TWI746590B - 核酸複合體 - Google Patents

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春元俊正
岩井宏徒
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Abstract

本發明提供一種核酸複合體，其係糖鏈配體經由連接基而與寡核苷酸鍵結而成者，且糖鏈配體於糖鏈配體之非還原末端具有O鍵結甘露糖。

Description

核酸複合體
本發明係關於一種核酸複合體及包含該核酸複合體之醫藥組合物等。
作為核酸醫藥，已知有反義核酸、陷阱(Decoy)核酸、核糖核酸酵素、siRNA(small interfering RNA，短小干擾核糖核酸)、miRNA(micro RNA，微小核糖核酸)及antimiRNA(anti-micro RNA，抗微小核糖核酸)等。核酸醫藥因其能夠控制細胞內所有基因之高通用性，而期待臨床應用於迄今為止認為難以治療之各種疾病。 又，核酸醫藥因其於細胞內之靶選擇性與活性較高，而有望成為繼抗體、低分子醫藥後之下一代醫藥。 然而，核酸醫藥存在難以傳遞至靶組織之問題。 作為於體內有效之核酸醫藥之傳遞法之一，報告有使用靶向化合物與核酸之核酸複合體(複合核酸)。作為靶向化合物，可列舉能夠與在細胞外表現之受體結合之配體。其中尤其是，已數次報告有利用N-乙醯基-D-半乳胺糖(GalNAc)等作為能夠與在肝細胞中極高地表現之脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結合之配體的核酸複合體。近年來，報告有由該等配體與siRNA類結合而成之核酸複合體可有效率地傳遞至肝細胞(非專利文獻1)。 作為靶向化合物與寡核苷酸之複合體，專利文獻1及2中揭示有例如以下所示之核酸複合體。 [化1]
Figure 02_image001
(式中，Ac表示乙醯基；以下於本說明書中相同) 又，專利文獻3中揭示有具有包含與專利文獻1及2相同之糖配體-連接單元(tether unit)之以下結構之核酸複合體。 [化2]
Figure 02_image003
又，專利文獻4中，揭示有具有以下所示之結構作為糖配體-連接單元之核酸複合體。 [化3]
Figure 02_image005
作為如專利文獻1～4中報告之先前之核酸複合體之靶器官，大部分為肝臟，其適用範圍有限。因此，強烈期望開發對肝臟以外之靶器官之細胞顯示效果之核酸複合體。 CD209(別名DC-SIGN(Dendritic Cell-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin，樹狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結合非整合素))及CD206(別名MR1(Macrophage Mannose Rceptor 1，巨噬細胞甘露糖受體1))等C型凝集素於樹狀細胞、巨噬細胞、嗜中性球等免疫系細胞中表現，作為其功能之一，報告有病毒或細菌等外來異物之捕捉。CD206於巨噬細胞或樹狀細胞之表面表現，CD209於皮膚或黏膜組織上之樹狀細胞、扁桃體、淋巴結、脾臟等淋巴組織之樹狀細胞之表面表現，已知兩者均與HIV(human immunodeficiency virus，人類免疫缺陷病毒)等病毒之捕捉有關(非專利文獻2、3)。 作為利用CD206及CD209之傳遞技術，專利文獻5中揭示將甘露糖或岩藻糖(fucose)等糖分子與抗原之複合物(conjugate)用於免疫誘導。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]國際公開第2009/073809號 [專利文獻2]國際公開第2013/075035號 [專利文獻3]國際公開第2015/105083號 [專利文獻4]國際公開第2014/179620號 [專利文獻5]國際公開第2006/093524號 [非專利文獻] [非專利文獻1]《美國化學會志》(Journal of American Chemical Society)，2014年，第136卷，p16958-16961 [非專利文獻2]《自然綜述免疫學》(Nature Reviews Immunology)，2009年，第9卷，p465-479 [非專利文獻3]《自然綜述免疫學》(Nature Reviews Immunology)，2003年，第3卷，p697-709
[發明所欲解決之問題] 本發明之目的在於提供一種新穎核酸複合體。 [解決問題之技術手段] 本發明係關於以下之(1)～(22)。 (1) 一種核酸複合體，其係糖鏈配體經由連接基而與寡核苷酸鍵結而成者，且糖鏈配體於糖鏈配體之非還原末端具有O鍵結甘露糖。 (2) 如(1)記載之核酸複合體，其中糖鏈配體具有對CD209及/或CD206顯示出結合親和性之結構。 (3) 如(1)或(2)記載之核酸複合體，其中糖鏈配體於O鍵結甘露糖之1位經由醚鍵而與環己烷骨架鍵結。 (4) 如(1)至(3)中任一項記載之核酸複合體，其中糖鏈配體具有下述結構。 [化4]
Figure 02_image007
(式中， R1 及R2 分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1～20之烷基、經取代或未經取代之碳數2～20之烯基、經取代或未經取代之碳數3～20之炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群中之基， Y1 及Y2 分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3 所組成之群中之基， R3 為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1～20之烷基) (5) 如(1)至(4)中任一項記載之核酸複合體，其中糖鏈配體係以下述結構表示。 [化5]
Figure 02_image009
(式中， R1 '及R2 '分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1～20之烷基、經取代或未經取代之碳數2～20之烯基、經取代或未經取代之碳數3～20之炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群中之基， Y1 '及Y2 '分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3 '所組成之群中之基， R3 '為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1～20之烷基) (6) 如(4)或(5)記載之核酸複合體，其中Y1 及Y2 或Y1 '及Y2 '為NH。 (7) 如(6)記載之核酸複合體，其中R1 及R2 或R1 '及R2 '為經取代或未經取代之芳烷基。 (8) 如(1)至(7)中任一項記載之核酸複合體，其中糖鏈配體係以下述結構表示。 [化6]
Figure 02_image011
(式中， R1 ''及R2 ''分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1～20之烷基、經取代或未經取代之碳數2～20之烯基、經取代或未經取代之碳數3～20之炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群中之基， Y1 ''及Y2 ''分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3 ''所組成之群中之基， R3 ''為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1～20之烷基) (9) 如(8)記載之核酸複合體，其中糖鏈配體係以下述結構表示。 [化7]
Figure 02_image013
(式中， R1 '''及R2 '''分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1～20之烷基、經取代或未經取代之碳數2～20之烯基、經取代或未經取代之碳數3～20之炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群中之基， Y1 '''及Y2 '''分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3 ''所組成之群中之基， R3 '''為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1～20之烷基) (10) 如(1)至(9)中任一項記載之核酸複合體，其具有2～8個糖鏈配體。 (11) 如(1)至(10)中任一項記載之核酸複合體，其中連接基具有下述結構中之任一結構。 [化8]
Figure 02_image015
(式中， X1 為CH或氮原子。 X2 ～X4 分別獨立為CH或氮原子) (12) 如(1)至(11)中任一項記載之核酸複合體，其中連接基具有下述結構。 [化9]
Figure 02_image017
(13) 如(1)至(12)中任一項記載之核酸複合體，其中連接基具有下述結構中之任一結構。 [化10]
Figure 02_image019
(14) 如(1)至(13)中任一項記載之核酸複合體，其中連接基具有下述結構。 [化11]
Figure 02_image021
(式中， n1為1～100之整數) (15) 如(1)至(13)中任一項記載之核酸複合體，其中連接基具有下述結構中之任一結構。 [化12]
Figure 02_image023
[化13]
Figure 02_image025
[化14]
Figure 02_image027
[化15]
Figure 02_image029
[化16]
Figure 02_image031
[化17]
Figure 02_image033
[化18]
Figure 02_image035
[化19]
Figure 02_image037
[化20]
Figure 02_image039
[化21]
Figure 02_image041
[化22]
Figure 02_image043
[化23]
Figure 02_image045
(式中， n2及n3分別獨立為1～100之整數) (16) 如(1)至(15)中任一項記載之核酸複合體，其中上述寡核苷酸包含修飾核苷酸。 (17) 一種醫藥組合物，其包含如(1)至(16)中任一項記載之核酸複合體。 (18) 如(17)記載之醫藥組合物，其用以導入至細胞內。 (19) 如(18)記載之醫藥組合物，其中上述細胞為樹狀細胞或巨噬細胞。 (20) 如(17)至(19)中任一項記載之醫藥組合物，其係靜脈內投予或皮下投予。 (21) 一種疾病之治療或預防方法，其包括將如(1)至(16)中任一項記載之核酸複合體或如(17)至(20)中任一項記載之醫藥組合物對需要其之患者進行投予。 (22) 如(21)記載之治療或預防方法，其中上述患者為哺乳動物。 [發明之效果] 例如可對哺乳動物投予包含本發明之核酸複合體之醫藥組合物，於活體內治療各種相關疾病。
本發明之核酸複合體係糖鏈配體經由連接基而與寡核苷酸鍵結而成者，且糖鏈配體於糖鏈配體之非還原末端具有O鍵結甘露糖。 核酸複合體具有糖鏈配體、連接基及寡核苷酸作為其分子內構成要素，糖鏈配體與寡核苷酸係藉由經由連接基進行鍵結而連結。糖鏈配體或寡核苷酸與連接基之鍵結較佳為共價鍵結。 本發明之核酸複合體具有糖鏈配體-連接基-寡核苷酸之結構。 本發明中，只要糖鏈配體於非還原末端具有O鍵結甘露糖即可，連接基及寡核苷酸可採用公知結構。 即，具有糖鏈配體、連接基及寡核苷酸之各結構之先前公知之核酸複合體中，糖鏈配體採用本發明中之非還原末端具有O鍵結甘露糖之糖鏈配體的核酸複合體處於本發明之範圍內。 本發明中，糖鏈配體於非還原末端具有O鍵結甘露糖。 作為O鍵結甘露糖之結構，可列舉下述結構。 [化24]
Figure 02_image047
甘露糖之O鍵結可為α鍵結，亦可為β鍵結，較佳為甘露糖之O鍵結為α鍵結。 糖鏈通常具有非還原末端與還原末端，本發明中，非還原末端為O鍵結甘露糖。 所謂非還原末端為O鍵結甘露糖，意指於糖鏈配體之最外部具有O鍵結甘露糖且不再具有其他結構。 糖鏈配體意指源自能夠與靶細胞中所表現之受體結合之糖類(單糖、二糖、三糖及多糖等)的基，可列舉包含非天然結構者。 關於作為糖類單位之單糖，作為天然存在者，例如可列舉：阿洛糖、醛糖、阿拉伯糖、克拉定糖(cladinose)、赤藻糖、赤蘚酮糖、果糖、岩藻糖醇(fucitol)、墨角藻糖胺(Fucosamine)、岩藻糖、墨角藻糖(Fuculose)、半乳胺糖、半乳糖胺醇(Galactosaminitol)、N-乙醯基-半乳胺糖、半乳糖、葡萄胺、N-乙醯基-葡糖胺、葡糖胺醇(Glucosaminitol)、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、古洛糖、甘油醛、甘油基-甘露庚糖(glyceromanno-heptose)、甘油、甘油酮(glycerone)、古洛糖、艾杜糖、來蘇糖、甘露胺糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、阿洛酮糖、異鼠李糖、異鼠李糖胺、鼠李糖醇、鼠李糖胺、鼠李糖、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、山梨糖、塔格糖、塔羅糖、酒石酸、蘇糖、木糖、及木酮糖等，該等單糖以糖苷鍵進行鍵結，作為糖類天然存在。 本發明中，糖鏈配體較佳為包含非天然結構者，意指包含上述單糖以外之結構作為非天然結構。 糖類中之各單糖可為D體或L體，亦可為D體與L體之任意比率之混合物。 糖類亦可包括脫氧糖(將醇羥基取代為氫原子而成者)、胺基糖(將醇羥基取代為胺基而成者)、硫代糖(將醇羥基取代為硫醇基而成者、或將C=O取代為C=S而成者、或將環氧取代為硫而成者)、硒糖(seleno sugar)、碲糖(telluro sugar)、氮雜糖(將環碳取代為氮而成者)、亞胺基糖(將環氧取代為氮而成者)、膦糖(phosphano sugar)(將環氧取代為磷而成者)、磷糖(phospha sugar)(將環碳取代為磷而成者)、C-取代單糖(將非末端碳原子上之氫原子取代為碳原子而成者)、不飽和單糖、醛糖醇(將羰基取代為CHOH基而成者)、醛糖酸(將醛基取代為羧基而成者)、酮醛糖酸(Ketoaldonic acid)、糖醛酸、醛糖二酸等。 關於胺基糖，作為糖類中之胺基單糖，可列舉：半乳胺糖、葡糖胺、甘露胺糖、墨角藻糖胺、異鼠李糖胺、神經胺糖酸、胞壁酸、乳糖二胺、acosamine、bacillosamine、柔紅糖胺(daunosamine)、德糖胺(desosamine)、福樂糖胺(forosamine)、加拉糖胺(Garosamine)、卡糖胺(Kanosamine)、kansosamine、碳黴糖(mycaminose)、海藻糖胺(mycosamine)、perosamine、pneumosamine、絳紅糖胺(purpurosamine)、紫紅黴胺(rhodosamine)等。又，胺基糖之胺基可經乙醯基等取代。 本發明中，糖鏈配體較佳為具有對CD209及/或CD206顯示出結合親和性之結構。 本發明中，藉由使非還原末端為O鍵結甘露糖，而對CD209及/或CD206顯示出結合親和性。 藉由使糖鏈配體對CD209及/或CD206顯示出結合親和性，核酸複合體與於樹狀細胞或巨噬細胞之細胞表面表現之受體結合，從而能夠將寡核苷酸作為核酸醫藥傳遞至該細胞。 糖鏈配體較佳為具有於甘露糖之1位經由醚鍵而與環己烷骨架鍵結之結構。 環己烷骨架係作為糖鏈配體中之非天然結構而存在，作為於甘露糖之1位經由醚鍵而與環己烷骨架鍵結之結構，可列舉具有下述結構。 [化25]
Figure 02_image049
再者，環己烷環可具有取代基，甘露糖與環己烷之糖苷鍵可為α鍵結，亦可為β鍵結。 作為於甘露糖之1位經由醚鍵而與環己烷骨架鍵結之結構，較佳為例如下述結構。 [化26]
Figure 02_image051
式中， R1 及R2 分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1～20之烷基、經取代或未經取代之碳數2～20之烯基、經取代或未經取代之碳數3～20之炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群中之基， Y1 及Y2 分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3 所組成之群中之基， R3 為氫原子或經取代或未經取代之碳數1～20之烷基。 本說明書中，所謂分別獨立意指各基為與同時規定之其他基獨立地自可選者中選擇之基，可相同亦可不同。 作為經取代或未經取代之碳數1～20之烷基，並無特別限定，例如可列舉：甲基、乙基、丙基、環丙基、異丙基、丁基、環丁基、異丁基、戊基、環戊基、己基、環己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十五烷基、二十烷基。 作為經取代或未經取代之碳數1～20之烷基中之取代基，例如可列舉選自由羥基、鹵素、巰基、硝基、氰基、羧基、胺甲醯基、C1-C3烷氧基、C1～C3烷硫基、胺基、C1-C3單烷基胺基、C1-C3二烷基胺基所組成之群中之取代基。 取代基之個數例如為1～3個，於具有複數個取代基之情形時，複數個取代基可相同亦可不同。 本說明書中，關於經取代或未經取代之碳數2～20之烯基、經取代或未經取代之碳數3～20之炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之芳烷基中之取代基，與經取代或未經取代之碳數1～20之烷基中之取代基同義。 作為經取代或未經取代之碳數2～20之烯基，只要為經取代或未經取代之碳數2～20之烷基中包含1個以上之雙鍵的基即可。作為經取代或未經取代之碳數3～20之炔基，只要為經取代或未經取代之碳數3～20之烷基中包含1個以上之三鍵的基即可。 作為經取代或未經取代之芳基，並無特別限定，可列舉：苯基、萘基、蒽基等芳香環。 作為經取代或未經取代之雜芳基，意指環內具有氮原子、氧原子或硫原子之雜芳香環，例如可列舉具有1～3個氮原子、氧原子或硫原子之5～6員芳香環。 作為經取代或未經取代之雜脂環基，意指環內具有氮原子、氧原子或硫原子之雜脂肪族環，例如可列舉具有1～3個氮原子、氧原子或硫原子之5～6員脂肪族環。 作為經取代或未經取代之芳烷基，只要為經取代或未經取代之烷基經已經取代或未經取代之芳基取代而成之基即可，可列舉經取代或未經取代之碳數1～20之烷基中包含1個以上之芳基作為取代基的基，具體而言，可列舉經取代或未經取代之苄基或苯乙基等。 Y1 及Y2 較佳為氧原子，亦較佳為NH。 較佳為R1 及R2 分別獨立為經取代或未經取代之碳數1～20之烷基，其中，較佳為R1 及R2 為甲基。亦較佳為R1 及R2 分別獨立為經取代或未經取代之芳烷基，更佳為Y1 及Y2 為NH、且R1 及R2 為經取代或未經取代之芳烷基，進而較佳為Y1 及Y2 為NH、且R1 及R2 為4-羥基苄基、4-(羥基甲基)苄基或4-(甲氧基甲基)苄基。 作為於甘露糖之1位經由醚鍵而與環己烷骨架鍵結之結構中之具體結構，並無特別限定，例如具有下述結構。 [化27]
Figure 02_image053
式中， R1 '、R2 '、Y1 '、Y2 '及R3 '分別與對應之R1 、R2 、Y1 、Y2 及R3 同義。 作為具有上述結構之糖鏈配體，具體而言，可例示下述結構中之任一結構所表示之糖鏈配體。 [化28]
Figure 02_image055
式中， R1 、R2 、Y1 及Y2 與上述同義， R1 ''、R2 ''、Y1 ''、Y2 ''及R3 ''分別與對應之R1 、R2 、Y1 、Y2 及R3 同義，較佳之取代基之組合亦同義。 作為具有上述結構之糖鏈配體，更具體而言，可例示下述結構中之任一結構所表示之糖鏈配體。 [化29]
Figure 02_image057
