JP2021508491A - 高移動度グループボックス−１（ＨＭＧＢ１）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法 - Google Patents

高移動度グループボックス−１（ＨＭＧＢ１）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＨＭＧＢ１遺伝子を標的とする、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。本発明はまた、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するためにこのようなＲＮＡｉ剤を使用する方法、並びにＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、代謝障害又は非アルコール性脂肪肝疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を予防及び処置する方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１７年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，８６０号の優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願の全内容が、参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、全体が参照により本明細書に援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１２月１２日に作成され、１２１３０１−０８０２０＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１９２，１３７バイトのサイズである。
メタボリック・シンドロームは、先進国における死亡率及び罹患率の主な原因であり、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、米国において成人の３人に１人が罹患すると推定される、先進国において最も一般的な肝疾患である。小児におけるその有病率も、小児肥満症と並行して増加している。
ＮＡＦＬＤは、アルコールをほとんどないし全く飲まない対象が罹患する脂肪肝疾患（ＦＬＤ）全般を含む。その名称のとおり、非アルコール性脂肪肝疾患の主な特徴は、肝細胞に貯蔵された過剰な脂肪である。ＮＡＦＬＤの重症度は、様々であり、単純性脂肪肝又は非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）から、肝硬変、肝細胞癌又は肝不全につながり得る進行性疾患である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）まで及び得る。ＮＡＦＬＤは、一般的に、インスリン抵抗性、腹部肥満、脂質異常症、血圧上昇、高コレステロール血、及び前炎症状態を含む複数の障害の組合せであるメタボリック・シンドロームに関連付けられ、メタボリック・シンドロームの肝臓での表現型であると考えられる。肥満及びインスリン抵抗性と同様に、ＮＡＦＬＤは、慢性炎症に関連付けられている。ＮＡＦＬＤに加えて、肝臓感染症、肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、脂肪肝及び増加した血清脂質又はコレステロールの１つ又は複数に任意に関連する慢性的なアルコール摂取；ヘモクロマトーシス、及び肝障害を引き起こす医薬品の慢性使用を含むがこれらに限定されない他の障害が、慢性肝炎及び肝線維症に関連付けられている。
ＮＡＦＬＤ、メタボリック・シンドローム、及び他の障害の結果としての、肝炎及び線維症は、肝臓の壊死につながり得、肝臓の壊死は、肝細胞からの受動的な放出（ｐａｓｓｉｖｅ ｒｅｌｅａｓｅ）での高移動度グループボックス−１（ＨＭＧＢ１）タンパク質の放出をもたらし、これが、ひいては、好中球を含む炎症細胞の動員及び活性化を促進する。ＨＭＧＢ１はまた、細胞ストレス又は炎症に応答して非標準分泌経路を介して活発に分泌され得る。炎症反応は、更なる細胞損傷を引き起こし、線維症を促進し得る。
ＮＡＦＬＤ及びメタボリック・シンドロームの現在の治療は、主に、生活様式の変更であり、これは効果がないことが多い。したがって、ＮＡＦＬＤ及び関連疾患の処置のための組成物及び方法が当該技術分野において必要とされている。
本発明は、高移動度グループボックス−１（ＨＭＧＢ１）をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断に影響を与えるｉＲＮＡ組成物を提供する。ＨＭＧＢ１は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞中にあり得る。
一態様において、本発明は、ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。
特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、表３、５、６、又は７のいずれか１つに示される配列のいずれか１つから選択される配列を含む。
一態様において、本発明は、ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、表３、５、６、又は７のいずれか１つに列挙されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む。
一態様において、本発明は、ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ剤であって、ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドであり、センス鎖が、３’末端において結合されたリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡ剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖が、センス鎖中の３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドに相補的であるように、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド８３０〜８５１、８３０〜８５０、８３１〜８５１、９１７〜９３７、９４４〜９９７、９４４〜９９０、９４４〜９６４、９６８〜９９７、９６８〜９９０、９６８〜９９５、９６８〜９８８、９６９〜９８９、９７０〜９９０、９７１〜９９１、９７２〜９９２、９７２〜９９５、９７３〜９９３、９７４〜９９４、９７５〜９９５、９７６〜９９６、９７７〜９９７、１０１９〜１０３９、１１５８〜１１９４、１１５８〜１１８２、１１５８〜１１７８、１１５９〜１１７９、１１６０〜１１８０、１１６１〜１１８１、１１６２〜１１８２、又は１１７４〜１１９４のいずれかと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、二本鎖ＲＮＡ剤を提供する。特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、両方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。ある実施形態において、センス鎖は、３’末端において結合されたリガンドにコンジュゲートされている。
一態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ＨＭＧＢ１の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖が、センス鎖中の少なくとも１５連続ヌクレオチドに相補的であるように、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド８３０〜８５１、８３０〜８５０、８３１〜８５１、９１７〜９３７、９４４〜９９７、９４４〜９９０、９４４〜９６４、９６８〜９９７、９６８〜９９０、９６８〜９９５、９６８〜９８８、９６９〜９８９、９７０〜９９０、９７１〜９９１、９７２〜９９２、９７２〜９９５、９７３〜９９３、９７４〜９９４、９７５〜９９５、９７６〜９９６、９７７〜９９７、１１５８〜１１９４、１０１９〜１０３９、１１５８〜１１８２、１１５８〜１１７８、１１５９〜１１７９、１１６０〜１１８０、１１６１〜１１８１、１１６２〜１１８２、又は１１７４〜１１９４のいずれかからの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置からの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤も提供する。
特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’（配列番号５１１）の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’（配列番号５１２）の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’（配列番号５１１）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’（配列番号５１２）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’（配列番号５１１）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’（配列番号５１２）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’（配列番号５１１）の２１連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’（配列番号５１２）の少なくとも２１連続ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号５１３）の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’（配列番号５１４）の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号５１３）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’（配列番号５１４）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号５１３）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’（配列番号５１４）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号５１３）の２１連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’（配列番号５１４）の少なくとも２１連続ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、両方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。ある実施形態において、センス鎖は、３’末端において結合されたリガンドにコンジュゲートされている。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表３、５、６、又は７のいずれかに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。例えば、特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ−２４５２８１、ＡＤ−２４５２８２、ＡＤ−２４５３０５、ＡＤ−２４５３３６、ＡＤ−２４５３３９、ＡＤ−２４５３８３、ＡＤ−２４５４７２、ＡＤ−１９３１７７、ＡＤ−１９３３１２、ＡＤ−１９３１６８、ＡＤ−１９３３１３、ＡＤ−１９３１８０、ＡＤ−１９３１８２、ＡＤ−１９３３１４、ＡＤ−１９３１７３、ＡＤ−１９３３１１、ＡＤ−１９３１７９、ＡＤ−１９３１７８、ＡＤ−１９３１７４、ＡＤ−１９３３１５、ＡＤ−１９３１７５、ＡＤ−１９３３２６、ＡＤ−１９３１７６、ＡＤ−１９３１８、ＡＤ−８０６５１、又はＡＤ−８０６５２からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、上記の二本鎖のいずれか１つのうちの１つのアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。
ある実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む。一実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、及び２−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド；及びそれらの組合せからなる群から選択される。
特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。
特定の実施形態において、二本鎖は、表５、６、又は７のいずれか１つに示されるアンチセンス配列の群から選択される修飾アンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、二本鎖は、表５、６、又は７のいずれか１つに示されるセンス配列の群から選択される修飾センス鎖を含む。特定の実施形態において、二本鎖は、表５、６、又は７のいずれか１つに示される二本鎖の群から選択される修飾二本鎖を含む。特定の実施形態において、二本鎖は、ＡＤ−２４５２８１、ＡＤ−２４５２８２、ＡＤ−２４５３０５、ＡＤ−２４５３３６、ＡＤ−２４５３３９、ＡＤ−２４５３８３、ＡＤ−２４５４７２、ＡＤ−１９３１７７、ＡＤ−１９３３１２、ＡＤ−１９３１６８、ＡＤ−１９３３１３、ＡＤ−１９３１８０、ＡＤ−１９３１８２、ＡＤ−１９３３１４、ＡＤ−１９３１７３、ＡＤ−１９３３１１、ＡＤ−１９３１７９、ＡＤ−１９３１７８、ＡＤ−１９３１７４、ＡＤ−１９３３１５、ＡＤ−１９３１７５、ＡＤ−１９３３２６、ＡＤ−１９３１７６、ＡＤ−１９３１８、ＡＤ−８０６５１、又はＡＤ−８０６５２からなる群から選択される。
特定の実施形態において、センス鎖は、５’−ｕｓａｓａｇｕｕＧｆｇＵｆＵｆＣｆｕａｇｃｇｃａｇｕｕ−３’（配列番号５２５）の修飾配列を含み、アンチセンス鎖は、５’−ａｓＡｆｓｃｕｇｃ（Ｇｇｎ）ｃｕａｇａａＣｆｃＡｆａｃｕｕａｓｕｓｕ−３’（配列番号５２６）の修飾配列を含み、ここで、ａが、２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−リン酸であり、ｃが、２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−リン酸であり、ｇが、２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−リン酸であり、ｕが、２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−リン酸であり、Ａｆが、２’−フルオロアデノシン−３’−リン酸であり、Ｃｆが、２’−フルオロシチジン−３’−リン酸であり、Ｇｆが、２’−フルオログアノシン−３’−リン酸であり、Ｕｆが、２’−フルオロウリジン−３’−リン酸であり、（Ｇｇｎ）が、グアノシン−グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、ｓが、ホスホロチオエート結合であり；ここで、センス鎖の３’末端が、リガンド、例えば、Ｎ−［トリス（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）−アミドデカノイル）］−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）３又はＬ９６とも呼ばれる）に任意に共有結合される。
特定の実施形態において、センス鎖は、５’−ａｓａｓｇｕｕｇＧｆｕＵｆＣｆＵｆａｇｃｇｃａｇｕｕｕ−３’（配列番号５２７）の修飾配列を含み、アンチセンス鎖は、５’−ａｓＡｆｓａｃｕｇ（Ｃｇｎ）ｇｃｕａｇａＡｆｃＣｆａａｃｕｕｓａｓｕ−３’（配列番号５２８）の修飾配列を含み、ここで、ａが、２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−リン酸であり、ｃが、２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−リン酸であり、ｇが、２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−リン酸であり、ｕが、２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−リン酸であり、Ａｆが、２’−フルオロアデノシン−３’−リン酸であり、Ｃｆが、２’−フルオロシチジン−３’−リン酸であり、Ｇｆが、２’−フルオログアノシン−３’−リン酸であり、Ｕｆが、２’−フルオロウリジン−３’−リン酸であり、（Ｃｇｎ）が、シチジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、ｓが、ホスホロチオエート結合であり；ここで、センス鎖の３’末端が、リガンド、例えば、Ｎ−［トリス（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）−アミドデカノイル）］−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）３又はＬ９６とも呼ばれる）に任意に共有結合される。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖と標的との間の相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である。例えば、アンチセンス鎖と標的との間の相補性の領域は、１９〜２１ヌクレオチド長であり、例えば、相補性の領域は、２１ヌクレオチド長である。好ましい実施形態において、各鎖が、３０ヌクレオチド長以下である。一実施形態において、各鎖が、独立して、２１〜２３ヌクレオチド長である。
ある実施形態において、少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含み、例えば、少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
多くの実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドを更に含む。リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされ得る。リガンドは、
Figure 2021508491
 を含むがこれらに限定されないＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体であり得る。
例示的なｄｓＲＮＡ剤は、以下の概略図：
Figure 2021508491
 に示されるようにリガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである。一実施形態において、ＸがＯである。
特定の実施形態において、相補性の領域は、表３、５、６、又は７のいずれか１つにおけるアンチセンス配列のうちの１つを含む。他の実施形態において、相補性の領域は、表３、５、６、又は７のいずれか１つにおけるアンチセンス配列のうちの１つからなる。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ−２４５２８１、ＡＤ−２４５２８２、ＡＤ−２４５３０５、ＡＤ−２４５３３６、ＡＤ−２４５３３９、ＡＤ−２４５３８３、ＡＤ−２４５４７２、ＡＤ−１９３１７７、ＡＤ−１９３３１２、ＡＤ−１９３１６８、ＡＤ−１９３３１３、ＡＤ−１９３１８０、ＡＤ−１９３１８２、ＡＤ−１９３３１４、ＡＤ−１９３１７３、ＡＤ−１９３３１１、ＡＤ−１９３１７９、ＡＤ−１９３１７８、ＡＤ−１９３１７４、ＡＤ−１９３３１５、ＡＤ−１９３１７５、ＡＤ−１９３３２６、ＡＤ−１９３１７６、ＡＤ−１９３１８、ＡＤ−８０６５１、及びＡＤ−８０６５２からなる群から選択される二本鎖からのものである。
一態様において、本発明は、ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、ここで、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾から選択される修飾を含み、センス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖が、３’末端において一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。特定の実施形態において、修飾は、ＧＮＡ修飾を更に含む。特定の実施形態において、ＧＮＡ修飾は、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位におけるアンチセンス鎖のシード領域の反対側の部位にある。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖が、センス鎖中の少なくとも１５連続ヌクレオチドに相補的であるように、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド８３０〜８５１、８３０〜８５０、８３１〜８５１、９１７〜９３７、９４４〜９９７、９４４〜９９０、９４４〜９６４、９６８〜９９７、９６８〜９９０、９６８〜９９５、９６８〜９８８、９６９〜９８９、９７０〜９９０、９７１〜９９１、９７２〜９９２、９７２〜９９５、９７３〜９９３、９７４〜９９４、９７５〜９９５、９７６〜９９６、９７７〜９９７、１１５８〜１１９４、１０１９〜１０３９、１１５８〜１１８２、１１５８〜１１７８、１１５９〜１１７９、１１６０〜１１８０、１１６１〜１１８１、１１６２〜１１８２、又は１１７４〜１１９４のいずれかの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置からの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、ここで、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾から選択される修飾を含み、センス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖が、３’末端において一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされている。特定の実施形態において、修飾は、ＧＮＡ修飾を更に含む。
特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、各鎖が、独立して、１９〜３０ヌクレオチドを有する。特定の実施形態において、各鎖が、１４〜４０ヌクレオチドを有する。
特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾される。
特定の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位におけるアンチセンス鎖のシード領域の反対側の部位に配置された熱的に不安定なヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、熱的に不安定な修飾は、非塩基性修飾；二本鎖における反対のヌクレオチドとのミスマッチ；及び２’−デオキシ修飾などの不安定な糖修飾又は非固定核酸（ＵＮＡ）若しくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）などの非環状ヌクレオチドから選択される。特定の実施形態において、不安定な糖修飾は、ＧＮＡである。
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるようなｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞を提供する。
一態様において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１本の鎖をコードするベクターであって、ｄｓＲＮＡ剤が、ＨＭＧＢ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性の領域を含み、ｄｓＲＮＡが、３０塩基対以下の長さであり、ｄｓＲＮＡ剤が、切断のためにｍＲＮＡを標的とする、ベクターを提供する。特定の実施形態において、相補性の領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、相補性の領域は、１９〜２３ヌクレオチド長である。
一態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含むＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤及び脂質製剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、脂質製剤は、ＬＮＰを含む。特定の実施形態において、脂質製剤は、ＭＣ３を含む。
一態様において、本発明は、細胞内でのＨＭＧＢ１発現を阻害する方法であって、（ａ）細胞を、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤又は本発明の医薬組成物と接触させる工程と；（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、ＨＭＧＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、細胞内でのＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する工程とを含む方法を提供する。特定の実施形態において、細胞は、対象、例えば、ヒト対象、例えばヒト女性又はヒト男性中にある。好ましい実施形態において、ＨＭＧＢ１発現は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％だけ、又は細胞内での検出閾値未満になるまで阻害される。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１の発現の低下が、対象に由来する血液又は血清試料中のＨＭＧＢ１のレベルを測定することによって、対象中で検出される。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１の発現の低下が、対象に由来する尿試料中のＨＭＧＢ１のレベルを測定することによって、対象中で検出される。好ましい実施形態において、対象試料中のＨＭＧＢ１レベルが、少なくとも３０％、４０％、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％低下される。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１タンパク質が検出される。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１ ＲＮＡ、例えば、小胞構造中に存在する循環ＲＮＡが検出される。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１ ＲＮＡは、部位特異的切断についてアッセイされる。特定の実施形態において、対象は、ＨＭＧＢ１関連疾患に罹患している。特定の実施形態において、対象は、代謝障害の少なくとも１つの診断基準を満たす。特定の実施形態において、対象は、代謝障害と診断されている。特定の実施形態において、対象は、ＮＡＦＬＤと診断されている。特定の実施形態において、対象は、ＮＡＳＨと診断されている。
一態様において、本発明は、ＨＭＧＢ１関連疾患を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１関連疾患は、肝炎、肝線維症、ＨＭＧＢ１のレベルの上昇に関連する肝障害、代謝障害、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、大きい胴囲（男性の場合は４０インチ以上及び女性の場合は３５インチ以上）；ウエスト・ヒップ比＜１．０（男性の場合）若しくは＜０．８（女性の場合）；低いＨＤＬコレステロール（男性の場合は４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満）、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、ＮＡＳＨ肝硬変、特発性肝硬変、高血圧症、高コレステロール血、肝臓感染症、肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、慢性的なアルコール摂取、アルコール性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシス、及び肝障害を引き起こす医薬品の慢性使用から選択される。一態様において、本発明は、代謝障害を処置する方法を提供する。一態様において、本発明は、ＮＡＦＬＤを処置する方法を提供する。一態様において、本発明は、ＮＡＳＨを処置する方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＨＭＧＢ１関連疾患を発症するリスクがある対象におけるＨＭＧＢ１関連疾患の発症を予防する方法を提供する。一態様において、本発明は、ＮＡＳＨを発症するリスクがある対象、例えば、ＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害を発症するリスクがある又はＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害と診断された対象におけるＮＡＳＨの発症を予防する方法を提供する。
好ましい実施形態において、ＨＭＧＢ１関連疾患と診断された又はＨＭＧＢ１関連疾患を発症するリスクがある対象はヒトである。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの上昇した空腹時血糖値、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、男性の場合は４０インチ以上及び女性の場合は３５インチ以上である大きい胴囲；男性の場合は４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満である低いＨＤＬコレステロール；１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリドから選択される代謝障害の少なくとも１つの兆候を有する。特定の実施形態において、対象は、少なくとも６．５％のＨｂ１Ａｃ、２型糖尿病、又は食後２時間後の血糖値若しくは少なくとも１４０ｍｇ／ｄｌの血清グルコース濃度を有する。特定の実施形態において、対象は、肥満である。特定の実施形態において、対象は、２型糖尿病に罹患している。特定の実施形態において、対象は、脂肪肝疾患（ＦＬＤ）に罹患している。特定の実施形態において、対象は、ＮＡＦＬＤ、例えば、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、ＮＡＳＨ肝硬変、特発性肝硬変、又はヘモクロマトーシスに罹患している。特定の実施形態において、対象は、肝炎又は線維症に罹患している。特定の実施形態において、対象は、肝臓感染症、肝硬変、又は自己免疫性肝炎に罹患している。特定の実施形態において、対象は、慢性的な過剰のアルコール摂取を示していた。特定の実施形態において、対象は、アルコール性肝炎又はアルコール性脂肪性肝炎に罹患している。特定の実施形態において、対象は、ヒト女性である。特定の実施形態において、対象は、ヒト男性である。
特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１関連疾患に罹患した対象は、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある。特定の実施形態において、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある対象は、肥満である。特定の実施形態において、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある対象は、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの上昇した空腹時血糖値、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、男性の場合は４０インチ以上及び女性の場合は３５インチ以上である大きい胴囲；男性の場合は４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満である低いＨＤＬコレステロール；１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリドから選択される、代謝障害の少なくとも１つの兆候を有する。特定の実施形態において、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある対象は、少なくとも６．５％のＨｂ１Ａｃ、２型糖尿病、又は食後２時間後の血糖値若しくは少なくとも１４０ｍｇ／ｄｌの血清グルコース濃度を有する。特定の実施形態において、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある対象は、肥満、２型糖尿病、脂質異常症、及び多嚢胞性卵巣症候群などの、ＮＡＦＬＤとの確立された関連性を有する状態を有する。特定の実施形態において、対象は、甲状腺機能低下症、閉塞性睡眠時無呼吸、下垂体機能低下症、性腺機能低下症、膵十二指腸切除、及び乾癬などの、ＮＡＦＬＤに関連する状態を有する。特定の実施形態において、対象は、ＮＡＦＬＤに罹患している。特定の実施形態において、対象は、ヒト女性である。特定の実施形態において、対象は、ヒト男性である。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に皮下投与される。
特定の実施形態において、本発明の方法は、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、ＮＡＦＬＤ又は代謝障害の１つ又は複数の診断マーカーの変化について対象を監視することを更に含む。特定の実施形態において、本方法は、対象におけるＨＭＧＢ１のレベル、例えば、対象の血液若しくは血清試料又は対象の尿試料におけるＨＭＧＢ１タンパク質又はＲＮＡのレベルを測定することを更に含む。特定の実施形態において、対象は、ＨｂＡ１ｃレベル、食前血糖値、食後血糖値、インスリン感受性についての検査、又はグルコース感受性検査、血圧検査、コレステロール検査、若しくは血清脂質検査；又は体重若しくは身長測定又は胴囲測定を受けている。
特定の実施形態において、対象は、更なる薬剤を投与されているか、又は代謝障害の処置への介入、例えば、高血圧若しくは２型糖尿病の処置のための更なる薬剤、又は胃バイパス手術を受けている。
様々な実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの用量で、月に約１回、２ヶ月に約１回、四半期に約１回（すなわち、３ヶ月に１回）、又は６ヶ月に約１回投与される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、月に約１回以下投与される。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、月に１回対象に投与される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、３ヶ月に１回対象に投与される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、３〜６ヶ月に１回投与される。特定の実施形態において、ＲＮＡ剤は、月に１回以下投与される。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に皮下投与される。
特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１のレベルは、対象中で測定される。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１のレベルは、対象の血液若しくは血清試料中のＨＭＧＢ１タンパク質のレベル、又は血液若しくは尿試料中のＨＭＧＢ１ ＲＮＡのレベルである。特定の実施形態において、血液又は尿試料中のＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ切断部位についてアッセイされる。
本発明は、ＨＭＧＢ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。この遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞中にあり得る。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子（ＨＭＧＢ１遺伝子）のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。
本発明のｉＲＮＡは、他の哺乳動物種のＨＭＧＢ１オルソログにおいて保存される遺伝子の部分を含むヒトＨＭＧＢ１遺伝子を標的とするように設計されている。理論に制約されるのを意図していないが、上記の特性及びこれらのｉＲＮＡにおける特定の標的部位又は特定の修飾の組合せ又は部分的な組合せが、本発明のｉＲＮＡに、改善された有効性、安定性、効力、耐久性、及び安全性を与えるものと考えられる。
したがって、本発明は、ＨＭＧＢ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を用いて、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、ＮＡＦＬＤ又は代謝障害を処置及び予防するための方法を提供する。
本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長、好ましくは１９〜２１ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、ＨＭＧＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。
特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖の一方又は両方は、最大で６６ヌクレオチド長、例えば、３６〜６６、２６〜３６、２５〜３６、３１〜６０、２２〜４３、２７〜５３ヌクレオチド長であり、ＨＭＧＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的な少なくとも１９連続ヌクレオチドの領域を有する。ある実施形態において、より長い長さのアンチセンス鎖を有するこのようなｉＲＮＡ剤は、好ましくは、２０〜６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含んでいてもよく、ここで、センス及びアンチセンス鎖は、１８〜３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
