WO2023054666A1 - 脂肪肝および非アルコール性脂肪肝炎の治療薬 - Google Patents

脂肪肝および非アルコール性脂肪肝炎の治療薬 Download PDF

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peptide
seq
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克人 玉井
敬史 新保
崇二 寺井
淳紀 土屋
尊彦 山崎
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国立大学法人大阪大学
国立大学法人新潟大学
株式会社ステムリム
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics

Definitions

  • This application relates to a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of fatty liver and non-alcoholic steatohepatitis.
  • Fatty liver disease is caused by viral infections, alcohol, and other reasons. Fatty liver disease of causes other than viruses and alcohol are often caused by diabetes, dyslipidemia, and obesity/metabolic syndrome. Viral, non-alcoholic fatty liver and the range of liver diseases caused by it are termed non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). In general, fatty liver disease is determined to be non-alcoholic when the patient's alcohol consumption is less than 30 g/day for men and 20 g/day for women.
  • NAFLD non-alcoholic fatty liver disease
  • liver steatosis accompanied by inflammation is called non-alcoholic steatohepatitis (NASH). And this inflammation may be accompanied by fibrosis. As this fibrosis progresses, it leads to liver cirrhosis.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • fibrosis As this fibrosis progresses, it leads to liver cirrhosis.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the purpose of this application is to provide therapeutic and/or prophylactic drugs for fatty liver and non-alcoholic steatohepatitis.
  • HMGB1 high mobility group box 1
  • a pharmaceutical composition for preventing and/or treating fatty liver containing the substance described in any one of the following (a) to (c): (a) a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (b) a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; and (c) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 A peptide consisting of an amino acid sequence with a sequence identity of 90% or more.
  • the pharmaceutical composition according to [1] above which also improves blood lipid levels.
  • [3] The pharmaceutical composition of [1] or [2] above, which is repeatedly administered at least once a week for 2 weeks or longer.
  • [4] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [3] above, wherein the fatty liver is fatty liver of fatty liver disease.
  • Fatty liver disease consists of non-alcoholic fatty liver disease, alcoholic fatty liver disease, nutritional fatty liver disease, starving fatty liver disease, obese fatty liver disease and diabetic fatty liver disease
  • a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of non-alcoholic steatohepatitis containing the substance described in any one of the following (a) to (c): (a) a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (b) a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; and (c) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 A peptide consisting of an amino acid sequence with a sequence identity of 90% or more.
  • a method for preventing and/or treating fatty liver comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the substance according to any one of (a) to (c) below to a subject in need of prevention and/or treatment for fatty liver
  • Method: (a) a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (b) a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; and (c) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an experimental scheme in which NASH model mice are created and HMGB1 fragment peptides are administered to them.
  • FIG. 2 is a graph showing body weight, liver weight, liver weight ratio, and body weight change of NASH model mice.
  • Figure 3 shows aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), albumin (Alb), total bilirubin (T-bil), total cholesterol (T-Cho) and medium in the serum of NASH model mice.
  • 1 is a graph showing levels of sexual fat (TG).
  • FIG. 4 is a photomicrograph showing liver tissue images of NASH model mice (magnification: 100 times).
  • FIG. 5 is a graph quantifying the results of Sirius Red staining, hydroxyproline content, and F4/80 immunostaining in the liver tissue of NASH model mice.
  • FIG. 6 is a graph showing hepatic tissue lobular inflammation, hepatocyte ballooning, and NAFLD Activity Score (NAS) in NASH model mice.
  • the present application provides a medicament for the prevention and/or treatment of fatty liver, containing the substance described in any of the following (a) to (c) (hereinafter sometimes referred to as "the peptide of the present application")
  • a composition is provided.
  • (c) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 A peptide consisting of an amino acid sequence with a sequence identity of 90% or more.
  • the present application provides a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of non-alcoholic steatohepatitis, containing the peptide of the present application.
  • the present application provides a method for preventing and/or treating fatty liver, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the peptide of the present application to a subject in need of prevention and/or treatment for fatty liver.
  • a substance consisting of the peptide of the present application for use in prevention and/or treatment of fatty liver.
  • another embodiment provides use of a substance consisting of the peptides of the present application in the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of fatty liver.
  • the invention of the present application described above is an animal model in which NASH is induced by feeding a high-fat diet, for example, an experiment using NASH mice in which NASH is induced by feeding a high-fat diet to type 4 melanocortin receptor knockout mice. Based on results, etc.
  • a "high-fat diet” in the present application is a diet that preferably contains fat at an energy ratio of 20% or more.
  • the energy content of such diet is preferably 400 kcal/100 g or more.
  • Fats contained in such high-fat diets include, for example, animal fats such as beef tallow, lard, and milk fat, and vegetable oils such as rapeseed oil, corn oil, and soybean oil.
  • Ingredients other than fat in such a high-fat diet may be normal dietary ingredients, and may include proteins, carbohydrates, minerals, and the like.
  • pharmaceutical composition for prevention and/or treatment means, for example, “pharmaceutical composition for prevention and/or treatment” or “pharmaceutical composition for prevention and/or treatment.” Used interchangeably.
  • pharmaceutical composition is used interchangeably with “pharmaceutical", “drug” or “pharmaceutical composition”.
  • Fatty liver in this application refers to a state in which drops of neutral fat accumulate in hepatocytes. These droplets of neutral fat are called lipid droplets, and pathologically, a state in which 5% or more of the liver cells have lipid droplets is called fatty liver. Therefore, when the ratio of such lipid droplets decreases, it can be said that the fatty liver has improved. Furthermore, the act of reducing the proportion of lipid droplets is included in the treatment of fatty liver in the present application.
  • Diagnostic criteria for fatty liver are well-known, and prevention and treatment of fatty liver can be evaluated based on the well-known diagnostic criteria.