式中， R1 '、R2 '、Y1 '及Y2 '與上述同義， R1 '''、R2 '''、Y1 '''、Y2 '''及R3 '''分別與對應之R1 、R2 、Y1 、Y2 及R3 同義，較佳之取代基之組合亦同義。 本發明中之糖鏈配體結構可參考國際公開第2011/000721號、《分子多樣性》(Molecular Diversity，2011年，第15卷，p347-360)、《歐洲化學》(Chemistry A European Journal，2013年，第19卷，p4786-4797)及《ACS化學生物學》(ACS Chemical Biology，2010年，第5卷，p301-312)而製造。 作為本發明中之「寡核苷酸」，可使用已知之用作核酸醫藥之寡核苷酸。本發明中，所謂核酸醫藥，意指以反義核酸、陷阱核酸、核糖核酸酵素、siRNA、miRNA及antimiRNA等形式使用之核苷酸。 本發明中，關於連接基與寡核苷酸，不僅可經由構成核苷酸之糖部分之3'位或5'位而與連接基鍵結，亦可經由構成核苷酸之鹼基部分而與連接基鍵結。本發明中，寡核苷酸可理解為具有將連接基與寡核苷酸進行鍵結之結構之基，例如於寡核苷酸經由-O-P(Z)(Z')O-(式中，Z及Z'分別獨立為氧原子或硫原子)而與連接基鍵結之情形時，作為X之寡核苷酸可理解為-O-P(Z)(Z')O-寡核苷酸。 又，寡核苷酸可為單鏈或雙鏈寡核苷酸。 核酸複合體中之連接基與寡核苷酸之鍵結可於寡核苷酸等核苷酸上進行，例如於寡核苷酸之3'末端或5'末端進行鍵結。於寡核苷酸為雙鏈之情形時，連接基較佳為與構成雙鏈核酸之正義鏈之3'末端或5'末端鍵結，但並不限定於該鍵結。 本發明中，將包含與靶mRNA呈互補性之鹼基序列的核酸稱為反義核苷酸，包含與反義核苷酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列的核酸稱為正義核苷酸。 本發明中所使用之構成核酸複合體之寡核苷酸只要為於導入至哺乳動物細胞內之情形時具有控制靶基因之表現之能力者，則可為任意形狀，適宜使用單鏈寡核苷酸或雙鏈寡核苷酸。 作為寡核苷酸，只要為核苷酸或與核苷酸具有同等功能之分子之聚合物，則可為任意分子，例如可列舉：作為脫氧核糖核苷酸之聚合物的DNA、作為核糖核苷酸之聚合物的RNA、作為DNA與RNA之聚合物的嵌合核酸。又，DNA、RNA及嵌合核酸亦可為其中之至少一個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸等核苷酸被與核苷酸具有同等功能之分子取代的核苷酸聚合物。再者，RNA中之尿嘧啶(U)相當於DNA中之胸腺嘧啶(T)。作為與核苷酸具有同等功能之分子，例如可列舉對核苷酸實施修飾所得之核苷酸衍生物等，例如為了相較於DNA或RNA而增強核酸酶耐性或實現穩定化，為了提高與互補鏈核酸之親和性，為了提高細胞透過性，或者為了實現可視化，適宜使用對脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸實施修飾所得之分子等。 作為核苷酸衍生物，例如可列舉：糖部修飾核苷酸，磷酸二酯鍵修飾核苷酸，鹼基修飾核苷酸等，糖部、磷酸二酯鍵及鹽基中之至少一者經修飾之核苷酸等。 作為糖部修飾核苷酸，只要為核苷酸之糖之化學結構之局部或整體經任意取代基修飾或取代者、或經任意原子取代者，則可為任意者，可較佳地使用2'-修飾核苷酸。 作為2'-修飾核苷酸，例如可列舉核糖之2'-OH基被選自由OR、R、R'OR、SH、SR、NH2 、NHR、NR2 、N3 、CN、F、Cl、Br及I所組成之群(R為烷基或芳基，較佳為碳數1～6之烷基，R'為伸烷基，較佳為碳數1～6之伸烷基)中之取代基取代而成之2'-修飾核苷酸，作為2'-修飾，可較佳地列舉利用F、甲氧基及乙氧基進行之取代。又，亦可列舉被選自由2-(甲氧基)乙氧基(2-(methoxy)ethoxy基)、3-胺基丙氧基(3-aminopropoxy基)、2-[(N,N-二甲基胺基)氧基]乙氧基(2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基)、3-(N,N-二甲基胺基)丙氧基(3-(N,N-dimethylamino)propoxy基)、2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙氧基(2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基)、2-(甲基胺基)-2-側氧基乙氧基(2-(methylamino)-2-oxoethoxy基)、2-(N-甲基胺甲醯基)乙氧基(2-(N-methylcarbamoyl)ethoxy基)及2-氰基乙氧基(2-cyanoethoxy基)所組成之群中之取代基取代而成之2'-修飾核苷酸等。 又，作為糖部修飾核苷酸，亦適宜使用藉由對糖部導入橋接結構而具有2個環狀結構之橋接結構型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)。具體而言，可列舉：2'位之氧原子與4'位之碳原子經由亞甲基橋接的鎖式人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)[Tetrahedron Letters, 38, 8735 (1997)及Tetrahedron, 54, 3607 (1998)]、伸乙基橋接結構型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]、限制性乙基(Constrained Ethyl)(cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)]、醯胺基橋接結構型人工核酸(Amido-Bridged Nucleic Acid)(AmNA)[Chem Bio Chem 13, 2513 (2012)]及2'-O,4'-C-螺伸環丙基橋接結構型人工核酸(2'-O,4'-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid)(scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)]等。 進而，作為糖部修飾核苷酸，亦可列舉：肽核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、氧基肽核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、肽核糖核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等。 作為磷酸二酯鍵修飾核苷酸，只要為核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之局部或整體經任意取代基修飾或取代者、或經任意原子取代者，則可為任意者，例如可列舉：磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵經二硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵經烷基膦酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵經胺基磷酸酯鍵取代之核苷酸等，可較佳地列舉磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸。 作為鹼基修飾核苷酸，只要為核苷酸之鹼基之化學結構之局部或整體經任意取代基修飾或取代者、或經任意原子取代者，則可為任意者，例如可列舉：鹼基內之氧原子經硫原子取代者，氫原子經碳數1～6之烷基、鹵基取代者，甲基經氫原子、羥基甲基、碳數2～6之烷基取代者，胺基經碳數1～6之烷基、碳數1～6之烷醯基、側氧基、羥基等取代者。再者，使用5-甲基胞嘧啶(5-mC)代替胞嘧啶(C)作為鹼基修飾核苷酸亦為本發明之一較佳形態。 作為核苷酸衍生物，亦可列舉對核苷酸或者糖部、磷酸二酯鍵或鹼基之至少一者經修飾之核苷酸衍生物直接或經由連接基加成肽、蛋白質、糖、脂質、磷脂質、啡𠯤、葉酸酯、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明、香豆素、色素等其他化學物質而成者，具體而言，可列舉：5'-聚胺加成核苷酸衍生物、膽固醇加成核苷酸衍生物、類固醇加成核苷酸衍生物、膽汁酸加成核苷酸衍生物、維生素加成核苷酸衍生物、Cy5加成核苷酸衍生物、Cy3加成核苷酸衍生物、6-FAM加成核苷酸衍生物、及生物素加成核苷酸衍生物等。 核苷酸衍生物亦可與核酸內之其他核苷酸或核苷酸衍生物形成伸烷基結構、肽結構、核苷酸結構、醚結構、酯結構、及組合有該等中之至少一者之結構等橋接結構。 寡核苷酸亦包括其分子中之一部分或全部原子經質量數不同之原子(同位素)取代者。 本說明書中，所謂「互補」意指於2個鹼基間能夠進行鹼基配對之關係，例如，如腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶之關係、以及鳥嘌呤與胞嘧啶之關係般，經由鬆弛之氫鍵而雙鏈區域整體上形成雙重螺旋結構。 本說明書中，所謂「互補性」並非僅指2個核苷酸序列完全互補之情形，核苷酸序列間亦可具有0～30%、0～20%或0～10%之失配鹼基，例如，與靶mRNA呈互補性之反義寡核苷酸可於與靶mRNA之部分鹼基序列完全互補之鹼基序列中包含1個或複數個鹼基之置換。具體而言，反義寡核苷酸相對於靶基因之靶序列，可具有1～8個、較佳為1～6個、1～4個、1～3個、尤其2個或1個失配鹼基。 又，所謂「互補性」包括一核苷酸序列為於與另一核苷酸序列完全互補之鹼基序列中增添及/或缺失了1個或複數個鹼基之序列的情況。例如靶mRNA與反義寡核苷酸可因反義寡核苷酸中之鹼基之增添及/或缺失而於反義鏈及/或靶mRNA區域具有1個或2個凸起鹼基。 惟，以下表述為「互補性」之部分亦包括「互補」之含義在內。 本發明中使用之所謂反義寡核苷酸係與編碼靶基因之DNA、由編碼靶基因之DNA所轉錄之mRNA前驅物、mRNA、microRNA前驅物或microRNA呈互補性的寡核苷酸，該反義寡核苷酸與成為靶之DNA、mRNA前驅物或mRNA形成雙鏈，藉此抑制DNA、mRNA前驅物、mRNA、microRNA前驅物或microRNA之作用。 反義寡核苷酸不僅包括與成為靶之DNA、mRNA前驅物、mRNA、microRNA前驅物或microRNA完全互補者，存在1個或數個失配者只要其能夠與DNA、mRNA前驅物、mRNA、microRNA前驅物或microRNA於嚴格條件下雜交，則亦包括在內。 反義寡核苷酸只要為與靶基因雜交之核酸，則可被導入至髮夾型(hairpin)寡聚物、環狀寡聚物之形態中，可含有內部或末端之凸起或環等結構要素。 反義寡核苷酸之長度為8～80鹼基，較佳為8～30鹼基。例如可為8～20鹼基、10～20鹼基、13～20鹼基、13～16鹼基、13鹼基、14鹼基、15鹼基、16鹼基、17鹼基、18鹼基、19鹼基、20鹼基。 反義寡核苷酸若被導入細胞內，則可與互補性mRNA前驅物或mRNA結合而立體阻礙向蛋白質之轉譯，從而抑制靶基因之表現。 又，反義寡核苷酸亦可於細胞內與互補性microRNA前驅物或microRNA結合而立體阻礙microRNA之功能。 又，反義寡核苷酸有時亦會於細胞內與互補性mRNA及mRNA前驅物結合而切斷mRNA及mRNA前驅物。作為此種例，已知藉由將RNA與DNA之雙鏈之RNA鏈切斷之內切核酸酶即RNaseH的作用。本發明之細胞內之反義寡核苷酸若與mRNA及mRNA前驅物形成雙鏈，則可被RNaseH識別，而可將互補性mRNA鏈酶性分解。 對於誘導藉由RNaseH而進行之mRNA及mRNA前驅物之切斷而言，較佳為具有4～80個連續DNA區域之反義寡核苷酸。於該情形時，反義寡核苷酸較佳為具有0～80%之糖部修飾核苷酸，更佳為10～60%，進而較佳為20～50%。又，具有糖部修飾核苷酸之情形時之連續DNA區域更佳為4～20個，進而較佳為4～15個，最佳為5～10個。進而，反義寡核苷酸中之糖部修飾核苷酸之位置較佳為配置於5'末端附近及/或3'末端附近，更佳為配置於自5'端起為全長之長度之25%以內之位置及/或自3'端起為全長之長度之25%以內之位置。 反義寡核苷酸亦可藉由與互補性寡核酸形成雙鏈而以雙鏈核酸之形式導入細胞內，從而誘導靶基因之表現抑制(參考國際公開第2005/113571號)。於該情形時，雙鏈核酸經配體修飾之位置較佳為互補性寡核酸之5'末端或3'末端。 本發明中所用之反義寡核苷酸亦可藉由使用與靶基因之啟動子序列等呈互補性之鹼基序列而使靶基因表現亢進(參考國際公開第2013/173601號及國際公開第2013/173637號)。 作為製造反義寡核苷酸之方法，並無特別限定，可列舉公知之利用化學合成之方法、或酶轉錄法等。作為公知之利用化學合成之方法，可列舉：亞磷醯胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、CEM(Cation Exchange Membrane，陽離子交換膜)法[《核酸研究(Nucleic Acid Research)》，35，3287 (2007)]等，例如可使用ABI3900高通量核酸合成儀(Applied Biosystems公司製造)合成。合成結束後，進行自固相之脫離、保護基之去保護及目標物之純化等。較理想為藉由純化而獲得純度90%以上、較佳為95%以上之反義寡核苷酸。作為製造本發明之反義寡核苷酸之酶轉錄法，可列舉以具有目標鹼基序列之質體或DNA作為模板，並使用噬菌體RNA聚合酶、例如T7、T3或SP6RNA聚合酶進行轉錄之方法。 本發明中使用之雙鏈寡核苷酸只要為包含與靶mRNA之部分鹼基序列呈互補性之鹼基序列的核酸及/或包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列的核酸，則可由任意之寡核苷酸或其衍生物構成。 本發明中使用之雙鏈寡核苷酸只要包含與靶mRNA序列呈互補性之鹼基序列的核酸和包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列的核酸能夠形成雙鏈，則可為任意長度，能夠形成雙鏈之序列之長度通常為11～35鹼基，較佳為15～30鹼基，更佳為17～25鹼基，進而較佳為17～23鹼基，尤佳為19～23鹼基。 作為本發明中使用之抑制靶蛋白質之表現的雙鏈寡核苷酸，適宜使用包含與靶mRNA序列呈互補性之鹼基序列、且抑制靶蛋白質之表現的單鏈核酸，或者含有包含與靶mRNA序列呈互補性之鹼基序列的核酸和包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列的核酸、且抑制靶蛋白質之表現的雙鏈核酸。 雙鏈寡核苷酸亦可藉由使用如下分子而使靶基因表現亢進，該分子含有包含與靶基因之啟動子序列等呈互補性之鹼基序列的核酸和包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列的核酸[Nucleic Acid Research, 41, 10086 (2013)；Hepatology, 59, 216 (2014)]。 所謂雙鏈寡核苷酸係指兩條寡核苷酸配對而具有雙鏈區域之核苷酸。所謂雙鏈區域係指構成雙鏈之核苷酸或其衍生物構成鹼基對而形成有雙鏈之部分。雙鏈區域通常為11～27鹼基對，較佳為15～25鹼基對，更佳為15～23鹼基對，進而較佳為17～21鹼基對。 構成雙鏈寡核苷酸之單鏈寡核苷酸通常包含11～30鹼基，較佳為包含15～29鹼基，更佳為包含15～27鹼基，進而較佳為包含15～25鹼基，尤佳為包含17～23鹼基。 於雙鏈寡核苷酸在與雙鏈區域相連之3'側或5'側具有未形成雙鏈之追加之核苷酸或核苷酸衍生物之情形時，將其稱為突出部(懸突)。於具有突出部之情形時，構成突出部之核苷酸可為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或該等之衍生物。 作為具有突出部之雙鏈寡核苷酸，可使用於至少一條鏈之3'末端或5'末端具有包含1～6鹼基、通常包含1～3鹼基之突出部者，較佳地使用具有包含2鹼基之突出部者，例如可列舉具有包含dTdT或UU之突出部者。突出部可僅具有反義寡核苷酸、或僅具有正義寡核苷酸、或具有反義寡核苷酸與正義寡核苷酸兩者，較佳地使用於反義寡核苷酸上具有突出部之雙鏈寡核苷酸。再者，反義寡核苷酸包含雙鏈區域及與其相連之突出部。 作為雙鏈寡核苷酸，可使用包含與靶基因之鹼基序列或其互補鏈之鹼基序列相同之序列的核酸，亦可使用如下之雙鏈核酸，其含有該核酸之至少一條鏈之5'末端或3'末端被削除1～4鹼基的核酸、和包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列的核酸。 雙鏈寡核苷酸可為RNA彼此形成雙鏈之雙鏈RNA(dsRNA)、DNA彼此形成雙鏈之雙鏈DNA(dsDNA)、或RNA與DNA形成雙鏈之雜種核酸。或者雙鏈中之一條鏈或兩條鏈可為DNA與RNA之嵌合核酸。較佳為雙鏈RNA(dsRNA)。 自反義寡核苷酸之5'末端起第2個核苷酸較佳為與自靶mRNA序列之3'末端起第2個脫氧核糖核苷酸互補，更佳為自反義寡核苷酸之5'末端起第2～7個核苷酸與自靶mRNA序列之3'末端起第2～7個脫氧核糖核苷酸完全互補，進而較佳為自反義寡核苷酸之5'末端起第2～11個核苷酸與自靶mRNA序列之3'末端起第2～11個脫氧核糖核苷酸完全互補。又，較佳為自反義寡核苷酸之5'末端起第11個核苷酸與自靶mRNA序列之3'末端起第11個脫氧核糖核苷酸互補，更佳為自反義寡核苷酸之5'末端起第9～13個核苷酸與自靶mRNA序列之3'末端起第9～13個脫氧核糖核苷酸完全互補，進而較佳為自反義寡核苷酸之5'末端起第7～15個核苷酸與自靶mRNA序列之3'末端起第7～15個脫氧核糖核苷酸完全互補。 相對於雙鏈核酸區域內之核苷酸，較佳為包含50～100%之修飾核苷酸，更佳為包含70～100%，進而較佳為包含90～100%。 雙鏈寡核苷酸可化學合成，一般而言可藉由使用固相寡核苷酸合成法合成(例如參考Usman et al.,美國專利第5,804,683號說明書；美國專利第5,831,071號說明書；美國專利第5,998,203號說明書；美國專利第6,117,657號說明書；美國專利第6,353,098號說明書；美國專利第6,362,323號說明書；美國專利第6,437,117號說明書；美國專利第6,469,158號說明書；Scaringe et al.,美國專利第6,111,086號說明書；美國專利第6,008,400號說明書；美國專利第6,111,086號說明書)。 RNA可藉由酶性或部分/全部有機合成而生成，或可於體外藉由酶性或有機合成而導入經修飾之核糖核苷酸。於一態樣中，各鏈係藉由化學方式製備。化學合成RNA分子之方法於該技術領域中為公知[參考Nucleic Acids Research, 32, 936 (1998)]。 作為本發明中使用之RNA，可列舉包含靶基因之mRNA上連續15～30鹼基、較佳為17～25鹼基、更佳為19～23鹼基之序列(以下稱為序列X)及與序列X呈互補性之鹼基之序列(以下稱為互補性序列X')的RNA，例如可列舉：含有包含序列X之正義寡核苷酸及包含互補性序列X'之反義寡核苷酸的雙鏈RNA、該正義寡核苷酸與該反義寡核苷酸經由間隔子寡核苷酸連結之具有髮夾型結構之RNA。 作為包含序列X之正義寡核苷酸，可列舉：僅包含序列X作為鹼基之RNA(以下稱為序列X鏈)、於序列X鏈之3'端或5'端或兩端增添有相同或不同之1～6個、較佳為2～4個核苷酸之RNA。 作為包含互補性序列X'之反義寡核苷酸，可列舉：僅包含互補性序列X'作為鹼基之RNA(以下稱為互補性序列X'鏈)、於互補性序列X'鏈之3'端或5'端或兩端增添有相同或不同之1～6個、較佳為2～4個核苷酸之雙鏈RNA等。 作為包含序列X之正義寡核苷酸與包含互補性序列X'之反義寡核苷酸經由間隔子寡核苷酸連結之具有髮夾型結構之RNA的間隔子寡核苷酸，較佳為6～12鹼基之核苷酸，且較佳為其5'端之序列為2個U。作為間隔子寡核苷酸之例，可列舉包含UUCAAGAGA之鹼基序列之寡核苷酸。關於經間隔子寡核苷酸連結之2個RNA之順序，哪個RNA成為5'側均可，較佳為包含序列X之正義鏈成為5'側。 序列X鏈及互補性序列X'鏈上增添之核苷酸、以及間隔子寡核苷酸之鹼基可為鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶中之任一種或複數種，又，與各鹼基鍵結之糖可為核糖、脫氧核糖或2'位之羥基經修飾基取代之核糖中之任意者，作為所增添之核苷酸，更佳為尿苷酸(U)及脫氧胸苷酸(dT)之任一種或兩種。又，可將序列X鏈之3'端所增添之核苷酸之鹼基之序列設為和於靶基因之mRNA內與序列X鄰接之核苷酸之鹼基之序列相同的鹼基序列。又，可將互補性序列X'鏈之3'端所增添之核苷酸之鹼基之序列設為和於靶基因之mRNA內與序列X鄰接之核苷酸之鹼基之序列呈互補性的鹼基序列。 作為本發明中使用之RNA之更佳例，例如可列舉：(a)含有包含序列X之正義寡核苷酸及包含互補性序列X'之反義寡核苷酸的雙鏈RNA，其中序列X為靶基因之mRNA上連續19～21鹼基之序列，正義寡核苷酸包含序列X鏈及序列X鏈之3'端所增添之相同或不同之2～4個核苷酸，反義寡核苷酸包含互補性序列X'鏈及互補性序列X'鏈之3'端所增添之相同或不同之2～4個核苷酸；(b)含有包含序列X之正義寡核苷酸及包含互補性序列X'之反義寡核苷酸的雙鏈RNA，其中序列X為靶基因之mRNA上連續23～25鹼基之序列，正義寡核苷酸為序列X鏈，反義寡核苷酸為互補性序列X'鏈；(c)含有包含序列X之正義寡核苷酸及包含互補性序列X'之反義寡核苷酸的雙鏈RNA，其中序列X為靶基因之mRNA上連續23～27鹼基之序列，正義寡核苷酸包含序列X鏈及序列X鏈之3'端所增添之相同或不同之2～4個核苷酸，反義寡核苷酸包含互補性序列X'鏈及互補性序列X'鏈之3'端所增添之相同或不同之2～4個核苷酸，互補性序列X'鏈之3'端所增添之核苷酸之鹼基之序列為和於靶基因之mRNA內與序列X鄰接之核苷酸之鹼基之序列呈互補性的鹼基序列；等。 又，作為本發明中使用之RNA，較佳地列舉利用RNA干擾(RNAi)之具有該靶基因之表現抑制作用的RNA。 關於單鏈寡核苷酸，採用固相亞磷醯胺法[參考Nucleic Acids Research, 30, 2435 (1993)]合成，進行去保護，並於NAP-5管柱(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上進行脫鹽。寡聚物係採用時長15分鐘之線性梯度之Amersham Source 15Q管柱-1.0 cm。使用利用高度25 cm(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)之離子交換高性能液相層析法(IE-HPLC)進行純化。梯度係自90：10之緩衝液A：B變為52：48之緩衝液A：B，緩衝液A為100 mmol/L Tris pH值8.5，緩衝液B為100 mmol/L Tris pH值8.5(1 mol/L之NaCl)。於260 nm下監測試樣，對與全長寡核苷酸種對應之波峰進行收集，加以混合，利用NAP-5管柱進行脫鹽並冷凍乾燥。 各單鏈寡核苷酸之純度係藉由利用Beckman PACE 5000(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif)之毛細管電泳(CE)而確定。CE毛細管其內徑為100 μm，內含ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)。典型而言，將約0.6 nmole之寡核苷酸注射至毛細管內，於444 V/cm之電場下實施電泳，藉由260 nm下之UV吸光度進行檢測。改性Tris-硼酸-7 mol/L-尿素電泳緩衝液係自Beckman-Coulter購入。獲得用於以下記述之實驗的藉由CE評價時純度至少達90%之單鏈寡核苷酸。化合物同一性係根據製造業者之推薦操作說明，藉由利用Voyager DE.TM.Biospectometry Workstation(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)之基質輔助雷射脫附電離-飛行時間型(MALDI-TOF)質譜法進行驗證。單鏈寡核苷酸之相對分子質量可於預測之分子質量之0.2%以內獲得。 使單鏈寡核苷酸以100 μmol/L濃度再懸浮於包含100 mmol/L乙酸鉀、30 mmol/L HEPES之pH值7.5之緩衝液中。將呈互補性之正義鏈與反義鏈以同等莫耳量進行混合，獲得50 μmol/L雙鏈寡核苷酸之最終溶液。歷時5分鐘將試樣加熱至95℃，於使用前冷卻至室溫。雙鏈核酸係於-20℃下保存。單鏈寡核苷酸係進行冷凍乾燥、或於無核酸酶之水中以-80℃貯藏。 作為本發明中之「連接基」，可使用已知之用於核酸複合體之任意連接基。 作為連接基結構之例示，例如可採用國際公開第2009/073809號、國際公開第2013/075035號、國際公開第2015/105083號、國際公開第2014/179620號、國際公開第2015/006740號、國際公開第2017/010575號中所揭示之結構。 連接基可為直鏈結構，但宜具有成為分支結構之下述結構中之任一結構。 例如藉由具有下述分支，可形成分子內具有複數個糖鏈配體之核酸複合體，宜具有2～8個糖鏈配體。 [化30]
Figure 02_image059
式中， X1 為CH或氮原子。 X2 ～X4 分別獨立為CH或氮原子。 連接基宜進而具有下述結構中之任一結構。 [化31]
Figure 02_image061
本發明中，於連接基具有下述結構之情形時，例如可參考國際公開第2009/073809號、國際公開第2013/075035號、國際公開第2015/105083號、國際公開第2014/179620號、國際公開第2015/006740號、國際公開第2017/010575號而製造連接基。 [化32]
Figure 02_image063
X1 與上述同義。 本發明中，於連接基具有下述結構之情形時，可藉由如以下例示之方法製造本發明之核酸複合體。 [化33]
Figure 02_image065
X2 ～X4 分別獨立地與上述同義。X2 ～X4 例如均為CH，於該情形時以下述結構表示。 [化34]
Figure 02_image067
於該等情形時，本發明之核酸複合體宜為下述式1所表示之核酸複合體。 式1： [化35]
Figure 02_image069
