ｄ６、Ｊ（Ｈｚ）：１．４４（ｍ，４Ｈ）；１．７８（ｓ，３Ｈ）；２．１６（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．０）；３．２８（ｍ，１Ｈ）；３．４５（ｍ，１Ｈ）；３．５５（ｓブロード，１Ｈ）；３．６２（ｍ，２Ｈ）；３．７１（ｍ，１Ｈ）；３．７６（ｓ，３Ｈ）；４．１５（ｍ，２Ｈ）；４．２２（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．４）；４．７１（ｓブロード，１Ｈ、ＯＨ）；４．９２（ｓブロード，１Ｈ、ＯＨ）；６．７３（ｄｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝１．４、Ｊ２＝２．５、Ｊ３＝８．０）；７．２３（ｔ，１Ｈ、Ｊ＝８．０）；７．２８（ｍ，２Ｈ）；７．６３（ｍ，３Ｈ）、１２．０（ｓブロード，ＣＯＯＨ）。
実施例５０
Figure 2020114886
ヒスタミン誘導体８：無水ＤＣＭ（３ｍＬ）およびピリジン（０．０５ｍＬ）中のＮＨＳエステル化合物７（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）およびヒスタミン塩基（５２ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）の懸濁液を、室温で５日間撹拌した。反応を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の添加によってクエンチし、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機相を分離し、飽和塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。生成物化合物８を、ＤＣＭ中のＭｅＯＨ（０〜３０％）の勾配を用いたシリカゲルにおけるカラムクロマトグラフィーによって単離した。収量：６４ｍｇ、３２％。ＭＳ（ＭｅＯＨ中）：（＋）モード：５９９（Ｍ）；（−）モード：６３３（Ｍ＋Ｃｌ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＡＣＮ−ｄ３、Ｊ（Ｈｚ）：１．４１（ｓ，９Ｈ）；１．５４（ｍ，４Ｈ）；１．８３（ｓ，３Ｈ）；１．９１（ｓ，３Ｈ）；２．０９（ｓ，３Ｈ）；２．１８（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．０）；２．６９（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝６．５）；３．２９（ｍ，２Ｈ）；３．４７（ｍ，１Ｈ）；３．７８（ｍ，１Ｈ）；３．８７（ｔ，１Ｈ、Ｊ＝６．３）；３．９４（ｑ，１Ｈ、Ｊ＝１１．０）；４．０４（ｍ，２Ｈ）；４．５１（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．５）；５．００（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝３．２、Ｊ２＝１１．２）；５．２６（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝２．９）；５．９１（ｓブロード，１Ｈ）；６．４０（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９．４）；６．８１（ｓブロード，１Ｈ）；７．４９（ｓブロード，１Ｈ）。
脱保護されたヒスタミン誘導体９：９８％のギ酸（２ｍＬ）中の保護されたヒスタミン誘導体８（６３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液を、一晩室温に保ち、次に、トルエン（１０ｍＬ）で希釈し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ＭｅＯＨ−ＡＣＮ混合物と１回、およびＭｅＯＨ−ピリジン混合物と１回同時蒸発させた。生成物を高真空下で乾燥させ、メタノール（３ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（０．３ｍＬ）を加えた。混合物を６５℃で一晩撹拌し、ろ過し、蒸発させ、残渣を、ピリジン（３ｍＬ）と３回、ＡＣＮ（５ｍＬ）と１回同時蒸発させ、高真空下で乾燥させたところ、５０ｍｇ（定量的）の化合物９が非常に吸湿性の白色の固体として得られた。ＭＳ（ＭｅＯＨ中）：（−）モード：４５７（Ｍ−Ｈ）．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、ＤＭＳＯ−ｄ６、Ｊ（Ｈｚ）：１．４６（ｍ，４Ｈ）；１．７８（ｓ，３Ｈ）；２．１８（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．３）；２．６１（ｔ，２Ｈ、Ｊ＝７．６）；３．１８（ｑ，２Ｈ、Ｊ＝６．９）；３．３４（ｍ，２Ｈ）；３．４４（ｄｄ，１Ｈ、Ｊ１＝３．０、Ｊ２＝１０．６）；３．５１（ｔ，１Ｈ、Ｊ＝５．８）；３．６０（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝２．４）；３．６８（ｍ，２Ｈ）；４．０４（ｄ，２Ｈ、Ｊ＝５．８）；４．２３（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝８．４）；４．６７（ｓブロード，２Ｈ）；６．７７（ｓ，１Ｈ）；７．２３（ｔ，１Ｈ、Ｊ＝５．５）；７．５２（ｓ，１Ｈ）；７．６０（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９．０）；１２．０１（ｓブロード，２Ｈ）。
実施例５１
Figure 2020114886
化合物１０２の合成：化合物１０１（５ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を、１６時間にわたって５−ヘキセン−１−オール（８０ｍＬ）および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（０．５ｍＬ）とともに１００℃で加熱した。Ｅｔ２Ｏを用いた研和により、化合物１０２（４．０ｇ、１３．２ｍｍｏｌ、５８％）が得られた。Ｃ１４Ｈ２６ＮＯ６についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値３０４．１７６０、実測値３０４．２。
化合物１０３の合成：化合物１０２（１．４８ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）を、ピリジン（３０ｍＬ）およびＡｃ２Ｏ（１０ｍＬ）中で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１０３（１．４８ｇ、３．４５ｍｍｏｌ、７０％）が得られた。Ｃ２０Ｈ３２ＮＯ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値４３０．２０７７、実測値４３０．２。
化合物１０４の合成：化合物１０３（１．３７ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を、６４時間にわたってジオキサン（１３．７ｍＬ）およびフタル酸水素カリウム緩衝液（５４．８ｍＬ、ｐＨ＝４）中のカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）に由来するリパーゼ（３．４３ｇ）で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１０４（６８０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、５５％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．８５−５．７５（ｍ，１Ｈ）、５．５９（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３−５．３２（ｍ，１Ｈ）、５．２１（ｄｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．０６−４．９６（ｍ，２Ｈ）、４．８６（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３−４．５７（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｔｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．７３−３．６２（ｍ，２Ｈ）、３．５１−３．３９（ｍ，２Ｈ）、２．１９（ｓ，３Ｈ）、２．１２−２．０６（ｍ，２Ｈ）、２．０２（ｓ，３Ｈ）、１．９６（ｓ，３Ｈ）、１．６６−１．５９（ｍ，２Ｈ）、１．４９−１．４１（ｍ，２Ｈ）。
化合物１０５の合成：化合物１０４（７４７ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってＴＨＦ（１７ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（９１３ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．６７４ｍＬ、３．４８ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．７５２ｍＬ、３．４８ｍＬ）で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１０５（７５２ｍｇ、定量的）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．８５−５．７５（ｍ，１Ｈ）、５．５６（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．３０（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．１５（ｄｄ，Ｊ＝１１．３、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．０５−４．９７（ｍ，２Ｈ）、４．８８（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．６０−４．５４（ｍ，１Ｈ）、４．０６（ｄｄ，Ｊ＝８．８、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７７−３．７１（ｍ，１Ｈ）、３．４９−３．４０（ｍ，２Ｈ）、３．１３（ｄｄ，Ｊ＝１２．８、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、２．１７（ｓ，３Ｈ）、２．１２−２．０７（ｍ，２Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）、１．９６（ｓ，３Ｈ）、１．６５−１．６０（ｍ，２Ｈ）、１．５０−１．４４（ｍ，２Ｈ）。
実施例５２
Figure 2020114886
化合物１０６の合成：化合物１０５（７３０ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）およびＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）中の塩化ルテニウム（ＩＩＩ）水和物（１８ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）および過ヨウ素酸ナトリウム（１．８９ｇ、８．８５ｍＬ）で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１０６（６７７ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ、８９％）が得られた。Ｃ１７Ｈ２７Ｎ４Ｏ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値４３１．１７７８、実測値４３１．１。
化合物１０７の合成：化合物１０６（２００ｍｇ、０．４６５ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（８０ｍｇ、０．６９８ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１３４ｍｇ、０．６９８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２４４ｍＬ、１．４０ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１０７（１８３ｍｇ、０．３４７ｍｍｏｌ、７５％）が得られた。Ｃ２１Ｈ３０Ｎ５Ｏ１１についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５２８．１９４２、実測値５２８．１。
化合物１０８の合成：ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の化合物１０６（２２７ｍｇ、０．５２７ｍｍｏｌ）および３−エチニルアニソール（０．０８０ｍＬ、０．６３２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（０．１ｍＬ）中のＴＨＰＴＡ（１１ｍｇ、０．０２６４ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（１．３ｍｇ、０．００５２７ｍｍｏｌ）の溶液およびＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（１０ｍｇ、０．０５２７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１０８（２６４ｍｇ、０．４６９ｍｍｏｌ、８９％）が得られた。Ｃ２６Ｈ３５Ｎ４Ｏ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５６３．２３５３、実測値５６３．２。
化合物１０９の合成：化合物１０８（２３３ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７２ｍｇ、０．６２１ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１１９ｍｇ、０．６２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２１６ｍＬ、１．２４ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１０９（１００ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ、３７％）が得られた。Ｃ３０Ｈ３８Ｎ５Ｏ１２についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６６０．２５１７、実測値６６０．２。
化合物１１０の合成：ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の化合物１０６（２２３ｍｇ、０．５１８ｍｍｏｌ）および２−メチル−８−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）キノリン（１２３ｍｇ、０．６２２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（０．１ｍＬ）中のＴＨＰＴＡ（１１．２ｍｇ、０．０２５９ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（１．３ｍｇ、０．００５１８ｍｍｏｌ）の溶液およびＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（１０．３ｍｇ、０．０５１８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１１０（３２０ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ、９８％）が得られた。Ｃ３０Ｈ３８Ｎ５Ｏ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６２８．２６１９、実測値６２８．２。
化合物１１１の合成：化合物１１０（３０７ｍｇ、０．４８９ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（８５ｍｇ、０．７３４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１４１ｍｇ、０．７３４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２５６ｍＬ、１．４７ｍｍｏｌ）で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物１１１（１５５ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ、４２％）が得られた。Ｃ３４Ｈ４１Ｎ６Ｏ１２についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値７２５．２７８２、実測値７２５．１。
化合物１１２の合成：化合物１０６（２４０ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ）を、５日間にわたってＭｅＯＨ（９ｍＬ）およびＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）中で処理したところ、化合物１１２（２５０ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ、定量的）が得られた。Ｃ１３Ｈ２３Ｎ４Ｏ７についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値３４７．１５６７、実測値３４７．１。
実施例５３
Figure 2020114886
化合物１２１の合成：化合物１０６の代わりに化合物１２０を用いて、化合物１０８について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物１２１（３００ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ、８０％）が得られた。Ｃ２９Ｈ４０ＦＮ４Ｏ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６０７．２７７９、実測値６０７．１。
化合物１２２の合成：化合物１０６の代わりに化合物１２０を用いて、化合物１０８について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物１２２（４１７ｍｇ、０．６３５ｍｍｏｌ、９０％）が得られた。Ｃ３０Ｈ４０Ｆ３Ｎ４Ｏ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６５７．２７４７、実測値６５７．２。
化合物１２３の合成：化合物１０６の代わりに化合物１２０を用いて、化合物１０８について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物１２３（３４３ｍｇ、０．５５９ｍｍｏｌ、８０％）が得られた。Ｃ３０Ｈ４０Ｎ５Ｏ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６１４．２８２６、実測値６１４．２。
化合物１２４の合成：化合物１０６の代わりに化合物１２０を用いて、化合物１０８について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物１２４（３４０ｍｇ、０．５３７ｍｍｏｌ、７９％）が得られた。Ｃ２９Ｈ４０Ｎ５Ｏ１１についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６３４．２７２４、実測値６３４．０。
化合物１２５の合成：化合物１０６の代わりに化合物１２０を用いて、化合物１０８について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物１２５（３２３ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、８３％）が得られた。Ｃ２９Ｈ４１Ｎ４Ｏ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６０５．２８２３、実測値６０５．２。
化合物１２６の合成：化合物１２１（２９０ｍｇ、０．４７８ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってギ酸（１０ｍＬ）で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物１２６（２４１ｍｇ、０．４３８ｍｍｏｌ、９２％）が得られた。Ｃ２５Ｈ３２ＦＮ４Ｏ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５５１．２１５３、実測値５５１．０。
化合物１２７の合成：化合物１２２（４０７ｍｇ、０．６２０ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってギ酸（１０ｍＬ）で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物１２７（３１８ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ、８５％）が得られた。Ｃ２６Ｈ３２Ｆ３Ｎ４Ｏ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６０１．２１２１、実測値６０１．０。
化合物１２８の合成：化合物１２３（３３３ｍｇ、０．５４３ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってギ酸（１０ｍＬ）で処理し。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物１２８（２８１ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ、９３％）が得られた。Ｃ２６Ｈ３２Ｎ５Ｏ９についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５５８．２２００、実測値５５８．２。
化合物１２９の合成：化合物１２４（３３０ｍｇ、０．５２１ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってギ酸（１０ｍＬ）で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物１２９（２７７ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ、９２％）が得られた。Ｃ２５Ｈ３２Ｎ５Ｏ１１についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５７８．２０９８、実測値５７８．０。
化合物１３０の合成：化合物１２５（３１３ｍｇ、０．５１８ｍｍｏｌ）を、１８時間にわたってギ酸（１０ｍＬ）で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物１３０（２５３ｍｇ、０．４６１ｍｍｏｌ、８９％）が得られた。Ｃ２５Ｈ３３Ｎ４Ｏ１０についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５４９．２１９７、実測値５４９．０。
実施例５４
Figure 2020114886
ＮＨＳエステル化合物１３１、１３２、１３３、１３４および１３５を、それぞれ化合物１２６、１２７、１２８、１２９および１３０を用いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いた標準的なエステル化プロセスによって調製する。完全に脱保護されたＧａｌＮＡｃ誘導体１３６、１３７、１３８、１３９および１４０を、Ｅｔ３Ｎ／ＭｅＯＨによる処理によって、化合物１２６、１２７、１２８、１２９および１３０から調製する。
実施例５５
Figure 2020114886
２０１の合成：化合物２００（２０ｇ、４４．７４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中で撹拌した。次に、ＥＤＡＣ（１２．８ｇ、６５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｇ、触媒）、およびｔ−ブタノール（２０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で２日間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物を、酢酸エチルおよびヘキサンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２０１（１５ｇ、６８％）が得られた。Ｃ２３Ｈ３７ＮＯ１１についての分子量計算値５０３．２４、実測値５２６．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２０２の合成：化合物１０４の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、１０ｇの化合物２０１を、化合物２０２（７．６ｇ、７８％）に転化した。Ｃ２１Ｈ３５ＮＯ１０についての分子量計算値４６１．２３、実測値４８４．２５（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２０３の合成：化合物１０５の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物２０３を合成した（５．２ｇ、６４％）。Ｃ２１Ｈ３４Ｎ４Ｏ９についての分子量計算値４８６．２３、実測値５０９．２４（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２０４の合成：化合物２０３（６．３４ｇ、１３．０３ｍｍｏｌ）を、ギ酸（２０ｍｌ）中で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。粗生成物を、酢酸エチル／ヘキサンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２０４．（４．６ｇ、８２％）が得られた。Ｃ１７Ｈ２６Ｎ４Ｏ９についての分子量計算値４３０．１７、実測値４５３．１８（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２０５の合成：化合物２０４（０．５０ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させた。次に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２００ｇ、１．５当量）、ＥＤＡＣおよびＤＩＥＡを加え、得られた混合物を一晩撹拌した。次に、混合物を水および塩水で洗浄した。溶媒を除去し、残渣を、酢酸エチル／ヘキサンを用いたろ過クロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２０５が得られた。
化合物２０６の合成：化合物２０４（１．００ｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を、メタノール／水の混合物（２：１）中で撹拌した。次に、１−エチニル−３−メトキシベンゼン（２０４Ａ）（０．３６７ｇ、２．７ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４．×Ｈ２Ｏ（０．０５０ｇ、触媒量）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．２５ｇ、１ｍｍｏｌ））を加え、混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、次に、水、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２０６が得られた。Ｃ２６Ｈ３４Ｎ４Ｏ１０についての分子量計算値５６２．２３、実測値５８５．２２（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２０７の合成：化合物２０７を、化合物２０５（３２０ｍｇ、９５％）の合成について記載されるのと同様の手順を用いて調製した。
実施例５６
Figure 2020114886
化合物２０７の合成：化合物２０２（２．８ｇ、６．０７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、混合物を氷水浴中で冷却した。この混合物に、ＤＳＣ（１．３ｇ、１．５当量）およびＴＥＡ（０．７ｍＬ）を加え、溶液を一晩撹拌した。次に、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、分液漏斗に移した。混合物を水および塩水で洗浄し、次に、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を減圧下で一晩乾燥させた。得られた生成物を、さらに精製せずに次の反応段階に使用した。
化合物２０８の合成：ＤＳＣ誘導体化合物２０７（０．５ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中で撹拌した。ベンジルアミン（０．１００ｇ、１ｍｍｏｌ）およびピリジン（５ｍＬ）を加え、混合物を一晩撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。粗生成物を、ジクロロメタン／メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２０８（０．３００ｇ、６５％）が得られた。Ｃ２９Ｈ４２Ｎ２Ｏ１１についての分子量計算値５９４．２８、実測値５９５．２９（Ｍ＋）。
化合物２０９の合成：ＤＳＣ誘導体化合物２０７（０．５ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中で撹拌した。次に、エタノールアミン（０．０７ｇ、１ｍｍｏｌ）およびピリジン（５ｍＬ）を加え、混合物を一晩撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。粗生成物を、ジクロロメタン／メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２０９（０．２５ｇ、４２％）が得られた。Ｃ２４Ｈ４０Ｎ２Ｏ１２についての分子量計算値５４８．２６、実測値５４９．２７（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２１０の合成：化合物２０８（２５０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をギ酸（２０ｍＬ）に溶解させ、溶液を一晩撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。粗化合物をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、ジクロロメタン／メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２１０（２００ｍｇ、８７％）が得られた。次に、この化合物をメタノールに溶解させ、ＴＥＡ（２ｍＬ）を加えた。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をピリジンと２回同時蒸発させた。生成物を水にさらに溶解させ、次に、凍結乾燥させたところ、化合物２１０が白色の粉末として得られた。Ｃ２１Ｈ３０Ｎ２Ｏ９についての分子量計算値４５４．２０、実測値４７７．２１（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２１１の合成：化合物２１１を、化合物２１０の調製に使用されるのと同様の方法を用いて化合物２０９から調製した。Ｃ１６Ｈ２８Ｎ２Ｏ１０についての分子量計算値４０８．１７、実測値４３１．２０（Ｍ＋Ｎａ）。
実施例５７
Figure 2020114886
化合物２１３の合成：グルタメート誘導体Ａ（０．１７４ｇ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させた。ＨＢＴＵ（０．３９０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡを加え、混合物を室温で数分間撹拌した。ＤＭＦ中のアミノ誘導体化合物２１２（０．４００ｇ、１ｍｍｏｌ）をこの溶液に加え、一晩、撹拌を続けた。次に、溶媒を減圧下で除去した。粗化合物を、ジクロロメタン／メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物２１３（０．３５０ｇ、５７％）が得られた。Ｃ２３Ｈ４０Ｎ４Ｏ１０についての分子量計算値５３２．２７、実測値５５５．２８（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２１４の合成：化合物２１３（３００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）をギ酸に溶解させ、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をトルエンと２回同時蒸発させた。この残渣を水に溶解させ、凍結乾燥させたところ、化合物２１４（２００ｍｇ、７４％）が白色の粉末として得られた。Ｃ１９Ｈ３２Ｎ４Ｏ１０についての分子量計算値４７６．２１、実測値４７７．２０（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２１５の合成：化合物２１５を、化合物Ｂ（１４０ｍｇ）から同様の手順で調製した。Ｃ２７Ｈ４８Ｎ４Ｏ１０についての分子量計算値５８８．３４、実測値６１１．３３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２１６の合成：化合物２１６を、化合物２１４（０．１２５ｇ、３５％）を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物２１５から調製した。Ｃ２３Ｈ４０Ｎ４Ｏ１０についての分子量計算値５３２．２７、実測値５５５．２５（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物２１７の合成：化合物２１６を、化合物Ｃおよびアミノ誘導体２１２（．２５０ｍｇ、６５％）から調製した。Ｃ２５Ｈ４１Ｎ５Ｏ９についての分子量計算値５５５．２９、実測値５５６．３１（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２１８の合成：化合物２１８を、化合物２１４（０．１４０ｍｇ、４５％）を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物２１７から調製した。Ｃ２１Ｈ３３Ｎ５Ｏ９についての分子量計算値４９９．２３、実測値５００．２５（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２１９の合成：化合物２１９を、化合物２１３（０．５２５ｇ、４３％）を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物Ｄおよびアミノ誘導体２１２から調製した。Ｃ２４Ｈ４３Ｎ３Ｏ９についての分子量計算値５１７．３０、実測値５１８．２８（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２２０の合成：化合物２２０を、化合物２１４（９５ｍｇ、２６％）を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物２１９から調製した。Ｃ２０Ｈ３５Ｎ３Ｏ９についての分子量計算値４６１．２４、実測値４６２．２６（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２２１の合成：化合物２２１を、化合物Ｅおよびアミノ誘導体化合物２１２（０．３２０ｇ、６５％）からの化合物から調製した。Ｃ２１Ｈ３７Ｎ３Ｏ９についての分子量計算値４７５．２５、実測値４７６．２３（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２２２の合成：化合物２２２を、化合物２１４（８５ｍｇ、５６％）を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物２２１から調製した。Ｃ１７Ｈ２９Ｎ３Ｏ９についての分子量計算値４１９．１９、実測値４２０．２０（Ｍ＋Ｎａ）。
