KR20220030204A - 치료 분자의 표적화된 전달 - Google Patents

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KR20220030204A
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linker
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bridge
cancer
sirna
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KR1020217023730A
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피터 장
샤오용 루
데이비드 엠. 에반스
패트릭 와이. 루
알란 루
존 수
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서나오믹스, 인크.
피터 장
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Abstract

본 발명은, 인간 및 기타 포유동물의 기관, 조직 및 세포에 대한 치료 분자의 표적화된 전달에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 치료 분자를 전달하기 위한 화학적 작제물 및 이러한 작제물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

치료 분자의 표적화된 전달
1. 관련 특허 출원의 상호 참조
본 출원은, 2018년 12월 28일자로 출원된 미국 가출원번호 제62/786,213호의 이익 및 우선권을 주장하고, 이의 전체가 참조에 의해 본원에 혼입된다.
1.1 서열 목록
본 출원은, ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 리스트를 포함하며, 이의 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다. 2020년 2월 14일에 작성된 상기 ASCII 카피는 4690_0024i_SL.txt로 명명되고, 크기가 9,268 바이트이다.
2. 발명의 분야
본 발명은 인간 및 기타 포유동물의 기관, 조직 및 세포에 대한 치료 분자(therapeutic molecule)의 표적화된 전달에 관한 것이다.
인체 내의 특정 위치(예를 들면, 원하는 기관, 조직 또는 세포)에 대한 치료 화합물의 전달은, 치료 효능을 증진시킬 뿐만 아니라, 투여량 및 클리어런스 속도(clearance rate)의 관점에서 안전성 프로파일을 개선시킨다는 점에서 다수의 이점을 갖는다. 치료제의 표적화된 전달은 효능의 증가 및 부작용의 감소를 통해 종양 치료를 개선시키기 위한 노력으로 큰 관심을 끌고 있다[1]. 추가적으로, 신체 내의 특정 위치에 대한 치료 화합물의 효율적 전달은, 의도하지 않은 부작용, 예컨대, 이들의 보다 높은 용량에서 원하지 않는 부작용을 생성할 가능성이 있는, 작용 부위에서 적절한 양의 물질의 전달을 보장하기 위해 보다 많은 용량에 대한 요건을 최소화하거나 회피할 것이다.
치료 화합물을 표적 위치로 전달하는데 효과적인 것으로 입증된 방법들 중 하나는 화합물을 표적화 리간드에 부착시키는 것에 의한 것이다[2]. 리간드는, 그의 호밍(homing) 수용체(표적화될 세포 상의 원형질 막의 외측에 존재)를 인식 및 결합하도록 선택되고, 치료 화합물에 부착된 리간드와 결합하면, 화합물을 세포로 이동시켜 이의 치료 효과를 발휘한다.
마이크로RNA(miRNA), 소간섭 RNA(siRNA) 및 DNA 백신 등의 뉴클레오티드-기반 의약을 포함하는 신규한 생물학적 약물 중에서, 포유동물에서 기능적 RNAi 경로의 발견은 특정 유전자를 선택적으로 사일런싱하고 질환의 병인에 본질적으로 관여하는 단백질의 생성을 감소시키는 방법으로서, 역유전학을 위한 강력한 도구를 제공했기 때문에, RNAi가 임의의 유전자를 사일런싱시키는 가능성은 이를 매력적인 치료법으로 되게 한다. 최근에, 이의 서열-특이적 전사후 유전자 사일런싱 능력 때문에, siRNA는 암, 감염, 황반 변성, 심혈관 질환, 신경계 장애 및 기타 유전자 관련 질환 등의 다수의 질환을 치료하기 위한 유망한 신규 치료 후보가 되었다. siRNA는, 임의 유전자의 발현을 녹-다운(knock down)하는 능력으로 인해, "언드러거블(undruggable)" 표적(즉, 모노클로날 항체에 의한 접근을 이용할 수 없는 것, 또는 소분자가 단백질의 활성을 차단할 수 있는 명확한 부위를 갖지 않는 것)을 갖는 것들을 포함하여, 광범위한 질환을 치료하기 위한 이상적 후보로서 예고되었다.
생체내에서 siRNA의 표적화 전달에 대한 접근법은, 혈청 뉴클레아제에 의한 비변형 siRNA의 분해, 신속한 클리어런스, 엔도좀 포획, 및 전달에 사용된 나노입자에 의해 생성된 고유한 면역 시뮬레이션 때문에 곤란했다[3].
도 1. 일반적 작제물의 개략도. 작제물은, 링커-1 및 링커-2, 및 리간드 부분 및 페이로드 부분을 연결하는 조인트 브릿지(joint bridge), 및 표적화 리간드 및 전달된 페이로드를 포함한다. 페이로드는 치료 분자이다.
도 2. 리간드-접합 siRNA의 개략도. N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 접합된 siRNA(TGFβ1 또는 cox2)는 25-뉴클레오티드 센스 쇄(sense strand) 및 25-뉴클레오티드 안티센스 쇄로 구성되고, 여기서 안티센스 쇄의 3' 말단은 제로-뉴클레오티드 오버행(overhang)을 갖는다. GalNAc는 센스 쇄의 3' 또는 5' 말단에 각각 접합된다. 여기서는 3개 유형의 리간드가 각각 3가-GalNAc 접합체, 2가-GalNAc 접합체, 1가-GalNAc 접합체로서 제시되고, 3개, 2개 및 1개의 리간드가 각 경우에 부착되었다.
도 3. siRNA의 대체 리간드-접합 센스 쇄의 개략도. N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 접합된 siRNA(TGFβ1 또는 Cox2)는 25-뉴클레오티드 센스 쇄 및 25-뉴클레오티드 안티센스 쇄로 구성되고, 여기서 안티센스 쇄의 3' 말단이 제로-뉴클레오티드 오버행을 갖는다. GalNAc는 각각 지방족 쇄를 통해 센스 쇄의 3' 또는 5' 말단에 접합된다. 여기서는 3개 유형의 리간드가 각각 3가-GalNAc 접합체(n = 3), 2가-GalNAc 접합체(n = 2), 1가-GalNAc 접합체(n = 1)로서 제시되어 있고, 여기서 3, 2 및 1개의 리간드가 각 경우에 부착되었다.
도 4. siRNA의 대체 리간드-접합 센스 쇄의 개략도. N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 접합된 siRNA(TGFβ1)는 25-뉴클레오티드 센스 쇄 및 25-뉴클레오티드 안티센스 쇄로 구성되고, 여기서 안티센스 쇄의 3' 말단이 제로-뉴클레오티드 오버행을 갖는다. RNA는 안정성을 개선시키기 위해 OMe(또는 부분적으로 변형된) 관능기(functional group)로서 메틸화된다. GalNAc는 각각 포스페이트를 통해 센스 쇄의 5'(또는 3') 말단에 접합된다. 여기서는 3개 유형의 리간드가 각각 3가-GalNAc 접합체(n = 3), 2가-GalNAc 접합체(n = 2), 1가-GalNAc 접합체(n = 1)로서 제시되어 있고, 여기서 3, 2 및 1개의 리간드가 각 경우에 부착되었다. 다른 3'(또는 5') 말단은 콜레스테롤 관능기와 접합시켜 막 투과성의 능력을 증강시켰다. 도 4는 서열번호 7을 개시한다.
