JP2024009838A - アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物およびそれらの使用方法 - Google Patents

アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物およびそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物、ならびにこのようなｄｓＲＮＡ組成物を使用して、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する方法、および高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝の障害を有する対象を治療する方法を提供する。【解決手段】アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記アンチセンス鎖が、特定のアンチセンスヌクレオチド配列の１つと３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる相補性領域を含んでなる、二本鎖リボ核酸とする。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１４６，６０４号明細書、および２０１５年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６２／２６１，３６１号明細書の優先権の利益を主張する。前述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０１６年４月１２日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１－０３３２０＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２１３，２４６バイトのサイズである。
アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）は、脂質代謝を調節する分泌因子のアンギオポエチン様ファミリーのメンバーであり、主に肝臓において発現される（非特許文献１）。ＡＮＧＰＴＬ３は、トリグリセリドの加水分解を触媒するリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の触媒活性と、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）リン脂質を加水分解する内皮リパーゼ（ＥＬ）の触媒活性とを二重に阻害する。低脂血症であるが肥満のＫＫ／Ｓｎｋマウスにおいては、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少は、トリグリセリドのクリアランスを促進することによって、高脂血症およびアテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）に対する保護効果を有する（非特許文献２）。ヒトＡＮＧＰＴＬ３血漿濃度は、血漿ＨＤＬコレステロールおよびＨＤＬリン脂質レベルと正の相関がある（非特許文献３）。
脂質代謝の障害は、トリグリセリドおよび／またはコレステロールなどの血清脂質のレベルの上昇をもたらし得る。血清脂質の上昇は、高血圧、心血管疾患、糖尿病およびその他の病的状態と強く関連付けられている。高トリグリセリド血症は、高い血中トリグリセリドレベルによって特徴付けられる脂質代謝障害の一例である。それは、高いコレステロールレベル（高コレステロール血症）の不在下であってさえも、アテローム性動脈硬化と関連付けられている。トリグリセリド濃度が過剰である（すなわち、１０００ｍｇ／ｄｌまたは１２ｍｍｏｌ／ｌを超える）場合、高トリグリセリド血症は、膵臓炎もまた引き起こし得る。高脂血症は、任意の１つまたは全ての血中脂質および／またはリポタンパクのレベルの上昇によって特徴付けられる、脂質代謝障害の別の例である。食事療法、運動、およびスタチンおよびその他の薬物による治療をはじめとする、脂質代謝の障害に対する現在の治療は、常に有効とは限らない。
Ｋｏｉｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３０（２）：１５１－１５７ Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４４：１２１６－１２２３ Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２７：３６６－３７２）
したがって、当該技術分野では、脂質代謝の障害を有する対象のための代案の治療法に対する必要性がある。
本発明は、ＡＮＧＰＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらす、ｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＮＧＰＬ３遺伝子は、例えばヒトなどの対象内の細胞などの細胞内にあってもよい。本発明は、ＡＮＧＰＬ３遺伝子の発現を阻害するために、および／または例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症に罹患しているまたは罹患し易い対象などの、脂質代謝の障害に罹患しているまたは罹患し易い対象などの、ＡＮＧＰＬ３遺伝子の発現を阻止するまたは減少させることから恩恵を受ける対象を治療するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法もまた提供する。
したがって一態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、アンチセンス鎖は配列番号５のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、その中ではセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチド異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる。
別の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’－ＧＡＡＵＡＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号１４）
５’－ＵＴＧＡＧＵＵＣＡＡＧＴＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号１５）、
５’－ＧＡＡＵＡＴＧＵＧＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号１６）
５’－ＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号１７）、
５’－ＡＵＵＡＡＧＣＵＧＣＵＵＣＵＵＵＴＵＡＵＵ－３’（配列番号１８）
５’－ＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧ－３’（配列番号１９）、
５’－ＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵＵＵ－３’（配列番号２０）
５’－ＡＡＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧ－３’（配列番号２１）；
５’－ＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号２２）
５’－ＵＵＧＡＧＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡ－３’（配列番号２３）；
５’－ＡＡＣＵＡＡＣＵＡＡＣＵＵＡＡＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号２４）
５’－ＵＵＵＧＡＡＵＵＡＡＧＵＵＡＧＵＵＡＧＵＵＧＣ－３’（配列番号２５）；
５’－ＵＣＡＣＡＡＵＵＡＡＧＣＵＣＣＵＵＣＵＵＵ－３’（配列番号２６）
５’－ＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧＵＧＡＡＣ－３’（配列番号２７）；
５’－ＧＡＧＣＡＡＣＵＡＡＣＵＡＡＣＵＵＡＡＵＵ－３’（配列番号２８）
５’－ＡＡＵＵＡＡＧＵＵＡＧＵＵＡＧＵＵＧＣＵＣＵＵ－３’（配列番号２９）；
５’－ＵＵＡＵＵＧＵＵＣＣＵＣＵＡＧＵＵＡＵＵＵ－３’（配列番号３０）
５’－ＡＡＡＵＡＡＣＵＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＵＡＡＡＡ－３’（配列番号３１）；
５’－ＡＵＵＡＡＧＣＵＣＣＵＵＣＵＵＵＵＵＡＵＵ－３’（配列番号３２）
５’－ＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧ－３’（配列番号３３）；
５’－ＧＡＡＵＡＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号３４）
５’－ＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号３５）；
５’－ＣＡＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵ－３’（配列番号３６）
５’－ＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧＡＧ－３’（配列番号３７）；および
５’－ＣＵＣＣＡＵＡＧＵＧＡＡＧＣＡＡＵＣＵＡＡ－３’（配列番号３８）
５’－ＵＵＡＧＡＵＵＧＣＵＵＣＡＣＵＡＵＧＧＡＧＵＡ－３’（配列番号３９）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる相補性領域を含んでなる。
特定の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、
５’－ＧＡＡＵＡＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号１４）
５’－ＵＴＧＡＧＵＵＣＡＡＧＴＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号１５）、
５’－ＧＡＡＵＡＴＧＵＧＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号１６）
５’－ＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号１７）、
５’－ＡＵＵＡＡＧＣＵＧＣＵＵＣＵＵＵＴＵＡＵＵ－３’（配列番号１８）
５’－ＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧ－３’（配列番号１９）、
５’－ＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵＵＵ－３’（配列番号２０）
５’－ＡＡＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧ－３’（配列番号２１）；
５’－ＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号２２）
５’－ＵＵＧＡＧＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡ－３’（配列番号２３）；
５’－ＡＡＣＵＡＡＣＵＡＡＣＵＵＡＡＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号２４）
５’－ＵＵＵＧＡＡＵＵＡＡＧＵＵＡＧＵＵＡＧＵＵＧＣ－３’（配列番号２５）；
５’－ＵＣＡＣＡＡＵＵＡＡＧＣＵＣＣＵＵＣＵＵＵ－３’（配列番号２６）
５’－ＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧＵＧＡＡＣ－３’（配列番号２７）；
５’－ＧＡＧＣＡＡＣＵＡＡＣＵＡＡＣＵＵＡＡＵＵ－３’（配列番号２８）
５’－ＡＡＵＵＡＡＧＵＵＡＧＵＵＡＧＵＵＧＣＵＣＵＵ－３’（配列番号２９）；
５’－ＵＵＡＵＵＧＵＵＣＣＵＣＵＡＧＵＵＡＵＵＵ－３’（配列番号３０）
５’－ＡＡＡＵＡＡＣＵＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＵＡＡＡＡ－３’（配列番号３１）；
５’－ＡＵＵＡＡＧＣＵＣＣＵＵＣＵＵＵＵＵＡＵＵ－３’（配列番号３２）
５’－ＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧ－３（配列番号３３）’；
５’－ＧＡＡＵＡＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号３４）
５’－ＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号３５）；
５’－ＣＡＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵ－３’（配列番号３６）
５’－ＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧＡＧ－３’（配列番号３７）；および
５’－ＣＵＣＣＡＵＡＧＵＧＡＡＧＣＡＡＵＣＵＡＡ－３’（配列番号３８）
５’－ＵＵＡＧＡＵＵＧＣＵＵＣＡＣＵＡＵＧＧＡＧＵＡ－３’（配列番号３９）。
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖中に、４つ以下（すなわち、４、３、２、１、または０）の未修飾ヌクレオチドを含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖中に、４つ以下（すなわち、４、３、２、１、または０）の未修飾ヌクレオチドを含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方の中に、４つ以下（すなわち、４、３、２、１、または０）の未修飾ヌクレオチドを含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖中のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖中のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から独立して選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドからなる群から選択される。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長の相補性領域を含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１９および２３ヌクレオチド長の相補性領域を含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１９ヌクレオチド長の相補性領域を含んでなる。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡの各鎖は３０ヌクレオチド長以下である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは少なくとも１５ヌクレオチド長である。
その他の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の片方または双方の鎖は、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長など最大６６ヌクレオチド長であって、少なくとも１９連続ヌクレオチド領域を有し、それはＩＮＳＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、１８～３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる。特定の実施形態では、少なくとも１本の鎖は、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドなどの少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる。その他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含んでなる。特定の実施形態では、少なくとも１本の鎖は、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドなどの少なくとも２ヌクレオチドの５’オーバーハングを含んでなる。なおも別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の１本の鎖の３’および５’末端の双方は、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含んでなる。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含んでなる。特定の実施形態では、リガンドはＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。リガンドは、一価、二価、または三価の分岐リンカーを介してＲＮＡｉ剤に付着する、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃであってもよい。リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の３’末端、または二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、それぞれ独立して複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに付着する、例えば、２、３、４、５、または６個などの複数のＧａｌＮＡｃを含んでなる。
特定の実施形態では、リガンドは、
である。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、
の概略図に示されるようにリガンドにコンジュゲートされ、式中、ＸはＯまたはＳである。一実施形態では、ＸはＯである。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－５７９２７．６、ＡＤ－６３１３３．１、ＡＤ－６３１３６．１、ＡＤ－６３１３７．１、ＡＤ－６３１３９．１、ＡＤ－６３１４２．１、ＡＤ－６３１４３．１、ＡＤ－６３１４４．１、ＡＤ－６３１４５．１、ＡＤ－６３１４８．１、ＡＤ－６３１４９．１、ＡＤ－６３１５０．１、ＡＤ－６３１５１．１、ＡＤ－６３１５３．１、ＡＤ－６３１５４．１、ＡＤ－６３１５６．１、ＡＤ－６３１５７．１、ＡＤ－６３１６０．１、ＡＤ－６３１６２．１、ＡＤ－６３１６３．１、ＡＤ－６３１６７．１、ＡＤ－６３１６８．１、ＡＤ－６３１７０．１、ＡＤ－６３１７３．１、ＡＤ－６３１７４．１、ＡＤ－６３１７５．１、ＡＤ－６３１７６．１、ＡＤ－６３１７７．１、ＡＤ－６３１７９．１、ＡＤ－６３１８１．１、ＡＤ－６６９１６、ＡＤ－６６９２０、ＡＤ－６６９２１、ＡＤ－６６９２３、ＡＤ－６６９２２、ＡＤ－６６９１７、ＡＤ－６６９１８、ＡＤ－６６９１９、ＡＤ－６６９２４、ＡＤ６６９２５、およびＡＤ－６３１８５．１からなる群から選択される二本鎖を含んでなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－５７９２７．６、ＡＤ－６３１３６．１、ＡＤ－６３１３７．１、ＡＤ－６３１４２．１、Ｄ－６３１４８．１、ＡＤ－６３１５１．１、ＡＤ－６３１５６．１、ＡＤ－６３１５７．１、ＡＤ－６３１６０．１、ＡＤ－６３１６３．１、ＡＤ－６３１６７．１、ＡＤ－６３１７０．１、ＡＤ－６３１７３．１、ＡＤ－６３１７４．１、ＡＤ－６３１７６．１、ＡＤ－６６９１６、ＡＤ－６６９２０、ＡＤ－６６９２１、ＡＤ－６６９２３、ＡＤ－６６９２２、ＡＤ－６６９１７、ＡＤ－６６９１８、ＡＤ－６６９１９、ＡＤ－６６９２４、ＡＤ６６９２５、ＡＤ－６７１７３、ＡＤ－６７１７４、ＡＤ－６７００７、およびＡＤ－６３１７９．１からなる群から選択される二本鎖を含んでなる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、
５’－ａｓｃｓａｕａｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃａｇｕｃｕｕｕｕｕ－－３’（配列番号４０）
５’－ａｓＡｆｓａａａＧｆａｃｕｇａｕｃＡｆａＡｆｕａｕｇｕｓｕｓｇ－－３’（配列番号４１）；
５’－ｕｓｇｓｕｃａｃＵｆｕＧｆＡｆＡｆｃｕｃａａｃｕｃａａＬ９６－－３’（配列番号４２）
５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＧｆＡｆｇｕｕｃＡｆａＧｆｕｇａｃａｓｕｓａ－－３’（配列番号４３）；
５’－ｇｓａｓａｕａｕＧｆｕＣｆＡｆＣｆｕｕｇａａｃｕｃａａ－３’（配列番号４４）
５’－ｕｓｄＴｓｇａｇｕｕｃａａｇｄＴｇｄＡｃａｕａｕｕｃｓｕｓｕ－－３’（配列番号４５）；
５’－ｇｓａｓａｕａｄＴｇｕｄＧａｃｕｕｇａａ（Ｃｇｎ）ｕｃａａ－－３’（配列番号４６）
５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＣｆＡｆａｇｕｇＡｆｃＡｆｕａｕｕｃｓｕｓｕ－－３’（配列番号４７）；
５’－ａｓｕｓｕａａｄＧｃｕｄＧｃｕｕｃｕｕｕ（Ｔｇｎ）ｕａｕｕ－－３’（配列番号４８）
５’－ａｓＡｆｓｕａａＡｆａａｇａａｇｇＡｆｇＣｆｕｕａａｕｓｕｓｇ－－３’（配列番号４９）；
５’－ＡｆｓｃｓＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆ－３’（配列番号５０）
５’－ａｓＡｆｓａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓｕｓｇ－３’（配列番号５１）；
５’－ＵｆｓｇｓＵｆｃＡｆｃＵｆｕＧｆＡｆＡｆｃＵｆｃＡｆａＣｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号５２）
５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆｇＵｆｕＧｆａＧｆｕｕｃＡｆａＧｆｕＧｆａＣｆａｓｕｓａ－３’（配列番号５３）；
５’－ａｓａｓｃｕａａＣｆｕＡｆＡｆＣｆｕｕａａｕｕｃａａａ－３’（配列番号５４）、
５’－ｕｓＵｆｓｕｇａＡｆｕＵｆＡｆａｇｕｕＡｆｇＵｆｕａｇｕｕｓｇｓｃ－３’（配列番号５５）；
５’－ｕｓｃｓａｃａａＵｆｕＡｆＡｆＧｆｃｕｃｃｕｕｃｕｕｕ－３’（配列番号５６）
５’－ａｓＡｆｓａｇａＡｆｇＧｆＡｆｇｃｕｕＡｆａＵｆｕｇｕｇａｓａｓｃ－３’（配列番号５７）；
５’－ｇｓａｓｇｃａａＣｆｕＡｆＡｆＣｆｕａａｃｕｕａａｕｕ－３’（配列番号５８）
５’－ａｓＡｆｓｕｕａＡｆｇＵｆＵｆａｇｕｕａＧｆｕＵｆｇｃｕｃｓｕｓｕ－３’（配列番号５９）；
５’－ｕｓｕｓａｕｕｇＵｆｕＣｆＣｆＵｆｃｕａｇｕｕａｕｕｕ－３’（配列番号６０）
５’－ａｓＡｆｓａｕａＡｆｃＵｆＡｆｇａｇｇＡｆａＣｆａａｕａａｓａｓａ－３’（配列番号６１）；
５’－ａｓｕｓｕａａｇＣｆｕＣｆＣｆＵｆｕｃｕｕｕｕｕａｕｕ－３’（配列番号６２）
５’－ａｓＡｆｓｕａａＡｆａＡｆＧｆａａｇｇＡｆｇＣｆｕｕａａｕｓｕｓｇ－３’（配列番号６３）；
５’－ｇｓａｓａｕａｕＧｆｕＣｆＡｆＣｆｕｕｇａａｃｕｃａａ－３’（配列番号６４）
５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＣｆＡｆａｇｕｇＡｆｃＡｆｕａｕｕｃｓｕｓｕ－３’（配列番号６５）；
５’－ｃｓａｓａｃａｕＡｆｕＵｆＵｆＧｆａｕｃａｇｕｃｕｕｕ－３’（配列番号６６）
５’－ａｓＡｆｓａｇａＣｆｕＧｆＡｆｕｃａａＡｆｕＡｆｕｇｕｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号６７）；および
５’－ｃｓｕｓｃｃａｕＡｆｇＵｆＧｆＡｆａｇｃａａｕｃｕａａ－３’（配列番号６８）
５’－ｕｓＵｆｓａｇａＵｆｕＧｆＣｆｕｕｃａＣｆｕＡｆｕｇｇａｇｓｕｓａ－３’（配列番号６９）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡを含有する細胞を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。組成物は、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡ剤を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質製剤をさらに含んでなる。
本発明は、細胞内でＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する方法もまた提供する。方法は、細胞を本明細書に記載されるようなｄｓＲＮＡに接触させるステップと；ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり細胞を維持し、それによって細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。
特定の実施形態では、細胞は対象内にある。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、ヒト対象は、脂質代謝の障害に罹患している。特定の実施形態では、脂質代謝の障害は、高脂血症または高トリグリセリド血症である。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３発現は、少なくとも約３０％阻害される。