  • the degree of fatty liver can be measured noninvasively by measuring the Controlled Attenuation Parameter (CAP TM ) using Fibroscan (registered trademark).
  • Fatty liver in the present application includes, for example, fatty liver of fatty liver disease.
  • Fatty liver disease includes non-alcoholic fatty liver disease, alcoholic fatty liver disease, nutritional fatty liver disease, starvation fatty liver disease, obese fatty liver disease and diabetic fatty liver disease. It is one or more selected from the group consisting of The pharmaceutical composition of the present invention is effective against such various fatty liver diseases.
  • Non-alcoholic steatohepatitis is viral or non-alcoholic fatty liver accompanied by inflammation. Strictly speaking, steatohepatitis other than viral hepatitis, alcoholic hepatitis, autoimmune hepatitis, drug-induced liver injury, and genetic disease is classified as NASH. NASH inflammation may be accompanied by fibrosis. Fatty liver, inflammation, and fibrosis are the three major symptoms of NASH. In the liver tissue of NASH, fat is usually deposited in hepatocytes (lipid droplets), hepatocytes are swollen like balloons (balloon-like cells), inflammatory cells are infiltrated, and fibrous tissue surrounds hepatocytes. A pathological condition such as
  • Patients with NASH may have high blood levels of lipids such as cholesterol and triglycerides.
  • patients with NASH may develop liver dysfunction and have high blood levels of indicators of liver dysfunction, such as bilirubin (Bil).
  • patients with NASH may develop hepatocellular damage and have high blood concentrations of indicators of hepatocellular damage, such as AST and ALT.
  • the pharmaceutical composition of the present application preferably also improves the blood lipid level of the subject.
  • the lipid concentration referred to here is, for example, total cholesterol concentration and triglyceride concentration.
  • the improvement in blood lipid level referred to herein means that the total cholesterol level is preferably reduced by 20 mg/dl or more, more preferably by 50 mg/dl or more, by administration of the pharmaceutical composition of the present application, or It refers to a reduction in triglyceride concentration of preferably 20 mg/dl or more, more preferably 50 mg/dl or more.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a peptide consisting of amino acid residues 1-44 of the human-derived HMGB1 protein.
  • examples of the HMGB1 protein include, but are not limited to, a protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a protein encoded by a DNA containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3. not a thing
  • the following peptides can be used in place of or together with the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1:
  • peptides described as i) to ii) below examples include peptides described as i) to ii) below, and peptides described as i) to ii) below, which consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • peptides that are functionally equivalent to are, but are not limited to: i) 1 or more in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 ⁇ 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 or 2) amino acids are substituted, deleted, inserted or added peptides consisting of an amino acid sequence; ii) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and about 80% or more, for example about 85% or more, about 90% or more, about 91% or more, about 92% or more, about 93% or more, about 94% or more, about 95% % or greater, about 96% or greater, about 97% or greater, about 98% or greater, or about 99%
  • examples of peptides functionally equivalent to the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 include, but are not limited to, peptides having the following activities: - activity to stimulate migration of mesenchymal stem cells; - Activity to mobilize mesenchymal stem cells from the bone marrow into the blood; activity to reduce inflammation; - activity to improve fibrosis; or - activity to regenerate tissue.
  • the amino acid length of the peptide in the present application includes ranges such as 25-35 amino acids, 20-40 amino acids, 10-50 amino acids, 10-70 amino acids, and 10-100 amino acids, but is not limited thereto. .
  • a therapeutically effective amount of the peptide of the present application or a pharmaceutical composition containing it (hereinafter sometimes referred to as "the peptide of the present application, etc.") is used for the treatment or prevention of the diseases or symptoms described herein. administered to
  • a therapeutically effective amount in the present application refers to an amount sufficient to treat or prevent the diseases or lesions described herein.
  • Treatment in this application includes, but is not limited to, alleviation, delay, inhibition, amelioration, remission, cure, cure, and the like.
  • Prevention, as used herein also includes, but is not limited to, alleviation, delay, inhibition, and the like.
  • the subject of this application is not particularly limited, and includes mammals, birds, fish, and the like. Mammals include humans or non-human animals such as humans, mice, rats, monkeys, pigs, dogs, rabbits, hamsters, guinea pigs, horses, sheep, and whales, but are limited to these. isn't it.
  • peptide or the like of the present application can exert its effects when administered to any site, such as a site or a site distal and ectopic to a site where a lesion appears.
  • the peptide of the present application may be administered to the liver, a tissue different from the liver, a tissue distant from the liver, a tissue distal to the liver, or a tissue distal and ectopic to the liver. The effect can be exhibited.
  • Methods for administering the peptides of the present application include oral administration and parenteral administration.
  • parenteral administration methods include intravascular administration (intraarterial administration, intravenous administration, etc.), intramuscular administration, subcutaneous administration, and intradermal administration. administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, pulmonary administration, transdermal administration, and the like, but are not limited thereto.
  • the peptide, etc. of the present application can be administered systemically or locally (e.g., subcutaneously, intradermally, skin surface, eyeball or palpebral conjunctiva, nasal cavity) by injection administration, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc. mucosa, oral and gastrointestinal mucosa, vaginal/endouterine mucosa, or lesion sites).
  • the administration schedule of the peptide or the like of the present application for example, it is preferable to repeatedly administer at least once a week for 2 weeks or longer, more preferably at least twice a week for 4 weeks or longer.
  • the peptide of the present application can be obtained as a recombinant by incorporating the DNA encoding the peptide into an appropriate expression system.
  • peptides in the present application can be artificially synthesized.
  • peptides can be chemically synthesized by methods such as liquid phase peptide synthesis method and solid phase peptide synthesis method.