도 5. 대체 리간드-접합 siRNA의 개략도. N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 접합된 siRNA(COX-2)는 25-뉴클레오티드 센스 쇄 및 25-뉴클레오티드 안티센스 쇄로 구성되고, 여기서 안티센스 쇄의 3' 말단이 제로-뉴클레오티드 오버행을 갖는다. RNA는 안정성을 개선시키기 위해 OMe 관능기로서 메틸화된다. GalNAc는 각각 포스페이트를 통해 센스 쇄의 5'(또는 3') 말단에 접합된다. 여기서는 3개 유형의 리간드가 각각 3가-GalNAc 접합체(n = 3), 2가-GalNAc 접합체(n = 2), 1가-GalNAc 접합체(n = 1)로서 제시되어 있고, 여기서 3, 2 및 1개의 리간드가 각 경우에 부착되었다. 다른 3'(또는 5') 말단은 콜레스테롤 관능기와 접합시켜 막 투과성의 능력을 증강시켰다. 도 5는 서열번호 21을 개시한다.
도 6. siRNA 센스 쇄와 링커-리간드 사이의 연결 유형 및 합성 경로 예시. 센스 쇄의 3' 말단은 관능화된 폴리에틸렌 글리콜(Fun PEG) 그룹을 연결시키기 위해 몇몇 합성 단계를 통해 화학적 변형에 의해 공유결합적으로 변형되었다. 2' 위치는 TOM 또는 TBDMS 등의 보호 그룹을 갖는 H 또는 OR 그룹일 수 있다.
도 7. siRNA(TGFβ1)와 리간드(예: GalNAc) 사이의 링커-1 설계. siRNA를 리간드에 연결하기 위한 2개 유형의 링커가 본원에 기재되어 있다. 하나는 링커로 작용할 수 있는 말단 티올을 갖는 수용성 PEG를 사용하는 것이고, 다른 하나는, 다른 모이어티에 연결하기 위한 부위를 제공하기 위해 말단 티올을 또한 갖는 폴리(L-락타이드)이다. 이들 생성물 모두는 다양한 길이로 용이하게 이용가능하고, 표준 말레이미드 결합 화학를 사용하여 티올 그룹에 접합할 준비가 되어 있다[4].
도 8. 말레이미드 관능기에 의해 종결된 리간드 GalNAc 분자의 구조 예시. 1가 GalNAc 분자, 2가 GalNAc 분자 및 3가 GalNAc 분자가 도시되어 있다. 3개의 GalNAc 리간드는 아지드 및 알킨 사이의 "클릭" 반응을 사용하여 트리아졸 환을 통해 삼각대 링커에 연결되었다[5]. 분자의 다른 말단은 추가의 화학적 변형을 가능하게 하기 위해 말레이미드 작용성 모티프에 의해 캡핑되었다.
도 9. HepG2 세포주에서 GalNAc-siRNA의 시험관내 시험. 도 4 m = 0의 GalNAc-TGFβ1은 인간 간세포 암종 HepG2 세포 생존성에 대한 이 연구에서 사용되었다. 세포 사멸 siRNA에 의한 치료 효과는 GalNAc-TGFβ1(25nM, 50nM, l00nM), 대조군 블랭크, 비-사일런싱 siRNA(NC, 100nM), HKP(100nM), 리포좀(각각 25nM, 50nM 및 100nM), 및 리포좀-GalNAc-TGFβ1(각각 25nM, 50nM 및 100nM)과 함께 제형화되었다. GalNAc-TGFβ1(각각 25nM, 50nM, 100nM), 대조군 블랭크, 비-사일런싱(non-silencing) siRNA(NC, 100nM), HKP(100nM), 리포좀(각각 25nM, 50nM 및 100nM), 리포좀-GalNAc-TGFβ1(각각 25nM, 50nM, 100nM)의 혼합물을 100㎕ OPTI-MEM 배지에서 세포와 함께 인큐베이팅했다. 형질감염 배지는, 6시간 후에 10% FBS/DMEM 또는 EMEM으로 교환했다. 형질감염후 72시간에서, 생존 세포의 수를 실시간 정량적 역전사 QRT-PCR 검정으로 평가하여, TGF-β1 mRNA의 상대적 발현을 정량화했다. 무처리 세포(블랭크)로부터 유래하는 값을 100%로 설정했다. NC-비-사일런싱 siRNA.
도 10. 마우스 모델에서 GalNAc-siRNA의 생체내 시험. 이 연구에서는, 도 4(m = 0)의 GalNAc-TGFβ-1의 구조를 사용했다. 투여량은 마우스당 siRNA이고, GalNAc/siRNA-H(고농도)로부터 GalNAc/siRNA-L(저농도)에 대해 200㎍, 100㎍ 또는 50㎍에서 1회 주사가 수행되었고, PC(HKP/siRNA = 4:1)은 40㎍이다. 마우스는, 꼬리-정맥 주사를 통해 설계된 투여량으로 투여했다. 24시간의 약물 투여 후, 처리된 동물의 간의 우엽을 수집하고, RNA 추출을 위해 균질화했다. 이어서, QRT-PCR을 실행하여, 관련된 mRNA의 사일런싱의 정도를 측정했다. 제시된 데이터는 4마리 마우스의 평균이다. * -P < 0.05 대 블랭크, 및 ** -P < 0.01 대 블랭크. PC는 포지티브 대조군을 의미한다. 요약하면, 포지티브 대조군(PC)에서, HKP/siRNA는 간 전체에 전달되었지만, GalNAc-H, -M, -L은 간 간세포에만 특이적이다. 따라서, 간에서 발현되는 전체적 mRNA는 PC의 경우보다 GalNAc의 경우가 약간 높았다. 또한, GalNAc-H, -M 및 -L의 용량 의존적 효과도 관찰되었다. 전체로서, 이는 GalNAc가 siRNA에 성공적으로 전달되었고, 사일런스 효과를 나타내는 것을 강력히 시사한다.
도 11. 1가 GalNAc 리간드의 합성 경로. 1가 GalNAc 리간드의 합성이 제시된다. 이 방법은, 주로 2개 분자 사이의 "클릭" 반응을 이용하고, 이어서 NHS 그룹과 아민 사이의 아미드 형성을 이용하는 몇몇 단계를 채용했다. 마지막으로, 이는 말레이미드 그룹으로 종결했다.
도 12. 2가 GalNAc 리간드의 합성 경로. 2가 GalNAc 리간드의 합성은, 주로 알킨 그룹의 설치, 아지드-GalNAc 사이의 "클릭" 반응, 이어서 NHS 그룹과 아민 사이의 아미드 형성에 의한 5개 단계를 통해 본원에 제시한다. 마지막으로, 이는 말레이미드 그룹으로 종결했다.
도 13. 3가 GalNAc 리단드의 합성 경로. 합성 경로는 도 11의 경로와 매우 유사하고, 기질만이 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄으로 변경되었다.
도 14. siRNA의 3가 GalNAc 리간드 변형된 센스 쇄(TGFβ1)의 합성 경로. GalNAc는 25-뉴클레오티드의 센스 쇄로 이루어진 siRNA의 센스 쇄의 5' 말단에 접합되었고, 여기서 센스 쇄의 3' 말단은 다른 관능기에 의해 추가로 변형될 수 있다. 도 14는 외관상 각각 서열번호 7 및 7을 개시한다.
도 15. siRNA의 3가 GalNAc 리간드 변형된 센스 쇄(COX-2)의 합성 경로. GalNAc는 25-뉴클레오티드 센스 쇄로 이루어진 siRNA의 센스 쇄의 5' 말단에 접합되었고, 여기서 센스 쇄의 3' 말단은 다른 관능기에 의해 추가로 변형될 수 있다. 도 15는 외관상 각각 서열번호 21 및 21을 개시한다.