別の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から恩恵を受ける、障害を有する対象を治療する方法を提供する。方法は、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡのいずれかの治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療するステップを含む。特定の実施形態では、障害は脂質代謝の障害である。特定の実施形態では、脂質代謝の障害は、高脂血症または高トリグリセリド血症である。特定の実施形態では、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、１つまたは複数の血清脂質の減少および／またはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質蓄積の減少を引き起こす。
さらなる態様では、本発明は、対象においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する方法もまた提供する。方法は、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡのいずれかの治療有効量を対象に投与し、それによって対象においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するステップを含む。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法を実施するキットを提供する。一実施形態では、本発明は、細胞内でＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するのに有効な量の本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤に、細胞を接触させることで、細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害する方法を実施するキットを提供する。キットは、ＲＮＡｉ剤および使用説明書および、任意選択的に、ＲＮＡｉ剤を対象に投与する手段を含んでなる。
示されるｉＲＮＡ剤の単回３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ｏｂ／ｏｂメスマウスの血清中で３日目に残存するＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量を示すグラフである。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの量は、対照サンプル（ＰＢＳ）中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ量対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量の比と比較した、サンプル中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ量対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量の比として示される。 ｏｂ／ｏｂメスマウスにおける血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルに対する、ＡＤ－５７９２７の多回用量投与（１週目には５日間にわたり毎日３ｍｇ／ｋｇ、続いて２～４週目には毎週２回３ｍｇ／ｋｇ（３．０ｍｇ／ｋｇ ｑｄｘ５；ｑｗｘ６））の効果を示すグラフである。提示されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、ＡＤ－５７９２７の投与前の血清サンプル中に存在するＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 ｏｂ／ｏｂメスマウスにおけるトリグリセリド（ＴＧ）レベルに対する、ＡＤ－５７９２７の多回用量投与（１週目には５日間にわたり毎日３ｍｇ／ｋｇ、続いて２～４週目には毎週２回３ｍｇ／ｋｇ（３．０ｍｇ／ｋｇ ｑｄｘ５；ｑｗｘ６））の効果を示すグラフである。提示されるＴＧの量は、ＡＤ－５７９２７の投与前の血清サンプル中に存在するＴＧの量との比較である。 ｏｂ／ｏｂメスマウスにおけるＬＤＬコレステロール（ＬＤＬｃ）レベルに対する、ＡＤ－５７９２７の多回用量投与（１週目には５日間にわたり毎日３ｍｇ／ｋｇ、続いて２～４週目には毎週２回３ｍｇ／ｋｇ（３．０ｍｇ／ｋｇ ｑｄｘ５；ｑｗｘ６））の効果を示すグラフである。提示されるＬＤＬｃの量は、ＡＤ－５７９２７の投与前の血清サンプル中に存在するＬＤＬｃの量との比較である。 ｏｂ／ｏｂメスマウスにおける総コレステロール（Ｔｃ）レベルに対する、ＡＤ－５７９２７の多回用量投与（１週目には５日間にわたり毎日３ｍｇ／ｋｇ、続いて２～４週目には毎週２回３ｍｇ／ｋｇ（３．０ｍｇ／ｋｇ ｑｄｘ５；ｑｗｘ６））の効果を示すグラフである。提示されるＴｃの量は、ＡＤ－５７９２７の投与前の血清サンプル中に存在するＴｃの量との比較である。 ［図６Ａ］示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、野生型マウスの血清中に経時的に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与前の血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。［図６Ｂ］投与後１０日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、野生型マウスの血清中に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与前の血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 ［図７Ａ］示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、野生型マウスの血清中に経時的に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与前の血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。［図７Ｂ］投与後５日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、野生型マウスの血清中に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与前の血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ｏｂ／ｏｂマウスの血清中に経時的に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与前の血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 投与後５日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後のｏｂ／ｏｂマウスの血清中のマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のサイレンシングのパーセントを示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のサイレンシングのパーセントは、投与前の血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルとの比較である。 投与後５日目における、ＡＤ－６５６９５の単回０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇの皮下投与後のｏｂ／ｏｂマウスの血清中のマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のサイレンシングのパーセントを示すグラフである。マウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のサイレンシングのパーセントは、投与前の血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルとの比較である。 ［図１０Ａ］ｏｂ／ｏｂマウスのトリグリセリド（ＴＧ）レベルに対する、ＡＤ－６５６９５（ＡＬＮ－ＡＮＧ）の単回０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇの皮下投与の効果を示すグラフである。ＴＧの量は、ＰＢＳを投与されたマウスからの血清サンプル中のＴＧ量と比較した、ＡＤ－６５６９５を投与されたマウスからの血清サンプル中のＴＧ量の比として提示される。［図１０Ｂ］ｏｂ／ｏｂマウスの総コレステロール（ＴＣ）レベルに対する、ＡＤ－６５６９５（ＡＬＮ－ＡＮＧ）の単回０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇの皮下投与の効果を示すグラフである。ＴＣの量は、ＰＢＳを投与されたマウスからの血清サンプル中のＴＣ量と比較した、ＡＤ－６５６９５を投与されたマウスからの血清サンプル中のＴＣ量の比として提示される。［図１０Ｃ］ｏｂ／ｏｂマウスの低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）レベルに対する、ＡＤ－６５６９５（ＡＬＮ－ＡＮＧ）の単回０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇの皮下投与の効果を示すグラフである。ＬＤＬｃの量は、ＰＢＳを投与されたマウスからの血清サンプル中のＬＤＬｃ量と比較した、ＡＤ－６５６９５を投与されたマウスからの血清サンプル中のＬＤＬｃ量の比として提示される。［図１０Ｄ］ｏｂ／ｏｂマウスにおける高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）レベル対総コレステロール（ＴＣ）レベルの比に対する、ＡＤ－６５６９５（ＡＬＮ－ＡＮＧ）の単回０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇの皮下投与の効果を示すグラフである。 肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ（ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３）によって駆動されるヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（コード領域）をコードする、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターの１×１０１１個のウイルス粒子を静脈内投与することで感染させた野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）において、示されるｉＲＮＡ剤の持続性を判定するための投与計画および研究デザインを描写する。 ［図１２Ａ］示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に経時的に残存するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。［図１２Ｂ］示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に経時的に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスにおいて、示されるｉＲＮＡ剤の用量を設定し持続性を判定するための投与計画および研究デザインを描写する。 ［図１４Ａ］投与後１１日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。［図１４Ｂ］投与後１１日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 ［図１５Ａ］示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に経時的に残存するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。［図１５Ｂ］示されるｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に経時的に残存するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に経時的に残存するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 投与後１１日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 投与後２８日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 投与後１４日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 投与後２８日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの皮下投与後にＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの用量を投与された痩せ型カニクイザルの血清中に経時的に残存するカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量によって表わされる、示されるｉＲＮＡ剤の奏効持続期間を示すグラフである。提示されるカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの用量を投与されたカニクイザルの血清中に経時的に残存するトリグリセリドのパーセントを示すグラフである。提示されるトリグリセリドの量は、投与に先だつ（投与前）血清サンプル中に存在するカニクイザルトリグリセリドの量との比較である。 投与後２８日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 投与後２８日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。 投与後２８日目における、示されるｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇの皮下投与後に、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスの血清中に残存する、マウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量を示すグラフである。提示されるヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量は、投与に先立つ（投与前）血清サンプル中に存在するヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の量との比較である。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらす、ｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、例えば、ヒトなどの対象内の細胞などの細胞内にあってもよい。本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するために、および／または例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝の障害などの、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するまたは減少させることから恩恵を受ける障害を有する対象を治療するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法もまた提供する。
本発明のｉＲＮＡとしては、例えば１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長などの約３０ヌクレオチド以下の長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を挙げることができ、その領域は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。
その他の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の片方または双方の鎖は、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長など最大６６ヌクレオチド長であって、少なくとも１９連続ヌクレオチド領域を有し、それはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、１８～３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
本明細書に記載されるこれらのｉＲＮＡ剤の使用は、哺乳類においてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。特に、非常に低投与量のＡＮＧＰＴＬ３ ｉＲＮＡは、特異的かつ効率的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得て、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の著しい阻害がもたらされる。細胞ベースアッセイおよび生体内アッセイを用いて、本発明者らは、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介し得て、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の顕著な阻害をもたらすことを実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝の障害を有する対象などのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルおよび／または活性の低下によって恩恵を受ける対象を治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤はＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、それは、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長など最大６６ヌクレオチドヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）長であり得て、少なくとも１９の連続ヌクレオチドの領域があり、それはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、より長いアンチセンス鎖を有するｉＲＮＡ剤は、２０～６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含んでもよく、その中ではセンスおよびアンチセンス鎖が１８～３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
以下の詳細な説明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作成して利用する方法、ならびこの遺伝子の発現の阻害および／または低下から利益を受ける疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。
「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。「または」という用語は、本明細書では、文脈上、明確に別の意味でない限り、「および／または」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
「ＡＮＧＰＴＬ３」という用語は、特に断りのない限り、ヒト、ウシ、ニワトリ、齧歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、およびモルモットをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の脊椎動物または哺乳類起源に由来するアミノ酸配列を有するアンギオポエチン様タンパク質３を指す。用語はまた、天然ＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つの生体内または生体外活性を維持する、天然ＡＮＧＰＴＬ３の断片および変異体も指す。用語は、ＡＮＧＰＴＬ３の完全長未プロセス前駆体形態ならびにシグナルペプチドの翻訳後切断およびフィブリノーゲン様ドメインのタンパク質分解プロセシングから生じる成熟形態を包含する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：４５２４０８４４３（ＮＭ＿０１４４９５．３；配列番号１）にある。アカゲザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの予測配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：２９７２７８８４６（ＸＭ＿００１０８６１１４．２；配列番号２）にある。マウスＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：１４２３８８３５４（ＮＭ＿０１３９１３．３；配列番号３）にある。ラットＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：６８１６３５６８（ＮＭ＿００１０２５０６５．１；配列番号４）にある。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列の追加的な例は、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＯＭＩＭなどの公的に利用可能なデータベースを用いて容易に入手できる。
「ＡＮＧＰＴＬ３」という用語は、本明細書の用法では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の一塩基多型などの、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の自然発生的ＤＮＡ配列多様性によって、細胞内で発現される特定のポリペプチドも指す。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内の多数のＳＮＰが同定されており、例えばＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰにある（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照されたい）。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内のＳＮＰの非限定的例は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ受入番号ｒｓ１９３０６４０３９；ｒｓ１９２７７８１９１；ｒｓ１９２７６４０２７；ｒｓ１９２５２８９４８；ｒｓ１９１９３１９５３；ｒｓ１９１２９３３１９；ｒｓ１９１１７１２０６；ｒｓ１９１１４５６０８；ｒｓ１９１０８６８８０；ｒｓ１９１０１２８４１；またはｒｓ１９０２５５４０３にある。
本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡをはじめとする、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写中に形成される、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施態様（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）では、配列の標的部分は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。
標的配列は、例えば約１５～３０ヌクレオチド長などの約９～３６ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドなど、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
