WO2021006523A1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 뇌종양 진단방법 - Google Patents

세균 메타게놈 분석을 통한 뇌종양 진단방법 Download PDF

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bacteria
brain tumor
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백선하
문효은
박형우
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Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing brain tumors through bacterial metagenomic analysis, and more specifically, by performing a bacterial metagenomic analysis using samples derived from normal individuals and subjects, and analyzing the increase or decrease of the content of extracellular vesicles derived from specific bacteria. It is about how to diagnose.
  • Brain tumors are tumors that occur in the brain and central nervous system and can be used interchangeably with "brain cancer", and are the fourth and fifth most common systemic tumors, especially in children. It is the second most frequent tumor among tumors.
  • the incidence rate of brain tumors is about 10 per 100,000 population, and among primary brain tumors, the most common glioma accounts for about 35% of the total and is malignant.
  • mutagenic substances known so far include radiation, chemicals, and viruses, and it is known that the incidence of brain tumors increases even when the immune function decreases, such as AIDS.
  • interest in the relationship between chemical substances and cancer incidence is increasing due to environmental pollution, but there is no clear causal relationship between the occurrence of brain tumors.
  • brain tumors cause clinical symptoms are symptoms due to increased brain pressure, symptoms caused by pressure on the surrounding brain by brain tumors, symptoms caused by electrical stimulation of the surrounding cranial nerves by brain tumors (epileptic seizures), and symptoms due to hormonal abnormalities. Included. Without active treatment, both malignant and benign brain tumors have fatal consequences.
  • microbiota or microbiome refers to a microbial community including bacteria, archaea, and eukarya existing in a given dwelling place
  • the intestinal microbiota refers to human physiological phenomena. It plays an important role and is known to have a great effect on human health and disease through interaction with human cells.
  • Bacteria living in our body secrete nanometer-sized vesicles to exchange information such as genes and proteins with other cells.
  • the mucous membrane forms a physical barrier through which particles larger than 200 nanometers (nm) cannot pass, and bacteria that coexist in the mucous membrane cannot pass through the mucous membrane, but vesicles derived from bacteria are usually less than 100 nanometers in size. It freely passes through the mucous membrane and is absorbed by our body.
  • Metagenomics also called environmental genomics, can be said to be the analysis of metagenomic data obtained from samples taken from the environment. Recently, it has become possible to list the bacterial composition of the human microbiota by a method based on the 16s ribosomal RNA (16s rRNA) sequence, and the 16s rDNA sequence, the gene of the 16s ribosomal RNA, has been subjected to next generation sequencing. , NGS) platform.
  • NGS next generation sequencing
  • the present inventors extracted genes from bacteria-derived extracellular vesicles present in blood, which are samples derived from normal individuals and subjects, in order to diagnose the causative factor and risk of developing brain tumors in advance, and performed metagenomic analysis on this, and as a result, the cause of brain tumors Bacterial-derived extracellular vesicles that can act as factors were identified, and the present invention was completed based on this.
  • an object of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosing brain tumors through metagenomic analysis of extracellular vesicles derived from bacteria, a method for diagnosing brain tumors, and a method for predicting the risk of developing brain tumors.
  • the present invention provides a method for providing information for diagnosis of brain tumor, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for diagnosing a brain tumor, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for predicting the risk of developing brain tumors, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for providing information for predicting the onset of a brain tumor, comprising the following steps:
  • Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Saccharibacteria , And Tenericutes can be compared to the increase or decrease in the content of extracellular vesicles derived from one or more phylum bacteria selected from the group consisting of.
  • step (c) Clostridia, Basil, Erysipelotrichiam, Gammaproteobacteria, and alpha proteobacteria ( Alphaproteobacteria), Negativicutes, Saccharibacteria (p)), Chloroplast, Actinobacteria and Molycutes 1 selected from the group consisting of It is possible to compare the increase or decrease of the content of extracellular vesicles derived from class bacteria or more.
  • step (c) Clostridiales, Bifidobacteriales, Erysipelotrichales, Lactobacillales, Actinomycetes ( Micrococcales), Sphingomonadales, Selenomonadales, Chloroplast (c)), Saccharibacteria (p)), Turicibacterales and It is possible to compare the increase or decrease in the content of extracellular vesicles derived from one or more order bacteria selected from the group consisting of Xanthomonadales.
  • step (c) Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Cyanobacteria, and Saccharibacteria ), and one or more phylum bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Tenericutes,
  • Clostridiales Bifidobacteriales, Erysipelotrichales, Lactobacillales, Micrococcales, Sphingomonadales, Selenomonas (Selenomonadales), Chloroplast (c)), Saccharibacteria (p)), Turicibacterales, and Xanthomonadales, one selected from the group consisting of Extracellular vesicles derived from the above order bacteria,
  • Luminococcaceae Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae, Streptococcaceae, Bifidobacteriaceae, Bifidobacteriaceae Spingomonadaceae, Prophyromonadaceae, Bacteroidaceae, Bacteroidales S24-7, Chloroplast (c), Prevotellaceae ), Saccharibacteria (p), Intrasporangiaceae, Lactobacillaceae, Mogibacteriaceae, Turicibacteraceae, Nokar Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Nocardiaceae, Xanthomonadaceae, Weeksellaceae, and Veillonellaceae, or
  • step (c) compared with a sample derived from a normal person,
  • Tenericutes (Tenericutes) phylum bacteria-derived extracellular vesicles
  • Cells derived from one or more genus bacteria selected from the group consisting of Lactobacillus, Turicibacter, Tepidimonas, Rhodococcus, and Cloacibacterium If the content of outer vesicles is increased, it can be diagnosed as a brain tumor.
  • step (c) compared with a sample derived from a normal person,
  • Extracellular vesicles derived from Actinobacteria phylum bacteria Extracellular vesicles derived from Actinobacteria phylum bacteria
  • Xanthomonadales order bacteria-derived extracellular vesicles
  • Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Intrasporangiaceae, Xanthomonadaceae, and Veillonellaceae, or
  • extracellular vesicles derived from one or more genus bacteria selected from the group consisting of Stenotrophomonas and Sphingomonas is reduced, it can be diagnosed as a brain tumor.
  • step (c) compared with a sample derived from a normal person,
  • Extracellular vesicles derived from one or more class bacteria selected from the group consisting of Clostridia, Bacil, and Erysipelotrichiam,
  • Extracellular derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Luminococcaceae, Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae, and Erysipelotrichaceae. Parcel, or
  • Luminococcaceae UCG-014 Lachnospiraceae NK4A136, Ruminococcaceae UCG-013, Lactobacillus, Ruminiclostridium 6, Peptoclostridium If the content of extracellular vesicles derived from one or more genus bacteria selected from the group consisting of (Peptoclostridium) is increased, it can be diagnosed as a brain tumor.
  • step (c) compared with a sample derived from a normal person,
  • Extracellular vesicles derived from one or more class bacteria selected from the group consisting of Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, and Negativicutes,
  • Extracellular vesicles derived from one or more order bacteria selected from the group consisting of Lactobacillales, Micrococcales, Sphingomonadales, and Selenomonadales,
  • Eubacterium coprostanoligenes Escherichia-Shigella, Blautia, Bifidobacterium, Streptococcus, and Sphingomonas Sphingomonas
  • Eubacterium coprostanoligenes Escherichia-Shigella, Blautia, Bifidobacterium, Streptococcus, and Sphingomonas Sphingomonas
  • step (c) compared with a sample derived from a normal person,
  • Extracellular vesicles derived from one or more phylum bacteria selected from the group consisting of Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes,
  • Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Erysipelotrichaceae and Bacteroidaceae, or
  • extracellular vesicles derived from one or more genus bacteria selected from the group consisting of Bacteroides, and Erysipelatoclostridium When the content of extracellular vesicles derived from one or more genus bacteria selected from the group consisting of Bacteroides, and Erysipelatoclostridium is increased, it can be diagnosed as a brain tumor.
  • step (c) compared with a sample derived from a normal person,
  • Extracellular vesicles derived from one or more order bacteria selected from the group consisting of the order Clostridiales, the order Chloroplast (c), and the order Saccharibacteria (p),
  • Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of, or
  • Bacteroidales S24-7, Chloroplast (c), Lachnospiraceae NK4A136, Prevotella 9, and Candidatus Saccharimonas When the content of extracellular vesicles derived from one or more genus bacteria selected from the group is reduced, it can be diagnosed as a brain tumor.
  • the normal person and the subject sample may be blood or tissue.
  • the blood may be whole blood, serum, plasma, or blood monocytes.
  • the tissue may be a brain tissue.
  • Extracellular vesicles secreted from bacteria existing in the environment are absorbed into the body and can have a direct effect on the occurrence of inflammation.
  • Brain tumors are difficult to treat efficiently because early diagnosis is difficult before symptoms appear. Accordingly, by pre-diagnosing the risk of developing brain tumors through metagenomic analysis of bacterial-derived extracellular vesicles using human samples according to the present invention, it is possible to diagnose and predict the risk group of autism early, and also to determine the onset time through appropriate management. You can slow it down or prevent it from occurring.