ある実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖の一方又は両方は、最大で６６ヌクレオチド長、例えば、３６〜６６、２６〜３６、２５〜３６、３１〜６０、２２〜４３、２７〜５３ヌクレオチド長であり、ＨＭＧＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的な少なくとも１９連続ヌクレオチドの領域を有する。ある実施形態において、より長い長さのアンチセンス鎖を有するこのようなｉＲＮＡ剤は、２０〜６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含んでいてもよく、ここで、センス及びアンチセンス鎖は、１８〜３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
本発明のｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子（ＨＭＧＢ１遺伝子）のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。インビトロ及びインビボアッセイを用いて、本発明者らは、ＨＭＧＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを媒介することができ、ＨＭＧＢ１の発現のかなりの阻害をもたらすことを実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法及び組成物は、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、ＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害を発症するリスクがあるか又はＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、ＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害と診断された対象を予防及び処置するのに有用である。本明細書における方法及び組成物は、対象、特に、ＨＭＧＢ１関連疾患に罹患している対象におけるＨＭＧＢ１のレベルを低下させるのに有用である。
以下の詳細な説明は、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡを含有する組成物を作製及び使用する方法、並びにＨＭＧＢ１遺伝子の発現の低下から利益を得られ得る対象、例えば、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、ＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害を発症するリスクがあるか又はＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、ＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害と診断された対象を処置するための組成物、使用、及び方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。
「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。例えば、「センス鎖又はアンチセンス鎖」は、「センス鎖又はアンチセンス鎖又はセンス鎖及びアンチセンス鎖」であると理解される。
「約」という用語は、当該技術分野における許容差の典型的な範囲内にあることを意味するように本明細書において使用される。例えば、「約」は、平均から約２標準偏差であると理解され得る。特定の実施形態において、約は、±１０％を意味する。特定の実施形態において、約は、±５％を意味する。約が、一連の数値又は範囲の前に存在する場合、「約」が、一連の数値又は範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
数値又は一連の数値の前の「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接する数値、及び文脈から明らかであるような、論理的に含まれ得る全ての後続の数値又は整数を含むことが意図される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドが、示される特性を有することを意味する。少なくともが、一連の数値又は範囲の前に存在する場合、「少なくとも」が、一連の数値又は範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用される際、「以下」又は「未満」は、この語句に隣接する値、及び文脈から論理的である際、ゼロまでの、論理的なより低い値又は整数であると理解される。例えば、「２つ以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１、又は０個のヌクレオチドオーバーハングを有する。「以下」が、一連の数値又は範囲の前に存在する場合、「以下」が、一連の数値又は範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用される際、範囲は、上限値及び下限値の両方を含む。
配列と転写物上のその示される部位又は他の配列との間に矛盾がある場合、本明細書中、例えば、二本鎖配列を示す表中に列挙されるヌクレオチド配列が優先される。
本明細書において使用される際、「高移動度グループボックス−１」又は「ＨＭＧＢ１」は、高移動度グループボックススーパーファミリーに属するタンパク質である。コードされた非ヒストン性の、核ＤＮＡ結合タンパク質は、転写を調節し、ＤＮＡの組織化に関与する。このタンパク質は、炎症、細胞分化及び腫瘍細胞移動を含むいくつかの細胞過程において役割を果たす。この遺伝子の複数の偽遺伝子が、同定されている。選択的スプライシングが、同じタンパク質をコードする複数の転写物変異体をもたらす。ＨＭＧＢ１についての更なる情報が、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／３１４６（２０１７年１２月１８日時点で入手可能なバージョンで参照により本明細書に援用される）においてＮＣＢＩ Ｇｅｎｅデータベースに提供される。ＨＭＧＢ１は、ＨＭＧ１；ＨＭＧ３；ＨＭＧ−１；ＳＢＰ−１としても知られている。文脈から他の意味であることが明らかでない限り、ＨＭＧＢ１、又はその大文字表記の形態が、タンパク質又はＲＮＡのプロセシングされた及びプロセシングされていない形態又は断片を含む、遺伝子、ＲＮＡ、及びタンパク質のいずれかを指し得る。
本明細書において使用される際、「ＨＭＧＢ１」は、ＨＭＧＢ１タンパク質をコードする天然遺伝子を指す。ヒトＨＭＧＢ１遺伝子の参照配列のアミノ酸及び完全なコード配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１２８．５（配列番号１；配列番号２）に見られる。ヒトＨＭＧＢ１遺伝子の哺乳動物オルソログが、例えば、登録番号ＮＭ＿０１０４３９．４、マウス（配列番号３及び配列番号４）；登録番号ＮＭ＿０１２９６３．２、ラット（配列番号５及び配列番号６）；及び登録番号ＮＭ＿００１２８３３５６．１、カニクイザル（配列番号７及び配列番号８）に見られる。ヒトＨＭＧＢ１転写物変異体は、ＮＭ＿００１３１３８９２．１（配列番号９及び１０）及びＮＭ＿００１３１３８９３．１（配列番号１１及び１２）を含む。
いくつかの天然ＳＮＰが公知であり、例えば、ヒトＨＭＧＢ１中のＳＮＰを列挙するｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ？ＬｉｎｋＮａｍｅ＝ｇｅｎｅ＿ｓｎｐ＆ｆｒｏｍ＿ｕｉｄ＝３１４６（２０１７年１２月１８日時点で入手可能なバージョンで参照により本明細書に援用される）においてＮＣＢＩにおけるＳＮＰデータベースに見られる。好ましい実施形態において、このような天然変異体が、ＨＭＧＢ１遺伝子配列の範囲内に含まれる。
本明細書において使用される際、「ＨＭＧＢ１関連疾患」などは、脂肪肝、炎症、線維症、又は細胞死（例えば、壊死若しくはアポトーシス）若しくは活発な分泌による、ＨＭＧＢ１のレベルの上昇若しくは肝細胞からのＨＭＧＢ１の放出に関連する損傷に関連する疾病又は病態であると理解される。例示的なＨＭＧＢ１関連疾患としては、代謝障害及びその診断的要素、ＮＡＦＬＤ（例えば、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、ＮＡＳＨ肝硬変、又は特発性肝硬変）、肥満、肝臓感染症、肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、任意に、脂肪肝及び増加した血清脂質又はコレステロールのうちの１つ又は複数を伴う慢性的なアルコール摂取；アルコール性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシス、及び肝障害を引き起こす医薬品の慢性使用が挙げられる。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１関連疾患は、慢性障害に関連する疾患である。特定の実施形態において、ＨＭＧＢ１関連疾患は、急性障害、例えば、中毒、例えば、急性アセトアミノフェン過量摂取による急性肝毒性に関連する疾患を除外する。
本明細書において使用される際、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＨＭＧＢ１遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。配列の標的部分は少なくとも、ＨＭＧＢ１遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該当部分で又はその近くでｉＲＮＡ指向性切断のための基質として用いられるのに十分な長さであろう。一実施形態において、標的配列は、ＨＭＧＢ１のタンパク質コード領域内にある。
標的配列は、約９〜３６ヌクレオチド長、例えば、約１５〜３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長であり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
本明細書において使用される際、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）も指し得ることが理解されよう（例えば、表２を参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換され得ることを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明に取り上げられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換され得る。別の例では、オリゴヌクレオチド中のどこかのアデニン及びシトシンが、それぞれグアニン及びウラシルで置換されて、標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕゆらぎ塩基対合が形成され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明に取り上げられる組成物及び方法に好適である。
本明細書において同義的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによってｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのＨＭＧＢ１の発現を調節する（例えば阻害する）。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＭＧＢ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられている（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、すなわち、ＨＭＧＢ１遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のｉＲＮＡを指すために本明細書において使用される。
特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞又は生物中に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、それが、次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５〜３０のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計及び試験が、米国特許第８，１０１，３４８号明細書及びＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４に記載されており、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかが、本明細書に記載されるような又はＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ｉＲＮＡ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＨＭＧＢ１遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用される際、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ｉＲＮＡは、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用される際、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合、若しくは修飾された核酸塩基、又はそれらの任意の組合せを有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、又は核酸塩基に対する、例えば、官能基又は原子の置換、付加又は除去を包含する。本発明の剤に使用するのに好適な修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」又は「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さのものであってもよく、約９〜３６塩基対の長さ、例えば、約１５〜３０塩基対の長さの範囲、例えば、約１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さなどの、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対の長さであり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、２０個、２３個又はそれを超える不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、１０個以下のヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、８個以下の不対ヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、４〜１０個の不対ヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、４〜８つのヌクレオチドであり得る。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって含まれる場合、それらの分子は、共有結合され得るが、共有結合されていなくてもよい。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は、各鎖が、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く１９〜２３個のヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡである。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＭＧＢ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く２４〜３０個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。
本明細書において使用される際、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延びるか、又はその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか；或いはオーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド又はそれを超える数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端に存在し得る。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端又は５’末端に、１〜１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。特定の実施形態において、センス鎖又はアンチセンス鎖、又はその両方におけるオーバーハングは、１０個のヌクレオチドより長い伸長された長さ、例えば、１〜３０ヌクレオチド、２〜３０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２５ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、又は１０〜１５ヌクレオチド長を含み得る。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハング中のヌクレオチドの１つ又は複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。特定の実施形態において、オーバーハングが、生理的条件下で安定したヘアピン構造を形成することが可能であるように、オーバーハングは、自己相補的な部分を含む。
「平滑な」又は「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡ剤の該当する末端に不対ヌクレオチドが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」二本鎖ＲＮＡ剤は、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しない。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有さない（すなわち、１つのオーバーハング及び１つの平滑末端を有する剤）又はいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングを有さないＲＮＡｉ剤を含む。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖であるであろう。
「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」という用語は、標的配列、例えば、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において使用される際、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＨＭＧＢ１ヌクレオチド配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列と完全には相補的でない場合、その分子の内部領域又は末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５’末端又は３’末端の５、４、又は３ヌクレオチド以内にある。ある実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖中にヌクレオチドミスマッチを含む。ある実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖中にヌクレオチドミスマッチを含む。ある実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３ヌクレオチド以内にある。別の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド中にある。
本明細書において使用される際の「センス鎖」又は「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書において使用される際、「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」は、大部分が修飾されるが、完全に修飾されるわけではなく、５、４、３、２、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
本明細書において使用される際、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的における、切断が生じる部位である。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した３つの塩基を含む。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した２つの塩基を含む。ある実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０及び１１によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、及び１３を含む。
本明細書で使用される用語「相補的な」は、特に示されない限り、当業者により理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄を含み得る（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。内部で遭遇し得る、生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定できるであろう。
ｉＲＮＡ中、例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ中の相補的な配列は、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的な」と称され得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、又は、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二本鎖に対するハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つ又は複数であるが、一般に、５つ以下、４つ以下、３つ以下又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチと見なされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的において、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な配列である２１ヌクレオチドの配列を含む場合でも、「完全に相補的」と称されてもよい。
本明細書で使用される「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対、又は非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含むことができ、又は該塩基対から完全に形成され得る。そのような非ワトソン−クリック塩基対には、非限定的に、Ｇ：Ｕゆらぎ又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対が挙げられる。
本明細書で、用語「相補的な」「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又は二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。
本明細書において使用される際、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＨＭＧＢ１遺伝子をコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＨＭＧＢ１ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
したがって、ある実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＨＭＧＢ１配列に完全に相補的である。ある実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＨＭＧＢ１配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＨＭＧＢ１配列の逆相補的配列に実質的に相補的であり、その全長にわたって、配列番号２のヌクレオチド配列の相当する領域、又は配列番号２のフラグメントに少なくとも８０％相補的、例えば、少なくとも８５％、９０％、若しくは９５％相補的；又は１００％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＨＭＧＢ１配列に実質的に相補的であり、その全長にわたって、配列番号１のヌクレオチド配列の相当する領域、又は配列番号１のフラグメントに少なくとも８０％相補的、例えば、少なくとも８５％、９０％、若しくは９５％相補的；又は１００％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。標的部位は、標的ＨＭＧＢ１配列、例えば、配列番号１における標的部位の同定によって規定され得る。配列番号２の対応する部分、配列番号１の逆相補的配列は、本明細書に開示される二本鎖ＲＮＡｉを提供するのに十分な長さにわたって配列番号１の部分に相補的であろう配列番号２の部分である。
したがって、ある実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＨＭＧＢ１配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＨＭＧＢ１配列に実質的に相補的であり、その全長にわたって、配列番号１のヌクレオチド配列の相当する領域、又は配列番号１のフラグメントに少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約９０％、又は約９５％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、配列番号１のフラグメントは、配列番号１のヌクレオチド８３０〜８５１、８３０〜８５０、８３１〜８５１、９４４〜９９７、９４４〜９９０、９４４〜９６４、９６８〜９９７、９６８〜９９０、９６８〜９９５、９６８〜９８８、９６９〜９８９、９７０〜９９０、９７１〜９９１、９７２〜９９２、９７２〜９９５、９７３〜９９３、９７４〜９９４、９７５〜９９５、９７６〜９９６、９７７〜９９７、１０１９〜１０３９、１１５８〜１１９４、１１５８〜１１８２、１１５８〜１１７８、１１５９〜１１７９、１１６０〜１１８０、１１６１〜１１８１、１１６２〜１１８２、又は１１７４〜１１９４の群から選択される。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、標的ＨＭＧＢ１配列に実質的に相補的であり、且つその全長にわたって、表３、５、６、若しくは７のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチド配列の相当する領域、又は表３、５、６、若しくは７のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つのフラグメントに少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、９０％、９５％、又は１００％相補的である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンスポリヌクレオチドは、今度は、標的ＨＭＧＢ１配列に相補的であり、センス鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたって、表３、５、６、若しくは７のいずれか１つにおけるアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチド配列の相当する領域、又は表３、５、６、若しくは７のいずれか１つにおけるアンチセンス鎖のいずれか１つのフラグメントに少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、９０％、９５％、又は１００％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、表３、５、６、又は７のいずれか１つにおけるセンス及びアンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ−２４５２８１、ＡＤ−２４５２８２、ＡＤ−２４５３０５、ＡＤ−２４５３３６、ＡＤ−２４５３３９、ＡＤ−２４５３８３、ＡＤ−２４５４７２、ＡＤ−１９３１７７、ＡＤ−１９３３１２、ＡＤ−１９３１６８、ＡＤ−１９３３１３、ＡＤ−１９３１８０、ＡＤ−１９３１８２、ＡＤ−１９３３１４、ＡＤ−１９３１７３、ＡＤ−１９３３１１、ＡＤ−１９３１７９、ＡＤ−１９３１７８、ＡＤ−１９３１７４、ＡＤ−１９３３１５、ＡＤ−１９３１７５、ＡＤ−１９３３２６、ＡＤ−１９３１７６、ＡＤ−１９３１８１、ＡＤ−８０６５１、又はＡＤ−８０６５２から選択される。
一般に、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含む。このような修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｄｓＲＮＡ分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」によって包含される。
本発明の一態様において、本発明の方法及び組成物に使用するための剤は、アンチセンス阻害機構によって、標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害し得る（Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５を参照）。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含み得る。
本明細書において使用される際の、ｄｓＲＮＡなどの「ｉＲＮＡと細胞を接触させる」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを含む。ｉＲＮＡと細胞を接触させる工程は、細胞をｉＲＮＡとインビトロで接触させる工程又は細胞をｉＲＮＡとインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、ｉＲＮＡは、方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、或いは、ＲＮＡｉ剤は、それを後に細胞と接触させるのを可能にするか又はそれを後に細胞と接触させる状況に置かれてもよい。
細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、ｉＲＮＡを用いて細胞をインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、ｉＲＮＡが接触される細胞が位置する組織に後に到達するように、例えば、ｉＲＮＡを、細胞が位置する組織中又は組織の近くに注入することによって、又はｉＲＮＡを、別の部位、例えば、血流又は皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、ｉＲＮＡは、目的の部位、例えば、肝臓にｉＲＮＡを指向するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３を含んでいてもよく、又はそれに結合され得る。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。例えば、細胞はまた、ｉＲＮＡとインビトロで接触され、その後、対象に移植されてもよい。
特定の実施形態において、細胞をｉＲＮＡと接触させる工程は、細胞中への取り込み又は吸収を促進するか又は行うことによって、「導入する」又は「ｉＲＮＡを細胞中に送達する」工程を含む。ｉＲＮＡの吸収又は取り込みは、補助されない拡散（ｕｎａｉｄｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ）又は活性な細胞プロセスによって、又は補助的な薬剤又はデバイスによって行われ得る。細胞中へのｉＲＮＡの導入は、インビトロ又はインビボであってもよい。例えば、インビボでの導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入されるか又は全身投与され得る。細胞中へのインビトロでの導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの、当該技術分野において公知の方法を含む。更なる手法が、本明細書において後述され、又は当該技術分野において公知である。
「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、核酸分子、例えば、ｉＲＮＡが転写されるｉＲＮＡ又はプラスミドなどの薬学的に有効な分子を封入する脂質層を含む小胞である。ＬＮＰは、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，８５８，２２５号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書、同第８，１５８，６０１号明細書、及び同第８，０５８，０６９号明細書に記載されている。
本明細書において使用される際、「対象」は、内因的に又は異種的に標的遺伝子を発現する、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、及びチンパンジーなど）、非霊長類（ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、又はマウスなど）を含む哺乳動物、又は鳥類などの動物である。特定の実施形態において、対象は、ＨＭＧＢ１関連疾患と診断された又はＨＭＧＢ１関連疾患を発症するリスクがある動物である。特定の実施形態において、対象は、ＮＡＳＨと診断された又はＮＡＳＨを発症するリスクがある動物、例えば、ＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害を発症するリスクがある又はＮＡＦＬＤ若しくは代謝障害と診断された対象である。特定の実施形態において、対象は、代謝障害の少なくとも１つの診断基準、例えば、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、大きい胴囲（男性の場合は４０インチ以上及び女性の場合は３５インチ以上）；ウエスト・ヒップ比＜１．０（男性の場合）又は＜０．８（女性の場合）；低いＨＤＬコレステロール（男性の場合は４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満）、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリドを満たす対象である。特定の実施形態において、対象は、少なくとも６．５％のＨｂ１Ａｃ、２型糖尿病、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの上昇した空腹時血糖値、食後２時間後の血糖値又は少なくとも１４０ｍｇ／ｄｌの血清グルコース濃度のうちの１つ又は複数を有する。特定の実施形態において、対象は、ＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＦＬ、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、ＮＡＳＨ肝硬変、又は特発性肝硬変の少なくとも１つの診断基準を満たす対象である。特定の実施形態において、対象は、ＮＡＳＨの少なくとも１つの診断基準を満たす対象である。特定の実施形態において、対象は、肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、脂肪肝及び増加した血清脂質又はコレステロールの１つ又は複数に任意に関連する慢性的なアルコール摂取；ヘモクロマトーシスのうちの少なくとも１つと診断されており、又は肝障害を引き起こす医薬品を慢性的に使用しているか若しくは慢性的に使用していた。代謝障害及びＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨの診断基準が、以下に示される。特定の実施形態において、ＮＡＳＨを発症するリスクがある対象は、甲状腺機能低下症、閉塞性睡眠時無呼吸、下垂体機能低下症、性腺機能低下症、膵十二指腸切除、及び乾癬のうちの１つと診断されている。メタボリック・シンドローム及び様々なＮＡＦＬＤの診断基準は重複していることが理解される。特定の実施形態において、対象は、代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨの全診断基準を満たす。特定の実施形態において、対象は、慢性障害に関連するＨＭＧＢ１関連疾患に罹患している。ある実施形態において、対象は、ヒト女性である。他の実施形態において、対象は、ヒト男性である。
本明細書において使用される際、「処置する」又は「処置」という用語は、対象におけるＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨの少なくとも１つの兆候又は症状を軽減することなどの有益又は所望の結果を指す。「処置」は、処置をしない場合の予測される生存期間と比較した生存期間の延長も意味し得る。
対象におけるＨＭＧＢ１遺伝子発現のレベル又はＨＭＧＢ１タンパク質産生、又は疾病マーカー若しくは症状の文脈における「低下させる」という用語は、このようなレベルの統計的に有意な低下を指す。低下は、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％、又は関連する細胞又は組織、例えば、肝細胞、又は他の対象試料、例えば、尿、血液若しくはそれに由来する血清における検出方法のための検出レベル未満であり得る。低下は、タンパク質又はＲＮＡレベルの全身評価を必要としない。低下は、組織、例えば、肝臓に限定され得る。
本明細書において使用される際、「予防」又は「予防する」は、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現又はＨＭＧＢ１タンパク質の産生の低下から利益を得られ得る疾病、障害、又はその病態に関連して使用される場合、例えば、ＨＭＧＢ関連疾患、例えば、代謝障害、ＮＡＦＬＤ、又はＮＡＳＨを発症するリスクがある対象。特定の実施形態において、ＮＡＳＨを発症するリスクがある対象は、ＮＡＦＬＤ、甲状腺機能低下症、閉塞性睡眠時無呼吸、下垂体機能低下症、性腺機能低下症、膵十二指腸切除、又は乾癬と診断されている。代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨの発症、又はより重篤なＮＡＦＬＤへの進行、例えば、ＮＡＦＬからＮＡＳＨへの進行が、数ヶ月又は数年ないことは、有効な予防とみなされる。予防は、ｉＲＮＡ剤の２回以上の用量の投与を必要とし得る。