実施例５８
Figure 2020114886
化合物５８を、国際公開第９６／３９４１１号に報告されるのと同様の方法で調製する。Ｏ−グリコシル化、続いて加水分解により、化合物６０および６３が得られる。ＮＨＳエステル化合物６１および６４を、ＮＨＳを用いた標準的なエステル化によって調製する。化合物６５のアセチル基を、選択的に除去し、得られたヒドロキシル基を、ベンジル基によって保護したところ、化合物６６が得られる。末端アルケンの酸化的切断により、化合物６７が得られる。エステル化、続いて水素化により、化合物６１および６４が得られる。化合物５８のＯ−グリコシル化、続いて酸化および加水分解により、化合物６０が得られる。化合物６０のエステル化により、化合物６１が得られる
Figure 2020114886
トリフルオロメチルアセトアミド（ＴＦＡ）保護されたガラクトサミン（ＧａｌＮ−ＴＦＡ）ＮＨＳエステルを、合成後手法において、アミン含有オリゴヌクレオチド（化合物６９および７１）と結合して、Ｇａｌ−ＴＦＡ含有オリゴヌクレオチド（化合物７０および７２）を生成する。
実施例５９
Figure 2020114886
化合物５００９の合成：ピリジン（１００ｍＬ）中の化合物５００８（２５．０ｇ、８３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴｓＣｌ（１９．８ｇ、１０３．７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩（１４時間）撹拌した。溶媒を濃縮し、生成物を、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、水、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗化合物５００９（２５ｇ）が得られた。Ｃ２１Ｈ２９ＮＯ８ＳについてのＬＣＭＳ計算値：４５５．１６（Ｍ＋）、実測値：４５６．１（Ｍ＋＋１）、４７８．０（Ｍ＋＋Ｎａ＋）。
化合物５０１０の合成：ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の化合物５００９（１９．０ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮａＮ３（１６ｇ、２４６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を８０℃で３日間撹拌した。次に、さらに８ｇのＮａＮ３を加え、溶液を１４時間にわたって１００℃に加熱した。溶媒を濃縮し、生成物を、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、水、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗化合物５０１０が得られ、それを、カラムクロマトグラフィー（５ｇ、３７％）によって精製した。Ｃ１４Ｈ２２Ｎ４Ｏ５についてのＬＣＭＳ計算値：３２６．３５（Ｍ＋）、実測値：３２７．１（Ｍ＋＋１）。
化合物５０１１の合成：ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＬＡＨ（１３９ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、０℃でＴＨＦ（１０ｍＬ）中の化合物５０１０（５７４ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。混合物を室温で一晩（１４時間）撹拌した。反応混合物を１ｍＬの水でクエンチした後、Ｃｅｌｉｔｅ上でろ過し、酢酸エチル（２５ｍＬ）で洗浄した。溶媒の濃縮により、粗生成物（０．５ｇ）が得られ、それをＤＣＭ（０ｍＬ）に溶解させ、グルタル酸無水物（２５１ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。反応混合物を室温で１４時間撹拌した。溶媒の濃縮により、粗製の酸（２８５ｍｇ）が得られ、それを、２０ｍＬの、ジエチルエーテル中２ＮのＨＣｌに溶解させ、３時間撹拌した。溶媒の濃縮により、化合物５０１１（２００ｍｇ）が得られた。Ｃ１６Ｈ２６Ｎ２Ｏ８についてのＬＣＭＳ計算値：３７４．３９（Ｍ＋）、実測値：３７３．１（Ｍ−−１）。
化合物５０１２の合成：ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物５０１１（２００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（１１２ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＣＣ（２１８ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１４時間撹拌した。次に、２０ｍＬの酢酸エチルを加えた。固体のろ過により、化合物５０１２（１５０ｍｇ、６０％）が得られた。Ｃ２０Ｈ２９Ｎ３Ｏ１０についてのＬＣＭＳ計算値：４７１．４６（Ｍ＋）、実測値：５０６（Ｍ−＋Ｃｌ−）。
実施例６０：三価のＧａｌＮＡｃがコンジュゲートされたプソイドウリジン構成単位
Figure 2020114886
化合物１４３の合成：ＤＭＦ（１２ｍＬ）中の三価のＧａｌＮＡｃ酸化合物１４２（１．８０ｇ、０．８９８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（３４１ｍｇ、０．８９８ｍｍｏｌ）およびｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（０．５６８ｍＬ、３．２６ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、化合物１４１（５００ｍｇ、０．８１６ｍｍｏｌ）を溶液に加え、混合物を一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去した後、残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜１５％のＭｅＯＨ）によって精製したところ、化合物１４３（１．７５ｇ、０．６７３ｍｍｏｌ、８２％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｓ，１Ｈ）、７．９６（ｓ，１Ｈ）、７．８４−７．８１（ｍ，６Ｈ）、７．７６−７．７２（ｍ，４Ｈ）、７．５０（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．９８（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、３Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．４Ｈｚ、３Ｈ）、４．５３（ｓ，１Ｈ）、４．４８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、３Ｈ）、４．３５−４．３３（ｍ，１Ｈ）、４．１７（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５−３．８３（ｍ，１７Ｈ）、３．７３−３．６４（ｍ，３Ｈ）、３．５７−３．５２（ｍ，１２Ｈ）、３．４３−３．３８（ｍ，３Ｈ）、３．０６−３．００（ｍ，１６Ｈ）、２．４４−２．３９（ｍ，２Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．１０（ｓ，９Ｈ）、２．０４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、９Ｈ）、１．９９（ｓ，９Ｈ）、１．８９（ｓ，９Ｈ）、１．７７（ｓ，９Ｈ）、１．５２−１．４２（ｍ，２２Ｈ）、１．２１（ｓ，１３Ｈ）、１．０１（ｓ，９Ｈ）、０．９８（ｓ，９Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ）、０．１２（ｓ，３Ｈ）、０．０７９（ｓ，３Ｈ）。
化合物１４４の合成：フッ化水素−ピリジン（約７０％のＨＦ、０．１７３ｍＬ、６．６６ｍｍｏｌ）を、０℃で冷却しながらピリジン（２ｍＬ）で希釈した。得られた溶液を、０℃でＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の化合物１４３の溶液に加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。揮発性物質を蒸発させた後、粗生成物を減圧下で乾燥させたところ、そのジオールが白色の発泡体として得られた。ピリジン（１５ｍＬ）中のこの材料の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（６９１ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１４時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜１０％のＭｅＯＨ）によって精製したところ、化合物１４４（３．３１ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、６５％）が得られた。
化合物１４５の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の化合物１４４（３．２５ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（４３２ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（２３６ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。濃縮後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中８％のＭｅＯＨ／８％のＥｔ３Ｎ）によって精製したところ、化合物１４５（３．０３ｇ、１．７８ｍｍｏｌ、８７％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．２２（ｂｒｓ、１Ｈ）、１１．４１（ｓ，１Ｈ）、７．９４（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．８５−７．８１（ｍ，６Ｈ）、７．７５−７．７２（ｍ，４Ｈ）、７．６６（ｓ，１Ｈ）、７．４１−７．３８（ｍ，２Ｈ）、７．３２−７．１９（ｍ，９Ｈ）、６．９８（ｓ，１Ｈ）、６．８９−６．８７（ｍ，４Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、３Ｈ）、５．０７（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．４Ｈｚ、３Ｈ）、４．５５（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．５６−４．４４（ｍ，４Ｈ）、４．０５−３．９７（ｍ，１０Ｈ）、３．９１−３．８３（ｍ，３Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．７１−３．６４（ｍ，４Ｈ）、３．５６−３．５２（ｍ，１４Ｈ）、３．４３−３．３８（ｍ，３Ｈ）、３．２３−３．１４（ｍ，２Ｈ）、３．０６−３．００（ｍ，１６Ｈ）、２．４６−２．３８（ｍ，４Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．１０（ｓ，９Ｈ）、２．０６−２．０１（ｍ，９Ｈ）、１．９９（ｓ，９Ｈ）、１．８９（ｓ，９Ｈ）、１．７７（ｓ，９Ｈ）、１．５２−１．４３（ｍ，２２Ｈ）、１．２１（ｓ，１３Ｈ）、０．９５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、０．８０（ｓ，９Ｈ）、−０．０１３（ｓ，３Ｈ）、−０．０４６（ｓ，３Ｈ）。
化合物１４６の合成：ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）中の化合物１４５（１０３ｍｇ、０．０３４７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（２６ｍｇ、０．０６９４ｍｍｏｌ）、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０２６ｍＬ、０．１４９ｍｍｏｌ）およびＣＰＧ−ＮＨ２（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＣＰＧ−５００、８０μｍｏｌ／ｇであると考えられるＮＨ２充填量）（４５０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２４時間にわたって振とうし、次にろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧下で乾燥させた。残りのアミノ基を、ピリジン（７．５ｍＬ）、無水酢酸（２．５ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．５ｍＬ）を用いて１時間振とうすることによってキャッピングした。ろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）、次に５０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させたところ、化合物１４６が得られた。充填量：４９μｍｏｌ／ｇ。
実施例６１：三本鎖および１＋１＋１リガンド設計のための初代肝細胞結合
ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは同じであり、ＴＴＲを標的にしていた。以下のリガンドを、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート４３５２７におけるものと同じであった。
Figure 2020114886
図１３は、ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲート６１６９６、６１６９５、６１６９２、６１６９４、６１６９７、６１６９３、４３５２７および６１６９８のための初代肝細胞結合親和性を示し、それらの構造が以下に示される。結合親和性Ｋｉ値が、以下の表に示される。
Figure 2020114886
実施例６２：高親和性リガンドを有するＳｉＲＮＡ ＧａｌＮＡＣコンジュゲート
ｓｉＲＮＡ−リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のｓｉＲＮＡは同じであり、ＴＴＲを標的にしていた。以下のリガンドを、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート５７７２７におけるものと同じであった。Ｌ２２４、Ｌ２２３、Ｌ２２１、Ｌ９６およびＬ２２７の構造が以下に示される。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
図３Ａおよび３Ｂは、実施例３３におけるプロトコルにしたがった、マウスへのコンジュゲート５７７２７、６３１８９、６３１９２、６３１９０および６３１９１の単回の皮下投与の７２時間後（図３Ａ）および１４４時間後（図３Ｂ）の血中血清ｍＴＴＲ ＳｉＲＮＡレベルを示す。
実施例６３：Ｔ−２’−ＧａｌＮＡｃ構成単位のための化合物
Figure 2020114886
実施例６４：Ｔ−３’−ＧａｌＮＡｃ構成単位のための化合物
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
実施例６５：
Figure 2020114886
２’−および３’−Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジン（２Ａ、２Ｂ）。２’，３’−Ｏ−ジブチルスタンニレン−５−メチルウリジン（２．０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に懸濁させた。６−ブロモヘキシルフタルイミド（２．５ｇ、８．２ｍｍｏｌ）およびＮａＩ（１２０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を懸濁液に加えた。試薬を、１００℃で３．５時間マイクロ波にかけたところ、暗褐色の均一混合物が得られた。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルに吸着させた。シリカゲルを、シリカゲルクロマトグラフィー用のカートリッジ中に充填した。Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジンの２’−および３’−異性体が、分離できない混合物として溶離して、８９０ｍｇの２Ａおよび２Ｂ（１．８ｍｍｏｌ、４５％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．２９（ｓ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．８８−７．８０（ｍ，４Ｈ）、７．７８−７．７６（ｍ，１Ｈ）、７．７３−７．７０（ｍ，０Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．７２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２５（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．１２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．００（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．１４（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．０７（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９０−３．７９（ｍ，２Ｈ）、３．７４（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、０Ｈ）、３．６７−３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．５８−３．４９（ｍ，４Ｈ）、３．４６−３．３７（ｍ，１Ｈ）、１．７５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、３Ｈ）、１．６２−１．４２（ｍ，４Ｈ）、１．３７−１．２０（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６８．００、１６７．９７、１６３．７８、１６３．７３、１５０．７９、１５０．５７、１３６．２３、１３６．０７、１３４．４４、１３４．４０、１３１．６０、１３１．５６、１２３．０２、１０９．３８、１０９．２６、８７．７３、８５．８９、８５．０７、８２．７１、８０．８２、７７．４９、７２．４３、６９．６９、６９．５１、６８．３８、６０．８６、６０．６２、２９．２３、２８．９６、２７．９３、２６．１５、２６．０７、２５．１６、２４．９６、１２．２６．Ｃ２４Ｈ２９Ｎ３Ｏ８についてのＭＳ計算値４８７．１９５５、実測値ｍ／ｚ ４８８．０（Ｍ＋１）＋、５１０．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、４８６．２（Ｍ−１）−、５２２．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２６。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジン（３Ａ）。２Ａおよび２Ｂの混合物（８９０ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）を、ピリジンと同時蒸発させ、次に、アルゴン雰囲気下でピリジン（１０ｍＬ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却した。この混合物に、ＤＭＴｒＣｌ（６９０ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を、室温に温めながら、一晩撹拌した。さらなる０．５５当量のＤＭＴｒＣｌを加え、反応物をさらに２時間撹拌した。反応をＭｅＯＨでクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗製の２’および３’異性体（３Ａおよび３Ｂ）をＤＣＭに溶解させ、有機層を塩水で２回洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、減圧下で濃縮したところ、５１０ｍｇの３Ａ（０．６５ｍｍｏｌ、３５％）が得られた。２’−Ｏ−アルキル化異性体を、Ｄ２Ｏ交換、続いてＣＯＳＹによる３’−ＯＨの同定によって特性評価した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｓ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．８８−７．７７（ｍ，４Ｈ）、７．４８（ｓ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．３３−７．１９（ｍ，７Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、４Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．１８（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９６（ｑ，Ｊ＝４．８、４．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６２−３．４６（ｍ，４Ｈ）、３．２７−３．１４（ｍ，２Ｈ）、１．５９−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．３８（ｓ，３Ｈ）、１．３４−１．２０（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．９１、１６３．６１、１５８．１９、１５８．１６、１５０．４１、１４４．６６、１３５．４５、１３５．３１、１３５．１１、１３４．３３、１３１．５８、１２９．７４、１２７．９３、１２７．６５、１２６．８４、１２２．９７、１１３．２７、１０９．６０、８６．４６、８５．９１、８３．０９、８０．５３、６９．６３、６８．７６、６３．１９、５５．０６、３７．３１、２８．８９、２７．９１、２６．０７、２４．９５、１１．６６．Ｃ４５Ｈ４７Ｎ３Ｏ１０についてのＭＳ計算値７８９．３２６１、実測値ｍ／ｚ ８１２．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、７８８．３（Ｍ−１）−、８２４．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ− Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン ｖ／ｖ中の０．３５。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−フタルイミドヘキシル−５−メチルウリジン（３Ｂ）。３’−異性体（３Ｂ）を、シリカゲルクロマトグラフィー中に２’−異性体（３Ａ）から分離し、減圧下で濃縮したところ、４２０ｍｇの３Ｂ（２９％、０．５３ｍｍｏｌ）が得られた。３’−Ｏ−アルキル化異性体を、Ｄ２Ｏ交換による２’−ＯＨの同定を除いて、同じように特性評価した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３４（ｓ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．８７−７．７９（ｍ，４Ｈ）、７．４９（ｓ，１Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．２９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２６−７．１９（ｍ，５Ｈ）、６．９４−６．８１（ｍ，４Ｈ）、５．７１（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．２７（ｑ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９−３．９５（ｍ，１Ｈ）、３．９０（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．６３−３．４７（ｍ，３Ｈ）、３．３６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．２６−３．１５（ｍ，２Ｈ）、１．５９−１．３９（ｍ，７Ｈ）、１．２８−１．２０（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．９３、１６３．６９、１５８．１７、１５８．１５、１５０．５７、１４４．６３、１３５．７２、１３５．３０、１３５．１７、１３４．３５、１３１．５８、１２９．７１、１２７．９１、１２７．６３、１２６．８２、１２２．９７、１１３．２４、１０９．３７、８８．６９、８５．９１、８０．６０、７７．２７、７２．１８、６９．６７、５５．０３、３９．５０、３７．３３、２９．０９、２７．８８、２６．０８、２５．０８、１１．７４．Ｃ４５Ｈ４７Ｎ３Ｏ１０についてのＭＳ計算値７８９．３２６１、実測値ｍ／ｚ ８１２．０（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、７８８．３（Ｍ−１）−、８２４．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ− Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン ｖ／ｖ中の０．１８。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−５−メチルウリジン（４Ａ＊）。ＭｅＯＨ（１９０ｍＬ）中の３Ａ（ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した、ロット＃Ｈ１０１０−０４、１５．０ｇ、１８．９９ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン（３．０４ｇ、９４．５２ｍｍｏｌ）を加え、不均一混合物を、３．５時間にわたって加熱還流させた。混合物を室温に冷まし、減圧下で蒸発させたところ、白色の粉末が得られた。生成物をＤＣＭに溶解させ、水酸化アンモニウムで洗浄した。エマルジョンの除去を助けるように塩水を加えた。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、１１．８０ｇの粗生成物が得られ、それを精製せずに次の工程に使用した。
Ｃ３７Ｈ４５Ｎ３Ｏ８についてのＭＳ計算値６５９．３２０７、実測値ｍ／ｚ ６６０．２（Ｍ＋１）＋、６８２．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、６５８．１（Ｍ−１）−、６９４．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．０２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．４８（ｓ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ、５Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ）、４．１９（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６３−３．４５（ｍ，３Ｈ）、３．２７−３．１５（ｍ，３Ｈ）、１．４８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｓ，３Ｈ）、１．３４−１．１８（ｍ，６Ｈ）。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−５−メチルウリジン（４Ａ）。ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中の粗製の４Ａ＊（６．００ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（３．８ｍＬ、２７．３０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１０分間撹拌させた。ＧａｌＮＡｃ−Ｃ５−ＮＨＳエステル（７．３１ｇ、１０．００ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物を飽和重炭酸塩で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次に、減圧下で蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、９．５６ｇの４Ａ（７．４９ｍｍｏｌ、８２％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３７（ｓ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．９７（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．９１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、７．７３−７．４５（ｍ，１１Ｈ）、７．４１−７．１９（ｍ，１１Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝８．８、７．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９−４．１５（ｍ，３Ｈ）、３．９６（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．７９（ｄｄ，Ｊ＝９．４、３．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６３−３．４５（ｍ，３Ｈ）、３．２８−３．１６（ｍ，２Ｈ）、２．９９（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．４３（ｍ，６Ｈ）、１．３６（ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ、５Ｈ）、１．２４（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７３、１６９．４０、１６５．２０、１６５．１６、１６４．８６、１６３．６２、１５８．１８、１５８．１５、１５０．４１、１４４．６４、１３５．４７、１３５．３１、１３５．１０、１３３．７７、１３３．４９、１２９．７３、１２９．２０、１２９．１６、１２９．０３、１２９．００、１２８．９７、１２８．７０、１２８．５９、１２７．９１、１２７．６４、１２６．８２、１１３．２６、１０９．５９、１００．８９、８６．４７、８５．９１、８３．０９、８０．６０、７１．８５、６９．９７、６９．７４、６８．７７、６７．９２、６３．１９、６２．０３、５５．０４、４９．７４、３８．３４、３５．０３、２９．１７、２９．０４、２８．５９、２６．２５、２５．１２、２２．６９、２１．８５、１１．６６．Ｃ７１Ｈ７８Ｎ４Ｏ１８についてのＭＳ計算値１２７４．５３１１、実測値ｍ／ｚ １２９８．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３０９．４（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３６。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−３’−Ｏ−スクシネート−５−メチルウリジン（５Ａ）。ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の４Ａ（２．００ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（５７４ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（３１３ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（φ＝４．２ｃｍ×１５ｃｍ、ＤＣＭ中２％のＴＥＡで前処理された）によって精製した。生成物を、ＤＣＭ中０〜５％のＭｅＯＨおよび２〜５％のＥｔ３Ｎ（ｖ／ｖ）で溶離し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、２．１１ｇ（１．４３ｍｍｏｌ、９１％）の６ａがＥｔ３Ｎ塩として得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４４（ｓ，１Ｈ）、８．０５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、７．７４−７．４５（ｍ，１１Ｈ）、７．４０−７．２７（ｍ，６Ｈ）、７．２３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、５Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７−５．２２（ｍ，１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８−４．４０（ｍ，２Ｈ）、４．３８−４．２２（ｍ，３Ｈ）、４．１３（ｑ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５４−３．２８（ｍ，５Ｈ）、３．２５−３．１９（ｍ，１Ｈ）、２．９７（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．５７−２．５１（ｍ，２Ｈ）、２．４４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５７−１．