式1中， X為寡核苷酸， X2 ～X4 分別獨立地與上述同義。 L1及L2分別獨立為糖鏈配體， S1、S2及S3分別獨立為構成連接基之部分結構。 式1中，下述結構為連接基， [化36]
Figure 02_image071
S1、S2及S3為構成連接基之部分結構， X2 ～X4 分別獨立地與上述同義。 再者，以下對上述式1之核酸複合體進行說明，但於核酸複合體轉而具有以下結構時亦可應用式1中之說明。 [化37]
Figure 02_image073
再者，S4可理解為與S1及S2同義，X1 與上述同義，L3為糖鏈配體。 式1中，相對於S3於苯環上之取代位置，S1及S2分別可於鄰位、間位、對位與苯環鍵結，但宜為下述式1-1所表示之核酸複合體。意指式1中之S1及S2於苯環上之鍵結鍵可為除苯環上之S3之取代位置以外之任意位置。 式1-1： [化38]
Figure 02_image075
式1-1中， X、L1、L2、S1、S2及S3分別與上述同義。 本說明書中，所謂與上述同義，意指若對式1-1中進行例示說明，則關於式1-1中之X、L1、L2、S1及S2各者，可為與式1中對上述X、L1、L2、S1及S2各者之定義相同的基。 本發明中，關於S3與寡核苷酸，不僅可經由構成核苷酸之糖部分之3'位或5'位而與S3鍵結，亦可經由構成核苷酸之鹼基部分而與S3鍵結。本發明中，寡核苷酸可理解為具有將S3與寡核苷酸進行鍵結之結構之基，例如於寡核苷酸經由-O-P(Z)(Z')O-(式中，Z及Z'分別獨立為氧原子或硫原子)而與S3鍵結之情形時，作為X之寡核苷酸可理解為-O-P(Z)(Z')O-寡核苷酸。 式1中，S1與S2只要為將作為糖鏈配體之L1與L2和苯環進行連結之結構，則並無特別限定，可採用核酸複合體中所用之公知結構。S1與S2可相同亦可不同。 作為糖鏈配體之L1與L2較佳為與S1及S2藉由糖苷鍵而連結，S1及S2分別可與苯環藉由例如-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵而連結。 S3為具有與寡核苷酸之鍵結部的連接基，只要為將作為寡核苷酸之X與苯環進行連結之結構，則並無特別限定，可採用核酸複合體中所用之公知結構。 作為寡核苷酸之X較佳為與S3藉由磷酸二酯鍵而連結，S3可與苯環藉由例如-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵而連結。 作為構成連接基之部分結構的S1、S2及S3例如可採用國際公開第2009/073809號、國際公開第2013/075035號、國際公開第2015/105083號、國際公開第2014/179620號、國際公開第2015/006740號中所揭示之結構。 本發明中，核酸複合體宜為具有下述式2所表示之結構之核酸複合體。 式2： [化39]
Figure 02_image077
式2中， X、X2 ～X4 、L1、L2及S3分別與上述同義， P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q1、Q2、Q3及Q4分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數2～12之伸烷基、-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -，n為0～99之整數， B1及B2分別獨立，或為鍵結鍵，或為下述式2-1所表示之任一結構，各結構中之末端之黑色圓點分別為與P2或P3、或者與P5或P6之鍵結點，m1、m2、m3及m4分別獨立為0～10之整數， 式2-1： [化40]
Figure 02_image079
p1及p2分別獨立為1、2或3之整數， q1、q2、q3及q4分別獨立為0～10之整數， 其中，於p1及p2分別為2或3之整數時，各P3及P6、Q2及Q4、T1及T2、以及L1及L2可相同或不同。 P1及P4分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-O-、-O-CO、-NH-CO-或-CO-NH-，較佳為-O-、-NH-CO-或-CO-NH-，進而較佳為-NH-CO-。 於P1或P4例如為-NH-CO-之情形時，具有-NH-CO-苯環之部分結構。 Q1、Q2、Q3及Q4分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -，n為1～99之整數，較佳為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基，更佳為未經取代之碳數1～12之伸烷基，進而較佳為未經取代之碳數1～6之伸烷基，進而更佳為未經取代之碳數1～4之伸烷基。 P2及P5分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為不存在或為-CO-O-或-CO-NH-，更佳為不存在或為-CO-NH-。於P2及P5例如為-CO-NH-之情形時，具有B1-CO-NH-Q1及B2-CO-NH-Q3之部分結構。 -(P2-Q1)q1 -及-(P5-Q3)q3 -分別獨立，宜不存在或為下述式3-1～式3-3所表示之任一結構。 式3-1： [化41]
Figure 02_image081
式3-2： [化42]
Figure 02_image083
式3-3： [化43]
Figure 02_image085
式3-1～3-3中， m5及m6分別獨立為0～10之整數，式3-1～式3-3之結構中之末端之黑色圓點分別為與B1或B2、或者與P1或P4之鍵結點。 B1及B2分別獨立為鍵結鍵，或為下述式所表示之任一結構，各結構中之末端之黑色圓點分別為與P2或P3、或者與P5或P6之鍵結點，m1、m2、m3及m4分別獨立為0～10之整數。 [化44]
Figure 02_image087
B1及B2較佳為源自麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、亞胺基二乙酸等包含非天然胺基酸之胺基酸、或源自1,3-丙二醇等胺基醇之基，於B1及B2為源自麩胺酸及天冬胺酸之基之情形時，麩胺酸及天冬胺酸之胺基分別鍵結，作為P2及P5，較佳為-NH-CO-鍵，於B1及B2為源自離胺酸之基之情形時，離胺酸之羧基分別鍵結，作為P2及P5，較佳為-CO-NH-鍵，於B1及B2為源自亞胺基二乙酸之基之情形時，亞胺基二乙酸之胺基分別鍵結，作為P2及P5，較佳為-CO-鍵。 X2 ～X4 較佳為分別獨立為CH，X2 ～X4 更佳為同時為CH。 本發明中，核酸複合體宜為具有下述式4-1～4-9所表示之結構之核酸複合體。 式4-1： [化45]
Figure 02_image089
式4-2： [化46]
Figure 02_image091
式4-3： [化47]
Figure 02_image093
式4-4： [化48]
Figure 02_image095
式4-5： [化49]
Figure 02_image097
式4-6： [化50]
Figure 02_image099
式4-7： [化51]
Figure 02_image101
式4-8： [化52]
Figure 02_image103
式4-9： [化53]
Figure 02_image105
式4-1～4-9中， X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2及q4分別與上述同義。 P3及P6分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-OCO-或-NH-CO-，更佳為-NH-CO-。於P3及P6例如為-NH-CO-之情形時，分別具有B1-NH-CO-Q2及B2-NH-CO-Q4之部分結構。 T1及T2分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-O-或-S-，更佳為-O-。 本發明中，核酸複合體宜為具有下述式5所表示之結構之核酸複合體。 式5係式2中之P1與P4、P2與P5、P3與P6、Q1與Q3、Q2與Q4、B1與B2、T1與T2、L1與L2、p1與p2、q1與q3、以及q2與q4分別相同。 式5： [化54]
Figure 02_image107
式5中， X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2分別與上述同義。 又，式5中之X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2分別可為上述較佳基，但P1較佳為-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。 式5中之-(P2-Q1)q1-宜不存在或為上述式3-1～式3-3所表示之任一結構。 本發明中，核酸複合體宜為具有下述式6-1～6-9所表示之結構之核酸複合體。 式6-1： [化55]
Figure 02_image109
式6-2： [化56]
Figure 02_image111
式6-3： [化57]
Figure 02_image113
式6-4： [化58]
Figure 02_image115
式6-5： [化59]
Figure 02_image117
式6-6： [化60]
Figure 02_image119
式6-7： [化61]
Figure 02_image121
式6-8： [化62]
Figure 02_image123
式6-9： [化63]
Figure 02_image125
式6-1～式6-9中， X、S3、P3、Q2、T1及L1分別與上述同義。 本發明中，核酸複合體宜為具有下述式7-1～式7-9中之任一者所表示之結構之核酸複合體。 式7-1： [化64]
Figure 02_image127
式7-2： [化65]
Figure 02_image129
式7-3： [化66]
Figure 02_image131
式7-4： [化67]
Figure 02_image133
式7-5： [化68]
Figure 02_image135
式7-6： [化69]
Figure 02_image137
式7-7： [化70]
Figure 02_image139
式7-8： [化71]
Figure 02_image141
式7-9： [化72]
Figure 02_image143
式7-10： [化73]
Figure 02_image145
式7-11： [化74]
Figure 02_image147
式7-12： [化75]
Figure 02_image149
式7-13： [化76]
Figure 02_image151
式7-14： [化77]
Figure 02_image153
式7-15： [化78]
Figure 02_image155
式7-16： [化79]
Figure 02_image157
式7-17： [化80]
Figure 02_image159
式7-18： [化81]
Figure 02_image161
式7-19： [化82]
Figure 02_image163
式7-20： [化83]
Figure 02_image165
式7-21： [化84]
Figure 02_image167
式7-1～式7-21中， X、L1、L2、S3、n2或n3分別與上述同義。L1與L2可相同亦可不同，宜為相同。 式7-1～式7-9中，藉由於各伸烷基部分導入不同鏈長之伸烷基鏈，又，藉由將醯胺鍵等替換為其他鍵，亦可製造具有式7-1～式7-9所表示之結構之核酸複合體以外之核酸衍生物。 如上所述，本發明之核酸複合體中所使用之連接基宜具有下述結構。 [化85]
Figure 02_image169
(式中， n1為1～100之整數) n1較佳為5～95之整數，更佳為10～80之整數，進而較佳為15～60之整數，進而更佳為20～40之整數。 n2及n3分別相同或不同，較佳為5～95之整數，更佳為10～80之整數，進而較佳為15～60之整數，進而更佳為20～40之整數。 本發明中，核酸複合體宜為具有下述式11所表示之結構之核酸複合體。 式11： [化98]
Figure 02_image171
式11中， L1、L2、S1及S2分別與上述同義， P7及P8分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q5、Q6及Q7分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH2 CH2 O)n8 -CH2 CH2 -，n8為0～99之整數， B3為下述式11-1所表示之任一結構，虛線處分別意指與Q5及Q6之鍵結鍵， 式11-1： [化99]
Figure 02_image173
q5及q6分別獨立為0～10之整數。 P7或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-O-、-NH-CO-或-CONH-，更佳為-O-或-NH-CO-。於P7例如為-O-之情形時，具有苯環-O-之部分結構を有する。 P8或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，於存在之情形時，較佳為-CO-O-或-CO-NH-，更佳為-CO-NH-。於P8例如為-CO-NH-之情形時，具有Q6-CO-NH-之部分結構。 Q5、Q6及Q7分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH2 CH2 O)n8 -CH2 CH2 -，n8為0～99之整數，較佳為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基，更佳為未經取代之碳數1～12之伸烷基，進而較佳為未經取代之碳數1～6之伸烷基，進而更佳為未經取代之碳數1～4之伸烷基。 -(P7-Q5)q5 -宜為-O-(CH2 )m15 -NH-及-NH-CO-(CH2 )m16 -NH-，m15及m16分別獨立為1～10之整數。 本發明中，核酸複合體宜為具有下述式12-1～式12-12中之任一者所表示之結構之核酸複合體。 式12-1： [化100]
Figure 02_image175
式12-2： [化101]
Figure 02_image177
式12-3： [化102]
Figure 02_image179
式12-4： [化103]
Figure 02_image181
式12-5： [化104]
Figure 02_image183
式12-6： [化105]
Figure 02_image185
式12-7： [化106]
Figure 02_image187
式12-8： [化107]
Figure 02_image189
式12-9： [化108]
Figure 02_image191
式12-10： [化109]
Figure 02_image193
式12-11： [化110]
Figure 02_image195
式12-12： [化111]
Figure 02_image197
式12-1～12-12中， X、L1、L2、S1及S2分別與上述同義，n1'～n12'分別獨立為1～10之整數。 作為本發明之另一較佳態樣之一，可列舉具有以下結構之核酸複合體。 [化112]
Figure 02_image199
[化113]
Figure 02_image201
式～式中， X、L1、S3或n2分別與上述同義。 關於本發明之核酸複合體，於式1所表示之核酸複合體中，較佳為一併具有式2及式11之結構之核酸複合體，該核酸複合體中，可為式11之結構，式2可為式4-1～式4-9，或可為式6-1～式6-9，或可為式7-1～式7-9，於式2為式4-1～式4-9、式6-1～式6-9、或式7-1～式7-9之情形時，式11可為式12-1～式12-12。關於本發明之核酸複合體，於式1所表示之核酸複合體中，更佳為一併具有式4-1～式4-9中之任一結構及式12-1～式12-12中之任一結構的核酸複合體、一併具有式6-1～式6-9中之任一結構及式12-1～式12-12中之任一結構的核酸複合體、一併具有式7-1～式7-9中之任一結構及式12-1～式12-12中之任一結構的核酸複合體。 再者，本說明書中，於將糖鏈配體表示為「Ligand」或「L1」等之情形時，亦存在包含與糖鏈配體直接鍵結之連接基之一部分(例如-O-(CH2 )2 -)而表示之情況。 關於本發明之核酸複合體，於任一氮原子上之孤電子對與氫離子進行有配位之情形時，可與製藥上可容許之陰離子形成鹽。 本發明中，作為製藥上可容許之陰離子，例如可列舉：氯化物離子、溴化物離子、硝酸根離子、硫酸根離子、磷酸根離子等無機酸根離子，乙酸根離子、草酸根離子、順丁烯二酸根離子、反丁烯二酸根離子、檸檬酸根離子、苯甲酸根離子、甲磺酸根離子等有機酸根離子等。 對本發明之核酸複合體之製造法進行說明。再者，以下所示之製造法中，於所定義之基會於該製造法之條件下變化或不適於實施該製造法之情形時，可藉由使用有機合成化學中常用之保護基之導入及去除方法[例如《有機合成中的保護基》第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)，T.W.Greene著，John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等中記載之方法]等而製造目標化合物。又，視需要亦可改變取代基導入等反應步驟之順序。 式1所表示之核酸聚合物亦可藉由固相合成而合成。 式1所表示之核酸聚合物可參考作為核酸複合體所公知之連接基結構之合成方法進行合成。 關於式1所表示之核酸複合體中之以S1作為連接基之L1-苯環單元或以S2作為連接基之L2-苯環單元之合成，例如以式2所表示之核酸複合體為例進行說明。 式2所表示之核酸複合體中之L1-苯環單元或L2-苯環單元藉由P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2而連結。 P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2之-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵例如可藉由參考第4版實驗化學講座19「有機化合物之合成I」丸善(1992年)、第4版實驗化學講座20「有機化合物之合成II」丸善(1992年)等中記載之鍵結反應之方法，選擇適於形成式2所表示之結構之原料而適當合成。 又，於苯環上依序鍵結具有Q1作為部分結構之化合物、具有B1作為部分結構之化合物，藉此可製造L1-苯環單元之部分結構。 另行合成具有L1與Q2作為部分結構之化合物，使具有L1與Q2作為部分結構之化合物與具有苯環、Q1及B1作為部分結構的具有L1-苯環單元之部分結構之化合物進行鍵結，藉此可製造L1-苯環單元結構。 關於L2-苯環單元亦同樣地，於苯環上依序鍵結具有Q3作為部分結構之化合物、具有B2作為部分結構之化合物，藉此可製造L2-苯環單元之部分結構。 另行合成具有L2與Q4作為部分結構之化合物，使具有L2與Q4作為部分結構之化合物與具有苯環、Q3及B2作為部分結構的具有L2-苯環單元之部分結構之化合物進行鍵結，藉此可製造L2-苯環單元結構。 關於具有Q1作為部分結構之化合物、具有Q3作為部分結構之化合物，可列舉於碳數1～10之伸烷基或-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -之兩末端具有羥基、羧基、胺基、硫醇基之化合物。 關於具有B1作為部分結構之化合物、具有B2作為部分結構之化合物，可列舉具有下述式2-1所表示之任一結構、且各結構中之末端之黑色圓點處分別具有羥基、羧基、胺基或硫醇基的化合物。 式2-1： [化114]
Figure 02_image203
關於具有B1作為部分結構之化合物、具有B2作為部分結構之化合物之具體例，可列舉：二醇、麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羥甲基胺基甲烷)、亞胺基二乙酸、2-胺基-1,3-丙二醇等，較佳為麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、亞胺基二乙酸。 亦可藉由合成具有L1、Q2及B1作為部分結構之化合物後，使之與具有Q1與苯環之化合物進行鍵結，而製造L1-苯環單元結構。 亦可藉由合成具有L2、Q4及B2作為部分結構之化合物後，使之與具有Q3與苯環之化合物進行鍵結，而製造L2-苯環單元結構。 本發明中，作為[L1-T1-(Q2-P3)q2 -]p1 -B1-(P2-Q1)q1 -P1-之部分結構與作為[L2-T2-(Q3-P6)q4 -]p2 -B2-(P5-Q3)q3 -P2-之部分結構可相同或不同，但較佳為相同。 作為相當於糖鏈配體之L1-T1-Q2的單元，例如可列舉：L3-T1-Q2-COOH、L3-T1-(Q2-P3)q2-1 -Q2-NH2 等。具體而言，可列舉：L3-O-碳數1～12之伸烷基-COOH、或L3-碳數1～12之伸烷基-CO-NH-碳數2～12之伸烷基-NH2 等。 L3只要為藉由去保護而成為L1之糖鏈配體衍生物，則並無特別限定。作為糖鏈配體之取代基，只要為糖質化學領域中通用之取代基，則並無特別限定，較佳為Ac基。 關於以S1作為連接基之L1-苯環單元或以S2作為連接基之L2-苯環單元之合成，具體而言，藉由參考實施例記載之方法，使用適當增減伸烷基鏈之碳數、並將末端胺基或末端羧基替換成能夠形成-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CONH-鍵之基的化合物，藉此可合成。又，關於L1之糖鏈配體，雖然實施例中例示有甘露糖衍生物、甘露糖或N-乙醯基半乳胺糖，但亦可變更為其他糖鏈配體而實施。 關於式1所表示之核酸複合體中之以S3作為連接基之X-苯環單元之合成，例如以式11所表示之核酸複合體為例進行說明。 式11所表示之核酸複合體中之X-苯環單元除具有寡核苷酸之鍵以外，亦具有P7及P8所表示之鍵。 P7及P8之-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵例如可藉由參考第4版實驗化學講座19「有機化合物之合成I」丸善(1992年)、第4版實驗化學講座20「有機化合物之合成II」丸善(1992年)中記載之鍵結反應之方法，選擇適於形成式11所表示之結構之原料而適當合成。 又，於苯環上依序鍵結具有Q5作為部分結構之化合物、具有B3作為部分結構之化合物，藉此可製造X-苯環單元之部分結構。 另行合成具有X與Q7作為部分結構之化合物或具有X與Q6作為部分結構之化合物，使具有X與Q7作為部分結構之化合物或具有X與Q6作為部分結構之化合物與具有苯環及Q5作為部分結構的具有X-苯環單元之部分結構之化合物進行鍵結，而構建B3部分，藉此可製造X-苯環單元結構。 具體而言，若以於具有苯環及Q5作為部分結構的具有X-苯環單元之部分結構之化合物之末端具有疊氮基之情形為例，則藉由與如實施例中揭示之經末端鍵結性官能基化之寡核苷酸進行反應而使之環化加成，形成三唑環，從而構建B3部分，藉此可製造X-苯環單元結構。 關於具有Q5作為部分結構之化合物、具有Q6作為部分結構之化合物、具有Q7作為部分結構之化合物，可列舉於碳數1～10之伸烷基或-(CH2 CH2 O)n8 -CH2 CH2 -之兩末端具有羥基、羧基、胺基、硫醇基之化合物。 L1-苯環單元結構、L2-苯環單元結構與X-苯環單元結構可分別依序製造，較佳為合成L1-苯環單元結構及L2-苯環單元結構後再鍵結X-苯環單元結構。尤其關於具有寡核苷酸部分之X，較佳為於接近糖鏈配體複合體合成之最終步驟時導入化合物內。製造方法 1 式1-1中P1及P4為-NH-CO-、-O-CO-或-S-CO-之L1-苯環單元結構及L2-苯環單元結構可藉由以下方法製造。 [化115]