本明細書の用法では、「配列を含んでなる鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含んでなる、オリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される（例えば表１を参照されたい）。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをその他の部分で置き換え得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、塩基としてイノシンを含んでなるヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、ＡＮＧＰＴＬ３発現を調節し、例えば阻害する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤としては、例えばＡＮＧＰＴＬ３標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡが挙げられる。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングがある１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次にｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内で生成されて、ＲＩＳＣ複合体形成を促進し、標的遺伝子、すなわちＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡ（ｓｓｓｉＲＮＡ）に関する。したがって「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上述したようなＲＮＡｉに言及するために、本明細書で使用される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために、細胞または生物に導入された一本鎖ＲＮＡｉ剤であってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤（ｓｓＲＮＡｉ）は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるアルゴノート２に結合し、それは次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ＲＮＡｉ剤の設計および試験は、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，１０１，３４８号明細書およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される。本明細書に記載される任意のアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書中に記載されるような一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用されてもよく、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０；：８８３－８９４に記載の方法によって化学的に修飾されて使用されてもよい。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書で「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると言及される、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含んでなる、二本鎖構造を有するリボ核酸分子複合体を指す。本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書でＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機序を通じて、例えばｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡ分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されるように、片方または双方の鎖はまた、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドなどの１つまたは複数の非リボヌクレオチドも含み得る。さらに、本明細書における用法では、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾があるリボヌクレオチドを含んでもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおける質的な修飾を含んでもよい。本明細書の用法では、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合、および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基への、例えば、官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の作用物質で使用するのに適した修飾は、本明細書で開示されるまたは当該技術分野で公知のあらゆる種類の修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子で使用されるようなこのような任意の修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的で、「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９～３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５～３０塩基対長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含んでなり得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含んでなり得る。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでなってもよい。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤はｄｓＲＮＡであり、そのそれぞれの鎖は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する、１９～２３ヌクレオチドを含んでなる。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次にｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含んでなり得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含んでなり得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含んでなり得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖、またはその双方のオーバーハングは、１０ヌクレオチドより長く、例えば１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチドまたは１０～１５ヌクレオチドの拡張された長さを含み得る。特定の実施形態では、拡張オーバーハングは二本鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態では、拡張オーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態では、拡張オーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態では、拡張オーバーハングは二本鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態では、拡張オーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態では、拡張オーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態では、拡張オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
本明細書でｄｓＲＮＡに関して用いられる「平滑化された」または「平滑末端化された」という用語は、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がない、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡ末端の片方または双方が、平滑化され得る。ｄｓＲＮＡの双方の末端が平滑化されている場合、ｄｓＲＮＡは平滑末端化されたと言われる。明確化のために言うと、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、双方の末端が平滑化されたｄｓＲＮＡであり、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖である。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えばＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡなどの標的配列と実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡ鎖を指す。本明細書の用法では、「領域相補性」という用語は、例えば本明細書で定義されるようなＡＮＧＰＴＬ３ヌクレオチド配列のような標的配列などの配列と実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。一般に、最も耐容されるミスマッチは、例えばｉＲＮＡの５’および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド内などの末端領域にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む、ｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書の用法では、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、そこで切断が起こる、標的上の部位である。いくつかの実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で切断部位に直接隣接して３つの塩基を含んでなる。いくつかの実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で切断部位に直接隣接して２つの塩基を含んでなる。いくつかの実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合された部位で特異的に生じ、切断部位はヌクレオチド１１、１２、および１３を含んでなる。
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解され得るように、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは最大で３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが概して５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含んでなり、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含んでなるｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。
「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解され得るように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えばＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列と完全に相補的である。その他の実施形態では、本明細書で開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列と実質的に相補的であり、配列番号１、または配列番号１の断片のヌクレオチド配列の対応する領域と、その全長にわたり、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的など、少なくとも約８０％相補的な連続ヌクレオチド配列を含んでなる。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列と相補的なアンチセンスポリヌクレオチドと、実質的に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号５、または配列番号５の断片のヌクレオチド配列の対応する領域と、その全長にわたり、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的など、少なくとも約８０％相補的な連続ヌクレオチド配列を含んでなる。「阻害する」という用語は、本明細書の用法では、「低下させる」、「サイレンシング」、「下方制御」、「抑制」、およびその他の類似した用語と同義的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
「ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する」という語句は、本明細書の用法では、あらゆるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（例えばマウスＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、ラットＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、サルＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子など）、ならびにＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をコードするＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の変種または変異体の発現の阻害を含む。
「ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の阻害」としては、少なくとも約２０％の阻害などのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の少なくとも部分的抑制などのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のあらゆるレベルの阻害が挙げられる。ある実施形態においては、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の阻害が挙げられる。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現は、例えばＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡレベル、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルなどの、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現に伴うあらゆる変数のレベルに基づいて評価してもよい。ＡＮＧＰＴＬ３発現は、血清脂質、トリグリセリド、コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＩＤＬ－Ｃおよび総コレステロールを含む）または遊離脂肪酸のレベルに間接的に基づいて評価してもよい。阻害は、対照レベルと比較した、これらの変数の１つまたは複数の絶対または相対レベルの低下によって評価してもよい。対照レベルは、例えば投与前基線レベル、または未処置のまたは対照（例えば緩衝液のみの対照または非活性薬剤対照など）で処置された同様の対象、細胞、またはサンプルから測定されたレベルなどの当該技術分野で利用される、あらゆるタイプの対照レベルであってもよい。
一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の少なくとも部分的抑制は、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、しかるべく処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現が阻害されるように処置されている、その中でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子が転写される第１の細胞または細胞群から単離され、またはその中に検出され得る、ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡの量の低下によって評価される。阻害の程度は、
を用いて表してもよい。
本明細書の用法では、ｄｓＲＮＡなどの「ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させる」という語句は、あらゆる可能な手段によって細胞を接触させるステップを含む。ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させることは、試験管内でｉＲＮＡに細胞を接触させる、または生体内でｉＲＮＡに細胞を接触させるステップを含む。接触は、直接または間接的に実施してもよい。したがって、例えば方法を実施する者が、ＲＮＡｉ剤を細胞と物理的に接触させてもよく、または代案としては、引き続いて細胞との接触が可能になり、または引き起こされる状況に、ＲＮＡｉ剤を置いてもよい。
試験管内における細胞の接触は、例えば細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートして実施してもよい。生体内における細胞の接触は、例えば細胞が位置する組織内にまたはその近辺にＲＮＡｉ剤を注入して実施してもよく、または接触させる細胞が位置する組織に引き続いて薬剤が到達するように、例えば血流または皮下空隙などの別の領域にＲＮＡｉ剤を注入して実施してもよい。例えばＲＮＡｉ剤は、例えば肝臓などの対象部位にＲＮＡｉ剤を誘導する、ＧａｌＮＡｃ３などのリガンドを含有し、および／またはそれと共役していてもよい。試験管内と生体内接触法の組み合わせもまた、可能である。例えば細胞を試験管内でＲＮＡｉ剤と接触させて、引き続いて対象に移植してもよい。
一実施形態では、細胞をｉＲＮＡに接触させるステップは、細胞内への取り込みまたは吸収を容易にし、またはそれをもたらすことで、「ｉＲＮＡを導入する」または「細胞に送達する」ステップを含む。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、助力を受けない拡散性または活性細胞過程を通じて、または助剤または装置によって生じ得る。ｉＲＮＡの細胞内への導入は、試験管内および／または生体内であってもよい。例えば生体内導入のために、ｉＲＮＡを組織部位に注射し、または全身投与し得る。生体内送達はまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，０３２，４０１号明細書および米国特許第５，６０７，６７７号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載されるものなどのβ－グルカン送達系によって実施し得る。細胞への生体外導入としては、電気穿孔およびリポフェクションなどの当該技術分野で公知の方法が挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書で以下に記載され、および／または当該技術分野で公知である。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、例えばｉＲＮＡなどの核酸分子またはそれからｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの薬理的活性分子を封入する脂質層を含んでなる、小胞である。ＬＮＰは、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第６，８５８，２２５号明細書、米国特許第６，８１５，４３２号明細書、米国特許第８，１５８，６０１号明細書、および米国特許第８，０５８，０６９号明細書に記載される。
本明細書の用法では、「対象」は、霊長類（ヒト、例えばサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類など）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）をはじめとする哺乳類、または鳥類（例えばアヒルまたはガチョウ）などの動物である。一実施形態では、対象は、ＡＮＧＰＴＬ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されまたは評価されるヒト；ＡＮＧＰＴＬ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状のリスクがあるヒト；ＡＮＧＰＴＬ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を有するヒト；および／または本明細書に記載されるようにＡＮＧＰＴＬ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されるヒトなどのヒトである。
本明細書の用法では、「治療する」または「治療」という用語は、対象においてトリグリセリドレベルを低下させるなどの有益なまたは所望の結果に言及する。「治療する」または「治療」という用語としてはまた、例えば、発疹性黄色腫のサイズの減少などの脂質代謝の障害の１つまたは複数の症状の緩和または改善も挙げられるが、これに限定されるものではない。「治療」はまた、治療不在下の予測生存期間と比較した生存期間の長期化も意味し得る。
「低下させる」とは、疾病マーカまたは症状の文脈で、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であり得て、好ましくは、このような疾患がない個人の正常範囲内にあると一般に認められたレベルに低下する。
本明細書の用法では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の低下から恩恵を受ける疾患、障害または病状に関して使用される場合、「予防」または「予防する」は、対象が、そのような疾患、障害、または病状に関連する、例えば、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫などの症状を起こす可能性の低下を指す。例えば、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫の１つまたは複数のリスク因子を有する個人が、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫を発症せず、または同一リスク因子を有して本明細書に記載されるような治療を受けない集団と比較して、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫をより低い重症度で発症する場合に、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫を発症する可能性は減少する。疾患、障害または病状を発症しないこと、またはこのような疾患、障害または病状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｉ）に関連する症状発生の減少（例えばその疾患または障害の臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％の）、または遅延症状呈示の遅延（例えば、数日間、数週間、数ヶ月または数年間）が、効果的予防と見なされる。
本明細書の用法では、「血清脂質」という用語は、血液中に存在するあらゆる主要な脂質を指す。血清脂質は、遊離形態として、または例えば、リポタンパク複合体などのタンパク質複合体の一部として、血液中に存在してもよい。血清脂質の非限定的例としては、トリグリセリドと、総コレステロール（ＴＧ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ－Ｃ）、および中密度リポタンパク質コレステロール（ＩＤＬ－Ｃ）などのコレステロールとが挙げられる。
本明細書の用法では、「脂質代謝の障害」は、脂質代謝の妨害に関連する、またはそれによって引き起こされる、あらゆる障害を指す。例えば、この用語は、高脂血症をもたらし得る任意の障害、疾患または病状、または任意のまたは全ての血中脂質および／またはリポタンパクレベルの異常な上昇によって特徴付けられる病状を含む。この用語は、家族性高トリグリセリド血症や家族性部分型リポジストロフィー１型（ＦＰＬＤ１）などの遺伝性疾患、または疾患、障害または病状（例えば、腎不全）、食餌、または特定の薬物摂取の結果として（例えば、ＡＩＤＳまたはＨＩＶの治療に使用される高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の結果として）誘発されまたは獲得された障害などの、誘発性または後天性障害を指す。例示的な脂質代謝の障害としては、アテローム性動脈硬化、異脂肪血症、高トリグリセリド血症（薬物誘発性高トリグリセリド血症、利尿薬誘発性高トリグリセリド血症、アルコール誘発性高トリグリセリド血症、β－アドレナリン作動性遮断剤誘発性高トリグリセリド血症、エストロゲン誘発性高トリグリセリド血症、グルココルチコイド誘発性高トリグリセリド血症、レチノイド誘発性高トリグリセリド血症、シメチジン誘発性高トリグリセリド血症、および家族性高トリグリセリド血症をはじめとする）、高トリグリセリド血症を伴う急性膵臓炎、カイロミクロン症候群（ｓｙｎｄｒｏｍ）、家族性カイロミクロン血症、アポＥ欠乏症または抵抗性、ＬＰＬ欠乏症または機能低下、高脂血症（家族性複合型高脂血症をはじめとする）、高コレステロール血症、高コレステロール血症を伴う痛風、黄色腫症（皮下コレステロール沈着）、不均一ＬＰＬ欠乏症を伴う高脂血症、および高ＬＤＬおよび不均一ＬＰＬ欠乏症を伴う高脂血症が挙げられるが、これに限定されるものではない。
脂質代謝の障害に関連する心血管疾患もまた、本明細書で定義される「脂質代謝の障害」と考えられる。これらの疾患としては、冠動脈疾患（虚血性心疾患とも称される）、冠動脈疾患を伴う炎症、再狭窄、末梢血管の疾患、および脳卒中が挙げられる。
体重に関連する障害も、本明細書で定義される「脂質代謝の障害」と見なされる。このような障害としては、代謝症候群の独立構成要素（例えば、中心性肥満、ＦＢＧ／前糖尿病／糖尿病、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、および高血圧）をはじめとする代謝症候群、甲状腺機能低下症、尿毒症、および（急速な体重増加をはじめとする）体重増加を伴うその他の病状、体重減少、体重減少の維持、または体重減少の後の体重回復のリスクが挙げられる。
血糖障害も、本明細書で定義される「脂質代謝の障害」とさらに見なされる。このような疾患としては、インスリン抵抗性に関連する、糖尿病、高血圧、および多嚢胞性卵巣症候群が挙げられる。その他の例示的な脂質代謝の障害としては、腎臓移植、ネフローゼ症候群、クッシング症候群、先端巨大症、全身性エリテマトーデス、異常グロブリン血症、リポジストロフィー、糖原病Ｉ型、およびアジソン病もまた挙げられる。