２７（ｍ，１１Ｈ）、１．１８（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．４０、１７１．７６、１７１．６３、１６９．３９、１６５．２０、１６５．１５、１６４．８６、１６３．５０、１５８．２２、１５０．５０、１４４．４８、１３５．４５、１３５．１２、１３４．９５、１３３．７６、１３３．４８、１２９．７０、１２９．１７、１２９．０３、１２９．００、１２８．９７、１２８．７０、１２８．５８、１２７．９５、１２７．６１、１１３．３０、１１０．１６、１００．９１、８６．１３、８０．７５、７８．２２、７１．８９、７０．６７、７０．２３、６９．９７、６８．７３、６７．９１、６２．０４、５５．０４、５２．０１、４９．７３、３８．３３、３４．９８、２９．１３、２８．９２、２８．５５、２６．１９、２５．０８、２２．６８、２１．８２、１１．６９、１０．４８．Ｃ７５Ｈ８１Ｎ４Ｏ２１ −についてのＭＳ計算値１３７４．５４７２、実測値ｍ／ｚ １３９７．４（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３７３．４（Ｍ−１）−、１４０９．４（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／５％のＥｔ３Ｎ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４１。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−３’−Ｏ−ＣＰＧ−５−メチルウリジン（６Ａ）。アセトニトリル（１００ｍＬ）中の５Ａ（２．０１ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（１．０３ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５２８ｍｇ、４．０８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５分間にわたって振とうしてから、ＣＰＧ（１６．００ｇ、１３０μｍｏｌ／ｇ、５４０Å）を加えた。混合物を２４時間にわたって振とうした。ＣＰＧをろ過し、ＤＣＭ、ＤＣＭ中２０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、次にエーテルで洗浄した。ＣＰＧを減圧下で蒸発させ、次に、ピリジン（７５ｍＬ）およびＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）中の無水酢酸（２５ｍＬ）で処理し、１時間にわたって振とうした。ＣＰＧをろ過し、上述されるのと同じ溶媒で洗浄した。平均充填量を、２つの試料のトリチル吸光度分光法測定によって測定し、計算したところ、７３μｍｏｌ／ｇであった。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチルホスホロアミダイト−５−メチルウリジン（７Ａ）。４Ａ（２．９０ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリルと２回同時蒸発させ、次に、完全なアルゴン雰囲気下に保った。０℃で無水ＤＣＭ（３５ｍＬ）中の４Ａの溶液に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３７ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）、続いてＤＣＩ（２６８ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で２０分間、次に室温で１７時間撹拌した。生成物を飽和重炭酸塩で洗浄し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。シリカゲルクロマトグラフィー（φ＝４．２ｃｍ×１９ｃｍ、ヘキサン中５０％のＥｔＯＡｃおよび１％のＴＥＡで前処理された）を行った。カラムを、ヘキサン中８０％のＥｔＯＡｃ（８ＣＶ）、続いて１００％のＥｔＯＡｃ（８ＣＶ）、次に、ＤＣＭ中３％のＭｅＯＨ（５ＣＶ）で洗浄した。生成物７Ａが、１００％のＥｔＯＡｃおよび再度３％のＭｅＯＨで溶離した。７Ａを含有する画分を組み合わせて、減圧下で蒸発させたところ、３．２０ｇの７Ａ（２．１７ｍｍｏｌ、９５％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３９（ｓ，１Ｈ）、７．９８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）、７．７２−７．４５（ｍ，１１Ｈ）、７．３８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、７．３３−７．２０（ｍ，７Ｈ）、６．８８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｓ，１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８−４．３１（ｍ，４Ｈ）、４．１５−４．０４（ｍ，２Ｈ）、３．７１（ｓ，８Ｈ）、３．５８−３．４５（ｍ，５Ｈ）、３．２８−３．２０（ｍ，２Ｈ）、３．０３−２．９３（ｍ，２Ｈ）、２．７６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．５７（ｑ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｓ，６Ｈ）、１．４２−１．２９（ｍ，５Ｈ）、１．２７−１．１５（ｍ，５Ｈ）、１．１４−１．０３（ｍ，１０Ｈ）、０．９４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．６０、１６９．２６、１６５．０７、１６５．０３、１６４．７３、１６３．４８、１５８．１０、１５８．０８、１５８．０７、１５０．２４、１５０．２２、１４４．３９、１４４．３４、１３４．９９、１３４．９７、１３４．８７、１３４．８０、１３３．６３、１３３．３７、１３３．３４、１２９．６５、１２９．６２、１２９．６０、１２９．０７、１２９．０５、１２９．０３、１２８．９０、１２８．８８、１２８．８７、１２８．８３、１２８．５６、１２８．４５、１２７．７５、１２７．５６、１２７．５０、１２６．７４、１１８．７２、１１８．５７、１１３．１０、１１３．０８、１０９．６３、１０９．５４、１００．７６、８５．９２、８５．９０、７１．７２、６９．８４、６８．６１、６７．７８、６１．８９、５４．９１、４９．６０、４５．５３、４２．５３、４２．４２、４２．３１、３８．２３、３８．２１、３４．８８、２９．０５、２９．０２、２８．９６、２８．４５、２６．１７、２５．０８、２５．０４、２４．１８、２４．１３、２４．０９、２４．０３、２２．５５、２１．７１、１９．７１、１９．６６、１９．６２、１１．５１、１１．４９．３１Ｐ ＮＭＲ（１６０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５４．０１、１５３．６５。
Ｃ８０Ｈ９５Ｎ６Ｏ１９ＰについてのＭＳ計算値１４７４．６３９０、実測値ｍ／ｚ １４９７．４（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１５０９．４（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中の０．３９。
実施例６６：
Figure 2020114886
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−５−メチルウリジン（４Ｂ＊）。ＭｅＯＨ（４６ｍｌ）中の３Ｂ（３．６４ｇ、４．６１ｍｍｏｌ 約１ｇ）の溶液に、ヒドラジン（７３８ｍｇ、２３．０４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５．５時間にわたって還流させた。４Ａ＊について記載される後処理手順を用いて、粗製の４Ｂ＊を単離した。アセトニトリルとの同時蒸発により、２．９３ｇの粗製の４Ｂ＊が得られた。
Ｃ３７Ｈ４５Ｎ３Ｏ８についてのＭＳ計算値６５９．３２０７、実測値ｍ／ｚ ６６０．２（Ｍ＋１）＋、６８２．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、６５８．１（Ｍ−１）−、６９４．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．０２。
粗製の４Ｂ＊のＮＭＲ：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．４３−７．１６（ｍ，９Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．７３（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．２９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２−３．８９（ｍ，３Ｈ）、３．４６−３．１５（ｍ，５Ｈ）、２．２４−２．１６（ｍ，１Ｈ）、２．０５（ｓ，１Ｈ）、１．５８−１．１０（ｍ，１３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６３．７３、１５８．０４、１５８．０２、１５０．５８、１４４．４９、１３５．５４、１３５．１８、１３５．０６、１２９．５６、１２７．７８、１２７．５０、１２６．６９、１１３．１１、１０９．２３、８８．４９、８５．７８、８０．４７、７７．２０、７２．０２、６９．６２、６２．８５、５４．９１、５４．９０、４１．４４、３３．１２、２９．１７、２６．１１、２５．３１、１１．６２。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−５−メチルウリジン（４Ｂ）。ＴＥＡ（１．８ｍＬ）で処理されたＤＣＭ（４５ｍＬ）中の４Ｂ＊（２．８５ｇ、４．３２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＧａｌＮＡｃ−ＮＨＳエステル（３．４７ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を２時間撹拌してから、さらなる０．２当量のＧａｌＮＡｃ−ＮＨＳエステルを加えた。１時間後、生成物を、５Ａについて記載されるのと同じように単離した。シリカカラム精製により、３．６２ｇの４Ｂ（２．８４ｍｍｏｌ）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｓ，１Ｈ）、８．００−７．８９（ｍ，５Ｈ）、７．７３−７．４５（ｍ，１１Ｈ）、７．４０−７．３５（ｍ，４Ｈ）、７．３３−７．２０（ｍ，７Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．４２−５．３３（ｍ，２Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８−４．４１（ｍ，２Ｈ）、４．３８−４．２３（ｍ，３Ｈ）、３．９９（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．９１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．８２−３．７６（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６２−３．４７（ｍ，２Ｈ）、３．４１−３．３６（ｍ，１Ｈ）、３．２７−３．１７（ｍ，２Ｈ）、２．９９（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．２８（ｍ，１１Ｈ）、１．２８−１．１５（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７２、１６９．３８、１６５．１９、１６５．１４、１６４．８５、１６３．６４、１６２．２５、１５８．１４、１５０．５５、１４４．５７、１３５．６８、１３５．３０、１３５．１６、１３３．７３、１３３．４５、１２９．６６、１２９．１８、１２９．１４、１２９．００、１２８．９３、１２８．６６、１２８．５５、１２７．８８、１２７．６１、１２６．８０、１１３．２２、１０９．３６、１００．８８、８８．５７、８５．９０、８０．６３、７７．３５、７２．１６、７１．８３、６９．９７、６９．７３、６８．７３、６７．９１、６２．９７、６２．０２、５５．０１、５４．８４、４９．７５、３８．３４、３５．７３、３５．０２、３０．７３、２９．２３、２９．１１、２８．５７、２６．２５、２５．２１、２２．６６、２１．８４、１１．６８．Ｃ７１Ｈ７８Ｎ４Ｏ１８についてのＭＳ計算値１２７４．５３１１、実測値ｍ／ｚ １２９７．４（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３０９．４（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．２４）。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−２’−Ｏ−スクシネート−５−メチルウリジン（５Ｂ）。ＤＣＭ（２０ｍＬ）およびＤＭＡＰ（３１５ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）中の４Ｂ（１．１０ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、無水コハク酸（１７２ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２３時間撹拌し、次に、５Ａについて記載される手順を用いて精製し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、１．０３ｇの５Ｂ（０．７０ｍｍｏｌ、８１％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、４Ｈ）、７．７６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７３−７．５１（ｍ，９Ｈ）、７．４７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０−７．１９（ｍ，１２Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．８５（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．４７−５．４２（ｍ，１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｑ，Ｊ＝９．１、７．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２０（ｍ，４Ｈ）、４．０１−３．９４（ｍ，２Ｈ）、３．８０−３．７６（ｍ，２Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．４０−３．１６（ｍ，１０Ｈ）、３．０７−２．９４（ｍ，３Ｈ）、２．５６（ｑ，Ｊ＝６．２、５．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．４３（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、３Ｈ）、２．０７−２．０１（ｍ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．４８（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ、７Ｈ）、１．４０−１．２７（ｍ，４Ｈ）、１．１６（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．６３、１７３．４５、１７２．７９、１７１．９２、１７１．５２、１６９．５４、１６８．９２、１６５．２９、１６５．２４、１６４．９４、１６３．７８、１５８．２３、１５０．３３、１４４．５７、１３６．１８、１３５．２７、１３５．１８、１３３．８４、１３３．５７、１２９．７７、１２９．２４、１２９．０９、１２９．０６、１２９．０４、１２８．７７、１２８．６５、１２７．９６、１２７．７０、１２６．９０、１１３．２９、１０９．７３、１００．９７、８５．９７、８０．７５、７５．８２、７３．３１、７１．９６、７０．４８、６２．５９、６２．４０、５５．１０、５５．０７、５２．０６、５１．４０、５１．３６、４５．４５、３８．４２、３５．０４、３３．３５、２９．２０、２９．０９、２８．９５、２８．７７、２２．７０、２１．９０、１１．８１、１０．０８、７．２６、７．１７．Ｃ７５Ｈ８１Ｎ４Ｏ２１ −についてのＭＳ計算値１３７４．５４７２、実測値ｍ／ｚ １３９７．４（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３７３．４（Ｍ−１）−．Ｒｆ＝ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ中の０．１８）。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−２’−Ｏ−ＣＰＧ−５−メチルウリジン（６Ｂ）。アセトニトリル（５０ｍＬ）中の５Ｂ（９７０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（４９７ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３３９ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）を加えた。５分間の振とうの後、ＣＰＧ（８．２０ｇ、１３０μｍｏｌ／ｇ、５４０Å）を加え、２１時間にわたって振とうを続けた。ＣＰＧをろ過によって除去し、洗浄し、キャッピングし、充填量を６Ａについて記載されるように決定したところ、５６μｍｏｌ／ｇの平均充填量を有するＣＰＧが得られた。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−アミノヘキシル−Ｃ５−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ−Ｂｚ）−２’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト−５−メチルウリジン（７Ｂ）。４Ｂ（１．９８ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を、７Ａに記載されるのと同じように調製し、同じ試薬で処理した。生成物７Ｂを、７Ａについて記載されるのと同じように準備されたカラム上に充填し、ヘキサン中７０％のＥｔＯＡｃ（４ＣＶ）、ヘキサン中８０％のＥｔＯＡｃ（１０ＣＶ）、１００％のＥｔＯＡｃ（２ＣＶ）、次に、ＤＣＭ中３％のＭｅＯＨ（４ＣＶ）で溶離した。所望の生成物が、１００％のＥｔＯＡｃおよび３％のＭｅＯＨで溶離した。所望の生成物を含有する画分を組み合わせて、減圧下で蒸発させたところ、１．８９ｇ（１．２８ｍｍｏｌ、８３％）の７Ｂが得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３８（ｓ，１Ｈ）、８．００−７．８８（ｍ，５Ｈ）、７．７２−７．４５（ｍ，１１Ｈ）、７．４１−７．３４（ｍ，４Ｈ）、７．３３−７．２０（ｍ，７Ｈ）、６．９１−６．８５（ｍ，４Ｈ）、５．８８（ｄｄ，Ｊ＝９．３、５．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．６２−４．５０（ｍ，１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝８．２、７．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２３（ｍ，２Ｈ）、４．０７−３．９５（ｍ，３Ｈ）、３．７２（ｓ，１３Ｈ）、３．４４−３．３９（ｍ，１Ｈ）、３．３１−３．２２（ｍ，２Ｈ）、２．９８（ｓ，２Ｈ）、２．７１−２．６６（ｍ，１Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．４７（ｄ，Ｊ＝２８．１Ｈｚ、８Ｈ）、１．４０−１．１８（ｍ，８Ｈ）、１．１３−１．００（ｍ，１１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７２、１７１．７０、１７０．３７、１７０．２９、１６９．３７、１６５．１８、１６５．１４、１６４．８５、１６３．５８、１６３．５０、１５８．２０、１５８．１８、１５８．１６、１５８．１４、１５４．８６、１５０．４８、１５０．４３、１４４．５３、１４４．５２、１４４．５０、１３５．１８、１３５．１４、１３５．０５、１３４．９８、１３３．７４、１３３．４８、１３３．４４、１２９．６９、１２９．６６、１２９．６３、１２９．１８、１２９．１６、１２９．１３、１２９．０１、１２８．９９、１２８．９８、１２８．９３、１２８．６７、１２８．６４、１２８．５６、１２８．５４、１２８．５２、１２７．９１、１２７．８８、１２７．５７、１１８．８１、１１８．７０、１１３．２５、１１３．２１、１０９．７２、１０９．６８、１００．８７、８６．１６、８６．１５、８６．０２、７１．８３、７１．８１、６９．９５、６９．９２、６８．７２、６８．７１、６７．８９、６３．４５、５９．７１、５５．００、５４．９８、４９．７２、４２．７９、４２．６９、４２．６４、３８．３５、３８．３３、３５．００、３０．１２、３０．０３、２９．２６、２９．２５、２９．１４、２９．１１、２９．０９、２８．５６、２８．５４、２６．２９、２５．２７、２５．２５、２４．３４、２４．２９、２４．２４、２４．２２、２４．０８、２４．０２、２２．６６、２２．６５、２１．８４、２１．８３、２１．３６、２０．７２、２０．６７、２０．６６、１９．８０、１９．７８、１９．７４、１９．７３、１９．６７、１９．６２、１８．８２、１８．５６、１６．５７、１４．０４、１３．６５、１３．５０、１１．６９、１１．５６、１１．５６、１１．５５、１１．５３．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５５．０８、１５４．６０。Ｃ８０Ｈ９５Ｎ６Ｏ１９ＰについてのＭＳ計算値１４７４．６３９０、実測値ｍ／ｚ １４９７．４（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１４７４．３（Ｍ−１）−、１５０９．４（Ｍ＋３５）Ｃｌ− Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中の０．４３）。
実施例６７：
Figure 2020114886
 Ｃ２４Ｈ２８Ｎ６Ｏ６についてのＬＲＭＳ計算値４９６．５２、実測値ｍ／ｚ ４９７．２（Ｍ＋１）＋、５１９．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、４８６．２（Ｍ−１）−、５２２．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。
（２Ａ／２Ｂ）−アデノシン（２０ｇ、７４．８ｍｍｏｌ）を、２０分間にわたって０℃で、ＤＭＦ（２００ｍｌ）中のＮａＨ（４．５ｇ、１１２ｍｍｏｌ）で処理した。Ｎ−（ヨードヘキシル）フタルイミド（３０．７ｇ、８６ｍｍｏｌ）を溶液に加え、次に、２日間にわたって８０℃に加熱した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させたところ、２’−および３’−Ｏ−アルキル化異性体を含有する薄いオレンジ色のガムが得られた。粗製の混合物を、シリカゲル上に吸着させ、精製したところ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ）、５．１ｇ（１０．３ｍｍｏｌ、１４％）の２Ａならびに位置異性体の混合物が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．３６（ｓ，１Ｈ）、８．１２（ｓ，１Ｈ）、７．９５−７．６８（ｍ，４Ｈ）、７．３２（ｓ，２Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．９６（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．４２（ｔ，Ｊ＝７．１、４．６Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．１５（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．４４（ｔ，Ｊ＝６．３、４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｑ，Ｊ＝４．９、２．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．９６（ｑ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６６（ｄｔ，Ｊ＝１２．２、４．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．６０−３．４２（ｍ，４Ｈ）、３．３０（ｄｄ，Ｊ＝９．５、６．４Ｈｚ、１Ｈ）、１．４１（ｄｔ，Ｊ＝３３．８、６．９Ｈｚ、４Ｈ）、１．２５−１．０４（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．８９、１５０．６８、１４８．２４、１４８．１９、１３４．３５、１３１．５４、１２８．３８、１２７．６１、１２５．４４、１２２．９６、１１８．７４、８６．３９、８６．０３、８１．４９、６９．６６、６８．６４、２８．８５、２７．８１、２５．９３、２４．８４．Ｃ２４Ｈ２８Ｎ６Ｏ６についてのＬＲＭＳ計算値４９６．２０７０、実測値ｍ／ｚ ４９７．２（Ｍ＋１）＋、５１９．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、５３１．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２８。
（３Ａ）−化合物２Ａ（７．４ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）を、ピリジンと同時蒸発させ、次に、アルゴンガス下でピリジン（７５ｍｌ）に溶解させた。トリエチルアミン（３．２ｍｌ、２２．４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（４５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１５分間撹拌した。次に、ＤＭＴｒＣｌ（５．６ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。次に、さらなる１．５ｇのＤＭＴｒＣｌを加えて、反応を完了させた。反応混合物をＭｅＯＨ（５ｍｌ）でクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗生成物を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗生成物を、シリカカラム（２．５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ）によって精製したところ、７．８ｇ（１３ｍｍｏｌ、６６％）の純粋な３Ａが得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２６（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｓ，１Ｈ）、７．８８−７．７７（ｍ，４Ｈ）、７．４２−７．３３（ｍ，２Ｈ）、７．３３−７．１６（ｍ，９Ｈ）、６．８８−６．７８（ｍ，４Ｈ）、６．０１（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１７（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．５６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．３８（ｑ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０６（ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６２−３．３７（ｍ，４Ｈ）、３．３４（ｓ，２Ｈ）、３．２３（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．６０−１．３７（ｍ，４Ｈ）、１．３１−１．１１（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．９０、１５８．０２、１５６．０８、１５２．６３、１４９．２１、１４４．８５、１３９．５８、１３５．５５、１３５．４５、１３４．３１、１３１．５７、１２９．７０、１２７．７５、１２７．６８、１２６．６２、１２２．９５、１１９．２０、１１３．１０、８５．９７、８５．４９、８３．４８、８０．１０、６９．７６、６９．１２、６３．５３、２８．９２、２７．８５、２５．９９、２４．９１．Ｃ４５Ｈ４６Ｎ６Ｏ８についてのＬＲＭＳ計算値７９８．３３７７、実測値ｍ／ｚ ７９９．２（Ｍ＋１）＋、８２１．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、８３３．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ− Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３３。
（４Ａ）−化合物３（１３ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１６０ｍｌ）に溶解させ、ヒドラジン（２．６ｇ、８１ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。反応混合物を３時間にわたって還流状態で撹拌した。ＴＬＣ分析は、３Ａの完全な消失およびより極性のスポット、おそらく４Ａ＊の出現を示した。ＭｅＯＨを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体をＮＨ４ＯＨで洗浄した。水層をＤＣＭで抽出し；エマルジョンを除去するために飽和ＮａＣｌが必要とされた。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。４Ａ＊をトルエンと同時蒸発させてから、ＤＣＭ（１５０ｍｌ）およびトリエチルアミン（６．６ｍｌ、４７．６ｍｍｏｌ）に溶解させた。ＧａｌＮＡｃ（ＯＢｚ）−Ｃ５−ＮＨＳエステル（１２．８ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）を混合物に加え、反応を室温で２時間継続した。さらなる１．７ｇ、２．４ｍｍｏｌのＧａｌＮＡｃ（ＯＢｚ）−Ｃ５−ＮＨＳエステルを反応物に加え、さらに２時間撹拌させた。反応混合物を減圧下で蒸発させ、粗生成物をＮａＨＣＯ３で洗浄した。水層をＤＣＭで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗製の４Ａをシリカに吸着させ、精製したところ（２．５〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ）、１６．７ｇ（１３．１ｍｍｏｌ、８１％）の４Ａが得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２６（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｓ，１Ｈ）、８．０２−７．８５（ｍ，５Ｈ）、７．７６−７．４５（ｍ，１０Ｈ）、７．４４−７．１７（ｍ，１３Ｈ）、６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．８、５．１Ｈｚ、４Ｈ）、６．０１（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．７８−５．７４（ｍ，１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５７（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．４６（ｑ，Ｊ＝８．６、７．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．４１−４．２３（ｍ，３Ｈ）、４．０７（ｑ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５−３．７６（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５５（ｄｄｄ，Ｊ＝２４．２、９．５、５．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．４６−３．３８（ｍ，１Ｈ）、３．２３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．９７（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５８−１．３６（ｍ，６Ｈ）、１．３３−１．１２（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．６９、１６９．３８、１６５．２０、１６５．１５、１６４．８５、１５８．００、１５６．０７、１５２．６２、１４９．１９、１４４．８２、１３９．５８、１３５．５３、１３５．４２、１３３．７７、１３３．５１、１３３．４７、１２９．６８、１２９．１９、１２９．１６、１２９．０２、１２９．００、１２８．９７、１２８．６９、１２８．５９、１２７．７３、１２７．６５、１２６．６１、１１９．１８、１１３．０８、１００．８８、８５．９４、８５．４７、８３．４９、８０．０８、７１．８４、６９．９６、６９．８０、６９．１０、６８．７５、６７．９１、６３．５３、６２．０２、５４．９８、５４．８９、４９．７３、３５．０１、２９．１１、２９．０３、２８．５８、２６．１７、２５．０５、２２．６９、２１．８３．Ｃ３７Ｈ４４Ｎ６Ｏ６についてのＬＲＭＳ計算値６６８．３３２２、実測値ｍ／ｚ ６９１．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、７０３．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−（４Ａ＊）．Ｃ７１Ｈ７７Ｎ７Ｏ１６についてのＬＲＭＳ計算値１２８３．５４２７、実測値ｍ／ｚ １３０６．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１２８２．３（Ｍ−１）−、１３１８．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−（４Ａ）．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．００（４Ａ＊）．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２４（４Ａ）。