「治療有効量」又は「予防的に有効な量」はまた、任意の処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）である所望の局所又は全身的作用を生じる、ＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法に用いられるｉＲＮＡは、このような処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。
「薬学的に許容され得る」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット・リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、或いは他の問題又は合併症を伴わずに、ヒト対象及び動物対象の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、又は剤形を指すために本明細書において用いられる。
本明細書において使用される際の「薬学的に許容され得る担体」という語句は、身体の１つの器官、又は部分から、身体の別の器官、又は部分へと対象に化合物を運ぶ又は輸送するのに関与する、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸亜鉛、又はステアリン酸）、又は溶媒封入材料などの、薬学的に許容され得る材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、処置される対象に有害でないという意味で「許容でき」なければならない。薬学的に許容され得る担体は、注射による投与のための担体を含む。薬学的に許容され得る担体は、吸入による投与のための担体を含む。
薬学的に許容され得る担体として働き得る材料のいくつかの例としては：（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース、及びその誘導体；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）マグネシウムステート（ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの滑沢剤；（８）カカオ脂及び坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質除去蒸留水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート又はポリ無水物；（２２）ポリペプチド及びアミノ酸などの増量剤（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬなどの血清成分；並びに（２２）医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合する物質が挙げられる。
本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、並びに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、或いはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は、例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。ある実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる尿を指す。「対象に由来する試料」は、対象からの尿、血液、又は血液由来の血清若しくは血漿を指し得る。
Ｉ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡは、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、代謝障害、ＮＡＦＬＤ、又はＮＡＳＨを発症するリスクがある、対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物内の細胞などの細胞内でのＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡｉ剤は、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、又は１８ヌクレオチド長以下）である。ＨＭＧＢ１遺伝子を発現する細胞と接触すると、ｉＲＮＡは、例えば、ＰＣＲ若しくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づいた方法、又は例えば、ウエスタンブロット法若しくはフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによるタンパク質に基づいた方法によってアッセイした際に、少なくとも約３０％、好ましくは、少なくとも約５０％、ＨＭＧＢ１遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、又は鳥類のＨＭＧＢ１遺伝子）の発現を阻害する。好ましい実施形態において、発現の阻害は、本明細書に示される適切な生物細胞株中で１０ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡを用いて、実施例、特に実施例２に示されるｑＰＣＲ方法によって決定される。特定の実施形態において、インビボでの発現の阻害は、例えば、最低量（ｎａｄｉｒ）のＲＮＡ発現で３ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与される場合、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類、例えば、ヒト標的遺伝子を発現するマウス若しくはＡＡＶ感染マウスにおけるヒト遺伝子のノックダウンによって決定される。特定の実施形態において、発現の阻害は、標的遺伝子が疾病の兆候に応答して増加される適切な疾病モデル、例えば、最低量のＲＮＡ発現で３ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与される場合のマウスにおいて決定される。肝臓におけるＲＮＡ発現は、実施例２に示されるＰＣＲ方法を用いて決定される。特定の実施形態において、ＲＮＡ発現は、肝臓試料を用いて決定される。特定の実施形態において、ＲＮＡ発現は、例えば、Ｓｅｈｇａｌ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２０：１４３−１４９，２０１４；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．４：ｅ２６３，２０１５に示されるように、当該技術分野において公知の方法を用いて、血液又は尿試料に由来する小胞結合ＲＮＡにおいて決定される。
ｄｓＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を含み、この２本のＲＮＡ鎖は、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズする。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的な、一般に完全に相補的な、相補性の領域を含む。標的配列は、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２本の鎖がハイブリダイズして、好適な条件下が組み合わされた際に二本鎖構造を形成するようになっている。本明細書のどこかに記載されるように、及び当該技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく、１つの核酸分子の自己相補的な領域として含まれることもある。
一般に、二本鎖構造は、１５〜３０塩基対の長さ、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さである。特定の実施形態において、二本鎖の長さは、１９〜２１塩基対の長さである。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
同様に、標的配列に相補性の領域は、１５〜３０ヌクレオチド長、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、相補性の領域は、１９〜２１ヌクレオチド長である。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２３ヌクレオチド長、又は約２５〜約３０ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として働くのに十分に長い。例えば、約２１〜２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒのための基質として働き得ることが当該技術分野において周知である。当業者がやはり認識するように、切断のために標的化されたＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子であることが多い）の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性の切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）のための基質であるのが可能であるほど十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。
二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約９〜約３６塩基対、例えば、約１０〜３６、１１〜３６、１２〜３６、１３〜３６、１４〜３６、１５〜３６、９〜３５、１０〜３５、１１〜３５、１２〜３５、１３〜３５、１４〜３５、１５〜３５、９〜３４、１０〜３４、１１〜３４、１２〜３４、１３〜３４、１４〜３４、１５〜３４、９〜３３、１０〜３３、１１〜３３、１２〜３３、１３〜３３、１４〜３３、１５〜３３、９〜３２、１０〜３２、１１〜３２、１２〜３２、１３〜３２、１４〜３２、１５〜３２、９〜３１、１０〜３１、１１〜３１、１２〜３１、１３〜３２、１４〜３１、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の二本鎖領域であることも当業者は認識するであろう。ここで、一実施形態において、所望のＲＮＡを切断のために標的とする例えば１５〜３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる程度まで、ＲＮＡ分子又は３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然のｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中に生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１〜４、２〜４、１〜３、１、２、３、又は４つのヌクレオチドを更に含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の同等物と比べて優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのンチセンス鎖又はセンス鎖の５’末端、３’末端又は両方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭ，Ｉｎｃから市販されているものなど）の使用によって、更に後述されるように、当該技術分野において公知の標準的な方法によって合成され得る。
本発明の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、２工程の手順を用いて調製され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別個に調製される。次に、構成要素の鎖はアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。同様に、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。
一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列及びアンチセンス配列を含む。センス鎖は、表３及び５に示される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表３、５、６又は７のいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、表３、５、６又は７のいずれか１つのセンス鎖として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表３、５、６又は７のいずれか１つのセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として表される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。特定の実施形態において、表３、５、６、又は７のいずれか１つからのセンス又はアンチセンス鎖は、ＡＤ−２４５２８１、ＡＤ−２４５２８２、ＡＤ−２４５３０５、ＡＤ−２４５３３６、ＡＤ−２４５３３９、ＡＤ−２４５３８３、ＡＤ−２４５４７２、ＡＤ−１９３１７７、ＡＤ−１９３３１２、ＡＤ−１９３１６８、ＡＤ−１９３３１３、ＡＤ−１９３１８０、ＡＤ−１９３１８２、ＡＤ−１９３３１４、ＡＤ−１９３１７３、ＡＤ−１９３３１１、ＡＤ−１９３１７９、ＡＤ−１９３１７８、ＡＤ−１９３１７４、ＡＤ−１９３３１５、ＡＤ−１９３１７５、ＡＤ−１９３３２６、ＡＤ−１９３１７６、ＡＤ−１９３１８１、ＡＤ−８０６５１、又はＡＤ−８０６５２のセンス又はアンチセンス鎖から選択される。
表３中の配列は、修飾又はコンジュゲートされた配列として記載されていないが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、本発明のｄｓＲＮＡが、表３に記載の配列のいずれか１つ、又は修飾された表５、６、若しくは７のいずれか１つの配列、又はコンジュゲートされた表５、６、若しくは７のいずれか１つの配列を含み得ることが理解されるであろう。言い換えると、本発明は、本明細書に記載されるように、非修飾、非コンジュゲート、修飾された、又はコンジュゲートされた、表３、５、６、又は７のいずれか１つのｄｓＲＮＡを包含する。
当業者は、約２０〜２３個の塩基対、例えば、２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であることが認められたことを十分に認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ．，２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他の当業者が、より短い又はより長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを見出した（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４−１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２−２２６）。上記の実施形態において、表３、５、６又は７のいずれか１つに示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小限の２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。一端又は両端におけるごくわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表３、５、６又は７のいずれか１つの配列のうちの１つを有するより短い二本鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることが当然予測され得る。したがって、表３、５、６又は７のいずれか１つの配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれを超える連続するヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する能力が、完全な配列を有するｄｓＲＮＡとは約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害だけ異なるｄｓＲＮＡが、本発明の範囲内にあるものと考えられる。
更に、表３、５、６又は７のいずれか１つに示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣを介した切断を受けやすい、ＨＭＧＢ１転写物における部位を特定する。したがって、本発明は、これらの部位の１つ内を標的とするｉＲＮＡを更に特徴とする。本明細書において使用される際、ｉＲＮＡが、その特定の部位内のいずれかの箇所で転写物の切断を促す場合、ｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とするとされている。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＨＭＧＢ１遺伝子中の選択された配列に隣接する領域から取られた更なるヌクレオチド配列に連結される、表２、３、７、８、９及び１０に示される配列のうちの１つからの少なくとも約１５連続ヌクレオチドを含むであろう。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つ又は複数のミスマッチを含み得る。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性の領域の中心に位置しないのが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチが、相補性の領域の５’末端又は３’末端のいずれかからの最後の５ヌクレオチド内に制限されるのが好ましい。例えば、２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤について、ＨＭＧＢ１遺伝子の領域に相補的な鎖は、一般に、中央の１３個のヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載される方法又は当該技術分野において公知の方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むｉＲＮＡがＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する際のミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、ＨＭＧＢ１遺伝子における相補性の特定の領域が集団内に多型配列変異を有することが分かっている場合に重要である。
ＩＩ．本発明の修飾されたｉＲＮＡ
特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、非修飾であり、例えば、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される化学修飾又はコンジュゲーションを含まない。他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性又は他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。本発明の特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される。本発明の他の実施形態において、ｉＲＮＡのヌクレオチドの全て又はｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾され、すなわち、５、４、３、２、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドが、ｉＲＮＡの鎖中に存在する。
本発明に取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ））又は３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去（非塩基性ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位又は４’位で）又は糖の置換；又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾されたＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾されたｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及び、隣接するヌクレオシド単位の対が、３’−５’〜５’−３’又は２’−５’ 〜５’−２’に結合する、反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。本発明のある実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、遊離酸形態である。本発明の他の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、塩形態である。一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、ナトリウム塩形態である。特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤が、ナトリウム塩形態である場合、ナトリウムイオンは、剤中に存在するホスホジエステル又はホスホロチオエート基の実質的に全てに対する対イオンとして剤中に存在する。ホスホジエステル又はホスホロチオエート結合の実質的に全てが、ナトリウム対イオンを有する剤は、ナトリウム対イオンを有さない５、４、３、２、又は１つ以下のホスホジエステル又はホスホロチオエート結合を含む。ある実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤が、ナトリウム塩形態である場合、ナトリウムイオンは、剤中に存在するホスホジエステル又はホスホロチオエート基の全てに対する対イオンとして剤中に存在する。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６，２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有するその他、が挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７；及び同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
好適なＲＮＡ模倣体が、本明細書で提供されるｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合された。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；５，７１４，３３１号明細書；及び５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。
本発明に取り上げられるある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上述した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−及び−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、及び上述した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施形態において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上述した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾されたＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；或いはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中、ｎ及びｍが、１〜約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、又はｉＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。ある実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。更なる例示的な修飾としては、５’−Ｍｅ−２’−Ｆヌクレオチド、５’−Ｍｅ−２’−ＯＭｅヌクレオチド、５’−Ｍｅ−２’−デオキシヌクレオチド、（これらの３つのファミリーのＲ及びＳ異性体の両方）；２’−アルコキシアルキル；及び２’−ＮＭＡ（Ｎ−メチルアセトアミド）が挙げられる。
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡは、核酸塩基（当技術分野にて多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、デオキシ−チミン（ｄＴ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−ダアザアデニン（ｄａａｚａｇｕａｎｉｎ）、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換基が、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。
上記の修飾された核酸塩基並びに他の修飾された核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９４，１２１号明細書、同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第６，０１５，８８６号明細書；同第６，１４７，２００号明細書；同第６，１６６，１９７号明細書；同第６，２２２，０２５号明細書；同第６，２３５，８８７号明細書；同第６，３８０，３６８号明細書；同第６，５２８，６４０号明細書；同第６，６３９，０６２号明細書；同第６，６１７，４３８号明細書；同第７，０４５，６１０号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；及び同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。この構造は、３’−ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５−３１９３）。
ある実施形態において、ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２個の原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２個の炭素原子を結合し、それによって、二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は、糖環の４’−炭素及び２’−炭素を結合する。したがって、ある実施形態において、本発明の剤は、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えると、ＬＮＡは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’−ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５−３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’及び２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤としては、４’−２’架橋を含む１つ又は複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような４’−２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」とも呼ばれる）及び４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（ここで、Ｒが、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである）、又は保護基（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照）；及び４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ロックト核酸ヌクレオチドの調製を教示する更なる代表的な米国特許及び米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，５２５，１９１号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；同第７，３９９，８４５号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；同第７，５６９，６８６号明細書；同第７，７４１，４５７号明細書；同第８，０２２，１９３号明細書；同第８，０３０，４６７号明細書；同第８，２７８，４２５号明細書；同第８，２７８，４２６号明細書；同第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；及び米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
例えば、α−Ｌ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ又は複数の立体化学的糖配置を有する上記の二環式ヌクレオシドのいずれかが調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書において使用される際、「拘束エチルヌクレオチド」又は「ｃＥｔ」は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックト核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「Ｓ−ｃＥｔ」と呼ばれるＳ立体配置にある。
本発明のｉＲＮＡは、１つ又は複数の「立体配座的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’及びＣ４’炭素又はリボースのＣ３及びＣ５’炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定した立体配置へと固定し、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高める。リンカーは、酸素を安定性及び親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さを有し、リボース環の歪み（ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を少なくする。
上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な公報としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；及びＰＣＴ公報の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（非固定（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸）ヌクレオチドである１つ又は複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、非固定非環状核酸であり、糖の結合のいずれかが、除去されており、非固定「糖」残基を形成する。一例において、ＵＮＡは、Ｃ１’−Ｃ４’の間の結合が除去されたモノマーも包含する（すなわち、Ｃ１’及びＣ４’炭素の間の共有炭素−酸素−炭素結合）。別の例において、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’及びＣ３’炭素の間の共有炭素−炭素結合）が除去されている（参照により本明細書に援用される、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３−１３４（２００８）及びＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照）。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；及び米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；同第２０１３／００１１９２２号明細書；及び同第２０１１／０３１３０２０号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−ホスフェート、逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾としては、５’ホスフェート又は５’ホスフェート模倣体、例えば、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖上の５’末端ホスフェート又はホスフェート模倣体が挙げられる。好適なホスフェート模倣体が、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書に開示され、その全内容が、参照により本明細書に援用される。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤としては、例えば、それぞれ全内容が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットに開示される化学修飾を有する剤が挙げられる。国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットは、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖中、特に、切断部位又はその近傍に提供する。ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、或いは完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入により、存在する場合、センス又はアンチセンス鎖の修飾パターンが中断される。ｄｓＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖上で、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと任意にコンジュゲートされ得る。
より詳細には、二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、ｄｓＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを有するように完全に修飾される場合、ｄｓＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が観察された。
したがって、本発明は、インビボでの標的遺伝子（すなわち、ＨＭＧＢ１遺伝子）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、独立して、１２〜３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、各鎖は、独立して、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、又は２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書において「ｄｓＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２〜３０ヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２７〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、又は２１〜２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例において、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７ヌクレオチド長から選択される。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１つ又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端において１つ又は複数のオーバーハング領域又はキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、独立して、１〜６ヌクレオチド長、例えば２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、又は１〜２ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、オーバーハング領域は、上に示される伸長されたオーバーハング領域を含み得る。オーバーハングは、１つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、又は同じ長さの２つの鎖が互い違いになっている結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。第１及び第２の鎖がまた、例えば、ヘアピンを形成するように更なる塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって結合され得る。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、限定はされないが、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらの任意の組合せなどの２’−糖修飾を含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖における５’−又は３’−オーバーハングは、リン酸化され得る。ある実施形態において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。ある実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に存在する。ある実施形態において、この３’−オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。ある実施形態において、この３’−オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
ｄｓＲＮＡｉ剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る、１つのみのオーバーハングを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、或いは、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に制約されるのを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に作用する。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７、８、９位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８、９、１０位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