도 16. 3가 GalNAc 리간드 변형된 siRNA의 제조. 도 16에 제시된 바와 같이, 센스 쇄 또는 안티센스 쇄의 3'(또는 5') 말단에 티올 함유 링커로 화학 변형된 siRNA 이중쇄. 이어서, 이 작제물은, pH 7.4 내지 9.0 완충액에서 티올-탄소 결합을 형성할 때에, 티올/말레이미드 화학을 통해 1.2:1의 몰 비에서 사전 제조된 3가 GalNAc 리간드와 접합되었다. 수득된 GalNAc 접합된 siRNA는 시험관내 연구용의 완충제로서 직접 사용될 수 있거나, 막으로 투석하여 염을 제거하고, 고체 형태로 동결시킬 수 있다.
본 발명은 치료 분자를 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포, 및 가장 바람직하게는 인체 내의 인간 세포에 전달하기 위한 화학적 작제물(chemical construct)에 관한 것이다. 작제물은 하기 화학식 I로 나타내어진다:
[화학식 I]
A-B-[-C-D]n
상기 화학식 I에서, A는 제1 링커(링커 1)이고, B는 브릿지이고, C는 제2 링커(링커 2)이고, D는 표적화 리간드이고, n은 1 내지 4의 정수이다. 링커 1 및 링커 2는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 가지 실시양태에서, n=1이다. 또 다른 실시양태에서, n=3이다.
링커는, 충분히 안정하고, 하나 이상의 표적화 모이어티(들) 사이의 잠재적 상호작용을 제한하는 수용성, 유연한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는, 본원에 개시된 작제물에서의 사용에 적합하도록 선택된다. 또한, PEG는, 임상 연구로부터 치료 목적으로 안전하고 호환가능한 것으로 검증되어 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 에스테르 결합에서 생분해성의 성질을 갖는 표적 화합물의 적절한 전달을 위해, 선택된 범위의 분자량을 갖는 폴리(L-락타이드)일 수 있다. 링커 반응성 연결 모이어티는, 이들로 한정되지 않지만, 티올-말레이미드 결합, 알킨-아지드 결합의 트리아졸 및 아민-NHS 결합의 아미드를 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 링커 1은 하기 제1 구조식에 도시된 바와 같이 선형 폴리에틸렌 글리콜이고, 여기서 n1은 1 내지 50의 정수이거나, 링커 1은 하기 제2 구조식에 도시된 바와 같이 폴리(L-락타이드)이고, 여기서 n2는 1 내지 70의 정수이고, Z(하기 구조식 둘 다에서 도시됨)는 티올 또는 카복실산 등의 관능기이고, 이는 말레이미드 또는 아민과 반응하여 브릿지와 공유 접합한다:
Figure pct00001
폴리에틸렌 글리코, 티올 종결됨(thiol terminated)
Figure pct00002
폴리(L-락타이드), 티올 종결됨
또 다른 실시양태에서, 링커 1은, 제시된 바와 같이, 티올-말레이미드 결합을 포함하는 서브-화학 그룹(sub-chemical group) Z를 갖는다:
Figure pct00003
,
Figure pct00004
또는 하기 제시된 공액 화학의 임의의 기타 쌍, 이는 브릿지와의 링커 2 접합에 또한 사용될 수 있다:
Figure pct00005
이러한 실시양태의 한 가지 측면에서, Z는 링커 1 및 브릿지를 화학적으로 부착하는 도킹 부위(docking site)이다.
한 가지 실시양태에서, 링커 2는 트리-, 테트라- 또는 펜타-에틸렌 글리콜이다. 이러한 실시양태의 한 가지 측면에서, 링커 2 및 1 내지 3개의 표적화 리간드를 포함하는 화학적 구조가 브릿지에 부착되고, 여기서 화학 구조는 하기 구조 중의 하나를 포함한다:
Figure pct00006
상기 식에서, n은 1, 2 또는 3이고, OCH2 유닛(unit)을 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 연결된다; 또는
Figure pct00007
상기 식에서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 유닛을 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿제 연결된다; 또는
Figure pct00008
상기 식에서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 유닛을 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 연결된다.
한 가지 실시양태에서, 브릿지는 링커 1과 링커 2를 연결하는 화학 구조이고, 상기 화학 구조는 선형 구조
Figure pct00009
, 단일-분지 구조
Figure pct00010
, 또는 이중-분지 삼각대 구조
Figure pct00011
이고, 여기서, 상기 브릿지는 링커 2의 트리아졸 환에 직접 연결된다.
또 다른 실시양태에서, 브릿지는
링커 2와 표적화 리간드를 포함하는 하나의 화학 작제물만이 파라-위치에서 접합되도록 하는, 화학식
Figure pct00012
또는
Figure pct00013
을 갖는 선형 구조, 또는
링커 2와 표적화 리간드를 포함하는 2개의 화학 작제물이 2개의 메타-위치에서 접합되도록 하는, 화학식
Figure pct00014
또는
Figure pct00015
을 갖는 분지형 구조, 또는
링커 2와 표적화 리간드를 포함하는 3개의 화학 작제물이 2개의 메타- 및 1개의 파라-위치에서 접합되도록 하는, 화학식
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
을 갖는 삼각데 구조이다.
화학 작제물의 한 가지 실시양태에서, 링커 1은 내부 아미드 결합에 의해 접합된 선형 지방족 쇄이고, 링커 2 및 브릿지는, 하기 구조식에 도시된 바와 같이, 포스페이트 결합으로 치환되어 있다:
Figure pct00018
상기 식에서, m은 0 내지 10이고, n은 1 내지 3이다.
작제물의 한 가지 실시양태에서, 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), 갈락토스, 갈락토사민, N-포르말-갈락토소아민, N-프로피오닐-갈락토사민 또는 N-부타노일갈락토사민이다. 이 실시양태의 한 가지 측면에서, 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)이다.
작제물 I은 링커 1을 통해 치료 분자에 직접 결합할 수 있거나, 화학식 II를 갖는 신규한 작제물을 형성할 수 있다:
[화학식 II]
TM-A-B-[-C-D]n
상기 화학식 II에서, TM은 치료 분자이고, A는 제1 링커(링커 1)이고, B는 브릿지이고, C는 제2 링커(링커 2)이고, D는 표적화 리간드이고, n은 1 내지 4의 정수이다. 본원에 사용된 바와 같이, 치료 분자는 인체에서 치료 효과를 갖는 분자이다. 이러한 치료 분자는 발현-억제 올리고뉴클레오티드, 치료 펩티드, 치료 효능을 갖는 항체, 및 치료 효능을 갖는 소분자를 포함한다.
이러한 제2 작제물(II)의 한 가지 실시양태에서, 발현 억제 올리고뉴클레오티드는 RNAi, 안티센스 RNA 또는 cDNA이다. 이러한 실시양태의 한 가지 측면에서, RNAi는 siRNA 또는 miRNA이다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, RNAi는 siRNA이다.
또 다른 실시양태에서, 제2 작제물은 화학식 III으로 나타내어진다:
[화학식 III]
0-A-B-[-C-D]n
상기 화학식 III에서, O는 올리고뉴클레오티드이고, A는 제1 링커(링커 1)이고, B는 브릿지이고, C는 제2 링커(링커 2)이고, D는 표적화 리간드이고, n은 1 내지 4의 정수이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 RNAi, 안티센스 RNA 또는 cDNA를 포함한다. A, B, C 및 D는 상기 기재한 바와 같다. 이러한 실시양태의 한 가지 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 이본쇄이다. 또 다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 일본쇄이다. 이러한 실시양태의 한 가지 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 화학적으로 변형된다.