（５Ａ）−化合物４Ａ（１６ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（７．４ｇ、６２．３ｍｍｏｌ）を撹拌している溶液に加えた。反応混合物を３時間にわたって６０℃に加熱してから、ＤＭＦを減圧下で除去した。微量の出発材料を、シリカゲルカラム（２．５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ）によって除去したところ、１２．５ｇ（９．３ｍｍｏｌ、７５％）の５Ａが得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８８（ｓ，１Ｈ）、８．３５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．９８−７．８８（ｍ，５Ｈ）、７．５９（ｄｄｔ、Ｊ＝６０．０、３０．９、７．５Ｈｚ、１１Ｈ）、７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１６．２、８．２Ｈｚ、４Ｈ）、７．２１（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、８Ｈ）、６．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．８、７．２Ｈｚ、４Ｈ）、６．０５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５８（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｑ，Ｊ＝８．３、７．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９−４．２２（ｍ，３Ｈ）、４．０６（ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｄｄ，Ｊ＝９．９、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５３（ｄｔｄ、Ｊ＝１９．４、９．５、５．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．４０（ｄｔ，Ｊ＝９．４、６．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２２（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、３．１１（ｓ，３Ｈ）、２．９３（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｓ，２Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．５３−１．３６（ｍ，７Ｈ）、１．３０−１．０８（ｍ，７Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．６８、１６９．３８、１６５．１９、１６５．１５、１６４．８５、１５９．２３、１５８．０１、１５７．９８、１５７．９１、１５１．９３、１５１．１９、１４４．８０、１４１．３９、１３５．４９、１３５．４４、１３３．７６、１３３．４９、１３３．４６、１２９．６８、１２９．６３、１２９．１８、１２９．１７、１２９．１５、１２９．０２、１２９．００、１２８．９９、１２８．９６、１２８．６８、１２８．５８、１２７．７３、１２７．６５、１２６．６１、１２５．７６、１１８．０３、１００．８８、８５．９７、８５．４７、８３．５９、８０．０１、７１．８４、６９．９６、６９．７９、６９．１１、６８．７４、６７．９０、６３．５４、６２．５１、６２．０２、５４．９７、５４．９５、５４．８８、５１．９７、４９．７２、４５．６２、３５．００、３４．５２、２９．０７、２９．００、２８．５７、２６．１４、２５．０３、２２．６８、２１．８３、７．１５．Ｃ７４Ｈ８２Ｎ８Ｏ１６についてのＬＲＭＳ計算値１３３８．５８４９、実測値ｍ／ｚ １３３９．４（Ｍ）、１３６１．４（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３３８．４（Ｍ−１）−、１３７３．４（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２９。
（６Ａ）−化合物５Ａ（２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍｌ）に溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（５５０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）を撹拌している混合物に加えた。無水コハク酸（３００ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で３時間撹拌した。ＤＣＭを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を、ＤＣＭ中２％のトリエチルアミン（ｖ／ｖ）で前処理された手動のカラム（φ＝４．６×１７）上に充填した。１〜５％のＭｅＯＨ／２〜５％のトリエチルアミン／ＤＣＭ ｖ／ｖの勾配を用いて、６Ａを精製した。６Ａが、定量的収率で３％のＭｅＯＨ／３％のトリエチルアミン／ＤＣＭ ｖ／ｖになった。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８９（ｓ，１Ｈ）、８．４２（ｓ，１Ｈ）、８．３０（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ、４Ｈ）、７．７５−７．６５（ｍ，４Ｈ）、７．６５−７．５３（ｍ，４Ｈ）、７．４７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１３．９、７．３Ｈｚ、４Ｈ）、７．２１（ｔｄ、Ｊ＝１２．２、１０．６、５．５Ｈｚ、７Ｈ）、６．８２（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、４Ｈ）、６．０４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．４５−５．４１（ｍ，１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．０８−５．０２（ｍ，１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８−４．３９（ｍ，３Ｈ）、４．３８−４．１９（ｍ，５Ｈ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｓ，６Ｈ）、３．５０（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、２Ｈ）、３．４０−３．２６（ｍ，６Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、３．１１（ｓ，３Ｈ）、２．５９（ｑ，Ｊ＝６．８、６．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．０３（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｓ，４Ｈ）、１．３４−１．１６（ｍ，６Ｈ）、１．０８−０．９７（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．３５、１７１．７３、１７１．４８、１６９．３９、１６５．２０、１６５．１４、１６４．８５、１５９．３３、１５８．０６、１５８．０３、１５７．９６、１５１．９４、１５１．２２、１４４．６８、１４１．８１、１３５．３１、１３３．７５、１３３．４８、１３３．４５、１２９．６９、１２９．６１、１２９．１７、１２９．１６、１２９．１４、１２９．０１、１２８．９８、１２８．９５、１２８．６８、１２８．５７、１２７．７５、１２７．６１、１２６．６６、１２５．８６、１１３．１１、１００．８８、８５．８２、８５．６９、８１．３９、７７．４５、７１．８９、７１．０１、７０．１９、６９．９６、６８．７０、６７．８９、６３．２８、６２．０４、５４．９８、５４．９６、５２．０１、４９．７１、３４．９５、３４．５４、２９．００、２８．９２、２８．８５、２８．８１、２８．５３、２６．０５、２４．９５、２２．６７、２１．８０、７．１８．Ｃ７８Ｈ８６Ｎ８Ｏ１９についてのＬＲＭＳ計算値１４３８．６００９、実測値ｍ／ｚ １４３９．４（Ｍ）、１４６３．４（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１４３７．４（Ｍ−１）−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／５％のＥｔ３Ｎ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２３。
（７Ａ）−化合物６Ａ（２．２ｇ、１．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１１０ｍｌ）に溶解させ、ＨＢＴＵ（１．１ｇ、２．９ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５５０ｍｇ、４．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５分間にわたって振とうし、次に、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１８ｇ、５４０Å、１３０μｍｏｌ／ｇ）を加え、室温で一晩振とうした。ＣＰＧをろ過し、それぞれ３００ｍｌのＤＣＭ、２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させた。ＣＰＧを、無水酢酸（２５ｍｌ）、ピリジン（７５ｍｌ）、およびトリエチルアミン（１ｍｌ）中で１時間にわたって振とうしてから、前述されるのと同じ条件によって再度洗浄した。化合物７Ａを減圧下で一晩乾燥させ、充填量を、分光光度計（７２μｍｏｌ／ｇ）によって測定した。
（８Ａ）−化合物５Ａ（１．０ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を、ＡＣＮと２回同時蒸発させ、完全なアルゴン雰囲気下に置いた。ＤＣＭ（７．５ｍｌ）をフラスコに加え、０℃に冷却してから、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４５０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２０分間撹拌し、次に、４，５−ジシアノイミダゾール（９０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を反応物に加えた。反応物を、一晩、ゆっくりと室温に温めた。反応物を飽和重炭酸塩で洗浄し、水層をＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。発泡体を、２％のトリエチルアミン／４９％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖで準備された、前処理された手動のカラム（φ＝４．６×１７）上に充填した。不純物を、８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖ（８ＣＶ）、続いて１００％のＥｔＯＡｃ（８ＣＶ）で溶離した。次に、８Ａを、２％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ（５ＣＶ）、および４％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ（８ＣＶ）で溶離した。８Ａを減圧下で蒸発させたところ、９００ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ、７８％）のアミダイトがジアステレオマー混合物として得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．４１（ｓ，１Ｈ）、８．３２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．７５−７．５２（ｍ，８Ｈ）、７．４７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３６（ｄｔ，Ｊ＝１２．４、７．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．２１（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、７Ｈ）、６．８１（ｑ，Ｊ＝７．７、７．１Ｈｚ、４Ｈ）、６．０６（ｄｄ，Ｊ＝８．８、５．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．８４（ｑ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３（ｄｄ，Ｊ＝１０．１、５．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９−４．４１（ｍ，２Ｈ）、４．３８−４．１５（ｍ，３Ｈ）、３．８０（ｄｄ，Ｊ＝１７．４、８．２Ｈｚ、３Ｈ）、３．７０（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ、７Ｈ）、３．６７−３．１９（ｍ，１４Ｈ）、３．１７（ｓ，３Ｈ）、３．１１（ｓ，３Ｈ）、２．７７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．６０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．０３（ｓ，２Ｈ）、１．９０（ｓ，１Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｓ，４Ｈ）、１．４３−１．３４（ｍ，２Ｈ）、１．２３（ｄｔ，Ｊ＝１４．６、６．６Ｈｚ、３Ｈ）、１．０１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７２．００、１７１．７０、１６９．３９、１６５．２０、１６５．１６、１６４．８７、１５９．２９、１５８．０５、１５８．０３、１５７．９３、１５１．８９、１５１．８３、１５１．１３、１５１．０５、１４４．７３、１４４．６９、１４１．９７、１４１．７２、１３５．４２、１３５．３４、１３３．７５、１３３．４９、１３３．４５、１２９．７０、１２９．６６、１２９．６２、１２９．２０、１２９．１６、１２９．０２、１２８．９５、１２８．８０、１２８．６８、１２８．５７、１２７．６９、１２７．６２、１２６．６３、１２５．９３、１２５．８５、１１８．８６、１１８．６７、１１３．０５、１００．８９、８６．４０、８６．１３、８５．６２、８５．５９、８２．８８、８２．６５、７８．９２、７８．７５、７１．８４、７１．０１、７０．５４、７０．３７、７０．０６、６９．９８、６９．８８、６８．７３、６７．９１、６３．００、６２．８３、６２．０３、５８．８３、５８．６５、５８．２２、５８．０３、５４．９６、５４．８６、４９．７４、４６．１２、４５．６５、４２．７４、４２．６２、４２．５８、４２．４６、４０．６２、３８．３０、３４．９９、３４．５２、２９．０６、２８．９７、２８．５７、２６．１８、２５．０９、２５．０６、２４．３７、２４．２９、２４．２３、２４．１６、２２．６７、２１．８３、２１．０５、１９．８９、１９．８２、１９．７８、１９．７１、１９．０７、１０．５７．３１Ｐ ＮＭＲ（１６０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５４．０９、１５３．８８．Ｃ８３Ｈ９９Ｎ１０Ｏ１７ＰについてのＬＲＭＳ計算値１５３８．６９２７、実測値ｍ／ｚ １５３９．３（Ｍ）、１５６２．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１５７３．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３５。
実施例６８：
Figure 2020114886
（３Ｂ）−２Ａおよび２Ｂの混合物（１２ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）を、上述されるのと同じように再度精製して、２’−Ｏ−アルキル化異性体をできる限り多く除去した。主に２Ｂ（２．８ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を含有する混合物を、化合物２Ａと同じようにトリチル化したところ、２．６ｇの３Ｂ（３．３ｍｍｏｌ、５８％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２６（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｓ，１Ｈ）、７．８２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、４Ｈ）、７．３４−７．１５（ｍ，１１Ｈ）、６．８０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．８９（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．４６（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．８４（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．１４（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．０９−４．０３（ｍ，１Ｈ）、３．６９（ｓ，６Ｈ）、３．６１−３．５１（ｍ，３Ｈ）、３．１５（ｄｄ，Ｊ＝１０．１、４．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．５８−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．２５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．９２、１５８．０１、１５６．０６、１５２．５９、１４９．２５、１４４．７８、１３９．５７、１３５．４７、１３４．３３、１３１．５８、１２９．６３、１２７．７３、１２７．６２、１２６．６１、１２２．９５、１１９．１６、１１３．０８、８８．２２、８５．４８、８０．８３、７７．６４、７１．７０、６９．５８、６３．０９、５４．９６、５２．００、３７．３２、２９．０５、２７．８８、２６．０７、２５．０６、７．１５．Ｃ４５Ｈ４６Ｎ６Ｏ８についてのＬＲＭＳ計算値７９８．３３７７、実測値ｍ／ｚ ７９９．２（Ｍ＋１）＋、８２１．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３０。
（４Ｂ）−化合物３Ｂを、化合物３Ａと同様の方法で脱保護したところ、粗製の４Ｂ＊が得られた。次に、粗製の４Ｂ＊を、３Ａ＊に上述されるようにＧａｌＮＡｃ誘導体に結合したところ、２．５ｇの４Ｂ（１．９ｍｍｏｌ、８０％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２７（ｓ，１Ｈ）、８．１０（ｓ，１Ｈ）、８．０３−７．８８（ｍ，５Ｈ）、７．７５−７．４４（ｍ，１０Ｈ）、７．４２−７．１６（ｍ，１３Ｈ）、６．８２（ｄｄ，Ｊ＝８．９、２．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．９０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．４７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．８７（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５０−４．４１（ｍ，２Ｈ）、４．３９−４．２２（ｍ，２Ｈ）、４．１５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．０７（ｑ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８４−３．７５（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．６４−３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．５１（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．４５−３．３８（ｍ，１Ｈ）、３．２７（ｄｄ，Ｊ＝１０．４、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．４、４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．００（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５１（ｓ，６Ｈ）、１．４０−１．１８（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７４、１６９．４１、１６５．２１、１６５．１６、１６４．８７、１５８．０１、１５６．０５、１５２．５８、１５２．５７、１４９．２５、１４４．７６、１３９．５８、１３９．５６、１３５．４８、１３５．４６、１３３．７８、１３３．５２、１３３．４８、１２９．６２、１２９．１９、１２９．１７、１２９．０４、１２９．００、１２８．９９、１２８．９７、１２８．７０、１２８．６０、１２７．７５、１２７．６２、１２６．６３、１１９．１５、１１３．０９、１００．９０、８８．１６、８５．４９、８０．８６、７７．７０、７１．８５、７１．７１、６９．９６、６９．６６、６８．７７、６７．９１、６３．１１、６２．０２、５４．９７、４９．７３、３５．０３、２９．２４、２９．１７、２８．５９、２６．３０、２５．２５、２２．７０、２１．８７．Ｃ３７Ｈ４４Ｎ６Ｏ６についてのＬＲＭＳ計算値６６８．３３２２実測値ｍ／ｚ ６９１．２（Ｍ＋１）＋、７０３．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−（４Ｂ＊）．Ｃ７１Ｈ７７Ｎ７Ｏ１６についてのＬＲＭＳ計算値１２８３．５４２７、実測値ｍ／ｚ １３０６．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１２８２．２（Ｍ−１）−、１３１８．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２０。
（５Ｂ）−化合物４Ｂ（２．５ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を、化合物４Ａと同じように保護したところ、２．０ｇの５Ｂ（１．５ｍｍｏｌ、７７％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８９（ｓ，１Ｈ）、８．３７（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ）、８．０３−７．８７（ｍ，５Ｈ）、７．７３−７．４５（ｍ，１０Ｈ）、７．４０−７．２９（ｍ，４Ｈ）、７．２１（ｄｄ，Ｊ＝１５．７、８．２Ｈｚ、７Ｈ）、６．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．８、４．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．９５（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．５０（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．９０（ｑ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝８．１、７．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９−４．２３（ｍ，２Ｈ）、４．１５（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．０８（ｑ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８４−３．７５（ｍ，１Ｈ）、３．７０（ｓ，６Ｈ）、３．６５−３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．５４−３．４７（ｍ，１Ｈ）、３．１７（ｓ，４Ｈ）、３．１１（ｓ，３Ｈ）、３．００（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５７−１．４３（ｍ，６Ｈ）、１．４０−１．１９（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７７、１６９．４２、１６５．２１、１６５．１７、１６４．８８、１５９．２１、１５８．０２、１５８．００、１５７．９２、１５１．９０、１５１．２７、１４４．７４、１４１．４７、１３５．５１、１３５．４６、１３３．７８、１３３．５２、１３３．４８、１２９．６３、１２９．５８、１２９．１９、１２９．１７、１２９．０４、１２９．００、１２８．９７、１２８．７０、１２８．６０、１２７．７５、１２７．６３、１２６．６５、１２５．７６、１１３．０９、１００．９０、８８．２３、８５．４９、８０．９５、７７．７５、７１．８６、７１．６５、６９．９８、６９．６９、６８．７７、６７．９２、６３．１５、６２．０４、５４．９７、４９．７５、４５．６８、４０．６４、３５．０４、３４．５４、２９．２３、２９．１６、２８．６０、２６．３０、２５．２４、２２．７０、２１．８８、１１．３５．Ｃ７４Ｈ２８２Ｎ８Ｏ１６についてのＬＲＭＳ計算値１３３８．５８４９、実測値ｍ／ｚ １３４１．３（Ｍ＋１）＋、１３６１．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３３７．４（Ｍ−１）−、１３７３．４（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４０。
（６Ｂ）−化合物５Ｂ（５００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を、化合物５Ａと同じように無水コハク酸で処理したところ、５４０ｍｇの６Ｂ（０．３５ｍｍｏｌ、９４％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．９０（ｓ，１Ｈ）、８．４２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ、２Ｈ）、８．０６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、４Ｈ）、７．７７−７．４５（ｍ，１０Ｈ）、７．３７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０−７．１０（ｍ，９Ｈ）、６．８５−６．７３（ｍ，４Ｈ）、６．１９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．１２−６．０４（ｍ，１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．７０−４．６３（ｍ，１Ｈ）、４．４９−４．４０（ｍ，２Ｈ）、４．４０−４．２３（ｍ，３Ｈ）、４．１０−４．０３（ｍ，１Ｈ）、３．８３−３．７６（ｍ，２Ｈ）、３．６９（ｓ，６Ｈ）、３．５４−３．４８（ｍ，２Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、３．１１（ｓ，４Ｈ）、２．９８（ｑ，Ｊ＝６．４、５．５Ｈｚ、３Ｈ）、２．８０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）、２．５７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５０（ｓ，４Ｈ）、１．４１（ｓ，２Ｈ）、１．３３（ｓ，２Ｈ）、１．２６−１．１４（ｍ，７Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７４．１７、１７２．７１、１７２．３７、１７０．３４、１６６．１４、１６６．０９、１６５．８０、１６０．２４、１５８．９３、１５８．９１、１５８．８８、１５２．９９、１５１．８３、１４５．５６、１４２．７９、１３６．４０、１３６．２６、１３４．７１、１３４．４５、１３４．４１、１３０．５１、１３０．４６、１３０．１０、１２９．９７、１２９．９５、１２９．９３、１２９．９０、１２９．６４、１２９．５３、１２８．６５、１２８．５２、１２７．５６、１２６．６５、１１３．９９、１０１．８４、８７．２８、８６．３１、８１．７１、７６．７３、７３．８６、７２．８２、７１．２３、７０．９０、６９．６８、６８．８４、６３．４７、６２．９７、５５．８９、５２．９２、５０．６６、４６．３５、３５．９３、３５．４９、３０．０６、２９．７４、２９．６７、２９．５０、２７．１８、２６．１２、２３．６２、２２．７８、１０．５５、８．１１．Ｃ７８Ｈ８６Ｎ８Ｏ１９についてのＬＲＭＳ計算値１４３８．６００９．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／５％のＥｔ３Ｎ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３８。
（７Ｂ）−化合物６Ｂ（５１０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、６Ａと同じようにＬＣＡＡ−ＣＰＧ上に充填したところ、４．１ｇのＣＰＧ（７１μｍｏｌ／ｇ）が得られた。
（８Ｂ）−化合物５Ｂ（１．４ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を、化合物５Ａと同じようにホスフィチル化したところ、１．２ｇのアミダイト８Ｂ（０．７８ｍｍｏｌ、７３％）がジアステレオマー混合物として得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８８（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．４１−８．３０（ｍ，２Ｈ）、７．９８−７．８９（ｍ，５Ｈ）、７．７２−７．４５（ｍ，１１Ｈ）、７．４１−７．２９（ｍ，４Ｈ）、７．２９−７．１４（ｍ，８Ｈ）、６．８４−６．７８（ｍ，４Ｈ）、６．０９（ｄｄ，Ｊ＝２８．１、４．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７−５．１４（ｍ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｑ，Ｊ＝７．３、６．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．３７−４．２２（ｍ，３Ｈ）、４．１４−４．０９（ｍ，１Ｈ）、３．８１−３．７２（ｍ，２Ｈ）、３．７０（ｓ，６Ｈ）、３．５６−３．３５（ｍ，６Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、３．１２−３．１０（ｍ，３Ｈ）、３．０３−２．９６（ｍ，３Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５０（ｓ，６Ｈ）、１．３８−１．１９（ｍ，７Ｈ）、１．０４（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、９Ｈ）、０．７５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７１、１６９．３６、１６５．１７、１６５．１３、１６４．８４、１５９．１８、１５８．０１、１５７．８６、１５１．８０、１５１．１３、１４４．６８、１４４．６４、１４１．６２、１３５．４１、１３５．３８、１３３．７３、１３３．４５、１３３．４２、１２９．５７、１２９．１４、１２９．００、１２８．９２、１２８．６５、１２８．５５、１２７．７２、１２７．５８、１２６．６３、１２５．８２、１２５．７８、１１８．７５、１１８．５６、１１３．０６、１００．８８、８７．４８、８７．１２、８５．５５、８５．４７、８１．２８、８０．９５、７７．３６、７７．０２、７３．４５、７３．３４、７２．８１、７２．６７、７１．８３、６９．９６、６９．７４、６８．７３、６７．９０、６２．７４、６２．５７、６２．０１、５８．７３、５８．５９、５８．１５、５８．００、５４．９４、５４．８５、４９．７４、４２．７５、４２．６６、４２．５０、４２．４０、３５．０２、３４．５２、２９．２４、２９．１４、２８．５７、２６．３１、２５．２８、２４．２６、２４．２０、２４．１４、２３．７８、２３．７３、２２．６６、２１．８５、１９．７７、１９．７２、１９．５５、１９．４９．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５４．９２、１５４．６９．Ｃ８３Ｈ９９Ｎ１０Ｏ１７ＰについてのＬＲＭＳ計算値１５３８．６９２７、実測値ｍ／ｚ １５３９．３（Ｍ＋１）＋、１５６２．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１５７３．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２５。
実施例６９：
Figure 2020114886
 Ｃ２４Ｈ２８Ｎ６Ｏ６についてのＬＲＭＳ計算値４９６．５２、実測値ｍ／ｚ ４９７．２（Ｍ＋１）＋、５１９．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、４８６．２（Ｍ−１）−、５２２．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。