  • Solid-phase peptide synthesis is one of the commonly used methods for chemically synthesizing peptides.
  • a polystyrene polymer gel bead with a diameter of about 0.1 mm whose surface is modified with amino groups is used as a solid phase, and amino acid chains are extended one by one by dehydration reaction. Once the target peptide sequence is completed, it is cut out from the solid phase surface to obtain the target substance.
  • the peptide of the present application may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt of the peptide.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, hydrochlorides, acetates, trifluoroacetates, and the like.
  • the peptide of the present application may be in the form of a solvate of the peptide or a solvate of a pharmaceutically acceptable salt of the peptide.
  • a solvate refers to a solute molecule coordinated with any number of solvent molecules, and includes, but is not limited to, hydrates.
  • the administration method can be appropriately selected according to the subject's age and symptoms.
  • the dosage can be selected in the range of 0.5 mg to 25 mg per kg of body weight per administration.
  • the dosage can be selected in the range of 25 to 2500 mg/body per patient.
  • the amount of the peptide can be administered within the above range.
  • the pharmaceutical composition in this application is not limited to these doses.
  • the pharmaceutical composition of the present application can be formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), and contains both pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • a conventional method for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives There may be.
  • surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrants, lubricants, fluidity enhancers, flavoring agents etc. but not limited to these, and other commonly used carriers can be used as appropriate.
  • HMGB1 fragment peptide consisting of amino acid residues 1 to 44 (SEQ ID NO: 1) of human-derived HMGB1 protein was chemically synthesized by solid-phase method. bottom.
  • HMGB1 fragment peptide is simply referred to as HMGB1 peptide, and is abbreviated as "HMGB1" in the drawings.
  • Control a group of controls, which will be described later, is abbreviated as "Control” in the drawings.
  • mice A type 4 melanocortin receptor knockout mouse (hereinafter also referred to as “MC4R-KO mouse”; genetic background: C57BL/6J) was provided by Joel K Elmquist, University of Texas Medical Center. NASH was then induced in mice by feeding MC4R-KO mice a high-fat diet, as detailed in the article below. Specifically, as shown in FIG. 1, MC4R-KO mice were fed normal diet (ND) until 8 weeks of age. After that, the diet was switched from the normal diet to a high-fat diet (HFD), and the high-fat diet was continued for 20 weeks. This caused the mice to develop NASH. Itoh M, Suganami T, Nakagawa N, et al. Melanocortin 4 receptor-deficient mice as a novel mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. Am J Pathol 2011;179:2454-63.
  • ND normal diet
  • HFD high-fat diet
  • CE-2 manufactured by CLEA Japan
  • Western diet manufactured by EPS Ekishin Co., Ltd., containing 0.21% cholesterol + 41% kcal milk fat
  • HMGB1-administered group an HMGB1 peptide-administered group
  • a control group physiological saline; NS-administered; CTRL-administered group.
  • HMGB1-administered group 5 mg/kg of HMGB1 peptide was injected into the tail vein twice a week for 4 weeks from week 16 to week 20 after the start of the high-fat diet.
  • CTRL-administered group 5 ml/kg of physiological saline was intravenously injected into the tail twice a week for four weeks from week 16 to week 20 after the start of the high-fat diet.
  • mice were euthanized, and arterial blood was collected from the hearts of the mice. Furthermore, mouse livers were collected. Then, the collected blood and liver were subjected to the following analysis. In the statistical analysis below, all significant differences were determined by the t-test.
  • AST Blood analysis Aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • Alb albumin
  • T-bil total bilirubin
  • T-Cho total cholesterol
  • TG triglycerides
  • liver Tissue Analysis b-1) HE Staining and Sirius Red Staining The collected liver was fixed with 10% formalin, and 4 ⁇ m-thick sections were prepared. These sections were then stained with hematoxylin and eosin (HE) and Sirius Red. Sections of liver tissue were HE-stained and observed under a microscope to confirm the presence or absence of lipid droplets and their ratio. In addition, 10 micrographs were randomly taken per mouse, and the area stained with Sirius Red was measured using image analysis software.
  • HE hematoxylin and eosin
  • NASH NAFLD Activity Score
  • Kleiner DE Brunt EM, Van Natta M, Behling C, Contos MJ, Cummings OW, Ferrell LD, Liu YC, Torbenson MS, Unalp-Arida A, Yeh M, McCullough AJ, Sanyal AJ; Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network. validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2005 Jun;41(6):1313-21.
  • FIG. 3 shows the AST concentration in serum
  • the second from the left shows the ALT concentration
  • the second from the right shows the Alb concentration
  • the right shows the T-bil concentration
  • the lower left of FIG. 3 shows the T-Cho concentration
  • the right shows the TG concentration.
  • the values of AST, ALT, T-bil, and T-Cho were significantly decreased (improved) in the HMGB1 peptide-administered group compared with the control group.
  • FIG. 4 shows the results of HE staining in the upper row, the results of F4/80 immunohistochemical staining in the middle row, and the results of Sirius Red staining in the lower row.
  • the left side is the micrograph of the control group, and the right side is the micrograph of the HMGB1 peptide-administered group.
  • the number of lipid droplets in hepatocytes confirmed was smaller in the HMGB1 peptide-administered group than in the control group.
  • the HMGB1 peptide-administered group showed a decrease in lipid droplets compared to the control group.
  • F4/80 immunohistochemical staining the stained area was smaller and the number of F4/80-positive cells was smaller in the HMGB1 peptide-administered group than in the control group.
  • Sirius Red staining the stained area was smaller in the HMGB1 peptide-administered group than in the control group.