이러한 실시양태의 한 가지 측면에서, RNAi는 siRNA 또는 miRNA이다. 이러한 실시양태의 추가의 측면에서, RNAi는 siRNA이다. 또 다른 측면에서, RNAi는 이본쇄이고, RNAi의 센스 쇄의 3' 말단 단부(terminal end)에서 포스페이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포네이트 그룹을 통해 링커 1에 공유 결합된다.
또 다른 측면에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA이다. 바람직하게는, siRNA는 길이가 10-27 뉴클레오티드이다. 가장 바람직하게는, 길이가 19-25 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 표적화 리간드는 GalNAc이다.
또 다른 측면에서, 제1 작제물(I)은 하기 나타낸 바와 같이 링커 1을 통해 3' 위치 또는 5' 위치에서 siRNA 분자에 공유적으로 연결되어 있고, x = 0 또는 S, y = 0 또는 S이다:
Figure pct00019
본원에 사용된 바와 같이, siRNA 분자는, 분자가 세포 내로 도입된 후, 세포 내의 유전자의 발현을 방해하는, 짧은 이본쇄 폴리뉴클레오티드인 이중쇄 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들면, 이는 일본쇄 표적 RNA 분자에서 상보성 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 결합한다. siRNA 분자는 당업자에게 공지되어 있는 기술에 의해 화학적으로 합성되거나, 달리는 작제된다. 이러한 기술은 미국 특허 제5,898,031호, 제6,107,094호, 제6,506,559호, 제7,056,704호 및 유럽 특허 제1214945호 및 제1230375호에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다. 현장에서 관례에 의해, siRNA 분자가 단일, 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 동정(identifying)되는 경우, 상기 서열은 이중쇄 분자의 센스 쇄를 지칭한다. 분자를 구성하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 개별 뉴클레오티드의 수준에서 변형되는 것에 추가하여, 올리고뉴클레오티드의 백본(backbone)을 변형시킬 수 있다. 추가 변형은 siRNA 분자에 대한 접합을 위해 소분자(예를 들면, 당 분자), 아미노산, 펩티드, 콜레스테롤 및 기타 거대 분자를 사용하는 것을 포함한다.
특정 측면에서, siRNA는 항-TGFβ1 siRNA이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항-TGFβ1 siRNA는, TGFβ1 단백질의 합성을 코딩하는 인간 또는 기타 포유동물 세포에서 유전자의 발현을 감소 또는 방지하는 siRNA 분자이다.
또 다른 특정 측면에서, siRNA는 항-Cox2 siRNA이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항-Cox2 siRNA는, Cox2 단백질의 합성을 코딩하는 인간 또는 기타 포유동물 세포에서 유전자의 발현을 감소 또는 방지하는 siRNA 분자이다.
또 다른 특정 측면에서, siRNA의 올리고뉴클레오티드는 안정성을 개선시키기 위해 2' 위치에서 완전히 또는 부분적으로 화학적으로 변형된다.
TGF-베타 1 및 Cox2를 표적화하는 강력한 siRNA
hmTFβ1a: 센스:
안티-센스: 		5' r(GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA)-3' (서열번호 1)
5'-r(UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC)-3' (서열번호 2)
hmTFβ1b: 센스: 안티-센스: 5'-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3' (서열번호 3)
5'r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3' (서열번호 4)
hmTFβ1c: 센스: 안티-센스: 5'r(GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU)-3' (서열번호 5)
5'-r(AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC)-3' (서열번호 6)
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5' ACUGUAGAGUUAAGCUGGGUGCGGC 3' (서열번호 8)
hmTFb1e: 센스: 안티-센스: 5' (GmCmCmGmCmAmCmCmCmAmGmCmUFUFAFAFCmUmCmUmAmCmAmGmUm) 3' (서열번호 9)
5' AFCUFGUFAGFAGFUUFAAFGCFUGFGGFUGFCGFGCF 3' (서열번호 10)
hmTFb1f: 센스: 안티-센스: 5' (GmCmCmGmCmAmCmCmCmAmGmCmUFUFAFAFCmUmCmUmAmCmAmGmUm) 3' (서열번호 9)
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5' r(AUGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUC)-3' (서열번호 12)
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COX2: 센스: 안티-센스: 5' (GmUmGmCmUmGmUmUmCmCmUmGmGmAmGmGmUmCmGmUmUmGmAmGmUm) 3' (서열번호 21)
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5' ACUCAACGACCUCCAGGAACAGCAC 3'(서열번호 22)
COX2b 센스: 안티-센스: 5' (GmUmGmCmUmGmUmUmCmCmUmGmGFAFGFGFUmCmGmUmUmGmAmGmUm) 3' (서열번호 23)
5' AFCUFCAFACFGAFCCFUCFCAFGGFAAFCAFGCFACF 3' (서열번호 24)
주: Xm , 뉴클레오티드 2' OMe 변형. XF, 뉴클레오티드 2' F 변형.
특정 항-TGFβi 및 항-Cox-2 siRNA 분자는, 2017년 5월 9일자 미국 특허 제9,642,873 B2호, 및 2018년 5월 29일자 미국 재발행 특허 제RE46,873 E호에 기재되어 있고, 이들의 개시는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.
제2 작제물(II)의 한 가지 실시양태에서, 치료 분자는 치료 펩티드이다. 이러한 치료 펩티드는 사이클릭(c)RGD, APRPG(서열번호 25), NGR, F3 펩티드, CGKRK(서열번호 26), LyP-1, iRGD(CRGDRCPDC)(서열번호 27), iNGR, T7 펩티드(HAIYPRH)(서열번호 28), MMP2-절단가능한 옥타펩티드(GPLGIAGQ)(서열번호 29), CP15(VHLGYAT)(서열번호 30), FSH(FSH-β, 33-53 아미노산, YTRDLVKDPARPKIQKTCTF)(서열번호 31), LHRH(QHTSYkcLRP), 가스트린-방출 펩티드(GRP)(CGGNHWAVGHLM)(서열번호 32), RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)(서열번호 33), FMDV20 펩티드 서열(NAVPNLRGDLQVLAQKVART)(서열번호 34) 또는 GLP를 포함한다.
제2 작제물(II)의 또 다른 실시양태에서, 치료 분자는 치료 용도를 위한 항체이다. 이러한 치료 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, 또는 항체 단편 F(ab')2, Fab, Fab' 또는 Fv를 포함한다.
제2 작제물(II)의 또 다른 실시양태에서, 치료 분자는 치료 용도를 위한 소분자이다. 이러한 치료용 소분자는 겜시타빈, 엽산, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 독소루비신 또는 파클리탁셀을 포함한다.