  • early diagnosis can be performed even after the onset, which not only lowers the incidence of brain tumors and increases the treatment effect, but also improves the course of the disease or prevents recurrence by avoiding exposure of causative factors through metagenomic analysis in patients diagnosed with brain tumors. There is an advantage that can be prevented.
  • 1A and 1B show (a) alpha diversity of serum EV microbiome in healthy control group (HC) and brain tumor patients (BT) using PCoA based on Bray-Curtis similarity at the genus level (Chao1, Shannon and Simpson index) and (b) beta diversity.
  • 2A to 2D show differences in microbiome abundance between healthy control group (HC) and brain tumor patients (BT) in serum at the level of the phylum and genus.
  • HC healthy control group
  • BT brain tumor patients
  • (a) shows the abundance heat map at the level of the serum microbial EV
  • (b) shows the heat map of the abundance at the genus level of the serum microbial EV
  • (c) shows the major microbial EV by t-test.
  • At the door level, (d) is at the inner level.
  • 3A and 3B show significantly different microbial EVs determined through LEFSe analysis at phylum level (a) and genus level (b).
  • Figures 4a to 4c show the abundance of microbiome at (a) class, (b) order, (c) and (family) levels in serum.
  • 5A and 5B show a brain tumor diagnosis model based on serum EV microbiome at the genus level.
  • (a) shows the ROC curves for M1 (red), M2 (blue), M3 (green), and M4 (yellow), and
  • (b) shows the ROC curve for M5.
  • 6A to 6E show differences in microbiome abundance between the healthy control group (HC) and brain tumor patients (BT) in brain tissue at the level of the phylum and genus, (a) and (b), respectively, And heat maps of the EV taxa of key microorganisms in brain tissue at the genus level, (c) and (d) are the major microbial EVs by t-test at the phylum and genus level, respectively, and (e) are significantly different determined through LEfSe analysis. Microbial EV biomarkers are shown at the genus level.
  • 7a to 7c show the abundance of microbiome at the level of (a) class, (b) order, (c) and (family) in brain tissue.
  • Figures 8a to 8d show the fold-change between the healthy control group (HC) and brain tumor patients (BT) of serum and tissues at (a) door, (b) river, (c) neck, (d) and level will be.
  • Red indicates the genera of microbial EVs that are significantly different between clinical groups in serum
  • green indicates the genera of microbial EVs that are significantly different between clinical groups in brain tissue
  • blue indicates significant differences in both serum and tissue samples. It shows the genus of the microorganism EV.
  • HC healthy control group
  • BT brain tumor patients
  • Red indicates the genera of microbial EVs that are significantly different between clinical groups in serum
  • green indicates the genera of microbial EVs that are significantly different between clinical groups in brain tissue
  • blue indicates significant differences in both serum and tissue samples. It shows the genus of the microorganism EV.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • 11 is a result showing the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at a class level by separating bacterial-derived vesicles from blood of brain tumor patients and normal humans, and then performing metagenomic analysis.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • the present invention relates to a method for diagnosing brain tumors through bacterial metagenomic analysis, wherein the present inventors extracted genes from extracellular vesicles derived from bacteria using samples derived from normal individuals and subjects, and performed metagenomic analysis on them, and the cause of brain tumors Bacterial-derived extracellular vesicles that can act as factors were identified.
  • the present invention comprises the steps of: (a) extracting DNA from extracellular vesicles isolated from normal and subject samples;
  • brain tumor diagnosis used in the present invention means to determine whether a patient is likely to develop a brain tumor, a relatively high probability of developing a brain tumor, or whether a brain tumor has already occurred.
  • the method of the present invention can be used to delay the onset period or prevent onset through special and appropriate management as a patient with a high risk of developing brain tumors in any specific patient.
  • the method of the present invention can be used clinically to determine a treatment by early diagnosis of a brain tumor and selecting the most appropriate treatment method.
  • metagenome used in the present invention is also referred to as "military genome”, and refers to the sum of genomes including all viruses, bacteria, fungi, etc. in isolated areas such as soil and animal intestines, It is mainly used as a concept of genome to describe the identification of many microorganisms at once using a sequence analyzer to analyze microorganisms that cannot be cultured.
  • metagenome does not refer to the genome or genome of one species, but refers to a kind of mixed genome as the genome of all species in one environmental unit.
  • the normal person and the subject sample may be blood, and the blood may be whole blood, serum, plasma, or blood mononuclear cells, but is not limited thereto.
  • the normal person and the subject sample may be a tissue, and the tissue may be a brain tissue, but is not limited thereto.
  • metagenomic analysis was performed on the bacterial-derived extracellular vesicles, and analyzed at the level of phylum, class, order, family, and genus, respectively.
  • vesicles derived from bacteria that can actually act as the cause of brain tumor development were identified (see Table 8 of the present invention).
  • Clostridiales Bifidobacteriales, Erysipelotrichales, Lactobacillales, Micrococcales, Sphingomonadales, Selenomonadales,
  • Ruminococcaceae Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae, Bifidobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Porphyromonadaceae,
  • Ruminococcaceae UCG-014 Lachnospiraceae NK4A136, Ruminococcaceae UCG-013, Lactobacillus, Ruminiclostridium 6, Peptoclostridium, [Eubacterium] coprostanoligenes, Escherichia-Shigella, Blautia, Bifidobacterium, Streptococcus
  • Bacteroidaceae Bacteroidaceae, Erysipelotrichaceae, Ruminococcaceae, Bacteroidales S24-7 group, Chloroplast (c), Prevotellaceae, Saccharibacteria (p),
  • the content of extracellular vesicles derived from Actinobacteria and Tenericutes phylum bacteria is There was a significant difference between brain tumor patients and normal subjects (see Example 6).
  • the content of the extracellular vesicles derived from Actinobacteria and Mollicutes class bacteria is a brain tumor patient. There was a significant difference between the and normal subjects (see Example 6).
  • the present invention as a result of analyzing the bacterial metagenome at the family level for vesicles present in a blood sample derived from a subject, Intrasporangiaceae, Lactobacillaceae, Mogibacteriaceae, Turicibacteraceae, Nocardiaceae, Xanthomonadaceae, Weeksellaceae, and There was a significant difference in the content of extracellular vesicles derived from bacteria of the family Veillonellaceae between brain tumor patients and normal subjects (see Example 6).
  • bacterial metagenome as a result of analyzing the bacterial metagenome at the genus level for vesicles present in a blood sample derived from a subject, Stenotrophomonas, Lactobacillus, Turicibacter, Tepidimonas, Sphingomonas, Rhodococcus, and Cloacibacterium genus (genus)
  • Stenotrophomonas Lactobacillus
  • Turicibacter Tepidimonas
  • Sphingomonas Sphingomonas
  • Rhodococcus Rhodococcus
  • Cloacibacterium genus Cloacibacterium genus
  • Serum samples from a total of 182 brain tumor (BT) patients and 125 healthy control (HC) subjects were collected at Seoul National University Hospital and Inje University Haeundae Hospital.
  • tissue samples were evaluated from 5 BT patients and 5 HC subjects collected at Seoul National University Hospital.
  • Each BT clinical subject exhibited symptoms leading to a hospital visit for treatment.
  • Health care subjects were selected through general health checkups.
  • Experimental examples of the present invention were approved by the Seoul National University Hospital Institutional Review Board (IRB No. H-1009-025-331) and Inje University Haeundae Hospital (IRB No. 1297992-2015-064). All methods of the present invention were performed according to approved guidelines, and informed consent was obtained from all clinical subjects.
  • All collected human serum samples were transferred to a serum separator tube (SST) and then centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes at 4°C. All brain tissue samples were frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C for analysis.
  • SST serum separator tube
  • mice used were 6 week old female C57BL/6 mice (Orient Bio Inc, Seongnam, Korea). Mice were housed and maintained in standard laboratory conditions of 22 ⁇ 2° C. and 50 ⁇ 5% humidity on a 12 hour day and night cycle throughout the course of the in vivo study.
  • PCR was performed using the 16S rDNA primer shown in Table 1 to amplify the gene and perform sequencing (Illumina MiSeq sequencer).
  • the classification was performed with the profiling program MDx-Pro ver.2 (MD Healthcare, Korea).
  • the paired-end reads were filtered according to the barcode, and the primer sequences were trimmed using Cutadapt (version 1.1.6), and then merged with CASPER.
  • Cutadapt version 1.1.6
  • OTU Orthogonal Taxonomic Unit
  • a candidate strain having a p value of less than 0.01, a fold change greater than 2 times, and an average relative abundance greater than 0.1% was selected.
  • the strains selected as model variables were compared to determine the model with the highest AUC (Area Under the Curve), sensitivity, specificity, and accuracy.
  • the first method used stepwise selection in which AIC (Akaike information criterion) is used to compare predictive diagnostic models with different variables.
  • the second method combined age and sex as covariates in addition to the stepwise selection methodology.
  • the third selection method used linear discriminant analysis (LDA) and LDA Effect Size (LEfSe) algorithms for strain marker discovery.