  • FIG. 5 shows the Sirius Red-positive area
  • the upper right shows the quantitative results of hydroxyproline
  • the lower shows the F4/80-positive area. All of the Sirius Red-positive area, hydroxyproline amount, and F4/80-positive area were significantly lower in the HMGB1 peptide-administered group than in the control group.
  • FIG. 6 shows the evaluation results of lobular inflammation
  • the middle shows the evaluation results of hepatocyte ballooning
  • the right shows NAS.
  • the lobular inflammation score, hepatocyte ballooning score, and NAS were significantly lower than in the control group.
  • Hepatic inflammation and hepatocyte/hepatic dysfunction F4/80 is known to be a macrophage marker.
  • the liver tissue of the HMGB1 peptide-administered group had a smaller area stained by F4/80 immunohistochemical staining than the liver tissue of the control group, and the number of F4/80-positive cells was smaller.
  • HMGB1 peptide administration decreased the number of inflammation-inducing cells in NASH model mice.
  • histological evaluation also showed a reduction in inflammation in the HMGB1 peptide-administered group compared to the control group.
  • the hepatocyte ballooning score was also significantly improved by administration of the HMGB1 peptide.
  • the serum biochemical analysis showed a decrease in AST and ALT. This indicates that hepatocellular injury was reduced in the HMGB1 peptide-administered group as compared to the control group.
  • a decrease in T-bil was observed in serum biochemical analysis. From this, it can be seen that liver dysfunction was also reduced in the HMGB1 peptide-administered group compared to the control group. Based on the above results, HMGB1 peptide is presumed to ameliorate NASH-induced liver inflammation, hepatocellular injury, and liver dysfunction.
  • Fibrosis of Liver Sirius Red is known to stain type I and type III collagen and is used as a fibrosis marker.
  • the liver tissue of the HMGB1 peptide-administered group had a smaller region stained by Sirius Red staining than the liver tissue of the control group. It is suggested that administration of the peptide reduced the fibrotic area of the liver tissue.
  • Hydroxyproline is also known to be a marker of fibril precursors. A reduction in hydroxyproline levels also suggests a reduction in liver fibrosis. Based on the above results, the HMGB1 peptide is presumed to improve liver fibrosis caused by NASH.
  • HMGB1 peptide Fatty Liver and Blood Lipids
  • the number of lipid droplets was significantly reduced in the HMGB1 peptide-administered group compared to the control group.
  • the above results show that administration of the HMGB1 peptide improved the fatty liver itself.
  • the T-Cho concentration was also decreased in the HMGB1 peptide-administered group compared to the control group. This suggests that administration of HMGB1 peptide also improves blood lipid status.
  • Many therapeutic drugs for NASH improve liver inflammation and fibrosis, but there are few that improve fatty liver and blood lipids. Therefore, it can be said that the HMGB1 peptide can provide effects that are difficult to achieve with other NASH therapeutic agents.
  • a pharmaceutical composition containing the peptide of the present application can be used as a therapeutic and/or prophylactic agent for various symptoms associated with fatty liver, non-alcoholic steatohepatitis, and fatty liver, for which existing therapeutic agents are not sufficiently effective. expected to be beneficial.

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Abstract

本発明者らは、HMGB1に由来するペプチドが、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、および脂肪肝に伴う種々の症状の治療薬及び／又は予防薬として用いることができることを見出した。この知見に基づき、本願は、HMGB1に由来するペプチドの従来とは異なる用途を提供する。

Description

脂肪肝および非アルコール性脂肪肝炎の治療薬
　本願は、脂肪肝および非アルコール性脂肪肝炎の予防および／または治療のための医薬組成物に関する。
　脂肪性肝疾患は、ウィルス感染、アルコール、それ以外の理由により起こる。ウィルスおよびアルコール以外が原因の脂肪性肝疾患は、糖尿病や脂質異常症、肥満／メタボリックシンドロームによって引き起こされるものが多い。ウィルス性、アルコール性でない脂肪肝およびこれによって引き起こされる一連の肝臓疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と呼ばれる。一般に、患者の飲酒量が男性の場合３０ｇ／日、女性の場合２０ｇ／日未満だと、脂肪性肝疾患は、非アルコール性と判定される。
　NAFLDのうち、肝臓の脂肪化に炎症が伴ったものは、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)と呼ばれる。そして、この炎症には、線維化を伴うことがある。この線維化が進行すると、肝硬変に至る。日本では、健康診断を受ける成人の２０～３０％がNAFLD有病と言われており、そのうちの５～２０％がNASHにまで進行していると言われている。
　現在、NASHの治療薬は多数存在するが、その多くは肝臓の炎症および線維化を抑えるための薬であり、脂肪肝そのものに効く良い薬は未だ存在しない。
WO 2012/147470
Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif D, Fazel Y, Henry L and Wymer M. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 2016;64:73-84.