（２Ａ／２Ｂ）−化合物１（２．０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を、６時間にわたってＤＭＦ（１０ｍｌ）中のＮ−（６−ブロモヘキシル）フタルイミド（２．６ｇ、８．４ｍｍｏｌ）の存在下でマイクロ波にかけた（１００℃、２００Ｗ）。ＮａＩ（１２５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を用いて、反応を加速させた。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、粗製のガムをシリカに吸着させ、４０ｇの金カラムを用いて精製した。２Ａ、ならびに３’−Ｏ−アルキル化異性体２Ｂが、ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ ｖ／ｖとともに溶離した。６７０ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ、３３％）の位置異性体混合物を、１Ｈ ＮＭＲによって約１対１の比率で収集した。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３１（ｓ，２Ｈ）、７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８−７．８１（ｍ，７Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．７３（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．１、１．９Ｈｚ、２Ｈ）、５．３０（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、５．０３（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｑ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０７（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９０（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．７５（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．６８−３．４９（ｍ，９Ｈ）、３．４３（ｄｄ，Ｊ＝１７．９、９．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．６５−１．４３（ｍ，７Ｈ）、１．３９−１．２１（ｍ，７Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７０．７１、１７０．６９、１６５．８７、１６５．８２、１５３．４８、１５３．２７、１４３．３２、１４３．１４、１３７．１２、１３４．３６、１２５．７５、１０４．５３、１０４．４４、９０．８１、８８．９３、８７．８２、８５．５３、８３．８５、８０．１７、７５．４０、７２．４３、７２．３３、７１．０９、６３．５０、６３．２２、５７．６８、４８．５４、４０．１３、４０．０９、３１．９５、３１．７２、３０．６８、２８．８９、２８．８１、２７．９０、２７．７１．Ｃ２３Ｈ２７Ｎ３Ｏ８についてのＬＲＭＳ計算値４７３．１７９８、実測値ｍ／ｚ ４７４．１（Ｍ＋１）＋、４７２．０（Ｍ−１）−、５０８．０（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４０。
（３Ａ／３Ｂ）−化合物２Ａおよび２Ｂの混合物（６５０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、最初にピリジンと同時蒸発させて、微量の水を除去した。次に、ヌクレオシド混合物をピリジン（１４ｍｌ）中で０℃に冷却してから、ＤＭＴｒＣｌ（５１０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、一晩、室温に温めた。さらなる０．２当量のＤＭＴｒＣｌを加え、反応混合物を４時間撹拌してから、さらに０．２当量のＤＭＴｒＣｌを加えた。次に、反応物を２時間撹拌し、ＭｅＯＨでクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗製の混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＤＣＭで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合物をカラム（４０ｇの金）上に充填し、６０〜７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖで溶離したところ、３１０ｍｇ（０．３４ｍｍｏｌ、２９％）の３Ａおよび３４０ｍｇ（０．４４ｍｍｏｌ、３２％）の３Ｂが得られた。
３Ａ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｓ，１Ｈ）、７．８９−７．７６（ｍ，４Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０−７．２８（ｍ，４Ｈ）、７．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．８、２．１Ｈｚ、５Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、４Ｈ）、５．７７（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．０９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７−３．９２（ｍ，１Ｈ）、３．９０−３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．６１−３．４９（ｍ，４Ｈ）、３．３０−３．１７（ｍ，２Ｈ）、１．６０−１．４６（ｍ，４Ｈ）、１．３４−１．２２（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．８７、１６２．９２、１５８．１０、１５８．０９、１５０．２２、１４４．６０、１４０．１５、１３５．３１、１３５．０４、１３４．２８、１３１．５５、１２９．７３、１２７．８５、１２７．６６、１２６．７５、１２２．９２、１１３．２２、１１３．２０、１０１．４３、１０１．４０、８７．１１、８７．０９、８５．８４、８２．５６、８０．７９、６９．７１、６８．４３、６２．５８、５５．０２、５５．００、２８．８８、２７．８６、２６．０１、２４．９２．Ｃ４４Ｈ４５Ｎ３Ｏ１０についてのＬＲＭＳ計算値７７５．３１０５、実測値ｍ／ｚ ７９８．０（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、７７４．２（Ｍ−１）−、８１０．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−（３Ａ）．Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン ｖ／ｖ（３Ａ）中の０．２８
３Ｂ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３４（ｓ，１Ｈ）、７．８８−７．７１（ｍ，５Ｈ）、７．３８−７．１８（ｍ，９Ｈ）、６．８７（ｄｄ，Ｊ＝８．８、１．５Ｈｚ、４Ｈ）、５．６８（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．４０（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．２９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｑ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９２−３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５４（ｑ，Ｊ＝８．２、７．２Ｈｚ、３Ｈ）、３．３４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．３０−３．１８（ｍ，２Ｈ）、１．５８−１．４０（ｍ，４Ｈ）、１．２８−１．１９（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．９０、１６３．０２、１５８．１１、１５０．４１、１４４．５９、１４０．４５、１３５．２６、１３５．０９、１３４．３３、１３１．５７、１２９．７２、１２７．８７、１２７．６５、１２６．７８、１２２．９５、１１３．２１、１０１．３４、８９．４１、８５．９２、８０．３５、７６．７０、７２．０１、６９．５６、６３．４７、６２．３５、５５．０１、３７．３２、３０．１５、２９．０３、２７．８７、２６．０７、２５．０７、１８．５９．Ｃ４４Ｈ４５Ｎ３Ｏ１０についてのＬＲＭＳ計算値７７５．３１０５、実測値ｍ／ｚ ７９８．０（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、７７４．２（Ｍ−１）−、８１０．０（Ｍ＋３５）Ｃｌ−（３Ｂ）．Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン ｖ／ｖ中の０．１６（３Ｂ）。
（４Ａ）−化合物３Ａ（１．０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をピリジン（４．５ｍｌ）に溶解させ、イミダゾール（２６０ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１０分間撹拌してから、ＴＢＳＣｌ（２９０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加え、次に、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応をＭｅＯＨでクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗生成物を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＤＣＭで抽出した。有機層を、シリカゲル精製の前にＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。生成物４Ａが、３５〜４５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖで溶離して、１．０ｇの生成物（１．１ｍｍｏｌ、８７％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｓ，１Ｈ）、７．８９−７．７６（ｍ，５Ｈ）、７．３９−７．２７（ｍ，４Ｈ）、７．２７−７．１８（ｍ，５Ｈ）、６．９３−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ）、５．２７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．２８−４．２１（ｍ，１Ｈ）、３．８９（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ、６Ｈ）、３．６２−３．４９（ｍ，３Ｈ）、３．４６−３．３５（ｍ，２Ｈ）、３．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．９、３．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．６０−１．４２（ｍ，４Ｈ）、１．２６（ｄｄ，Ｊ＝１５．９、８．０Ｈｚ、４Ｈ）、０．７１（ｓ，９Ｈ）、−０．０６（ｄ，Ｊ＝２８．２Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ１７３．２６、１６８．４４、１６３．５８、１５５．５５、１４９．７５、１４５．７４、１４０．４９、１４０．３０、１３９．６８、１３６．９４、１３５．１９、１３５．１５、１３３．２２、１３３．１２、１３２．２４、１２８．３２、１１８．５８、１１８．５６、９１．３９、８７．５７、８５．９７、７５．０１、７４．８８、６０．４３、６０．４２、４２．７０、３４．５０、３３．２９、３１．４６、３０．８２、３０．５４、２２．９６、０．５８、０．００．Ｃ５０Ｈ５９Ｎ３Ｏ１０ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値８８９．３９７０、実測値ｍ／ｚ ９１２．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、８８８．３（Ｍ−１）−、９２５．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン ｖ／ｖ中の０．７２。
（５Ａ）−１，２，４−トリアゾール（９．１ｇ、１３１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍｌ）に加え、０℃に冷却した。ＰＯＣｌ３（４．６ｇ、３０．２ｍｍｏｌ）を加えて、均一な溶液を形成した。０℃で２０分後、Ｅｔ３Ｎ（１３．２ｇ、１３１ｍｍｏｌ）を加えたところ、Ｅｔ３ＮＨＣｌ塩が形成された。別個のフラスコ中で、化合物４Ａ（１１．７ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８０ｍｌ）に溶解させ、トリアゾールを含むフラスコにゆっくりと加え、３時間撹拌させた。アセトニトリルを減圧下で除去し、得られた粗製の発泡体をＥｔＯＡｃに溶解させた。塩をろ過して取り除き、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次に、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ＥｔＯＡｃを減圧下で除去したところ、５Ａ＊が淡黄色の発泡体として得られた。
Ｃ５２Ｈ６０Ｎ６Ｏ９ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値９４０．４１９１、実測値ｍ／ｚ ９６３．０（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、９４０．２（Ｍ−１）−、９７５．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖ中の０．５０。
次に、５Ａ＊をジオキサン（１３２ｍｌ）に溶解させ、ＮＨ４ＯＨ（３３ｍｌ、２８％ｗ／ｖ）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。ジオキサンを減圧下で排出し、粗生成物を水で洗浄し、ＤＣＭで抽出した。塩水を用いて、エマルジョンを除去した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、精製したところ（２．５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離した）、８．４ｇの５Ａ（９．４ｍｍｏｌ、７２％）が得られた。粗ＬＣＭＳにより、いくらかのフタルイミド損傷が起こったことが示唆された（Ｃ５０Ｈ６３Ｎ５Ｏ９ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値９０６．１５、実測値ｍ／ｚ ９２８．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、９０４．２（Ｍ−１）−、９４１．０（Ｍ＋３５）Ｃｌ−）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．８７−７．７４（ｍ，４Ｈ）、７．４０−７．１５（ｍ，１１Ｈ）、６．９２−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．８０（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．５０（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｄｄ，Ｊ＝７．６、５．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，８Ｈ）、３．５３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．４５−３．４０（ｍ，２Ｈ）、３．１２（ｄｄ，Ｊ＝１０．９、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、１．６２−１．４１（ｍ，４Ｈ）、１．３６−１．２０（ｍ，５Ｈ）、０．６９（ｓ，９Ｈ）、−０．０５（ｓ，３Ｈ）、−０．１３（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．９０、１６５．５３、１５８．２１、１５４．７０、１４４．３７、１４０．６４、１３５．１５、１３５．０６、１３４．３２、１３１．５７、１２９．７８、１２９．７４、１２７．８４、１２７．７８、１２６．８８、１２２．９６、１１３．２１、１１３．１８、８５．９３、８１．５９、８１．３８、６９．５５、５５．０７、５５．０６、３７．３７、２９．２３、２７．９５、２６．１６、２５．４３、２５．２７、１７．５９、−４．８０、−５．３８．Ｃ５０Ｈ６０Ｎ４Ｏ９ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値８８８．４１３０、実測値ｍ／ｚ ８８９．０（Ｍ＋１）＋、９１１．０（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、８８８．１（Ｍ−１）−、９２３．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３４。
（６Ａ）−化合物５Ａ（８．４ｇ、９．４ｍｍｏｌ）を、３時間にわたってヒドラジン（１．５ｇ、４７．１ｍｍｏｌ）を用いてＭｅＯＨ（９０ｍｌ）中で還流させた。ＭｅＯＨを減圧下で除去し、粗化合物をＮＨ４ＯＨで洗浄し、水層をＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、粗生成物６Ａ＊が得られた。
Ｃ４２Ｈ５８Ｎ４Ｏ７ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値７５８．４０７５、実測値ｍ／ｚ ７５９．２（Ｍ＋１）＋、７５７．２（Ｍ−１）−、７９３．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．１１。
６Ａ＊を、Ｅｔ３Ｎ（３．９ｍｌ、２８．３ｍｍｏｌ）とともにＤＣＭ（９０ｍｌ）に溶解させ、アルゴン下で短時間撹拌した。次に、ＧａｌＮＡｃ（ＯＢｚ）−Ｃ５−ＮＨＳエステル（７．６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を加え、反応を、一晩継続させた。さらなる０．２当量のＧａｌＮＡｃ（ＯＢｚ）−Ｃ５−ＮＨＳエステルを加えて、反応をほぼ完了させたが、ＴＬＣプロファイルは同じままであった。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（２．５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離した）によって精製したところ、８．４ｇの６Ａ（６．１ｍｍｏｌ、６５％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０２−７．８８（ｍ，６Ｈ）、７．７４−７．１６（ｍ，２２Ｈ）、６．９５−６．８１（ｍ，４Ｈ）、５．８２（ｓ，１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．５１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｑ，Ｊ＝８．６、７．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９−４．２１（ｍ，３Ｈ）、３．９２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，８Ｈ）、３．４６（ｄｄ，Ｊ＝３０．５、９．４Ｈｚ、３Ｈ）、３．１７−２．９３（ｍ，４Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｓ，６Ｈ）、１．４０−１．２０（ｍ，６Ｈ）、０．７１（ｓ，９Ｈ）、−０．０７（ｄ，Ｊ＝３７．７Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．５３、１６９．１９、１６５．２７、１６５．０２、１６４．９７、１６４．６８、１５８．０１、１５４．４５、１４４．１８、１４０．４８、１３４．９５、１３４．８６、１３３．５８、１３３．３１、１３３．２８、１２９．５８、１２９．５５、１２９．０３、１２９．００、１２８．９８、１２８．８５、１２８．８３、１２８．７８、１２８．５１、１２８．４０、１２７．６５、１２７．５９、１２６．６８、１１３．０２、１１２．９９、１００．７１、９３．６５、９３．６２、８８．１１、８８．０９、８５．７４、８１．４３、８１．２３、７１．６８、６９．８０、６９．４６、６９．１２、６８．５５、６７．７５、６１．８６、６１．３５、５４．８７、５４．８６、４９．５７、４５．４０、３４．８３、２９．１６、２８．９９、２８．３９、２６．１３、２５．２７、２５．２２、２２．５２、２２．５１、２１．６７、１７．４３、８．３６、−４．９５、−５．５５．Ｃ７６Ｈ９１Ｎ５Ｏ１７ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値１３７３．６１７９、実測値ｍ／ｚ １３９６．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３７２．３（Ｍ−１）−、１４０８．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２９。
（７Ａ）−化合物６Ａ（５００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（８ｍｌ）に溶解させ、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦを反応混合物に加えた。シリル切断が完了するのに４８時間かかった。ＴＨＦを減圧下で蒸発させ、粗生成物を水で洗浄し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、精製したところ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離した）、４４０ｍｇの７Ａ（０．３５ｍｍｏｌ、９６％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０２−７．８８（ｍ，５Ｈ）、７．７８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７４−７．５４（ｍ，８Ｈ）、７．４９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４３−７．３６（ｍ，４Ｈ）、７．３２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２６（ｄｄ，Ｊ＝８．９、２．３Ｈｚ、５Ｈ）、７．１７（ｄ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ、２Ｈ）、６．９０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．４９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．００（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２２（ｍ，２Ｈ）、４．１６（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９−３．９１（ｍ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，８Ｈ）、３．６８−３．４７（ｍ，３Ｈ）、３．２６（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．０１（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５１（ｓ，６Ｈ）、１．３２（ｄｔ，Ｊ＝４２．４、８．９Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７４、１６９．４０、１６５．４１、１６５．１９、１６５．１５、１６４．８５、１５８．０９、１５４．７２、１４４．６２、１４０．５５、１３５．３９、１３５．１６、１３３．７６、１３３．４８、１２９．７０、１２９．１８、１２９．１５、１２９．０２、１２９．００、１２８．９８、１２８．９６、１２８．６９、１２８．５８、１２７．８６、１２７．６８、１２６．７７、１１３．２０、１００．８７、９３．７２、８７．８６、８５．７８、８１．７３、８１．６３、７１．８５、６９．９６、６９．７３、６８．７３、６８．２５、６７．９０、６２．２５、６２．０２、５５．０１、５４．８８、４９．７３、４５．５９、３５．０１、２９．１３、２８．５６、２６．２５、２５．１７、２２．６８、２１．８４、８．５４．Ｃ７０Ｈ７７Ｎ５Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１２５９．５３１４、実測値ｍ／ｚ １２８２．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１２５８．２（Ｍ−１）−、１２９４．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３３。
（８Ａ）−化合物７Ａ（６．４ｇ、５．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（３．０ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で２時間撹拌した。粗生成物を、シリカカラム（２〜４％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離した）によって精製したところ、５．８ｇの８Ａ（４．４ｍｍｏｌ、８６％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．６０（ｓ，１Ｈ）、８．０６−７．８８（ｍ，６Ｈ）、７．７５−７．４５（ｍ，１０Ｈ）、７．４２−７．２１（ｍ，１１Ｈ）、６．９０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｓ，１Ｈ）、５．６１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．０６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝８．９、７．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．４０−４．１３（ｍ，３Ｈ）、４．０３−３．９６（ｍ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，８Ｈ）、３．６９−３．５６（ｍ，２Ｈ）、３．５１（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．２９−３．２４（ｍ，１Ｈ）、３．１６（ｓ，３Ｈ）、３．０１（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ、５Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５０（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、６Ｈ）、１．３９−１．２２（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７６、１７１．０７、１６９．４０、１６５．２２、１６５．１７、１６４．８７、１５８．１３、１５７．８７、１５４．８７、１４４．６５、１４１．７５、１３５．４３、１３５．１０、１３３．７７、１３３．５０、１３３．４８、１２９．８０、１２９．７６、１２９．２１、１２９．１７、１２９．０４、１２９．０２、１２８．９７、１２８．７０、１２８．５９、１２７．８９、１２７．７１、１２６．７９、１１３．２６、１１３．２４、１０１．４０、１００．９０、８８．３３、８５．８５、８１．９７、８１．７２、７１．８８、７０．００、６９．８２、６８．７５、６８．３１、６７．９４、６２．２４、６２．０５、５５．０５、５２．０３、４９．７６、４５．４７、３５．０３、３４．７８、２９．１４、２９．１１、２８．５９、２６．２５、２５．１８、２２．７０、２１．８６、８．５４、７．１８．Ｃ７３Ｈ８２Ｎ５Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１３１４．５７３６、実測値ｍ／ｚ １３１５．２（Ｍ＋１）＋、１３３７．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３１４．２（Ｍ−１）−、１３４９．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４１。
（９Ａ）−化合物８Ａ（１．０ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７．５ｍｌ）に溶解させ、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２８０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２０分間撹拌し、次に、無水コハク酸（１５０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＤＣＭを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を、ＤＣＭ中２％のトリエチルアミン（ｖ／ｖ）で前処理された手動のカラム（φ＝４．６×２０）上に充填した。１〜５％のＭｅＯＨ／２〜５％のトリエチルアミン／ＤＣＭ ｖ／ｖの勾配を用いて、９Ａを精製した。９Ａは、３〜４％のＭｅＯＨ／３〜４％のトリエチルアミン／ＤＣＭ ｖ／ｖになった。１．１ｇの９Ａ（０．７１ｍｍｏｌ、９４％）を収集した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．６３（ｓ，１Ｈ）、８．０５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９２（ｑ，Ｊ＝６．３、５．７Ｈｚ、５Ｈ）、７．７５−７．４７（ｍ，１０Ｈ）、７．４１−７．２１（ｍ，１１Ｈ）、６．９０（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ、４Ｈ）、５．９０（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ）、５．３８（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．１７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４６（ｑ，Ｊ＝９．５、７．９Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２５（ｍ，２Ｈ）、４．１６（ｑ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．８０（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．７４（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｄｄ，Ｊ＝９．６、６．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．４２−３．２８（ｍ，４Ｈ）、３．１６（ｓ，３Ｈ）、３．０１（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ、５Ｈ）、２．６１−２．５２（ｍ，２Ｈ）、２．０６（ｓ，２Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ）、１．５７−１．１５（ｍ，１４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．２７、１７１．７４、１７１．５６、１７１．２３、１６９．３９、１６５．２０、１６５．１６、１６４．８７、１５８．１４、１５８．０５、１５４．８８、１４４．５４、１４１．８３、１３５．１９、１３５．００、１３３．７７、１３３．４９、１２９．７０、１２９．２０、１２９．１７、１２９．０３、１２９．０１、１２８．９７、１２８．７０、１２８．５９、１２７．９３、１２７．６０、１２６．８１、１１３．２９、１０１．９６、１００．９１、８８．１７、８６．０７、８０．１６、７９．２５、７１．８８、７０．２８、７０．１３、６９．９８、６８．７３、６７．９２、６２．２５、６２．０４、５５．０３、５４．９０、５１．９９、４９．７４、４５．４６、３４．９９、３４．８２、２９．１２、２８．９５、２８．８４、２８．７１、２８．５７、２６．１９、２５．１３、２２．６９、２１．８４、１０．００、７．１７．Ｃ７７Ｈ８６Ｎ６Ｏ２０についてのＬＲＭＳ計算値１４１４．５８９７、実測値ｍ／ｚ １４１６．２（Ｍ＋１）＋、１４３７．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１４１３．３（Ｍ−１）−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／５％のＥｔ３Ｎ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４８。
（１０Ａ）−化合物９Ａ（１．０ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６５ｍｌ）に溶解させ、ＨＢＴＵ（５００ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２５０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５分間にわたって振とうし、次に、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（８．２ｇ、５４０Å、１３１μｍｏｌ／ｇ）を加え、室温で一晩振とうした。ＣＰＧをろ過し、それぞれ２００ｍｌのＤＣＭ、２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させた。ＣＰＧを、無水酢酸（２５ｍｌ）、ピリジン（７５ｍｌ）、およびトリエチルアミン（１ｍｌ）中で１時間にわたって振とうしてから、前述されるのと同じ条件によって再度洗浄した。化合物１０Ａを減圧下で一晩乾燥させ、充填量を、分光光度計（８４μｍｏｌ／ｇ）によって測定した。