本明細書の用法では、「治療有効量」は、脂質代謝の障害を有する対象に投与されると、（例えば既存の疾患の、または１つまたは複数の疾患症状の低減、改善または維持によって）疾患の治療をもたらすのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤投与方法、疾患とその重症度、および治療される対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行または併用治療薬のタイプ、もしあればその他の個人特性に応じて変動してもよい。
本明細書の用法では、「予防有効量」は、脂質代謝の障害を有する対象に投与されると、疾患の、または１つまたは複数の疾患症状を予防または改善するのに十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図される。疾患の改善としては、疾患経過の減速、または後に発症する疾患の重症度の低下が挙げられる。「予防有効量」は、ｉＲＮＡ、薬剤投与方法、疾患リスクの程度、および治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行または併用治療薬のタイプ、もしあればその他の個人特性に応じて変動してもよい。
「治療有効量」または「予防有効量」としてはまた、あらゆる治療薬に当てはまる妥当な利点／リスク比で、いくつかの所望の局所性または全身性効果を生じる、ＲＮＡｉ剤の量も挙げられる。本発明の方法で用いられるｉＲＮＡは、このような治療に当てはまる妥当な利点／リスク比を生じるのに十分な量で、投与されてもよい。
「薬学的に許容可能」という語句は、本明細書で、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答がなく、またはその他の問題または合併症が、妥当な利点／リスク比で釣り合う、ヒト対象および動物対象の組織との接触で使用するのに適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
本明細書の用法では、「薬理的に許容可能な担体」という語句は、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば潤滑剤、滑石マグネシウム、カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）など）、または対象化合物を１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分に運搬または輸送するのに関与する溶媒封入材料などの、薬理的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤のその他の成分と適合し、治療される対象に傷害性でないと言う意味で、「許容可能」でなくてはならない。薬理的に許容可能な担体の役割を果たし得る材料のいくつかの例としては、（１）乳糖、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースとその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）マグネシウム状態（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、および滑石などの平滑剤；（８）カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル、および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびエチルラウレートなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質非含有水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬなどの血清成分；および（２２）医薬製剤で用いられるその他の無毒の適合性物質が挙げられる。
本明細書の用法では、「サンプル」という用語は、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織の採取物、ならびに対象内に存在する体液、細胞、または組織を含む。生体液の例としては、血液、血清および漿液（ｓｅｒｏｓａｌ ｆｌｕｉｄｓ）、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、臓器または局在性領域からのサンプルが挙げられる。例えばサンプルは、特定の臓器、臓器の部分、または体液またはこれらの臓器内の細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば肝臓全体または肝臓の特定部分、または例えば肝実質細胞などの肝臓の特定タイプの細胞）に由来してもよい。いくつかの実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本明細書に記載されるのは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡである。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば家族性高脂血症などの脂質代謝の障害を有するヒトのような、哺乳類などの対象内の細胞などの細胞内で、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド以下の長さ（例えば約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド以下の長さ）である。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を発現する細胞との接触に際して、ｉＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（例えばヒト、霊長類、非霊長類、または鳥類ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法による、または例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
一般に、二本鎖構造は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどの１５～３０塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
同様に、標的配列の相補性領域は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長など１５～３０ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５～約２３ヌクレオチド長、または約２５～約３０ヌクレオチド長である。一般にｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば約２１～２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当該技術分野で周知である。当業者が認識し得るように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者は、例えば約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対などの約９～３６塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることもまた認識するであろう。したがって一実施形態では、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含んでなり得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせ上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または双方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または双方を使用して調製し得る。
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖配列は、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つに提供される配列群から選択され、センス鎖のアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド配列は、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つの配列群から選択される。この態様では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の一方は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現中に生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがって、この態様では、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つのセンス鎖（パッセンジャー鎖）として記載され、第２のオリゴヌクレオチドは、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つのセンス鎖の対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として記載される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上に含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一オリゴヌクレオチド上に含有される。
表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂの配列は、修飾、未修飾、非コンジュゲートおよび／または結合配列として記載されるが、例えば、本発明のｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未修飾、非結合、および／または記載されるのとは異なって修飾および／または結合された、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つに記載される配列のいずれか１つを含んでなってもよいものと理解される。
別の態様では、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための本発明の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、それから本質的になり、またはそれからなり、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｇｓｕｃａｃＵｆｕＧｆＡｆＡｆｃｕｃａａｃｕｃａａＬ９６－３’を含んでなり、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＧｆＡｆｇｕｕｃＡｆａＧｆｕｇａｃａｓｕｓａ－３’を含んでなり；またはセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａｕａｕＧｆｕＣｆＡｆＣｆｕｕｇａａｃｕｃａａＬ９６－３’を含んでなり、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＣｆＡｆａｇｕｇＡｆｃＡｆｕａｕｕｃｓｕｓｕを含んでなる。
当業者は、例えば２１塩基対などの約２０～２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８）。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している。（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上述の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって本明細書の配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドの配列を有して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含んでなるｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％の以下異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。
さらに本明細書で提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＡＮＧＰＴＬ３転写物中の部位を同定する。したがって本発明は、この配列内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、本明細書で提供される配列の１つからの約１５個の連続ヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般に約１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および（本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって本明細書で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、本明細書で同定されるあらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＡＮＧＰＴＬ３遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。
ＩＩＩ．発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未変性であり、例えば当該技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および／または結合を含まない。別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの発明のｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明の特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡの実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。本発明の別の実施形態では、本発明のｉＲＮＡの全てのヌクレオチドが修飾されている。その中で「実質的に全てのヌクレオチドが修飾された」本発明のｉＲＮＡは、ほとんどが修飾されているが完全ではなく、５、４、３、２または１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’－５’結合、それらの２’－５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載される。
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［天然リン酸ジエステル主鎖は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１～約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしてもまた知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’－ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。さらに例示的な修飾としては、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド（これら３つのファミリーのＲおよびＳ異性体の双方）；２’－アルコキシアルキル；２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。
その他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。
本発明のｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンをはじめとする、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含むように修飾され得る。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を結合する追加の架橋を含んでなる。この構造は、リボースを３’－エンド立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つまたは複数の二環式糖部分を含むようにも修飾され得る。「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されるフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を連結する架橋を含んでなり、それによって二環式環系を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’－炭素および２’－炭素を連結する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の作用物質は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよい。ロックド核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を連結する追加の架橋を含んでなる。換言すれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含んでなる二環式糖部分を含んでなる、ヌクレオチドである。この構造は、３’エンド立体構造内で、リボースを事実上「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清中でｓｉＲＮＡの安定性を増大させて、オフターゲット効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチド中で使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定されるものではないが、４’および２’リボシル環原子の間の架橋を含んでなるヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’から２’への架橋を含んでなる、１つまたは複数の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’から２’への架橋二環式ヌクレオシドの例としては、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許公報第２００４／０１７１５７０号明細書を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、または保護基である）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照されたい）；および４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照されたい）が挙げられるが、これに限定されるものではない。前述の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する、追加的な代表的な米国特許および米国特許公報としては、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，５２５，１９１；６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６，７７０，７４８号明細書；米国特許第６，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０３４，１３３；７，０８４，１２５号明細書；米国特許第７，３９９，８４５号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；米国特許第７，５６９，６８６号明細書；米国特許第７，７４１，４５７号明細書；米国特許第８，０２２，１９３号明細書；米国特許第８，０３０，４６７号明細書；米国特許第８，２７８，４２５号明細書；米国特許第８，２７８，４２６号明細書；米国特許第８，２７８，２８３号明細書；米国特許公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
前述の二環式ヌクレオシドのいずれでも、例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースをはじめとする、１つまたは複数の立体化学的糖配置を有するように調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照されたい）。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つまたは複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書の用法では、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０－２’架橋を含んでなる二環式糖部分を含んでなるロックド核酸である。一実施形態では、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書で「Ｓ－ｃＥｔ」と称されるＳ立体配座にある。
本発明のｉＲＮＡとしては、１つまたは複数の「立体構造的拘束ヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）もまた挙げられる。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３および－Ｃ５’炭素を連結するリンカーを有する、ヌクレオチド類似体である。ＣＲＮはリボース環を安定した立体配座にロックして、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、酸素を安定性および親和性のために最適な位置に配置させるのに十分な長さであり、リボース環パッカリングの減少がもたらされる。
上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な文献としては、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；および国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロックド核酸）ヌクレオチドである、１つまたは複数のモノマーを含んでなる。ＵＮＡはアンロックド非環式核酸であり、その中では、糖の結合のいずれかが除去されて、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間結合（すなわち、Ｃ１’およびＣ４’炭素の間の炭素－酸素－炭素の共有結合）が除去されている単量体も包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’およびＣ３’炭素間の共有炭素－炭素結合）が除去されている。（本明細書に参照により援用される、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照されたい）。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国の刊行物としては、限定されるものではないが、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；米国特許出願公開第２０１３／００１１９２２号明細書；および米国特許出願公開第２０１１／０３１３０２０号明細書が挙げられる。
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットにある。
本発明のｉＲＮＡのその他の修飾としては、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’末端リン酸塩またはリン酸塩模倣体などの５’リン酸塩または５’リン酸塩模倣体が挙げられる、適切なリン酸模倣体は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書で開示される。
ＩＶ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３－６５５６）などの脂質部分；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０）；例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：５３３－５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４）などの脂肪族鎖；例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９－９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ－κＢ活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含んでなるオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含んでなる、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当該技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質複合体