　本願は、脂肪肝および非アルコール性脂肪肝炎の治療薬及び／又は予防薬の提供を目的とする。
　本発明者らは、High mobility group box 1 (HMGB1)タンパク質に由来するペプチドが、肝臓の炎症や繊維化を改善するだけではなく、脂肪肝そのものを改善できることを見出した。
　すなわち、本願は、以下を提供する。
〔１〕
　以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、脂肪肝の予防および／または治療のための医薬組成物：
　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；および
　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
〔２〕
　血中脂質濃度をも改善させる、前記〔１〕に記載の医薬組成物。
〔３〕
　少なくとも週１回、２週間以上連続で繰り返し投与される、前記〔１〕または〔２〕に記載の医薬組成物。
〔４〕
　脂肪肝が脂肪性肝疾患の脂肪肝である、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔５〕
　脂肪性肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、栄養性脂肪性肝疾患、飢餓性脂肪性肝疾患、肥満性脂肪性肝疾患及び糖尿病性脂肪性肝疾患からなる群より選択される１種以上である、前記〔４〕に記載の医薬組成物。
〔６〕
　以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、非アルコール性脂肪肝炎の予防および／または治療のための医薬組成物：
　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；および
　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
〔７〕
　脂肪肝の予防および／または治療が必要な対象に、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の治療有効量を投与する工程を含む、脂肪肝の予防方法および／または治療方法：
　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；および
　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
〔８〕
　脂肪肝の予防および／または治療に用いるための、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質：
　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；および
　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
〔９〕
　脂肪肝の予防および／または治療のための医薬の製造における、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の使用：
　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；および
　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
図１は、NASHモデルマウスを作成し、これにHMGB1断片ペプチドを投与する実験スキームを説明するダイアグラムである。 図２は、NASHモデルマウスの体重、肝臓重量、肝体重比、体重変化を示すグラフである。 図３は、NASHモデルマウスの血清中における、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニン・アミノトランスフェラーゼ(ALT)、アルブミン(Alb)、総ビリルビン(T-bil)、総コレステロール(T-Cho)及び中性脂肪(TG)のレベルを示すグラフである。 図４は、NASHモデルマウスの肝組織像を示す顕微鏡写真である（倍率はいずれも１００倍）。上から順にヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、F4/80免疫組織染色、Sirius Red染色の結果を示す。 図５は、NASHモデルマウスの肝組織において、Sirius Red染色の結果、ヒドロキシプロリン含有量、F4/80免疫染色の結果を定量化したグラフである。 図６は、NASHモデルマウスの肝組織の小葉の炎症、肝細胞の風船化、及びNAFLD Activity Score (NAS)を示すグラフである。
　本願は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質（以下、「本願のペプチド」と称する場合がある。）を含有する、脂肪肝の予防および／または治療のための医薬組成物を提供する。
　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；および
　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
　本願は、本願のペプチドを含有する、非アルコール性脂肪肝炎の予防および／または治療のための医薬組成物を提供する。
　本願は、脂肪肝の予防および／または治療が必要な対象に、本願のペプチドの治療有効量を投与する工程を含む、脂肪肝の予防方法および／または治療方法を提供する。また、別の実施形態では、脂肪肝の予防および／または治療に用いるための、本願のペプチドからなる物質を提供する。さらに、別の実施形態では、脂肪肝の予防および／または治療のための医薬の製造における、本願のペプチドからなる物質の使用を提供する。
　上述の本願の発明は、高脂肪食を与えることによりNASHが誘導された動物モデル、例えば、４型メラノコルチン受容体ノックアウトマウスに高脂肪食を与えることによりNASHが誘導されたNASHマウスを使用した実験結果等に基づく。
　本願における「高脂肪食」としては、脂肪をエネルギー比率にて好ましくは２０％以上含む食餌である。このような食餌のエネルギー量として、４００ｋｃａｌ／１００ｇ以上であることが好ましい。かかる高脂肪食に含まれる脂肪としては、例えば、牛脂、豚脂、乳脂肪等の動物性脂肪や、ナタネ油、コーン油、大豆油等の植物性油、が挙げられる。かかる高脂肪食における脂肪以外の成分は、通常の食餌成分であればよく、タンパク質、炭水化物、ミネラル等を含んでいてもよい。
　本願において、「予防および／または治療のための医薬組成物」という用語は、例えば、「予防用および／または治療用の医薬組成物」または「予防および／または治療するための医薬組成物」と互換的に用いられる。「医薬組成物」という用語は、「医薬」、「薬剤」または「薬学的組成物」と互換的に用いられる。
　本願における脂肪肝とは、肝細胞に中性脂肪のしずくが溜まった状態をいう。この中性脂肪のしずくは脂肪滴と呼ばれ、病理学的には、肝細胞の５％以上に脂肪滴が形成された状態を、脂肪肝という。従って、かかる脂肪滴の割合が減少した場合、脂肪肝が改善したと言うことができる。さらに、脂肪滴の割合を減少させる行為は、本願における脂肪肝の治療に包含される。
　脂肪肝に関する診断基準は周知であり、その周知の診断基準に基づき、脂肪肝の予防および治療を評価することができる。例えば、下記文献に報告されるように、Fibroscan（登録商標）を用いてControlled Attenuation Parameter (CAPTM)を測定することにより、脂肪肝の度合いを非侵襲的に計測できる。
Newsome PN, Sasso M, Deeks JJ, Paredes A, Boursier J, Chan WK, Yilmaz Y, Czernichow S, Zheng MH, Wong VW, Allison M, Tsochatzis E, Anstee QM, Sheridan DA, Eddowes PJ, Guha IN, Cobbold JF, Paradis V, Bedossa P, Miette V, Fournier-Poizat C, Sandrin L, Harrison SA. FibroScan-AST (FAST) score for the non-invasive identification of patients with non-alcoholic steatohepatitis with significant activity and fibrosis: a prospective derivation and global validation study. Lancet Gastroenterol Hepatol. 2020 Apr;5(4):362-373.