본 발명의 작제물은, 본원에 개시된 구조 및 교시를 고려하면, 당업자에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 제2 작제물 내의 치료 분자가 siRNA 분자인 경우, 작제물은 하기 단계들에 의해 합성될 수 있다:
1) 포스페이스 결합의 형성을 통해, siRNA 분자의 센스 쇄를 상기 siRNA 분자의 5' 또는 3' 부위에서 관능화된 링커-1에 접합시키는 단계;
2) 표적화 리간드-링커 2 분자의 1개 내지 3개를 삼각대, 쌍각대 또는 선형 브릿지 부위에 연결하는 단계로서, 상기 브릿지의 다른 말단에는, 링커 1을 브릿지에 접합시키기 위해 사용되는, 말레이미드 그룹으로 종결된 사전 설치된 짧은 PEG 그룹이 있는, 단계;
3) 티올/말레이미드 반응을 통해 siRNA-링커-1 작제물을 링커-2-표적화 리간드 작제물과 접합시켜, 1 내지 3개 표적화 리간드 분자를 갖는 siRNA 분자의 센스 쇄의 작제물을 제공하는 단계; 및
4) 센스 쇄-표적화 리간드 작제물을 siRNA 분자의 안티센스 쇄와 혼합하여, 1 내지 3개 표적화 리간드와의 이중쇄 siRNA를 형성하는 단계.
제2 작제물 내의 치료 분자가 항체 또는 펩티드인 경우, 작제물은 다음 단계에 의해 합성될 수 있다:
1) 트리아졸 환, 티올-탄소 결합 또는 아미드 결합의 형성을 통해, 항체(또는 펩티드) 분자의 알킨, 티올, NHS 관능화 부위에서 관능화 링커-1(예컨대, 아지도, 말레이미드, 아민)에 항체(또는 펩티드) 분자를 접합시키는 단계;
2) 표적화 리간드-링커 2 작제물의 1개(2 또는 3개)를 중앙 선형 링커(쌍각대 또는 삼각대 브릿지) 부위에 연결시키는 단계로서, 브릿지의 다른 말단에서는, 링커 1을 브릿지에 접합시키기 위해 사용되는, 말단에 말레이미드 관능기를 갖는 짧은 PEG 그룹과 접합되는, 단계; 및
3) 티올/말레이미드 반응을 통해 항체(또는 펩티드)-링커-1 작제물을 링커-2-표적화 리간드 작제물과 접합시켜, 표적화 리간드를 갖는 항체(또는 펩티드)의 작제물을 제공하는 단계.
제2 작제물 내의 치료 분자가 siRNA 분자이고 표적화 리간드가 GalNAc인 경우, 작제물은 하기 단계들에 의해 합성될 수 있다:
1) 1 내지 3개 GalNAc-링커 2 분자를 삼각대, 쌍각대 또는 선형 브릿지 부위에 연결합으로써 GalNAc-링커-2-브릿지를 작제하는 단계로서, 브릿지의 다른 말단에는, 링커 1을 브릿지에 접합시키기 위해 사용되는, 말레이미드 그룹으로 종결된 사전 설치된 짧은 PEG 그룹이 있는, 단계;
2) 티올 그룹 모이어티를 함유하는 PEG 또는 폴리(L-락타이드) 등의 링커 1을 브릿지-링커 2-GalNAc 모이어티 상의 말단 말레이미드와 반응시켜 S-C 공유 결합을 형성하는 단계;
3) 포스폰아미다이트 그룹 또는 하이드록실 그룹 사이의 포스페이트 결합을 통해, 리간드-링커 2-링커 1 작제물을 siRNA 분자의 센스 쇄의 5' 또는 3' 말단에 접합시키는 단계; 및
4) 센스 쇄-GalNAc 작제물을 siRNA 분자의 안티센스 쇄와 혼합하여, 1 내지 3개 GalNAc 리간드와 siRNA 이중쇄를 형성하는 단계.
본 발명의 작제물(I)은 세포 투과성 펩티드 및/또는 엔도좀 방출제 등의 전달제를 통해 치료 분자에 간접적으로 결합될 수 있다. 작제물(I)은 먼저 짧은 관능성 펩티드(3-20개 아미노산, 예컨대, 세포 엔도좀 방출 펩티드 HHHK(서열번호 35), HHHHK(서열번호 36), (HHHK)n, n = 1-5 등)(서열번호 37)와 커플링된다. 이어서, 치료 분자(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, DNA, 압타머, 펩티드, 소분자 약물 등)를 기능성 펩티드와 접합시킨다.
본 발명은 또한 약제학적 조성물을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 상기 기재된 제1 작제물(I)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 상기 기재된 제2 작제물(II) 또는 제3 작제물(III)을 포함한다. 양 실시양태의 한 가지 측면에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 및 인산칼륨 일염기성 무수 NF, 염화나트륨 USP, 인산나트륨 이염기성 7수화물 USP 및 인산염 완충 식염수(PBS) 중 하나 이상의 염 또는 완충제를 포함한다.
본 발명의 작제물 및 약제학적 조성물은, 시험관내 또는 생체내이든, 인간 세포에 치료 분자를 전달하는데 유용하다. 상기 개시된 바와 같이, 이러한 치료 분자는 발현-억제 올리고뉴클레오티드, 치료 펩티드, 치료학적으로 유효한 항체, 및 치료학적으로 유효한 소분자를 포함한다.
생체내에서 사용되는 경우, 작제물 및 약제학적 조성물은 인간 질환을 치료하는데 사용된다. 한 가지 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량은 치료를 필요로 하는 질환을 갖는 인간에게 전달된다.
이러한 질환의 하나의 카테고리는 인간 암이다. 이러한 암은 간암, 담관암(CCA), 결장암, 췌장암, 폐암, 방광암, 난소암, 두경부암, 식도암, 뇌암, 및 흑색종 및 비-흑색종 피부 암을 포함하는 피부암을 포함한다. 이러한 실시양태의 한 가지 측면에서, 상기 암은 간암, 결장암 또는 췌장암이다.
특정 측면에서, 상기 암은 간암이다. 간암은 원발성 간암, 또는 인간 신체의 또 다른 조직으로부터 간으로 전이되는 암일 수 있다. 원발성 간암은 간세포암(hepatocellular carcinoma) 또는 간모세포종(hepatoblastoma)을 포함한다. 전이된 암은 결장암 및 췌장암을 포함한다.
다른 인간 질환은 본 발명의 작제물 및 약제학적 조성물로 치료가능하다. 이러한 질환은 간염, 섬유증 및 원발성 경화성 담관염(PSC)을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
본 발명의 작제물 및 약제학적 조성물은 또한 유전자 치료에 유용하다. 본 발명의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 인간 또는 다른 포유동물에게 투여된다. 다른 포유동물은, 설치류, 기니아 피그, 및 페렛, 애완동물 및 비인간 영장류 등의 실험실 동물을 포함한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 양태를 예시하고, 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
6. 실시예:
실시예 1. 말레이미드로 종결된 3가 GalNAc-PEG6-Mal의 1 H NMR 스펙트럼(D 2 O, 400MHz). GalNAc는 "클릭" 반응에 의해 트리아졸 환에 의한 트리에틸렌 글리콜을 통해 삼각대 중심에 연결되었다. 말레이미드와 연결하기 위해, 다른 말단에 헥사-PEG를 사용했다.
Figure pct00020
실시예 2. 말레이미드로 종결된 3가 GalNAc-PEG6-Mal의 질량 스펙트럼(ESI-MS, 양성). 분자 이온은, 관측치 [M + H]+ = 1928.1 및 계산치 1928이었다.
Figure pct00021
실시예 3. 말레이미드로 종결된 3가 GalNAc-PEG6-Mal의 HPLC 스펙트럼(C18 컬럼, 0.1% TFA 물/0.1% TFA 아세토니트릴 구배)
Figure pct00022
실시예 4. TGFβ1 및 COX-2의 서열 및 구조. 센스 쇄 및 안티센스 쇄의 서열은 하기에 제시되어 있다. 완전히 메틸화되어 있는 센스 쇄 내의 모든 뉴클레오티드에 변형이 이루어져있다. 센스 쇄의 5' 말단은 링커를 통해 GalNAc 리간드에 의해 접합되고, 센스 쇄의 3' 말단은 콜레스테롤에 의해 화학적으로 변형되어 막 투과의 능력을 개선시켰다.
