JP6913402B2

JP6913402B2 - 非アルコール性脂肪性肝炎（ｎａｓｈ）の治療と予防に適した配合剤

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Publication number: JP6913402B2
Application number: JP2019516717A
Authority: JP
Inventors: 悟久保田; 透河野
Original assignee: MEDICO CONSL CO.,LTD.
Current assignee: MEDICO CONSL CO.,LTD.
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2021-08-04
Anticipated expiration: 2037-11-30
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Description

本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療と予防に適した、医薬配合剤及び健康食品に関する。
さらに詳述すると、本発明は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療をするための亜鉛製剤、特にポラプレジンクと、セレン製剤、特に亜セレン酸ナトリウムとの配合剤、ならびに非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に関連もしくは付随する疾患の治療における亜鉛製剤、特にポラプレジンクと、セレン製剤、特に亜セレン酸ナトリウムとの配合剤に関するものである。本明細書で定義される亜鉛製剤、特にポラプレジンクと、セレン製剤、特に亜セレン酸ナトリウムを含み、１種又は複数の他の活性物質を配合してもよく、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療及び予防における使用のための医薬配合剤及び健康食品もまた企図される。本明細書は以後亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）と記載する場合があるが、かかる記載は亜鉛製剤及びセレン製剤の代表例を示すものである。

アルコールに起因しない脂肪肝による疾患は、肝脂肪変性から炎症性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ；非アルコール性脂肪性肝炎）に進行し、肝線維化を経て、肝硬変や肝細胞がんにまで進展する。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の進行した状態であり、日本国内でＮＡＳＨ１００万人、ＮＡＦＬＤ１，０００万人以上の患者推定がなされている。北アメリカでは成人の６〜１５％、欧州では同じく３〜１５％が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）であると推定されている。従って、予防及び治療対策が急務となっている。ところで、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症機序としては、先ず肝臓内外の変化により肝脂肪変性が起きる。これに呼応して炎症性サイトカインレベルが上昇する事で炎症が促進すると考えられている。加えて、発症には肥満や糖尿病などによる糖代謝異常が深く関わっている。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に関する対策は食事療法、運動療法、および体重管理が主な対処法であり、予防に対応する健康食品や決定的な治療薬が開発されていない現在、予防に対応する健康食品及び長期使用が可能な安全でかつ有効な医薬品の登場が待たれている。
肝炎、特にＣ型ウイルス性肝炎の治療についてはインターフェロンと抗ウイルス剤による治療から、Ｃ型肝炎ウイルスの複製に関わるタンパクを阻害し、ウイルスの増殖を抑制するポリメラーゼ阻害剤やＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ合成を阻害するプロテアーゼ阻害剤等の登場により劇的に変化し、Ｃ型肝炎患者の肝炎ウイルス量が測定検出限界以下（ＳＶＲ：持続性ウイルス学的著効）に改善したという患者が９０％以上存在すると言う結果が報告されている。
Ｃ型ウイルス性肝炎患者の肝炎ウイルス量を測定検出限界以下(ＳＶＲ：持続性ウイルス学的著効）に改善する治療薬が開発され、既に臨床応用されているが、肝炎ウイルスが関与しない非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に対する確定した治療薬は未だ存在しない。世界的に急増している非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に対して、肝硬変、肝がんへの進展を抑制し、肝機能を改善する治療薬の開発が待たれている。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）においては、肝線維化が進行するのは３７％であり、糖尿病を合併していると線維化が進行しやすくなり、高ＢＭＩであると肝硬変に移行しやすくなる（非特許文献１）。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）においては必ずしも線維化が進行するということではないが、重症化抑制には肝線維化の抑制が重要になってくる。又非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）においては約５％で肝硬変に進展すると報告されている（非特許文献２）。亜鉛製剤（ポラプレジンク）においては、既に肝線維化を抑制することが示され、特許番号４８０２４７０号として開示されている（特許文献１）。

特許４８０２４７０号亜鉛製剤（ポラプレジンク）は消化性潰瘍治療剤として有効であることが知られており、本邦ならびに韓国にて汎用されている。消化性潰瘍治療剤として用いられている亜鉛製剤（ポラプレジンク）はL−カルノシン亜鉛塩として知られている(特許文献１)。