Figure 02_image205
(式中，Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、P2、P3、P5、P6、P7、T1、T2、L1、L2、q1、q2、q3及q4分別與上述同義，q2'表示比q2小1之整數，q4'表示比q4小1之整數，P1'及P4'分別獨立表示-NH-CO-、-O-CO-或-S-CO-，Z表示H、OH、NH2 、SH、氯原子、溴原子、碘原子、甲磺醯氧基、對乙磺醯氧基或羧酸，B1'及B2'表示下述式之結構體之任一者，PG1、PG2、PG3、PG4、PG5、PG6及PG7分別表示適宜之保護基) 式： [化116]
Figure 02_image207
m1、m2、m3或m4分別獨立表示0～10之整數。 步驟1 化合物(I-C)可藉由使化合物(I-A)與化合物(I-B)於四氫呋喃等溶劑中，添加三苯膦聚合物載體，於冰浴冷卻下，使之與偶氮二羧酸二異丙酯甲苯溶液反應而製造。 作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、吡啶、水等，該等可單獨或混合使用。 化合物(I-A)可作為市售品購得。 步驟2 化合物(I-D)可藉由使用化合物(I-C)，於甲醇等溶劑中，於冰浴冷卻下，於鹼存在下進行反應而製造。 作為溶劑，可列舉製造方法1步驟1中所例示者。 作為鹼，例如可列舉：碳酸銫、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基𠰌啉、吡啶、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、N,N-二甲基-4-胺基吡啶(DMAP)等。 步驟3 化合物(I-F)可藉由使化合物(I-D)及化合物(I-E)於無溶劑下或溶劑中，於1～30當量之鹼、縮合劑及視需要0.01～30當量之添加劑之存在下，於室溫至200℃之間之溫度下，進行5分鐘～100小時之反應而製造。 作為溶劑，可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、吡啶，該等可單獨或混合使用。 作為鹼，可列舉製造方法1步驟2中所例示者。 作為縮合劑，例如可列舉：1,3-二環己烷碳二醯亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺・鹽酸鹽(EDC)、羰基二咪唑、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(二甲基胺基)鏻、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻、六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(HATU)、六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(HBTU)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓等。 作為添加劑，例如可列舉：1-羥基苯并三唑(HOBt)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP)等。 步驟4 化合物(I-H)可使用化合物(I-F)及化合物(I-G)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 步驟5 化合物(I-J)可使用化合物(I-H)及化合物(I-I)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 又，藉由反覆進行DP步驟與步驟5，可製造q1被調整為理想值之化合物(I-J)。 步驟6 化合物(I-L)可使用化合物(I-J)及化合物(I-K)，於與製造方法1之步驟3製造方法1之步驟2相同之條件下製造。 步驟7 化合物(I-N)可使用化合物(I-L)及化合物(I-M)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 步驟8～10 化合物(I')可使用化合物(I-O)、化合物(I-P)及化合物(I-Q)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 又，藉由反覆進行DP步驟與步驟8，可製造q3被調整為理想值之化合物(I')。 步驟DP 可藉由適當使用有機合成化學中常用之方法[例如《有機合成中的保護基》第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)，T.W.Greene著，John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等中記載之方法等]而製造。 化合物(I-B)、化合物(I-E)、化合物(I-G)、化合物(I-I)、化合物(I-K)、化合物(I-M)、化合物(I-O)、化合物(I-P)及化合物(I-Q)可作為市售品購得，或藉由將「實驗化學講座第4版 有機合成，p.258，丸善(1992年)」、「March's Advanced Organic Chemistry：Reactions、Mechanisms and Structure，第7版」中記載之方法加以組合、或藉由依據其之方法而獲得。製造方法 2 式2中P1及P4為-O-、X2～X4為CH之L1-苯環單元結構及L2-苯環單元結構可藉由以下方法製造。 [化117]
Figure 02_image209
(式中，Q1、Q2、Q3、Q4、P2、P3、P5、P6、T1、T2、L1、L2、q1、q2、q3、q4、q2'、q4'、Z、B1'或B2'分別與上述同義，PG8、PG9、PG10、PG11、PG12、PG13及PG14分別表示適宜之保護基) 步驟13 化合物(II-C)可藉由使化合物(II-A)與化合物(II-B)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺等溶劑中，添加碳酸氫鉀等鹼，於室溫～200℃下反應5分鐘～100小時而製造。 作為溶劑，可列舉製造步驟1之步驟2中所例示者。 作為鹼基，可列舉製造方法1之步驟3中所例示者。 步驟14 化合物(II-E)可藉由使化合物化合物(II-C)與化合物(II-D)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺等溶劑中，添加碳酸氫鉀等鹼，於室溫～200℃下反應5分鐘～100小時而製造。 作為溶劑，可列舉製造步驟1之步驟2中所例示者。 作為鹼基，可列舉製造方法1之步驟3中所例示者。 化合物(II-A)可作為市售品購得。 步驟15 化合物(II-G)可使用化合物(II-E)及化合物(II-F)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 步驟16 化合物(II-I)可使用化合物(II-G)及化合物(II-H)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 又，藉由反覆進行DP步驟與步驟16，可製造q1被調整為理想值之化合物(II-I)。 步驟17 化合物(II-K)可使用化合物(II-I)及化合物(II-J)，於與製造方法1之步驟2相同之條件下製造。 步驟18 化合物(II-M)可使用化合物(II-K)及化合物(II-L)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 步驟19-21 化合物(II')可使用化合物(II-M)、化合物(II-N)、化合物(II-O)及化合物(II-P)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。 又，藉由反覆進行DP步驟與步驟19，可製造q3被調整為理想值之化合物(II')。 步驟DP 可藉由適當使用有機合成化學中常用之方法[例如《有機合成中的保護基》第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)，T.W.Greene著，John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等中記載之方法等]而製造。 化合物(II-B)、化合物(II-D)、化合物(II-F)、化合物(II-H)、化合物(II-J)、化合物(II-L)、化合物(II-N)、化合物(II-O)及化合物(II-P)可作為市售品購得，或藉由將「實驗化學講座第4版 有機合成，p.258，丸善(1992年)」、「March's Advanced Organic Chemistry：Reactions、Mechanisms and Structure，第7版」中記載之方法加以組合、或藉由依據其之方法而獲得。 本發明中，可列舉下述式6所表示之化合物作為中間物。 式6： [化118]
Figure 02_image211
(式6中， Y9 及Y10 可為P1及P4所表示之基，宜為氧原子或-NH-， R17 及R18 分別獨立為氫原子、順丁烯二醯亞胺基、經取代或未經取代之碳數1～20之烷基、第三丁氧基羰基(Boc基)、苄氧基羰基(Z基)、9-茀基甲基氧基羰基(Fmoc基)、-[Q8-P9]q7 -R19、或-[Q9-P10]q8 -B4-[(P11-Q10)q7 ]p3 -T3-L3， P9～P11及T3分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q8～Q10或不存在，或為經取代或未經取代之碳數2～12之伸烷基、-CH2 CH2 -(OCH2 CH2 O)n-或-CH2 CH2 -(CH2 CH2 O)n-CH2 CH2 -，n為0～99之整數， R19為氫原子、順丁烯二醯亞胺基、經取代或未經取代之碳數1～20之烷基、第三丁氧基羰基(Boc基)、苄氧基羰基(Z基)、9-茀基甲基氧基羰基(Fmoc基)， B4分別獨立為鍵結鍵，或為選自由下述式所表示之群中之碳骨架結構，各碳骨架結構中之末端之黑色圓點分別為羰基或與P9之鍵結點，m1及m2分別獨立為0～10之整數， [化119]
Figure 02_image213
p3為1、2或3之整數， q7為0～10之整數， L3為可經保護之糖鏈配體。 本發明中，藉由使具有糖鏈配體之式6之化合物與式7之化合物反應，可製造本發明之核酸複合體。 式7： [化120]
Figure 02_image215
本說明書中之核酸複合體亦可例如以酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等鹽之形式獲得。 作為酸加成鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽，乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽等有機酸鹽；作為金屬鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽，鋁鹽、鋅鹽等；作為銨鹽，例如可列舉：銨、四甲基銨等鹽；作為有機胺加成鹽，例如可列舉：𠰌啉、哌啶等加成鹽，作為胺基酸加成鹽，例如可列舉：離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸等加成鹽。 於欲製備本說明書之核酸複合體之鹽之情形時，於該複合體係以所需鹽之形態獲得時直接進行純化即可，又，於以游離之形態獲得時使該複合體溶解或懸浮於適宜溶劑，添加對應之酸或鹼，進行單離、純化即可。又，於將形成該複合體鹽之抗衡離子替換為不同之抗衡離子時，使該複合體鹽溶解或懸浮於適宜溶劑後，添加數當量～遠過量之酸、鹼及/或鹽(氯化鈉、氯化銨等無機鹽等)，進行單離、純化即可。 本說明書之核酸複合體中亦有可能存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等，所有可能之異構物及該等之混合物均包含於本發明中。 又，本說明書之核酸複合體有時亦會以與水或各種溶劑之加成物之形態存在，該等加成物亦包含於本發明中。 進而，本發明之核酸複合體亦包含分子中之一部分或全部原子經質量數不同之原子(同位素)(例如氘原子等)取代者。 例示本發明之核酸複合體之具體例。但本發明之核酸複合體並不限定於該等。圖中之帶狀結構表示寡核苷酸。 [化121]
Figure 02_image217
Figure 02_image219
[化122]
Figure 02_image221
Figure 02_image223
[化123]
Figure 02_image225
Figure 02_image227
[化124]
Figure 02_image229
Figure 02_image231
[化125]
Figure 02_image233
[化126]
Figure 02_image235
本發明之醫藥組合物包含核酸複合體。本發明之核酸複合體藉由糖鏈配體於非還原末端具有O鍵結甘露糖，而被靶細胞識別並導入細胞內。 本發明之核酸複合體藉由對哺乳動物進行投予而使活體內靶基因之表現降低或停止而抑制靶基因表現，從而可用於治療靶基因相關疾病。 於使用本發明之核酸複合體作為治療劑或預防劑之情形時，作為投予路徑，較理想為採用對於治療最有效之投予路徑，並無特別限定，例如可列舉：靜脈內投予、皮下投予及肌內投予等，較佳為靜脈內投予。 投予量根據投予對象之病狀或年齡、投予路徑等而異，例如以換算為雙鏈寡核苷酸之1日投予量成為0.1 μg～1000 mg之方式投予即可，更佳為以1日投予量成為1～100 mg之方式投予。 作為適於靜脈內投予或肌內投予之製劑，例如可列舉注射劑，可將所製備之液劑直接以例如注射劑等形態使用，亦可藉由例如過濾、離心分離等自該液劑去除溶劑後再使用，將該液劑冷凍乾燥後再使用，及/或將添加有例如甘露醇、乳糖、海藻糖(trehalose)、麥芽糖或甘胺酸等賦形劑之液劑冷凍乾燥後再使用。 於注射劑之情形時，較佳為對液劑或者去除溶劑或冷凍乾燥之組合物混合例如水、酸、鹼、各種緩衝液、生理鹽水或胺基酸輸液等而製備注射劑。又，亦可添加例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱胺酸或EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，四乙酸乙二胺)等之抗氧化劑、或者甘油、葡萄糖或氯化鈉等之等張劑等而製備注射劑。又，亦可添加例如甘油等之冷凍保存劑而冷凍保存。 [實施例] 其次，藉由實施例及試驗例而具體地說明本發明。但本發明並不限定於該等實施例及試驗例。再者，實施例所示之質子核磁共振譜(1 H NMR)係於270 MHz、300 MHz或400 MHz下所測得者，根據化合物及測定條件而存在未清楚觀測到交換性質子之情況。又，訊號之多重度之表示係使用通常所用者，br代表外觀上為寬幅之訊號。 實施例1 連接基單元之合成1 化合物9合成 [化127]
Figure 02_image237
步驟1 使5-羥基間苯二甲酸二甲酯(化合物1，和光純藥工業公司製造，5.0443 g，24 mmol)溶解於四氫呋喃(和光純藥工業公司製造，25 mL)，添加2-(第三丁氧基羰基胺基)-1-乙醇(東京化成工業公司製造，4.0343 g，25.03 mmol)、及三苯膦聚合物載體(Aldrich公司製造，6.61 g，25.2 mmol)後，於冰浴冷卻下，添加40%偶氮二羧酸二異丙酯(DIAD)甲苯溶液(東京化成工業公司製造，13.26 mL，25.2 mmol)，於室溫下攪拌一晩。將反應液進行過濾，於減壓下蒸餾去除濾液後，藉由胺基矽膠管柱層析法(己烷/乙酸乙酯＝95/5～80/20)純化殘渣，藉此獲得化合物2(5.3071 g，產率63%)。 ESI-MS m/z: 254 (M + H)+ ，作為脫Boc(t-Butyloxy carbonyl，第三丁氧基羰基)體而檢測出 步驟2 使步驟1中所合成之化合物2(5.3071 g，15.02 mmol)溶解於甲醇(25 mL)，於冰浴冷卻下，添加2 mol/L氫氧化鈉水溶液(和光純藥工業公司製造，13 mL)，於室溫下攪拌4小時。將反應液進行冰浴冷卻，添加10%檸檬酸水溶液，經乙酸乙酯萃取後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。藉由於減壓下蒸餾去除溶劑，而定量地獲得化合物3。 ESI-MS m/z: 324 (M - H)- 步驟3 使步驟2中所合成之化合物3(0.9372 g，2.8809 mmol)、β丙胺酸甲酯鹽酸鹽(東京化成工業株式會公司製造，0.8082 g，5.7902 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，添加二異丙基乙基胺(2.52 mL，14.40 mmol)、及2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(2.1908 g，5.76 mmol)，於室溫下攪拌整夜。將反應液進行冰浴冷卻，添加10%檸檬酸水溶液，經氯仿萃取後，將有機層利用飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，而定量地獲得化合物4。 ESI-MS m/z: 496 (M + H)+ 步驟4 使用步驟3中所合成之化合物4(0.9622 g，1.9518 mmol)，使之溶解於二氯甲烷(10 mL)，於冰浴冷卻下，添加三氟乙酸(2.5mL，32.4 mmol)，於室溫下攪拌2小時。藉由於減壓下對反應液蒸餾去除溶劑，而定量地獲得化合物5。 ESI-MS m/z: 396 (M + H)+ 步驟5 使步驟4中所合成之化合物5(0.1146 g，0.290 mmol)及N-丁二醯亞胺基15-疊氮基-4,7,10,13-四氧雜十五酸(N3 -PEG4 -NHS，東京化成工業股份有限公司製造，0.0750 g，0.1931 mmol)溶解於四氫呋喃(6 mL)，添加二異丙基乙基胺(0.337 mL，1.931 mmol)，於室溫下攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)純化殘渣，藉此定量地獲得化合物6。 ESI-MS m/z: 669 (M + H)+ 步驟6 使用步驟5中所合成之化合物6(0.1291 g，0.193 mmol)，藉由與步驟2相同之方法定量地獲得化合物7。 ESI-MS m/z: 641 (M + H)+ 1 H-NMR (DMSO-D6) δ: 2.35 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.51-2.54 (4H, m), 3.38-3.65 (24H, m), 4.07 (2H, t, J = 5.4 Hz), 7.51 (2H, br s), 7.89 (1H, br s), 8.13 (1H, dd, J = 5.3, 2.7 Hz), 8.63 (2H, t, J = 5.4 Hz) 步驟7 使用步驟6中所合成之化合物7(0.1252 g，0.193 mmol)及L-麩胺酸二第三丁酯(渡邊化學股份有限公司製造，0.1180 g，0.399 mmol)，藉由與步驟3相同之方法獲得化合物8(0.0521 g，產率24%)。 ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+ 步驟8 使用步驟7中所合成之化合物8(0.0521 g，0.0464 mmol)，使之溶解於二氯甲烷(2 mL)，於冰浴冷卻下，添加三氟乙酸(0.2 mL，32.4 mmol)，於室溫下攪拌整夜。藉由於減壓下對反應液蒸餾去除溶劑，而定量地獲得化合物9。 ESI-MS m/z: 899 (M + H)+ 1 H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.70-1.82 (2H, m), 1.90-2.02 (2H, m), 2.23-2.30 (4H, m), 2.35 (2H, t, J = 5.3 Hz), 2.44 (4H, t, J = 7.4 Hz), 3.38-3.65 (24H, m), 4.07 (2H, t, J = 5.3 Hz), 4.17-4.26 (2H, m), 7.51 (2H, d, J = 1.3 Hz), 7.89 (1H, br s), 8.13 (1H, dd, J = 10.0, 5.0 Hz), 8.21 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.57 (2H, t, J = 5.8 Hz) 實施例2 連接基單元之合成2 化合物19之合成 [化128]
Figure 02_image239