更に他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖及び２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、２ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。
２つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、３つのうちの２つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。特定の実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’−Ｏ−メチル又は３’−フルオロで修飾される。任意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）を更に含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）を起点として、第１の鎖の１〜２３位が、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドを起点として、センス鎖の１〜２３位と対合される位置において少なくとも８つのリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、最大で６連続の３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、それによって、１〜６つのヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合されない１０〜３０連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０〜３０個のヌクレオチド一本鎖５’オーバーハングを形成し；少なくともセンス鎖５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス及びアンチセンス鎖が最大の相補性のために整列される場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合される塩基であり、それによって、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖の領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９個のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフのうちの少なくとも１つが、切断部位又はその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス及びアンチセンス鎖を含み、ｄｓＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５且つ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、３０ヌクレオチド長以下を有する第２の鎖とを含み；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３’末端で第１の鎖より１〜４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２の鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ｄｓＲＮＡｉ剤のダイサー切断（Ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それによって、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンドを更に含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。
１７〜２３ヌクレオチド長、例えば、１７〜２３塩基対長の二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０、１１、及び１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端の１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又はアンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；又は１３、１４、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖の切断部位はまた、５’末端からのｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖及びアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、センス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフ及びアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、すなわち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。或いは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、又は全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位又はその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位又はその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、又は少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じか又は異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位又はその近傍の第１のモチーフに対して１つの端部に又はリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つ又は複数のウイング修飾を含み得る。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端に第１の１つ又は２つの末端ヌクレオチドを含まない。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つ又は２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つ、又は３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つ、又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。
ある実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素又は結合リン酸酸素の１つ又は複数の一方又は両方の１つ又は複数の改変；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’−ヒドロキシルの改変；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾又は置換；及びリボース−リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。
核酸が、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’末端又は５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよく、又はＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端又は両方の末端が、リン酸化され得る。
例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、又は一本鎖オーバーハング、例えば、５’−又は３’−オーバーハング、又はその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある実施形態において、３’−又は５’−オーバーハング中の塩基の全て又は一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）又は２’−Ｏ−メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
ある実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾、又は他のものであり得る。
特定の実施形態において、Ｎａ又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。本明細書において使用される際の「交互のモチーフ」という用語は、１つ又は複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ又は３つおきのヌクレオチドに１つ、又は同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ、及びＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、すなわち、１つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖又はアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」又は「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
ある実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」から開始され得る。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な又は部分的なシフトが存在する。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを最初に有し、すなわち、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’−Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’−Ｏ−メチル修飾から開始してもよい。
センス鎖又はアンチセンス鎖への、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフの導入は、センス鎖又はアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖又はアンチセンス鎖に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを導入することによる、センス鎖又はアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を高め得る。
ある実施形態において、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」及び「Ｎｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドに対する修飾を表し、Ｎａ及びＮｂは、同じか又は異なる修飾であり得る。或いは、Ｎａ又はＮｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在していても又は存在していなくてもよい。
ｉＲＮＡは、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じか又は異なっていてもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端又は３’末端のいずれかにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも２、３、４つ、又は全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意に、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、又はアンチセンス鎖の５’末端にあり得る。
ある実施形態において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、又はそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解を促進する傾向に基づいて評価され得る（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに基づいて評価され、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る）。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃ；Ｇより好ましく：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２、３、４、又は５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、及び二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴから選択される。或いは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２、又は３つの塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
他の実施形態において、センス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ−チミン（ｄＴ）であり、又はアンチセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ−チミン（ｄＴ）である。例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端において、デオキシ−チミンヌクレオチドの短い配列、例えば、２つのｄＴヌクレオチドが存在する。
特定の実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉ）
（式中：
ｉ及びｊがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ及びｑがそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａが、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂが、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ及びＹが、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、及びＺＺＺがそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。好ましくは、ＹＹＹは、全て２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
ある実施形態において、Ｎａ又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。
ある実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在し得る（例えば：６、７、８；７、８、９；８、９、１０；９、１０、１１；１０、１１，１２；又は１１、１２、１３位に存在し得る）。
一実施形態において、ｉが１であり、ｊが０であり、又はｉが０であり、ｊが１であり、又はｉ及びｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｃ）；又は
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｄ）。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは、独立して、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、又は６である。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、Ｙ及びＺのそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
他の実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉａ）。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎ’ａ−ｎｐ’３’（ＩＩ）
（式中：
ｋ及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ’及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’及びＹ’が、同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。
ある実施形態において、Ｎａ’又はＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９、１０、１１；１０、１１、１２；１１、１２、１３；１２、１３、１４；又は１３、１４、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位に存在する。
特定の実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、ｋが１であり、ｌが０であり、又はｋが０であり、ｌが１であり、又はｋ及びｌの両方が１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；又は
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｄ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎｂ ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、又は６である。
他の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’３’（Ｉａ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’及びＺ’のそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’、及びＺ’は、特に、２’−Ｏ−メチル修飾又は２’−フルオロ修飾を表し得る。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔである場合、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９、１０、及び１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでいてもよく；Ｙは、２’−Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフ又はＺＺＺモチーフを更に含んでいてもよく；ＸＸＸ及びＺＺＺはそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
ある実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１、１２、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでいてもよく；Ｙ’は、２’−Ｏ−メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフ又はＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを更に含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、及び（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
したがって、本発明の方法に使用するためのｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４〜３０のヌクレオチドを有し、ｉＲＮＡ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ ’−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ及びＮａ ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
一実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり；又はｉが１であり、ｊが０であり；又はｉが０であり、ｊが１であり；又はｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。別の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり；又はｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であり；又はｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。
ｉＲＮＡ二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式を含む：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ ’−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｄ）
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立して、１〜１０、１〜７、１〜５、又は１〜４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、及びＮｂ ’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）中のＸ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、互いに同じか又は異なり得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＹヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＺヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）又は（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＸヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
特定の実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、又はＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾である。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。更に他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる（以下に記載）。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意に、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される３、４、５、６つ、又はそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意に、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）の少なくとも１つによって表される２つのｄｓＲＮＡｉ剤は、５’末端、及び３’末端の一方又は両方において互いに結合され、任意に、リガンドにコンジュゲートされる。この剤のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又はこの剤のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含む少数のヌクレオチド、例えば、２’−フルオロ修飾を有する１０以下のヌクレオチドを含み得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０のヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する１０のヌクレオチド、例えば、センス鎖における２’−フルオロ修飾を有する４つのヌクレオチド及びアンチセンス鎖における２’−フルオロ修飾を有する６つのヌクレオチドを含む。別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する６つのヌクレオチド、例えば、センス鎖における２’−フルオロ修飾を有する４つのヌクレオチド及びアンチセンス鎖における２’−フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチドを含む。
他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含むごく少数のヌクレオチド、例えば、２’−フルオロ修飾を含む２つ以下のヌクレオチドを含み得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する２、１又は０のヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチド、例えば、センス鎖における２−フルオロ修飾を有する０のヌクレオチド及びアンチセンス鎖における２’−フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチドを含み得る。
様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体ｉＲＮＡが記載されている。このような刊行物としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７，８５８，７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット、及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
以下により詳細に説明されるように、ｉＲＮＡに対する１つ又は複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含むｉＲＮＡは、ｉＲＮＡの１つ又は複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ｉＲＮＡの修飾サブユニットに結合される。例えば、ｉＲＮＡの１つ又は複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは環状の）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、すなわち、全ての環原子が、炭素原子であり、又は複素環系、すなわち、１つ又は複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、又は２つ以上の環、例えば縮合環を含み得る。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、又は１つ又は複数の二重結合を含み得る。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは、２つの「骨格結合点」及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー結合点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書において使用される際の「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、ホスフェート、又は修飾ホスフェート、例えば、硫黄を含有する、リボ核酸の骨格中への担体の組み込みに利用可能であり、且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」（ＴＡＰ）は、ある実施形態において、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子と異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり得る。任意に、選択された部分は、介在するテザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、又は一般に、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込み又は連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を提供する。
ｉＲＮＡは、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基又は非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル（ｐｙｒｉｄａｚｉｎｏｎｙｌ）、テトラヒドロフリル、及びデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格である。
本発明の別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。ＲＮＡｉ剤は、式（Ｌ）：
Figure 2021508491
 （Ｌ）
によって表され得、
式（Ｌ）中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドである。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、２’−ＯＭｅ修飾を含む。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆ修飾を含む。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’の少なくとも１つが、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を含む。
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域の反対側に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位に）配置された熱的に不安定なヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位においてヌクレオチドと対合するセンス鎖の位置にある。一例において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、非塩基性修飾；二本鎖における反対のヌクレオチドとのミスマッチ；及び２’−デオキシ修飾などの糖修飾又は非環状ヌクレオチド、例えば、非固定核酸（ＵＮＡ）又はグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み得る熱的に不安定な修飾を有する。一実施形態において、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖における反対のヌクレオチドとのミスマッチ；ｉｉ）以下からなる群から選択される非塩基性修飾：
Figure 2021508491
 ；及びｉｉｉ）以下からなる群から選択される糖修飾：
Figure 2021508491
 からなる群から選択される熱的に不安定な修飾を有し、式中、Ｂが、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２が、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、又はアルキルであり；Ｒ３が、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である。一実施形態において、Ｃ１における熱的に不安定な修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、及びＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；任意に、ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基は、２’−デオキシ核酸塩基である。一例において、Ｃ１における熱的に不安定な修飾は、ＧＮＡ又は
Figure 2021508491
 である。
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’はそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さより小さいか又は等しい立体的嵩高さをヌクレオチドに与える修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的嵩高さは、修飾の立体効果の総和を指す。ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定するための方法は、当業者に公知である。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位にあるか、又は非リボースヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、又はリボース糖の２’位と同様若しくは同等のヌクレオチドの骨格に対する修飾であり得、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さより小さいか又は等しい立体的嵩高さをヌクレオチドに与える。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’はそれぞれ、独立して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルから選択される。一実施形態において、Ｔ１はＤＮＡである。一実施形態において、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡである。一実施形態において、Ｔ２’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。一実施形態において、Ｔ３’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
ｎ１、ｎ３、及びｑ１は、独立して、４〜１５ヌクレオチド長である。
ｎ５、ｑ３、及びｑ７は、独立して、１〜６ヌクレオチド長である。
ｎ４、ｑ２、及びｑ６は、独立して、１〜３ヌクレオチド長であり；或いは、ｎ４は０である。
ｑ５は、独立して、０〜１０ヌクレオチド長である。
ｎ２及びｑ４は、独立して、０〜３ヌクレオチド長である。
或いは、ｎ４は、０〜３ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ｎ４は０であり得る。一例において、ｎ４は０であり、ｑ２及びｑ６は１である。別の例において、ｎ４は０であり、ｑ２及びｑ６は１であり、（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、ｎ４、ｑ２、及びｑ６はそれぞれ、１である。
一実施形態において、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、及びｑ６はそれぞれ、１である。
一実施形態において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４〜１７位にあり、ｎ４は１である。一実施形態において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。
一実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始する。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１に等しい。
一実施形態において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一例において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１に等しい。
例示的な実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、ｑ６は１に等しく、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始し、ｑ２は１に等しい。
一実施形態において、Ｔ１’及びＴ３’は、１１ヌクレオチド長だけ隔てられる（すなわち、Ｔ１’及びＴ３’ヌクレオチドを数えない）。
一実施形態において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一例において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１に等しく、修飾は、２’位又は２’−ＯＭｅリボースより少ない立体的嵩高さを与える非リボース、非環状若しくは骨格における位置にある。
一実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１に等しく、修飾は、２’位又は２’−ＯＭｅリボースより少ないか又は等しい立体的嵩高さを与える非リボース、非環状又は骨格における位置にある。
一実施形態において、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位にあり、ｎ２は１である。例示的な実施形態において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位の、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１である。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６位から開始する。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６〜１０位にあり、ｑ４は１である。