Adams LA et.al J.Hepatology 2005.42(1):132-138 The histological course of nonalcoholic fatty liver disease : a longitudinal study of 103 patients with sequential liver biopsies. Adams LA et.al. Gastroenterology 2005.129(1) 113-121 The natural history of nonalcoholic fatty liver disease : a population-based cohort study Ming Ding et.al Biol Trace Elem Res 2010.133(1) 83-97 Selenium Supplementation Decreases Hepatic Fibrosis in Mice After Chronic Carbon Tetrachloride Administration セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）には、肝線維化を抑制することが示されている（非特許文献３）。 Kleiner.D.E,et.al Hepatology 2005.41(6):1313-1321 Design and Validation of a Histological Scoring System for Nonalcoholic Fatty Liver Disease セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）はセレン欠乏による視力障害、神経障害、心筋障害、毛髪変化の改善の目的で海外では使用されている。本邦はじめ海外でも肝機能の予防・治療の目的で医療用治療薬としての使用は認可されていない。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特徴は、肝臓の組織中に大滴性脂肪の沈着、肝細胞の風船状肥大（バルーニング）、肝細胞周囲の線維化、炎症細胞の浸潤などが組織像として現われる。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の活動度の指標としてＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）を用いてＮＡＦＬＤ総合評価として用いている。これは脂肪化、炎症細胞浸潤、バルーニング変性の３項目をスコア−化し、ＮＡＳ満点８点により活動度を判定する。２００５年にKleinerが発表してから、臨床応用されている方法である（非特許文献４）。 Sugino.H et.al J Gastroenterol Hepatol 2008.23(12) 1909-1916 Polaprezinc attenuates liver fibrosis in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis 高松正剛他 Theraputic Research 2011.32(7) 967-973 NAFLD治療における亜鉛補充の有益な効果 Y Murata et.al Clin J Gastroenterol 2011.4.242-248 Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) after pancreatico-duodenectomy: association of pancreatic exocrine deficiency and infection 亜鉛製剤（ポラプレジンク）、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）のそれぞれにおいては肝線維化抑制作用が報告されているが、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特徴である肝臓の組織中に大滴性脂肪の沈着、肝細胞の風船状肥大（バルーニング）、炎症細胞の浸潤などの組織像の改善やＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）を用いての改善効果については確認されていない。何れも強い活性酸素消去作用を有する事から、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独及び亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤を用い、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に対する治療を行ない、検討した。亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独にはコントロール群と比較して改善は認められたが、何れも非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と正常肝が同程度混在するレベルであり、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を改善した結果には至らなかった。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤はほぼ正常肝と考えられるＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）を示し、コントロール、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独に比較して、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に対する有意な改善が認められた。尚、亜鉛製剤（ポラプレジンク）には非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）での肝線維化に限定した改善効果（非特許文献５）が報告されているが、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特徴である肝臓の組織中に大滴性脂肪の沈着、肝細胞の風船状肥大（バルーニング）、炎症細胞の浸潤などの組織像の改善やＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）を用いての改善作用については確認されていない。加えて非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に対して、ウルソデオキシコール酸や脂質改善薬などの肝機能の改善が期待される薬剤に亜鉛製剤（ポラプレジンク）を追加投与した群と非投与群にて、亜鉛製剤（ポラプレジンク）の上乗せ改善効果を検討しているが、肝線維化の抑制と炎症を抑制した結果（非特許文献６）であり、肝臓の組織中の大滴性脂肪の沈着、肝細胞の風船状肥大（バルーニング）、ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）の改善は示されていない。又膵頭十二指腸切除後に非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を併発し、大量の膵酵素剤と亜鉛製剤（ポラプレジンク）を投与後に下痢と肝機能が正常化され、その後の継続投与で、画像での正常化が観られた（非特許文献７）ことが報告されている。大量の膵酵素剤と亜鉛製剤（ポラプレジンク）の併用効果を示したものであり、亜鉛製剤（ポラプレジンク）が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に効果があることは確認されていない。