步驟9 使用實施例1之步驟1中所合成之化合物2(2.1 g，5.940 mmol)，藉由與實施例1之步驟4相同之方法定量地獲得化合物10。 ESI-MS m/z: 254 (M + H)+ 1 H-NMR (DMSO-D6) δ: 3.26 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.90 (6H, s), 4.30 (2H, t, J = 5.1 Hz), 7.77 (2H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 8.13 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz). 步驟10 使用步驟9中所合成之化合物10(0.427 g，1.686 mmol)與藉由《有機&生物分子化學》(Organic & Biomolecular chemistry，第13卷，第1778-1791頁，2015年)中記載之方法所合成之6-疊氮基己酸吡咯啶基酯(0.6 g，2.360 mmol)，藉由與實施例1之步驟5相同之方法獲得化合物11(0.248 g，產率38%)。 ESI-MS m/z: 393 (M + H)+ 1 H-NMR (CDCl3 ) δ: 1.37-1.44 (2H, m), 1.64-1.69 (4H, m), 2.23 (2H, t,J = 7.5 Hz), 3.25 (2H, t,J = 6.8 Hz), 3.71 (2H, dd,J = 5.3, 2.7 Hz), 3.95 (6H, s), 4.13 (2H, t,J = 6.7 Hz), 7.75 (2H, dd,J = 1.5, 0.8 Hz), 8.30 (1H, dd,J = 1.4, 0.7 Hz). 步驟11 使用步驟10中所合成之化合物11(0.248 g，0.632 mmol)，藉由與實施例1之步驟2相同之方法定量地獲得化合物12。 ESI-MS m/z: 365 (M + H)+ 1 H-NMR (MeOD) δ: 1.37-1.41 (2H, m), 1.60-1.65 (4H, m), 2.25 (2H, t, J = 7.4 Hz), 3.25 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.63 (2H, t, J = 4.9 Hz), 4.18 (2H, t, J = 5.2 Hz), 7.79 (2H, dd, J = 1.6, 0.8 Hz), 8.27 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz). 步驟12 使步驟11中獲得之化合物12(0.230 mg，0.631 mmol)溶解於四氫呋喃(274.7 μL)，添加N-羥基丁二醯亞胺(0.174 g，1.515 mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(0.313 g，1.515 mmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌一晩。於減壓下蒸餾去除溶劑，其後，經氯仿萃取後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得化合物13之粗生成物。 ESI-MS m/z: 559 (M + H)+ 步驟13 使用步驟12中所合成之化合物13(0.200 g，0.358 mmol)、6-胺基己酸(Nacalai Tesque公司製造，0.141 g，1.074 mmol)及二異丙基乙基胺(0.139 mL，1.074 mmol)，於磷酸緩衝液/二甲基亞碸混合溶劑中(v/v＝1/1，50 mL)，於室溫下攪拌整夜。於反應液中添加10%檸檬酸溶液(50 mL)，經氯仿萃取後，將有機層利用飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此獲得化合物14(0.157 g，產率74%)。 ESI-MS m/z: 591 (M + H)+ 1 H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.26-1.33 (8H, m), 1.51-1.53 (10H, m), 2.10 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.21 (4H, t, J = 7.4 Hz), 3.25 (8H, t, J = 6.5 Hz), 4.08 (2H, t, J = 5.4 Hz), 7.48-7.51 (2H, br m), 7.87-7.89 (1H, br m), 8.07-8.08 (1H, br m), 8.53-8.54 (2H, br m). 步驟14 使用步驟13中所合成之化合物14(0.1442 g，0.2441 mmol)，藉由與步驟12相同之方法定量地獲得化合物15。 ESI-MS m/z: 785 (M + H)+ 步驟15 使用步驟14中所合成之化合物15(0.0958 g，0.1221 mmol)，藉由與步驟13相同之方法定量地獲得化合物16。 ESI-MS m/z: 818 (M + H)+ 步驟16 1)化合物17之合成 使用步驟12中所合成之化合物13(0.0209 g，0.0375 mmol)與羧基(12乙二醇)乙基胺(Thermo Scientific公司製造，0.0674 g，0.1091 mmol)，藉由與步驟13相同之方法獲得化合物17(0.0580 g，產率99%)。 ESI-MS m/z: 1564 (M + H)+ 2)化合物18之合成 使用步驟12中所合成之化合物13(0.0047 g，0.00654 mmol)與羧基(24乙二醇)乙基胺(Thermo Scientific公司製造，0.0225 g，0.01963 mmol)，藉由與步驟13相同之方法獲得化合物18(0.0144 g，產率79%)。 ESI-MS m/z: 2622 (M + H)+ 步驟17 1)化合物19之合成 使用步驟16中所合成之化合物17(0.0580 g，0.0375 mmol)，藉由與步驟12相同之方法定量地獲得化合物19。 ESI-MS m/z: 1759 (M + H)+ 1 H-NMR (DMSO-D6 ) δ: 1.22-1.25 (6H, m), 2.10 (2H, t,J = 7.5 Hz), 2.81 (8H, br s), 2.93 (4H, t,J = 6.1 Hz), 3.26-3.27 (6H, m), 3.43-3.45 (2H, m), 3.49-3.50 (92H, m), 3.71 (4H, t,J = 6.0 Hz), 4.07 (2H, t,J = 6.0 Hz), 7.53 (2H, dd,J = 1.5, 0.8 Hz), 7.93 (1H, dd,J = 1.5, 0.8 Hz), 8.05-8.07 (1H, br m), 8.59-8.61 (2H, br m). 2)化合物20之合成 使用步驟16中所合成之化合物18(0.0580 g，0.0375 mmol)，藉由與步驟12相同之方法定量地獲得化合物20。 ESI-MS m/z: 2817 (M + H)+ 實施例3 連接基單元之合成3 化合物22之合成 [化129]
Figure 02_image241
步驟18 (a)：使實施例2之步驟12中所合成之化合物13(10 mg，17.9 μmol)溶解於四氫呋喃(90 μL)與磷酸緩衝液(90 μL)之混合溶液，添加羧基(12寡乙二醇)乙基胺(Thermo Scientific公司製造，22.1 mg，35.8 μmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，其後，經氯仿、10%檸檬酸水溶液萃取後，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得化合物17之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1564 (M+H)+ (b)：使實施例2之步驟12中所合成之化合物13(10 mg，17.9 μmol)溶解於四氫呋喃(90 μL)與磷酸緩衝液(90 μL)之混合溶液，添加羧基(24寡乙二醇)乙基胺(Thermo Scientific公司製造，41 mg，35.8μmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，其後，經氯仿、10%檸檬酸水溶液萃取後，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得化合物18之粗生成物。 ESI-MS m/z: 2622 (M + H)+ 步驟19 (a)：使步驟18中所合成之化合物17(14 mg，8.9 μmol)溶解於四氫呋喃(90 μL)，添加L-麩胺酸二第三丁酯(渡邊化學股份有限公司製造，5.2 mg，17.9 μmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(6.8 mg，17.9 μmol)、二異丙基乙基胺(3.1 μL，17.9μmol)，於室溫下氬氣環境下攪拌一晩。於減壓下蒸餾去除溶劑，其後，經氯仿萃取後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。其後，藉由逆相高效液相層析法進行純化，獲得化合物21a (4.5 mg，產率25%)。 ESI-MS m/z: 2046 (M + H)+ 1 H-NMR (CDCl3) δ: 1.44-1.46 (36H, m), 1.61-1.66 (4H, m), 1.89-1.91 (4H, m), 2.06-2.16 (2H, m), 2.20-2.37 (6H, m), 2.50 (4H, t, J = 6.0 Hz), 3.26 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.59-3.68 (98H, m), 3.71-3.76 (4H, m), 4.14 (2H, t, J = 5.2 Hz), 4.48-4.50 (2H, m), 7.59 (2H, dd, J = 1.3, 0.6 Hz), 7.92 (1H, br s). (b)：使步驟18中所合成之化合物18(23.4 mg，8.9 μmol)溶解於四氫呋喃(90 μL)，添加L-麩胺酸α,γ-二(第三丁酯)鹽酸鹽(5.2 mg，17.9 μmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(6.8 mg，17.9 μmol)、二異丙基乙基胺(3.1 μL，17.9 μmol)，於室溫下氬氣環境下攪拌一晩。於減壓下蒸餾去除溶劑，其後，經氯仿萃取後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。其後，藉由逆相高效液相層析法進行純化，獲得化合物21b(7.4 mg，產率27%)。 ESI-MS m/z: 1553 (M - 2H)2- 1 H-NMR (CDCl3) δ: 1.44 (18H, s), 1.46 (18H, s), 1.62-1.67 (4H, m), 1.86-1.89 (2H, m), 2.20-2.36 (10H, m), 2.51 (4H, t, J = 5.8 Hz), 3.26 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.63-3.65 (194H, m), 3.73-3.76 (4H, m), 4.14 (2H, t, J = 5.1 Hz), 4.46-4.50 (2H, m), 7.60 (2H, dd, J = 1.0, 0.5 Hz), 7.92 (1H, br s) 步驟20 (a)：使用步驟19中所合成之化合物21a(4.5 mg，2.1 μmol)，藉由與實施例1之步驟8藉由與相同之方法定量地獲得化合物22a。 ESI-MS m/z: 1822 (M + H)+ (b)：使用步驟19中所合成之化合物21b(4.5 mg，2.1 μmol)，藉由與實施例1之步驟8藉由與相同之方法定量地獲得化合物22b。 ESI-MS m/z: 2878 (M + H)+ 實施例4 連接基單元之合成4 化合物26之合成 [化130]
Figure 02_image243
步驟21 使實施例2之步驟11中所合成之化合物12(10 mg，27.4 μmol)溶解於四氫呋喃(274.7 μmol)，添加L-麩胺酸二第三丁酯(渡邊化學股份有限公司製造，32.5 mg，109.8 μmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(41.7 mg，109.8 μmol)、二異丙基乙基胺(24.2 μL，137.3 μmol)，於室溫下氬氣環境下攪拌一晩。於減壓下蒸餾去除溶劑，其後，經氯仿、10%檸檬酸水溶液萃取後，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得化合物23之粗生成物。 ESI-MS m/z: 847 (M + H)+ 步驟22 使步驟21中所合成之化合物23(139.4 mg，164.6 μmol)溶解於二氯甲烷(1.3 mL)及三氟乙酸(0.3 mL)，於室溫下攪拌一晩。於減壓下蒸餾去除溶劑，定量地獲得化合物24。 ESI-MS m/z: 623 (M + H)+ 步驟23 使步驟22中所合成之化合物24(100 mg，160.7 μmol)溶解於二甲胺(1 mL)，添加N-羥基丁二醯亞胺(81.3 mg，707 μmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(135.4 mg，707 μmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌一晩，獲得化合物25之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1011 (M + H)+ 步驟24 (a)：使步驟23中所合成之化合物25(16.2 mg，16 μmol)溶解於磷酸緩衝液(95 μL)，添加羧基(乙二醇)乙基胺(80.4 mg，129.8 μmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相高效液相層析法進行純化，獲得化合物26a(6.2 mg，產率21%)。 ESI-MS m/z: 1511 (M + 2H)2+ (b)：使步驟23中所合成之化合物25(16.2 mg，16 μmol)溶解於磷酸緩衝液(95 μL)，添加羧基(乙二醇)乙基胺(149.3 mg，129.8 μmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相高效液相層析法進行純化，獲得化合物26b(5.5 mg，產率11%)。 ESI-MS m/z: 2566 (M + 2H)2+ 實施例5 糖鏈配體-連接基單元之合成1 化合物27、28之合成 [化131]
Figure 02_image245
步驟25 使實施例1之步驟6中所合成之化合物7(0.8 mg，1.249 μmol)、藉由《ACS化學生物學》(ACS Chemical Biology，第5卷，第301-312頁，2010年)中記載之方法所合成之經胺基乙基修飾之α(1,2)α(1,6)偽甘露三糖(pseudomannotriose)(3.0 mg，5.0 μmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(3.8 mg，10 μmol)、二異丙基乙基胺(1.7 μL，10 μmol)溶解於N,N-二甲基乙醯胺(1 mL)，於室溫下靜置兩天。藉由逆相高效液相層析法純化混合物，獲得化合物25(1.6 mg，產率71%)。 ESI-MS m/z: 1802 (M - H)- 步驟26 使用實施例1之步驟8中所合成之化合物9(0.9 mg，1.04 μmol)、步驟25中記載之α(1,2)α(1,6)偽甘露三糖(8.34 g，8.34 μmol)，藉由與步驟25相同之方法獲得化合物26(2.3 mg，產率68%)。 ESI-MS m/z: 1611 (M - 2H)2- 實施例6 糖鏈配體-連接基單元之合成2 化合物29、30、31、32、33之合成 [化132]
Figure 02_image247
步驟27 使用實施例2之步驟12中所合成之化合物13(0.6 mg，0.00111 mmol)及實施例5之步驟25中記載之α(1,2)α(1,6)偽甘露三糖(2.0 mg，0.00334 mmol)，藉由與實施例2之步驟13相同之方法獲得化合物29(1.1 mg，產率65%)。 ESI-MS m/z: 1528 (M + H)+ 步驟28 使用實施例2之步驟13中所合成之化合物14(0.66 mg，0.00111 mmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物30 (0.3 mg，產率15%)。 ESI-MS m/z: 1754 (M + H)+ 步驟29 使用實施例2之步驟15中所合成之化合物16(0.91 mg，0.00111 mmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物31 (0.4 mg，產率18%)。 ESI-MS m/z: 1981 (M + H)+ 步驟30 使用實施例2之步驟17中所合成之化合物19(1.95 mg，0.00111 mmol)，藉由與實施例2之步驟13相同之方法獲得化合物32(0.5 mg，產率17%)。 ESI-MS m/z: 2728 (M + H)+ 步驟31 使用實施例2之步驟16中所合成之化合物18(2.91 mg，0.00111 mmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物33 (2.2 mg，產率52%)。 ESI-MS m/z: 1892 (M + 2H)2+ 實施例7 糖鏈配體-連接基單元之合成3 化合物34、35之合成 [化133]
Figure 02_image249
步驟32 (a)：使用實施例3之步驟20中獲得之化合物22a(2 mg，1.1 μmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物34a(2 mg，產率44%)。 ESI-MS m/z: 2073 (M - 2H)2- (b)：使用實施例3之步驟20中獲得之化合物22a(3.1 mg，1.1 μmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物34b(1.8 mg，產率37%)。 ESI-MS m/z: 2601 (M - 2H)2- 步驟33 (a)：使用實施例4之步驟24中獲得之化合物26a(3.1 mg，1.1 μmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物35a(3 mg，產率55%)。 ESI-MS m/z: 2671 (M - 2H)2- (b)：使用實施例4之步驟24中獲得之化合物26b(2.7 mg，0.5 μmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物35b(2.2 mg，產率56%)。 ESI-MS m/z: 2486 (M - 2H)2- 比較例1 糖鏈配體-連接基單元之合成4 化合物38之合成 [化134]
Figure 02_image251
步驟34 使藉由《美國化學會志》(Journal of American Chemical Society，第136卷，第16958-16961頁，2014年)中記載之方法所合成之化合物36(0.9602 g，2.1460 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，添加N-Boc-乙二胺(Sigma-Aldrich公司製造，0.6877 g，4.292 mmol)、二異丙基乙基胺(1.90 mL，10.87 mmol)、及2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(和光純藥工業公司製造，1.6437 g，4.3229 mmol)，於室溫下攪拌整夜。於反應液中添加水，經氯仿萃取2次後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得化合物37之粗生成物。 ESI-MS m/z: 590 (M + H)+ 步驟35 使步驟34中所合成之化合物37(1.2654 g，2.1460 mmol)溶解於二氯甲烷(15 mL)，添加三氟乙酸(4 mL)，於室溫下攪拌一晩。於反應液中添加水，經乙酸乙酯萃取後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相管柱層析法(水/甲醇＝80/20)進行溶出，藉此獲得化合物38(0.3879 g，產率37%)。 ESI-MS m/z: 490 (M + H)+ 1 H-NMR (DMSO-D6 ) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t,J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t,J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd,J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d,J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd,J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d,J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d,J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m). 比較例2 糖鏈配體-連接基單元之合成5 [化135]
Figure 02_image253
化合物39之合成 步驟36 使用實施例1之步驟6中所合成之化合物7(4.36 mg，0.006 mmol)、比較例1之步驟35中所合成之化合物38(10 mg，0.02 mmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物39(7 mg，產率65%)。 ESI-MS m/z: 1581 (M - H)- 化合物40之合成 步驟37 使用實施例1之步驟8中所合成之化合物9(10 mg，0.011 mmol))、比較例1之步驟35中所合成之化合物38(43.9 mg，0.090 mmol)，藉由與實施例5之步驟25相同之方法獲得化合物39(22 mg，產率72%)。 ESI-MS m/z: 2785 (M - 2H)2- 實施例8 核酸複合體之合成1 [化136]
Figure 02_image255
步驟38 使用藉由《分子學》(Molecules，第17卷，第13825-13854頁，2012年)中記載之方法所合成之經末端鍵結性官能基化之化合物41，藉由《ACS奈米》(ACS nano，第9卷，第9652-9664頁，2015年)中記載之方法獲得化合物42。 步驟39 對使用對稱雙胺基磷酸酯(Symmetric Doubler Phosphoramidite)(Glen Research公司製造，目錄編號10-1920-90)藉由《分子學》(Molecules，第17卷，第13825-13854頁，2012年)中記載之方法所合成之經末端鍵結性官能基化之化合物43添加N-丁二醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯之二甲基亞碸溶液，於磷酸緩衝液中於室溫下靜置4小時。於反應溶液中添加二硫蘇糖醇，於室溫下靜置一晩。對混合物進行凝膠過濾處理(Nap管柱，GE Healthcare公司製造，溶出溶劑：20 mmol/L乙酸/乙酸鈉緩衝液(pH值5.0))及超過濾，藉此獲得化合物44。 步驟40 使用二苯并環辛炔-N-羥基丁二醯亞胺酯，藉由與步驟39相同之方法獲得化合物45。 [化137]
Figure 02_image257