Figure pct00023
실시예 5. HepG2 세포주에서 GalNAc-siRNA의 시험관내 시험
도 3 m = 0에서 GalNAc-TGFβ1은 인간 간세포암 HepG2 세포 생존율에 대한 본 연구에 사용되었다. 대조군 블랭크, 비-사일런싱 siRNA(NC, 100nM), HKP(100nM), 리포좀(각각 25nM, 50nM 및 100nM), 및 리포좀-GalNAc-TGFβ1(각각 25nM, 50nM, 100nM)과 함께 GalNAc-TGFβ1(25nM, 50nM, 100nM)로 제형화한 세포 사멸 siRNA에 의한 치료 효과. GalNAc-TGFβ1(각각 25nM, 50nM, 100nM), 대조군 블랭크, 비-사일런싱 siRNA(NC, 100nM), HKP(100nM), 리포좀(각각 25nM, 50nM, 100nM), 리포좀-GalNAc-TGFβ1(각각 25nM, 50nM, 100nM)의 혼합물을 100㎕의 OPTI-MEM 배지에서 세포와 함께 인큐베이팅했다. 형질감염 배지는, 6시간 후에 10% FBS/DMEM 또는 EMEM으로 교환했다. 형질감염의 72시간 후, TGF-β1 mRNA의 상대적 발현을 정량화하기 위해, 생존 세포의 수를 실시간 정량적 역전사 QRT-PCR 검정과 함께 평가했다. 무처리 세포(블랭크)로부터 유래한 값을 100%로 설정했다. NC-비-사일런싱 siRNA. 도 8 참조.
실시예 6: 마우스 모델에서 GalNAc-TGFβ1의 생체내 시험
4주령의 암컷 마우스 20마리의 그룹을 4개 그룹으로 나누었다. 투여량은 마우스당 siRNA이고, GalNAc/siRNA-H로부터 GalNAc/siRNA-L로 1회 주사 용량은 200㎍, 100㎍ 및 50㎍이고, PC(HKP/siRNA = 4:1)은 40㎍이다. 각 그룹에 대응하는 약제를 꼬리 정맥에 주사하고, 1회 주사했다. 동물을 희생시키고, 투여의 24시간 후에 간 조직을 수집했다. RNA 추출을 위해 간 조직의 우엽을 균질화했다. 이어서, qRT-PCR을 수행했다. 제시된 데이터는 4마리의 평균이다. *-P<0.05 대 블랭크, 및 **-P<0.01 대 블랭크. 도 9 참조. 포지티브 대조군(PC)에서, HKP/siRNA는 전체 간으로 전달되었지만, GalNAc-H, -M, -L은 간 간세포에만 특이적이다. 따라서, 전체 mRNA 발현 수준은 PC의 경우보다 GalNAc의 경우에서 약간 높았지만, 블랭크(무처리)와 양호하게 비교된다. GalNAc-H, -M 및 -L의 용량 의존적 효과를 관찰했다. 전체적으로, 이는 GalNAc가 siRNA를 성공적으로 전달했고, 사일런싱 효과를 나타냈음을 강력하게 시사한다.
실시예 7: 도 12의 삼각대 화합물(2)의 제조.[7]
t-BuOH(100mL) 중의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(1)(10.0g, 83.0mmol)의 현탁액에, MeOH:t-BuOH(160mL, V/V=1:1) 중의 디-3급-부틸 중탄산염(23.4g, 107.2mmol)의 혼합물을 격렬한 교반하에 서서히 첨가하고, 반응 혼합물을 15시간 동안 실온에서 교반시켰다. 15시간 후, 회전증발을 이용하여 용매를 증발시켜, 실온에서 에틸 아세테이트(300mL)로부터 재결정화되는 조 백색 고체를 수득했다. 진공 여과를 사용하여 백색 침상 결정을 수집하고, 이를 디에틸 에테르(100mL)에 의해 세척했다. 고체를 진공하에 6시간 동안 건조시켜 순수한 생성물(2)를 백색 고체로서 수득했다(17.0g, 93%). 1H NMR 데이터는 문헌치와 양호하게 일치했다. TLC(실리카 겔, 헥산:에틸 아세테이트 = 5:1), 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 5.77 (br s, 1H, NH), 4.50 (t, 3H, J =5.2 Hz, 3 × OH), 3.50 (d, 6H, J = 4.8 Hz, CH2OH), 1.37 [s, 9H, 3 × C(CH3)3] ppm.
실시예 8: 도 12의 삼각대 화합물(3)의 제조.[8]
건조 DMF 중의 화합물(4)(13.0g, 58.7mmol)의 용액에, 프로파르길 브로마이드(톨루엔 중의 80중량%)(32.0mL, 364.3mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반시켰다. 이어서, 미분말 KOH(20.0g, 364.3mmol)을 작은 분획으로 첨가했다. 이어서, 전체 반응 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반시키고, TLC(n 헥산:EtOAc = 5:1)은 보다 신속하게 이동하는 스팟(spot)의 생성을 나타냈다. 수득된 갈색 혼합물에, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 추가로 10분 동안 교반시켰다. 추가로, 전체 반응 혼합물을 H2O(2×30mL) 및 염수(25ml)로 연속하여 세척했다. 유기 에틸 아세테이트 층을 수집하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과했다. 이어서, 용매를 진공하에 증발시켰다. 이렇게 수득된 조 물질을 용출제로서 n-헥산:EtOAc를 사용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 순수한 화합물(5)(13.2g, 67%)를 황색 오일로서 수득했다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ : 4.9 (br s, 1H, NH), 4.14 (d, 6H, 3 × CH2CCH), 3.78 (s, 6H, CH2OH), 2.42 (t, 3H, 2.0 Hz, CCH), 1.42 (s, 1H, 3 × C(CH3)3).
실시예 9. 3가 GalNAc-PEG6-Mal 리간드의 제조
말레이미드로 종결된 3가 GalNAc-PEG6-Mal은 5개 단계로 합성하고; "클릭" 반응을 통해 화합물(9)를 화합물(3)과 커플링시켜 화합물(10)을 수득했다. Boc를 탈보호하여 화합물(11)을 수득한 후, 이어서 화합물(11)을 N-하이드록시석신이미드 그룹과 반응시켜 표적 화합물 3가 GalNAc-PEG6-Mal 리간드를 수득했다. 상세한 단계는 도 12를 참조하고, 특성화에 대해서는 실시예 1 내지 3을 참조한다.