１つの実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばネプロキシンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα－らせん剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５～５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１０））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１２））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ－ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的にする。
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ－３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ－３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含んでなる。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、Ｃ５以上（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は単糖である。一実施形態では、単糖は、
などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は、
からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態で使用される別の代表的な炭水化物複合体としては、
（式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着する。本発明のなおも別の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着する。
一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に付着する１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでなる。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、それぞれ独立して複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに付着する、複数の（例えば、２、３、４、５、または６つの）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでなる。
いくつかの実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端との間の中断のないヌクレオチド鎖によって連結されて、複数の不対ヌクレオチドを含んでなるヘアピンループを形成する、１つのより大きな分子の一部である場合、ヘアピンループ内の各不対ヌクレオチドは、独立して、一価のリンカーを介して付着するＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでなってもよい。
いくつかの実施形態では、炭水化物複合体は、ＰＫ調節因子および／または細胞透過性ペプチドなどであるが、これに限定されるものではない、上述の１つまたは複数の追加的なリガンドをさらに含んでなる。
本発明で使用するのに適した追加的な炭水化物複合体（およびリンカー）としては、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含んでなり、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４個の原子、３～２４個の原子、４～２４個の原子、５～２４個の原子、６～２４個の原子、６～１８個の原子、７～１８個の原子、７～１７個の原子、８～１７個の原子、６～１６個の原子、７～１７個の原子、または、８～１６個の原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１～７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
ｉ．酸化還元切断可能連結基
１つの実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含んでなる。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含んでなる。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｖ．エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含んでなる。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含んでなる。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役する。本発明の組成物および方法のリンカーと共役するｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、
（式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、
式（ＸＸＸＩＩ）～（ＸＸＸＶ）、
（式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０～２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得て；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結され得て；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、
式（ＸＸＸＶＩ）、
（式中、
Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書、米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
ＩＶ．発明のｉＲＮＡの送達
例えばヒト対象（例えば脂質代謝の障害を有する対象などのそれを必要とする対象）などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば送達は、試験管内または生体内のどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。
一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ． ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド－およびエキソ－ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばＫｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１２９２）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、当該技術分野において既知である。
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤もまた含む。一実施形態では、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物である。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、例えば、脂質代謝の障害、例えば、家族性高トリグリセリド血症や家族性部分型リポジストロフィー１型（ＦＰＬＤ１）などの（ｓｕｃｈ ａｓ ｓｕｃｈ）遺伝性疾患、または疾患、障害または病状（例えば、腎不全）、食餌、または特定の薬物摂取の結果として（例えば、ＡＩＤＳまたはＨＩＶの治療に使用される高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の結果として）誘発されまたは獲得された障害などの、誘発性または後天性障害などのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害を治療するのに有用である。
このような医薬組成物は、送達様式に基づいて調合される。一例は、例えば、静脈内（ＩＶ）などの非経口送達を通じた全身投与のために、または皮下送達のために調合される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ輸液などの脳内点滴による、肝臓内への直接送達のために調合される組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を阻害するのに十分な投与量で投与されてもよい。一般に、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、一般に、１日あたり体重１キログラムあたり約１～５０ｍｇの範囲である。典型的に、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇおよび約３．０ｍｇ／ｋｇである。
反復用量レジメン（ｒｅｇｉｍｉｎｅ）としては、隔日から１年に１回などの治療量のｉＲＮＡの定期的投与が挙げられる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、月に約１回、四半期に約１回（すなわち、３ヶ月毎に約１回）投与される。
最初の治療レジメンの後、治療はより少ない頻度で投与され得る。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、本明細書の他の箇所で記載されるように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて、推定し得る。
マウス遺伝学における進歩は、ＡＮＧＰＴＬ３発現の低下から恩恵を受ける脂質代謝の障害などの、様々なヒト疾患研究のためのいくつかのマウスモデルを作り出した。このようなモデルは、ｉＲＮＡの生体内試験のために、ならびに治療有効用量を判定するために、使用され得る。適切なマウスモデルは当該分野で公知であり、例えば、肥満（ｏｂ）遺伝子に変異を含む肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウス（Ｗｉｅｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：１０８１－１０８９）；ＬＤＬ受容体のホモ接合型ノックアウトを含むマウス（ＬＤＬＲ－／－マウス；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９２（２）：８８３－８９３）；食餌誘発性アテローム性動脈硬化（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）マウスモデル（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．，３２：５５９－５６８）；およびヘテロ接合リポタンパク質リパーゼノックアウトマウスモデル（Ｗｅｉｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６（６）：２５５５－２５６８）が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
Ａ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含んでなる複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含んでなる。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照されたい）。
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３～５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせをはじめとする、その他の方法によって製造してもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばＴｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照されたい）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏ－２４，２５－ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照されたい）。
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＫａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照されたい）。
本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２－ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能し、脂質代謝の障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定される（ｌｍｉｔｅｄ）ものではない。それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、ＡＮＧＰＴＬ３発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
ＶＩ．発明の方法
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ、および／または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用して、細胞内でＡＮＧＰＴＬ３発現を低下させおよび／または阻害する方法も提供する。方法は、細胞を本発明のｄｓＲＮＡに接触させるステップと、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり細胞を維持し、それによって細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。遺伝子発現の低下は、当該技術分野で公知の任意の方法によって評価され得る。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３発現の低下は、例えば、ノーザンブロット法、ｑＲＴ－ＰＣＲなどの当業者には通例の方法を使用してＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現レベルを判定することで；ウエスタンブロット法、免疫学的技術などの当業者には通例の方法を使用してＡＮＧＰＴＬ３のタンパク質レベルを判定することで、判定されてもよい。ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下は、例えば、血清脂質、トリグリセリド、コレステロールおよび／または遊離脂肪酸のレベルの低下などの、ＡＮＧＰＴＬ３の生物学的活性の低下を測定することによって、間接的に評価されてもよい。
本発明の方法では、細胞は、試験管内または生体内で接触させてもよく、すなわち細胞は対象内にあってもよい。
本発明の方法を使用した治療に適する細胞は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を発現するあらゆる細胞であってもよい。本発明の方法で使用するのに適した細胞は、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞または例えばサル細胞またはチンパンジー細胞などの非ヒト霊長類細胞など）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、またはバッファロー細胞など）などの哺乳類細胞、鳥類細胞（例えばアヒル細胞またはガチョウ細胞）、またはクジラ細胞であってもよい。一実施形態では、細胞は、例えばヒト肝細胞などのヒト細胞である。
ＡＮＧＰＴＬ３発現は、細胞中で、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または約１００％阻害される。好ましい実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３発現は少なくとも２０％阻害される。
本発明の生体内における方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与するステップを含んでもよく、ｉＲＮＡは、治療される哺乳類のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。ヒトなどの哺乳類などの生物が治療される場合、組成物は、経口；腹腔内；または頭蓋内（例えば心室内、実質内、およびクモ膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（煙霧剤）、経鼻、直腸をはじめとする非経口経路、および局所（バッカルおよび舌下をはじめとする）投与をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の任意の手段によって投与し得る。特定の実施形態では、組成物は、静脈輸液または注射によって投与される。特定の実施形態では、組成物は皮下注射によって投与される。
いくつかの実施形態では、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期にわたり、一貫性を持ってｉＲＮＡを放出してもよい。したがって蓄積注射は、例えば所望のＡＮＧＰＴＬ３阻害、または治療的または予防的効果などの所望の効果を得るのに、必要な投薬頻度を低下させてもよい。蓄積注射はまた、より一貫した血清濃度を提供してもよい。蓄積注射としては、皮下注射または筋肉内注射が挙げられる。好ましい実施形態では、蓄積注射は皮下注射である。
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ、または外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態では、ポンプは、皮下移植浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、点滴ポンプである。点滴ポンプは、静脈内、皮下、動脈、または硬膜外輸液のために使用してもよい。好ましい実施形態では、点滴ポンプは、皮下点滴ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する、外科的に埋め込まれたポンプである。
投与様式は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに基づいて、および治療領域に基づいて、選択されてもよい。投与経路および部位は、標的化を向上させるように選択してもよい。
一態様では、本発明は、哺乳類においてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法もまた提供する。方法は、哺乳類の細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含んでなる組成物を哺乳類に投与するステップと、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり哺乳類を維持し、それによって細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。遺伝子発現の低下は、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって、そして例えばｑＲＴ－ＰＣＲなどの本明細書に記載される方法によって、評価され得る。タンパク質産生の低下は、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって、そして例えばＥＬＩＳＡなどの本明細書に記載される方法によって、評価され得る。一実施形態では、穿刺肝臓生検サンプルが、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子および／またはタンパク質発現の低下をモニターするための組織材料の役割を果たす。
本発明は、それを必要とする対象を治療する方法をさらに提供する。本発明の治療方法は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む薬学的組成物を治療有効量で、ＡＮＧＰＴＬ３発現の低下および／または阻害から恩恵を受ける対象などの対象に、投与することを含む。
本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与されてもよい。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物不在下で投与される。裸のｉＲＮＡは、適切な緩衝溶液中にあってもよい。緩衝溶液は、酢酸エステル、クエン酸塩、プロラミン、炭酸、またはリン酸、またはそれらのあらゆる組み合わせを含んでなってもよい。一実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝溶液のｐＨおよびモル浸透圧濃度は、対象への投与に適するように調節され得る。
代案としては、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与されてもよい。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の低下および／または阻害の恩恵を受ける対象は、例えば、脂質代謝の遺伝性障害または脂質代謝の後天的障害などの脂質代謝の障害を有する対象である。一実施形態では、脂質代謝の障害を有する対象は、高脂血症を有する。別の実施形態では、脂質代謝の障害を有する対象は、高トリグリセリド血症を有する。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の低下および／または阻害から恩恵を受ける対象の治療としては、治療的処置（例えば、対象は発疹性黄色腫を有する）および予防的処置（例えば、対象は発疹性黄色腫を有しておらず、または対象は発疹性黄色腫を発症するリスクがある）が挙げられる。
本発明は、例えばこれらの障害を治療するために目下用いられているような、既知の医薬品および／または既知の治療法などのその他の医薬品および／またはその他の治療法と組み合わせて、例えば脂質代謝の障害を有する対象などのＡＮＧＰＴＬ３発現の低下および／または阻害から恩恵を受ける対象を治療するための、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物を使用する方法をさらに提供する。例えば、特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｉＲＮＡは、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるような脂質代謝の障害の治療に有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、脂質代謝の障害を有する対象などのＡＮＧＰＴＬ３発現低下（ｒｅｄｕｃｔｏｎ）の恩恵を受ける対象を治療するのに適した追加的な薬剤は、１つまたは複数の血清脂質を低下させる薬剤を含んでもよい。このような作用剤の非限定的例としては、例えば、スタチンのようなＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤などのコレステロール合成阻害剤が挙げられる。スタチンとしては、アトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ）、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ）、持続放出ロバスタチン（Ａｌｔｏｐｒｅｖ）、ピタバスタチン（Ｌｉｖａｌｏ）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ）、およびシムバスタチン（Ｚｏｃｏｒ）が挙げられる。脂質代謝の障害の治療において有用なその他の薬剤としては、コレスチラミンおよびその他の樹脂などの胆汁封鎖剤；ナイアシンなどのＶＬＤＬ分泌阻害剤；プロブコールなどの親油性抗酸化剤；アシルＣｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤；ファルネソイドＸ受容体拮抗薬；ステロール調節結合タンパク質切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）賦活剤；ミクロソームトリグリセリド転送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤；ＡｐｏＥ関連ペプチド；およびＡＮＧＰＴＬ３に対する治療用抗体が挙げられる。追加的な治療薬としては、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤などの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）上昇させる薬剤もまた挙げられる。さらに、追加的な治療薬としては、例えば、魚油などの健康補助食品もまた挙げられる。ｉＲＮＡおよび追加的な治療薬は、例えば非経口的に同時におよび／または同一配合中で投与してもよく、または追加的な治療薬は、別の組成物の一部として、または別の時点で、および／または当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、別の方法によって投与され得る。