步驟41 對藉由《ACS化學生物學》(第5卷，第3號，第301-312頁，2010年)中記載之方法所合成之化合物46添加實施例8之步驟38中所合成之化合物42，於室溫下靜置1小時。藉由陰離子交換層析法(GE Healthcare，MonoQ 5/50GL，10 μm，5.0 mm×50 mm，由A液：10 mM Tris緩衝液/30%乙腈與B液：10 mM Tris緩衝液/30%乙腈/1 M NaBr形成之梯度)或逆相液相層析法(Waters，X BridgeC18，5 μm，4.6 mm×250 mm，由A液：0.1 M乙酸三乙基銨緩衝液與B液:乙腈形成之梯度)之任一方法進行純化，藉此獲得單鏈核酸複合體47。 針對表1之化合物群或藉由《生物共軛化學》(Bioconjugate Chemistry，第14卷，第232-238頁，2003年)中記載之方法所合成之糖鏈順丁烯二醯亞胺加成體，使用藉由《分子學》(Molecules，第17卷，第13825-13854頁，2012年)中記載之方法所合成之經末端鍵結性官能基化之硫醇核酸、化合物42、44或45，藉由相同方法獲得表2之核酸複合體。 表1 [表1]
Figure 02_image259
[表2]
Figure 02_image261
表2 [表3]
Figure 02_image263
Figure 02_image265
[表4]
Figure 02_image267
Figure 02_image269
將藉由本實施例所合成之核酸複合體中之核酸之序列及質譜分析結果示於表3a及表3b。再者，表3a及表3b中之「化合物」欄之記載表示[表中之化合物編號]_[配體等於核酸中之鍵結位置]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(ASO或ssRNA)]。 表3a [表5] 表3b [表6] 表中，n表示DNA，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-氟修飾RNA，N(L)表示LNA，5(L)表示LNAmC，^表示硫代磷酸酯修飾，ss表示正義鏈，as表示反義鏈，粗體編號表示與實施例中之化合物編號對應之修飾基。以下各表中相同。 步驟38 利用混合緩衝液(100 mmol/L乙酸鉀、30 mmol/L 2-[4-(2-羥基乙基)哌𠯤-1-基]乙磺酸、HEPES-KOH(pH值7.4)、2 mmol/L乙酸鎂)調整步驟41中所合成之單鏈核酸複合體之濃度(50 μmol/L)。將正義鏈與反義鏈各(50 μmol/L)等量混合，於80℃下靜置10分鐘。反義鏈序列如表2之記載。緩慢降低溫度，於37℃下靜置1小時，獲得雙鏈核酸複合體。 將藉由本實施例所合成之核酸複合體示於表4，將核酸複合體中之核酸之序列示於表5。再者，表5中之「化合物」欄之記載表示[表中之化合物編號]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(siRNA)]，又，「單鏈名稱」欄之記載中，正義鏈(ss)表示[表中之化合物編號]_[配體等於核酸中之鍵結位置]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(ssRNA)]，反義鏈(as)表示[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(as-RNA)]。 表4 [表7]
Figure 02_image271
[表8]
Figure 02_image273
表5 [表9] 比較例3 核酸複合體之合成2 步驟43 對比較例2之步驟36及37中所合成之化合物39及40添加實施例8之步驟37中所合成之化合物42，於室溫下靜置1小時。於反應混合物中添加碳酸鈉，於4℃下靜置一晩。藉由與實施例8之步驟41相同之方法進行純化，藉此獲得表6之核酸複合體。 表6 [表10]
Figure 02_image275
將藉由本比較例所合成之核酸複合體中之核酸之序列及質譜分析結果示於表7a及表7b。再者，表7a及表7b中之「化合物」欄之記載表示[表中之化合物編號]_[配體等於核酸中之鍵結位置]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(ASO或ssRNA)]。 表7a [表11] 表7b [表12] 步驟40 由步驟43中所合成之單鏈糖鏈複合體，藉由與實施例8之步驟42相同之方法獲得雙鏈糖鏈複合體。 將藉由本比較例所合成之核酸複合體示於表8，核酸複合體中之核酸之序列示於表9。再者，表9中之「化合物」欄之記載表示[表中之化合物編號]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(siRNA)]，又，「單鏈名稱」欄之記載中，正義鏈(ss)表示[表中之化合物編號]_[配體等於核酸中之鍵結位置]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(ssRNA)]，反義鏈(as)表示[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(as-RNA)]。 表8 [表13]
Figure 02_image277
表9 [表14] 實施例9 糖鏈配體-連接基單元之合成6 [化138]
Figure 02_image279
步驟42 使用實施例1之步驟1中所合成之化合物2(8.17 g，23.12 mmol)，藉由與實施例1之步驟4相同之方法獲得化合物75(3.7 g，14.63 mmol，產率63%)。 ESI-MS m/z: 254 (M + H)+ 步驟43 使實施例9之步驟42中所合成之化合物75(3.70 g，14.63 mmol)溶解於四氫呋喃(10 mL)，於冰浴冷卻下，添加苯甲醯氯(4.12 mL，29.3 mmol)，於室溫下攪拌1小時。於減壓下對反應液蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)純化殘渣，藉此獲得化合物76(3.82 g，9.86 mmol，產率67%)。 ESI-MS m/z: 432 (M + HCOO)- 步驟44 使用實施例9之步驟43中所合成之化合物76(3.82 g，9.86 mmol)，藉由與實施例1之步驟2相同之方法獲得化合物77(3.07 g，8.56 mmol，產率87%)。 ESI-MS m/z: 360 (M + H)+ 步驟45 使用實施例9之步驟44中所合成之化合物77(213 mg，0.592 mmol)及亞胺基二乙酸二第三丁酯(375 mg，1.529 mmol)，藉由與實施例1之步驟7相同之方法定量地獲得化合物78。 ESI-MS m/z: 858 (M + HCOO)- 步驟46 STEP1：使用實施例9之步驟45中所合成之化合物78(482 mg，0.593 mmol)，使之溶解於甲醇(10 mL)，進行利用鈀/碳之催化氫還原。將所獲得之溶液滯留份於減壓下蒸餾去除溶劑。 STEP2：使用所獲得之粗生成物，藉由與實施例2之步驟9相同之方法獲得具有烷基疊氮基之偶合化合物。 STEP3：使用STEP2中獲得之化合物，藉由與實施例1之步驟8相同之方法獲得化合物79(238 mg，產率92%)。 ESI-MS m/z: 595 (M + H)+ 步驟47 使用實施例9之步驟46中所合成之化合物79(0.8 mg，1.346 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物80(1.3 mg，0.445 μmol)。 ESI-MS m/z: 2918 (M - H)- 實施例10 糖鏈配體-連接基單元之合成7 [化139]
Figure 02_image281
步驟48 使1,3-二羥基2-胺基丙烷81(東京化成工業公司製造，0.55 g，6.03 mmol)溶解於二甲基亞碸(15 mL)，於冰浴冷卻下，添加氫氧化鈉水溶液(2 mmol/L，3 mL)後，緩慢地添加經二甲基亞碸(2.2 mL)溶解之丙烯酸第三丁酯(1.93 g，15.07 mmol)，於室溫下反應4小時。於混合物中添加水，經乙酸乙酯萃取後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝98/2⇒90/10)純化殘渣，藉此獲得化合物82(0.74 g，產率35%)。 ESI-MS m/z: 348 (M + H)+ 步驟49 使用實施例10之步驟48中所合成之化合物82(0.150 g，0.433 mmol)，藉由與實施例1之步驟7相同之方法定量地獲得化合物83。 ESI-MS m/z: 1062 (M + HCOO)- 步驟50(Z之去保護、烷基疊氮基之醯胺化、TFA(Trifluoroacetyl，三氟乙醯基)之去保護) 使用實施例10之步驟49中所合成之化合物83(0.149 g，0.147 mmol)，藉由與實施例9之步驟46相同之方法獲得化合物84(91.4 mg，0.114 mmol，產率67%)。 ESI-MS m/z: 799 (M + H)+ 步驟51 使用實施例10之步驟51中所合成之化合物84(1.3 mg，1.4 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物85(2.4 mg，0.768 μmol，產率54.9%)。 ESI-MS m/z: 1562 (M + 2H)2+ 實施例11 糖鏈配體-連接基單元之合成8 [化140]
Figure 02_image283
步驟52 使3,5-二羥基苯甲酸86(東京化成工業公司製造，2.11 g，13.69 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(35 mL)，添加碳酸氫鉀(1.716 g，17.14 mmol)及苄基溴(3.51 g，2.439 mL，20.54 mmol)，於室溫下攪拌4小時。於反應液中添加飽和氯化銨，經二氯甲烷萃取後，將有機層利用水洗淨，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)純化殘渣，藉此定量地獲得化合物87。 ESI-MS m/z: 245 (M + H)+ 步驟53 使步驟52中所合成之化合物87(3.34 g，13.69 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(40 mL)，添加碳酸鉀(7.57 g，54.8 mmol)及第三丁基溴乙酸(4.42 mL，30.1 mmol)，於90℃下攪拌4小時。於反應液中添加飽和氯化銨，經二氯甲烷萃取後，將有機層利用飽和鹽水洗淨，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝75/25)純化殘渣，藉此獲得化合物88(5.67 g，產率88%)。 ESI-MS m/z: 471 (M - H)- 步驟54 使步驟53中所合成之化合物88(5.67 g，12.00 mmol)溶解於二氯甲烷(40 mL)，添加三氟乙酸(10 mL，130.0 mmol)，於室溫下攪拌整夜。於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得化合物89之粗生成物。 ESI-MS m/z: 359 (M - H)- 步驟55 使用亞胺基二乙酸二第三丁酯(0.407 g，1.660 mmol)及實施例11之步驟54中所合成之化合物89(0.239 g，0.664 mmol)，藉由與實施例1之步驟7相同之方法定量地獲得化合物90。 ESI-MS m/z: 813 (M - H)- 步驟56 STEP1：使用實施例11之步驟55中所合成之化合物90(541 mg，0.664 mmol)，使之溶解於甲醇(8 mL)，進行利用鈀/碳之催化氫還原。將所獲得之溶液滯留份於減壓下蒸餾去除溶劑。 STEP2：使用所獲得之粗生成物及3-疊氮基丙烷-1-胺(0.101 g，1.009 mmol)，藉由與實施例1之步驟7相同之方法獲得偶合化合物。 STEP3：將所獲得之化合物引退，使用粗生成物，藉由與實施例1之步驟8相同之方法定量地獲得化合物91。 ESI-MS m/z: 583 (M + H)+ 步驟57 使用實施例10之步驟50中所合成之化合物84(2.0 mg，1.476 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物92(2.0 mg，產率47%)。 ESI-MS m/z: 1456 (M + 2H)2+ 實施例12 糖鏈配體-連接基單元之合成9 [化141]
Figure 02_image285
步驟58 使實施例9之步驟44中所合成之化合物77(63 mg，0.175 mmol)溶解於二氯甲烷(5 mL)，添加三乙胺(0.24 mL，1.75 mmol)後，添加五氟苯基-2,2,2-三氟乙酸(0.119 mL，0.699 mmol)，於室溫下攪拌4小時。於混合物中添加氯仿，將有機層利用10%檸檬酸水溶液、飽和鹽水及碳酸氫鈉水溶液洗淨，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此定量地獲得化合物93。 ESI-MS m/z:(作為單酯體(加成有1個PEP之化合物)而檢測出) 524 (M - H)- 步驟59 使實施例12之步驟58中所合成之化合物93(0.121 g，0.175 mmol)溶解於二甲基亞碸(8 mL)，添加羧基(12寡乙二醇)乙基胺(0.510 g，0.444 mmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，其後，經氯仿、10%檸檬酸水溶液萃取後，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得化合物94之粗生成物。 ESI-MS m/z: 2614 (M-H)- 步驟60 使用實施例12之步驟59中所合成之化合物94(0.333 g，0.092 mmol)，藉由與實施例1之步驟7相同之方法定量地獲得化合物95。 ESI-MS m/z: 1537 (M + 2H)2+ 步驟61 使用實施例12之步驟60中所合成之化合物95(0.138 g，0.045 mmol)，藉由與實施例9之步驟42相同之方法獲得化合物96(0.0825 g，產率58%)。 ESI-MS m/z: 1426 (M + 2H)2+ 步驟62 使用實施例12之步驟61中所合成之化合物96(4.2 mg，14.04 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物97(2.1 mg，產率29%)。 ESI-MS m/z: 2590 (M + 2H)2+ 實施例13 糖鏈配體-連接基單元之合成10 [化142]
Figure 02_image287
步驟63 使用實施例12之步驟59中所合成之化合物94(0.189 g，0.052 mmol)及實施例10之步驟48中所合成之化合物82(0.051 g，0.148 mmol)，藉由與實施例1之步驟7相同之方法獲得化合物98(0.087 g，產率51%)。 ESI-MS m/z: 1639 (M + 2H)2+ 步驟64 使用實施例13之步驟63中所合成之化合物98(0.087 g，0.027 mmol)，藉由與實施例9之步驟42相同之方法獲得化合物99(38.5 mg，產率43%)。 ESI-MS m/z: 1529 (M + 2H)2+ 步驟65 使用實施例13之步驟64中所合成之化合物99(4.7 mg，1.403 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物100(2.4 mg，產率32%)。 ESI-MS m/z: 2689 (M + 2H)2+ 實施例14 糖鏈配體-連接基單元之合成11 [化143]
Figure 02_image289
步驟66 STEP1：使用實施例11之步驟54中所合成之化合物86(0.0678 g，0.1888 mmol)，藉由與實施例12之步驟58相同之方法獲得活性酯體。 STEP2：使用由STEP1獲得之活性酯(0.1283 g，0.185 mmol)，藉由與實施例12之步驟59相同之方法獲得化合物101(0.2819 g，0.108 mmol，產率58.1%)。 ESI-MS m/z: 2615 (M - H)- 步驟64 使用實施例14之步驟66中所合成之化合物101(0.282 g，0.108 mmol)，藉由與實施例9之步驟45相同之方法獲得化合物102(0.085 g，0.028 mmol，產率26%)。 ESI-MS m/z:(於tBu基脫離之狀態下檢測出) 712 (M + 4H)4+ 步驟64 使用實施例14之步驟67中所合成之化合物102(84.5 mg，0.028 mmol)，藉由與實施例11之步驟56相同之方法獲得化合物103(57.9 mg，產率66%)。 ESI-MS m/z: 2837 (M - H)- 步驟69 使用實施例14之步驟69中所合成之化合物103(4.8 mg，1.528 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物104(2.6 mg，產率33%)。 ESI-MS m/z: 2584 (M + 2H)2+ 實施例15 糖鏈配體-連接基單元之合成12 [化144]
Figure 02_image291
步驟70 STEP1：使用實施例11之步驟54中所合成之化合物86(4 mg，0.011 mmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得加成有配體之化合物(6.0 mg，產率36%)。 STEP2：使用由STEP1獲得之化合物(6.0 mg，3.94 μmol)，藉由與實施例9步驟42之STEP1相同之方法獲得化合物105(5.6 mg，產率99%)。 ESI-MS m/z: 1522 (M - H)- 實施例16 糖鏈配體-連接基單元之合成13 [化145]
Figure 02_image293
步驟71 使用實施例14之步驟67中所合成之化合物99(0.204 g，0.067 mmol)，藉由與實施例9之步驟45相同之方法定量地獲得化合物106。 ESI-MS m/z: 2846 (M - H)- 步驟72 使用實施例16之步驟71中所合成之化合物106(16.7 mg，5.22 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物107(6.3 mg，產率23%)。 ESI-MS m/z: 2586 (M - H)- 步驟73 使用實施例16之步驟72中所合成之化合物107(6.3 mg，1.218 μmol)，藉由與實施例9步驟46之STEP1相同之方法獲得化合物108(5.6 mg，產率90%)。 ESI-MS m/z: 2540 (M - 2H)2- 實施例17 糖鏈配體-連接基單元之合成14 [化146]
Figure 02_image295
步驟74 使用藉由國際公開2009/073809號中記載之方法所合成之化合物109(0.209 g，0.414 mmol)，藉由與實施例2之步驟9相同之方法獲得化合物110(0.116 g，產率43%)。 ESI-MS m/z: 645 (M + H)+ 步驟75 使用實施例17之步驟74中所合成之化合物110(0.116 g，0.179 mmol)，藉由與實施例9之步驟44相同之方法定量地獲得化合物111。 ESI-MS m/z: 477 (M + H)+ 步驟76 使用實施例17之步驟75中所合成之化合物111(1.1 mg，1.821 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物112(1.6 mg，產率40%)。 ESI-MS m/z: 2219 (M - H)- 實施例18 糖鏈配體-連接基單元之合成15 [化147]
Figure 02_image297
步驟77 使用實施例17之步驟75中所合成之化合物111(30 mg，0.05 mmol)，藉由與實施例14之步驟62相同之方法獲得化合物113(88.2 mg，產率43%)。 ESI-MS m/z: 1930 (M - 2H)2- 步驟78 使用實施例18之步驟77中所合成之化合物113(8.1 mg，2.098 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物114(5.9 mg，產率50. %)。 ESI-MS m/z: 2801 (M - 2H)2- 實施例19 糖鏈配體-連接基單元之合成16 [化148]
Figure 02_image299
步驟79 使用亞胺基二乙酸二第三丁酯115(東京化成工業公司製造，0.197 g，0.803 mmol)，藉由與實施例2之步驟9相同之方法定量地獲得化合物116。 ESI-MS m/z:[於tBu基脫離之狀態下檢測出] 273 (M + H)+ 步驟80 使用實施例19之步驟79中所合成之化合物116(0.309 g，0.803 mmol)，藉由與實施例9之步驟45相同之方法定量地獲得化合物117。 ESI-MS m/z: 273 (M + H)+ 步驟81 使用實施例17之步驟76中所合成之化合物117(1.2 g，2.62 mmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物118(1.1 mg，0.766 mmol，產率29%)。 ESI-MS m/z: 1436 (M + H)+ 實施例20 糖鏈配體-連接基單元之合成17 [化149]
Figure 02_image301
步驟82 使用實施例10之步驟47中所合成之化合物82(0.159 g，0.459 mmol)，藉由與實施例2之步驟9相同之方法獲得化合物119(0.096 g，0.197 mmol，產率43%)。 ESI-MS m/z: 487 (M + H)+ 步驟83 使用實施例20之步驟82中所合成之化合物119(96 mg，0.197 mmol)，藉由與實施例9之步驟41相同之方法定量地獲得化合物120。 ESI-MS m/z: 375 (M + H)+ 步驟84 使用實施例20之步驟83中所合成之化合物120(1.0 mg，2.55 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物121(2.6 mg，產率66%)。 ESI-MS m/z: 1539 (M + H)+ 實施例21 糖鏈配體-連接基單元之合成18 [化150]
Figure 02_image303
步驟85 使用藉由《歐洲化學》(Chemistry European Journal，第19卷，第4786-4797頁，2013年)中記載之方法所合成之化合物122(1 g，0.914 mmol)及4-(胺基甲基)苯酚鹽酸鹽(0.362 g，2.287 mmol)，藉由上述記載之文獻方法獲得化合物123(0.22 g，產率23%)。 ESI-MS m/z: 1062 (M + H)+ 步驟86 使實施例21之步驟85中所合成之化合物123(0.2 g，0.191 mmol)溶解於25%氨水溶液，添加吡啶(2 mL)及三甲基膦(0.12 mL)後，於室溫下攪拌16小時。將混合物減壓濃縮，藉由管柱層析法純化殘渣，藉此獲得化合物124(0.048 g，產率25%)。 ESI-MS m/z: 1037 (M + H)+ 步驟87 STEP1：使用藉由《歐洲化學》(Chemistry European Journal，第19卷，第4786-4797頁，2013年)中記載之方法所合成之化合物122(0.5 g，0.457 mmol)，藉由與步驟84相同之方法獲得偶合化合物(0.2 g，產率42%)。 STEP2：使STEP1中所合成之化合物(0.2 g，0.191 mmol)溶解於正丁醇(2 mL)，使用鉑/碳(200 mg)進行12小時之催化還原。將反應液減壓濃縮，藉由管柱層析法純化殘渣，藉此獲得化合物125(0.060 g，產率30%)。 ESI-MS m/z: 1019 (M + H)+ 實施例22 糖鏈配體-連接基單元之合成19 [化151]