本発明の目的は、肝炎ウイルスが関与しない非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／または肝脂肪性変性に対する治療及び予防に適した医薬及び健康食品を提供する点にある。

本発明は、亜鉛製剤とセレン製剤を有効成分とする、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および／または肝脂肪性変性の治療と予防に適した配合剤を提供する。すなわち、本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／または肝脂肪性変性の治療及び予防に適した医薬配合剤及び健康食品は、亜鉛製剤とセレン製剤との配合剤である。
具体的には、限定されるものではないが、本発明は、亜鉛製剤としてポラプレジンク、セレン製剤として亜セレン酸ナトリウムとの配合剤であることが望ましい。ポラプレジンクはL−カルノシン亜鉛塩である。
本発明の具体的態様としては、経口投与が好ましく、亜鉛製剤中の亜鉛量としては成人１日あたり０．０１５g〜０．２５ｇ、セレン製剤中のセレン量としての配合量は成人１日あたり１０μg〜４５０μgであることが好ましい。亜鉛製剤中の亜鉛量としては成人１日あたり０．０１５g未満であると厚生労働省による食事摂取推奨量に足りず、病気の予防・治療には少な過ぎる用量であり、０．２５ｇを超えると、長期投与における安全性が懸念される。医薬品として認可されている亜鉛製剤の１つの酢酸亜鉛では亜鉛の1日最大用量として０．２５ｇとしている点である。またセレン製剤中のセレン量としての配合量は成人１日あたり１０μg未満であると、厚生労働省による食事摂取推奨量に足りず、病気の予防・治療には少な過ぎる用量であり、４５０μgを超えると、厚生労働省による食事摂取上限量を上回るので、安全性に配慮した。
本発明は、亜鉛製剤とセレン製剤とを有効成分として含む配合剤であるが、これにビタミンＣ、ビタミンＥ、高山植物である紅景天、インスリン抵抗性を改善するメトホルミン、ピオグリタゾン、ＤＰＰ−４阻害薬、抗酸化作用を持つＥＰＡ（エイコサペンタサ塩酸）、高脂血症を改善するべザフィブラート、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、高コレステロール血症改善薬、アンジオテンシンII受容体拮抗剤、抗ＴＮＦ−α作用のあるペントキシフィリンの少なくとも１以上の物質とを組み合わせることでも差し支えない。

本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の改善によって、正常肝を取り戻し、肝硬変、肝ガンへの進展を抑制することが出来る。

図１：４群のＨＥ染色組織像を示す図である。
図２−１：４群のＦ４／８０（マクロファージ）染色組織像を示す図である。
図２−２：４群のＦ４／８０（マクロファージ）染色組織像を示す図である。
図３：４群のＯｉｌ―Ｒｅｄ−Ｏ染色（細胞内脂肪滴）組織像を示す図である。
図４：肝重量を示す図である。
図５：肝重量／体重比データを示す図である。
図６：ＡＬＴデータを示す図である。
図７：血清フェリチンデータを示す図である。
図８：ＭＤＡ（マロンジアルデヒド）データを示す図である。
図９：肝ＴＧ（肝中性脂肪）データを示す図である。
図１０：ＭＣＰ−１（単球走行性タンパク質−１）データを示す図である。
図１１：ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）データを示す図である。
図１２：ＩＦＮ-γ（インターフェロン−γ）データを示す図である。
図１３：肝線維化面積比データを示す図である。
図１４：肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇデータを示す図である。
図１５：Ｌｏｂｕｌａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（小葉内炎症）データを示す図である。
図１６：Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ（脂肪化）データを示す図である。
図１７：ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）データを示す図である。

発明の実施するための形態

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の研究モデルは、国際的に評価され認知されているＳＴＡＭ（登録商標）マウスを用いた。ＳＴＡＭ（登録商標）マウスとは株式会社ステリック再生医科学研究所が開発し、特許権者として公報されている、膵臓炎症誘導剤を投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎の動物モデル(特許文献２)であり、既にこの動物モデルを使用して国内外で多くの研究報告がなされている。