（１１Ａ）−化合物８Ａ（４．０ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリルと２回同時蒸発させ、次に、完全なアルゴン雰囲気下で無水ＤＣＭ（３０ｍｌ）に溶解させ、０℃に冷却した。２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．８ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２０分間撹拌し、次に、４，５−ジシアノイミダゾール（３６０ｍｇ、３．０４ｍｍｏｌ）を反応物に加えた。反応物をゆっくりと室温に温め、一晩撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させてから、減圧下で蒸発させた。得られた発泡体を、２％のトリエチルアミン／４９％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖで準備された手動のカラム（φ＝４．６×３０）によって精製した。不純物を、５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖ（１ＣＶ）、８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖ（７ＣＶ）、続いて１００％のＥｔＯＡｃ（８ＣＶ）で溶離した。次に、１１Ａを、２％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ（５ＣＶ）、および４％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ（７ＣＶ）で溶離した。１１Ａを減圧下で蒸発させたところ、２．１ｍｇ（１．３７ｍｍｏｌ、４５％）のアミダイトがジアステレオマー混合物として得られた。７．５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖが、化合物を含有するさらなるＤＭＴｒを溶離し、この化合物は、酸化された１１Ａとして質量によって特性評価された（ＬＣＭＳ 実測値ｍ／ｚ １５３２．２（Ｍ＋１）＋、１５５５．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．６１（ｓ，１Ｈ）、８．０７−７．８７（ｍ，６Ｈ）、７．７６−７．１９（ｍ，２１Ｈ）、６．９７−６．８２（ｍ，４Ｈ）、５．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．４、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．９、７．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９−４．２３（ｍ，５Ｈ）、４．１７−４．０７（ｍ，１Ｈ）、３．９８−３．９２（ｍ，１Ｈ）、３．８３−３．７７（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ、６Ｈ）、３．７１−３．４５（ｍ，７Ｈ）、３．３５（ｄ，Ｊ＝２２．０Ｈｚ、６Ｈ）、３．１６（ｓ，３Ｈ）、３．０１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、５Ｈ）、２．７４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．６４−２．５７（ｍ，１Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５１（ｓ，６Ｈ）、１．４２−１．１９（ｍ，７Ｈ）、１．１７−１．０３（ｍ，１０Ｈ）、０．９５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．６９、１７１．０８、１６９．３５、１６５．１７、１６５．１３、１６４．８４、１５８．１４、１５７．８５、１５４．８３、１５４．８１、１４４．５３、１４４．４５、１４１．７５、１４１．５４、１３５．１５、１３４．９１、１３４．８７、１３３．７１、１３３．４４、１３３．４１、１２９．８１、１２９．７５、１２９．１７、１２９．１３、１２９．００、１２８．９１、１２８．６４、１２８．５３、１２７．８１、１２７．７０、１２６．８０、１１８．７５、１１８．６１、１１３．１６、１０１．６０、１０１．５１、１００．８７、８８．８１、８８．３２、８５．９９、８１．３５、８０．９６、８０．４９、７１．８３、６９．９７、６９．８０、６９．４８、６９．３８、６８．７１、６７．９０、６２．０１、６１．８７、６１．２８、５８．４０、５８．２５、５８．１７、５８．０１、５４．９９、４９．７３、４５．６１、４２．６１、４２．５６、４２．５１、４２．４５、３４．９９、３４．７３、２９．２０、２９．１４、２９．１０、２８．５６、２６．２８、２５．２７、２５．２３、２４．３０、２４．２４、２４．１７、２２．６６、２１．８３、１９．８０、１９．７５．３１Ｐ ＮＭＲ（１６０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５３．８８、１５３．４０．Ｃ８２Ｈ９９Ｎ８Ｏ１８ＰについてのＬＲＭＳ計算値１５１４．６８１５、実測値ｍ／ｚ １５３７．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１５５１．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４１。
実施例７０：
Figure 2020114886
（４Ｂ）−化合物３Ｂ（４．９５ｇ、６．３８ｍｍｏｌ）を、化合物３Ａと同じようにＴＢＳＣｌ（１．４４ｇ、９．５７ｍｍｏｌ）で保護したところ、５．００ｇの４Ｂ（５．６２ｍｍｏｌ、８８％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３７（ｓ，１Ｈ）、７．８７−７．７７（ｍ，５Ｈ）、７．３７−７．１９（ｍ，９Ｈ）、６．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．９、１．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．６６（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．２８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．３６（ｔ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．８８−３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５７−３．４２（ｍ，３Ｈ）、３．３４（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．２５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０、３．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．５７−１．３７（ｍ，４Ｈ）、１．２９−１．１９（ｍ，４Ｈ）、０．８１（ｓ，９Ｈ）、０．０３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．８５、１６２．９３、１５８．１４、１５０．３３、１４４．４７、１３９．８７、１３５．０４、１３４．８９、１３４．３０、１３１．５３、１２９．７３、１２７．８５、１２７．６１、１２６．８１、１２２．９１、１１３．２０、１０１．３２、８８．７２、８６．０３、８０．６０、７６．６９、７３．７１、６９．８５、６２．０８、５９．７０、５４．９９、３７．２８、２９．０７、２７．８３、２６．０４、２５．４１、２５．０９、１７．６３、−５．０７、−５．２６．Ｃ５０Ｈ５９Ｎ３Ｏ１０ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値８８９．３９７０、実測値ｍ／ｚ ９１２．０（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、８８８．２（Ｍ−１）−、９２４．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン ｖ／ｖ中の０．７１。
（５Ｂ）−化合物４Ｂ（４．９４ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）を、化合物４Ａと同じように中間体５Ｂ＊を経て５Ｂに転化した。２段階反応のために、３．４５ｇの５Ｂが得られた（３．８８ｍｍｏｌ、７０％）。
５Ｂ＊）
Ｃ５２Ｈ６０Ｎ６Ｏ９ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値９４０．４１９１、実測値ｍ／ｚ ９６４．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、９４１．３（Ｍ−１）−、９７６．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖ中の０．５１
５Ｂ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８９−７．７５（ｍ，５Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，９Ｈ）、７．０９（ｓ，２Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、４Ｈ）、５．７１（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．５０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｓ，１Ｈ）、３．９９（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．８８−３．８３（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．４１（ｄｄ，Ｊ＝２６．０、９．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．２１（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．４６（ｄ，Ｊ＝５５．９Ｈｚ、４Ｈ）、１．２０（ｓ，４Ｈ）、０．８２（ｓ，９Ｈ）、０．０５（ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．８７、１６５．５４、１５８．１４、１５４．９５、１４４．４９、１４０．３８、１３５．１３、１３５．０６、１３４．３３、１３１．５６、１２９．７１、１２７．８６、１２７．６５、１２６．８２、１２２．９４、１１３．１９、９３．６３、８９．７９、８５．９３、７９．８６、７６．３４、７４．０３、６９．８０、６１．８０、５５．０１、５４．９０、３７．３０、２９．１０、２７．８４、２６．０７、２５．５３、２５．１０、１７．７１、−４．７７、−５．３９．Ｃ５０Ｈ６０Ｎ４Ｏ９ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値８８８．４１３０、実測値ｍ／ｚ ９１１．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、８８８．３（Ｍ−１）−、９２３．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４６。
（６Ｂ）−化合物５Ｂ（３．４５ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）を、５Ａと同じようにヒドラジンで処理したところ、中間体６Ｂ＊が得られた。
６Ｂ＊）
Ｃ４２Ｈ５８Ｎ４Ｏ７ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値７５８．４０７５、実測値ｍ／ｚ ７５９．２（Ｍ＋１）＋、７８１．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、７５７．２（Ｍ−１）−、７９３．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２０。
次に、中間体６Ｂ＊を、６Ａ＊と同じようにＧａｌＮＡｃ（ＯＢｚ）−Ｃ５−ＮＨＳエステルに結合したところ、４．６４ｇの６Ｂ（３．３８ｍｍｏｌ、８７％）が得られた。
６Ｂ）
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９９−７．８６（ｍ，６Ｈ）、７．７３−７．５３（ｍ，９Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３４（ｍ，４Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．８、２．８Ｈｚ、６Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、４Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．５１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２４（ｍ，３Ｈ）、４．０１（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．９０−３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５５−３．４２（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．３０−３．１８（ｍ，２Ｈ）、２．９８（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５１（ｓ，４Ｈ）、１．４４−１．２８（ｍ，４Ｈ）、１．２３−１．１４（ｍ，４Ｈ）、０．８３（ｓ，９Ｈ）、０．１０−０．０２（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７２．２２、１６９．８８、１６６．００、１６５．７１、１６５．６７、１６５．３８、１５８．６８、１５５．４３、１４５．００、１４０．９４、１３５．７１、１３５．６０、１３４．２７、１３４．０１、１３３．９７、１３０．２３、１２９．７３、１２９．６８、１２９．５５、１２９．４７、１２９．２０、１２９．０９、１２８．３９、１２８．１９、１２７．３６、１１３．７３、１０１．４２、９４．１９、９０．２０、８６．４８、８０．４６、７６．９８、７４．５８、７２．３７、７０．５１、７０．４４、６９．２６、６８．４５、６７．５１、６２．５６、６２．４３、５５．５５、５５．５４、５０．２８、３８．８７、３５．５４、２９．８３、２９．６６、２９．１１、２６．８４、２６．０５、２５．８２、２５．６３、２３．２１、２２．３９、１８．２４、−４．２６、−４．８３．Ｃ７６Ｈ９１Ｎ５Ｏ１７ＳｉについてのＬＲＭＳ計算値１３７３．６１７９、実測値ｍ／ｚ １３９６．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３７３．３（Ｍ−１）−、１４０８．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４８。
（７Ｂ）−化合物６Ｂ（４．６０ｇ、３．３５ｍｍｏｌ）を、６Ａと同様の方法でＴＨＦ（６７ｍｌ）中のＥｔ３Ｎ・３ＨＦ（６．５４ｍｌ、４０．１６ｍｍｏｌ）を用いて脱シリル化したところ、７Ｂが定量的に得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．００（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．８２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、４Ｈ）、７．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５６（ｑ，Ｊ＝８．２Ｈｚ、３Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３４（ｍ，４Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．２４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、６Ｈ）、７．１０（ｓ，１Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、４Ｈ）、５．７６−５．７３（ｍ，２Ｈ）、５．５２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３９−５．３１（ｍ，２Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝９．３、７．９Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．３１（ｍ，１Ｈ）、４．３２−４．２２（ｍ，１Ｈ）、４．１２（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．０１−３．９７（ｍ，１Ｈ）、３．９３−３．８９（ｍ，１Ｈ）、３．８２−３．７７（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５６−３．４８（ｍ，２Ｈ）、３．３０（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．１９（ｄｄ，Ｊ＝１０．８、３．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．９９（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５４−１．３９（ｍ，６Ｈ）、１．３７−１．２９（ｍ，２Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．６８、１６９．３４、１６５．５３、１６５．１７、１６５．１２、１６４．８３、１５８．０８、１５５．００、１４４．５２、１４０．７２、１３５．３４、１３５．１８、１３３．７２、１３３．４６、１３３．４３、１２９．６４、１２９．６１、１２９．１７、１２９．１３、１２８．９９、１２８．９２、１２８．６５、１２８．５４、１２７．８２、１２７．６４、１２６．７４、１１３．１７、１００．８７、９３．６３、９０．３３、８５．８１、７９．７５、７６．４４、７２．３３、７１．８３、６９．９５、６９．４９、６８．７１、６７．８９、６２．０７、６２．０１、５４．９８、４９．７１、３８．３３、３４．９８、２９．２０、２９．１１、２８．５５、２６．２６、２５．１９、２２．６６、２１．８２．Ｃ７０Ｈ７７Ｎ５Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１２５９．５３１４、実測値ｍ／ｚ １２８２．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１２５９．２（Ｍ−１）−、１２９４．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２４。
（８Ｂ）−化合物７Ｂ（４．２１ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）を、７Ａと同じようにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１．９９ｇ、１６．７０ｍｍｏｌ）でＮ４位を保護したところ、３．７９ｇの化合物８Ａ（２．８８ｍｍｏｌ、８６％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．６２（ｓ，１Ｈ）、８．０２−７．８８（ｍ，６Ｈ）、７．７４−７．５２（ｍ，８Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．２１（ｍ，１１Ｈ）、６．９３−６．８５（ｍ，４Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、３Ｈ）、５．６２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．４３（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９−４．４１（ｍ，２Ｈ）、４．３７−４．２４（ｍ，２Ｈ）、４．２０−４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．０７−４．０２（ｍ，１Ｈ）、３．９７−３．９３（ｍ，１Ｈ）、３．８２−３．７６（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５８−３．４８（ｍ，２Ｈ）、３．３１（ｓ，２Ｈ）、３．２６（ｄｄ，Ｊ＝１０．８、３．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．１５（ｓ，３Ｈ）、３．０５−２．９５（ｍ，５Ｈ）、２．０９−２．００（ｍ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．４０（ｍ，６Ｈ）、１．３８−１．２９（ｍ，２Ｈ）、１．２２（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．６８、１７１．０４、１６９．３５、１６５．１７、１６５．１２、１６４．８３、１５８．０９、１５７．８１、１５４．９９、１４４．５３、１４１．９０、１３５．３３、１３５．０６、１３３．７２、１３３．４６、１３３．４３、１２９．７１、１２９．６６、１２９．１７、１２９．１３、１２８．９９、１２８．９２、１２８．６５、１２８．５５、１２７．８３、１２７．６３、１２６．７６、１１３．１９、１０１．２８、１００．８７、９０．８１、８５．８６、７９．９７、７６．３２、７２．３５、７１．８２、６９．９５、６９．４９、６８．７２、６７．９０、６２．００、５４．９９、５４．８５、４９．７２、４５．６７、３５．００、３４．７２、２９．２０、２９．１１、２８．５７、２６．２５、２５．２０、２２．６６、２１．８３．Ｃ７３Ｈ８２Ｎ６Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１３１４．５７３６、実測値ｍ／ｚ １３１６．４（Ｍ＋１）＋、１３３７．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３１４．２（Ｍ−１）−、１３４９．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３２。
（９Ｂ）−化合物８Ｂ（５００ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）を、９Ａと同じ条件下でコハク酸化（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）したところ、５５０ｍｇの化合物９Ｂ（０．３６３ｍｍｏｌ、９５％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．６１（ｓ，１Ｈ）、８．０７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９９−７．８４（ｍ，５Ｈ）、７．７９−７．４４（ｍ，１０Ｈ）、７．４１−７．２０（ｍ，１１Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、４Ｈ）、５．８６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．４３−５．３３（ｍ，２Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９−４．４０（ｍ，２Ｈ）、４．３７−４．２１（ｍ，３Ｈ）、４．０２−３．９６（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，７Ｈ）、３．５９−３．４５（ｍ，２Ｈ）、３．４３−３．２０（ｍ，６Ｈ）、３．１５（ｓ，３Ｈ）、３．０４−２．９３（ｍ，５Ｈ）、２．４６−２．３８（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５０（ｓ，４Ｈ）、１．４１−１．２７（ｍ，４Ｈ）、１．１６（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．２６、１７１．７２、１７１．３２、１７１．１０、１６９．３５、１６５．１７、１６５．１３、１６４．８３、１５８．１０、１５７．９２、１５４．６７、１４４．４７、１４２．４４、１３５．２３、１３５．０５、１３３．７２、１３３．４３、１２９．６９、１２９．１８、１２９．１３、１２９．００、１２８．９２、１２８．６５、１２８．５４、１２７．８３、１２７．６５、１２６．７６、１１３．１８、１０１．６７、１００．８９、８８．９９、８５．８７、８０．３６、７５．３９、７３．６６、７１．８７、７０．４８、６９．９５、６８．６９、６７．９０、６２．５３、６２．０２、６１．８０、５４．９８、５４．８６、５１．９８、５１．２６、４９．７２、４０．８４、３８．３２、３４．９５、３４．７７、２９．１０、２９．０６、２８．９７、２８．８８、２８．６７、２８．５３、２６．２１、２５．１６、２２．６５、２１．８０、１０．６４、７．１４．Ｃ７７Ｈ８６Ｎ６Ｏ２０についてのＬＲＭＳ計算値１４１４．５８９７、実測値ｍ／ｚ １４３８．９（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１４１３．２（Ｍ−１）−。
（１０Ｂ）−化合物９Ｂ（５００ｍｇ、０．３２９ｍｍｏｌ）を、化合物１０Ａと同じようにコハク酸化するために充填したところ、７９μｍｏｌ／ｇの充填量で４．１１ｇの１０Ｂが得られた。
実施例７１：
Figure 2020114886
 Ｃ２４Ｈ２８Ｎ６Ｏ６についてのＬＲＭＳ計算値４９６．５２、実測値ｍ／ｚ ４９７．２（Ｍ＋１）＋、５１９．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、４８６．２（Ｍ−１）−、５２２．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−
（２Ａ／２Ｂ）−化合物１（４０ｇ、１１３．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９５０ｍｌ）に溶解させた。ＮａＨ（油中６０％；１１．３２ｇ、２８３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を、ガスの発生が停止するまで、約３時間撹拌した。次に、Ｎ−（ブロモヘキシル）フタルイミド（５２．７ｇ、１６９．８ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を５０℃に加熱し、７２時間保った。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られたガムを、シリカゲルカラム精製用のシリカに吸着させた。２Ａおよび２Ｂの混合物が、４〜６％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離して、２９．８５ｇの生成物（５１．２ｍｍｏｌ、４５％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０５（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、１１．６５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、８．２６（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８２（ｐ，Ｊ＝４．３Ｈｚ、４Ｈ）、５．８７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．７８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、０Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．３９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、０Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．１２（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．０４（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．５６−４．５１（ｍ，０Ｈ）、４．３３−４．２７（ｍ，１Ｈ）、４．２４（ｑ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９４−３．８７（ｍ，１Ｈ）、３．６４−３．４２（ｍ，６Ｈ）、２．７４（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．４３（ｄｔ，Ｊ＝２７．１、６．５Ｈｚ、４Ｈ）、１．２３−１．１２（ｍ，４Ｈ）、１．０９（ｄｄ，Ｊ＝６．６、４．９Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１８０．０３、１６７．９１、１６７．８９、１６７．８１、１５４．７２、１４８．８３、１４８．１９、１３７．４３、１３７．４１、１３４．３０、１３１．５５、１３１．５２、１２２．９２、１２２．８６、１１９．９９、８６．２４、８４．４６、８４．４４、８１．４１、６９．５９、６８．８９、６８．８８、６１．２５、３７．１６、３４．７０、２８．８７、２７．８４、２７．７８、２５．９０、２４．７９、１８．８２、１８．７９、１８．７５．Ｃ２８Ｈ３４Ｎ６Ｏ８についてのＬＲＭＳ計算値５８２．２４３８、実測値ｍ／ｚ ５８３．２（Ｍ＋１）＋、５８１．１（Ｍ−１）−、６１７．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３０。
（３Ａ／３Ｂ）−化合物２Ａ／２Ｂ（１４．１ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）を、完全なアルゴン雰囲気下で無水ピリジン（２４０ｍｌ）に溶解させ、０℃に冷却した。次に、ＤＭＴｒＣｌ（９．０ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温に温め、７２時間撹拌させた。反応をＭｅＯＨでクエンチし、ピリジンを減圧下で除去した。粗生成物を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、１３．８２ｇ（１５．６２ｍｍｏｌ、６５％）の３Ａおよび２．０６ｇ（２．３３ｍｍｏｌ、１０％）の３Ｂが得られた。
３Ａ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０６（ｓ，１Ｈ）、１１．５９（ｓ，１Ｈ）、８．１２（ｓ，１Ｈ）、７．８１（ｐ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．３３（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８２（ｄｄ，Ｊ＝８．７、７．１Ｈｚ、４Ｈ）、５．９２（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．１４（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．３９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｑ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３（ｑ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．５１−３．３８（ｍ，３Ｈ）、３．２７（ｄｄ，Ｊ＝１０．４、６．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．１５（ｄｄ，Ｊ＝１０．３、３．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．７４（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．４７（ｄｔ，Ｊ＝２１．２、６．６Ｈｚ、４Ｈ）、１．２８−１．１５（ｍ，４Ｈ）、１．１０（ｄｄ，Ｊ＝６．６、５．１Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１８０．０４、１６７．８３、１５８．０２、１５８．００、１５４．７４、１４８．７６、１４８．１６、１４４．７４、１３７．４４、１３５．４４、１３５．３５、１３４．３０、１３１．５２、１２９．６８、１２９．６５、１２７．７２、１２７．６５、１２６．６２、１２２．９２、１２０．２９、１１３．０６、８５．５２、８５．０２、８４．０６、８０．５９、６９．７８、６９．１２、６３．９３、６３．４５、３７．１９、３４．７２、２８．８９、２７．７９、２５．９４、２４．８３、１８．８０、１８．７８．Ｃ４９Ｈ５２Ｎ６Ｏ１０についてのＬＲＭＳ計算値８８４．３７４５、実測値ｍ／ｚ ８８５．２（Ｍ＋１）＋、９０７．０（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、８８３．２（Ｍ−１）−、９１９．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中の０．５２
３Ｂ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０８（ｓ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、１１．６７（ｓ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、８．１４（ｓ，１Ｈ）、７．８６−７．７６（ｍ，４Ｈ）、７．３７−７．１４（ｍ，９Ｈ）、６．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．８、４．０Ｈｚ、４Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．５１（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．６７（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５−３．９１（ｍ，２Ｈ）、３．７０（ｓ，６Ｈ）、３．５５（ｄｔ，Ｊ＝１４．２、８．２Ｈｚ、３Ｈ）、３．３９（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２６−３．１４（ｍ，２Ｈ）、２．７６（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．５０（ｄｔ，Ｊ＝３５．７、６．６Ｈｚ、４Ｈ）、１．３２−１．１９（ｍ，４Ｈ）、１．１１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ１８０．１０、１６７．９０、１５８．０２、１５４．８１、１４８．８１、１４８．１６、１４４．７０、１３７．２９、１３５．３９、１３５．３６、１３４．３３、１３１．５５、１２９．６４、１２９．６１、１２７．７４、１２７．６１、１２６．６４、１２２．９４、１２０．２８、１１３．０７、８７．１７、８５．５７、８１．１４、７７．７１、７２．２２、６９．６３、６３．３１、５９．７２、５４．９４、３７．３０、３４．７３、２９．０８、２７．８６、２６．０５、２５．０３、１８．８７、１８．７８、１４．０５．Ｃ４９Ｈ５２Ｎ６Ｏ１０についてのＬＲＭＳ計算値８８４．３７４５、実測値ｍ／ｚ ８８５．１（Ｍ＋１）＋、８８３．０（Ｍ−１）−、９１９．０（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中の０．３２。
（４Ａ）−化合物３Ａ（５．０ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）を、３時間にわたって還流しているＭｅＯＨ（５６ｍｌ）中のヒドラジン（９００ｍｇ、２８ｍｍｏｌ）で処理した。フタルイミドおよびイソブチリル保護基の両方が、反応中に切断された。ＭｅＯＨを減圧下で除去し、粗生成物をＮＨ４ＯＨで洗浄した。水層をＤＣＭで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。ＤＣＭを減圧下で除去したところ、４Ａ＊が粗製の発泡体として得られた。
Ｃ３７Ｈ４４Ｎ６Ｏ７についてのＬＲＭＳ計算値６８４．３２７１、実測値ｍ／ｚ ６８５．２（Ｍ＋１）＋、６８３．１（Ｍ−１）−、７１９．１（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．００。