  • the fourth method included age and sex as covariates in addition to incorporating selected strain markers using LEfSe.
  • the fifth method was calculated by a machine learning algorithm based on the gradient boosting machine (GBM) ensemble method.
  • GBM was incorporated into the modeling using scikit-learn's Gradient Boosting Regressor (version 0.21.3) in Python (version 3.6.9). After variable selection, the predictive diagnostic model was calculated using logistic regression with a training and test set set at an 80:20 ratio for model validation.
  • PCoA was performed and all samples were plotted along the two most dissimilar principal coordinates (PCo) between the samples to evaluate the similarity between the HC and BT groups. At all taxa levels, significant clustering was observed between the two groups (p ⁇ 0.001) (Fig. 1B).
  • 13 taxa were significantly different between the control group and the patient group, and Clostridiales showed the greatest difference with a log (LDA score) value of 3.9 (FIG. 4B).
  • Ruminococcaceae Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae, Sphingomonadaceae and Porphyromonadaceae were significantly changed.
  • LEfSe evaluation at the family level a total of 21 taxa were significantly different, and the log (LDA score) value of Ruminococcaceae was greater than 4.0 (FIG. 4C).
  • Example 4 Development of a diagnostic model for brain tumor (BT) based on serum microbial EV metagenome
  • the M1 and M2 models yielded 12 important microbial EV genera, Stenotrophomonas, Knoellia, Sphingomonas, Solanum melongena, Parabacteroides, Actinomyces, Ruminiclostridium, Lactococcus, Turicibacter, Faecalibacterium, Streptococcus, and Bifidobacterium.
  • logistic regression analysis using biomarkers determined by LEfSe analysis for M3 and M4 showed 29 different important microbial genus EVs, Ruminococcaceae UCG-014, Lachnospiraceae NK4A136, Lactobacillus, Lachnospiraceae(f), Acinetobacter, Staphylococcus, Pseudomonas, Ruminococcaceae.
  • UCG-013 Klebsiella, Bifidobacterium, Ruminococcus 1, Streptococcus, Ruminiclostridium 6, Peptoclostridium, Sphingomonas, Clostridiales vadinBB60(f), Turicibacter, Ruminococcaceae(f), Ruminococcus 2, Peptococcaceae(f), Ruminococcus 2, Peptococcaceae(f), Diaphorobacter, 1, Diaphorobacter, Solanum melongena, Actinomyces, Knoellia, Stenotrophomonas, and Veillonella were calculated.
  • Model performance using the test set was evaluated based on the AUC, sensitivity, specificity, and accuracy of each method to determine the optimal BT diagnostic model. As a result, all of the BT diagnostic models showed an AUC higher than 0.93 (FIG. 5A).
  • the model based on the GBM method showed the highest sensitivity, specificity and AUC with values of 1.000, 0.936 and 0.993, respectively (Fig. 5b).
  • Example 5 Development of a brain tumor (BT) diagnostic model based on brain tissue microbial EV metagenome
  • Clostridiales, Chloroplast (c) and Saccharibacteria (p) were remarkably abundant in the control, while Erysipelotrichales was significantly lower (Fig. 7b).
  • Ruminococcaceae, Prevotellaceae, Bacteroidaceae and Erysipelotrichaceae Fig. 7c).
  • Bacteroides and Erysipelatoclostridium were significantly lower in the control group than in the BT group, whereas Bacteroidales S24-7 group, Chloroplast (c), Lachnospiraceae NK4A136 group, Prevotella 9, Candidatus Saccharimonas were significantly higher (Fig. 6b, Fig. 6d).
  • LEfSe evaluation at the genus level showed Bacteroidales S24-7 group, Lachnospiraceae NK4A136, Bacteroides and Erysipelatoclostridium as important brain tumor biomarkers (Fig. 6e).
  • Example 6-1 Metagenomic analysis of DNA extracted from blood
  • SFF Standard Flowgram Format
  • the part with an average base call accuracy of less than 99% (Phred score ⁇ 20) was removed.
  • the Operational Taxonomy Unit (OTU) performed clustering according to sequence similarity using UCLUST and USEARCH.
  • clustering is performed based on sequence similarity of 94% for genus, 90% for family, 85% for order, 80% for class, and 75% for phylum.
  • Classification of the phylum, river, order, family, and genus levels of OTU was performed, and bacteria having sequence similarity of 97% or more were analyzed using BLASTN and GreenGenes' 16S DNA sequence database (108,453 sequences) (QIIME).
  • Example 6-2 Brain tumor diagnosis model based on metagenomic analysis of bacterial-derived vesicles isolated from blood
  • Example 6-1 In the method of Example 6-1, after separating vesicles from the blood of 170 brain tumor patients and 200 normal individuals whose age and sex were matched, metagenome sequencing was performed. To develop a diagnostic model, first, a strain with a p value of 0.05 or less between the two groups and a group average of 0.1% or more was selected in the t-test, and then AUC (area under curve), a diagnostic performance index, using logistic regression analysis Sensitivity, and specificity were calculated.
  • AUC area under curve
  • Table 8 summarizes the results of bacterial-derived vesicle analysis in serum, blood, and brain tissue samples.

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Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 뇌종양을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 뇌종양을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 뇌종양 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 자폐증의 위험군을 조기에 진단 및 예측 가능하며, 또한 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있다. 이에 더하여, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 뇌종양의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 뿐 아니라, 뇌종양으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 질병의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있는 장점이 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 뇌종양 진단방법
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 뇌종양을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 뇌종양을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
본 출원은 2019년 07월 08일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0082317호 및 2020년 05월 14일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0057634호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
뇌종양(brain tumor)은 뇌 및 중추신경계에서 발생되는 종양으로서 "뇌암(brain cancer)"과 혼용하여 사용될 수 있으며, 전체적으로 볼 때 전신에서 발생하는 종양 중 네다섯 번째로 많이 발생하고, 특히 소아에서는 전체 악성종양 중 2번째로 호발하는 종양이다. 뇌종양의 발생률은 인구 10만 명당 약 10명이며, 원발성 뇌종양 중에서 가장 많이 발생하는 신경교종은 전체의 약 35%를 차지하고 악성이 많다. 뇌종양의 원인중 하나로 지금까지 알려진 돌연변이 유발물질에는 방사선, 화학물질, 바이러스 등이 있으며, 에이즈처럼 면역기능이 저하되는 경우에도 뇌종양의 발생빈도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 최근 환경오염 등으로 인해서 화학물질과 암 발생간의 연관성에 대한 관심이 높아지고 있으나 뇌종양의 발생간에는 명확한 인과관계가 규명되어 있지 않다.
뇌종양이 임상증상을 일으키는 기전으로는, 뇌압상승으로 인한 증상, 뇌종양이 주위 뇌를 압박함으로써 발생하는 증상, 뇌종양이 주위 뇌신경을 전기적으로 자극함으로써 발생하는 증상(간질발작), 호르몬 이상으로 인한 증상이 포함된다. 적극적인 치료를 받지 않는 경우는 악성, 양성 뇌종양의 경우 모두 치명적인 결과를 초래하게 된다.