　本願における脂肪肝としては、例えば脂肪性肝疾患の脂肪肝が挙げられる。脂肪性肝疾患としては、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、栄養性脂肪性肝疾患、飢餓性脂肪性肝疾患、肥満性脂肪性肝疾患及び糖尿病性脂肪性肝疾患からなる群より選択される１種以上である。本発明の医薬組成物は、かかる種々の脂肪性肝疾患に対して有効である。
　ウィルス性またはアルコール性でない脂肪肝に炎症を伴ったものが非アルコール性脂肪肝炎(NASH)である。厳密には、脂肪肝炎のうち、ウィルス性肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、薬物性肝障害、遺伝子疾患によるもの以外の脂肪肝炎が、NASHと分類される。NASHの炎症には、線維化を伴うことがある。脂肪肝、炎症、線維化が、NASHの三大症状である。そして、NASHの肝組織では、通常、肝細胞に脂肪が沈着する（脂肪滴）、肝細胞が風船様に腫大する（風船様細胞）、炎症細胞が浸潤する、そして肝細胞の周囲が線維化するといった病態が観察される。
　NASH罹患者では、コレステロール、中性脂肪等の脂質の血中濃度が高い場合がある。また、NASH罹患者では、肝機能障害が生じ、ビリルビン(Bil)等の肝機能障害の指標の血中濃度が高い場合がある。さらには、NASH罹患者では、肝細胞障害が生じ、AST、ALT等の肝細胞障害の指標の血中濃度が高い場合がある。
　従って、本願の医薬組成物は、好ましくは、対象の血中脂質濃度をも改善させる。ここで言う脂質濃度とは、例えば総コレステロール濃度、中性脂肪濃度である。ここで言う血中脂質濃度の改善とは、本願の医薬組成物の投与により、総コレステロール濃度が好ましくは２０ｍｇ／ｄｌ以上低下すること、より好ましくは５０ｍｇ／ｄｌ以上低下することをいい、あるいは、中性脂肪濃度が好ましくは２０ｍｇ／ｄｌ以上低下すること、より好ましくは５０ｍｇ／ｄｌ以上低下することをいう。
　本願において、「対象」という用語は、「患者」、「個体」または「動物」と互換的に用いられる。
　本願において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとは、ヒト由来のHMGB1タンパク質のアミノ酸残基1-44からなるペプチドである。
　本願において、HMGB1タンパク質としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、および、配列番号：３に記載の塩基配列を含むDNAによってコードされるタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。
　本願の医薬組成物においては、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに代えて、またはこれと共に以下のペプチドを用いることもできる：
A) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が改変（置換、欠失、挿入若しくは付加）されたアミノ酸配列からなるペプチド；
B) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が改変（置換、欠失、挿入若しくは付加）されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチド。
　そのようなペプチドの例としては、以下のi)～ii)として記載するペプチド、ならびに、以下のi)～ii)として記載するペプチドであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドを例示できるが、これらに限定されるものではない：
i) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば１個～１０個、１個～９個、１個～８個、１個～７個、１個～６個、１個～５個、１個～４個、１個～３個、または１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；
ii) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
　本願において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、以下の活性を有するペプチドが例示できるが、これらに限定されるものではない：
・間葉系幹細胞の遊走を刺激する活性；
・間葉系幹細胞を骨髄から血中に動員する活性；
・炎症を緩和する活性；
・線維化を改善する活性；または
・組織を再生する活性。
　本願におけるペプチドのアミノ酸長としては、例えば25～35アミノ酸、20～40アミノ酸、10～50アミノ酸、10～70アミノ酸、10～100アミノ酸等の範囲が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本願のペプチドやそれを含有する医薬組成物（以下、「本願のペプチド等」と称する場合がある。）の治療有効量が、本明細書に記載の疾患や症状の治療や予防のために対象に投与される。
　本願における治療有効量とは、本明細書に記載の疾患や病変の治療や予防に十分な量をいう。本願における治療には、軽減、遅延、阻止、改善、寛解、治癒、完治などが含まれるが、これらに限定されない。また本願における予防には、軽減、遅延、阻止などが含まれるが、これらに限定されない。
　本願における対象としては、特に制限はなく、哺乳類、鳥類、魚類等が挙げられる。哺乳類としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ウマ、ヒツジ、クジラなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。
　本願のペプチド等の投与部位に制限はなく、病変が現れる部位もしくはその近傍、それらとは異なる部位（それら以外の部位）、病変が現れる部位から離れた部位、病変が現れる部位から遠位にある部位、または、病変が現れる部位に対して遠位かつ異所である部位など、いかなる部位に投与されても、本願のペプチド等は、その効果を発揮することができる。
　また本願のペプチド等は、肝臓、肝臓とは異なる組織、肝臓から離れた組織、肝臓から遠位にある組織、または、肝臓に対して遠位かつ異所にある組織などに投与されても、その効果を発揮することができる。
　本願のペプチド等の投与方法としては、経口投与または非経口投与が挙げられ、非経口投与方法としては、血管内投与（動脈内投与、静脈内投与等）、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられるが、これらに限定されない。また、本願のペプチド等を、注射投与、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって全身または局部的（例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、口腔内および消化管粘膜、膣・子宮内粘膜、または病変部位など）に投与できる。
　本願のペプチド等の投与スケジュールとしては、例えば、少なくとも週１回、２週間以上連続で繰り返し投与することが好ましく、少なくとも週２回、４週間以上連続で繰り返し投与することがより好ましい。
　また、本願のペプチド等に代えて、本願のペプチドを分泌する細胞、該ペプチドをコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクター、およびこれらを含有する医薬組成物を用いることもできる。
　本願におけるペプチドを、該ペプチドをコードするDNAを適当な発現系に組み込んで遺伝子組換え体(recombinant)として得ることができる。