Figure 02_image305
步驟88 STEP1：使用實施例1之步驟4中所合成之化合物5(3.39 g，8.584 mmol)，藉由與實施例2之步驟10相同之方法以粗生成物(2.293 g，產率50%)之形式獲得具有疊氮基之偶合化合物。 STEP2：使用STEP1中獲得之化合物(2.293 g，4.29 mmol)，藉由與實施例1之步驟2相同之方法以水解體(2.021 g，產率93%)之形式獲得羧酸酯。 STEP3：使用STEP2中獲得之化合物(0.100 g，0.197 mmol)，藉由與實施例12之步驟54相同之方法定量地獲得活性酯體。 STEP3：使用藉由STEP3之方法所獲得之活性酯(0.214g，0.255 mmol)，藉由與實施例12之步驟55相同之方法獲得化合物126(0.216 g，產率85%)。 ESI-MS m/z: 2763 (M - H)- 步驟89 將R＝R1時之結果示於以下。R2時亦獲得相同結果。 STEP1：使實施例21之步驟86中所合成之化合物124(9.9 mg，0.069 mmol)溶解於甲醇(500 μL)，添加28%甲醇鈉/甲醇溶液(14 μL)後，於室溫下靜置一晩。藉由逆相層析法(水/乙腈)純化混合物，藉此定量地獲得苯甲醯基去保護之目標物。 STEP2：使用實施例21之步驟87中獲得之化合物125(1.4 mg，0.502 μmol)及由STEP1獲得之化合物(4.2 mg，5.02 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物127(0.6 mg，產率30%)。 ESI-MS m/z: 1982 (M - 2H)2- 實施例23 糖鏈配體-連接基單元之合成20 [化152]
Figure 02_image307
步驟90 使用實施例3之步驟18中所合成之化合物126(24 mg，7.30 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物129(11 mg，48%)。 ESI-MS m/z: 1608 (M - 2H)2- 實施例24 糖鏈配體-連接基單元之合成21 [化153]
Figure 02_image309
步驟91化合物 130 之合成 STEP1：使用實施例3之步驟20中所合成之化合物22b(4 mg，1.342 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得配體加成體(0.9 mg，10%)。 STEP2：使由STEP1獲得之化合物(0.9 mg，0.129 μmol)溶解於甲醇(0.6 mL)，添加甲醇鈉(2 μL，10 μmol)後，於室溫下反應3小時。藉由逆相層析法分取反應液，進行冷凍乾燥，藉此獲得化合物130(0.3 mg，44%)。 ESI-MS m/z: 2642 (M - 2H)2- 化合物 131 之合成 使用實施例3之步驟20中所合成之化合物22b(22 mg，5.88 μmol)，藉由與實施例5之步驟26相同之方法獲得化合物131(3.6 mg，17%)。 ESI-MS m/z: 1851 (M + 2H)2+ 實施例25 核酸複合體之合成3 步驟92 方法1：使用表10-1～表10-3記載之化合物，藉由與實施例9之步驟38相同之方法獲得表11-1～表11-4記載之單鏈核酸複合體132～151。表11-3中之X、Y表示寡核苷酸之3'末端之核苷酸結構。 方法2：使用藉由《分子學》(Molecules，第17卷，第13825-13843頁，2012年)中記載之方法所合成之末端經胺基修飾之寡核苷酸及化合物105，藉由《生物共軛化學》(第22卷，第1723-1728頁，2011年)之方法獲得表11-3記載之單鏈核酸複合體152及153。 將藉由本實施例所合成之核酸複合體之序列及質譜分析結果示於表12。 表10-1 [表15]
Figure 02_image311
表10-2 [表16]
Figure 02_image313
表11-1 [表17]
Figure 02_image315
表11-2 [表18]
Figure 02_image317
表11-3 [表19]
Figure 02_image319
表11-4 [表20]
Figure 02_image321
表12 [表21] 實施例26 核酸複合體之合成4 步驟92 由步驟91中所合成之單鏈糖鏈複合體，藉由與實施例8之步驟38相同之方法獲得雙鏈糖鏈複合體154-175。將藉由本實施例所合成之核酸複合體示於表13-1～表13-4。表13-3中之X、Y表示正義鏈之3'末端之核苷酸。 表13-1 [表22]
Figure 02_image323
表13-2 [表23]
Figure 02_image325
表13-3 [表24]
Figure 02_image327
表13-4 [表25]
Figure 02_image329
將藉由本實施例所合成之核酸複合體之序列示於表14。再者，表14中之「化合物」欄之記載表示[表中之化合物編號]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(siRNA)]，又，「單鏈名稱」欄之記載中，正義鏈(ss)表示[表中之化合物編號]_[配體等於核酸中之鍵結位置]_[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-核酸之種類(ssRNA)，反義鏈(as)表示[核酸複合體中之核酸序列之簡寫符號]-[核酸之種類(as-RNA)]。 表14 [表26] 實施例27 核酸複合體之合成5 步驟93 藉由與實施例26、27相同之方法，分別獲得化合物148中序列不同之核酸複合體。以下將核酸複合體之序列及質譜分析結果示於表15，將雙鏈複合體之序列示於表16。 表15 [表27] 表16 [表28] 試驗例1：藉由CD45 ASO進行之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 使用包含10%胎牛血清之RPMI(Roswell Park Memorial Institute，洛斯維·帕克紀念研究所)1640培養基(Nacalai Tesque公司製造，30264-56)(以下記為10%FBS RPMI1640培養基)及DNase I溶液(DNase I Solution，StemCell Technology公司製造，07900)，依據隨附之操作說明，融解人CD14陽性單核細胞(未激活冷凍NPB-CD14+單核細胞(Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes)，Allcells公司製造，PB011F)。 其後，以最終濃度成為100 ng/mL之方式添加重組人介白素-4(Recombinant Human IL-4 Protein，R&D System公司製造，204-IL)(以下記為IL-4)，以最終濃度成為50 ng/mL之方式添加重組人粒細胞-單核細胞群落刺激因子(Recombinant Human GM-CSF Protein CF，R&D System公司製造，215-GM-050/CF)(以下記為GM-CSF)，以106 cells/mL之密度接種至懸浮培養用多層培養盤(Multiplate)(SUMILON公司製造，MS-8006R)，於37℃、5%CO2 條件下培養。 自培養開始起3天後及6天後，利用包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 50 ng/mL之10%FBS RPMI1640培養基半量更換培養基，誘導形成樹狀細胞。 自培養開始起8天後回收細胞，又，亦使用乙二胺四乙酸溶液(0.2 g/L‐EDTA Solution，Nacalai Tesque公司製造，14367-74)對貼壁細胞進行回收。於離心操作後，以1,250,000 cells/mL再次懸浮於新的包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 50 ng/mL之10%FBS RPMI1640培養基，以每孔80 μL接種至超低吸附96孔盤(Corning公司製造，3474)。 作為受驗樣品，使用KAC_008及KAC_009，作為比較對照，設置無配體之KAC_CTR_001及CD45基因中無互補部位之KAC_CTR_002。於如下條件下實施：KAC_008之最終濃度為1 μmol/L及0.3 μmol/L兩種濃度，KAC_009及KAC_CTR_001為1 μmol/L、0.3 μmol/L、0.1 μmol/L及0.03 μmol/L四種濃度，KAC_CTR_002為1 μmol/L，N＝3。 核酸複合體溶液之稀釋係藉由以下步驟進行。將於檸檬酸緩衝液(20 mM Citrate(pH值7)，150 mM NaCl)中以50 μM製備之核酸複合體溶液利用Opti-MEM(註冊商標)I低血清培養基(Reduced Serum Medium)(Life technologies公司製造，31985-070)稀釋成5 μM，溶液之進一步稀釋係使用以檸檬酸緩衝液與Opti-MEM成為1：9之方式製備之溶液進行稀釋。對細胞溶液分別添加經稀釋之核酸複合體溶液20 μL，對陰性對照組添加稀釋溶液20 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養2天。 包含RNA之細胞溶解液之製備係使用SuperPrep(註冊商標)細胞裂解&qPCR逆轉錄套組(Cell Lysis & RT Kit for qPCR)(TOYOBO公司製造，SCQ-101)，使用該套組配套之RT套組(qPCR逆轉錄套組)，依據套組之隨附說明書進行逆轉錄反應，製作cDNA。 使用該cDNA作為PCR反應之模板，使用QuantStudio 12K Flex即時PCR系統(Applied Biosystems公司製造)，藉由Taqman探針(Taqman probe)法使CD45之基因、及作為對照之甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(以下記為GAPDH)之基因進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，以GAPDH之mRNA擴增量作為內部對照，算出CD45之mRNA之準定量值。又，同樣地分別測定陰性對照組中之CD45及GAPDH之mRNA擴增量，算出CD45之mRNA之準定量值。 CD45基因之測定係使用Taqman探針Hs00894727_m1(Applied Biosystems公司製造)，GAPDH基因之測定係使用Hs02758991_g1(Applied Biosystems公司製造)，反應試劑係使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems公司製造，4369542)，依據隨附之操作說明實施。核酸複合體(ASO導入檢體)之靶mRNA量係以將陰性對照組(ASO未導入組)中之CD45之mRNA量設為1時之相對比率算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖1。 根據本結果，確認與比較對照(KAC_CTR_001、KAC_CTR_002)相比，受驗樣品(KAC_008、KAC_009)顯示出較強之減量效果。 試驗例2：針對β2微球蛋白(以下記為B2M)之使用ASO之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗 藉由與試驗例1相同之程序自人CD14陽性單核細胞誘導樹狀細胞，接種至超低吸附6孔盤(Corning公司製造，3471)，於37℃、5%CO2 條件下培養。3天後利用包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 50 ng/mL之10%FBS RPMI1640培養基半量更換培養基，誘導形成樹狀細胞。 自培養開始起6天後回收細胞，於離心操作後，以125000 cells/mL再次懸浮於新的包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 50 ng/mL之10%FBS RPMI1640培養基，以每孔80 μL接種至超低吸附96孔盤(Corning公司製造，3474)。 作為受驗樣品，使用KAC_010及KAC_012，作為比較對照，設置無配體之KAC_CTR_003及具有GalNAc配體之KAC_013、KAC_014。於如下條件下實施：各ASO之最終濃度為0.3 μmol/L、0.1 μmol/L兩種濃度，N＝2。 核酸複合體溶液之稀釋係藉由以下步驟進行。將於檸檬酸緩衝液中以40 μM製備之各核酸複合體溶液利用Opti-MEM稀釋成1.5 μM，溶液之進一步稀釋係使用以檸檬酸緩衝液與Opti-MEM成為3：77之方式製備之溶液進行稀釋。對細胞溶液分別添加經稀釋之核酸複合體溶液20 μL，對陰性對照組添加稀釋溶液20 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養。 添加核酸1天後回收細胞，於離心操作後，再次懸浮於新的包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 50 ng/mL之10%FBS RPMI1640培養基 80 μL，於37℃、5%CO2 條件下進而培養3天。 細胞之洗淨溶液係藉由對含1%(w/v)BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)之磷酸緩衝生理鹽水500 mL添加10%疊氮化鈉溶液(Nacalai Tesque公司製造)2.5 mL、0.5 M EDTA溶液(EDTA(0.5 M)，pH值8.0，Ambion公司製造，AM9260G)685 μL而製備。又，對上述洗淨溶液以成為20%(v/v)之方式添加FcR阻斷試劑-人(Miltenyi Biotec公司製造，130-059-901)，藉此製備FcR阻斷溶液。 添加核酸4天後回收細胞，進行離心操作後，使用洗淨溶液進行一次洗淨操作。去除上清液後，分別添加FcR阻斷溶液90 μL，於冰上靜置30分鐘，藉此進行阻斷反應。 準備FcR阻斷溶液15 μL與針對B2M蛋白質之抗體(APC(antigen presenting cell，抗原呈現細胞)抗人β2微球蛋白抗體(APC anti-human β2-microglobulin Antibody)，Biolegend公司製造，316312)5 μL之混合液置於新培養盤內，添加經FcR阻斷後之細胞溶液80 μL，於冰上靜置，藉此使抗體反應。 1小時後回收細胞，利用洗淨溶液進行3次洗淨後，再次懸浮於200 μL，利用BD FACSCantoTM II流式細胞儀(Becton Dickinson公司製造)進行測定。 解析係使用FlowJo 7.6.5(Tomy Digital Biology公司製造)，利用前方散射光(FSC)與側方散射光(SSC)對細胞組分設門，藉由作為平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity)(以下記為MFI)之幾何平均(Geometric means of the fluorescence intensity，幾何平均螢光強度)之值測定細胞表面抗原之表現量。 將表示MFI值之平均值之結果示於圖2。根據本結果，確認與比較對照(KAC_013、KAC_014、KAC_CTR_003)相比，受驗樣品(KAC_010、KAC_012)於低濃度區域較強地減量B2M蛋白質。 試驗例3：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗 藉由與試驗例2相同之步驟誘導樹狀細胞，自培養開始起6天後將細胞接種至超低吸附96孔盤。 作為受驗樣品，使用KsiRC_010、KsiRC_011及KsiRC_012，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001、及具有GalNAc配體之KsiRC_013與KsiRC_014。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為3 μmol/L、1 μmol/L、0.3 μmol/L三種濃度，N＝1；關於不含核酸之陰性對照組，N＝3。 核酸複合體溶液之稀釋係藉由以下步驟進行。將於檸檬酸緩衝液中以40 μM製備之之各核酸利用Opti-MEM稀釋成15 μM，溶液之進一步稀釋係使用以檸檬酸緩衝液與Opti-MEM成為21：35之方式製備之溶液進行稀釋。對細胞溶液分別添加經稀釋之核酸複合體溶液20 μL，對陰性對照組添加稀釋溶液20 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養。 添加核酸4天後回收細胞，進行離心操作後，使用洗淨溶液進行一次洗淨操作，其後藉由與試驗例2相同之方法測定細胞表面抗原之B2M蛋白之表現量並進行解析。 將其結果示於圖3。關於陰性對照組，以平均±標準偏差表示。與比較對照(KsiRC_013、KsiRC_014、KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_010、KsiRC_011、KsiRC_012)顯示出顯著之B2M蛋白之減量。 試驗例4：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 藉由與試驗例2相同之步驟誘導樹狀細胞，自培養開始起6天後將細胞接種至超低吸附96孔盤。 作為受驗樣品，使用KsiRC_010，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為3 μmol/L、1 μmol/L、0.3 μmol/L三種濃度，N＝3。 關於核酸複合體溶液之稀釋及添加，藉由與試驗例3相同之方法進行，於37℃、5%CO2條件下培養。 添加核酸4天後回收細胞，進行離心操作後，使用洗淨溶液進行一次洗淨操作，其後藉由與試驗例1相同之方法測定mRNA之表現量。 B2M基因之測定係使用Taqman探針Hs00984230_m1(Applied Biosystems公司製造)，GAPDH基因之測定係使用Hs02758991_g1(Applied Biosystems公司製造)，反應試劑係使用TaqMan Gene Expression Master Mix，依據隨附之操作說明實施。siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖4。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_010)顯示出顯著之減量活性之提高。 試驗例5：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗 藉由與試驗例3相同之步驟誘導樹狀細胞，自培養開始起6天後將細胞接種至超低吸附96孔盤。 作為受驗樣品，使用KsiRC_010、KsiRC_003、KsiRC_004、KsiRC_005、KsiRC_006、KsiRC_008、KsiRC_001、KsiRC_002、KsiRC_007，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001、變更KsiRC_008之siRNA序列所得之對照體KsiRC_009(GAPDH靶序列)。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為1 μmol/L、0.3 μmol/L兩種濃度，N＝1；關於不含核酸之陰性對照組，N＝2。 核酸複合體溶液之稀釋係藉由以下步驟進行。將於檸檬酸緩衝液中以20 μM製備之之各核酸利用Opti-MEM稀釋成5 μM，溶液之進一步稀釋係使用以檸檬酸緩衝液與Opti-MEM成為1：3之方式製備之溶液進行稀釋。對細胞溶液分別添加經稀釋之核酸複合體溶液20 μL，對陰性對照組添加稀釋溶液20 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養。 添加核酸4天後回收細胞，進行離心操作後，使用洗淨溶液進行一次洗淨操作。去除上清液後，分別添加FcR阻斷溶液75 μL，於冰上靜置30分鐘，藉此進行阻斷反應。 準備包含B2M之對應抗體(APC抗人β2微球蛋白抗體，Biolegend公司製造，316312)5 μL、LIVE/DEAD(註冊商標)可固定水性死細胞染色套組(Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit)(Thermo Fisher Scientific公司，L34957)1 μL、HLΑ-DR之對應抗體(Brilliant Violet 421™抗人HLΑ-DR抗體(anti-human HLΑ-DR Antibody)，Biolegend公司製造，307635)5 μL、CD11c之對應抗體(PE抗人CD11c抗體(anti-human CD11c Antibody)，Biolegend公司製造，301606)5 μL的混合液置於新培養盤內，添加經阻斷操作之細胞溶液65 μL，於冰上靜置1小時。 其後回收細胞，使用洗淨溶液進行3次洗淨後，再次懸浮於200 μL，利用BD FACSVerseTM 流式細胞儀(Becton Dickinson公司製造)進行測定。 解析係使用FlowJo 7.6.5。利用前方散射光(FSC)與側方散射光(SSC)對細胞設門，將LIVE DEAD之陰性組分作為活細胞，將HLΑ-DR及CD11c陽性組分作為解析對象。藉由APC通道之作為平均螢光強度之幾何平均(幾何平均螢光強度)之值而測定細胞表面抗原之表現量。 將所獲得之值示於圖5。關於陰性對照組，顯示平均值。與比較對照(KsiRC_CTR_001、KsiRC_009)相比，受驗樣品(KsiRC_010、KsiRC_003、KsiRC_004、KsiRC_005、KsiRC_006、KsiRC_008、KsiRC_001、KsiRC_002、KsiRC_007)顯示出顯著之B2M蛋白之減量。 試驗例6：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 使用X-VIVO15TM 培養基(X-VIVO™ 15限定化學成分無血清造血細胞培養基(Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium)，Lonza公司製造，04-418Q)，依據隨附之操作說明融解人CD14陽性單核細胞(Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes，Allcells公司製造，PB011F)。 