기존의 뇌종양 환자들의 예후를 판별하는 방법으로는 임상치료의 경과, 방사선 요법 및 화학요법의 경과들을 종합하고, 뇌종양의 악성도와 위치, 연령 등을 고려하여 재발 가능성을 비롯한 생존 예후를 결정하는 것이 일반적인 방법이었으나, 이는 환자의 유형마다 다양한 차이가 존재하며, 임상적 치료에 대한 결과도 달라지므로 정확한 예후 예측방법이라고 할 수 없다. 따라서 뇌종양을 진단하고, 예후를 예측할 수 있는 새로운 진단 및 치료 표적으로서의 바이오 마커 개발의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통과하여 우리 몸에 흡수된다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다. 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 이용하여 분석한다. 그러나 뇌종양 발병에 있어서, 혈액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 뇌종양의 원인인자를 동정하고 뇌종양을 예측하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 뇌종양의 원인인자 및 발병 위험도를 미리 진단하기 위하여, 정상인 및 피검자 유래 샘플인 혈액에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 뇌종양의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 뇌종양을 진단하기 위한 정보제공방법, 뇌종양 진단방법, 및 뇌종양 발병 위험도 예측방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌종양 진단방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌종양의 발병 위험도 예측방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌종양 발병을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 (c) 단계에서 방선균문(Actinobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 후벽균(Firmicutes), 의간균(Bacteroidetes), 남세균(Cyanobacteria), 사카리박테리아(Saccharibacteria), 및 테네리쿠테스(Tenericutes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 클로스트리디움강(Clostridia), 바실강(Bacill), 에리시펠로스리키아강(Erysipelotrichiam), 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 네가티비콕쿠스강(Negativicutes), 사카리박테리아강(Saccharibacteria (p)), 클로로플라스트강(Chloroplast), 방선균강(Actinobacteria) 및 몰리쿠테스(Mollicutes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 클로스트리디움목(Clostridiales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 에리시펠로스리키아목(Erysipelotrichales), 유산균목(Lactobacillales), 방선균목(Micrococcales), 스핑고모나스목(Sphingomonadales), 셀레노모나스목(Selenomonadales), 클로로플라스트목(Chloroplast (c)), 사카리박테리아목(Saccharibacteria (p)), 터리시박테랄레스(Turicibacterales) 및 잔토모나달레스(Xanthomonadales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 루미노코카새애(Ruminococcaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 에리시펠로트릭스과(Erysipelotrichaceae), 래크노스피래세애(Lachnospiraceae), 연쇄상구균과(Streptococcaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 스핑고모나다세애(Sphingomonadaceae), 프로피로모나스과(Porphyromonadaceae), 박테로이데스과(Bacteroidaceae), 박테로이데스 S24-7(Bacteroidales S24-7), 클로로플라스트과(Chloroplast (c)), 프레보텔라세애(Prevotellaceae), 사카리박테리아과(Saccharibacteria (p)), 인트라스포란지아시에(Intrasporangiaceae), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 모지박테리아시에(Mogibacteriaceae), 터리시박테라시에(Turicibacteraceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 잔토모나다시에(Xanthomonadaceae), 위크셀라시에(Weeksellaceae), 및 베일로넬라시에(Veillonellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-014, 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) NK4A136, 루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-013, 루미니클로스트리듐(Ruminiclostridium) 6, 펩토클로스트리듐(Peptoclostridium), 유박테륨 코프로스타노리제네스([Eubacterium] coprostanoligenes), 대장균-이질균속(Escherichia-Shigella), 블라우티아(Blautia), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 박테로이데스(Bacteroides), 에리시펠라토클로스트리듐(Erysipelatoclostridium), 박테로이데스(Bacteroidales) S24-7, 클로로플라스트속(Chloroplast (c)), 프레보텔라(Prevotella) 9, 칸디다투스 사카리모나스(Candidatus Saccharimonas), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 터리시박터(Turicibacter), 테피디모나스(Tepidimonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 및 클로아시박테리움(Cloacibacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 방선균문(Actinobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 후벽균(Firmicutes), 의간균(Bacteroidetes), 남세균(Cyanobacteria), 사카리박테리아(Saccharibacteria), 및 테네리쿠테스(Tenericutes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
클로스트리디움강(Clostridia), 바실강(Bacill), 에리시펠로스리키아강(Erysipelotrichiam), 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 네가티비콕쿠스강(Negativicutes), 사카리박테리아강(Saccharibacteria (p)), 클로로플라스트강(Chloroplast), 방선균강(Actinobacteria) 및 몰리쿠테스(Mollicutes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
클로스트리디움목(Clostridiales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 에리시펠로스리키아목(Erysipelotrichales), 유산균목(Lactobacillales), 방선균목(Micrococcales), 스핑고모나스목(Sphingomonadales), 셀레노모나스목(Selenomonadales), 클로로플라스트목(Chloroplast (c)), 사카리박테리아목(Saccharibacteria (p)), 터리시박테랄레스(Turicibacterales) 및 잔토모나달레스(Xanthomonadales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
루미노코카새애(Ruminococcaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 에리시펠로트릭스과(Erysipelotrichaceae), 래크노스피래세애(Lachnospiraceae), 연쇄상구균과(Streptococcaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 스핑고모나다세애(Sphingomonadaceae), 프로피로모나스과(Porphyromonadaceae), 박테로이데스과(Bacteroidaceae), 박테로이데스 S24-7(Bacteroidales S24-7), 클로로플라스트과(Chloroplast (c)), 프레보텔라세애(Prevotellaceae), 사카리박테리아과(Saccharibacteria (p)), 인트라스포란지아시에(Intrasporangiaceae), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 모지박테리아시에(Mogibacteriaceae), 터리시박테라시에(Turicibacteraceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 잔토모나다시에(Xanthomonadaceae), 위크셀라시에(Weeksellaceae), 및 베일로넬라시에(Veillonellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-014, 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) NK4A136, 루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-013, 루미니클로스트리듐(Ruminiclostridium) 6, 펩토클로스트리듐(Peptoclostridium), 유박테륨 코프로스타노리제네스([Eubacterium] coprostanoligenes), 대장균-이질균속(Escherichia-Shigella), 블라우티아(Blautia), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 박테로이데스(Bacteroides), 에리시펠라토클로스트리듐(Erysipelatoclostridium), 박테로이데스(Bacteroidales) S24-7, 클로로플라스트속(Chloroplast (c)), 프레보텔라(Prevotella) 9, 칸디다투스 사카리모나스(Candidatus Saccharimonas), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 터리시박터(Turicibacter), 테피디모나스(Tepidimonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 및 클로아시박테리움(Cloacibacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
테네리쿠테스(Tenericutes) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
몰리쿠테스(Mollicutes) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
터리시박테랄레스(Turicibacterales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
락토바실라시에(Lactobacillaceae), 모지박테리아시에(Mogibacteriaceae), 터리시박테라시에(Turicibacteraceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 및 위크셀라시에(Weeksellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
락토바실러스(Lactobacillus), 터리시박터(Turicibacter), 테피디모나스(Tepidimonas), 로도코커스(Rhodococcus), 및 클로아시박테리움(Cloacibacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 뇌종양으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
방선균문(Actinobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
방선균강(Actinobacteria) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
잔토모나달레스(Xanthomonadales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
인트라스포란지아시에(Intrasporangiaceae), 잔토모나다시에(Xanthomonadaceae), 및 베일로넬라시에(Veillonellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌종양으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
후벽균(Firmicutes) 유래 세포밖 소포,
클로스트리디움강(Clostridia), 바실강(Bacill), 및 에리시펠로스리키아강(Erysipelotrichiam)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
클로스트리디움목(Clostridiales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 및 에리시펠로스리키아목(Erysipelotrichales)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
루미노코카새애(Ruminococcaceae), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 및 에리시펠로트릭스과(Erysipelotrichaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-014, 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) NK4A136, 루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-013, 락토바실러스(Lactobacillus), 루미니클로스트리듐(Ruminiclostridium) 6, 펩토클로스트리듐(Peptoclostridium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우, 뇌종양으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
방선균문(Actinobacteria) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 방선균강(Actinobacteria), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 및 네가티비콕쿠스강(Negativicutes)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
유산균목(Lactobacillales), 방선균목(Micrococcales), 스핑고모나스목(Sphingomonadales), 및 셀레노모나스목(Selenomonadales)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
래크노스피래세애(Lachnospiraceae), 연쇄상구균과(Streptococcaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 스핑고모나다세애(Sphingomonadaceae), 및 프로피로모나스과(Porphyromonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
유박테륨 코프로스타노리제네스([Eubacterium] coprostanoligenes), 대장균-이질균속(Escherichia-Shigella), 블라우티아(Blautia), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌종양으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
방선균문(Actinobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 후벽균(Firmicutes), 및 의간균(Bacteroidetes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
에리시펠로스리키아강(Erysipelotrichiam) 세균 유래 세포밖 소포,
에리시펠로스리키아목(Erysipelotrichales) 세균 유래 세포밖 소포,
에리시펠로트릭스과(Erysipelotrichaceae) 및 박테로이데스과(Bacteroidaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
박테로이데스(Bacteroides), 및 에리시펠라토클로스트리듐(Erysipelatoclostridium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 뇌종양으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
남세균(Cyanobacteria), 및 사카리박테리아(Saccharibacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
클로스트리디움강(Clostridia), 사카리박테리아강(Saccharibacteria (p)), 및 클로로플라스트강(Chloroplast)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
클로스트리디움목(Clostridiales), 클로로플라스트목(Chloroplast (c)), 및 사카리박테리아목(Saccharibacteria (p))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
루미노코카새애(Ruminococcaceae), 박테로이데스 S24-7(Bacteroidales S24-7), 클로로플라스트과(Chloroplast (c)), 프레보텔라세애(Prevotellaceae), 및 사카리박테리아과(Saccharibacteria (p))로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
박테로이데스(Bacteroidales) S24-7, 클로로플라스트속(Chloroplast (c)), 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) NK4A136, 프레보텔라(Prevotella) 9, 및 칸디다투스 사카리모나스(Candidatus Saccharimonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌종양으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액 또는 조직일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조직은 뇌조직일 수 있다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 뇌종양은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 이에, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 뇌종양 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 자폐증의 위험군을 조기에 진단 및 예측 가능하며, 또한 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있다. 이에 더하여, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 뇌종양의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 뿐 아니라, 뇌종양으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 질병의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있는 장점이 있다.
도 1a 및 도 1b는 속 (genus) 수준에서 Bray-Curtis 유사성을 기초로 PCoA를 사용하여 건강한 대조군 그룹 (HC) 및 뇌종양 환자 (BT)에서 혈청 EV 마이크로바이옴의 (a) 알파 다양성 (Chao1, Shannon 및 Simpson 지수) 및 (b) 베타 다양성을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 문 (phylum) 및 속 (genus) 수준에서 혈청에서 건강한 대조군 그룹 (HC) 및 뇌종양 환자 (BT) 사이의 마이크로바이옴 풍부도 차이를 나타낸 것이다. (a)는 혈청 미생물 EV의 문 수준에서의 풍부도 히트맵, (b)는 혈청 미생물 EV의 속 수준에서의 풍부도 히트맵을 나타낸 것이고, (c)는 t-검정에 의한 주요 미생물 EV를 문 수준에서, (d)는 속 수준에서 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 LEFSe 분석을 통하여 결정된 유의하게 다른 미생물 EV를 문 수준 (a) 및 속 수준 (b)에서 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 혈청에서 (a) 강 (class), (b) 목 (order), (c) 과 (family) 수준에서의 마이크로바이옴의 풍부도를 나타낸 것이다.