　また本願におけるペプチドを人工的に合成することも出来る。本願におけるペプチド合成法では、ペプチド液相合成法およびペプチド固相合成法等の方法によってペプチドを化学合成することができる。ペプチド固相合成法はペプチドを化学的に合成する際に、一般的に用いられる方法のひとつである。表面をアミノ基で修飾した直径0.1mm程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズなどを固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していく。目的とするペプチドの配列が出来上がったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る。固相合成法により、バクテリア中で合成させることの難しいリボソームペプチドの合成や、D体や安定同位元素（2H、13C、15N等）置換体などの非天然アミノ酸の導入、重原子置換体（例えばセレノメチオニンなどのセレノアミノ酸）の導入、ペプチド及びタンパク質主鎖の修飾なども可能である。固相法において70から100個を超える長いペプチド鎖を合成する場合、ネイティブケミカルライゲーション法を用いて、2つのペプチド鎖を結合させる事により合成することが可能である。
　本願のペプチドは、該ペプチドの医薬上許容される塩の形態であってもよい。医薬上許容される塩としては、塩酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本願のペプチドは、該ペプチドの溶媒和物、または、該ペプチドの医薬上許容される塩の溶媒和物の形態であってもよい。溶媒和物とは、溶質分子に任意の数の溶媒分子が配位しているものをいい、例えば水和物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　また、対象の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本願のペプチドを例えばヒトに投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重1 kgあたり0.5mgから25mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり25から2500mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。本願のペプチドを分泌する細胞や該ペプチドをコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、該ペプチドの量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本願における医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本願の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
　なお、本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明は、下記の実施例によってさらに例示されるが、それらに限定されるものではない。
実施例１
NASHモデルマウスに対するHMGB1断片ペプチドの有効性の評価
（１）材料および方法
ｉ）薬剤調製
　ヒト由来のHMGB1タンパク質のアミノ酸残基1-44（配列番号：１）からなるペプチドを固相法により化学合成した。以下、当該HMGB1断片ペプチドを単にHMGB1ペプチドと称し、図面では「HMGB1」と省略して表記する。また、後述のコントロール群を図面では「Control」と省略して表記する。
ｉｉ）NASHモデルマウスの作成
　テキサス大学メディカルセンター　Joel K Elmquistより、４型メラノコルチン受容体ノックアウトマウス（以下、「MC4R-KOマウス」とも称する。遺伝的バックグランド：C57BL/6J）の提供を受けた。
　次いで、下記の文献に詳述されるように、MC4R-KOマウスに高脂肪食を与えることにより、マウスにNASHを誘導した。具体的には、図１に示すように、生後８週齢まではMC4R-KOマウスに普通食（ND）を与えた。その後、餌を普通食から高脂肪食（HFD）に切り替え、２０週間高脂肪食を与え続けた。これにより、マウスにNASHを発症させた。
Itoh M, Suganami T, Nakagawa N, et al. Melanocortin 4 receptor-deficient mice as a novel mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. Am J Pathol 2011;179:2454-63.
　なお、普通食としては、CE-2（日本クレア社製）を使用した。高脂肪食としては、ウェスタンダイエット（ＥＰＳ益新社製、０．２１％コレステロール＋４１％ｋｃａｌ乳脂肪含有）を使用した。
ｉｉｉ）HMGB1ペプチドの投与
　実験は、このマウスを、HMGB1ペプチド投与群（HMGB1投与群）とコントロール群（生理食塩水；NS投与；CTRL投与群）との二群に分けて行った。HMGB1投与群には、高脂肪食開始後１６週から２０週までの４週間、HMGB1ペプチドを週二回、5mg/kgの量で尾静注した。CTRL投与群には、高脂肪食開始後１６週から２０週までの４週間、生理食塩水を週二回、5ml/kgの量で尾静注した。
ｉｖ）投与効果の評価
　高脂肪食開始後２０週経過時点でマウスを安楽死させ、マウスの心臓から動脈血を採取した。さらには、マウスの肝臓を採取した。そして、採取した血液、肝臓に対して以下の解析を行った。なお、以下の統計解析では、有意差は、全てｔ検定で求めた。
ａ）血液分析
　採取した動脈血におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニン・アミノトランスフェラーゼ(ALT)、アルブミン(Alb)、総ビリルビン(T-bil)、総コレステロール(T-Cho)及び中性脂肪(TG)の血清濃度を、Oriental Yeast Co., Ltd. Nagahama LSL(Nagahama, Japan)が測定した。
ｂ）肝組織分析
ｂ－１）HE染色およびSirius Red染色
　採取した肝臓を、１０％ホルマリンで固定し、厚さ4μmの切片を作成した。そして、これらの切片に対してヘマトキシリン・エオジン(HE)およびSirius Red染色を行った。肝臓組織の切片をHE染色し、顕微鏡で観察することにより、脂肪滴の有無やその割合を確認した。また、マウス一匹あたり１０枚の顕微鏡写真をランダムに撮影し、画像解析ソフトを用いて、Sirius Redで染色された面積を測定した。
ｂ－２）免疫組織染色
　採取した肝臓を、１０％ホルマリンで固定し、厚さ4μmの切片を作成した。この切片に対し、抗F4/80ウサギモノクローナル抗体(Abcam, Cambridge, UK)を用いて、免疫組織染色を行った。上記と同様に顕微鏡写真を撮影し、画像解析ソフトを用いて、抗F4/80抗体で染色された面積を測定した。
ｂ－３）ヒドロキシプロリンアッセイ
　採取した肝組織20 mgをホモジナイズし、QuickZyme Hydroxyproline Assays (QuickZyme Bioscience, Zernikedreef, Netherlands)を用いて、試料中のヒドロキシプロリンの量を測定した。
ｂ－４）NASの測定
　得られた肝臓の組織染色に対して顕微鏡観察を行い、下記表１に示す基準に従って、肝組織における小葉の炎症と肝細胞の風船化を評価した。肝細胞に障害が発生すると、膨張して風船化する。したがって、風船化した肝細胞が多いと言うことは、障害を受けた肝細胞が多いことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
 
　さらには、下記の文献に基づいて、NAFLD Activity Score (NAS)を算出した。NASはNASHの病状の度合いを示す指標であり、数値が高いほど、NASHの病態が進行している、あるいは悪化していることを示す。
Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, Behling C, Contos MJ, Cummings OW, Ferrell LD, Liu YC, Torbenson MS, Unalp-Arida A, Yeh M, McCullough AJ, Sanyal AJ; Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2005 Jun;41(6):1313-21.