特許文献２
特許第５３３７２４５号

本発明の有効成分である亜鉛製剤（ポラプレジンク）は特公平３−５３６７号公報の方法により得ることが出来る。セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）は、亜セレン酸と水酸化ナトリウムから合成され得られる。亜セレン酸ナトリウムは海外において、セレン欠乏によって生じる重篤な視力障害、神経障害、心筋障害、毛髪変化の改善という目的で既に使用されている。又中国ではセレン欠乏によって生ずる克山病の治療に使用されている。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）という既知の２成分を使用し、確定的な治療薬がない疾病の治療において有効な配合剤が得られたことは極めて重要である。
本発明の医薬品としては、経口投与製剤が好ましい。特に錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤等が好ましい。
亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の製造には、亜鉛製剤（ポラプレジンク）として注射用蒸留水、精製水、カルボキシメチルセルロース、マンニット、白糖、トウモロコシ澱粉、結晶セルロース、ラクチトール、セルロース誘導体、アラビアゴム、トラガントゴム、ゼラチン、ポリソルベート８０、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水、エタノール、白色ワセリン、グリセリン、脂肪、脂肪油、グリコール類、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類、プラスチべース、パラフィン、ミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、サッカリン、パインシロップ等を適宜選択組み合わせることができる。セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）としては、亜セレン酸と水酸化ナトリウムから合成され得ることができる。
配合成分としての亜鉛製剤中の亜鉛量としては年齢、体重、病態、治療効果、投与時期、投与回数、投与期間、投与方法によって異なるが、好ましくは成人１日あたり０．０１５ｇ〜０．２５ｇである。同じくセレン製剤中のセレン量としての配合量は年齢、体重、病態、治療効果、投与時期、投与回数、投与期間、投与方法によって異なるが、好ましくは成人１日あたり１０μｇ〜４５０μｇであり、この配合剤を１日１〜４回に分けて投与することが好ましい。

実施例
実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何ら実施例に限定されるものではない。
実施例
ＮＡＳＨモデルマウスから平均体重が均等になるように体重層別化無作為抽出法によって、４群（８匹／群）に群分を行った。４群とは亜鉛製剤（ポラプレジンク）＋セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）群、亜鉛錯体製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群、コントロール群である。投与経路は経口投与とし、投与期間は２８日間とした。
投与回数は１日１回とした。投与量は１０ｍｌ／kg体重とし、経口ゾンデを用いて投与した。
各群の投与量は表１に示す。
［表１］

投与終了時にエーテル麻酔下で心臓から血液を採取した。得られた血清をチューブに分注した。採血後、放血致死させ、摘出肝について写真撮影した。全ての剖検動物について、肝臓を４つの各葉（内側右葉／左葉、外側左葉、右葉、尾状葉）に分けて処理し、特に外側左葉は６等分にし、その内の２片づつ３部分を処理し、組織像を解析した。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝（ＮＡＳＨ）改善に対する評価は、以下の項目によって評価した。
( １ )ＨＥ染色組織
( ２ )Ｆ４／８０抗体（マクロファージ）染色組織
( ３ )Ｏｉｌ―Ｒｅｄ−Ｏ染色（細胞内脂肪滴）組織
( ４ )肝重量及び肝重量の体重に対する変化
( ５ )ＡＬＴの変化
( ６ )血清フェリチン値の変化
( ７ )ＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の変化
( ８ )肝ＴＧ（肝中性脂肪）の変化
( ９ )ＭＣＰ−１（単球走化性促進因子）の変化
( １０)ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）の変化
( １１)ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）の変化
( １２)肝線維化面積比の変化
( １３)ＮＡＳ（脂肪化、小葉内炎症、Ballooning変性とＮＡＳ）による活動度変化

（肝臓の組織像）
図１は４群のＨＥ染色組織像を示す図である。図１において、ＨＥ染色の結果、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は、他の群に比較して、脂肪細胞数及び脂肪細胞のサイズ縮小が観察され、小葉中心性の肝細胞の風船様変性、細胞周囲の線維化が抑えられていた。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤によって、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の特徴である肝臓の組織中に大滴性脂肪の沈着、肝細胞の風船状肥大（バルーニング）、炎症細胞の浸潤などの組織像の改善が明白となった。