5a 및 도 5b는 속 수준에서 혈청 EV 마이크로바이옴에 기초한 뇌 종양 진단 모델을 나타낸 것이다. (a)는 M1 (빨간색), M2 (파란색), M3 (녹색), M4 (노란색)에 대한 ROC 곡선을 나타낸 것이고, (b)는 M5에 대한 ROC 곡선을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6e는 문 및 속 수준에서 뇌 조직에서의 건강한 대조군 그룹 (HC)과 뇌종양 환자 (BT) 사이의 마이크로바이옴 풍부도의 차이를 나타낸 것으로, (a) 및 (b)는 각각 문 및 속 수준에서 뇌조직의 핵심 미생물 EV 분류군의 히트맵, (c) 및 (d)는 각각 문 및 속 수준에서 t-검정에 의한 주요 미생물 EV, (e)는 LEfSe 분석을 통해 결정된 유의하게 다른 미생물 EV 바이오마커를 속 수준에서 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7c는 뇌조직에서 (a) 강 (class), (b) 목 (order), (c) 과 (family) 수준에서의 마이크로바이옴의 풍부도를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8d는 (a) 문, (b) 강, (c) 목, (d) 과 수준에서 혈청 및 조직의 건강한 대조군 그룹 (HC)과 뇌종양 환자 (BT) 사이의 Fold-change를 나타낸 것이다. 빨간색은 혈청 내 임상 그룹 간에 유의하게 상이한 미생물 EV의 속을 나타낸 것이고, 녹색은 뇌조직 내 임상 그룹 간에 유의하게 상이한 미생물 EV의 속을 나타낸 것이고, 파란색은 혈청 및 조직 샘플 모두에서 유의한 차이를 갖는 미생물 EV의 속을 나타낸 것이다.
도 9는 속 수준에서 혈청 및 조직의 건강한 대조군 그룹 (HC)과 뇌종양 환자 (BT) 사이의 Fold-change를 나타낸 것이다. 빨간색은 혈청 내 임상 그룹 간에 유의하게 상이한 미생물 EV의 속을 나타낸 것이고, 녹색은 뇌조직 내 임상 그룹 간에 유의하게 상이한 미생물 EV의 속을 나타낸 것이고, 파란색은 혈청 및 조직 샘플 모두에서 유의한 차이를 갖는 미생물 EV의 속을 나타낸 것이다.
도 10는 뇌종양환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 11은 뇌종양환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 12는 뇌종양환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 13는 뇌종양환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 14은 뇌종양환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 뇌종양을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 뇌종양의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.
이에, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 뇌종양을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "뇌종양 진단" 이란 환자에 대하여 뇌종양이 발병할 가능성이 있는지, 뇌종양이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 뇌종양이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 뇌종양 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 뇌종양을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명에 있어서, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액일 수 있으며, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 조직일 수 있으며, 상기 조직은 뇌 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 상기 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 뇌종양 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다 (본 발명의 표 8 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈청 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 분석한 결과,
문 (phylum) 수준에서, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria,
강 (class) 수준에서, Clostridia, Bacill, Erysipelotrichia, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Negativicutes,
목 (order) 수준에서, Clostridiales, Bifidobacteriales, Erysipelotrichales, Lactobacillales, Micrococcales, Sphingomonadales, Selenomonadales,
과 (family) 수준에서, Ruminococcaceae, Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae, Bifidobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Porphyromonadaceae,
속 (genus) 수준에서, Ruminococcaceae UCG-014, Lachnospiraceae NK4A136, Ruminococcaceae UCG-013, Lactobacillus, Ruminiclostridium 6, Peptoclostridium, [Eubacterium] coprostanoligenes, Escherichia-Shigella, Blautia, Bifidobacterium, Streptococcus, Sphingomonas
세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌종양 환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다 (실시예 3 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 뇌조직 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 분석한 결과,
문 (phylum) 수준에서, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Cyanobacteria, Saccharibacteria,
강 (class) 수준에서, Erysipelotrichia, Clostridia, Saccharibacteria (p), Chloroplast
목 (order) 수준에서, Erysipelotrichales, Clostridiales, Chloroplast (c), Saccharibacteria (p),
과 (family) 수준에서, Bacteroidaceae, Erysipelotrichaceae, Ruminococcaceae, Bacteroidales S24-7 군, Chloroplast (c), Prevotellaceae, Saccharibacteria (p),
속 (genus) 수준에서, Bacteroides, Erysipelatoclostridium, Bacteroidales S24-7 군, Chloroplast (c), Lachnospiraceae NK4A136 군, Prevotella 9, Candidatus Saccharimonas
세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌종양 환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다 (실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Actinobacteria 및 Tenericutes 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌종양 환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 강(class) 수준에서 분석한 결과, Actinobacteria 및 Mollicutes 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌종양 환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목(order) 수준에서 분석한 결과, Turicibacterales, Xanthomonadales, 및 RF39 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌종양 환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 과(family) 수준에서 분석한 결과, Intrasporangiaceae, Lactobacillaceae, Mogibacteriaceae, Turicibacteraceae, Nocardiaceae, Xanthomonadaceae, Weeksellaceae, 및 Veillonellaceae 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌종양 환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Stenotrophomonas, Lactobacillus, Turicibacter, Tepidimonas, Sphingomonas, Rhodococcus, 및 Cloacibacterium 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌종양 환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
상기 실시예 결과를 통해 상기 동정된 세균 유래 세포밖 소포의 분포 변수가 뇌종양 발생 예측에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험예 1. 피험자 및 샘플 수집
서울대학교 병원과 인제대학교 해운대 병원에서 총 182명의 뇌종양(BT, Brain Tumor) 환자와 125명의 건강한 대조군 (HC, Healthy control) 피험자의 혈청 샘플을 각각 수집하였다. 또한, 서울대학교 병원에서 수집한 5명의 BT 환자와 5명의 HC 피험자로부터 조직 샘플을 평가하였다. 각 BT 임상 대상은 치료를 위해 병원을 방문하도록 하는 증상을 나타냈다. 건강 관리 대상은 일반적인 건강 검진을 통해 선별되었다. 본 발명의 실험예는 서울대학교 병원 임상 시험 심사위원회 (IRB 번호 H-1009-025-331)와 인제대학교 해운대 병원 (IRB 번호 1297992-2015-064)에 의해 승인되었다. 본 발명의 모든 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었으며, 모든 임상 대상으로부터 사전 동의를 얻었다.
수집된 모든 인간 혈청 샘플을 혈청 분리기 튜브 (SST)로 옮긴 다음, 4 ℃에서 15 분 동안 3,000 rpm으로 원심분리 하였다. 모든 뇌 조직 샘플은 액체 질소에서 동결시키고 분석을 위해 -80℃에 보관하였다.
실험예 2. in vivo 마우스 연구 모델
사용된 모든 마우스는 6 주령의 암컷 C57BL/6 마우스였다 (Orient Bio Inc, 성남, 한국). 마우스는 in vivo 연구 과정 전반에 걸쳐 12 시간의 밤낮 주기로 22±2℃ 및 50±5% 습도의 표준 실험실 조건에서 수용하고 유지시켰다.
실험예 3. EV DNA 추출 및 시퀀싱
혈청 및 조직 샘플로부터 EV를 추출하기 위해, 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 혈액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3' 2
실험예 4. 미생물 EV 조성물의 메타게놈 분석
상기 실험예 3의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표 1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 분류 (Taxonomic assignment)는 프로파일링 프로그램 MDx-Pro ver.2 (MD Healthcare, Korea)로 수행하였다. paired-end 리드를 바코드에 따라 필터링하고, 프라이머 서열을 Cutadapt (버전 1.1.6)를 사용하여 트리밍한 다음, CASPER와 병합하였다. 고품질 시퀀싱 리드를 수득하기 위해, 350 bp 미만 또는 550 bp 초과의 리드, 및 20 미만의 Phred 품질 점수를 갖는 서열을 제외하였다. VSEARCH de novo 클러스터링 방법을 사용하여 97 % 유사성 임계값을 기준으로, OTU (Operational Taxonomic Unit)를 속 수준에 분류하였다. 하나의 샘플에만 1 개의 서열을 포함하는 OTU는 추가 분석에서 제외되었다. 이어서, 기본 파라미터 하에서 Silva 132 database에 대해 UCLUST 및 QIIME 1.9.1을 사용하여 분류 수준 지정을 종 수준으로 수행하였다. 데이터베이스의 분류학적 정보가 충분하지 않아 속 수준에서 군집을 할당할 수 없는 경우, 분류군이 다음으로 높은 수준으로 지정하였다. 분류명 주위의 괄호는 주로 게놈 데이터베이스 내의 전체 게놈 계통 발생에 기초하여 확인되지 않은, 제안된 분류 (taxonomic assignment)를 나타낸다.