次に、４Ａ＊を、完全なアルゴン雰囲気下で無水ＤＣＭ（５６ｍｌ）に溶解させ、Ｅｔ３Ｎ（２．４ｍｌ、１７ｍｍｏｌ）を加えた。次に、ＧａｌＮＡｃ（ＯＢｚ）−Ｃ５−ＮＨＳエステル（４．５ｇ、６．２２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。ＤＣＭを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次に、水層をＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次に、減圧下で除去した。粗製の発泡体を、シリカゲルクロマトグラフィー（２．５〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離した）によって精製したところ、７．０ｇ（５．４１ｍｍｏｌ、９６％）の４Ａが得られた。アセトニトリルとの同時蒸発は、１Ｈ ＮＭＲに見られるトリエチルアミンピークを低下させなかった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．７３（ｓ，１Ｈ）、９．９０（ｓ，１Ｈ）、８．０２（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、４Ｈ）、７．７９（ｓ，１Ｈ）、７．７４−７．５２（ｍ，８Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１３．９、７．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．３０−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．９、２．７Ｈｚ、４Ｈ）、６．５３（ｓ，２Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１３（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９−４．４０（ｍ，２Ｈ）、４．３９−４．１９（ｍ，４Ｈ）、３．９９（ｑ，Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．６１−３．４６（ｍ，２Ｈ）、３．４６−３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．２４−３．１２（ｍ，２Ｈ）、２．９７（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５６−１．３７（ｍ，６Ｈ）、１．３６−１．２５（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７２、１６９．３８、１６５．１９、１６５．１４、１６４．８４、１５８．０２、１５６．６６、１５３．８１、１５１．３０、１４４．７７、１３５．４７、１３５．３７、１３４．８９、１３３．７５、１３３．４７、１２９．６７、１２９．１８、１２９．１６、１２９．１４、１２９．０１、１２８．９８、１２８．９５、１２８．６８、１２８．５７、１２７．７７、１２７．６５、１２６．６４、１１６．６４、１１３．１２、１００．８８、８５．５３、８４．４４、８３．５３、８０．６１、７１．８６、６９．９６、６９．７８、６９．０８、６８．７３、６７．９０、６３．８４、６２．０２、５４．９８、４９．７２、４５．４２、３８．３０、３４．９９、２９．１２、２９．０６、２８．５６、２６．１７、２５．０６、２２．６８、２１．８２、８．４７．Ｃ７１Ｈ７７Ｎ７Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１２９９．５３７６、実測値ｍ／ｚ １３０１．１（Ｍ＋１）＋、１３２２．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１２９８．２（Ｍ−１）−、１３３６．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３７。
（５Ａ）−化合物４Ａ（６．８ｇ、５．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１．９ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、１．５時間にわたって６０℃に加熱した。ＤＭＦを減圧下で除去し、粗生成物をシリカに吸着させた。シリカゲルクロマトグラフィー（２．５〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離した）によって精製を行ったところ、５．６３ｇの５Ａ（４．１５ｍｍｏｌ、７９％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３８（ｓ，１Ｈ）、９．９４（ｓ，１Ｈ）、８．４８（ｓ，１Ｈ）、８．０３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９７−７．８７（ｍ，５Ｈ）、７．７５−７．５２（ｍ，８Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１４．６、７．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．２９−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．７、４．６Ｈｚ、４Ｈ）、５．９３（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝８．３、７．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９−４．２３（ｍ，４Ｈ）、４．０２（ｑ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｄｄｔ、Ｊ＝４０．７、１６．１、７．９Ｈｚ、４Ｈ）、３．２５（ｄｄ，Ｊ＝１０．３、５．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．１５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．０７（ｓ，３Ｈ）、３．０１−２．９２（ｍ，５Ｈ）、２．０４（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．３８（ｍ，６Ｈ）、１．３５−１．２４（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７４、１６９．４０、１６５．２０、１６５．１５、１６４．８５、１５８．０３、１５８．０１、１５７．７９、１５７．５８、１５７．２８、１４９．８６、１４４．７６、１３６．３３、１３５．４７、１３５．３８、１３３．７５、１３３．４８、１３３．４５、１２９．６６、１２９．６２、１２９．１５、１２９．１４、１２９．０１、１２８．９９、１２８．９４、１２８．６７、１２８．５６、１２７．７６、１２７．６３、１２６．６４、１１９．７８、１１３．１１、１００．８８、８５．５０、８５．０６、８３．４６、８０．７８、７１．８７、６９．９７、６９．８３、６９．０４、６８．７２、６７．９１、６３．８０、６２．０３、５４．９８、４９．７３、４５．４５、４５．４３、３４．９９、３４．６３、２９．１０、２９．０６、２８．５５、２６．１６、２５．０７、２２．６７、２１．８２、８．４８．Ｃ７４Ｈ８２Ｎ８Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１３５４．５７９８、実測値ｍ／ｚ １３５６．１（Ｍ＋１）＋、１３７７．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３５３．３（Ｍ−１）−、１３８９．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４０。
（６Ａ）−化合物５Ａ（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７ｍｌ）に溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（２７０ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、５分間撹拌した。次に、無水コハク酸（１５０ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＤＣＭを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を、ＤＣＭ中２％のトリエチルアミン（ｖ／ｖ）で前処理された手動のカラム（φ＝４．６×１７）上に充填した。１〜５％のＭｅＯＨ／２〜５％のトリエチルアミン／ＤＣＭ ｖ／ｖの勾配を用いて、６Ａを精製した。６Ａは、定量的収率で４〜５％のＭｅＯＨ／４〜５％のトリエチルアミン／ＤＣＭ ｖ／ｖになった。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４３（ｓ，１Ｈ）、８．６２（ｓ，１Ｈ）、８．０８−７．９８（ｍ，２Ｈ）、７．９２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、４Ｈ）、７．７１（ｄｄ，Ｊ＝１２．７、７．３Ｈｚ、４Ｈ）、７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｑ，Ｊ＝７．７、７．１Ｈｚ、３Ｈ）、７．５０（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０−７．１４（ｍ，９Ｈ）、６．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．８、４．９Ｈｚ、４Ｈ）、５．９４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．７６（ｓ，１Ｈ）、５．６３（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．３８（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９０（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．７６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４６（ｑ，Ｊ＝９．９、８．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９−４．２４（ｍ，２Ｈ）、４．１５（ｑ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．８２−３．７７（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５３−３．４３（ｍ，２Ｈ）、３．３７（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、３．２７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５、５．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．２２−３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．０３（ｓ，３Ｈ）、３．０１−２．９４（ｍ，５Ｈ）、２．７９（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．５９（ｑ，Ｊ＝６．４、５．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５６−１．４６（ｍ，４Ｈ）、１．３８（ｓ，２Ｈ）、１．３３−１．２６（ｍ，２Ｈ）、１．１５（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．２１、１７１．８３、１７１．６９、１６９．３４、１６５．１６、１６５．１１、１６４．８１、１５８．００、１５７．９９、１５７．９６、１５７．５５、１５７．２４、１４９．５９、１４４．５８、１３７．７５、１３５．３２、１３５．２９、１３３．７１、１３３．４３、１２９．５２、１２９．４１、１２９．１６、１２９．１３、１２９．１１、１２８．９８、１２８．９１、１２８．６４、１２８．５３、１２７．７１、１２７．４９、１２６．５８、１２０．１６、１１３．０６、１００．８６、８６．３６、８５．３８、８０．１２、７８．０６、７１．８４、７０．２７、６９．９４、６８．６８、６７．８９、６２．００、５４．９４、５４．９３、５４．８４、５１．９８、４９．７０、４５．４４、３４．９４、３４．６０、２９．０５、２８．９７、２８．６８、２８．６３、２８．５２、２６．０９、２５．０３、２２．６４、２１．７８、９．７４、７．１３．Ｃ７８Ｈ８６Ｎ８Ｏ２０についてのＬＲＭＳ計算値１４５４．５９５８、実測値ｍ／ｚ １４５５．２（Ｍ＋１）＋、１４７８．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１４５３．２（Ｍ−１）−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３２。
（７Ａ）−化合物６Ａ（１．０ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７０ｍｌ）に溶解させ、ＨＢＴＵ（５２０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２７０ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５分間にわたって振とうし、次に、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（８．６ｇ、５１０Å、１３１μｍｏｌ／ｇ）を加え、室温で一晩振とうした。ＣＰＧをろ過し、それぞれ２００ｍｌのＤＣＭ、２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させた。ＣＰＧを、無水酢酸（１２．５ｍｌ）、ピリジン（３７．５ｍｌ）、およびトリエチルアミン（０．５ｍｌ）中で１時間にわたって振とうしてから、前述されるのと同じ条件によって再度洗浄した。化合物７Ａを減圧下で一晩乾燥させ、充填量を、分光光度計によって測定した（７３μｍｏｌ／ｇ）。
（８Ａ）−化合物５Ａ（２．０ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を、ピリジンと２回同時蒸発させ、完全なアルゴン雰囲気下に置いた。ＤＣＭ（１５ｍｌ）をフラスコに加え、０℃に冷却してから、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（８９０ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２０分間撹拌し、次に、４，５−ジシアノイミダゾール（１７５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を反応物に加えた。反応物を、一晩、ゆっくりと室温に温めた。反応物を飽和重炭酸塩で洗浄し、水層をＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。発泡体を、２％のトリエチルアミン／４９％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖで準備された、前処理された手動のカラム（φ＝４．６×１９）上に充填した。不純物を、８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンｖ／ｖ（８ＣＶ）、続いて１００％のＥｔＯＡｃ（８ＣＶ）で溶離した。次に、ＥｔＯＡｃを１００％のＤＣＭ（１ＣＶ）でパージした。８Ａを３％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ（５ＣＶ）、および６％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ（５ＣＶ）で溶離した。８Ａを減圧下で蒸発させたところ、１．６５ｇ（１．０６ｍｍｏｌ、７２％）のアミダイトがジアステレオマー混合物として得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４０（ｓ，１Ｈ）、８．４２（ｓ，１Ｈ）、８．０５−７．８５（ｍ，６Ｈ）、７．７４−７．４４（ｍ，１０Ｈ）、７．４３−７．１５（ｍ，１１Ｈ）、６．８１（ｑ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．９５（ｔ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５７−４．４０（ｍ，４Ｈ）、４．３０（ｄｑ、Ｊ＝２９．０、９．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．２１−４．０６（ｍ，１Ｈ）、３．８２−３．６８（ｍ，８Ｈ）、３．６４−３．４３（ｍ，７Ｈ）、３．３０−３．１９（ｍ，４Ｈ）、３．０４（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ、３Ｈ）、３．００（ｓ，３Ｈ）、２．９７−２．８６（ｍ，５Ｈ）、２．７４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．５４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．０３（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５６−１．３６（ｍ，６Ｈ）、１．３４−１．０４（ｍ，１９Ｈ）、０．９５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．８５、１６９．５２、１６５．３５、１６５．３０、１６５．０１、１５８．２３、１５８．１９、１５７．７２、１５７．４１、１５７．３９、１４９．９６、１４９．９３、１４４．８６、１４４．８３、１３６．９１、１３６．６６、１３５．５０、１３５．４９、１３５．４４、１３５．４０、１３３．９１、１３３．６４、１３３．６１、１２９．８４、１２９．８０、１２９．７７、１２９．７１、１２９．３４、１２９．３２、１２９．３０、１２９．１７、１２９．１５、１２９．１１、１２８．８４、１２８．７３、１２７．９１、１２７．８９、１２７．７９、１２７．７１、１２６．８３、１２６．８０、１２０．２０、１１９．００、１１８．７９、１１３．２５、１０１．０４、８５．７９、８５．７５、８５．２６、８２．８８、８２．６３、８０．０７、７９．６５、７２．０１、７０．１２、６８．８８、６８．０７、６３．５０、６３．３７、６２．１８、５８．７８、５８．６５、５８．２１、５８．０６、５５．１５、５５．１４、５５．１２、４９．８８、４５．７４、３５．１５、３４．７７、２９．３０、２９．２７、２９．２４、２８．７２、２６．３９、２５．３０、２５．２８、２４．４７、２４．４４、２４．４２、２４．３８、２４．３４、２４．２８、２２．８３、２１．９８、２１．２１、１９．９６、１９．９１、１９．８８、１９．８３、１８．９６、９．５６．３１Ｐ ＮＭＲ（１６０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５４．０２、１５３．９９．Ｃ８３Ｈ９９Ｎ１０Ｏ１８ＰについてのＬＲＭＳ計算値１５５４．６８７６、実測値ｍ／ｚ １５５５．３（Ｍ＋１）＋、１５７８．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１５５５．４（Ｍ−１）−、１５９０．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４６。
実施例７２：
Figure 2020114886
（４Ｂ）−化合物３Ｂ（４．２ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）を、３Ａと同じ条件を用いて脱保護したところ、化合物３Ｂ＊が得られた。
Ｃ３７Ｈ４４Ｎ６Ｏ７についてのＬＲＭＳ計算値６８４．３２７１、実測値ｍ／ｚ ６８５．２（Ｍ＋１）＋、７０７．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、６８３．３（Ｍ−１）−、７１９．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．００。
次に、化合物３Ｂ＊を、化合物３Ａ＊と同じようにＧａｌＮＡｃ（ＯＢｚ）−Ｃ５−ＮＨＳエステル（３．８ｇ、５．２２ｍｍｏｌ）で処理した。４．５ｇの化合物４Ｂ（３．４３ｍｍｏｌ、７２％）が得られた。
Ｃ７１Ｈ７７Ｎ７Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１２９９．５３７６、実測値ｍ／ｚ １３００．１（Ｍ＋１）＋、１３２２．１（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１２９８．２（Ｍ−１）−、１３３４．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−。Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．２９。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．９１（ｓ，１Ｈ）、１０．６５（ｓ，１Ｈ）、８．１３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、４Ｈ）、７．８２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７６−７．６７（ｍ，３Ｈ）、７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、３Ｈ）、７．４９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３１（ｍ，４Ｈ）、７．２７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、５Ｈ）、６．８９−６．８１（ｍ，４Ｈ）、６．７５（ｓ，２Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．７１（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．５０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｓ，６Ｈ）、４．７８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．６０（ｑ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝１０．０、８．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２４（ｍ，２Ｈ）、４．０３−３．９５（ｍ，２Ｈ）、３．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．６２−３．４７（ｍ，２Ｈ）、３．１８（ｄｄｄ，Ｊ＝４４．２、１０．５、３．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．０１−２．９５（ｍ，２Ｈ）、２．０６（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５６−１．４１（ｍ，６Ｈ）、１．３５（ｑ，Ｊ＝６．６、６．１Ｈｚ、２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７４、１６９．３５、１６５．１８、１６５．１２、１６４．８３、１５８．００、１５６．６０、１５３．９４、１５１．２４、１４４．７０、１３５．４３、１３４．９２、１３３．７４、１３３．４５、１２９．６１、１２９．１７、１２９．１５、１２９．１３、１２９．００、１２８．９８、１２８．９４、１２８．６８、１２８．５６、１２７．７５、１２７．６３、１２６．６３、１１６．６２、１１３．１０、１００．８８、８６．８０、８５．５４、８０．７１、７７．７７、７２．１３、７１．９１、６９．９６、６９．６２、６８．６９、６７．８８、６３．３４、６２．６１、６２．０４、５４．９７、５４．９０、４９．６９、３４．９５、２９．２４、２９．１２、２８．５２、２６．２７、２５．２１、２２．６７、２１．８１、８．４３。
（５Ｂ）−化合物４Ｂ（４．３ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）を、化合物４Ａと同じように保護したところ、３．０ｇの化合物５Ｂ（２．２１ｍｍｏｌ、６７％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３７（ｓ，１Ｈ）、１０．４６（ｓ，１Ｈ）、８．５１（ｓ，１Ｈ）、８．０８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９９−７．８７（ｍ，５Ｈ）、７．７７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７３−７．５２（ｍ，７Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３１（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．２１（ｄｄ，Ｊ＝１９．７、８．２Ｈｚ、７Ｈ）、６．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．９、２．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．５２（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．８１−４．６７（ｍ，２Ｈ）、４．４４（ｑ，Ｊ＝８．７、７．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２３（ｍ，２Ｈ）、４．１０（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｑ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．６４−３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．５０（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．２４−３．１２（ｍ，２Ｈ）、３．０３（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１０Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．２９（ｍ，８Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．７３、１６９．３６、１６５．１９、１６５．１３、１６４．８４、１５８．００、１５７．９９、１５７．８０、１５７．５７、１５７．２２、１４９．８３、１４４．７０、１３６．７９、１３５．４６、１３５．４３、１３３．７４、１３３．４７、１３３．４５、１２９．５８、１２９．５５、１２９．１７、１２９．１５、１２９．１４、１２９．００、１２８．９８、１２８．９４、１２８．６８、１２８．５６、１２７．７３、１２７．６０、１２６．６３、１１９．７７、１１３．０８、１００．８９、８７．６５、８５．４６、８０．７３、７７．６７、７２．０５、７１．９０、６９．９６、６９．７５、６８．７１、６７．９０、６３．２２、６２．０４、５４．９９、５４．９７、４９．７１、３４．９８、３４．６３、２９．２２、２９．１３、２８．５４、２６．２６、２５．２０、２２．６７、２１．８３、８．３８．Ｃ７４Ｈ８２Ｎ８Ｏ１７についてのＬＲＭＳ計算値１３５４．５７９８、実測値ｍ／ｚ １３５５．３（Ｍ＋１）＋、１３７７．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１３８９．３（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３７。
（６Ｂ）−化合物５Ｂ（１５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、化合物５Ａと同じように無水コハク酸（２２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）で処理したところ、１２０ｍｇの化合物６Ｂ（０．０８２ｍｍｏｌ、７５％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４７（ｓ，１Ｈ）、８．５１（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９９（ｓ，１Ｈ）、７．９２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ）、７．７６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７４−７．６７（ｍ，３Ｈ）、７．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｑ，Ｊ＝８．２Ｈｚ、３Ｈ）、７．４９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．２９（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７−７．１４（ｍ，７Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、４Ｈ）、６．０３（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．００−５．９７（ｍ，１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５５−４．４９（ｍ，１Ｈ）、４．４５（ｑ，Ｊ＝９．９、８．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．３８−４．２５（ｍ，２Ｈ）、４．０４−３．９９（ｍ，１Ｈ）、３．８３−３．７６（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．５４−３．４１（ｍ，２Ｈ）、３．４０−３．２６（ｍ，６Ｈ）、３．１４（ｄｄ，Ｊ＝１０．７、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．０５（ｓ，３Ｈ）、３．０４−２．９７（ｍ，６Ｈ）、２．６２−２．５６（ｍ，２Ｈ）、２．０６（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．５６−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．３４（ｄｄ，Ｊ＝１９．５、１３．０Ｈｚ、４Ｈ）、１．１７（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．２６、１７２．０１、１７１．７３、１７１．４６、１６９．３６、１６８．６８、１６５．１８、１６５．１３、１６４．８４、１５８．００、１５７．９０、１５７．５４、１５７．３６、１４９．３７、１４４．５５、１３７．１７、１３５．３８、１３５．３１、１３３．７４、１３３．４８、１３３．４５、１２９．５４、１２９．５１、１２９．１８、１２９．１５、１２９．１４、１２９．０１、１２８．９９、１２８．９４、１２８．６８、１２８．５６、１２７．７３、１２７．５７、１２６．６３、１１９．９４、１１３．０６、１００．９０、８６．１０、８５．４１、８０．５３、７５．７７、７２．９８、７１．８８、７０．４３、６９．９６、６８．７０、６７．９０、６２．５５、６２．０２、５４．９６、５１．９９、４９．７１、４５．４３、３４．９７、３４．６２、３３．２４、２９．１４、２９．１０、２８．９４、２８．８４、２８．５４、２６．２０、２５．１８、２２．６６、２２．５９、２１．８２、２１．１３、１４．７２、１０．０３、７．１６．Ｃ７８Ｈ８６Ｎ８Ｏ２０についてのＬＲＭＳ計算値１４５４．５９５８、実測値ｍ／ｚ １４５５．３（Ｍ＋１）＋、１４５３．２（Ｍ−１）−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／５％のＥｔ３Ｎ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４３。
（７Ｂ）−化合物６Ｂ（８０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を、６Ａと同じようにＬＣＡＡ−ＣＰＧ上に充填したところ、６４０ｍｇのＣＰＧ（６９μｍｏｌ／ｇ）が得られた。
（８Ｂ）−化合物５Ｂ（２００ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を、ＡＣＮおよび次にピリジンと同時蒸発させた。次に、５Ｂを、５Ａと同様の方法でホスフィチル化したところ、８０ｍｇの８Ｂがジアステレオマー混合物（０．０５１ｍｍｏｌ、３４．７％）として得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４１（ｓ，１Ｈ）、８．４７（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．０６−７．８６（ｍ，６Ｈ）、７．７７−７．４３（ｍ，１０Ｈ）、７．４２−７．１２（ｍ，１１Ｈ）、６．８１（ｄｄ，Ｊ＝５．９、２．７Ｈｚ、４Ｈ）、５．９８（ｄｄ，Ｊ＝２１．６、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３８（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．０７−４．９２（ｍ，１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５３−４．２０（ｍ，５Ｈ）、４．０７−３．９８（ｍ，１Ｈ）、３．８６−３．４５（ｍ，１４Ｈ）、３．４１−３．１３（ｍ，８Ｈ）、３．０２（ｄｄ，Ｊ＝１０．２、３．３Ｈｚ、８Ｈ）、２．７４（ｄｄ，Ｊ＝１２．３、６．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．５７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．０５（ｓ，２Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．４８（ｄ，Ｊ＝２７．８Ｈｚ、６Ｈ）、１．３９−１．３０（ｍ，２Ｈ）、１．２６−１．０４（ｍ，１５Ｈ）、０．８９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．８９、１６９．５４、１６５．３６、１６５．３１、１６５．０３、１５８．２１、１５８．１９、１５７．８２、１５７．７５、１５７．７１、１５７．４０、１４９．８８、１４９．８５、１４４．８２、１３７．１５、１３７．０２、１３５．５７、１３５．５２、１３５．５０、１３３．９２、１３３．６５、１３３．６１、１２９．７４、１２９．３５、１２９．３３、１２９．３２、１２９．１９、１２９．１７、１２９．１６、１２９．１１、１２８．８４、１２８．７３、１２７．９２、１２７．７６、１２６．８３、１２０．１４、１２０．０１、１１８．９８、１１８．８０、１１３．２５、１０１．０７、８５．７４、８５．６４、７２．０２、７０．１３、６８．９２、６８．０８、６２．１９、５５．１３、５５．１１、４９．９０、４６．３２、４５．７８、４２．９６、４２．８６、３５．１９、３４．７８、２９．４７、２９．４１、２９．３３、２９．３１、２８．７５、２６．４８、２５．４４、２４．４８、２４．４３、２４．３９、２４．３７、２４．３４、２４．０５、２３．９９、２２．８４、２２．０４．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ１５１．３３、１５０．９９．Ｃ８３Ｈ９９Ｎ１０Ｏ１８ＰについてのＬＲＭＳ計算値１５５４．６８７６、実測値ｍ／ｚ １５５５．３（Ｍ＋１）＋、１５７７．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、１５５５．４（Ｍ−１）−、１５９１．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４６。