（肝臓の組織像）
図２−１は４群のＦ４／８０（マクロファージ）染色組織像を示す図である。
図２−２は４群のＦ４／８０（マクロファージ）染色組織像を示す図である。
図２−１、図２−２において、Ｆ４／８０はマクロファージに特異的に発現する抗原の１つであり、肝臓類洞に存在するマクロファージであるクッパ―細胞などに常時発現し、発現量も多く、細胞の生理的状態によって調節されている。亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独でもコントロールに比べて有意に発現量を抑制しているが、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は、コントロール群、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独の３群と比較して、発現量が有意に減少している。脂肪変性した肝細胞とマクロファージにより構成される組織学的構造は炎症や線維化の原因となり、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の重症度に比例して出現する（非特許文献８）。マクロファージの減少は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の重症度を軽減することを意味する。抗原発現量の減少はマクロファージが減少していることであり、肝臓類洞に存在するマクロファージであるクッパ―細胞の活性を抑えていることが明白になった。

非特許文献８
Michiko Itoh et.al PLoS ONE 2013.8.12 e82163
Hepatic Crown-Like Structure: A Unique Histological Feature in Non-Alcoholic Steatohepatitis in Mice and Humans

（肝臓の組織像）
図３は４群のＯｉｌ―Ｒｅｄ−Ｏ染色（細胞内脂肪滴）組織像を示す図である。
図３において、Ｏｉｌ―Ｒｅｄ−Ｏは脂肪細胞に触れると細胞内脂質の溶媒に溶け込み、発色するので、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化を確認するために実施される。脂肪内脂質は赤く染まり、核は青く染まる。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は、コントロール群、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群の３群と比較して、脂肪内脂質の染色面積が少なく、脂肪細胞の脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化が少ないことが明白になった。

（肝重量）
図４は肝重量を示す図である。
図４において、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）では肝臓に脂肪が蓄積されるので、肝重量が増加する。肝重量において、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は投与後１，２３９．９ｍｇ、コントロール群は投与後１，４６７ｍｇ、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群は投与後１，３８９ｍｇ、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群は投与後１，３８５．２ｍｇであった。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤はコントロール群と亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群に対して有意に肝重量を減少させ、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群に対して減少傾向を示した。

図５は肝重量／体重比データを示す図である。
図５に示す肝重量／体重比において、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は投与後６．８２％、コントロール群は投与後７．７１％、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群は投与後７．４９％、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群は投与後７．４３％であった。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群はコントロール群に対して有意に低下させ、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群及びセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群に対して低下傾向を示した。

（炎症度の変化）
図６はＡＬＴデータを示す図である。
図６において、血清ＡＬＴ値について、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は投与後３７．８ＩＵ／Ｌ、コントロール群は投与後７４．２ＩＵ／Ｌ、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群は投与後５８．８ＩＵ／Ｌ、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群は投与後５４．６ＩＵ／Ｌであった。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群はコントロール群、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群の３群と比較して肝臓の炎症度を示すＡＬＴを有意に低下させた。

図７は血清フェリチンデータを示す図である。
図７において、血清フェリチン値は体内貯蔵鉄量を反映する。従って、血清フェリチン値が高値の場合は、肝臓における鉄蓄積と有意に相関し、鉄過剰であると考えられる。鉄貯蔵臓器である肝臓が障害されると、肝臓から鉄が逸脱する事で、血清フェリチン値は上昇し、鉄過剰によって引き起こされる活性酸素によって、臓器は障害を受ける。鉄過剰はさらにＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）の増大や肝線維化進行に寄与する因子として有意に関連することが報告されている（非特許文献９）。従って、鉄過剰の改善によって臓器を保護する事が重要になってくる。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群では３，４４８．８ｎｇ／ｍｌであり、コントロール群７，２０７ｎｇ／ｍｌ、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群５，７４０ｎｇ／ｍｌ、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群５，２５１ｎｇ／ｍｌの３群と比較して、有意に血清フェリチン値を減少させた。

非特許文献９
Kris V Kowdley et.al Hepatology 2012.55(1):77-85
Elevated serum ferritin is an independent predictor of histologic severity and advanced fibrosis among patients with nonalcoholic fatty liver disease