실험예 5. 예측 진단 모델의 확립
뇌종양 (BT, Brain Tumor) 예측 진단 모델의 개발을 위해, 속 수준에서 OTU의 상대적 존재비를 모델 변수로 간주하였다.
먼저, p 값이 0.01 미만이고, 배수 변화가 2 배보다 크고, 평균 상대 존재비가 0.1 %보다 큰 후보 균주를 선정하였다. 모델 변수로서 선정된 균주를 AUC (Area Under the Curve), 민감도 (sensitivity), 특이성 (specificity) 및 정확도 (accuracy)가 가장 높은 모델을 결정하기 위해 비교하였다.
첫 번째 방법 (M1)은 AIC (Akaike information criterion)가 변수가 다른 예측 진단 모델을 비교하는 데 사용되는 단계적 선택 (stepwise selection)을 사용하였다. 두 번째 방법 (M2)은 단계적 선택 방법론 외에 공변량으로 연령과 성별을 통합하였다. 세 번째 선택 방법 (M3)은 균주 마커 발견을 위해 선형 판별 분석 (LDA) 및 LDA Effect Size (LEfSe) 알고리즘을 사용하였다. 네 번째 방법 (M4)은 LEfSe를 사용하여 선택한 균주 마커를 통합하는 것 외에도 공변량으로 연령과 성별을 포함하였다. 또한, 다섯 번째 방법 (M5)은 그래디언트 부스팅 머신 (GBM, Gradient Boosting machine) 앙상블 방법에 기초한 머신 러닝 알고리즘에 의해 계산되었다.
GBM은 파이썬 (버전 3.6.9)에서 scikit-learn의 Gradient Boosting Regressor (버전 0.21.3)를 사용하여 모델링에 통합하였다. 변수 선택 후, 예측 진단 모델은 모델 검증을 위해 80:20 비율로 설정된 트레이닝 및 테스트 세트와 함께 로지스틱 회귀를 사용하여 계산되었다.
실험예 6. 통계 분석
BT와 대조군 사이의 유의한 연령 차이는 각각 스튜던트 t-검정 및 Wilcoxon 랭크섬 검정을 통해 결정되었다. 코호트의 성별에 기초한 그룹 간의 통계적 차이를 결정하기 위해 카이-제곱 검정 (Chi-square test)을 수행하였다. Praycipal coordinate analysis (PCoA)는 Bray-Curtis의 비유사도 거리에 따른 그룹의 개별 분류 수준 군집을 결정하기 위해 수행되었다. HC 그룹과 BT 그룹 사이의 마이크로바이옴 조성의 차이를 분석하기 위해, 스튜던트 t-검정을 수행 하였다. LEfSe는 통계적 및 생물학적 중요성을 갖는 바이오마커의 선택을 위해, 임상 그룹 사이에 유의미하고, 차별화된 풍부한 속을 결정하는데 사용되었다. LEfSe 알고리즘은 Wilcoxon 랭크섬 검정 및 LDA (Linear Discriminate Analysis)를 사용하여 컷오프 LDA 스코어 (log10)를 2로 설정하였다. p 값이 0.05 미만 (p <0.05) 일 때 결과가 유의한 것으로 간주하였고, 모든 분석은 R 버전 3.6.1을 사용하여 수행하였다.
실시예 1. 임상적 특성
HC (Healthy control) 및 BT (Brain tumor) 대상체 그룹의 임상적 특성의 평가를 통해, 두 그룹 사이에 유의한 차이가 있는 것으로 결정되었다 (p <0.001). HC 피험자들은 40 세에서 78 세 사이였으며, 평균 연령은 59.7 (SD 10.5)였으며, BT 피험자들은 16세 내지 81세 사이였으며, 평균 연령이 51.5 (SD 14.2)였다 (표 2).
Figure PCTKR2020008508-appb-img-000001
실시예 2. 다양성
BT 군에서는 종 풍부도의 Chao1 지수와 세균 군집 다양성의 샤넌 지수가 유의하게 높았지만, BT 군과 대조군 간의 심슨 지수의 차이는 유의하지 않았다 (도 1a).
PCoA를 수행하고 모든 샘플을 HC와 BT 그룹 사이의 유사성을 평가하기 위해 샘플들 사이에서 가장 유사하지 않은 두 가지 주요 좌표 (PCo, principal coordinates)를 따라 플롯팅하였다. 모든 분류군 수준에서, 두 군 사이에서 유의한 군집이 관찰되었다 (p <0.001) (도 1b).
실시예 3. 혈청 내 미생물 EV 풍부 및 바이오마커 확인
문 (phylum) 수준에서 Firmicutes 풍부도는 환자군보다 대조군에서 현저히 낮았던 반면 Actinobacteria와 Proteobacteria는 더 높았다 (도 2a 및 도 2c). 문 수준 바이오마커의 LEfSe 분석은 Actinobacteria, Proteobacteria 및 Firmicutes를 log (LDA score) 값이 4보다 큰 유일한 문으로 도출하였다 (도 3a).
강 (class) 수준에서 Clostridia, Bacilli, Erysipelotrichia, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria 및 Negativicutes가 크게 변화되었다. 8 개의 강 수준 바이오마커는 4.0의 log (LDA 점수)를 산출하는 Actinobacteria를 이용하여 결정되었으며, 이들은 대조군에서 생물학적으로 유의하게 높은 풍부도를 나타냈다 (도 4a).
목 (order) 수준에서 Clostridiales, Bifidobacteriales, Erysipelotrichales, Lactobacillales, Micrococcales, Sphingomonadales 및 Selenomonadales는 대조군과 환자 그룹 사이에서 크게 변화되었다. 목 수준에서 LEfSe 평가 결과, 대조군과 환자 그룹 간에 13 개의 분류군이 유의하게 다른 것으로 나타났으며, Clostridiales가 log (LDA 점수) 값 3.9로 가장 크게 차이나는 것으로 나타났다 (도 4b).
과 (family) 수준에서 Ruminococcaceae, Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae, Sphingomonadaceae 및 Porphyromonadaceae가 크게 변화되었다. 과 수준에서 LEfSe 평가 결과, 총 21 개의 분류군이 유의하게 다른 것으로 나타났으며, Ruminococcaceae가 log (LDA 점수) 값이 4.0보다 크게 나타났다 (도 4c).
마지막으로, 속 (genus) 수준에서의 분서 결과, 대조군과 BT 그룹 사이에서 다수의 유의한 차이를 나타내는 분류군이 결정되었다 (도 2b). Ruminococcaceae UCG-014, Lachnospiraceae NK4A136, Ruminococcaceae UCG-013, Lactobacillus, Ruminiclostridium 6 및 Peptoclostridium은 BT 그룹에서 대조군과 비교하여 유의하게 높은 반면, [Eubacterium] coprostanoligenes, Escherichia-Shigella, Blautia, Bifidobacterium, Streptococcus, 및 Sphingomonas 는 유의하게 더 낮은 수준으로 나타났다 (도 2d).
속 수준 혈청 EV 마이크로 바이옴 조성물의 LEfSe 분석은 총 30 개의 속을 산출하였으며, 특히 Ruminococcaceae UCG-014는 4.0을 초과하는 것으로 나타났다 (도 3b). 총 4, 9, 12, 18 및 29 taxa는 모든 그룹에서 0.5 %보다 높은 비율을 보였으며 문, 강, 목, 과 속에서 t-검정을 사용하여 대조군과 환자군 사이에서 유의한 차이를 나타냈다 (p <0.05).
실시예 4. 혈청 미생물 EV 메타게놈 기반 뇌종양 (BT) 진단 모델의 개발
대조군 및 BT 그룹의 혈청 미생물 EV 메타게놈 프로파일을 사용하여, 건강한 대상체에서 뇌종양의 위험을 결정하기 위한 진단 모델을 개발하였다.
단계적 선택 및 로지스틱 회귀 분석에 이어 M1 및 M2 모델은 12 개의 중요한 미생물 EV 속, Stenotrophomonas, Knoellia, Sphingomonas, Solanum melongena, Parabacteroides, Actinomyces, Ruminiclostridium, Lactococcus, Turicibacter, Faecalibacterium, Streptococcus, 및 Bifidobacterium을 산출하였다.
한편, M3 및 M4에 대한 LEfSe 분석에 의해 결정된 바이오마커를 이용한 로지스틱 회귀 분석은 29 개의 상이한 중요한 미생물 EV 속, Ruminococcaceae UCG-014, Lachnospiraceae NK4A136, Lactobacillus, Lachnospiraceae(f), Acinetobacter, Staphylococcus, Pseudomonas, Ruminococcaceae UCG-013, Klebsiella, Bifidobacterium, Ruminococcus 1, Streptococcus, Ruminiclostridium 6, Peptoclostridium, Sphingomonas, Clostridiales vadinBB60(f), Turicibacter, Ruminococcaceae(f), Ruminococcus 2, Peptococcaceae(f), Diaphorobacter, Corynebacterium 1, Lactococcus, Propionibacterium, Solanum melongena, Actinomyces, Knoellia, Stenotrophomonas, 및 Veillonella를 산출하였다.