例示的な実施形態において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、例えば、センス鎖の５’末端から１１位の、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１であり；Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１に等しく、Ｔ１’に対する修飾は、リボース糖の２’位にあるか又は２’−ＯＭｅリボースより少ない立体的嵩高さを与える非リボース、非環状若しくは骨格における位置にあり；Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６〜１０位にあり、ｑ４は１であり；Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１に等しく、Ｔ３’に対する修飾は、２’位にあるか又は２’−ＯＭｅリボースより少ないか又は等しい立体的嵩高さを与える非リボース、非環状又は骨格における位置にある。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位から開始する。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位から開始し、ｑ４は２である。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位から開始する。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位にあり、ｑ４は１である。
一実施形態において、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意に、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの更なるＴＴを有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意に、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの更なるＴＴを有し；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端ホスフェート（５’−Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’−ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’−ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、又は５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル
Figure 2021508491
 であり得る。５’末端リン含有基が、５’末端ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）である場合、５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ異性体（すなわち、トランス−ビニルホスフェート、
Figure 2021508491
 ）、５’−Ｚ−ＶＰ異性体（すなわち、シス−ビニルホスフェート、
Figure 2021508491
 ）、又はそれらの混合物のいずれかであり得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端にリン含有基を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’−Ｐを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’−ＰＳを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’−ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’−Ｅ−ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’−Ｚ−ＶＰを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’−ＰＳ２を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルを含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡｉ ＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せ）、及び標的化リガンドも含む。
一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組合せ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８〜２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９〜１１、１３、１７、１９、及び２１位における２’−Ｆ修飾、並びに２、４、６、８、１２、１４〜１６、１８、及び２０位における２’−ＯＭｅ修飾を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、９、１１〜１３、１５、１７、１９、２１、及び２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、４、６〜８、１０、１４、１６、１８、２０、及び２２位における２’Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９〜１１、１３、１５、１７、１９位における２’−Ｆ修飾、及び２１、並びに２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、及び２０位における２’−ＯＭｅ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９、１１〜１３、１５、１７、１９、及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、及び２０位における２’Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１〜６、８、１０、及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、７、及び９位における２’−Ｆ修飾、並びに１１位におけるデオキシ−ヌクレオチド（例えばｄＴ）；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、４〜６、８、１０、１２、１４、１６、及び１８位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜６、８、１０、１２、１４、及び１６〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに７、９、１１、１３、及び１５位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜９、及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに１０、及び１１位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９、１１〜１３、１５、１７、１９、及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、及び２０位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９〜１１、及び１３位における２’−Ｆ修飾、並びに２、４、６、８、１２、及び１４〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５〜７、９、１１〜１３、１５、１７〜１９、及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、４、８、１０、１４、１６、及び２０位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、２、４、６、８、１２、１４、１５、１７、及び１９〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに３、５、７、９〜１１、１３、１６、及び１８位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、４、６、７、９、１１〜１３、１５、１７、及び１９〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、２、３、５、８、１０、１４、１６、及び１８位における２’−Ｆ修飾、並びに２４及び２５位におけるデオキシ−ヌクレオチド（例えばｄＴ）；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に４つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜６、８、及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに７、及び９〜１１位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３〜５、７、８、１０〜１３、１５、及び１７〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、６、９、１４、及び１６位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜６、８、及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに７、及び９〜１１位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３〜５、７、１０〜１３、１５、及び１７〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、６、８、９、１４、及び１６位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）１９ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜４、６、及び１０〜１９位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに５、及び７〜９位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３〜５、７、１０〜１３、１５、及び１７〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、並びに２、６、８、９、１４、及び１６位における２’−Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド１９位と２０位との間、及びヌクレオチド２０位と２１位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
特定の実施形態において、本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡは、表３、５、６、又は７のいずれか１つに列挙される薬剤から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドを更に含み得る。
ＩＩＩ．リガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、例えば細胞中への、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数のリガンド、部分又はコンジュゲートをｉＲＮＡに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分などの脂質部分が挙げられる（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）。他の実施形態において、リガンドは、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）である。
特定の実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドのない種と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞又は細胞型）、区画（例えば、細胞又は器官の区画）、身体の組織、器官又は領域に対する向上した親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合に関与しない。
リガンドは、タンパク質などの天然の物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はヒアルロン酸）；又は脂質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの、組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、又はＲＧＤペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態において、リガンドは、多価ガラクトース、例えば、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンである。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）、アクリジン−イミダゾール複合体、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）、又は抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、又は多価フコースなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、又は中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されたリガンドは、薬物動態学的調節剤（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（ＰＫ調節剤）として働く。ＰＫ調節剤としては、親油性物質（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンド（例えばＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。更に、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに好適である。
本発明のリガンドコンジュゲートｉＲＮＡは、オリゴヌクレオチドへの結合分子の結合から誘導されるものなどの反応性のペンダント官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る（後述される）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、又は結合部分が結合されたリガンドと直接反応されてもよい。
本発明のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に及び日常的に作製され得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の方法が、それに加えて又はその代わりに用いられてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも公知である。
本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンドコンジュゲートｉＲＮＡ及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体、或いは結合部分を既に有するヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、或いは非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、好適なＤＮＡ合成装置において組み立てられ得る。
結合部分を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いる場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が、通常、完了されてから、リガンド分子が、結合部分と反応されて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが形成される。ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に通例使用される市販の、標準的なホスホラミダイト及び非標準的なホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されるホスホラミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質コンジュゲート
特定の実施形態において、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。
脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。
特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。
他の実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミン或いは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＳＡ及び低比重リポタンパク（ＬＤＬ）も含まれる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤（ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔ又はアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びＤ−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα−へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチド及びペプチド模倣薬の結合は、細胞認識及び吸収を向上させることなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を与え得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。
ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１４）も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１５）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１６）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４、１９９１）。細胞標的化の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、又はＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。
本発明の組成物及び方法に使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状又は環状であってもよく、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾されていてもよく、例えば、グリコシル化又はメチル化されていてもよい。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、Ｄ−アミノ酸、並びに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１又はＶＥＧＦを標的とする。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、或いはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−へリックス直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７又はＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン又はバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、又は１つ若しくは２つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９又はインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のある実施形態において、ｉＲＮＡは、炭水化物を更に含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載するように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書で使用される「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；又はその一部として、１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、該単糖単位の各々が少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物には、糖（単糖、二糖、三糖、及び、約４、５、６、７、８、又は９単糖単位を含むオリゴ糖）、並びに澱粉、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖には、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）の糖が挙げられ；二及び三糖には、２つ又は３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７又はＣ８）を有する糖が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。
一実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、
Figure 2021508491
Figure 2021508491
Figure 2021508491
Figure 2021508491
Figure 2021508491
 （式中、Ｙが、Ｏ又はＳであり、ｎが３〜６である）（式ＸＸＩＶ）；
Figure 2021508491
 （式中、Ｙが、Ｏ又はＳであり、ｎが、３〜６である）（式ＸＸＶ）；
Figure 2021508491
 （式中、Ｘが、Ｏ又はＳである）（式ＸＸＶＩＩ）；
Figure 2021508491
Figure 2021508491
 からなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態において、単糖は、
Figure 2021508491
 などのＮ−アセチルガラクトサミンである。
本明細書に記載される実施形態に使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、限定はされないが、
Figure 2021508491
 が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
本発明の特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。ある実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。本発明の更に他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。
一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’末端、又は本明細書に記載される二重標的化ＲＮＡｉ剤の一方若しくは両方のセンス鎖の５’末端に結合された１つのＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、それぞれが独立して、複数の一価のリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合された、複数（例えば、２、３、４、５、又は６つ）のＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
ある実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された１つのより大きい分子の一部である場合、ヘアピンループ内の各不対ヌクレオチドは、独立して、一価のリンカーを介して結合されたＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。
ある実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、限定はされないが、ＰＫ調節剤又は細胞透過性ペプチドなどの上述したような１つ又は複数の更なるリガンドを更に含む。
本発明における使用に好適な更なる炭水化物コンジュゲート及びリンカーとしては、それぞれの全内容が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット及び国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は非切断可能であってもよい様々なリンカーを用いて、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。
用語「リンカー」又は「結合基」は、化合物の２つの部分を接続し、例えば化合物の２つの部分を共有結合させる有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合、又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、又は、非限定的に置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）アリール（１つ又は複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、又は置換又は非置換のヘテロ環状により中断又は終結されてもよい）などの原子の鎖を含み；ここでＲ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換された脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４、３〜２４、４〜２４、５〜２４、６〜２４、６〜１８、７〜１８、８〜１８、７〜１７、８〜１７、６〜１６、７〜１７、又は８〜１６個の原子からなる。
切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を解放するものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、標的細胞内又は第一の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下で、対象の血液中又は第二の参照条件（例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下の少なくとも約１０倍、２０、倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又はそれを超える、又は少なくとも１００倍速く切断される。
結合可能な結合基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清又は血液中と比較して細胞内部に広く存在し、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。そのような分解剤の例には：例えば細胞内に存在する酸化若しくは還元酵素、又は、還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できる、メルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択され又は基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を形成可能な、例えば５以下のｐＨをもたらす薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な結合基を加水分解又は分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４である一方、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは５．５〜６．０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５．０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドから陽イオン性脂質を放出し、又は細胞の所望の区画内へ放出するであろう。
リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含んでもよい。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、陽イオン性脂質に結合されてもよい。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞タイプ内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞タイプには、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などの、ペプチダーゼに富んだ細胞タイプを標的とする際に使用することができる。
一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤（又は分解条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、又は他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補結合基が切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。それ故、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内又は生体液、例えば血液又は血清中での切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内若しくは組織培養物中、又は全動物内で行うことができる。無細胞又は培養物条件内で最初の評価を行い、動物内での更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍速く切断される。
ｉ．切断可能なレドックス結合基
特定の実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定のターゲティング剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載した方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、又は当技術分野にて既知の試薬を使用した他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察されるであろう切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価し得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で多くて約１０％切断される。別の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能な結合基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、及び−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｉｉｉ．酸切断可能な結合基
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、又はそれ未満）のｐＨを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの、特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、非限定的にヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は−ＯＣ（Ｏ）を有してもよい。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはｔ−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｉｖ．エステルベースの切断可能な結合基
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、非限定的にアルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｖ．ペプチドベースの切断可能な結合基
更なる別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基の例は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物及び方法のリンカーとのｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、限定はされないが、
Figure 2021508491
Figure 2021508491
Figure 2021508491
 が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
本発明の組成物及び方法の特定の実施形態において、リガンドは、二価及び三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＬＶ）〜（ＸＬＶＩ）：
Figure 2021508491
 のいずれかに示される構造の群から選択される二価及び三価の分枝鎖状リンカーにコンジュゲートされ、
式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、０〜２０を表し、繰返し単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１つ又は複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終端されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021508491
 又はヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、リガンドを表し；すなわち、それぞれ、出現するごとに独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒａが、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、式（ＸＬＩＸ）：
Figure 2021508491
 のものなどの、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤とともに使用するのに特に有用であり、式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝状結合基の例には、非限定的に、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、及びＸＩＩＩとして上記に引用した構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な特許には、非限定的に米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書，米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３，５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８；５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書；及び米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられ、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中に又は更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
本発明の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物又は「キメラ」は、ｉＲＮＡ化合物、好ましくは、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｄｓＲＮＡｉ剤である。これらのｉＲＮＡは、通常、少なくとも１つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、又は標的核酸に対する結合親和性の増加をｉＲＮＡに与えるように修飾される。ｉＲＮＡの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質として働き得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大幅に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡによって同等の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、及び必要に応じて、当該技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通例検出され得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させるためにｉＲＮＡに結合されており、このような結合を行うための手順は、科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分は、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分を含んでいた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的な結合プロトコルは、配列の１つ又は複数に位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング剤又は活性化試薬を用いて、アミノ基を結合された分子と反応させる。結合反応は、固体担体に依然として結合されたＲＮＡを用いて、又は溶液相中のＲＮＡの切断の後に行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。
ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象（例えば、代謝障害、例えば血糖コントロール不良を発症するリスクがあるか又は代謝障害、例えば血糖コントロール不良と診断された対象などの、それを必要とする対象）などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。或いは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。
一般に、核酸分子を（インビトロ又はインビボで）送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４及び国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照）。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入又は移植によって、或いは製剤を局所的に投与することによって、最小限に抑えられ得る。処置部位への局所投与は、剤の局所濃度を最大にし、剤によって悪影響を受け得るか又は剤を分解し得る、全身組織への剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子の総投与量を少なくすることができる。いくつかの研究が、ｄａＲＮＡｉ剤が局所投与される場合の遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルの硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２−１３８）及びマウスの網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）は両方とも、加齢性黄斑変性症の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。更に、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与が腫瘍容積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、担癌マウスの生存を延長することができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａ．ｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）及び鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）による成功も示している。感染の防止のためにｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡは、修飾され得るか、或いは薬剤送達システムを用いて送達され得；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐ働きをする。ＲＮＡ又は医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡの標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与し、肝臓及び空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを得た（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲートは、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を仲介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、又はカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜における相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、又はポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、又はｉＲＮＡを包む小胞又はミセル（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１１６を参照）を形成するように誘導され得る。小胞又はミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、上記参照；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）、上記を参照）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。ある実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法及びｉＲＮＡｓ及びシクロデキストリンの医薬組成物が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出され得る。
Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
ＨＭＧＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らのＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレット、ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１４号パンフレット、及び米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照）。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的（およそ数時間から数週間）であるか又は持続され得る（数週間から数カ月又はそれ以上）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｉＲＮＡの個々の１つ又は複数の鎖は、発現ベクターにおけるプロモーターから転写され得る。２本の別個の鎖が発現されて、例えば、ｄｓＲＮＡを生成する場合、２つの別個の発現ベクターが、（例えば、トランスフェクション又は感染によって）標的細胞中に共導入され得る。或いは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖が、同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ステム・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。通常、所望の核酸セグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から移植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などによる全身送達であり得る。
本明細書に記載される方法及び組成物とともに用いられ得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）、例えば、ワクシニアウイルスベクター又は鳥ポックス、例えばカナリア痘又は鶏痘などのポックスウイルスベクター；及び（ｊ）ヘルパー依存性又は弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれないであろう。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。或いは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクター及び構築物について考慮される他の態様は、当該技術分野で知られている。
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物及び製剤も含む。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が本明細書に提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨを予防又は処置するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口送達を介した、例えば、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、又は静脈内（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化された組成物である。本発明の医薬組成物は、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。
本発明の医薬組成物は、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、一日当たりレシピエントのキログラム体重当たり約０．００１〜約２００．０ミリグラムの範囲、一般に、一日当たりキログラム体重当たり約１〜５０ｍｇの範囲であろう。典型的に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．３ｍｇ／ｋｇ及び約３．０ｍｇ／ｋｇであろう。反復投与計画は、毎月、３〜６ヶ月に１回、又は年に１回など、定期的な、治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、月に約１回から６ヶ月に約１回投与される。
最初の治療計画の後、治療は、より低い頻度で投与され得る。治療の期間は、疾病の重症度に基づいて決定され得る。
他の実施形態において、医薬組成物の単回投与は、長続きすることができるため、用量は、１、２、３、又は４ヶ月以下の間隔で投与される。本発明のある実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、月に約１回投与される。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、四半期ごと（すなわち、約３ヶ月ごと）に投与される。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、年に２回（すなわち、６ヶ月に約１回）投与される。
当業者は、対象に存在する突然変異、以前の治療、対象の全体的な健康又は年齢、及び存在する他の疾病を含むがこれらに限定されないいくつかの要因が、対象を有効に処置するのに必要とされる投与量及び時間に影響を与え得ることを理解するであろう。更に、必要に応じて、予防的又は治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。
本発明の医薬組成物は、局所的又は全身的処置が必要かどうか及び処置される部位に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所投与（例えば、経皮パッチによる）、例えば、噴霧器などによる、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による経肺投与；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口又は非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与；又は例えば、実質内、髄腔内若しくは脳室内投与による頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、特定の組織（例えば、肝細胞）を標的とするように送達され得る。
局所又は経皮投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり、又は所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入されることができ、又はリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成することができる。代替的に、ｉＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸及びエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。
経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤、又は水若しくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、所望され得る。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種又は複数種の透過促進剤界面活性剤及びキレート剤と共に投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸若しくはエステル又はその塩、胆汁酸又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはモノグリセリド、ジグリセリド、又はこれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、又はマイクロ若しくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達され得る。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤、及びそれらの製剤は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書及び米国特許第６，７４７，０１４号明細書に記載されている。
非経口、実質内（脳内へ）、くも膜下腔内、脳室内又は肝内投与用の組成物及び製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、該無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤、並びに、非限定的に浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤などの他の好適な添加剤も含み得る。
本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に予め形成された液剤、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成され得る。製剤としては、肝臓を標的とするものが挙げられる。
単位剤形にて都合よく存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉化固体担体又は両方と均一且つ親密に関連させた後、必要であれば、製品を成形することにより調製される。
本発明の組成物は、非限定的に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬、及び浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水性縣濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液はまた、安定剤を含み得る。
Ａ．更なる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、１つの液体が、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、該構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏ベース及びクリームの場合のように半固体又は固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製の際の界面活性剤の分類及び選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、すなわち、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。
エマルション製剤中に使用される、天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収ベースは、無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を取り入れてｗ／ｏエマルションを形成するが、尚それらの半固体稠度を維持する親水性特性を所有する。微粉化固体は、特に界面活性剤の組み合わせ中、及び粘稠な製剤中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤粘土、顔料、及び炭素などの非極性固体又はトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。
非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイド又は親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グァーガム、カラヤガム、及びトラガカント）などの天然に存在するゴム及び合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散し又は水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えられて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口及び非経口経路を介したエマルション製剤の適用並びにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、並びに吸収及び生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。鉱油基剤の緩下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤が、ｏ／ｗ型エマルションとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１８５−２１５）。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプ又は水中油（ｏ／ｗ）タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｐａｃｋｉｎｇ）とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を用いる現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルションを製剤化する方法についての広範な知識を当業者に与えている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で又は補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体とすることができる。油相は、非限定的にＣａｐｔｅｘ（登録商標）３００、Ｃａｐｔｅｘ（登録商標）３５５、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などの材料を含むことができる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化及び薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティの向上に提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性及び透過性の変更に起因する薬物吸収の可能な向上、調製の容易さ、固体剤形を超える経口投与の容易さ、臨床的効能の改善、及び毒性の低下の利点を提供する（例えば例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、マイクロエマルションの構成成分が周囲温度で一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチド又はｉＲＮＡを処方する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた美容及び医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤が胃腸管からのｉＲＮＡ及び核酸の全身吸収の増大、並びにｉＲＮＡ及び核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。
本発明のマイクロエマルションはまた、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ（登録商標）３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）（登録商標）、及び透過促進剤などの追加の構成成分及び添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、且つ本発明のｉＲＮＡ及び核酸の吸収を向上させ得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類され得る−−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は、上記に論じられている。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡは、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組合せを含む他の方法によって生成されてもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。
浸透促進剤は、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。
浸透促進剤の上記の種類のそれぞれが、以下により詳細に記載される。
界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液に溶解されると、溶液の表面張力又は水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化学物質である。胆汁塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）；及びＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、並びにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照）。
胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照）。様々な天然の胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれか並びにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照）。
本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのキレート剤の使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するという更なる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照）。
本明細書において使用される際、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてのわずかな活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照）。この種類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；並びにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
細胞レベルにおけるｉＲＮＡの取り込みを促進する剤も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に加えられ得る。例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）などのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジンなどのポリカチオン性分子（ＬｏｌｌｏらのＰＣＴ出願の国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、特に、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、並びにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む、他の剤を用いて、投与される核酸の浸透を促進することができる。
ｖ．担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性（即ち、生物学的活性ｐｅｒｓｅを所有しない）であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤も本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌及び非無菌水性溶液、非水性溶液、又は液体若しくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤を使用し得る。
薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤などの更なる、適合可能な、医薬的に活性な材料を含有することができ、又は、染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料又は芳香性物質などと混合される。
水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。縣濁液は、安定剤も含み得る。
ある実施形態において、本発明に取り上げられる医薬組成物は、（ａ）１つ又は複数のｉＲＮＡ及び（ｂ）非ｉＲＮＡ機構によって機能し、代謝障害、例えば、血糖コントロール不良を処置するのに有用な１つ又は複数の薬剤を含む。
このような化合物の毒性及び予防的効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％の致死量）及びＥＤ５０（個体群の５０％に予防に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と処置効果との間の用量比は、処置指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い処置指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性を伴わずにＥＤ５０、好ましくはＥＤ８０又はＥＤ９０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に取り上げられる方法に使用される任意の化合物では、予防に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）又はより高いレベルの阻害を含む、化合物の、又は、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
上述されるそれらの投与に加えて、本発明に取り上げられるｉＲＮＡは、代謝障害、例えば、血糖コントロール不良の予防又は処置に使用される他の公知の薬剤と組み合わせて投与され得る。いずれの場合でも、投与する医師は、当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を使用して、観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量及び時間を調整することができる。
ＶＩ．ＨＭＧＢ１発現を阻害するための方法
本発明は、細胞内でのＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。本方法は、細胞を、細胞内でのＨＭＧＢ１の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤と接触させ、それによって、細胞内でのＨＭＧＢ１の発現を阻害する工程を含む。
細胞を、ｉＲＮＡ、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤と接触させる工程は、インビトロで又はインビボで行われ得る。細胞をインビトロで接触させる工程は、培養物中で細胞群を接触させる工程を含む。細胞をｉＲＮＡとインビボで接触させる工程は、対象、例えば、ヒト対象中の細胞又は細胞群を、ｉＲＮＡと接触させる工程を含む。細胞を接触させるインビトロ及びインビボ方法の組合せも可能である。細胞を接触させる工程は、上述されるように、直接又は間接的であり得る。更に、細胞を接触させる工程は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の任意のリガンドを含む標的化リガンドを介して行われ得る。好ましい実施形態において、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、又は目的とする部位にＲＮＡｉ剤を指向する任意の他のリガンドである。
本明細書において使用される際の「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
「ＨＭＧＢ１の発現を阻害する」という語句は、任意のＨＭＧＢ１遺伝子（例えば、マウスＨＭＧＢ１遺伝子、ラットＨＭＧＢ１遺伝子、サルＨＭＧＢ１遺伝子、又はヒトＨＭＧＢ１遺伝子など）並びにＨＭＧＢ１遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。したがって、ＨＭＧＢ１遺伝子は、野生型ＨＭＧＢ１遺伝子、突然変異体ＨＭＧＢ１遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、若しくは生物の文脈におけるトランスジェニックＨＭＧＢ１遺伝子であり得る。
「ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する」は、ＨＭＧＢ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＨＭＧＢ１遺伝子の発現は、ＨＭＧＢ１遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化、例えば、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベル又はＨＭＧＢ１タンパク質レベルに基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む、個々の細胞又は細胞群中で評価され得る。ＨＭＧＢ１は、身体、例えば、肝臓、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸、子宮内膜、食道、脂肪、胆嚢、心臓、腎臓、肺、リンパ節、卵巣、前立腺、皮膚、小腸、胃、精巣、甲状腺、及び膀胱中の多くの組織型において発現されることが理解される。小胞構造に関連するＨＭＧＢ１ ＲＮＡは、血液、尿、及び他の体液中に存在することが予想される。血液及び尿中のＲＮＡのレベルは、肝臓中のＲＮＡレベルと相関することが実証されている（例えば、いずれも参照により本明細書に援用される、Ｓｅｈｇａｌ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２０：１４３−１４９，２０１４；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．４：ｅ２６３，２０１５を参照されたい）。更に、予測される部位特異的ｓｉＲＮＡ切断産物の検出によってＲＮＡ干渉を確認する方法は、当該技術分野において公知であり、臨床試験においてＲＮＡ切断を実証するために使用されている（例えば、いずれも参照により本明細書に援用される、Ｚｉｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４１：１１１−１１４，２００６；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４６４：１０６７−１０７０，２０１０を参照されたい）。したがって、肝臓中のＨＭＧＢ１遺伝子及び遺伝子発現のノックダウンのレベルは、血液中のＨＭＧＢ１タンパク質のノックダウンのレベル又は血液若しくは尿中の小胞構造に関連するＨＭＧＢ１ ＲＮＡより高くなり得る。ＨＭＧＢ１は、肝炎の際に、損傷した細胞からの漏出により活発に又は受動的に肝細胞から放出される。したがって、処置後のＨＭＧＢ１の低下は、例えば、処置前の同じ個体におけるより早い時点と比較して、又は罹患集団からのレベルと比較した際のみに観察され得る。このような考察は、当業者によって十分に理解される。
阻害は、対照のレベルと比較したＨＭＧＢ１発現に関連する１つ又は複数の変数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル、又は非処理若しくは対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、若しくは試料から測定されるレベルであり得る。
本発明の方法のある実施形態において、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％だけ、又はアッセイの検出のレベル未満になるまで阻害される。好ましい実施形態において、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現は、少なくとも５０％阻害される。ＨＭＧＢ１の完全な又はほぼ完全な阻害が望ましくないことがあることが理解される。他の組織、例えば、脳における発現のかなりの阻害を伴わない、特定の組織、例えば、肝臓におけるＨＭＧＢ１発現の阻害が望ましいことがあることが更に理解される。好ましい実施形態において、発現レベルは、種を一致させた適切な細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示されるアッセイ方法を用いて決定される。
特定の実施形態において、インビボでの発現の阻害は、例えば、最低量のＲＮＡ発現で３ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与される場合、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類、例えば、ヒト標的遺伝子（すなわち、ＨＭＧＢ１）を発現するＡＡＶ感染マウスにおけるヒト遺伝子のノックダウンによって決定される。モデル動物系における内在性遺伝子の発現のノックダウンはまた、例えば、最低量のＲＮＡ発現で３ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与の後、決定され得る。このような系は、ヒトｉＲＮＡがモデル動物遺伝子の有効なノックダウンを提供するように、ヒト遺伝子及びモデル動物遺伝子の核酸配列が十分に近い場合に有用である。肝臓におけるＲＮＡ発現は、実施例２に示されるＰＣＲ方法を用いて決定される。
ＨＭＧＢ１遺伝子の発現の阻害は、ＨＭＧＢ１遺伝子が転写され、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現が阻害されるように処理されている（例えば、１つ又は複数の細胞を本発明のｉＲＮＡと接触させることによって、又は本発明のｉＲＮＡを、細胞が存在する若しくは存在していた対象に投与することによって）第１の細胞又は細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（ｉＲＮＡで処理されていないか又は対象とする遺伝子に標的化されたｉＲＮＡで処理されていない対照細胞）と比較した際の低下によって現れ得る。好ましい実施形態において、阻害は、種を一致させた細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示される方法によって、及び以下の式を用いて、対照細胞内のｍＲＮＡのレベルのパーセンテージとして、処理された細胞内のｍＲＮＡのレベルを表すことによって評価される：
Figure 2021508491
他の実施形態において、ＨＭＧＢ１遺伝子の発現の阻害は、ＨＭＧＢ１遺伝子発現に機能的に関連付けられたパラメータ、例えば、対象に由来する血液若しくは血清中のＨＭＧＢ１タンパク質レベル、対象に由来する血液若しくは尿試料中のＲＮＡレベルの低下に関して評価され得る。ＨＭＧＢ１遺伝子サイレンシングは、発現構築物からの内在性又は異種のいずれかの、ＨＭＧＢ１を発現する任意の細胞において、及び当該技術分野において公知の任意のアッセイによって決定され得る。
ＨＭＧＢ１タンパク質の発現の阻害は、細胞若しくは細胞群によって発現されるか又は対象試料中のＨＭＧＢ１タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する血液試料中のタンパク質のレベル）の低下によって現れ得る。上記に説明されるように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処理された細胞又は細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞若しくは細胞群におけるタンパク質のレベルにおけるパーセンテージ、又は対象試料、例えば、尿若しくは血液、又はそれに由来する血清におけるタンパク質のレベルの変化として同様に表され得る。
ＨＭＧＢ１遺伝子の発現の阻害を評価するのに使用され得る対照細胞、細胞群、又は対象試料は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触されていない細胞、細胞群、又は対象試料を含む。例えば、対照細胞、細胞群、又は対象試料は、ＲＮＡｉ剤又は適切に一致させた集団対照による対象の処置の前に、個々の対象（例えば、ヒト又は動物対象）から得られ得る。
細胞又は細胞群によって発現されるＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定され得る。一実施形態において、試料におけるＨＭＧＢ１の発現のレベルは、転写されるポリヌクレオチド、又はその部分、例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ（商標）、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することを含むＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ解析が挙げられる。
ある実施形態において、ＨＭＧＢ１の発現のレベルは、核酸プローブを用いて決定される。本明細書において使用される際の「プローブ」という用語は、特定のＨＭＧＢ１に選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成されるか、又は適切な生物学的製剤から得られる。プローブは、標識されるように特に設計され得る。プローブとして用いられ得る分子の例としては、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡが、ハイブリダイゼーション又は限定はされないが、サザン若しくはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアレイを含む増幅アッセイに使用され得る。ｍＲＮＡレベルの決定のための一方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズされ得る核酸分子（プローブ）と接触させる工程を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、固体表面上で固定され、例えば、アガロースゲル上で単離されたｍＲＮＡを電気泳動させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜へと移すことによって、プローブと接触される。代替的な実施形態において、プローブは、固体表面上で固定され、ｍＲＮＡは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触される。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのレベルを決定するのに使用するために容易に適合させることができる。