図８はＭＤＡ（マロンジアルデヒド）データを示す図である。
図８において、ＭＤＡは酸化ストレスのマーカーとして測定される。ＮＡＳＨ進展において酸化ストレスは重要な因子となるが、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は、コントロール群、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群の３群と比較して、酸化ストレスマーカーである過酸化脂質濃度を有意に低下させた。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は投与後３７．８Ｕ／Ｌ、コントロール群は投与後７４．２Ｕ／Ｌ、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群は投与後５８．８Ｕ／Ｌ、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群は投与後５４．６Ｕ／Ｌであった。

図９は肝ＴＧ（肝中性脂肪）データを示す図である。
図９において、中性脂肪が肝細胞に沈着して肝臓に障害をきたすのが非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり、それが進行すると非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に進展する。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群はコントロール群、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群の３群と比較して肝内中性脂肪を有意に減少させ、中性脂肪の肝臓への沈着を抑制した。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は投与後４１．１ｍｇ／ｄｌ、コントロール群は投与後７８．７ｍｇ／ｄｌ、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群は投与後６４．２ｍｇ／ｄｌ、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群は投与後５７．３ｍｇ／ｄｌであった。

図１０はＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）データを示す図である。
図１０において、ＮＡＳＨの病態ではＭＣＰ−１など炎症性サイトカインの産生が亢進し、ＭＣＰ−１はその受容体（ＣＣＲ２）を介してＮＡＳＨを進展させることが報告されている（非特許文献１０）。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は、ＭＣＰ−１産生を抑制し、肝機能保護作用が発揮されていることが示された。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は投与後２．４、コントロール群は投与後４．２、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群は投与後３．３、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群は投与後３．２であった。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群はコントロール群に対してＭＣＰ−１を有意に低下させ、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群及びセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群に対して低下傾向を示した。

非特許文献１０
Kouichi Miura et.al Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2012.302:1310-1321
Hepatic recruitment of macrophages promotes nonalcoholic steatohepatitis through CCR2

図１１はＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）データを示す図である。
図１１において、ＴＮＦ−αは脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカイン（生理活性物質）の１つで、筋肉、脂肪組織や肝臓での糖の働きを抑制する作用がある。肥満時には増加し、糖尿病や動脈硬化などのリスクを高める。炎症を誘導するたんぱく質であることが明らかとなり、ＴＮＦ−αは前炎症性サイトカインとして、急性炎症と慢性炎症を誘導する。肝細胞に脂肪が蓄積する過程で、肝細胞が変性したり、自己死に陥ったり、壊死炎症が生じることで、肝臓のマクロファージであるクッパー細胞が活性化し、更には肥満や常習飲酒家では腸内細菌叢が変化し、増加したエンドトキシンが腸管から肝臓に到達し、クッパー細胞の活性化に繋がる。活性化されたこの細胞からはＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインが遊出し、肝臓内で炎症反応が進み、肝細胞周囲の線維化に進展して行く。炎症度を示すＳｃｏｒｅは亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は８．４２で、コントロール群１６．２９、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群１３．２３と比較して有意にＴＮＦ−αによる炎症を抑制し、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群１２．８０と比較して抑制傾向を示した。

図１２はＩＦＮ−γ（インターフェロン-γ）データを示す図である。
図１２において、肝細胞のマクロファージであるクッパ―細胞はＩＦＮ−γ刺激によって活性化される。ＩＦＮ−γはＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカイン産生に関与し、肝細胞の炎症を進行させる。従って、ＩＦＮ−γの抑制は肝細胞の炎症、線維化抑制に寄与する。炎症度を示すＳｃｏｒｅは亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は４．２０、コントロール群１０．６９、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群８．０２、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群７．９５であり、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群はコントロール群とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群に対して有意にＩＦＮ−γによる炎症を抑制し、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群に対しては、抑制傾向を示した。