M5의 경우, 분석된 총 미생물 EV 메타게놈 정보의 상대적 풍부도를 특정 바이오마커보다는 분석을 위한 특징으로서 입력되었다.
테스트 세트를 사용한 모델 성능은 최적의 BT 진단 모델을 결정하기 위해 각 방법의 AUC, 민감도, 특이도 및 정확도를 기반으로 평가하였다. 그 결과, BT 진단 모델은 모두 0.93보다 높은 AUC를 나타냈다 (도 5a).
GBM 방법에 기초한 모델은 각각 1.000, 0.936 및 0.993의 값으로 가장 높은 민감도, 특이도 및 AUC를 나타냈다 (도 5b).
실시예 5. 뇌 조직 미생물 EV 메타게놈 기반 뇌종양 (BT) 진단 모델의 개발
문 수준에서 Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria 및 Proteobacteria는 모든 그룹에서 가장 풍부한 문이었으며, 환자 및 대조군에서 조직 EV 분류군의 80 % 이상을 차지하였다. Cyanobacteria 및 Saccharibacteria는 대조군에서 환자군보다 유의하게 높았다 (도 6a, 도 6c).
강 (class) 수준에서 Erysipelotrichia는 대조군에서 환자군보다 유의하게 낮았다. 반면, Clostridia, Saccharibacteria (p) 및 Chloroplast는 대조군에서 유의하게 높았다 (도 7a).
목 (order) 수준에서 Clostridiales, Chloroplast (c) 및 Saccharibacteria (p)는 대조군에서 현저하게 풍부한 반면, Erysipelotrichales는 유의하게 낮은 것으로 나타났다 (도 7b).
과 (family) 수준에서 Bacteroidaceae, Ruminococcaceae, Bacteroidales S24-7 군, Erysipelotrichaceae, Chloroplast (c), Prevotellaceae 및 Saccharibacteria (p)가 임상 그룹간에 크게 변화하였으며, LEfSe를 통해 발견된 바이오마커에는 Bacteroidales S24-7 그룹, Ruminococcaceae, Prevotellaceae, Bacteroidaceae 및 Erysipelotrichaceae 가 포함되었다 (도 7c).
속 (genus) 수준에서 Bacteroides와 Erysipelatoclostridium은 BT 군에 비해 대조군에서 유의하게 낮은 반면, Bacteroidales S24-7 군, Chloroplast (c), Lachnospiraceae NK4A136 군, Prevotella 9, Candidatus Saccharimonas는 유의하게 높았다 (도 6b, 도 6d). 속 수준에서의 LEfSe 평가는 중요한 뇌종양 바이오마커로서 Bacteroidales S24-7 군, Lachnospiraceae NK4A136, Bacteroides 및 Erysipelatoclostridium을 보여주었다 (도 6e).
또한, 대조군과 환자 사이의 혈청 및 조직의 마이크로바이옴 조성 변경을 비교하기 위해, 동일한 개체로부터 얻은 혈청 및 조직의 미생물 EV 조성물의 배수 변화를 분석하였다.
문 (phylum) 수준에서, 환자의 Saccaribacteria는 혈청과 조직 모두에서 유의하게 감소하였다 (도 8a).
강 (class) 수준에서, 환자의 Erysipelotrichia은 혈청 및 조직 샘플 둘 다에서 유의하게 증가되었다 (도 8b).
목 (order) 수준에서, Erysipelotrichiales는 환자 혈청과 조직 샘플 모두에서 유의하게 증가되었다 (도 8c).
과 (family) 수준에서, 환자의 혈청과 조직에서 Erysipelotrichiales는 유의하게 높았고, Prevotellaceae는 유의하게 감소하였다 (도 8d).
마지막으로, 속 수준에서 환자의 [Eubacterium] rectale (E. rectale) 및 Dialister는 혈청 및 조직 샘플 모두에서 유의하게 감소하였다. 또한, Lachnospiraceae NK4A136은 뇌종양 환자 조직에서 유의하게 낮았지만, 대조군의 조직 및 혈청 샘플과 비교하여 환자의 혈청에서 각각 크게 증가함을 확인하였다 (도 9).
실시예 6. 혈액 샘플을 이용한 뇌종양 진단 모델 개발
실시예 6-1. 혈액에서 추출한 DNA의 메타게놈 분석
혈액에 존재하는 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 혈액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 상기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다. 결과를 Standard Flowgram Format (SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
실시예 6-2. 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 뇌종양 진단모형
상기 실시예 6-1의 방법으로, 뇌종양환자 170명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 200명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 그룹 평균이 0.1% 이상인 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 문 (phylum) 수준에서 분석한 결과, Actinobacteria, 및 Tenericutes 문 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌종양에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 10 참조).
　 대조군 뇌종양 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
p__Actinobacteria 0.0625 0.0492 0.0316 0.0210 0.0000 0.51 0.75 0.70 0.70 0.71
p__Tenericutes 0.0018 0.0039 0.0033 0.0026 0.0000 1.86 0.72 0.64 0.85 0.46
혈액 내 세균유래 소포를 강 (class) 수준에서 분석한 결과, Actinobacteria, 및 Mollicutes 강 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌종양에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 11 참조).
　 대조군 뇌종양 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
c__Actinobacteria 0.0542 0.0474 0.0258 0.0204 0.0000 0.48 0.73 0.70 0.67 0.73
c__Mollicutes 0.0018 0.0039 0.0033 0.0026 0.0000 1.86 0.72 0.64 0.85 0.46
혈액 내 세균유래 소포를 목 (order) 수준에서 분석한 결과, Turicibacterales, Xanthomonadales, 및 RF39 목 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌종양에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 12 참조).
　 대조군 뇌종양 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
o__Turicibacterales 0.0042 0.0060 0.0090 0.0055 0.0000 2.15 0.76 0.59 0.76 0.46
o__Xanthomonadales 0.0076 0.0123 0.0009 0.0017 0.0000 0.12 0.73 0.74 0.64 0.83
o__RF39 0.0013 0.0027 0.0026 0.0022 0.0000 2.07 0.70 0.59 0.85 0.39
혈액 내 세균유래 소포를 과 (family) 수준에서 분석한 결과, Intrasporangiaceae, Lactobacillaceae, Mogibacteriaceae, Turicibacteraceae, Nocardiaceae, Xanthomonadaceae, Weeksellaceae, 및 Veillonellaceae 과 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌종양에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 13 참조).
　 대조군 뇌종양 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
f__Intrasporangiaceae 0.0075 0.0278 0.0002 0.0006 0.0003 0.03 0.77 0.74 0.48 0.95
f__Lactobacillaceae 0.0263 0.0217 0.0516 0.0228 0.0000 1.97 0.76 0.62 0.73 0.54
f__[Mogibacteriaceae] 0.0005 0.0017 0.0010 0.0021 0.0157 1.96 0.76 0.51 0.94 0.17
f__Turicibacteraceae 0.0042 0.0060 0.0090 0.0055 0.0000 2.15 0.76 0.59 0.76 0.46
f__Nocardiaceae 0.0008 0.0024 0.0014 0.0023 0.0206 1.69 0.74 0.49 1.00 0.07
f__Xanthomonadaceae 0.0075 0.0119 0.0009 0.0017 0.0000 0.12 0.73 0.77 0.67 0.85
f__[Weeksellaceae] 0.0025 0.0047 0.0038 0.0054 0.0137 1.53 0.71 0.50 1.00 0.10
f__Veillonellaceae 0.0115 0.0154 0.0045 0.0106 0.0000 0.39 0.71 0.58 0.73 0.46
혈액 내 세균유래 소포를 속 (genus) 수준에서 분석한 결과, Stenotrophomonas, Lactobacillus, Turicibacter, Tepidimonas, Sphingomonas, Rhodococcus, 및 Cloacibacterium 속 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌종양에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 7 및 도 14 참조).
　 대조군 뇌종양 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
g__Stenotrophomonas 0.0060 0.0111 0.0001 0.0003 0.0000 0.01 0.79 0.78 0.64 0.90
g__Lactobacillus 0.0261 0.0216 0.0514 0.0228 0.0000 1.97 0.76 0.62 0.73 0.54
g__Turicibacter 0.0042 0.0060 0.0090 0.0055 0.0000 2.15 0.76 0.59 0.76 0.46
g__Tepidimonas 0.0002 0.0009 0.0011 0.0024 0.0000 4.79 0.76 0.49 0.91 0.15
g__Sphingomonas 0.0116 0.0440 0.0015 0.0044 0.0016 0.13 0.75 0.65 0.55 0.73
g__Rhodococcus 0.0008 0.0024 0.0014 0.0024 0.0220 1.69 0.74 0.49 1.00 0.07
g__Cloacibacterium 0.0019 0.0040 0.0034 0.0052 0.0030 1.76 0.74 0.51 0.94 0.17
하기 표 8에 혈청, 혈액 및 뇌조직 샘플에서의 세균유래 소포 분석 결과를 간략히 나타내었다.