試料中のＨＭＧＢ１の発現のレベルを決定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉらの米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は任意の他の核酸増幅方法による、例えば試料中のｍＲＮＡの（ｃＤＮＡを調製するための）核酸増幅又は逆転写酵素のプロセス、続いて、当業者に周知の技術を用いた増幅した分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子がごく少数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。本発明の特定の態様において、ＨＭＧＢ１の発現のレベルは、定量蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）によって決定される。特定の実施形態において、予測される部位特異的ｓｉＲＮＡ切断産物の検出によってＲＮＡ干渉を確認する方法は、当該技術分野において公知であり、臨床試験においてＲＮＡ切断を実証するために使用されている（例えば、いずれも参照により本明細書に援用される、Ｚｉｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４１：１１１−１１４，２００６；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４６４：１０６７−１０７０，２０１０を参照されたい）。好ましい実施形態において、発現レベルは、種を一致させた細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示される方法によって決定される。
ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されるような）、又はマイクロウェル、試料管、ゲル、ビーズ若しくは繊維（又は結合核酸を含む任意の固体担体）を用いて監視され得る。参照により本明細書に援用される、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書及び同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＨＭＧＢ１発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブを使用することも含み得る。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書に示される実施例に記載され、例示されている。好ましい実施形態において、発現レベルは、種を一致させた細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示される方法によって決定される。
ＨＭＧＢ１タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体又はゲル内沈降素反応、吸光分光法、比色分析法、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、（単純又は二重）免疫拡散法、免疫電気泳動、ウエスタンブロット法、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
ある実施形態において、本発明の方法の有効性は、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ又はタンパク質レベル（例えば、肝生検、血液、若しくは尿中）の低下によって評価される。
本発明の方法のある実施形態において、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡが、対象中の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＨＭＧＢ１の発現の阻害は、対象中に特定の部位に由来する体液又は組織（例えば、肝臓、血液、又は尿）に由来する試料中のＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ又はＨＭＧＢ１タンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を用いて評価され得る。
本明細書において使用される際、被分析物のレベルを検出又は決定するという用語は、材料、例えば、タンパク質、ＲＮＡが存在するかどうかを決定する工程を行うことを意味することが理解される。本明細書において使用される際、検出又は決定する方法は、使用される方法のための検出のレベル未満の被分析物レベルの検出又は決定を含む。
ＶＩＩ．ＨＭＧＢ１ ｉＲＮＡを用いてＨＭＧＢ１関連疾患を予防及び処置する方法
本発明は、ＨＭＧＢ１の発現を阻害し、それによって、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨを予防又は処置するために、本発明のｉＲＮＡ又は本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用する方法も提供する。
本発明の方法において、細胞は、インビトロ又はインビボでｓｉＲＮＡと接触され得、すなわち、細胞は、対象中にあり得る。
本発明の方法を使用する処置に好適な細胞は、ＨＭＧＢ１遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸、子宮内膜、食道、脂肪、胆嚢、心臓、腎臓、肺、リンパ節、卵巣、前立腺、皮膚、小腸、胃、精巣、甲状腺、及び膀胱であり得る。好ましい実施形態において、好適な細胞は、肝細胞である。本発明の方法に使用するのに好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（キメラ非ヒト動物中のヒト細胞を含むヒト細胞、又は非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞若しくはチンパンジー細胞など）、又は非霊長類細胞であり得る。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞である。本発明の方法において、ＨＭＧＢ１発現は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、若しくは９５だけ、又はアッセイの検出のレベル未満のレベルまで、細胞内で阻害される。好ましい実施形態において、ＨＭＧＢ１発現は、少なくとも５０％阻害される。特定の実施形態において、発現は、肝細胞内で決定される。特定の実施形態において、発現は、体液、例えば、血液又は尿中の小胞結合ＲＮＡを検出することによって決定される。
本発明のインビボ方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与する工程を含んでいてもよく、ここで、ｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ剤が投与される哺乳動物のＨＭＧＢ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。組成物は、経口、腹腔内、又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内、及び髄腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、経鼻、直腸、及び局所（口腔及び舌下を含む）投与を含む非経口経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。特定の実施形態において、組成物は、静脈内注入又は注射によって投与される。特定の実施形態において、組成物は、皮下注射によって投与される。特定の実施形態において、組成物は、筋肉内注射によって投与される。特定の実施形態において、組成物は、吸入によって投与される。
いくつかの実施形態において、投与は、デポー注射による。デポー注射は、長時間に亘ってｉＲＮＡを一貫して放出することができる。それ故、デポー注射は、所望の効果、例えばＨＭＧＢ１の所望の阻害、又は予防的若しくは治療的効果を得るのに必要な投与の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することができる。デポー注射は、皮下注射又は筋内注射を含み得る。好ましい実施形態では、デポー注射は、皮下注射である。
いくつかの実施形態において、投与はポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は手術により埋め込まれたポンプであってもよい。所定の実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、又は硬膜外注入用に使用することができる。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する、手術により埋め込まれたポンプである。
投与方法は、局所的又は全身的処置が必要かどうかに基づいて及びｉＲＮＡ剤が投与される部位に基づいて選択され得る。投与の経路及び部位は、標的化を促進するように選択され得る。
一態様において、本発明は、哺乳動物におけるＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本方法は、哺乳動物の細胞内のＨＭＧＢ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を哺乳動物に投与する工程、及びＨＭＧＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物を維持し、それによって、細胞内でのＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する工程を含む。遺伝子発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、及び例えば、本明細書、例えば実施例２に記載されるｑＲＴ−ＰＣＲといった方法によって評価され得る。タンパク質産生の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えばＥＬＩＳＡによって、及び本明細書に記載される方法によって評価され得る。一実施形態において、穿刺肝生検試料は、ＨＭＧＢ１遺伝子又はタンパク質発現の低下を監視するための組織材料として用いられる。他の実施形態において、血液試料は、ＨＭＧＢ１タンパク質発現の低下を監視するための対象試料として用いられる。
本発明は、それを必要とする対象、例えば、代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨと診断された対象における処置の方法を更に提供する。
本発明は、それを必要とする対象における予防の方法を更に提供する。本発明の処置方法は、ＨＭＧＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ又はＨＭＧＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む医薬組成物の予防的に有効な量で、対象、例えば、ＨＭＧＢ１発現の低下から利益を得られ得る対象に、本発明のｉＲＮＡを投与する工程を含む。
本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与され得る。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下で投与される。裸のｉＲＮＡは、好適な緩衝液中にあり得る。緩衝液は、アセテート、シトレート、プロラミン、カーボネート、若しくはホスフェート、又はそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨ及び浸透圧は、対象に投与するのに好適であるように調整され得る。
或いは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。
ＨＭＧＢ１遺伝子発現の阻害から利益を得られ得る対象は、代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨ、又はＮＡＦＬに関連する他の病態、例えば、肥満、２型糖尿病、脂質異常症、多嚢胞性卵巣症候群、甲状腺機能低下症、閉塞性睡眠時無呼吸、下垂体機能低下症、性腺機能低下症、膵十二指腸切除、及び乾癬を発症するリスクがあるか又はそれらであると診断された対象である。
一実施形態において、本方法は、標的ＨＭＧＢ１遺伝子の発現が、例えば、１回の投与当たり約１、２、３、４、５、６、１〜６、１〜３、又は３〜６ヶ月にわたって低下されるように、本明細書に取り上げられる組成物を投与する工程を含む。
好ましくは、本明細書に取り上げられる方法及び組成物に有用なｉＲＮＡは、標的ＨＭＧＢ１遺伝子の（一次又はプロセシングされた）ＲＮＡを特異的に標的とする。ｉＲＮＡを用いてこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法が、本明細書に記載されるように、調製され、実施され得る。
本発明の方法に係るｉＲＮＡの投与は、代謝障害又はＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨの予防又は処置をもたらし得る。代謝障害及び様々なＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨの診断基準が、以下に示される。
対象は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与され得る。
ｉＲＮＡは、定期的に、所定の期間にわたって、静脈内注入によって投与され得る。特定の実施形態において、最初の治療計画の後、治療は、より低い頻度で投与され得る。ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、又は他の区画におけるＨＭＧＢ１レベルを、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％だけ、又は使用されるアッセイ方法の検出のレベル未満まで低下させ得る。好ましくは、ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、又は他の区画におけるＨＭＧＢ１レベルを、少なくとも５０％低下させ得る。
或いは、ｉＲＮＡは、皮下に、すなわち、皮下注射によって投与され得る。１回又は複数回の注射を用いて、所望の用量のｉＲＮＡを対象に送達し得る。注射は、所定の期間にわたって繰り返され得る。
投与は、定期的に繰り返され得る。特定の実施形態において、最初の治療計画の後、治療は、より低い頻度で投与され得る。反復投与計画は、月に１回から年に１回など、定期的な、治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、月に約１回から３ヶ月に約１回、又は３ヶ月に約１回から６ヶ月に約１回投与される。
ＶＩＩＩ．代謝障害及びＮＡＦＬＤの特徴及び診断基準
Ａ．メタボリック・シンドローム及び関連する病態
メタボリック・シンドローム（Ｘ症候群）は、同時に起こって、冠動脈疾患、脳卒中、及び２型糖尿病のリスクを増大する危険因子の一群の名称である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄｈｅａｌｔｈ／ＰＭＨ０００４５４６／）。メタボリック・シンドロームの診断基準は、米国心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）及び米国国立心肺血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって、以下の兆候のうちの３つ以上を有する個体として定義される：
１．１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
２．１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値（グルコース）；
３．大きい胴囲（腰回りの長さ）：男性−−４０インチ以上、女性−−３５インチ以上；
４．低いＨＤＬコレステロール：男性−−４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性−−５０ｍｇ／ｄＬ未満；及び
５．１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド。
メタボリック・シンドロームの２つの最も重要な危険因子は、身体の中心部分及び上部の回りの過度の体重（中心性肥満）及び身体がインスリンを有効に使用できないインスリン抵抗性である。十分なインスリンを産生しないか又は産生されるインスリンのレベルに応答しない個体において、血糖及び脂肪レベルが上昇する。メタボリック・シンドロームの他の危険因子としては、加齢、遺伝因子、ホルモンの変化、及び座りがちな生活様式が挙げられる。メタボリック・シンドロームに罹患した個体は、過剰な血液凝固及び低レベルの全身性炎症の一方又は両方を頻繁に起こし、これらは両方とも、状態を悪化させ得る。心血管疾患及び２型糖尿病を発症する増大した長期のリスクを有することに加えて、メタボリック・シンドロームの合併症は、アテローム性動脈硬化症、心臓発作、腎疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、末梢動脈疾患、及び脳卒中、並びに糖尿病に典型的に関連する合併症を更に含む。
メタボリック・シンドロームは、上記の５つの基準によって正式に定義されるが、代謝の不均衡が、他の尺度によって定義され得る。例えば、インスリン抵抗性又は前糖尿病が、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの上昇した空腹時血糖値、食後２時間後の血糖値又は少なくとも１４０ｍｇ／ｄｌの血清グルコース濃度によって示され得る。２型糖尿病の診断基準は、高血糖の古典的症状（すなわち、多尿症、多渇症、多食症、体重減少）又は高血糖緊急症を有する患者における、６．５％以上のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベル；少なくとも１２６ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値；少なくとも２００ｍｇ／ｄｌの食後２時間後の血糖値若しくは血清グルコース濃度；又は少なくとも２００ｍｇ／ｄＬのランダムな血漿グルコースのうちのいずれか１つである。
肥満（過剰なボディマスインデックス［ＢＭＩ］及び内臓型肥満）が、ＮＡＦＬＤの最も一般的で且つ十分に実証された危険因子である。実際に、過体重（ＢＭＩ ２５．０から３０未満）から肥満（ＢＭＩ＞３０）及び重度の肥満（クラス１：ＢＭＩ ３０から３５未満；クラス２：３５から４０未満；クラス３：４０超）の範囲の、肥満全般。
高血圧症、高血圧は、重症度によって定義され得、ステージ１高血圧症は、１４０〜１５９ｍｍ Ｈｇの範囲の収縮期圧又は９０〜９９ｍｍ Ｈｇの範囲の拡張期圧である。より重度の高血圧症である、ステージ２高血圧症は、１６０ｍｍ Ｈｇ以上の収縮期圧又は１００ｍｍ Ｈｇ以上の拡張期圧である。
同様に、高コレステロール血は、レベルに基づいて様々な重症度を有するものと見なされる。ＬＤＬ−コレステロールについては、１３０〜１５９ｍｇ／ｄＬが、高境界値であると見なされ；１６０〜１８９ｍｇ／ｄＬが高いと見なされ；１９０ｍｇ／ｄＬ超が、非常に高いと見なされる。総コレステロールについては、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬが、高境界値であると見なされ、２４０ｍｇ／ｄｌ超が、高いと見なされる。ＨＤＬ−コレステロールについては、４０ｍｇ／ｄｌ未満が過度に低いと見なされる。
メタボリック・シンドローム及び関連疾患の処置は、生活様式の変更又は血圧、ＬＤＬコレステロール、及び血糖を低下させるのを助ける薬剤、例えば、体重を減少させ、運動を増加させることを含む。血圧及びコレステロールはまた、適切な薬物を用いて調節され得る。
Ｂ．ＮＡＦＬＤ
ＮＡＦＬＤは、（１）イメージング又は組織学のいずれかによる、肝脂肪症（ＨＳ）のエビデンス、及び（２）かなりのアルコール摂取、脂肪合成薬物療法（ｓｔｅａｔｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）の長期使用、又は単因子遺伝性疾患などの肝脂肪蓄積の二次的原因の欠如によって正式に定義される（参照により本明細書に援用される、Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．ＤＯＩ：１０．１００２／ｈｅｐ．２９３６７）。ＮＡＦＬＤは、例えば、脂肪肝、脂肪性肝炎、及び肝硬変を含む、かなりのアルコール摂取を伴わない個体の脂肪肝疾患全般を包含することが理解される。
ＮＡＦＬは、肝細胞の風船状腫大の形態の肝細胞損傷のエビデンス又は線維症のエビデンスを伴わない少なくとも５％のＨＳの存在を含むものと考えられる。典型的に、肝硬変及び肝不全への進行のリスクは、最小であると考えられる。
ＮＡＳＨは、線維症を伴う又は伴わない炎症及び肝細胞損傷（風船状腫大）を伴う少なくとも５％のＨＳの存在を含むものと考えられる。ＮＡＳＨは、肝硬変、肝不全、及び場合により肝臓癌へと進行し得る。
ＮＡＦＬＤを等級分けするための重み付けされない及び半定量的スコアリング方法の両方が知られている。ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ）によって開発されたＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）は、脂肪症、小葉の炎症、及び肝細胞風船状腫大スコアの重み付けされない複合スコアである。理論上は、ＮＡＳは、臨床試験においてＮＡＦＬＤに罹患した患者における肝臓組織学の変化を測定する有用な手段であるが、連続する肝生検の対象を試験するコスト及びリスクにより、このスコアリングシステムは監視のためにあまり実用的でない。線維症は、別々に採点される（Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．４１：１３１３−１３２１、ｔｐｉｓ．ｕｐｍｃ．ｃｏｍ／ｃｈａｎｇｅｂｏｄｙ．ｃｆｍ？ｕｒｌ＝／ｔｐｉｓ／ｓｃｈｅｍａ／ＮＡＦＬＤ２００６．ｊｓｐも参照、これらはいずれも参照により援用される）。
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって開発された脂肪症活動線維症（ＳＡＦ）は、脂肪症の量、活動（小葉の炎症及び肝細胞風船状腫大）、及び線維症からなる半定量的スコアである（参照により本明細書に援用される、Ｂｅｄｏｓｓａ，２０１４．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，６０：５６５−５７５）。組織学的ＮＡＳＨに罹患した患者、特に、ある程度の線維症に罹患した患者が、肝硬変及び肝臓に関連する死亡率などの有害転帰のリスクがより高いというエビデンスが増加しているため、評価に線維症を含めることが有用であり得る。長期の死亡率に最も密接に関連する線維症のタイプは、ゾーン３類洞線維症及び門脈周囲線維症（ステージ２）から進行した架橋性線維症（ステージ３）又は肝硬変（ステージ４）まである。しかしながら、ＮＡＳと同様に、肝生検を行う必要性により、このスコアリング方法は、監視よりむしろ診断を確定するのにより有用である。
患者の大部分において、ＮＡＦＬＤは、肥満、糖尿病、及び脂質異常症などの代謝共存症に関連している。ＮＡＦＬＤはまた、多嚢胞性卵巣症候群、甲状腺機能低下症、閉塞性睡眠時無呼吸、下垂体機能低下症、性腺機能低下症、膵十二指腸切除、及び乾癬に関連し得る。ＮＡＦＬＤの確定診断は、組織学的確認を必要とするが、ＮＡＦＬＤの特定の治療法がなく、肝生検を得ることは、コストがかかり、患者にリスクを与え、肝臓全体の組織構造の潜在的な不均一性のためサンプリング「誤差」が生じ得る。したがって、診断としてＮＡＦＬＤを包含又は除外し、疾病の重症度についての情報を与えることによって、スクリーニングから利益を得る可能性の高い患者のみに肝生検が行われるべきである。肝生検による一般的な患者集団の日常的なスクリーニングは推奨されない。
メタボリック・シンドロームの存在は、ＮＡＦＬＤに罹患した患者におけるＳＨの存在の強力な予測因子である。ＮＡＦＬＤは、メタボリック・シンドロームの構成要素と高い関連性があるが、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧症脂質異常症、及び内臓型肥満などの、増加する代謝性疾患の存在が、進行性の肝疾患のリスクを増大するようである。したがって、ＮＡＦＬＤ並びに２型糖尿病及び高血圧症などの複数の危険因子を有する患者は、有害転帰のリスクが最も高い。
ＳＨ及び線維症を評価するための非侵襲的方法が知られているが、このような方法には、限界がある。血清アミノトランスフェラーゼレベル、並びにトランジエント・エラストグラフィ（ＴＥ）を含む超音波検査；コンピューター断層撮影法（ＣＴ）；及び核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの画像検査は、ＮＡＦＬＤに罹患した患者の肝臓組織学の範囲を確実に反映しない。このような限界にもかかわらず、分光法又はプロトン密度脂肪率測定のいずれかによるＭＲＩは、ＨＳを定量化するための優れた非侵襲的手法であり、ＮＡＦＬＤ臨床試験に広く使用されている。連続した減衰パラメータを得るためのＴＥの使用は、外来環境において肝脂肪を定量化するための有望な手段である。しかしながら、日常的な臨床ケアにおいてＮＡＦＬＤに罹患した患者のＨＳを非侵襲的に定量化する有用性は限られる。
ＮＡＦＬＤに罹患した患者におけるＳＨを確認するための臨床予測ルール及び非侵襲的バイオマーカーを開発することが大きな関心を集めている。サイトケラチン−１８断片の循環中レベルは、ＮＡＦＬＤに罹患した患者におけるＳＨの存在についての新規なバイオマーカーとして広く研究されている。この試験は、現在、臨床ケア環境において利用可能でない。ＮＡＦＬＤにおける進行した線維症の存在についての一般的に研究されている非侵襲的手段としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）から血小板比指数（ＡＰＲＩ）、及び血清バイオマーカー（増強された肝線維症［ＥＬＦ］パネル）が挙げられる。しかしながら、これまで、十分に満足できるアッセイ方法又はバイオマーカーは特定されていない（Ｍｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．４３：６１７−６４９）。
Ｃ．肝硬変
肝硬変は、線維症及び正常な肝臓構造から構造的に異常な結節への変化によって特徴付けられるびまん性肝臓の過程として組織学的に定義される。肝臓損傷から肝硬変への進行は、数週間から数年間かけて起こり得る。肝硬変は、自己免疫性肝炎、ウイルス性肝炎（例えば、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎）、ヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変、又は肝障害を引き起こし得るアルコール若しくは他の薬物の慢性的若しくは過剰摂取を含むいくつかの障害のいずれかに起因して生じ得る。
肝硬変は、無症候性であり得、又は多くの症状を伴い、末期肝疾患をもたらし得る。一般的な兆候及び症状は、肝臓の低下した合成機能（例えば、凝固障害）、門脈高血庄症（例えば、静脈瘤出血）、又は肝臓の低下した解毒能力（例えば、肝性脳症）に起因し得る。肝硬変に罹患した患者は、疲労、食欲不振、体重減少、及び筋肉疲労を生じる。肝硬変の皮膚症状としては、黄疸、クモ状血管腫、皮膚毛細血管拡張症（「紙幣状皮膚」）、手掌紅斑、爪の白化、爪半月の消失、及び特に、肝肺症候群の場合、ばち状指が挙げられる。肝線維症は、ＮＡＦＬＤを監視するための上述される方法によって監視され得る。
肝硬変の処置は、疾病の基礎にある病因に依存する。
本発明は、以下の実施例によって更に示されるが、これらの実施例は、限定的なものであると解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参照文献、特許及び公開特許出願の全内容、並びに配列表が、参照により本明細書に援用される。
実施例１．ｉＲＮＡ合成
試薬の供給源
本明細書に試薬の供給源が特に示されていない場合、このような試薬は、分子生物学における試薬の任意の供給業者から、分子生物学における用途のための品質／純度基準で得ることができる。
ｓｉＲＮＡ設計
ヒト高移動度グループボックス１遺伝子を標的とする一連のｓｉＲＮＡ（ＨＭＧＢ１；ヒトＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿００２１２８．５；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：３１４６）並びにカニクイザルに由来する毒物学種ＨＭＧＢ１オルソログ：ＮＭ＿００１２８３３５６）を、カスタムＲ及びＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて設計した。全てのｓｉＲＮＡ設計は、ヒトＨＭＧＢ１転写産物に対する完全な一致を有し、サブセットは、カニクイザルオルソログに対する完全又はほぼ完全な一致を有する。ヒトＮＭ＿００２１２８ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、ｖｅｒｓｉｏｎ ５は、４２７３塩基の長さを有する。
非修飾ＨＭＧＢ１センス及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表３に示される。修飾ＨＭＧＢ１センス及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表５、６、及び７に示される。
ｓｉＲＮＡ合成
当該技術分野において公知の日常的な方法を用いて、ｓｉＲＮＡを合成し、アニールした。
実施例２−インビトロスクリーニング方法：
細胞培養及びトランスフェクション：
３８４ウェルプレート中で、各ＳｉＲＮＡ二本鎖の４つの複製を用いて、ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ及び０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ ＃ １３７７８−１５０）を、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによって、Ｈｅｐ３ｂ細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、約５×１０３個の細胞を含む４０μｌのイーグル最小必須培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。細胞を、ＲＮＡ精製の前に２４時間インキュベートした。単回投与実験を、１０ｎＭで行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用した総ＲＮＡ単離：
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃６１０１２）を用いてＢｉｏＴｅｋ−ＥＬ４０６プラットフォームにおいて自動プロトコルを用いて、ＲＮＡを単離した。簡潔に述べると、７０μｌの溶解／結合緩衝液及び３μｌの電磁ビーズを含む１０ｕｌの溶解緩衝液を、細胞とともにプレートに加えた。プレートを、室温で１０分間にわたって電磁振動機においてインキュベートし、次に、電磁ビーズを捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズが結合したＲＮＡを、１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回及び洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、再度捕捉し、上清を除去した。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
反応当たり１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌの１０×ランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮアーゼ阻害剤及び６．６μｌのＨ２Ｏを含む１０μｌのマスターミックスを、上記の単離されたＲＮＡに加えた。プレートを密閉し、混合し、室温で１０分間、続いて３７℃で２時間にわたって電磁振動機においてインキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）中で、ウェル当たり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（４３２６３１７Ｅ）、及び０．５μｌのＨＭＧＢ１ヒトプローブ（Ｈｓ．ＰＴ．５８．２２５９０１７、ＩＤＴ）及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内で行った。各二本鎖を少なくとも２回試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して正規化した。相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を用いて行われたアッセイに対して正規化した。
Figure 2021508491
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実施例３−単回用量のＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによるＨＭＧＢ１発現のノックダウン
マウスＨＭＧＢ１を標的とする一連のｄｓＲＮＡ剤を設計し、６〜８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウスにおけるＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの発現をノックダウンする能力について試験した。二本鎖は、表６に列挙される。
二本鎖ＡＤ−８０６４４は、ヒトｍＲＮＡ配列と比較して、アンチセンス鎖の１位に単一のミスマッチを含む。二本鎖ＡＤ−８０６５２及びＡＤ−８０６５３は、ヒトｍＲＮＡ配列と比較して、アンチセンス鎖における完全な一致である。二本鎖ＡＤ−８０６４６、ＡＤ−８０６５１、及びＡＤ８０６５２は、マウス配列とヒト配列との間に複数のミスマッチを含む。
単回用量の６つの選択されたｄｓＲＮＡ剤；又はＰＢＳ対照を、３ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝３）の用量で１日目に皮下投与した。投与の７及び２１日後に、肝臓のイメージングを容易にするために、肝臓からグリコーゲンを取り除くために殺処分の前に５時間にわたってマウスを絶食させ、肝臓を採取し、ＨＭＧＢ１発現を分析した。
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ ＃ ７４１３６）を用いて単離した。１μｇの総ＲＮＡを、ＡＢＩ（登録商標）高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を用いてｃＤＮＡに転写した。両方とも製造業者のプロトコルにしたがった。
１μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）中で、ウェル当たり０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（４３５２３３９Ｅ）、０．５μｌのマウスＨＭＧＢ１プローブ（Ｍｍ００８４９８０５＿ｇＨ）、５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）及び３μｌのヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスに加えた。反応をトリプリケートで行った。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内で行った。相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、ＰＢＳ処理動物に対して正規化した。結果が、以下の表に示される。
Figure 2021508491
これらのデータに基づいて、二本鎖ＡＤ−８０６５３を、更なる試験のために選択した。
Figure 2021508491
実施例４−ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによるＨＭＧＢ１関連疾患の処置
ＮＡＳＨの高脂肪−高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）を供給したマウスモデル（参照により本明細書に援用される、Ｓｏｆｔｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２７（１１）：４０５９−４０７４，２０１７）を用いて、ＮＡＳＨ及び代謝障害の兆候を処置するためのＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡの有効性を実証した。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに、ＮＡＳＨを誘発するために、ｄｓＲＮＡ剤による処理の前に１２週間にわたって脂肪としてカロリーの６０％及び水中３０％のフルクトースを含有する高脂肪食（Ｈｆ Ｈｆｒ食）を供給するか、又は標準食及び水の食餌を供給した。食物及び水を自由に与えた。予測されるように、体重及び肝重量は、ＨＦ ＨＦｒ供給マウスにおいて有意に高かった。肝臓損傷が、Ｈｆ Ｈｆｒマウスにおいて、血清グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの有意な増加によって示された。肝臓組織学を、ＮＡＳＨの発症を確認するために評価した。空胞化、炎症、肝細胞風船状腫大の悪化、及び線維症が、Ｈｆ Ｈｆｒ食を供給されたマウスにおいて観察されたが、標準食を供給されたマウスにおいて観察されなかった。これらのデータは、Ｈｆ Ｈｆｒ食が、ＮＡＳＨ表現型を確立するのに有効であったことを実証する。増加した血清インスリン及びグルコース及び増加した血清コレステロールを含む、メタボリック・シンドロームに関連するいくつかの兆候も、Ｈｆ Ｈｆｒ食の結果として観察された。
１２週から開始して、隔週で合計４回の投与にわたって、１０ｍｇ／ｋｇの用量の、ＨＭＧＢ１（ＡＤ−８０６５３）に標的化されたｓｉＲＮＡを、ＨＦ ＨＦｒ供給マウスに皮下投与した。最後の投与の２週間後（２０週の時点で）、肝臓を採取し、ＲＮＡを単離し、ＨＭＧＢ１ノックダウンを、上述される方法を用いてｒｔＰＣＲによって決定した。肝臓ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの９４％の低下が、ＰＢＳで処理されたＨＦ ＨＦｒ供給マウスと比較して、ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡで処理されたＨｆ Ｈｆｒ供給マウスにおいて観察された。
ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによる処理は、体重のパーセントとしての肝重量を減少させ、肝トリグリセリドレベルを減少させることによって、Ｈｆ Ｈｆｒ食の悪影響をいくらかを改善した。結果が、以下の表に示される。
Figure 2021508491
血清コレステロールも、ＨＦ ＨＦｒ ＰＢＳで処理されたマウスと比較して、ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡで処理されたＨＦ ＨＦｒマウスにおいて、有意に減少された（５６％、ｐ＝０．０００１）。
ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによる処理はまた、以下の表に示されるように、脂質代謝に関連する遺伝子の発現を正常化した。値が、ＨＦ ＨＦｒ＋ＰＢＳからの相対的な倍加変化として表される。
Figure 2021508491
ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによる処理はまた、以下に示されるように、組織病理学的データに基づいて、いくつかの平均ＮＡＳ及び線維症スコアを改善した。
Figure 2021508491
炎症若しくは線維症遺伝子の発現、肝臓損傷の血清バイオマーカー、又は血清インスリン若しくはグルコースの有意な変化は観察されなかった。
第２の実験を、上述されるのと同じマウスモデル及び投与計画を用いて行った。アッセイされるエンドポイントのいくつかは、第２の試験において異なっていた。この試験の結果が、以下に示される。
簡潔に述べると、上述されるように、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに、ＮＡＳＨを誘発するために、処理前の１２週間にわたって脂肪としてカロリーの６０％及び水中３０％のフルクトースを含有する高脂肪食（Ｈｆ Ｈｆｒ食）を供給するか、又は標準食及び水の食餌を供給した。
１２週から出発して、隔週で合計４回の投与にわたって、１０ｍｇ／ｋｇの用量の、ＨＭＧＢ１（ＡＤ−８０６５３）に標的化されたｓｉＲＮＡを、ＨＦ ＨＦｒ供給マウスに皮下投与した。最後の投与の２週間後（２０週の時点で）、肝臓を採取し、ＲＮＡを単離し、ＨＭＧＢ１ノックダウンを、上述される方法を用いてｒｔＰＣＲによって決定した。肝臓ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの９０％の低下が、ＰＢＳで処理されたＨＦ ＨＦｒ供給マウスと比較して、ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡで処理されたＨｆ Ｈｆｒ供給マウスにおいて観察された。
ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによる処理は、体重のパーセントとしての肝重量、肝トリグリセリド、肝臓遊離コレステロール、及び肝臓遊離脂肪酸レベルを減少させることによって、Ｈｆ Ｈｆｒ食の悪影響のいくらかを改善した。結果が、以下の表に示される。
Figure 2021508491
ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによる処理はまた、血清コレステロール、ＬＤＬコレステロール及び血清非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の減少をもたらした。ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡ処理により見られる血清トリグリセリドレベルの増加があった。結果が、以下の表に示される。
Figure 2021508491
ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによる処理はまた、以下の表に示されるように、組織病理学的データに基づいて、平均ＮＡＳ及び線維症スコアを改善した。
Figure 2021508491
ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによる処理はまた、血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）を少し減少させた。
これらのデータは、ＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡが、ＨＭＧＢ１関連疾患、例えば、代謝障害及びＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨの処置に有効であることを実証している。
実施例５−単回用量のＨＭＧＢ１ ｓｉＲＮＡによるＨＭＧＢ１発現のノックダウン
マウスＨＭＧＢ１を標的とする一連のｄｓＲＮＡ剤を設計し、６〜８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウスにおけるＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの発現をノックダウンする能力について試験した。評価された二本鎖が、以下の表７に列挙される。
Figure 2021508491
ｄｓＲＮＡ剤；又はＰＢＳ対照のうちの１つの単回用量を、１０ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝３）の用量で１日目に皮下投与した。投与の１４日後に、マウスを殺処分し、肝臓を採取し、ＨＭＧＢ１発現を分析した。
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ ＃ ７４１３６）を用いて単離した。１μｇの総ＲＮＡを、ＡＢＩ（登録商標）高容量ｃＤＮＡ逆転写キットＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を用いてｃＤＮＡに転写した。両方とも製造業者のプロトコルにしたがった。
１μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）中で、ウェル当たり０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（４３５２３３９Ｅ）、０．５μｌのマウスＨＭＧＢ１プローブ（Ｍｍ００８４９８０５＿ｇＨ）、５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）及び３μｌのヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスに加えた。反応をトリプリケートで行った。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内で行った。相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、ＰＢＳ処理動物に対して正規化した。結果が、表８に示される。
Figure 2021508491
均等物
当業者は、本明細書に記載される特定の実施形態及び方法に対する多くの均等物を認識するか、又は単なる日常的な実験を用いて確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (89)

  1. 高移動度グループボックス−１（ＨＭＧＢ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  2. 前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド８３０〜８５１、８３０〜８５０、８３１〜８５１、９１７〜９３７、９４４〜９９７、９４４〜９９０、９４４〜９６４、９６８〜９９７、９６８〜９９０、９６８〜９９５、９６８〜９８８、９６９〜９８９、９７０〜９９０、９７１〜９９１、９７２〜９９２、９７２〜９９５、９７３〜９９３、９７４〜９９４、９７５〜９９５、９７６〜９９６、９７７〜９９７、１０１９〜１０３９、１１５８〜１１９４、１１５８〜１１８２、１１５８〜１１７８、１１５９〜１１７９、１１６０〜１１８０、１１６１〜１１８１、１１６２〜１１８２、又は１１７４〜１１９４のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  3. ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表３、表５、表６、又は表７のいずれか１つに列挙されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むＨＭＧＢ１をコードするｍＲＮＡに相補性の領域を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  4. 前記アンチセンス鎖が、ＡＤ−２４５２８１、ＡＤ−２４５２８２、ＡＤ−２４５３０５、ＡＤ−２４５３３６、ＡＤ−２４５３３９、ＡＤ−２４５３８３、ＡＤ−２４５４７２、ＡＤ−１９３１７７、ＡＤ−１９３３１２、ＡＤ−１９３１６８、ＡＤ−１９３３１３、ＡＤ−１９３１８０、ＡＤ−１９３１８２、ＡＤ−１９３３１４、ＡＤ−１９３１７３、ＡＤ−１９３３１１、ＡＤ−１９３１７９、ＡＤ−１９３１７８、ＡＤ−１９３１７４、ＡＤ−１９３３１５、ＡＤ−１９３１７５、ＡＤ−１９３３２６、ＡＤ−１９３１７６、ＡＤ−１９３１８１、ＡＤ−８０６５１、及びＡＤ−８０６５２からなる群から選択される二本鎖のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  5. 前記センス鎖が、ＡＤ−２４５２８１のセンス鎖ヌクレオチド配列（５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’）（配列番号５１１）の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ＡＤ−２４５２８１のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列（５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’）（配列番号５１２）からの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  6. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’（配列番号５１１）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’（配列番号５１２）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含む、請求項５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  7. 前記鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’（配列番号５１１）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’（配列番号５１２）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む、請求項５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  8. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＵＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵ−３’（配列番号５１１）の２１連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵＵ−３’（配列番号５１２）の少なくとも２１連続の７ヌクレオチドを含む、請求項５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  9. 前記センス鎖が、ＡＤ−２４５２８２のセンス鎖ヌクレオチド配列（５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’）（配列番号５１３）の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ＡＤ−２４５２８２のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列（５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’）（配列番号５１４）の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  10. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号５１３）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’（配列番号５１４）の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含む、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  11. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号５１３）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’（配列番号５１４）の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  12. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＵＵＧＧＵＵＣＵＡＧＣＧＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号５１３）の２１連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＵＧＣＧＣＵＡＧＡＡＣＣＡＡＣＵＵＡＵ−３’（配列番号５１４）の少なくとも２１連続ヌクレオチドを含む、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  13. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、表３、表５、表６、又は表７のいずれか１つにおけるヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  14. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  15. 前記センス鎖のヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、ヌクレオチド修飾を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  16. 前記センス鎖が、５’−ｕｓａｓａｇｕｕＧｆｇＵｆＵｆＣｆｕａｇｃｇｃａｇｕｕ−３’（配列番号５２５）の修飾ヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、５’−ａｓＡｆｓｃｕｇｃ（Ｇｇｎ）ｃｕａｇａａＣｆｃＡｆａｃｕｕａｓｕｓｕ−３’（配列番号５２６）の修飾ヌクレオチド配列を含み、ここで、ａが、２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−リン酸であり、ｃが、２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−リン酸であり、ｇが、２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−リン酸であり、ｕが、２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−リン酸であり、Ａｆが、２’−フルオロアデノシン−３’−リン酸であり、Ｃｆが、２’−フルオロシチジン−３’−リン酸であり、Ｇｆが、２’−フルオログアノシン−３’−リン酸であり、Ｕｆが、２’−フルオロウリジン−３’−リン酸であり、（Ｇｇｎ）が、グアノシン−グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、ｓが、ホスホロチオエート結合である、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 前記センス鎖の３’末端に共有結合されたＮ−［トリス（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）−アミドデカノイル）］−４−ヒドロキシプロリノールを更に含む、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. 前記センス鎖が、５’−ａｓａｓｇｕｕｇＧｆｕＵｆＣｆＵｆａｇｃｇｃａｇｕｕｕ−３’（配列番号５２７）の修飾ヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、５’−ａｓＡｆｓａｃｕｇ（Ｃｇｎ）ｇｃｕａｇａＡｆｃＣｆａａｃｕｕｓａｓｕ−３’（配列番号５２８）の修飾ヌクレオチド配列を含み、ここで、ａが、２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−リン酸であり、ｃが、２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−リン酸であり、ｇが、２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−リン酸であり、ｕが、２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−リン酸であり、Ａｆが、２’−フルオロアデノシン−３’−リン酸であり、Ｃｆが、２’−フルオロシチジン−３’−リン酸であり、Ｇｆが、２’−フルオログアノシン−３’−リン酸であり、Ｕｆが、２’−フルオロウリジン−３’−リン酸であり、（Ｃｇｎ）が、シチジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、ｓが、ホスホロチオエート結合である、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. 前記センス鎖の３’末端に共有結合されたＮ−［トリス（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）−アミドデカノイル）］−４−ヒドロキシプロリノールを更に含む、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記二本鎖ＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖が、３’末端において結合されたリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤。
  21. 前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド８３０〜８５１、８３０〜８５０、８３１〜８５１、９１７〜９３７、９４４〜９９７、９４４〜９９０、９４４〜９６４、９６８〜９９７、９６８〜９９０、９６８〜９９５、９６８〜９８８、９６９〜９８９、９７０〜９９０、９７１〜９９１、９７２〜９９２、９７２〜９９５、９７３〜９９３、９７４〜９９４、９７５〜９９５、９７６〜９９６、９７７〜９９７、１０１９〜１０３９、１１５８〜１１９４、１１５８〜１１８２、１１５８〜１１７８、１１５９〜１１７９、１１６０〜１１８０、１１６１〜１１８１、１１６２〜１１８２、又は１１７４〜１１９４のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. 前記センス鎖のヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、ヌクレオチド修飾を含む、請求項２０又は２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、及び２−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド；及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０又は２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. 前記修飾ヌクレオチドが、３’末端デオキシ−チミンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む、請求項２３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 前記相補性の領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. 前記相補性の領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  27. 前記相補性の領域が、１９ヌクレオチド長である、請求項２６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  28. 各鎖が、独立して、３０ヌクレオチド長以下である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  29. 少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  30. 少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  31. リガンドを更に含む、請求項１〜１６及び１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  32. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされている、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  33. 前記リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項２０又は３１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  34. 前記リガンドが、
    Figure 2021508491
     である、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  35. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、以下の概略図
    Figure 2021508491
     に示されるように前記リガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  36. 前記ＸがＯである、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  37. 前記相補性の領域が、表３、表５、表６、又は表７のいずれか１つのアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つを含む、請求項３又は４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  38. 前記相補性の領域が、表３、表５、表６、又は表７のいずれか１つのアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つからなる、請求項３又は４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  39. 前記アンチセンスヌクレオチド配列が、ＡＤ−２４５２８１、ＡＤ−２４５２８２、ＡＤ−２４５３０５、ＡＤ−２４５３３６、ＡＤ−２４５３３９、ＡＤ−２４５３８３、ＡＤ−２４５４７２、ＡＤ−１９３１７７、ＡＤ−１９３３１２、ＡＤ−１９３１６８、ＡＤ−１９３３１３、ＡＤ−１９３１８０、ＡＤ−１９３１８２、ＡＤ−１９３３１４、ＡＤ−１９３１７３、ＡＤ−１９３３１１、ＡＤ−１９３１７９、ＡＤ−１９３１７８、ＡＤ−１９３１７４、ＡＤ−１９３３１５、ＡＤ−１９３１７５、ＡＤ−１９３３２６、ＡＤ−１９３１７６、ＡＤ−１９３１８１、ＡＤ−８０６５１、及びＡＤ−８０６５２からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス配列である、請求項３７又は３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  40. 前記二本鎖領域が、１５〜３０ヌクレオチド対長である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  41. 前記二本鎖領域が、１７〜２３ヌクレオチド対長である、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  42. 前記二本鎖領域が、１７〜２５ヌクレオチド対長である、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  43. 前記二本鎖領域が、２３〜２７ヌクレオチド対長である、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  44. 前記二本鎖領域が、１９〜２１ヌクレオチド対長である、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  45. 前記二本鎖領域が、２１〜２３ヌクレオチド対長である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  46. 各鎖が、独立して、１９〜３０ヌクレオチドを有する、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  47. 前記ヌクレオチド上の修飾が、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、ＧＮＡ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  48. 前記ヌクレオチド上の修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾である、請求項４７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  49. 前記リガンドが、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  50. 前記剤が、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  51. 前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１本の鎖の３’末端にある、請求項５０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  52. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項５１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  53. 前記鎖が、前記センス鎖である、請求項５１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  54. 前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１本の鎖の５’末端にある、請求項５０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  55. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項５４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  56. 前記鎖が、前記センス鎖である、請求項５４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  57. 前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１本の鎖の５’末端及び３’末端の両方にある、請求項５０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  58. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項５７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  59. 前記二本鎖領域の前記アンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  60. 前記センス鎖が、合計で２１のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が、合計で２３のヌクレオチドを有する、請求項５６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  61. ＨＭＧＢ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、
    前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾，及び２’−フルオロ修飾から選択されるヌクレオチド修飾を含み、
    前記センス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択されるヌクレオチド修飾を含み、
    前記アンチセンス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記センス鎖が、３’末端において一価、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤。
  62. 前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド８３０〜８５１、８３０〜８５０、８３１〜８５１、９１７〜９３７、９４４〜９９７、９４４〜９９０、９４４〜９６４、９６８〜９９７、９６８〜９９０、９６８〜９９５、９６８〜９８８、９６９〜９８９、９７０〜９９０、９７１〜９９１、９７２〜９９２、９７２〜９９５、９７３〜９９３、９７４〜９９４、９７５〜９９５、９７６〜９９６、９７７〜９９７、１０１９〜１０３９、１１５８〜１１９４、１１５８〜１１８２、１１５８〜１１７８、１１５９〜１１７９、１１６０〜１１８０、１１６１〜１１８１、１１６２〜１１８２、又は１１７４〜１１９４のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項６１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  63. 前記センス鎖のヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである、請求項６１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  64. 各鎖が、独立して、１９〜３０ヌクレオチドを有する、請求項６１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  65. 各鎖が、独立して、１４〜４０ヌクレオチドを有する、請求項６１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  66. 前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位における前記アンチセンス鎖のシード領域と反対側の部位に配置された熱的に不安定なヌクレオチドを含む、請求項６１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  67. 前記熱的に不安定な修飾が、非塩基性修飾；前記二本鎖における反対のヌクレオチドとのミスマッチ；及び不安定な糖修飾から選択される、請求項６６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  68. 請求項１〜６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、単離された細胞。
  69. 請求項１〜６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、ＨＭＧＢ１をコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  70. 請求項１〜６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤と、脂質とを含む医薬組成物。
  71. 細胞内でのＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤又は請求項６９又は７０に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、前記細胞内での前記ＨＭＧＢ１遺伝子の発現を阻害する工程を含む方法。
  72. 前記細胞が、対象中にある、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記対象が、ヒト対象である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記対象が、ＨＭＧＢ１関連疾患に罹患している、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、肝炎、肝線維症、ＨＭＧＢ１のレベルの上昇に関連する肝障害、代謝障害、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの上昇した空腹時血糖値、大きい胴囲（男性の場合は４０インチ以上及び女性の場合は３５インチ以上）；ウエスト・ヒップ比＜１．０（男性の場合）若しくは＜０．８（女性の場合）；低いＨＤＬコレステロール（男性の場合は４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満）、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、ＮＡＳＨ肝硬変、特発性肝硬変、高血圧症、高コレステロール血、肝臓感染症、肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、慢性的なアルコール摂取、アルコール性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシス、及び肝障害を引き起こす医薬品の慢性使用からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、代謝障害である、請求項７４に記載の方法。
  77. 前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、ＮＡＦＬＤである、請求項７４に記載の方法。
  78. ＨＭＧＢ１の前記発現が、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡ剤と接触させない場合と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％だけ又は前記アッセイの検出のレベル未満になるまで阻害される、請求項７１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. ＨＭＧＢ１の前記発現の阻害が、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％だけ、前記対象の血清中のＨＭＧＢ１タンパク質レベルを低下させる、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載の方法。
  80. 対象におけるＨＭＧＢ１関連疾患を処置する方法であって、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤又は請求項６９又は７０に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象におけるＨＭＧＢ１関連疾患を処置する工程を含む方法。
  81. 前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、肝炎、肝線維症、ＨＭＧＢ１のレベルの上昇に関連する肝障害、代謝障害、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの上昇した空腹時血糖値、大きい胴囲（男性の場合は４０インチ以上及び女性の場合は３５インチ以上）；ウエスト・ヒップ比＜１．０（男性の場合）若しくは＜０．８（女性の場合）；低いＨＤＬコレステロール（男性の場合は４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満）、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、ＮＡＳＨ肝硬変、特発性肝硬変、高血圧症、高コレステロール血、肝臓感染症、肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、慢性的なアルコール摂取、アルコール性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシス、及び肝障害を引き起こす医薬品の慢性使用からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、代謝障害である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記ＨＭＧＢ１関連疾患が、ＮＡＦＬＤである、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記対象が、ヒト対象である、請求項８０に記載の方法。
  85. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、前記対象に皮下投与される、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  87. ＨＭＧＢ１の前記レベルが、前記対象中で測定される、請求項８０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
  88. ＨＭＧＢ１の前記レベルが、対象の血液若しくは血清試料中のＨＭＧＢ１タンパク質のレベル、又は血液若しくは尿試料中のＨＭＧＢ１ ＲＮＡのレベルである、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記血液又は尿試料中の前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ切断部位についてアッセイされる、請求項８８に記載の方法。
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