실시예 10: 올리고뉴클레오티드-GalNAc 접합체의 제조
올리고뉴클레오티드는 설계된 서열 및 기능성 모이어티를 갖는 RNA ABI 합성기에 의해 제조했다. 도 15의 예를 참조한다. 센스 쇄는 합성후 변형을 통해 티올 링커에 의해 변형시켰다. 이어서, 티올 변형된 센스 쇄를 포스페이트 완충제(pH = 7.5-9) 중의 3가 베타-(GalNAc)3-PEG6-MAI와 커플링시키고, 겔-팩 컬럼(gel-pak column) 또는 아세토니트릴 및 나트륨 아세테이트 완충제에서 용출시킨 역 C18 카트리지에 의해 정제한 후, 순수한 리간드 접합된 올리고뉴클레오티드를 수득했다. siRNA 이중쇄는 2개의 단일 올리고뉴클레오티드(리간드가 부착된 센스 쇄 및 안티센스 쇄 둘 다)를 포함했고, 이 경우, 3'-센스 쇄는 링커 및 GalNAc에 의해 티올 변형되고, 이어서 2개의 일본쇄의 혼합물(센스:안티센스 비율 = 1:1.05 = nmol:nmol)을 90℃에서 5분 동안 가열한 다음, 이를 실온까지 1℃/분으로 서서히 냉각시킴으로써 양쪽 쇄를 어닐링시켰다. 이어서, 수득된 혼합물은 사용 전에 -20℃에서 밤새 저장했다. 또는, 이중쇄는 리간드 변형을 수반하는 센스 쇄 및 안티센스 쇄를 사용하는 유사한 방법에 의해 먼저 어닐링(annealing)시켰다. 이어서, 어닐링된 이중쇄(duplex)를 사용하여, 포스페이트 완충제(pH = 7.5-9)에서 3가 베타-(GalNAc)3-PEG6-MAI와 커플링시켰다. 염을 제거하거나 그 상태로 사용한 후에, 순수한 리간드-접합된 siRNA를 수득했다. 도 12-15를 참조한다.
7. 참고문헌
Figure pct00024
Figure pct00025
발행된 특허 및 공개된 특허 출원을 포함하여, 본원에서 확인된 모든 간행물 및 URL 어드레스 또는 수탁번호에 의해 확인된 모든 데이터베이스 엔트리는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
본 발명은, 이의 특정 실시양태와 관련하여 설명되고, 예시의 목적으로 다수의 상세가 기재되었지만, 본 발명은 추가의 실시양태의 영향을 받기 쉽고, 본원에 기재된 특정 상세는, 본 발명의 기본 원리로부터 벗어남이 없이, 변경될 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다.

Claims (60)

  1. 하기 화학식을 포함하는 화학 작제물(chemical construct):
    A-B-[-C-D]n
    상기 화학식에서, A는 제1 링커(링커 1)를 포함하고, B는 브릿지(bridge)를 포함하고, C는 제2 링커(링커 2)를 포함하고, D는 표적화 리간드(targeting ligand)를 포함하고, n은 1 내지 4의 정수이고, 링커 1 및 링커 2는 동일하거나 상이할 수 있고, 링커 1은 하기 제1 구조식에 도시된 바와 같이 선형 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 여기서 n1은 1 내지 50의 정수이거나, 링커 1은 하기 제2 구조식에 도시된 바와 같이 폴리(L-락타이드)를 포함하고, 여기서 n2는 1 내지 70의 정수이고, Z(하기 구조식에서 도시됨)는 티올 또는 카복실산과 같은 관능기(functional group)이고, 이는 말레이미드 또는 아민과 반응하여 브릿지와 공유 결합으로 접합된다.
    Figure pct00026

    폴리에틸렌 글리코, 티올 종결됨(thiol terminated)
    Figure pct00027

    폴리(L-락타이드), 티올 종결됨.
  2. 제1항에 있어서, 링커 2가 트리-, 테트라- 또는 펜타-에틸렌 글리콜을 포함하는, 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 링커 2 및 1 내지 3개의 표적화 리간드를 포함하는 화학 구조가 브릿지에 부착되어 있고, 상기 화학 구조가 하기 구조 중의 하나를 포함하는, 작제물:
    Figure pct00028

    상기 식에서, n은 1, 2 또는 3이고, OCH2 유닛(unit)을 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 연결된다; 또는
    Figure pct00029

    상기 식에서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 유닛을 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿제 연결된다; 또는
    Figure pct00030

    상기 식에서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 유닛을 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 연결된다.
  4. 제1항에 있어서, 링커 1은 내부 아미드 결합에 의해 접합된 선형 지방족 쇄를 포함하고, 링커 2 및 브릿지는, 하기 구조식에 도시된 바와 같이, 포스페이트 결합으로 치환되어 있는, 작제물:
    Figure pct00031

    상기 식에서, m은 0 내지 10이고, n은 1 내지 3이다.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 브릿지가 링커 1과 링커 2를 연결하는 화학 구조를 포함하고, 상기 화학 구조가 선형 구조
    Figure pct00032
    , 단일-분지 구조
    Figure pct00033
    , 또는 이중-분지 삼각대(tripodal) 구조
    Figure pct00034
    이고, 여기서 상기 브릿지는 링커 2의 트리아졸 환에 직접 연결되고, 브릿지의 N 말단 측(side)은 말레이미드 관능기 또는 링커 1과 커플링되는 기타 임의의 관능기로 종결된 짧은 peg 그룹에 연결되는, 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 브릿지가
    링커 2와 표적화 리간드를 포함하는 하나의 화학 작제물만이 파라-O 위치에서 접합되도록 하는, 화학식
    Figure pct00035
    또는
    Figure pct00036
    을 갖는 선형 구조, 또는
    링커 2와 표적화 리간드를 포함하는 2개의 화학 작제물이 2개의 O 위치에서 접합되도록 하는, 화학식
    Figure pct00037
    또는
    Figure pct00038
    을 갖는 분지형 구조, 또는
    링커 2와 표적화 리간드를 포함하는 3개의 화학 작제물이 3개의 O 위치에서 접합되도록 하는, 화학식
    Figure pct00039
    또는
    Figure pct00040
    을 갖는 삼각대 구조이고, 여기서 브릿지의 CH2 측은 말레이미드 관능기 또는 링커 1과 커플링되는 임의의 기타 관능기로 종결된 짧은 peg 그룹에 연결되어 있는, 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 1이 하기 도시된 바와 같이 티올-말레이미드 결합을 포함하는 서브-화학 그룹(sub-chemical group) Z를 갖는, 작제물:
    Figure pct00041
    ,
    Figure pct00042
    , 또는 하기 나타낸 공액 화학(conjugation chemistry)의 기타 쌍:
    Figure pct00043
  8. 제7항에 있어서, Z는 링커 1 및 브릿지를 화학적으로 부착시키는 도킹 부위(docking site)를 포함하는, 작제물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), 갈락토스, 갈락토사민, N-포르말-갈락토소아민, N-프로피오닐-갈락토사민 및 N-부타노일갈락토스아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 작제물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)인, 작제물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인, 작제물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, n이 3인, 작제물.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, n이 4인, 작제물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 1이, 발현 억제 올리고뉴클레오티드, 치료 펩타이드, 치료 효능을 갖는 항체, 및 치료 효능을 갖는 소분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료 분자에 부착되어 있는, 작제물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 발현 억제 올리고뉴클레오티드가 RNAi, 항-센스 RNA, 또는 cDNA를 포함하는, 작제물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 RNAi가 siRNA 또는 miRNA를 포함하는, 작제물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 RNAi가 siRNA를 포함하는, 작제물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이, 하기 도시된 바와 같은 링커 1를 통해 3' 위치 또는 5' 위치에서 siRNA 분자에 공유 결합되어 있고, x=O 또는 S, y=O 또는 S인, 작제물:
    Figure pct00044
    .