実施例７３：
Figure 2020114886
（２）−化合物１（３０．０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３００ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で冷却した。ＮａＨ（３．８６ｇ、１５９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌した。次に、Ｎ−（ブロモヘキシル）フタルイミド（３７．８ｇ、１２２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を一晩、７０℃に加熱した。ＤＭＦを、褐色のガムになるまで減圧下で蒸発させた。褐色のガムを、シリカゲルへの吸着のために、ＤＣＭとＭｅＯＨとの１対１の混合物に溶解させた。溶媒混合物を減圧下で除去し、粗生成物を精製したところ、８．１０ｇの２（１５．８３ｍｍｏｌ、１４．９％）ならびに２およびその３’−Ｏ−アルキル化位置異性体の混合物（２３．４５ｇ、４５．８４ｍｍｏｌ、４３．２％）が得られた。２および位置異性体の全収率は５８％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９５（ｓ，１Ｈ）、７．８９−７．７７（ｍ，４Ｈ）、６．７８（ｓ，２Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．８１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｓ，２Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．５１−５．４３（ｍ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．０８（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．３７（ｄｄ，Ｊ＝６．６、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７−４．２１（ｍ，１Ｈ）、３．９２（ｑ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．６７−３．５９（ｍ，１Ｈ）、３．５２（ｑ，Ｊ＝７．９、７．０Ｈｚ、４Ｈ）、３．３４−３．３０（ｍ，１Ｈ）、１．４５（ｄｔ，Ｊ＝３８．０、６．６Ｈｚ、４Ｈ）、１．２４−１．１２（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．９０、１６０．０３、１５６．２１、１５１．３６、１３６．０６、１３４．３１、１３１．５５、１２２．９５、１１３．４８、８６．１８、８５．１１、８０．５２、６９．５０、６９．１２、６１．６８、５４．８８、２８．９４、２７．８４、２６．００、２４．８６．Ｃ２４Ｈ２９Ｎ７Ｏ６についてのＬＲＭＳ計算値５１１．５３０４、実測値ｍ／ｚ ５１２．２（Ｍ＋１）＋、５３４．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、５４６．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．５０。
（３）−化合物２（１００ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１ｍｌ）中の１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（９０ｍｇ、１．５当量）で処理した。室温で３日後、反応物をＭｅＯＨでクエンチし、飽和重炭酸塩で洗浄し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、１２０ｍｇの３（０．１５９ｍｍｏｌ、８２％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８３（ｄｔｄ、Ｊ＝８．７、６．２、３．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．７３（ｓ，１Ｈ）、６．７６（ｓ，２Ｈ）、５．７３（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ、３Ｈ）、４．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．６、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．１８（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３（ｄｄ，Ｊ＝１２．９、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９６−３．８５（ｍ，２Ｈ）、３．７８−３．７０（ｍ，１Ｈ）、３．６６−３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．５３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．５３（ｄｐ、Ｊ＝２０．７、６．８Ｈｚ、４Ｈ）、１．３０（ｄｄｔ、Ｊ＝４４．２、１４．５、７．２Ｈｚ、４Ｈ）、１．０７−０．９５（ｍ，２８Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．８９、１６０．３２、１５６．１２、１５０．９７、１３４．３９、１３４．３３、１３１．５５、１２２．９５、１１３．２７、８６．５６、８０．８１、８０．６３、７０．４６、６９．７５、６０．２３、２９．１９、２７．９５、２６．０９、２５．２５、１７．３０、１７．１８、１７．１３、１７．０８、１６．９６、１６．８５、１６．８１、１６．７４、１２．７５、１２．３７、１２．２３、１２．０７．Ｃ３６Ｈ５５Ｎ７Ｏ７Ｓｉ２についてのＬＲＭＳ計算値７５４．０３５６、実測値ｍ／ｚ ７５４．３（Ｍ＋１）＋、７７６．３（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、７５３．３（Ｍ−１）−、７８８．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．３１。
（４）−化合物３（１０ｇ、１３．２６ｍｍｏｌ）をピリジン（２６５ｍｌ）に溶解させ、ＥｔＯＨ氷浴中で冷却した。塩化イソブチリル（１．５５ｇ、１４．５９ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を、−１０℃で２時間、次に、室温で１時間撹拌した。反応をＭｅＯＨでクエンチし、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を飽和重炭酸塩で洗浄し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔｏＡｃ／ヘキサンで溶離した）によって精製した。いくらかのＮ２およびＮ６ビス保護が起こった。７．２１ｇの純粋な４（８．７５ｍｍｏｌ、６６％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７３（ｓ，１Ｈ）、８．０２（ｓ，１Ｈ）、７．８３（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、４Ｈ）、７．１９（ｓ，２Ｈ）、５．８３（ｓ，１Ｈ）、４．６５（ｄｄ，Ｊ＝８．３、５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．３２（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５−４．０７（ｍ，１Ｈ）、３．９７−３．８５（ｍ，２Ｈ）、３．８１−３．７２（ｍ，１Ｈ）、３．６８−３．５９（ｍ，１Ｈ）、３．５３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．９１−２．８０（ｍ，１Ｈ）、１．６２−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．４１−１．２１（ｍ，４Ｈ）、１．２０−１．０７（ｍ，３Ｈ）、１．０６−０．８３（ｍ，３１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７４．７５、１６７．８２、１５６．０１、１５２．８９、１４９．４４、１３７．５７、１３４．２７、１３１．５２、１２２．８９、１１６．２７、８７．３４、８１．１９、８０．９８、７０．４９、７０．３０、６０．８３、３７．３１、３４．０１、２９．１９、２７．９２、２６．０８、２５．１６、１９．２４、１９．１９、１７．２８、１７．１３、１６．９７、１６．９１、１６．８８、１６．８２、１２．５３、１２．３５、１２．１２、１２．０４．Ｃ４０Ｈ６１Ｎ７Ｏ８Ｓｉ２についてのＬＲＭＳ計算値８２３．４１２０、実測値ｍ／ｚ ８２４．２（Ｍ＋１）＋、８４６．２（Ｍ＋２３）Ｎａ＋、８２２．２（Ｍ−１）−、８５８．２（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝１００％のＥｔＯＡｃ中の０．５４。
（５）−化合物２（５００ｍｇ、０．９７７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（１４ｍｌ）、ＰＢＳ（０．１Ｍ、０．４ｍｌ）、およびトリス（０．１Ｍ、１２ｍｌ）に溶解させた。０．１ＭのＨＣｌを用いてｐＨを７．３３に低下させてから、アデノシンデアミナーゼ（２５０単位、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）組み換え体、ＣＡＳ：９０２６−９３−１、ＳＫＵ：５２５４４）を加えた。酵素の添加の直後に白色の沈殿物が形成された。反応は３日間継続し、次に、さらに２日間そのままにしておいたが、さらなる脱アミノ化は起こらなかった。酵素の添加は、反応を促進しなかった。反応物のｐＨを監視し、６．４０〜７．８０の間に収まるように調整した。白色の沈殿物を遠心分離し、上清をデカントした。沈殿物を、ピリジンを入れたフラスコに移し、減圧下で蒸発させてから、シリカに吸着させ、手動のカラム（φ＝４．６×１３．５）によって精製した。ＤＭＳＯを、１００％のＥｔＯＡｃ（２ＣＶ）、ＤＣＭ中４％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）（１ＣＶ）、次に、ＤＣＭ中６％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）（２ＣＶ）で溶離した。次に、生成物５を、ＤＣＭ中８％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）（２．８ＣＶ）、ＤＣＭ中９％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）（１．２ＣＶ）、および最後にＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）（２．８ＣＶ）で溶離したところ、２９０ｍｇの５（０．５６６ｍｍｏｌ、５８％）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．６１（ｓ，１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、７．９５（ｓ，１Ｈ）、７．８８−７．７８（ｍ，４Ｈ）、６．４４（ｓ，２Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、５．７６（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．０６（ｓ，２Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、４．２８−４．１７（ｍ，２Ｈ）、３．６３−３．４６（ｍ，５Ｈ）、３．３８−３．２８（ｍ，３Ｈ）、１．４６（ｄｔ，Ｊ＝３７．２、６．７Ｈｚ、４Ｈ）、１．１９（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６７．８８、１５６．６１、１５３．７４、１５１．１８、１３５．３６、１３４．３２、１３１．５５、１２２．９５、１１６．５７、８５．８５、８４．４２、８１．０７、６９．５６、６８．８８、６１．３０、３７．２６、２８．９５、２７．８３、２５．９９、２４．８６．Ｃ２４Ｈ２８Ｎ６Ｏ７についてのＬＲＭＳ計算値５１２．２０１９、実測値ｍ／ｚ ５１３．１（Ｍ＋１）＋、５１１．０（Ｍ−１）−、５４７．０（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．１９。
（６）−化合物４（６．２０ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）を、水（４５ｍｌ）および氷酢酸（１０５ｍｌ）に溶解させた。次に、ＮａＮＯ２（４．１５ｇ、６０．１９ｍｍｏｌ）を、撹拌している混合物に加えた。約４０分後、さらなる４．１５ｇのＮａＮＯ２を加え、室温で２日間撹拌した。さらなる２．１ｇのＮａＮＯ２を加え、さらに２日間撹拌した。ＴＬＣによれば、出発材料は、完全に消費された。しかしながら、疑われるシリル損傷に相当する多数のスポットが観察された。次に、反応物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。有機層を飽和重炭酸塩で洗浄し、次に、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。生成物６を、粗材料のまま次の脱シリル化工程に使用した。
（７）−化合物６（７．５２ｍｍｏｌ）を、一晩、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（１４．６ｇ、９０．２８ｍｍｏｌ）を用いてＴＨＦ（１５０ｍｌ）中で脱シリル化した。ＴＨＦを減圧下で除去し、粗生成物をシリカに吸着させ、次に、シリカゲルクロマトグラフィー（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで溶離した）によって精製したところ、定量的収率が得られた。ＮＭＲは約９５％の純度を示し、約５％はジアミノヌクレオシドに関連していた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０４（ｓ，１Ｈ）、１１．６４（ｓ，１Ｈ）、８．２７（ｓ，１Ｈ）、７．８２（ｐ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．８８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．１３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．０５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２８（ｄｄｄ，Ｊ＝２３．５、６．８、４．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．９２（ｑ，Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．６３−３．５０（ｍ，３Ｈ）、３．４６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．３５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．７４（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ）、１．４３（ｄｔ，Ｊ＝２７．１、６．５Ｈｚ、４Ｈ）、１．２５−１．１３（ｍ，４Ｈ）、１．０９（ｄｄ，Ｊ＝６．７、４．８Ｈｚ、６Ｈ）．Ｃ２８Ｈ３４Ｎ６Ｏ８についてのＬＲＭＳ計算値５８２．２４３８、実測値ｍ／ｚ ５８２．２（Ｍ＋１）＋、５８１．１（Ｍ−１）−、６１６．０（Ｍ＋３５）Ｃｌ−．Ｒｆ＝７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中の０．４１。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
式Ｉを有するコンジュゲート：
Figure 2020114886
 式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
前記リンカーが、前記リガンドと前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり；および
前記リガンドが糖に由来し、（ｉ）前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、かつ（ｉｉ）前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し、
少なくとも１個のリンカーが、表１（ここで、ＤＭＴｒ基が、除去され、かつ隣接する酸素原子が、前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質への前記リンカーの結合部位である）または表１Ａに記載のものから選択される、および／または
少なくとも１個のリガンドが、
（ａ）表２または２Ａ中のリガンド、
（ｂ）−Ｒ２−（Ｒ３）ｋ（ここで、
Ｒ２が、存在しないか、またはＲ３基のための２つ以上の結合部位を有するスペーサであり、
Ｒ３が、表３に記載のものから選択される標的化モノマーであり、かつｎが、１〜５（好ましくは、１〜３）であり、各Ｒ３は、Ｒ２中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、
ｋが、１〜６である）、
（ｃ）以下の構造の１つを有するリガンド、
Figure 2020114886
 （式中、
矢印が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示し（すなわち、前記リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される）；
Ｒ６が、ＨまたはＡｃであり；
Ｒ７が、−ＯＨまたは−ＮＨＲ９であり；
Ｒ８が、ＡｃまたはＲ９であり、ここで、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つが、窒素含有部分であり；
Ｒ９が、
Figure 2020114886
 であり；
Ｑ１が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、
Figure 2020114886
 であり；
Ｑ２が、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｘが、ＨまたはＭｅであり；
Ｙが、Ｈ、Ａｃ、またはＣＯＣＦ３であり；および
ｎが、１〜８（例えば、１〜４）である）
および
（ｄ）表４または４Ａ中のリガンド
から選択される。
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
Figure 2020114886
［実施態様２］
前記オリゴヌクレオチドが、（ｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’または５’末端、（ｉｉ）位置に関係なく前記オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの１つ以上の糖部分、または（ｉｉｉ）位置に関係なく存在する前記ヌクレオシドの１つ以上の塩基部分、を介して前記リンカーに結合する、実施形態１に記載のコンジュゲート。
［実施態様３］
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドが、糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
Figure 2020114886
 式中、
５’および３’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し；
Ｒ６が核酸塩基であり、かつ任意選択的に、該核酸塩基に結合した窒素含有部分を有し；
Ｒ７がリンカーであり、ここで、Ｒ７が、Ｒ６中の窒素原子に結合し；および
各Ｒ８が、独立して、実施形態１に記載の−Ｒ２−Ｒ３から選択されるリガンドまたは実施形態１に記載の表２、２Ａ、４、もしくは４Ａからのリガンドであり、各Ｒ８は、前記リンカーＲ７中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
［実施態様４］
Ｒ６が、５位においてアミド基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換されたウラシルであり、ここで、Ｒ７が、前記アミド基の窒素原子を介してＲ６に結合する、実施形態３に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
［実施態様５］
Ｒ６が、５位においてアミド基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換されたシトシンであり、ここで、Ｒ７が、前記アミド基の窒素原子を介してＲ６に結合する、実施形態３に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
［実施態様６］
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドが、その２’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
Figure 2020114886
 式中、
５’および３’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し；
Ｒ６が核酸塩基であり；
Ｒ７がリンカーであり；
各Ｒ８が、独立して、実施形態１に記載の−Ｒ２−Ｒ３から選択されるリガンドまたは実施形態１に記載の表２、２Ａ、４、もしくは４Ａからのリガンドであり、各Ｒ８は、前記リンカーＲ７中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
［実施態様７］
前記オリゴヌクレオチドが、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介して前記リンカーに結合する、実施形態３〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
［実施態様８］
式Ｉを有するコンジュゲート：
Figure 2020114886
 式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
前記リンカーが、実施形態１の表１または表１Ａに記載のものから選択され；
前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し；および
各リガンドが、１〜６個の標的化モノマーを含む。
［実施態様９］
前記リガンドが肝臓を標的にする、実施形態８に記載のコンジュゲート。
［実施態様１０］
前記リガンドがＡＳＧＰＲを標的にする、実施形態８または９に記載のコンジュゲート。
［実施態様１１］
各リガンドが糖含有基を含む、実施形態８〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［実施態様１２］
式Ｉを有するコンジュゲート：
Figure 2020114886
 式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり；
前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく；および
各リガンドが、実施形態１の表２、２Ａ、４、または４Ａに記載のものから選択される。
［実施態様１３］
式Ｉを有するコンジュゲート：
Figure 2020114886
 式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり；
前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく；および
各リガンドが、式−Ｒ２−（Ｒ３）ｋのものであり、式中、Ｒ２がスペーサであり、Ｒ３が、実施形態１の表３に記載のものから選択される標的化モノマーであり、およびｋが１〜６であり、各Ｒ３は、Ｒ２中の窒素原子に結合し、Ｒ２中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。

Claims (13)

  1. 式Ｉを有するコンジュゲート：
    Figure 2020114886
     式中、
    前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
    前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
    前記リンカーが、前記リガンドと前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり；および
    前記リガンドが糖に由来し、ここで、（ｉ）前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、かつ（ｉｉ）前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し、
    少なくとも１個のリンカーが、表１（ここで、ＤＭＴｒ基が、除去され、かつ隣接する酸素原子が、前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質への前記リンカーの結合部位である）または表１Ａに記載のものから選択される、および／または
    少なくとも１個のリガンドが、
    （ａ）表２または２Ａ中のリガンド、
    （ｂ）−Ｒ２−（Ｒ３）ｋ（ここで、
    Ｒ２が、存在しないか、またはＲ３基のための２つ以上の結合部位を有するスペーサであり、
    Ｒ３が、表３に記載のものから選択される標的化モノマーであり、かつｎが、１〜５（好ましくは、１〜３）であり、各Ｒ３は、Ｒ２中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、
    ｋが、１〜６である）、
    （ｃ）以下の構造の１つを有するリガンド、
    Figure 2020114886
     （式中、
    矢印が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示し（すなわち、前記リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される）；
    Ｒ６が、ＨまたはＡｃであり；
    Ｒ７が、−ＯＨまたは−ＮＨＲ９であり；
    Ｒ８が、ＡｃまたはＲ９であり、ここで、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つが、窒素含有部分であり；
    Ｒ９が、
    Figure 2020114886
     であり；
    Ｑ１が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、
    Figure 2020114886
     であり；
    Ｑ２が、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
    Ｘが、ＨまたはＭｅであり；
    Ｙが、Ｈ、Ａｃ、またはＣＯＣＦ３であり；および
    ｎが、１〜８（例えば、１〜４）である）
    および
    （ｄ）表４または４Ａ中のリガンド
    から選択される。
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
    Figure 2020114886
  2. 前記オリゴヌクレオチドが、（ｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’または５’末端、（ｉｉ）位置に関係なく前記オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの１つ以上の糖部分、または（ｉｉｉ）位置に関係なく存在する前記ヌクレオシドの１つ以上の塩基部分、を介して前記リンカーに結合する、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドが、糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
    Figure 2020114886
     式中、
    ５’および３’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し；
    Ｒ６が核酸塩基であり、かつ任意選択的に、該核酸塩基に結合した窒素含有部分を有し；
    Ｒ７がリンカーであり、ここで、Ｒ７が、Ｒ６中の窒素原子に結合し；および
    各Ｒ８が、独立して、請求項１に記載の−Ｒ２−Ｒ３から選択されるリガンドまたは請求項１に記載の表２、２Ａ、４、もしくは４Ａからのリガンドであり、各Ｒ８は、前記リンカーＲ７中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
  4. Ｒ６が、５位においてアミド基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換されたウラシルであり、ここで、Ｒ７が、前記アミド基の窒素原子を介してＲ６に結合する、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  5. Ｒ６が、５位においてアミド基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換されたシトシンであり、ここで、Ｒ７が、前記アミド基の窒素原子を介してＲ６に結合する、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  6. オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドが、その２’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
    Figure 2020114886
     式中、
    ５’および３’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し；
    Ｒ６が核酸塩基であり；
    Ｒ７がリンカーであり；
    各Ｒ８が、独立して、請求項１に記載の−Ｒ２−Ｒ３から選択されるリガンドまたは請求項１に記載の表２、２Ａ、４、もしくは４Ａからのリガンドであり、各Ｒ８は、前記リンカーＲ７中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
  7. 前記オリゴヌクレオチドが、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介して前記リンカーに結合する、請求項３〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  8. 式Ｉを有するコンジュゲート：
    Figure 2020114886
     式中、
    前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
    前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
    前記リンカーが、請求項１の表１または表１Ａに記載のものから選択され；
    前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し；および
    各リガンドが、１〜６個の標的化モノマーを含む。
  9. 前記リガンドが肝臓を標的にする、請求項８に記載のコンジュゲート。
  10. 前記リガンドがＡＳＧＰＲを標的にする、請求項８または９に記載のコンジュゲート。
  11. 各リガンドが糖含有基を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  12. 式Ｉを有するコンジュゲート：
    Figure 2020114886
     式中、
    前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
    前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
    前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり；
    前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく；および
    各リガンドが、請求項１の表２、２Ａ、４、または４Ａに記載のものから選択される。
  13. 式Ｉを有するコンジュゲート：
    Figure 2020114886
     式中、
    前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり；
    前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり；
    前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり；
    前記コンジュゲートが、１〜１２個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく；および
    各リガンドが、式−Ｒ２−（Ｒ３）ｋのものであり、式中、Ｒ２がスペーサであり、Ｒ３が、請求項１の表３に記載のものから選択される標的化モノマーであり、およびｋが１〜６であり、各Ｒ３は、Ｒ２中の窒素原子に結合し、Ｒ２中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
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