図１３は肝線維化面積比データを示す図である。
図１３において、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）では必ずしも肝線維化が進行するわけではない。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）では、３７％で肝線維化が進行し、３４％が不変、２９％が正常に戻ったと報告されている（非特許文献１）。肝線維化面積比において、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は０．８１％であり、コントロール群１．４７％、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群１．１６％、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群１．１８％に対して、肝線維化面積が減少する傾向を示した。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の評価には、ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）が用いられている。ＮＡＳはＮｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ・Ｓｔｅａｔｏ・ｈｅｐａｔｉｔｉｓ・Ｃｌｉｎｉｃａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｎｅｔｗｏｒｋによって提唱されている（非特許文献２）。ＮＡＳは臨床診断と相関し、活性度を８点満点で表し、５点以上ではほとんどがＮＡＳＨであり、３，４点でＮＡＳＨの疑いと非ＮＡＳＨが混在している、３点未満でほぼ非ＮＡＳＨであるとされている。ＮＡＳの活動度は脂肪化、小葉内炎症、Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ変性の３つをスコア-化して、評価される。脂肪化と小葉内炎症は０〜３点、肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ変性は０〜２点の合計８点満点で示される。脂肪化、小葉内炎症、肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ変性およびＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）を亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群、コントロール群、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群の４群で比較検討した。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の診断には特に肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇが鍵となり、その抑制が重要であることが示唆されている（非特許文献１１）。

図１４は肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇデータを示す図である。
図１４において、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群では０．３８であり、コントロール群１．８５、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群１．３８、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群１．２３に比べて、有意に肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇを抑制した。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は進行度によってｔｙｐｅ-１~ｔｙｐｅ-４に分類され、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と診断されるｔｙｐｅ-３、ｔｙｐｅ-４で初めて肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇが観察される。ｔｙｐｅ-３、ｔｙｐｅ-４では肝硬変への進展ならびに肝疾患関連死がｔｙｐｅ-１、ｔｙｐｅ-２と比較して有意に増加する（非特許文献１１）ことから、進展には肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇがより重要と考えられる。故に肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ進行を抑制することが重要である。亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤は肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇを有意に抑制することで、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の肝硬変への進展ならびに肝疾患関連死の減少が期待される。

図１５はＬｏｂｕｌａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（肝小葉内炎症）データを示す図である。
図１５において、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群０．８５は、コントロール群２．２３と比較して、有意に小葉内炎症を抑制した。亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群１．３８、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群１．４６に対して、抑制傾向が見られた。

図１６はＳｔｅａｔｏｓｉｓ（肝脂肪化）データを示す図である。
図１６において、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群０．５４は、コントロール群１．５４と比較して、有意に（肝内）脂肪化を抑制した。亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群０．８５、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群０．８５に対しては、抑制傾向が見られた。

図１７はＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）データを示す図である。
図１７において、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群のＮＡＳは１．７７であり、コントロール群は５．６２、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群は３．６２、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群は３．５４であった。４群中、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群のＮＡＳはコントロール群、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群の３群と比較して有意に低値であった。
亜鉛製剤（ポラプレジンク）、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群においても、コントロール群と比較してＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）を有意に低下させたが、亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤の群は、亜鉛製剤（ポラプレジンク）単独群、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）単独群に比べて、より有意にＮＡＳ（ＮＡＦＬＤＡｃｔｉｖｉｔｙＳｃｏｒｅ）を改善した。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）での診断には特に肝細胞の風船様変性（肝Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）が鍵となり、その抑制が重要であることが示唆されている（非特許文献１１）。
亜鉛製剤（ポラプレジンク）とセレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）の配合剤は、この観点からも、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療薬として、亜鉛製剤（ポラプレジンク）、セレン製剤（亜セレン酸ナトリウム）それぞれの単独製剤に対し、より有意・有効な非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療薬であることを証明するものである。

本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／または肝脂肪性変性の治療及び予防用の配合剤のほか、これに関連もしくは付随する疾患の治療における配合剤や、１種又は複数の他の活性物質を配合してもよく、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療及び予防における使用のための医薬配合物及び健康食品に適用される。

Claims

亜鉛製剤としてのポラプレジンクとセレン製剤としての亜セレン酸ナトリウムを有効成分とし、NASのスコアリングを２点以下とするための、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の治療用配合剤。