정상 대조군 대비 뇌종양 환자에서의 증감 증가 감소
혈청 문 Firmicutes Actinobacteria, Proteobacteria
강 Clostridia, Bacill, Erysipelotrichia Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Negativicutes
목 Clostridiales, Bifidobacteriales, Erysipelotrichales Lactobacillales, Micrococcales, Sphingomonadales, Selenomonadales
과 Ruminococcaceae, Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae Lachnospiraceae, Streptococcaceae, Bifidobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Porphyromonadaceae
속 Ruminococcaceae UCG-014, Lachnospiraceae NK4A136, Ruminococcaceae UCG-013, Lactobacillus, Ruminiclostridium 6, Peptoclostridium [Eubacterium] coprostanoligenes, Escherichia-Shigella, Blautia, Bifidobacterium, Streptococcus, Sphingomonas
조직 문 Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Cyanobacteria, Saccharibacteria
강 Erysipelotrichia Clostridia, Saccharibacteria (p), Chloroplast
목 Erysipelotrichales Clostridiales, Chloroplast (c), Saccharibacteria (p)
과 Bacteroidaceae Erysipelotrichaceae Ruminococcaceae, Bacteroidales S24-7 군, Chloroplast (c), Prevotellaceae, Saccharibacteria (p)
속 Bacteroides, Erysipelatoclostridium Bacteroidales S24-7 군, Chloroplast (c), Lachnospiraceae NK4A136 군, Prevotella 9, Candidatus Saccharimonas
혈액 문 Tenericutes Actinobacteria
강 Mollicutes Actinobacteria
목 Turicibacterales Xanthomonadales
과 Lactobacillaceae, Mogibacteriaceae, Turicibacteraceae, Nocardiaceae, Weeksellaceae, Intrasporangiaceae, Xanthomonadaceae, Veillonellaceae
속 Lactobacillus, Turicibacter, Tepidimonas, Rhodococcus, Cloacibacterium Stenotrophomonas, Sphingomonas
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 뇌종양 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 자폐증의 위험군을 조기에 진단 및 예측 가능하며, 또한 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있다. 이에 더하여, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 뇌종양의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 뿐 아니라, 뇌종양으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 질병의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있는 장점이 있으므로, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (12)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액 또는 조직이고,
    상기 (c) 단계에서 방선균문(Actinobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 후벽균(Firmicutes), 의간균(Bacteroidetes), 남세균(Cyanobacteria), 사카리박테리아(Saccharibacteria), 및 테네리쿠테스(Tenericutes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    클로스트리디움강(Clostridia), 바실강(Bacill), 에리시펠로스리키아강(Erysipelotrichiam), 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 네가티비콕쿠스강(Negativicutes), 사카리박테리아강(Saccharibacteria (p)), 클로로플라스트강(Chloroplast), 방선균강(Actinobacteria) 및 몰리쿠테스(Mollicutes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    클로스트리디움목(Clostridiales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 에리시펠로스리키아목(Erysipelotrichales), 유산균목(Lactobacillales), 방선균목(Micrococcales), 스핑고모나스목(Sphingomonadales), 셀레노모나스목(Selenomonadales), 클로로플라스트목(Chloroplast (c)), 사카리박테리아목(Saccharibacteria (p)), 터리시박테랄레스(Turicibacterales) 및 잔토모나달레스(Xanthomonadales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    루미노코카새애(Ruminococcaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 에리시펠로트릭스과(Erysipelotrichaceae), 래크노스피래세애(Lachnospiraceae), 연쇄상구균과(Streptococcaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 스핑고모나다세애(Sphingomonadaceae), 프로피로모나스과(Porphyromonadaceae), 박테로이데스과(Bacteroidaceae), 박테로이데스 S24-7(Bacteroidales S24-7), 클로로플라스트과(Chloroplast (c)), 프레보텔라세애(Prevotellaceae), 사카리박테리아과(Saccharibacteria (p)), 인트라스포란지아시에(Intrasporangiaceae), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 모지박테리아시에(Mogibacteriaceae), 터리시박테라시에(Turicibacteraceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 잔토모나다시에(Xanthomonadaceae), 위크셀라시에(Weeksellaceae), 및 베일로넬라시에(Veillonellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-014, 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) NK4A136, 루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-013, 루미니클로스트리듐(Ruminiclostridium) 6, 펩토클로스트리듐(Peptoclostridium), 유박테륨 코프로스타노리제네스([Eubacterium] coprostanoligenes), 대장균-이질균속(Escherichia-Shigella), 블라우티아(Blautia), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 박테로이데스(Bacteroides), 에리시펠라토클로스트리듐(Erysipelatoclostridium), 박테로이데스(Bacteroidales) S24-7, 클로로플라스트속(Chloroplast (c)), 프레보텔라(Prevotella) 9, 칸디다투스 사카리모나스(Candidatus Saccharimonas), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 터리시박터(Turicibacter), 테피디모나스(Tepidimonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 및 클로아시박테리움(Cloacibacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액이고,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    테네리쿠테스(Tenericutes) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    몰리쿠테스(Mollicutes) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    터리시박테랄레스(Turicibacterales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    락토바실라시에(Lactobacillaceae), 모지박테리아시에(Mogibacteriaceae), 터리시박테라시에(Turicibacteraceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 및 위크셀라시에(Weeksellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    락토바실러스(Lactobacillus), 터리시박터(Turicibacter), 테피디모나스(Tepidimonas), 로도코커스(Rhodococcus), 및 클로아시박테리움(Cloacibacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 뇌종양으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액이고,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    방선균문(Actinobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    방선균강(Actinobacteria) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    잔토모나달레스(Xanthomonadales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    인트라스포란지아시에(Intrasporangiaceae), 잔토모나다시에(Xanthomonadaceae), 및 베일로넬라시에(Veillonellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌종양으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈청이고,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    후벽균(Firmicutes) 유래 세포밖 소포,
    클로스트리디움강(Clostridia), 바실강(Bacill), 및 에리시펠로스리키아강(Erysipelotrichiam)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    클로스트리디움목(Clostridiales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 및 에리시펠로스리키아목(Erysipelotrichales)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    루미노코카새애(Ruminococcaceae), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 및 에리시펠로트릭스과(Erysipelotrichaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-014, 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) NK4A136, 루미노코카새애(Ruminococcaceae) UCG-013, 락토바실러스(Lactobacillus), 루미니클로스트리듐(Ruminiclostridium) 6, 펩토클로스트리듐(Peptoclostridium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우, 뇌종양으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈청이고,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    방선균문(Actinobacteria) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 방선균강(Actinobacteria), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 및 네가티비콕쿠스강(Negativicutes)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    유산균목(Lactobacillales), 방선균목(Micrococcales), 스핑고모나스목(Sphingomonadales), 및 셀레노모나스목(Selenomonadales)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    래크노스피래세애(Lachnospiraceae), 연쇄상구균과(Streptococcaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 스핑고모나다세애(Sphingomonadaceae), 및 프로피로모나스과(Porphyromonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    유박테륨 코프로스타노리제네스([Eubacterium] coprostanoligenes), 대장균-이질균속(Escherichia-Shigella), 블라우티아(Blautia), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌종양으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 조직이고,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    방선균문(Actinobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 후벽균(Firmicutes), 및 의간균(Bacteroidetes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    에리시펠로스리키아강(Erysipelotrichiam) 세균 유래 세포밖 소포,
    에리시펠로스리키아목(Erysipelotrichales) 세균 유래 세포밖 소포,
    에리시펠로트릭스과(Erysipelotrichaceae) 및 박테로이데스과(Bacteroidaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    박테로이데스(Bacteroides), 및 에리시펠라토클로스트리듐(Erysipelatoclostridium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 뇌종양으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 조직이고,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    남세균(Cyanobacteria), 및 사카리박테리아(Saccharibacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    클로스트리디움강(Clostridia), 사카리박테리아강(Saccharibacteria (p)), 및 클로로플라스트강(Chloroplast)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    클로스트리디움목(Clostridiales), 클로로플라스트목(Chloroplast (c)), 및 사카리박테리아목(Saccharibacteria (p))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    루미노코카새애(Ruminococcaceae), 박테로이데스 S24-7(Bacteroidales S24-7), 클로로플라스트과(Chloroplast (c)), 프레보텔라세애(Prevotellaceae), 및 사카리박테리아과(Saccharibacteria (p))로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    박테로이데스(Bacteroidales) S24-7, 클로로플라스트속(Chloroplast (c)), 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) NK4A136, 프레보텔라(Prevotella) 9, 및 칸디다투스 사카리모나스(Candidatus Saccharimonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌종양으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 조직은 뇌조직인 것을 특징으로 하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 하기의 단계를 포함하는, 뇌종양 진단방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  12. 하기의 단계를 포함하는, 뇌종양 발병을 예측하기 위한 정보제공방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
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