  19. 제14항에 있어서, 상기 치료 펩티드가 사이클릭(c)RGD, APRPG(서열번호 25), NGR, F3 펩티드, CGKRK(서열번호 26), LyP-1, iRGD(CRGDRCPDC)(서열번호 27), iNGR, T7 펩티드(HAIYPRH)(서열번호 28), MMP2-절단가능한 옥타펩티드(GPLGIAGQ)(서열번호 29), CP15(VHLGYAT)(서열번호 30), FSH(FSH-β, 33-53 아미노산, YTRDLVKDPARPKIQKTCTF)(서열번호 31), LHRH(QHTSYkcLRP), 가스트린-방출 펩티드(GRP)(CGGNHWAVGHLM)(서열번호 32), RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)(서열번호 33), FMDV20 펩티드 서열(NAVPNLRGDLQVLAQKVART)(서열번호 34) 또는 GLP를 포함하는, 작제물.
  20. 제14항에 있어서, 치료 용도를 위한 항체가 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, 또는 항체 단편 F(ab')2, Fab, Fab' 또는 Fv를 포함하는, 작제물.
  21. 제14항에 있어서, 치료 효능을 갖는 소분자가 겜시타빈, 엽산, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 독소루비신 또는 파클리탁셀을 포함하는, 작제물.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 물, 및 염 또는 완충제:인산칼륨 일염기성 무수 NF, 염화나트륨 USP, 인산나트륨 이염기성 7수화물 USP, 및 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작제물을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 인간 세포에 치료 분자를 전달하는 방법.
  25. 제22항 또는 제23항의 조성물을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 인간 세포에 치료 분자를 전달하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 치료 분자가 생체내에서 세포로 전달되는, 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 분자가 발현 억제 올리고뉴클레오티드, 치료 펩티드, 치료 효능을 갖는 항체, 및 치료 효능을 갖는 소분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 세포가 인간의 암에서 악성 세포인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 암이 간암, 담관암(CCA), 결장암, 췌장암, 폐암, 방광암, 난소암, 두경부암, 식도암, 뇌암, 및 흑색종 및 비흑색종 피부암을 포함하는 피부암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 암이 간암, 결장암 및 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 암이 간암인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 간암이 원발성 간암을 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 원발성 간암이 간세포암 또는 간모세포종을 포함하는, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 암이 인체의 다른 조직으로부터 상기 간으로 전이되어 있는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 전이된 암이 결장암을 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 전이된 암이 췌장암을 포함하는, 방법.
  37. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 치료 분자가 siRNA 분자를 포함하고, 상기 세포가 간세포를 포함하는, 방법.
  38. 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 분자가 간염, 섬유증 및 원발성 경화성 담관염(PSC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환을 치료하기 위해 인간에게 전달되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 치료 분자가 siRNA를 포함하는, 방법.
  40. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작제물의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 유전자 치료 방법.
  41. 제22항 또는 제23항의 조성물의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 유전자 치료 방법.
  42. 치료 분자가 siRNA 분자인 제14항의 작제물을 합성하는 방법으로서,
    포스페이스 결합의 형성을 통해, siRNA 분자의 센스 쇄를 상기 siRNA 분자의 5' 또는 3' 부위에서 관능화된 링커-1에 접합시키는 단계;
    표적화 리간드-링커 2 작제물의 1개(2 또는 3개)의 수를 중앙 선형 링커(쌍각대 또는 삼각대 브릿지) 부위에 연결하는 단계로서, 상기 브릿지(bridge)의 다른 말단은, 링커 1을 브릿지에 접합시키기 위해 사용되는, 말단에 말레이미드 관능기를 갖는 짧은 PEG 그룹과 접합되는, 단계;
    티올/말레이미드 반응을 통해 siRNA-링커-1 작제물을 링커-2-표적화 리간드 작제물과 접합시켜, 1 내지 3개의 표적화 리간드 분자를 갖는 siRNA 분자의 센스 쇄의 작제물을 제공하는 단계; 및
    센스 쇄-표적화 리간드 작제물을 siRNA 분자의 안티센스 쇄와 혼합하여, 1 내지 3개의 표적화 리간드와의 이중쇄(duplex) siRNA를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 치료 분자가 항체 또는 펩티드인, 제14항의 작제물을 합성하는 방법으로서,
    트리아졸 환, 티올-탄소 결합 또는 아미드 결합의 형성을 통해, 항체(또는 펩티드) 분자의 알킨, 티올, NHS 관능화 부위에서 관능화 링커-1(아지도, 말레이미드, 아민)에 항체(또는 펩티드) 분자를 접합시키는 단계;
    표적화 리간드-링커 2 작제물의 1개(2개 또는 3개)의 수를 중앙 선형 링커(쌍각대 또는 삼각대 브릿지) 부위에 연결시키는 단계로서, 브릿지의 다른 말단은, 링커 1을 브릿지에 접합시키기 위해 사용되는, 말단에서 말레이미드 관능기를 갖는 짧은 PEG 그룹과 접합되는, 단계;
    티올/말레이미드 반응을 통해 항체(또는 펩티드)-링커-1 작제물을 링커-2-표적화 리간드 작제물과 접합시켜, 표적화 리간드를 갖는 항체(또는 펩티드)의 작제물을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제18항의 작제물을 합성하는 방법으로서,
    표적화 리간드-링커 2 작제물의 1개(2개 또는 3개)의 수를 중앙 선형 링커(쌍각대 또는 삼각대 브릿지) 부위에 연결시키는 단계로서, 상기 브릿지의 다른 말단은, 링커 1을 브릿지에 접합시키기 위해 사용되는, 다른 말단에 말레이미드 관능기를 갖는 짧은 PEG 그룹과 접합되는, 단계;
    티올 그룹 모이어티를 함유하는 PEG 또는 폴리(L-락타이드)와 같은 링커 1을 브릿지-링커 2-GalNAc 모이어티 상의 말단 말레이미드와 반응시켜 S-C 공유 결합을 형성하는 단계;
    리간드-링커 2-링커 1 작제물을, 포스폰아미다이트 그룹과 하이드록실 그룹 사이의 포스페이트 결합을 통해 siRNA 분자의 센스 쇄의 5' 또는 3' 말단에 접합시키는 단계; 및
    센스 쇄-GalNAc 작제물을 siRNA 분자의 안티센스 쇄와 혼합하여, 1 내지 3개의 GalNAc 리간드와의 siRNA 이중쇄를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 하기 구조를 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 인간 간세포에 전달하기 위한 작제물:
    O-A-B-[-C-D]n
    상기 식에서, O는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, A는 제1 링커(링커 1)를 포함하고, B는 브릿지를 포함하고, C는 제2 링커(링커 2)를 포함하고, D는 표적화 리간드를 포함하고, n은 1 내지 4의 정수이다.
  46. 제45항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 이본쇄인, 작제물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 일본쇄인, 작제물.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 siRNA, 안티센스 RNA, miRNA 또는 cDNA를 포함하는, 작제물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 siRNA를 포함하는, 작제물.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 10 내지 27 뉴클레오티드인, 작제물.
  51. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 19 내지 25 뉴클레오티드인, 작제물.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA가, 안정성을 향상시키기 위해, 2' 위치 또는 포스포로티오에이트 결합 연결에서 완전히 또는 부분적으로 화학적으로 변형되는, 작제물.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 GalNAc를 포함하는, 작제물.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 물, 및 염 및 완충제: 인산칼륨 일염기성 무수 NF, 염화나트륨 USP, 인산나트륨 이염기성 7수화물 USP 및 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  56. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항의 작제물을 간세포에 전달하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 인간 간세포에 전달하는 방법.
  57. 제54항 또는 제55항의 조성물을 간세포에 전달하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 인간 간세포에 전달하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 분자가 생체내에서 간세포로 전달되는, 방법.
  59. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항의 작제물의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 유전자 치료 방법.
  60. 제54항 또는 제55항의 조성물의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 유전자 치료 방법.
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