（２）結果
ｉ）体重、肝臓重量
　図２上段左に高脂肪食開始後２０週経過時点でのマウスの体重を、上段真ん中に肝臓重量を、上段右に肝体重比を示す。また、下段にHMGB1ペプチド投与開始後飼育完了までのマウスの体重変化を示す。これらの図に示すように、HMGB1ペプチド投与群とコントロール群とで、マウスの体重、肝臓重量、肝体重比、および体重変化のいずれにも、有意差が認められなかった（図中、「ns」と示す）。
ｉｉ）血清の生化学分析
　図３上段左は血清中のAST濃度を、左から二番目はALT濃度を、右から二番目はAlb濃度を、右はT-bil濃度を示す。図３下段左はT-Cho濃度を、右はTG濃度を示す。コントロール群に比較してHMGB1ペプチド投与群では、AST, ALT, T-bil, T-Choの数値が、有意に低下（改善）した。
ｉｉｉ）組織学的評価
　図４上段はHE染色の結果を、中段はF4/80免疫組織染色の結果を、下段はSirius Red染色の結果を示す。左側はコントロール群の顕微鏡写真であり、右側はHMGB1ペプチド投与群の顕微鏡写真である。HE染色では、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、確認された肝細胞の脂肪滴の数が少なかった。すなわち、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、脂肪滴の減少が確認された。F4/80免疫組織染色では、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、染色された領域が小さく、F4/80陽性細胞の数が少なかった。Sirius Red染色では、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、染色された領域が小さかった。
ｉｖ）肝組織解析結果
　図５上段左はSirius Red陽性面積を、上段右はヒドロキシプロリンの定量結果を、下段はF4/80陽性面積を示す。HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、Sirius Red陽性面積、ヒドロキシプロリン量、およびF4/80陽性面積のいずれも、有意に低かった。
ｖ）NAS分析結果
　図６左は小葉の炎症の評価結果を、真ん中は肝細胞の風船化の評価結果を、右はNASを示す。HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、小葉の炎症のスコアも、肝細胞の風船化のスコアも、NASも有意に低かった。
（３）考察
ｉ）肝臓の炎症と肝細胞・肝機能障害
　F4/80は、マクロファージマーカーであることが知られている。図４中段および図５下段に示すように、HMGB1ペプチド投与群の肝組織ではコントロール群の肝組織に比べて、F4/80免疫組織染色によって染色された領域が小さく、F4/80陽性細胞の数も少なかったことから、NASHモデルマウスでは、HMGB1ペプチドの投与によって、炎症を惹起する細胞が減少したことが示唆される。加えて、図６左に示すように組織学的評価でも、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比べて、炎症の低減が認められた。さらに、図６真ん中に示すように、肝細胞の風船化のスコアもHMGB1ペプチドの投与によって有意に改善した。さらに、図３上段左および左から２番目に示すように、血清の生化学分析では、ASTやALTの低下が認められた。このことから、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比べて、肝細胞障害が軽減されたことが分かる。加えて、図３上段右に示すように、血清の生化学分析では、T-bilの低下が認められた。このことから、HMGB1ペプチド投与群では、コントロール群に比べて肝機能障害も軽減されたことが分かる。以上の結果から、HMGB1ペプチドは、NASHによる肝臓の炎症や肝細胞障害、肝機能障害を改善すると推定される。
ｉｉ）肝臓の線維化
　Sirius Redは、I型・III型コラーゲンを染色することが知られており、線維化のマーカーとして用いられている。図４下および図５上段左に示すように、HMGB1ペプチド投与群の肝組織ではコントロール群の肝組織に比べて、Sirius Red染色によって染色された領域が小さかったことから、NASHモデルマウスでは、HMGB1ペプチドの投与によって、肝組織の線維化した部分が減少したことが示唆される。また、ヒドロキシプロリンは線維の前駆体のマーカーであることが知られている。ヒドロキシプロリン量の低下も、肝臓の線維化が低減したことを示唆している。以上の結果から、HMGB1ペプチドは、NASHによる肝臓の線維化を改善すると推定される。
ｉｉｉ）脂肪肝および血中脂質
　図４上に示すように、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、脂肪滴の数が顕著に減少した。以上の結果は、HMGB1ペプチドの投与によって、脂肪肝そのものが改善したことを示す。さらには、図３下段左に示すように、HMGB1ペプチド投与群ではコントロール群に比較して、T-Choの濃度も低下した。このことは、HMGB1ペプチドの投与によって、血中脂質の状態も改善することを示唆している。NASHの治療薬では、肝臓の炎症および線維化を改善するものが多いが、脂肪肝や血中脂質を改善するものは少ない。ゆえに、HMGB1ペプチドは、他のNASH治療薬では実現しにくい効果を提供できると言える。
　本願のペプチドを含む医薬組成物は、既存の治療薬では十分な効果が得られない脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、および脂肪肝に伴う種々の症状の治療薬及び／又は予防薬として多大な恩恵をもたらすものと期待される。

Claims (6)

  1. 　以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、脂肪肝の予防および／または治療のための医薬組成物：
    　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；および
    　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
  2. 　血中脂質濃度をも改善させる、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　少なくとも週１回、２週間以上連続で繰り返し投与される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 　脂肪肝が脂肪性肝疾患の脂肪肝である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　脂肪性肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、栄養性脂肪性肝疾患、飢餓性脂肪性肝疾患、肥満性脂肪性肝疾患及び糖尿病性脂肪性肝疾患からなる群より選択される１種以上である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、非アルコール性脂肪肝炎の予防および／または治療のための医薬組成物：
    　（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    　（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド； および
    　（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
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