其後，以最終濃度成為100 ng/mL之方式添加重組人介白素-4(Recombinant Human IL-4 Protein，R&D System公司製造，204-IL)(以下記為IL-4)，以最終濃度成為100 ng/mL之方式添加重組人粒細胞單核細胞群落刺激因子(Human GM-CSF premiμm grade，Miltenyi Biotec公司製造，130-093-864、130-093-865)(以下記為GM-CSF)，以106 cells/mL之密度接種至6孔盤(Falcon® 6孔細胞培養盤，Corning公司製造，353046)，於37℃、5%CO2 條件下培養。自培養開始起2天後及3天後更換培養基，誘導形成樹狀細胞。 自培養開始起6天後回收細胞，亦使用乙二胺四乙酸溶液(0.2 g/L-EDTA Solution，Nacalai Tesque公司製造，14367-74)對貼壁細胞進行回收。於離心操作後，以500,000 cells/mL再次懸浮於新的包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 100 ng/mL之X-VIVO15TM 培養基，以每孔200 μL接種至超低吸附96孔盤(Corning公司製造，3474)，於37℃、5%CO2 條件下進而培養3天。 自培養開始起9天後回收細胞，於離心操作後，以625,000 cells/mL再次懸浮於新的包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 100 ng/mL之X-VIVO15TM 培養基，以每孔80 μL接種至超低吸附96孔盤。 作為受驗樣品，使用KsiRC_025、KsiRC_027及KsiRC_029，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為0.3 μmol/L、0.1 μmol/L，N＝3。 與試驗例1-5同樣地，對細胞溶液分別添加經Opti-MEM(註冊商標)I低血清培養基(Life technologies公司製造，31985-070、31985-088)稀釋之核酸複合體溶液20 μL，對陰性對照組添加稀釋溶液20 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養4天。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例4相同之方法測定mRNA之表現量。 siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖6。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_025、KsiRC_027及KsiRC_029)顯示出顯著之減量活性之提高。 試驗例7：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 藉由與試驗例6相同之方法誘導源自人單核細胞之樹狀細胞，評價各種B2M siRNA之活性。 作為受驗樣品，使用KsiRC_030、KsiRC_031、KsiRC_032、KsiRC_015、KsiRC_016、KsiRC_018、KsiRC_019及KsiRC_017，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為0.03 μmol/L、0.01 μmol/L，N＝3。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例6相同之方法測定mRNA之表現量。 siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖7。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_030、KsiRC_031、KsiRC_032、KsiRC_015、KsiRC_016、KsiRC_018、KsiRC_019及KsiRC_017)顯示出減量活性之提高。 試驗例8：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 藉由與試驗例6相同之方法誘導源自人單核細胞之樹狀細胞，評價各種B2M siRNA之活性。 作為受驗樣品，使用KsiRC_020，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為0.03 μmol/L、0.01 μmol/L，N＝3。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例7相同之方法測定mRNA之表現量。 siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖8。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_020)顯示出減量活性之提高。 試驗例9：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 藉由與試驗例6相同之方法誘導源自人單核細胞之樹狀細胞，評價各種B2M siRNA之活性。 作為受驗樣品，使用KsiRC_023、KsiRC_024、KsiRC_021及KsiRC_028，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為0.03 μmol/L、0.01 μmol/L，N＝3。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例8相同之方法測定mRNA之表現量。 siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖9。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_023、KsiRC_024、KsiRC_021、KsiRC_028)顯示出減量活性之提高。 試驗例10：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 藉由與試驗例6相同之方法誘導源自人單核細胞之樹狀細胞，評價各種B2M siRNA之活性。 作為受驗樣品，使用KsiRC_035、KsiRC_036、KsiRC_022、KsiRC_033、KsiRC_034)，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為0.01 μmol/L、0.003 μmol/L，N＝3。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例9相同之方法測定mRNA之表現量。 siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖10。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_035、KsiRC_036、KsiRC_022、KsiRC_033、KsiRC_034)顯示出減量活性之提高。 試驗例11：使用B2M-siRNA之源自成熟人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 藉由與試驗例6相同之方法誘導源自人單核細胞之樹狀細胞，自培養開始起6天後回收細胞，其後以500,000 cells/mL再次懸浮於新的包含IL-4 100 ng/mL及GM-CSF 100 ng/mL之X-VIVO15TM 培養基，以每孔200 μL接種至超低吸附96孔盤(Corning公司製造，3474)。此時，添加專利記載之CD40抗體(國際公開第02/088186號，Clone：KM341-1-19)，於37℃、5%CO2 條件下培養3天，藉此製備成熟樹狀細胞。 自培養開始起9天後回收細胞，於離心操作後，以625,000 cells/mL再次懸浮於新的包含IL-4 100 ng/mL、GM-CSF 100 ng/mL及CD40抗體之X-VIVO15TM 培養基，以每孔80 μL接種至超低吸附96孔盤(Corning公司製造，3474)。 作為受驗樣品，使用KsiRC_003、KsiRC_031、KsiRC_001，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為0.3 μmol/L、0.1 μmol/L，N＝3。 與試驗例1-5同樣地，對細胞溶液分別添加經Opti-MEM稀釋之核酸複合體溶液20 μL，對陰性對照組添加稀釋溶液20 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養4天。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例10相同之方法測定mRNA之表現量。siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖11。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_003、KsiRC_031、KsiRC_001)顯示出減量活性之提高。 試驗例12：使用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶1(以下記為HPRT1)-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗 藉由與試驗例11相同之方法誘導形成源自成熟人單核細胞之樹狀細胞，評價各種HPRT1 siRNA之活性。 作為受驗樣品，使用KsiRC_037，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_002。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為0.3 μmol/L、0.1 μmol/L、0.03 μmol/L，N＝3。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例11相同之方法測定mRNA之表現量。 HPRT1基因之測定係使用Taqman探針Hs99999909_m1(Applied Biosystems公司製造)，GAPDH基因之測定係使用Hs02758991_g1(Applied Biosystems公司製造)，反應試劑係使用TaqMan Gene Expression Master Mix，依據隨附之操作說明實施。siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之HPRT1之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖12。 與比較對照(KsiRC_CTR_002)相比，受驗樣品(KsiRC_037)顯示出減量活性之提高。 試驗例13：使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之巨噬細胞之mRNA減量試驗 使用X-VIVO15TM 培養基，依據隨附之操作說明融解人CD14陽性單核細胞(Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes，Allcells公司製造，PB011F)。 其後，以最終濃度成為100 ng/mL之方式添加GM-CSF，稀釋成375,000 cells/mL之密度後，以每孔200 μL接種至96孔盤(Nunc™ MicroWell™ 96孔微盤(96-Well Microplates)，Thermo Fisher Scientific公司製造，167008)，於37℃、5%CO2 條件下培養，藉此製備源自單核細胞之巨噬細胞。 自培養開始起7天後去除上清液，添加新的包含GM-CSF 125 ng/mL之X-VIVO15TM 培養基各80 μL。 作為受驗樣品，使用KsiRC_001、KsiRC_030、KsiRC_031及KsiRC_032，作為比較對照，設置無配體之KsiRC_CTR_001。於如下條件下實施：各siRNA之最終濃度為1 μmol/L、0.3 μmol/L、0.1 μmol/L，N＝3。 與試驗例1-5同樣地，對細胞溶液分別添加經Opti-MEM稀釋之核酸複合體溶液20 μL，對陰性對照組添加稀釋溶液20 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養4天。 添加核酸4天後回收細胞，其後藉由與試驗例12相同之方法測定mRNA之表現量。siRNA導入檢體之靶mRNA量係作為將siRNA未導入組(陰性對照組)中之B2M之mRNA量設為1時之相對比率而算出。將該mRNA量之相對比率以平均±標準偏差之形式表示之結果示於圖13。 與比較對照(KsiRC_CTR_001)相比，受驗樣品(KsiRC_001、KsiRC_030、KsiRC_031及KsiRC_032)顯示出減量活性之提高。 [產業上之可利用性] 本發明之核酸複合體可用於對哺乳動物進行投予，而於活體內治療各種相關疾病。 [序列表非關鍵文字] 序列編號1表示CD45-ASO之鹼基序列。 序列編號2表示ApoB-ASO之鹼基序列。 序列編號3表示B2M-ASO之鹼基序列。 序列編號4表示B2M-ssRNA之鹼基序列。 序列編號5表示B2M-asRNA之鹼基序列。 序列編號6表示GAPDH-ssRNA之鹼基序列。 序列編號7表示GAPDH-asRNA之鹼基序列。 序列編號8表示Hprt-1ssRNA之鹼基序列。 序列編號9表示Hprt-1asRNA之鹼基序列。
圖1係表示試驗例1之藉由CD45(Cluster of Differentiation 45，分化簇45)-反義寡核苷酸(ASO)進行之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA(messenger RNA，信使核糖核酸)減量試驗之結果。 圖2係表示試驗例2之針對B2M(Beta-2 Microglobulin，β2微球蛋白)之使用ASO之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖3係表示試驗例3之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖4係表示試驗例4之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之mRNA減量試驗之結果。 圖5係表示試驗例5之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖6係表示試驗例6之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖7係表示試驗例7之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖8係表示試驗例8之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖9係表示試驗例9之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖10係表示試驗例10之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖11係表示試驗例11之使用B2M-siRNA之源自成熟人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖12係表示試驗例12之使用HPRT1-siRNA之源自成熟人單核細胞之樹狀細胞之蛋白質減量試驗之結果。 圖13係表示試驗例13之使用B2M-siRNA之源自人單核細胞之巨噬細胞之蛋白質減量試驗之結果。

Claims (19)

  1. 一種核酸複合體，其係糖鏈配體經由連接基而與寡核苷酸鍵結而成者，且糖鏈配體具有下述結構，
    Figure 106122151-A0305-02-0216-1
     (式中，R1及R2分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1~20之烷基、經取代或未經取代之碳數2~20之烯基、經取代或未經取代之碳數3~20之炔基、經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜芳基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜脂環基、及經已經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基取代而成之經取代或未經取代之碳數1~20之芳烷基所組成之群中之基，Y1及Y2分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3所組成之群中之基，R3為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1~20之烷基)。
  2. 如請求項1之核酸複合體，其中糖鏈配體係以下述結構表示，
    Figure 106122151-A0305-02-0217-2
     (式中，R1'及R2'分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1~20之烷基、經取代或未經取代之碳數2~20之烯基、經取代或未經取代之碳數3~20之炔基、經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜芳基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜脂環基、及經已經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基取代而成之經取代或未經取代之碳數1~20之芳烷基所組成之群中之基，Y1'及Y2'分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3'所組成之群中之基，R3'為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1~20之烷基)。
  3. 如請求項1之核酸複合體，其中Y1及Y2為NH。
  4. 如請求項2之核酸複合體，其中Y1'及Y2'為NH。
  5. 如請求項3之核酸複合體，其中R1及R2為經已經取代或未經取代之苯 基、萘基或蒽基取代而成之經取代或未經取代之碳數1~20之芳烷基。
  6. 如請求項4之核酸複合體，其中R1'及R2'為經已經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基取代而成之經取代或未經取代之碳數1~20之芳烷基。
  7. 如請求項1至6中任一項之核酸複合體，其中糖鏈配體係以下述結構表示，
    Figure 106122151-A0305-02-0218-3
     (式中，R1"及R2"分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1~20之烷基、經取代或未經取代之碳數2~20之烯基、經取代或未經取代之碳數3~20之炔基、經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜芳基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜脂環基、及經已經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基取代而成之經取代或未經取代之碳數1~20之芳烷基所組成之群中之基，Y1"及Y2"分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3"所組成之群中 之基，R3"為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1~20之烷基)。
  8. 如請求項7之核酸複合體，其中糖鏈配體係以下述結構表示，
    Figure 106122151-A0305-02-0219-4
     (式中，R1'''及R2'''分別獨立為選自由氫原子、經取代或未經取代之碳數1~20之烷基、經取代或未經取代之碳數2~20之烯基、經取代或未經取代之碳數3~20之炔基、經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜芳基、經取代或未經取代之具有1~3個氮原子、氧原子或硫原子之5~6員雜脂環基、及經已經取代或未經取代之苯基、萘基或蒽基取代而成之經取代或未經取代之碳數1~20之芳烷基所組成之群中之基，Y1'''及Y2'''分別獨立為選自由氧原子、硫原子、及NR3"所組成之群中之基，R3'''為氫原子或者經取代或未經取代之碳數1~20之烷基)。
  9. 如請求項1至6中任一項之核酸複合體，其具有2~8個糖鏈配體。
  10. 如請求項1至6中任一項之核酸複合體，其中連接基具有下述結構中之任一結構，
    Figure 106122151-A0305-02-0220-5
     (式中，X1為CH或氮原子，X2~X4分別獨立為CH或氮原子)。
  11. 如請求項1至6中任一項之核酸複合體，其中連接基具有下述結構，
    Figure 106122151-A0305-02-0220-6
  12. 如請求項1之核酸複合體，其中連接基具有下述結構，
    Figure 106122151-A0305-02-0220-7
     (式中， n1為1~100之整數)。
  13. 如請求項1至6中任一項之核酸複合體，其中連接基具有下述結構中之任一結構，
    Figure 106122151-A0305-02-0221-8
    Figure 106122151-A0305-02-0222-9
    Figure 106122151-A0305-02-0223-10
    Figure 106122151-A0305-02-0224-11
    Figure 106122151-A0305-02-0225-12
     (式中，n2及n3分別獨立為1~100之整數)。
  14. 如請求項1至6中任一項之核酸複合體，其中上述寡核苷酸包含修飾核苷酸。
  15. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之核酸複合體。
  16. 如請求項15之醫藥組合物，其係用以導入至細胞內。
  17. 如請求項16之醫藥組合物，其中上述細胞為樹狀細胞或巨噬細胞。
  18. 如請求項15至17中任一項之醫藥組合物，其係供靜脈內投予或皮下投予。
  19. 如請求項1至14中任一項之核酸複合體或如請求項15至17中任一項之醫藥組合物，其係用於醫藥。
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