一実施形態では、方法は、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現が、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、または約３６時間などにわたって低下するように、本明細書で取り上げる組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、例えば約１週間、２週間、３週間、または４週間以上など、少なくとも約２、３、４日間以上などの長期間にわたって低下する。
好ましくは、本明細書で取り上げる方法および組成物で有用なｉＲＮＡは、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の（一次またはプロセシングされた）ＲＮＡを特異的に標的とする。これらの遺伝子の発現を阻害するための、ｉＲＮＡを使用した組成物および方法は、本明細書に記載されるように調製して実施し得る。
本発明の方法に従ったｄｓＲＮＡの投与は、脂質代謝の障害を有する患者中で、このような疾患または障害の重症度、徴候、症状、および／またはマーカの低下をもたらしてもよい。「低下」とは、この文脈で、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％であり得る。
疾患の治療または予防の効能は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛減少、生活の質、治療効果維持に必要な薬剤用量、疾病マーカレベルまたは治療されるまたは予防目標である、所与の疾患に適した、あらゆるその他の測定可能パラメータレベルを測定することで評価し得る。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば脂質代謝の障害治療の効能は、例えば１つ以上の脂質リンパレベルを周期的にモニターすることで、評価してもよい。最初の読み取りと後からの読み取りの比較は、治療が効果的かどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＡＮＧＰＴＬ３を標的にするｉＲＮＡまたはその医薬組成物投与との関連で，脂質代謝の障害「に対して効果的」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に、症状改善、治癒、疾患低減、延命、生活の質改善、または脂質代謝の障害および関連原因の治療に精通している医者によって、好ましいと一般に認められているその他の効果などの有益な効果をもたらすことを意味する。
病態の１つまたは複数のパラメータに統計的に有意な改善がある場合、または処置がなければ予期される症状悪化または発症の欠如によって、治療または予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬剤またはその薬剤の配合物の有効性はまた、当該技術分野で公知の所与の疾患のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカまたは症状の統計的に有意な低下が観察される場合に、証明される。
代案としては、効能は、一例としてＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈスコア（時にＣｈｉｌｄ－Ｔｕｒｃｏｔｔｅ－Ｐｕｇｈスコアとも）などの、臨床的に認められた疾患重症度評価尺度に基づく、診断当業者による判定で、疾患重症度の低下によって評価され得る。例えば適切な尺度を使用して評価された、疾患重症度の低下をもたらすあらゆる好ましい変化は、本明細書に記載されるｉＲＮＡまたはｉＲＮＡ調合物を使用した適切な治療を示す。
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｄｓＲＮＡが投与され得る。典型的に、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇおよび約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。
ｉＲＮＡは、定期的に一定期間にわたり静脈内点滴によって投与され得る。特定の実施形態では、最初の治療レジメンの後に、治療がより低い頻度で投与され得る。ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿またはその他の区画において、ＡＮＧＰＴＬ３レベルを少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または少なくとも約９９％以上低下させ得る。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿またはその他の区画において、ＡＮＧＰＴＬ３レベルを少なくとも２０％低下させ得る。
ｉＲＮＡの総用量の投与前に、５％輸液反応などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応などの悪影響についてモニターし得る。別の実施例では、サイトカイン（例えばＴＮＦ－αまたはＩＮＦ－α）レベル増大などの望まれない免疫賦活性効果について、患者をモニターし得る。
代案としては、ｉＲＮＡは、皮下投与、すなわち皮下注射によって投与され得る。１回または複数回の注射を使用して、所望の１日用量のｉＲＮＡが対象に送達されてもよい。注射は、一定期間にわたり繰り返されてもよい。投与は、定期的に繰り返されてもよい。特定の実施形態では、最初の治療レジメンの後に、治療がより低い頻度で投与され得る。反復用量レジメン（ｒｅｇｉｍｉｎｅ）としては、隔日または１年に１回までなどの治療量のｉＲＮＡの定期的投与が挙げられる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、月に約１回、四半期に約１回（すなわち、３ヶ月毎に約１回）投与される。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似したまたは同等の方法および材料を、本発明で取り上げるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験で使用し得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
実施例１．ｉＲＮＡの設計、合成、選択、および生体外評価
本実施例は、ＡＮＧＰＴＬ３ｉＲＮＡ剤を設計、合成、選択、および生体外評価する方法を記載する（その内容全体が参照により本明細書に援用される（ｉｎｃｏｐｏｒｔａｔｅｄ）国際公開第２０１２／１７７７８４号パンフレットもまた参照されたい）。
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示されない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から得られてもよい。
ヒトＡＮＧＰＴＬ３である「アンギオポエチン様３」（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０１４９９５；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：２７３２９）、ならびに毒性試験に用いた動物種であるＡＮＧＰＴＬ３オルソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５４３１８５；マウス：ＮＭ＿０１３９１３；ラット、ＮＭ＿００１０２５０６５）を標的とするｓｉＲＮＡのセットは、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、２９５１塩基の長さを有する。ｓｉＲＮＡのセットの設計の理論的根拠および方法は次のとおりである。多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００を超える別個のｓｉＲＮＡ設計からのｍＲＮＡノックダウンの直接測定から導かれた（ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅ）線形モデルを用いて、位置８１～位置２９５１（コード領域および３’ＵＴＲ）からのあらゆる潜在的な１９量体ｓｉＲＮＡについて、予測効率を判定した。ＡＮＧＰＴＬ３ｓｉＲＮＡのサブセットは、ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルの間で、完全にまたはほぼ完全に一致するように設計した。さらなるサブセットは、マウスおよびラットのＡＮＧＰＴＬ３オルソログに完全にまたはほぼ完全に一致するように設計した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、総当たり検索においてカスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、標的種トランスクリプトームにおけるｓｉＲＮＡと全ての潜在的なアライメントとの間のミスマッチの数および位置を測定した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの位置２～９として本明細書で定義されるシード領域中のミスマッチ、ならびに（ａｓ ｗｅｌｌ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの位置１０～１１として本明細書で定義されるｓｉＲＮＡの切断部位に、追加の加重を与えた。シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス位置１９までのその他の位置のミスマッチに対する相対加重は、２．８；１．２：１であった。第１位のミスマッチは無視した。各加重ミスマッチの値を合計することにより、各鎖について特異性スコアを計算した。ヒトおよびカニクイザルにおいて、そのアンチセンススコアが≧３．０であり、予測効率が≧ＡＮＰＴＬ３転写物ノックダウンの７０％であるｓｉＲＮＡに、優先度を与えた。
ＡＮＧＰＴＬ３配列の合成
ＡＮＧＰＴＬ３の一本鎖および二本鎖の合成
ＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡ配列は、固体支持体媒介ホスホルアミダイト化学反応を用いて、Ｍｅｒｍａｄｅ １９２合成機（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上で、１μモル規模で合成した。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンドまたは汎用固体担体が充填された、制御孔ガラス（５００°Ａ）であった（ＡＭ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。補助的合成試薬である２’－Ｆおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡおよびデオキシホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびＨｏｎｇｅｎｅ（中国）から入手した。２’Ｆ、２’－Ｏ－メチル、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびその他の修飾ヌクレオシドは、対応するホスホラミダイトを用いて配列中に導入した。３’ＧａｌＮＡｃ結合一本鎖の合成は、ＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体上で実施した。アンチセンス一本鎖の合成では、カスタムＣＰＧ汎用固体支持体を使用した。全てのホスホルアミダイト（アセトニトリル中の１００ｍＭ）のカップリング時間は、賦活剤として５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）（アセトニトリル中の０．６Ｍ）を用いて５分間であった。ホスホロチオエート結合は、無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中の５０ｍＭの３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１、２、４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡから入手される）溶液を使用して作製された。酸化時間は３分間であった。全ての配列は、最終的ＤＭＴ基除去（「ＤＭＴ ｏｆｆ」）によって合成した。
固相合成の完了時に、密封９６深型ウェルプレート内で、２００μＬ水性メチルアミン試薬を使用して、一本鎖を固体支持体から切断して６０℃で２０分間脱保護した。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護された２’リボ残基（２’－ＯＨ）を含む配列については、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミン三フッ化水素酸塩）試薬を使用して、第２段階の脱保護を実施した。メチルアミン脱保護溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦ試薬を添加し、溶液を６０℃でさらに２０分間インキュベートした。切断および脱保護工程の終了時に合成プレートを室温にして、１ｍＬのアセトン：エタノール混合物（９：１）の添加によって沈殿させた。プレートを－８０℃で２時間冷却し、マルチチャンネルピペットの助けを借りて、上清を注意深くデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、Ａ９０５オートサンプラーおよびＦｒａｃ９５０フラクションコレクターを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ上で、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。脱塩サンプルを９６ウェルプレート内に収集した。各配列からのサンプルをＬＣ－ＭＳで分析して同一性を確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で分析して定量化し、選択されたサンプルセットをＩＥＸクロマトグラフィーで分析して純度を判定した。
ＡＮＧＰＴＬ３一本鎖アニーリングは、Ｔｅｃａｎ液体取り扱いロボット上で実施した。等モルの混合物センスおよびアンチセンス一本鎖を合わせて、９６ウェルプレート内でアニールした。相補的な一本鎖を結合させた後、９６ウェルプレートを厳密に密閉して１００℃のオーブンで１０分間加熱し、２～３時間かけて緩慢に室温に戻した。各二本鎖の濃度を１×ＰＢＳ中で１０μＭに規準化し、次に生体外スクリーニングアッセイに供した。
実施例２．リードの選択と評価
修飾およびさらなる生体内評価のために、様々な生体外および生体内分析の結果（その内容全体が参照により本明細書に援用される（ｉｎｃｏｐｏｒｔａｔｅｄ）、国際公開第２０１２／１７７７８４号パンフレットを参照されたい）に基づいて、ＡＤ－５２９８１（センス配列：ＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵＵＵ（配列番号２０）；アンチセンス配列：ＡＡＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧ）（配列番号２１）の親配列を選択した。
したがって、ＡＤ－５２９８１の親配列を使用して、ＡＤ－５７９２７（センス配列：ＡｆｓｃｓＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆＬ９６（配列番号７０）；アンチセンス配列：ａｓＡｆｓａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓｕｓｇ）（配列番号：７１）を上述されたように合成した。
生体内におけるＤ－５７９２７の効果は、単回３０、１０、または３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－５２９８１（センス配列：ＡｆｃＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆＬ９６（配列番号７２）；アンチセンス配列：ａＡｆａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓＵｆｓｇ）（配列番号７３）、ＡＤ－５７９２７、またはＰＢＳ対照をＣ５７ＢＬ／６メスマウスに皮下投与することで評価した。投与の７２時間後に動物を殺処分し、肝臓ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを判定した。驚くことに、図１に示されるように、ＡＤ－５７９２７（「ＡＮＧ－ＧａｌＮＡｃ最適化」）はＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを親ｉＲＮＡ剤であるＡＤ－５２９８１（「ＡＮＧ－ＧａｌＮＡｃ」）よりも約１０倍低下させた。
ＡＤ－５７９２７が、生体内において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を抑制し、トリグリセリド（ｔｒｙｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ＬＤＬコレステロール、および総コレステロールのレベルを低下させる能力もまた、多回用量レジメンを使用して評価した。ｏｂ／ｏｂメスマウスに、１週目に毎日３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５７９２７を５日間皮下投与し、それに続いて２～４週目に３ｍｇ／ｋｇの用量で週２回皮下投与した（ｑｄ×５；ｑｗ×６）。動物は、０、４、８、１１、１５、１８、２２、および２５日目に採血し、２９日目に殺処分した。ＡＮＰＴＬ３タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定した。トリグリセリド、ＬＤＬコレステロール、および総コレステロールは、オリンパス血清分析器を用いて測定した。図２に示されるように、ＡＤ－５７９２７によるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の最大のノックダウンは９９％であった。ＡＤ－５７９２７によるトリグリセリド低下の最大レベルは９８％（図３）であり、ＡＤ－５７９２７による最大ＬＤＬ低下は８８％（図４）であり、ＡＤ－５７９２７による最大総コレステロール低下は６４％であった（図５）。図２～５に提示される全てのデータは、投与前レベルとの比較である。
要約すると、ＡＤ－５７９２７は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを親配列よりも約１０倍低下させることが実証された。ＡＤ－５７９２７は、ＡＮＧＰＴＬ３を用量反応性様式で低下させることが実証され（図１を参照されたい）、ＡＤ－５７９２７の有効性は多回用量投与時にさらに改善され、混合高脂血症のｏｂ／ｏｂマウスモデルにおいて血清ＡＮＰＴＬ３タンパク質の９５％以上の低下がもたらされた。さらに、３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５７９２７の多回用量投与は、ＡＮＧＰＴＬ３特異的ＥＬＩＳＡアッセイによる測定で、循環血清ＡＮＧＰＬＴ３タンパク質を除去し、それは高脂血症のｏｂ／ｏｂマウスモデルにおいて、ＴＧの＞９５％低下、ＬＤＬコレステロールの＞８５％低下、および総コレステロールの＞６０％低下をもたらした。
実施例３．ｉＲＮＡの設計、合成、選択、および生体外評価
本実施例は、追加的なＡＮＧＰＴＬ３ｉＲＮＡ剤を設計、合成、選択、および生体外評価する方法を記載する。
生体外スクリーニング：
細胞培養および形質移入：
Ｈｅｐ３ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ）が添加されたイーグル最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中において、５％ＣＯ２雰囲気内で、３７℃でコンフルエント近くまで増殖させた後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。３８４ウェルプレートの個々のウェル内で、各５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に、ウェルあたり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで形質移入を実施した。次に混合物を室温で２０分間インキュベートした。次に、５，０００個のＨｅｐ３ｂ細胞を含有する４０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。ＲＮＡ精製に先だって、細胞を２４時間培養した。単回用量実験は、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度で実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；パーツ番号６１０－１２）を使用した全ＲＮＡ単離：
ウェルあたり３μＬのビーズを含有する７５μｌの溶解／結合緩衝液中で細胞を溶解し、静電式振盪器上で１０分間混合した。洗浄工程は、磁気プレート支持体を用いて、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６上で自動化された。ビーズを緩衝液Ａで１回、緩衝液Ｂで１回、緩衝液Ｅで２回洗浄し（９０μＬ）、その間に吸引工程を入れた。最後の吸引に続いて、完全な１０μＬのＲＴ混合物を下述するように各ウェルに添加した。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用したｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号４３６８８１３）：
反応あたり１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および６．６μｌのＨ２Ｏのマスター混合物を作製した。プレートを密封して静電式振盪器上で１０分間撹拌し、次に、３７℃で２時間インキュベートした。これに続いて、プレートを８０℃で８分間撹拌した。
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内で、ウェル当たり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＡｎｇｐｔｌ３（Ｈｓ００２０５５８１＿ｍ１）、２μｌのヌクレアーゼ非含有水、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内で、リアルタイムＰＣＲを実施した。各二本鎖は、要約表に特に断りのない限り、少なくとも２回の独立した形質移入で試験した。
相対的倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭの非特異的ｓｉＲＮＡで形質移入された細胞または模擬形質移入細胞で実施したアッセイに、正規化した。
センス配列５’－ＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵＵＵ－３’（配列番号２０）およびアンチセンス配列５’－ＡＡＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧ－３’（配列番号２１）に基づく様々な化学修飾を含有する、一連のＡＮＧＰＬＴ３ ｉＲＮＡを試験した。配列の化学修飾は、表２Ａおよび２Ｂに示される。アッセイの結果は、表３に示される。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とする追加的なｉＲＮＡ剤は、上述されたようにして合成した。追加的な修飾ＡＮＧＰＴＬ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧は、表４Ａ、４Ｂ、７Ａ、および７Ｂに示され、未修飾ＡＮＧＰＴＬ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧は、表５および７Ｃに示される。
実施例４．野生型マウスにおける生体内ＡＮＧＰＴＬ３サイレンシング
上に記載された追加的な薬剤のサブセットの生体内効力および持続時間を、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスにおいて評価した。６～８週齢のメスマウスに、単回３ｍｇ／ｋｇの用量の薬剤を皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｌｓｙ）投与して、投与前、投与後０日目、および４、１０、１７、２７、３８、および５２日目に、動物の血清中でマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルを判定した。これらのアッセイでは、群当たり３匹のマウスを使用した。ＡＮＧＰＴＬ３レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイである、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓマウスアンギオポエチン様３Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＭＡＮＬ３０）を用いてアッセイした。
これらのアッセイの結果は、図６Ａおよび６Ｂに提供される。図６Ａに実証されるように、全ての薬剤は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を強力かつ持続的に阻害し、投与後約４日目に最下点に達する。図６Ｂに実証されるように、投与後１０日目に、ＡＮＧＰＴＬ３のレベルは、アッセイされたその他の薬剤と比較して、ＡＤ－６３１７４およびＡＤ－６３１７５を投与された動物において最も低い。
上に記載された追加的な薬剤の第２のサブセットもまた、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスにおいて評価した。６～８週齢のメスマウスに、単回１ｍｇ／ｋｇの用量または単回３ｍｇ／ｋｇの用量の薬剤のいずれかを皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｌｓｙ）投与して、投与前、投与後０日目、および５日目、１４日目、２１日目、２８日目および４２日目に、動物の血清中でマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルを判定した。（ＡＤ－６５６９５を投与された動物群では、試験されたその他の薬剤の応答と比較して、この薬剤に対する延長された奏効持続期間のために、マウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルを投与後５５日目にもＡＤ－６５６９５を投与された動物の血清中で判定した）。これらのアッセイでは、群当たり３匹のマウスを使用した。ＡＮＧＰＴＬ３レベルは、上述されたようにＥＬＩＳＡアッセイを用いてアッセイした。
これらのアッセイの結果は図７Ａおよび７Ｂに提供され、全ての薬剤が強力かつ持続的にＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害して、投与後約５日目に最下点に達し（図７Ａ）、アッセイされたその他の薬剤と比較して、ＡＤ－６５６９５を投与された動物が、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの用量で最も低いＡＮＧＰＴＬ３レベルを有した（図７Ｂ）ことが実証される。
実施例５．Ｏｂ／Ｏｂマウスにおける生体内ＡＮＧＰＴＬ３サイレンシング
上に記載された追加的な薬剤のサブセットの生体内効力および持続時間を、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて評価した。６～８週齢のメスｏｂ／ｏｂマウスに、単回３ｍｇ／ｋｇの用量の薬剤を皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｌｓｙ）投与して、投与前、投与後０日目、および５、１３、２４、および３８日目に、動物の血清中でマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルを判定した。これらのアッセイでは、群当たり４匹のマウスを使用した。ＡＮＧＰＴＬ３レベルは、上述されたようにＥＬＩＳＡアッセイを用いてアッセイした。
これらのアッセイの結果は図８Ａおよび８Ｂに提供され、全ての薬剤が強力かつ持続的にＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害して、投与後約５日目に最下点に達し（図８Ａ）、アッセイされたその他の薬剤と比較して、ＡＤ－６３１７５またはＡＤ－６５６９５を投与された動物が、３ｍｇ／ｋｇの用量でＡＮＧＰＴＬ３レベルの最も高いサイレンシングを有した（図８Ｂ）ことが実証される。
動物に０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇの単回用量を皮下投与して、ＡＤ－６５６９５の用量応答をｏｂ／ｏｂマウスにおいてアッセイし、マウスＡＮＧＰＴＬ３を投与前および投与後５日目および１３日目の動物の血清中で判定した。ＡＮＧＰＴＬ３レベルは、上述されたようにＥＬＩＳＡアッセイを用いてアッセイし、血清トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬｃ）、および総コレステロール（ＴＣ）レベルもまた、オリンパス分析器を用いて測定した。
図９は、５日目に、ＡＤ－６５６９５の０．３ｍｇ／ｋｇの用量を投与された動物の血清中にＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の５８％のサイレンシングがあり、ＡＤ－６５６９５の１ｍｇ／ｋｇの用量を投与された動物の血清中にＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の８２％のサイレンシングがあり、ＡＤ－６５６９５の３ｍｇ／ｋｇの用量を投与された動物の血清中にＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の９８％のサイレンシングがあり、ＡＤ－６５６９５の９ｍｇ／ｋｇの用量を投与された動物の血清中にＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の９９％のサイレンシングがあることを実証する。
図１０Ａに示されるのは、ｏｂ／ｏｂマウスにおける、ＰＢＳ対照またはＡＤ－６５６９５の投与後のＴＧのレベルであり；図１０Ｂに示されるのは、ＰＢＳコントロールまたはＡＤ－６５６９５の投与後のｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定された、ＴＣのレベルである。図１０Ｃに示されるのは、ｏｂ／ｏｂマウスにおける、ＰＢＳ対照またはＡＤ－６５６９５の投与後のＬＤＬのレベルであり；図１０Ｄに示されるのは、ＰＢＳ対照またはＡＤ－６５６９５の投与に続く、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＨＤＬｃ対ＴＣ比である。データは、ＡＤ－６５６９５の投与が、評価された全ての用量で、対照と比較してｏｂ／ｏｂマウスのＴＧ、ＬＤＬｃ、およびＴＣを低下させることを実証している（血清ＬＤＬｃおよびＴＧの８０％の低下は、ＡＤ＿６５６９５の単回３ｍｇ／ｋｇ用量を用いて観察された）。
実施例６．ＡＡＶ－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３マウスにおける生体内ＡＮＧＰＴＬ３サイレンシング
ヒトＡｎｇｐｔｌ３タンパク質レベルを低下させる、上に記載された追加的な薬剤のサブセットの単回用量の持続性を判定するために、投与の１４日前に、２００μｌ中の肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ（ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３）によって駆動されるヒトＡｎｇｐｔｌ３遺伝子（コード領域）をコードするアデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターの１×１０１１個のウイルス粒子の静脈内投与によって、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を感染させた。０日目に、マウスに単回３ｍｇ／ｋｇの薬剤を皮下投与して、投与前および投与後５、１４、２８、および４２日目の動物の血清中で、ＡＮＧＰＴＬ３のレベルを判定した（図１１を参照されたい）。血清サンプル中のマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルを上に記載されたＥＬＩＳＡアッセイを用いて判定し、血清サンプル中のヒトＡＮＧＰＴＬ３のレベルを、ヒトおよびカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ＡＮＧＰＴＬ３を検出するが、マウスＡＮＧＰＴＬ３と交差反応しない抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって判定した（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓヒトアンギオポエチン様３Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット）］。未感作マウス（ＡＡＶに曝露されていないマウス）からの血清は、これらのアッセイの陰性対照の役割を果たした。投与された２つの薬剤、ＡＤ－５７９２７およびＡＤ－６５６９５は、マウス、ラット、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）およびヒト（ｍ／ｒ／ｃｙ／ｈ）ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡと交差反応する。投与された他の２つの薬剤、ＡＤ－６２８６５およびＡＤ－６２８６６は、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）およびヒト（ｃｙ／ｈ）ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡとのみ交差反応する。
薬剤またはＰＢＳ対照の投与に続くヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルが図１２Ａに示され、薬剤またはＰＢＳ対照の投与に続くマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルが図１２Ｂに示され、予測されたように、ｃｙ／ｈ因子であるＡＤ－６２８６５およびＡＤ－６２８６６の投与（ａｄｍｉｎｓｉｔｒａｔｉｏｎ）に続いて、マウスＡＮＧＰＴＬ３のサイレンシングはなかった。結果は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３の最大８０％のノックダウンが薬剤の投与に続いて達成され、ＡＮＧＰＴＬ３の約６０％のノックダウンが少なくとも４週間持続したことを実証する。このデータはまた、交差反応性ｍ／ｒ／ｃｙ／ｈ剤ＡＤ－６５６９５の投与に続いて、マウスＡＮＧＰＴＬ３の＞９０％のノックダウンがあり、ＡＮＧＰＴＬ３の約７５％のノックダウンが、ＡＤ－６５６９５の単回３ｍｇ／ｋｇ投与後に続いて少なくとも４週間持続したことを実証する。さらに、データは、ｍ／ｒ／ｃｙ／ｈ剤であるＡＤ－６５６９５、およびｃｙ／ｈ剤であるＡＤ－６２８６５の投与（ａｄｍｉｎｓｉｔｒａｔｉｏｎ）に続いて、ＡＮＧＰＴＬ３ノックダウンの同等の有効性および持続期間があることを実証する。
単回用量持続性分析もまた、ＡＤ－６５６９５、ＡＤ－６２８６５、およびＡＤ－６２８６６を用いて実施した。図１３に示されるように、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスに、単回０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６５６９５を投与し、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスに、単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６２８６５を投与し、またはＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスに、単回０．３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６２８６６を投与した。投与前および投与後１１、２５、および３９日目に動物から血清を採取して、マウスおよびヒトＡＮＧＰＴＬ３のレベルを上述されたようにしてＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。
これらの分析からのデータは、図１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、および１５Ｂに示される。図１４Ａおよび１４Ｂは、薬剤の投与（ａｄｍｉｎｓｉｔａｒｔｉｏｎ）に続く投与後１１日目の、ヒトＡＮＧＰＴＬ３およびマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルをそれぞれ示す。図１５Ａおよび１５Ｂは、単回０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６５６９５の投与前および投与後１１、２５、および３９日目の、ヒトおよびマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルをそれぞれ提供する。データは、ＡＤ－６５６９５（ｍ／ｒ／ｃｙ／ｈ剤）がヒトＡＮＧＰＴＬ３について、３ｍｇ／ｋｇの動物の８０％における有効用量（ＥＤ８０）を有し、１ｍｇ／ｋｇのＥＤ４０を有することを実証する。データはまた、ＡＤ－６５６９５がマウスＡＮＧＰＴＬ３について、３ｍｇ／ｋｇのＥＤ９０、１ｍｇ／ｋｇのＥＤ７０、および０．３ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有することも実証する。さらに、データは、ＡＤ－６２８６５（ｃｙ／ｈ剤）がヒトＡＮＧＰＴＬ３について、３ｍｇ／ｋｇのＥＤ８０を有することを実証する。
単回１ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤投与によって、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスにおいて、それが由来する（上の表４Ａおよび４Ｂに記載される）親配列と比較して、より少ない２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有する追加的な薬剤の有効性をアッセイした。投与前および投与後９日目に動物から血清を採取して、マウスおよびヒトＡＮＧＰＴＬ３のレベルを上述されたようにしてＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。これらのアッセイの結果は下の表６に提供され、図１６は、親配列であるＡＤ－６６９２０、ＡＤ－６６９２１、およびＡＤ－６６９２２と比較して、より少ない２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有する薬剤の内３つが、ｃｙ／ｈ特異剤であるＡＤ－６２８６５よりもヒトＡＮＧＰＴＬ３ノックダウンの持続時間を改善したことを実証する。
実施例７．ＡＡＶ－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３マウスにおける生体内ＡＮＧＰＴＬ３サイレンシング
表７Ａ、７Ｂ、および７Ｃに列挙される追加的な薬剤の第２のサブセットを、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスにおいてアッセイした。これらの配列のセンスおよびアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列は、表８Ａおよび８Ｂに提供される。簡潔に述べると、上述されたようにして、投与の１４日前に、１×１０１１個のウイルス粒子の静脈内投与によって、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を感染させた。０日目に、単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤をマウスに投与した（ａｄｍｉｎｓｉｔｅｒｅｄ）。投与前および投与後１４および２８日目に動物から血清を採取して、マウスおよびヒトＡＮＧＰＴＬ３のレベルを上述されたようにしてＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。
これらのアッセイの結果は、下の表９および図１７Ａおよび１７Ｂに提供される。結果は、薬剤ＡＤ－６７１７３、ＡＤ－６７１７４、ＡＤ－６６９２２、ＡＤ－６７００７、およびＡＤ－６６９２０が、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ノックダウンの持続時間を改善したことを実証する。
別の実験において、表７Ａ、７Ｂ、および７Ｃに列挙される追加的な薬剤のさらなるサブセットを、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスにおいてアッセイした。これらの配列のセンスおよびアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列は、表１０Ａおよび１０Ｂに提供される。簡潔に述べると、上述されたようにして、投与の１４日前に、１×１０１１個のウイルス粒子の静脈内投与によって、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を感染させた。０日目に、単回１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤をマウスに投与した（ａｄｍｉｎｓｉｔｅｒｅｄ）。投与前および投与後１４および２８日目に動物から血清を採取して、マウスおよびヒトＡＮＧＰＴＬ３のレベルを上述されたようにしてＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。
投与後１４日目のこれらのアッセイの結果は、下の表１１、および図１８Ａに提供され、投与後２８日目のこれらのアッセイの結果は、下の表１２、および図１８Ｂに提供される。結果は、薬剤ＡＤ－６６９２１、ＡＤ－６６９１６、およびＡＤ－６７０４２が、ヒトＡｎｇｐｔｌ３ノックダウンの持続時間を改善したことを実証する。
実施例８．非ヒト霊長類における生体内ＡＮＧＰＴＬ３サイレンシング
１日目に、単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６５６９５またはＡＤ－６６９２０、または単回３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６６９２０をオスカニクイザル（ｎ＝３／群）に皮下投与した。絶食時血清を投与後４、８、１１、１５、および２２日目に採取して、Ａｎｇｐｌｔ３のタンパク質レベルおよび血清脂質レベルを測定した。
これらのアッセイの結果は図１９Ａおよび１９Ｂに提供され、ＡＤ－６６９２０（ｈ／ｃｙ）の単回３ｍｇ／ｋｇ用量に続く、血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の最大８０％のノックダウン、および血清トリグリセリドレベルの約５０％の低下があることが実証される。単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６６９２０は、血清トリグリセリドのレベルに軽微な効果を有した。驚くことに、単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６５６９５の投与は、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６６９２０と同様のレベルにまで低下させたが、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３マウスモデルにおいては、単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ－６５６９５は、単回１ｍｇ／ｋｇ用量ｏｆＡＤ－６６９２０よりも約３倍より弱く、血清トリグリセリドに影響を及ぼさなかった。
実施例９．ＡＡＶ－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３マウスにおける生体内ＡＮＧＰＴＬ３サイレンシング
ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする追加的な薬剤セットの生体内効力を、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスにおいてアッセイした。これらの配列のセンスおよびアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列は、表１３Ａおよび１３Ｂに提供される。簡潔に述べると、上述されたようにして、投与の２１日前に、１×１０１１個のウイルス粒子の静脈内投与によって、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６；ｎ＝３）を感染させた。０日目に、１ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤をマウスに単回投与した（ａｄｍｉｎｓｉｔｅｒｅｄ）。投与前および投与後２８日目に動物から血清を採取して、ヒトＡＮＧＰＴＬ３のレベルを上述されたようにしてＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。
これらのアッセイの結果は図２０に提供され、これらの薬剤がヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを効果的にノックダウンすることを実証する。
表１３Ａおよび１３Ｂに列挙されたＡＮＧＰＴＬ３を標的とするさらなる薬剤セットを、生体内効力についてＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３感染マウスにおいてアッセイした。上述されたようにして、投与の２１日前に、１×１０１１個のウイルス粒子の静脈内投与によって、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６；ｎ＝３）を感染させた。０日目に、１ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤をマウスに単回投与した（ａｄｍｉｎｓｉｔｅｒｅｄ）。投与前および投与後２８日目に動物から血清を採取して、ヒトおよびマウスＡＮＧＰＴＬ３のレベルを上述されたようにしてＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。
これらのアッセイの結果は図２１Ａおよび２１Ｂに提供され、これらの薬剤がマウスおよびヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを効果的にノックダウンすることが実証される。
実施例１０．ＡＡＶ－ＴＢＧ－ＡＮＧＰＴＬ３マウスにおける生体外ＡＮＧＰＴＬ３サイレンシング
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするさらなるｉＲＮＡ剤は、上述されたようにして合成した。追加的な未修飾ＡＮＧＰＴＬ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧は、表１４に示され、これらの追加的な薬剤の修飾センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧は、表１３Ａ、１３Ｂ、１５Ａ、および１５Ｂに示される。
これら追加的な薬剤は、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度での薬剤の単回用量形質移入によって、Ｈｅｐ３ｂおよび初代カニクイザル肝細胞内の生体外アッセイで評価した。（表１６を参照されたい）。
Ｈｅｐ３ｂ細胞を培養し、上述されたようにして形質移入した（ｔｒａｎｆｅｃｔｅｄ）。初代カニクイザル肝細胞内の自由取り込みサイレンシングを、ＡＮＧＰＴＬ３剤との２４時間のインキュベーションに続いて評価した。この方法は、５μＬの完全増殖培地で、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘおよびＯｐｔｉｍｅｍを含有する５μＬを置き換えたことを除いて、上に記載されたものと同様であった。これらのアッセイの結果（表１６に提供される）は、二重鎖の多くが、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現を強力に阻害することを例証する。

Claims (65)

  1. アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つに列挙される任意のアンチセンスヌクレオチド配列の１つと３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる相補性領域を含んでなる、二本鎖リボ核酸。
  2. 前記センスおよびアンチセンス鎖が、
    ５’－ＧＡＡＵＡＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号１４）
    ５’－ＵＴＧＡＧＵＵＣＡＡＧＴＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号１５）、
    ５’－ＧＡＡＵＡＴＧＵＧＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号１６）
    ５’－ＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号１７）、
    ５’－ＡＵＵＡＡＧＣＵＧＣＵＵＣＵＵＵＴＵＡＵＵ－３’（配列番号１８）
    ５’－ＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧ－３’（配列番号１９）、
    ５’－ＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵＵＵ－３’（配列番号２０）
    ５’－ＡＡＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧ－３’（配列番号２１）、
    ５’－ＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号２２）
    ５’－ＵＵＧＡＧＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡ－３’（配列番号２３）、
    ５’－ＡＡＣＵＡＡＣＵＡＡＣＵＵＡＡＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号２４）
    ５’－ＵＵＵＧＡＡＵＵＡＡＧＵＵＡＧＵＵＡＧＵＵＧＣ－３’（配列番号２５）、
    ５’－ＵＣＡＣＡＡＵＵＡＡＧＣＵＣＣＵＵＣＵＵＵ－３’（配列番号２６）
    ５’－ＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧＵＧＡＡＣ－３’（配列番号２７）、
    ５’－ＧＡＧＣＡＡＣＵＡＡＣＵＡＡＣＵＵＡＡＵＵ－３’（配列番号２８）
    ５’－ＡＡＵＵＡＡＧＵＵＡＧＵＵＡＧＵＵＧＣＵＣＵＵ－３’（配列番号２９）、
    ５’－ＵＵＡＵＵＧＵＵＣＣＵＣＵＡＧＵＵＡＵＵＵ－３’（配列番号３０）
    ５’－ＡＡＡＵＡＡＣＵＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＵＡＡＡＡ－３’（配列番号３１）、
    ５’－ＡＵＵＡＡＧＣＵＣＣＵＵＣＵＵＵＵＵＡＵＵ－３’（配列番号３２）
    ５’－ＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＡＡＵＵＧ－３’（配列番号３３）、
    ５’－ＧＡＡＵＡＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＣＡＡ－３’（配列番号３４）
    ５’－ＵＵＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＵＡＵＵＣＵＵ－３’（配列番号３５）、
    ５’－ＣＡＡＣＡＵＡＵＵＵＧＡＵＣＡＧＵＣＵＵＵ－３’（配列番号３６）
    ５’－ＡＡＡＧＡＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＵＧＵＵＧＡＧ－３’（配列番号３７）、および
    ５’－ＣＵＣＣＡＵＡＧＵＧＡＡＧＣＡＡＵＣＵＡＡ－３’（配列番号３８）
    ５’－ＵＵＡＧＡＵＵＧＣＵＵＣＡＣＵＡＵＧＧＡＧＵＡ－３’（配列番号３９）
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなる、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. 前記センス鎖のヌクレオチドの４つ以下が未修飾ヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. 前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの６つ以下が未修飾ヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. 前記センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１～３および５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. 前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１～３および６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. 前記センスおよびアンチセンス鎖が、
    ５’－ａｓｃｓａｕａｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃａｇｕｃｕｕｕｕｕ－－３’（配列番号４０）
    ５’－ａｓＡｆｓａａａＧｆａｃｕｇａｕｃＡｆａＡｆｕａｕｇｕｓｕｓｇ－－３’（配列番号４１）；
    ５’－ｕｓｇｓｕｃａｃＵｆｕＧｆＡｆＡｆｃｕｃａａｃｕｃａａＬ９６－－３’（配列番号４２）
    ５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＧｆＡｆｇｕｕｃＡｆａＧｆｕｇａｃａｓｕｓａ－－３’（配列番号３）；
    ５’－ｇｓａｓａｕａｕＧｆｕＣｆＡｆＣｆｕｕｇａａｃｕｃａａ－３’（配列番号４４）
    ５’－ｕｓｄＴｓｇａｇｕｕｃａａｇｄＴｇｄＡｃａｕａｕｕｃｓｕｓｕ－－３’（配列番号４５）；
    ５’－ｇｓａｓａｕａｄＴｇｕｄＧａｃｕｕｇａａ（Ｃｇｎ）ｕｃａａ－－３’（配列番号４６）
    ５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＣｆＡｆａｇｕｇＡｆｃＡｆｕａｕｕｃｓｕｓｕ－－３’（配列番号４７）；
    ５’－ａｓｕｓｕａａｄＧｃｕｄＧｃｕｕｃｕｕｕ（Ｔｇｎ）ｕａｕｕ－－３’（配列番号４８）
    ５’－ａｓＡｆｓｕａａＡｆａａｇａａｇｇＡｆｇＣｆｕｕａａｕｓｕｓｇ－－３’（配列番号４９）；
    ５’－ＡｆｓｃｓＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆ－３’（配列番号５０）
    ５’－ａｓＡｆｓａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓｕｓｇ－３’（配列番号５１）；
    ５’－ＵｆｓｇｓＵｆｃＡｆｃＵｆｕＧｆＡｆＡｆｃＵｆｃＡｆａＣｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号５２
    ５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆｇＵｆｕＧｆａＧｆｕｕｃＡｆａＧｆｕＧｆａＣｆａｓｕｓａ－３’（配列番号５３）；
    ５’－ａｓａｓｃｕａａＣｆｕＡｆＡｆＣｆｕｕａａｕｕｃａａａ－３’（配列番号５４）
    ５’－ｕｓＵｆｓｕｇａＡｆｕＵｆＡｆａｇｕｕＡｆｇＵｆｕａｇｕｕｓｇｓｃ－３’（配列番号５５）；
    ５’－ｕｓｃｓａｃａａＵｆｕＡｆＡｆＧｆｃｕｃｃｕｕｃｕｕｕ－３’（配列番号５６）
    ５’－ａｓＡｆｓａｇａＡｆｇＧｆＡｆｇｃｕｕＡｆａＵｆｕｇｕｇａｓａｓｃ－３’（配列番号５７）；
    ５’－ｇｓａｓｇｃａａＣｆｕＡｆＡｆＣｆｕａａｃｕｕａａｕｕ－３’（配列番号５８）
    ５’－ａｓＡｆｓｕｕａＡｆｇＵｆＵｆａｇｕｕａＧｆｕＵｆｇｃｕｃｓｕｓｕ－３’（配列番号５９）；
    ５’－ｕｓｕｓａｕｕｇＵｆｕＣｆＣｆＵｆｃｕａｇｕｕａｕｕｕ－３’（配列番号６０）
    ５’－ａｓＡｆｓａｕａＡｆｃＵｆＡｆｇａｇｇＡｆａＣｆａａｕａａｓａｓａ－３’（配列番号６１）；
    ５’－ａｓｕｓｕａａｇＣｆｕＣｆＣｆＵｆｕｃｕｕｕｕｕａｕｕ－３’（配列番号６２）
    ５’－ａｓＡｆｓｕａａＡｆａＡｆＧｆａａｇｇＡｆｇＣｆｕｕａａｕｓｕｓｇ－３’（配列番号５３）；
    ５’－ｇｓａｓａｕａｕＧｆｕＣｆＡｆＣｆｕｕｇａａｃｕｃａａ－３’（配列番号６４）
    ５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＣｆＡｆａｇｕｇＡｆｃＡｆｕａｕｕｃｓｕｓｕ－３’（配列番号６５）；
    ５’－ｃｓａｓａｃａｕＡｆｕＵｆＵｆＧｆａｕｃａｇｕｃｕｕｕ－３’（配列番号６６）
    ５’－ａｓＡｆｓａｇａＣｆｕＧｆＡｆｕｃａａＡｆｕＡｆｕｇｕｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号６７）；および
    ５’－ｃｓｕｓｃｃａｕＡｆｇＵｆＧｆＡｆａｇｃａａｕｃｕａａ－３’（配列番号６８）
    ５’－ｕｓＵｆｓａｇａＵｆｕＧｆＣｆｕｕｃａＣｆｕＡｆｕｇｇａｇｓｕｓａ－３’（配列番号６９）
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体構造的拘束ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基包含ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含んでなるヌクレオチド、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体を含んでなるヌクレオチド、ビニルホスフェートを含んでなるヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を含んでなるヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体を含んでなるヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェートを含んでなるヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェートを含んでなるヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェートを含んでなるヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結する末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３～７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  10. 前記ヌクレオチド上の修飾が、２’－Ｏ－メチルおよび２’フルオロ修飾である、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. 少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含んでなる、請求項８または９に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. 前記ｄｓＲＮＡが、６～８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでなる、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 前記相補性領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. 前記相補性領域が、１９～２３ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. 前記相補性領域が、１９ヌクレオチド長である、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. 各鎖が３０ヌクレオチド長以下である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. 少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. 少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. リガンドをさらに含んでなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３’末端に結合する、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ。
  21. 前記リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ。
  22. 前記リガンドが、
    である、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
  23. 前記ｄｓＲＮＡが、概略図、
    に示されるようにリガンドとコンジュゲートする、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ。
  24. 細胞内でアンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがアンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号２と相補的な領域を含んでなり、各鎖が約１４～約３０ヌクレオチド長であり。前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、
    式（ＩＩＩｅ）：
    センス：５’－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－３’
    アンチセンス：３’－ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－５’（ＩＩＩｅ）
    （式中、
    ｎｐ’は、２ヌクレオチドオーバーハングであり、ｎｐ’内の各ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結し；
    各Ｎａ、Ｎｂ、Ｎａ’、およびＮｂ’は、独立して、修飾または未修飾のどちらかである０～２５ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列またはそれらの組み合わせを表し、各配列は少なくとも、異なって修飾された２つのヌクレオチドを含んでなり；
    ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、それぞれ独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
    によって表わされ、
    前記センス鎖が４つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなり；
    前記アンチセンス鎖が６つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなり；
    前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、それぞれ独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含んでなり；
    前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる、二本鎖リボ核酸。
  25. 前記ＹＹＹモチーフが前記センス鎖の切断部位またはその付近に存在する、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  26. 前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記アンチセンス鎖の５’末端から１１、１２、および１３位に生じる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  27. 前記Ｙヌクレオチドが２’－フルオロ修飾を含有する、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  28. 前記Ｙ’ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含有する、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  29. 前記二本鎖領域が１５～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  30. 前記二本鎖領域が１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
  31. 前記二本鎖領域が１７～２５ヌクレオチド対の長さである、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
  32. 前記二本鎖領域が２３～２７ヌクレオチド対の長さである、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
  33. 前記二本鎖領域が１９～２１ヌクレオチド対の長さである、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
  34. 前記二本鎖領域が２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  35. 各鎖が１５～３０ヌクレオチドを有する、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  36. 各鎖が１９～３０ヌクレオチドを有する、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  37. 前記ヌクレオチド上の修飾が、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体構造的拘束ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基包含ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオチド、メチルホスホネート基を含んでなるヌクレオチド、５’－ホスフェートを含んでなるヌクレオチド、および５’－ホスフェート模倣体を含んでなるヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  38. 前記ヌクレオチド上の修飾が、２’－Ｏ－メチルまたは２’フルオロ修飾である、請求項３７に記載のｄｓＲＮＡ。
  39. 前記センス鎖が３つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  40. 前記センス鎖が２つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  41. 前記アンチセンス鎖が５つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  42. 前記アンチセンス鎖が４つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  43. 前記アンチセンス鎖が３つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  44. 前記アンチセンス鎖が２つ以下の２’－フルオロ修飾を含んでなる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  45. 前記リガンドが一価、二価、または三価の分岐リンカーを介して付着する、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  46. 前記リガンドが、
    である、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  47. 前記リガンドが、前記センス鎖の３’末端に付着する、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  48. 前記ＲＮＡｉ剤が、概略図、
    （式中、ＸはＯまたはＳである）
    に示されるように前記リガンドとコンジュゲートする、請求項４７に記載のｄｓＲＮＡ。
  49. 前記アンチセンス鎖が、
    ５’－ａｓｃｓａｕａｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃａｇｕｃｕｕｕｕｕ－－３’（配列番号４０）
    ５’－ａｓＡｆｓａａａＧｆａｃｕｇａｕｃＡｆａＡｆｕａｕｇｕｓｕｓｇ－－３’（配列番号４１）；
    ５’－ｕｓｇｓｕｃａｃＵｆｕＧｆＡｆＡｆｃｕｃａａｃｕｃａａＬ９６－－３’（配列番号４２）
    ５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＧｆＡｆｇｕｕｃＡｆａＧｆｕｇａｃａｓｕｓａ－－３’（配列番号４３）；
    ５’－ｇｓａｓａｕａｕＧｆｕＣｆＡｆＣｆｕｕｇａａｃｕｃａａ－３’（配列番号４４）
    ５’－ｕｓｄＴｓｇａｇｕｕｃａａｇｄＴｇｄＡｃａｕａｕｕｃｓｕｓｕ－－３’（配列番号４５）；
    ５’－ｇｓａｓａｕａｄＴｇｕｄＧａｃｕｕｇａａ（Ｃｇｎ）ｕｃａａ－－３’（配列番号４６）
    ５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＣｆＡｆａｇｕｇＡｆｃＡｆｕａｕｕｃｓｕｓｕ－－３’（配列番号４７）；
    ５’－ａｓｕｓｕａａｄＧｃｕｄＧｃｕｕｃｕｕｕ（Ｔｇｎ）ｕａｕｕ－－３’（配列番号４８）
    ５’－ａｓＡｆｓｕａａＡｆａａｇａａｇｇＡｆｇＣｆｕｕａａｕｓｕｓｇ－－３’（配列番号４９）；
    ５’－ＡｆｓｃｓＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆ－３’（配列番号５０）
    ５’－ａｓＡｆｓａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓｕｓｇ－３’（配列番号５１）；
    ５’－ＵｆｓｇｓＵｆｃＡｆｃＵｆｕＧｆＡｆＡｆｃＵｆｃＡｆａＣｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号５２）
    ５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆｇＵｆｕＧｆａＧｆｕｕｃＡｆａＧｆｕＧｆａＣｆａｓｕｓａ－３’（配列番号５３）；
    ５’－ａｓａｓｃｕａａＣｆｕＡｆＡｆＣｆｕｕａａｕｕｃａａａ－３’（配列番号５４）
    ５’－ｕｓＵｆｓｕｇａＡｆｕＵｆＡｆａｇｕｕＡｆｇＵｆｕａｇｕｕｓｇｓｃ－３’（配列番号５５）；
    ５’－ｕｓｃｓａｃａａＵｆｕＡｆＡｆＧｆｃｕｃｃｕｕｃｕｕｕ－３’（配列番号５６）
    ５’－ａｓＡｆｓａｇａＡｆｇＧｆＡｆｇｃｕｕＡｆａＵｆｕｇｕｇａｓａｓｃ－３’（配列番号５７）；
    ５’－ｇｓａｓｇｃａａＣｆｕＡｆＡｆＣｆｕａａｃｕｕａａｕｕ－３’（配列番号５８）
    ５’－ａｓＡｆｓｕｕａＡｆｇＵｆＵｆａｇｕｕａＧｆｕＵｆｇｃｕｃｓｕｓｕ－３’（配列番号５９）；
    ５’－ｕｓｕｓａｕｕｇＵｆｕＣｆＣｆＵｆｃｕａｇｕｕａｕｕｕ－３’（配列番号６０）
    ５’－ａｓＡｆｓａｕａＡｆｃＵｆＡｆｇａｇｇＡｆａＣｆａａｕａａｓａｓａ－３’（配列番号６１）；
    ５’－ａｓｕｓｕａａｇＣｆｕＣｆＣｆＵｆｕｃｕｕｕｕｕａｕｕ－３’（配列番号６２）
    ５’－ａｓＡｆｓｕａａＡｆａＡｆＧｆａａｇｇＡｆｇＣｆｕｕａａｕｓｕｓｇ－３’（配列番号６３）；
    ５’－ｇｓａｓａｕａｕＧｆｕＣｆＡｆＣｆｕｕｇａａｃｕｃａａ－３’（配列番号６４）
    ５’－ｕｓＵｆｓｇａｇＵｆｕＣｆＡｆａｇｕｇＡｆｃＡｆｕａｕｕｃｓｕｓｕ－３’（配列番号６５）；
    ５’－ｃｓａｓａｃａｕＡｆｕＵｆＵｆＧｆａｕｃａｇｕｃｕｕｕ－３’（配列番号６６）
    ５’－ａｓＡｆｓａｇａＣｆｕＧｆＡｆｕｃａａＡｆｕＡｆｕｇｕｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号６７）；および
    ５’－ｃｓｕｓｃｃａｕＡｆｇＵｆＧｆＡｆａｇｃａａｕｃｕａａ－３’（配列番号６８）
    ５’－ｕｓＵｆｓａｇａＵｆｕＧｆＣｆｕｕｃａＣｆｕＡｆｕｇｇａｇｓｕｓａ－３’（配列番号６９）（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵはリボースＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；ｓはホスホロチオエート結合である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  50. 前記ＲＮＡｉ剤が、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、および１５Ｂのいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ。
  51. 請求項１～５０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
  52. 請求項１～５０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含んでなる、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  53. 脂質製剤をさらに含んでなる、請求項５２に記載の医薬組成物。
  54. （ａ）細胞を請求項１～５０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡに接触させるステップと；
    （ｂ）ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり、ステップ（ａ）で生成された細胞を維持し、それによって前記細胞内で前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するステップと
    を含んでなる、細胞内でＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する方法。
  55. 前記細胞が対象内にある、請求項５４に記載の方法、
  56. 前記対象がヒトである、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記対象が、アカゲザル、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、マウス、およびラットからなる群（ｇｏｕｒｐ）から選択される、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記ヒト対象が脂質代謝の障害に罹患している、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記脂質代謝の障害が、高脂血症または高トリグリセリド血症である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＡＮＧＰＴＬ３発現が、少なくとも約３０％阻害される、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 請求項１～５０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡの治療有効量を対象に投与し、それによって前記対象を治療するステップを含んでなる、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から恩恵を受ける障害を有する対象を治療する方法。
  62. 前記障害が脂質代謝の障害である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記脂質代謝の障害が、高脂血症または高トリグリセリド血症である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記対象へのｄｓＲＮＡの投与が、血清脂質の１つまたは複数の減少およびＡＮＧＰＴＬ３タンパク質蓄積の減少を引き起こす、請求項６３に記載の方法。
  65. 請求項１～５０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡの治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するステップを含んでなる、対象においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する方法。
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