JP2010512168A

JP2010512168A - 組換えヒトアルギナーゼｉについての改善された発現系

Info

Publication number: JP2010512168A
Application number: JP2009541459A
Authority: JP
Inventors: リャンホァン，ユー; シュシェン，ツォン
Original assignee: Bio Cancer Treatment International Ltd
Current assignee: Bio Cancer Treatment International Ltd
Priority date: 2006-12-12
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2010-04-22
Also published as: EP2102231A4; EP2102231A2; WO2008073688A3; US20100041101A1; CN101605807A; AU2007333395A1; US20080138858A1; WO2008073688A2

Abstract

組換えヒトアルギナーゼＩの発現を改善するための新規組換えタンパク質発現系が提供される。この系は、組換えヒトアルギナーゼＩの発現を改善するために、プラスミドを構築するための、単離精製された核酸分子および大腸菌株を含む。本発明の別の態様において、前記アルギナーゼを発現させる際の単離された大腸菌株を作製するための方法が提供される。

Description

本発明は、ヒトアルギナーゼＩ（ｈｕｍａｎａｒｇｉｎａｓｅ I）のクローニングに関する。具体的には、本発明は、前記ヒトアルギナーゼＩに対応する核酸分子およびプラスミドに関する。本発明はまた、前記ヒトアルギナーゼＩの組換えタンパク質を発現させるための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株にも関する。本発明はまた、組換えタンパク質を生産する方法にも関する。

組換えプロセスでは、医学的用途に有用なタンパク質を産生する遺伝子操作された生物を用いる。組換えプロセスによって作製される生成物のいくつかの例として、インスリン、種々の成長ホルモンおよびワクチンが挙げられる。そのようなタンパク質の大量生産は、遺伝子操作された細菌のタンクを備えた工場において可能である。組換えプロセスにおいて最も一般に使用される生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である。

細菌の生理学および遺伝学は、他のどの生物よりもおそらくかなりよく理解されている。しかしながら、プロセスの成否は、遺伝子操作された細菌の生存率、および最終生成物を作製するために不可欠な情報を有する組換えＤＮＡに左右されることが多い。不完全に構築されたプラスミドは、有意義な量の生成物が産生できなくなる場合があり、また、遺伝子操作された細菌の生存率を低下させる場合がある。また、排除するのが難しく、最終生成物の品質を悪化させるコンタミネーションをもたらすリスクもある。

前述の背景を考慮して、前記アルギナーゼの生産量を最大にするために、ヒトアルギナーゼＩを生産する際により良好な遺伝子操作された細菌を提供することが、本発明の目的であり、それによって、医薬ＧＭＰグレードの材料を生産するための安全かつ効率的な方法がもたらされる。

従って、一つの側面において、本発明は、組換えヒトアルギナーゼＩの発現用の、単離され精製された核酸分子である。

本発明の好ましい一態様は、組換えヒトアルギナーゼＩ発現用プラスミドの構築における前述の核酸分子の使用である。

さらにまた本発明の一側面は、組換えヒトアルギナーゼＩ生産用大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の単離株の構築における前述のプラスミドの使用である。

形質転換されたコンピテントＤＨ５（α）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からのプラスミド抽出物（ｐＥＴ３０（＋）／ＡＲＧＣ）のアガロース電気泳動解析を示している。抽出されたｐＥＴ３０（＋）／ＡＲＧＣを制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化（切断）した。予測される断片サイズの１．４ｋｂおよび５ｋｂが示された。レーンＭ：λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩマーカー（ＭＢＩ）、レーン１：ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで二重消化されたｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣ、レーン２：未消化ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣ。１３８３塩基（核酸）を含む組換えｐＥＴ３０（＋）／ＡＲＧＣの、挿入されたヌクレオチド配列を示している。形質転換されたコンピテントＤＨ５（α）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からのプラスミド抽出物（ｐＥＴ３０（＋）／ＡＲＧＭ）のアガロース電気泳動解析を示している。抽出されたｐＥＴ３０（＋）／ＡＲＧＭを制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化（切断）した。予測される断片サイズの１ｋｂおよび５ｋｂが示された。レーンＭ：λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩマーカー（ＭＢＩ）、レーン１：ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで二重消化されたｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭ、レーン２：未消化ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭ。２セットの終止コドンＴＡＡを含む、９９３塩基（核酸）を含んでいる組換えｐＥＴ３０（＋）／ＡＲＧＭの、挿入されたヌクレオチド配列を示している。ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭの９９３塩基（核酸）のコード領域のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を示している。発現されるヒトアルギナーゼＩタンパク質は、３２２アミノ酸残基から成るタンパク質と、開始メチオニンおよび６つのヒスチジンから成るタグ、すなわち全部で３２９アミノ酸残基から成るタンパク質である。ＢＬ２１（ＤＥ３）によって発現されたｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。レーンＭ：低分子量タンパク質マーカー、レーン１：ＩＰＴＧ誘導なしの組換えヒトアルギナーゼＩ、レーン２：誘導の１時間後、レーン３：誘導の２時間後、レーン４：誘導の３時間後、レーン５：誘導の４時間後、レーン６：誘導の５時間後。ＢＬ２１（ＤＥ３）によって発現されたｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。レーンＭ：低分子量タンパク質マーカー、レーン１：ＩＰＴＧ誘導なしの組換えヒトアルギナーゼＩ、レーン２：誘導の１時間後、レーン３：誘導の２時間後、レーン４：誘導の３時間後、レーン５：誘導の４時間後、レーン６：誘導の５時間後。ＢＬ２１（ＤＥ３）によって発現されたｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。レーンＭ：低分子量タンパク質マーカー、レーンＰ：純粋なヒトアルギナーゼＩ、レーン１：ＩＰＴＧ誘導なしの組換えヒトアルギナーゼＩ、レーン２：誘導の１時間後、レーン３：誘導の２時間後、レーン４：誘導の３時間後、レーン５：誘導の４時間後、レーン６：誘導の５時間後。

実施例１：ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣプラスミドの構築

遺伝子クローニングの分野において一般的な実験手法を用いて、ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣプラスミドを調製した。まず、ｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣプラスミドおよびｐＥＴ３０ａ（＋）プラスミドの両方を、それぞれ別々に制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて３７℃で一晩消化に供した。次いで、消化（切断）された断片を、１６℃において一晩、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと混合した。ライゲーションされたプラスミドを用いてコンピテントＤＨ５（α）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。選択は、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレートで行った。幾つかのシングルコロニーを採取し、培養した。上記ライゲーションされたプラスミドを抽出し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて３７℃で１時間消化し、電気泳動することによってそのプラスミドを確認した。最後に、ｐＥＴ３０（＋）のバックボーンおよびヒトアルギナーゼ遺伝子（非コード配列を含む）を含んでいる、ライゲーションされ抽出されたプラスミドをｐＥＴ３０（＋）／ＡＲＧＣと命名した。その核酸配列は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ（上海）によって確認された。その配列は、図２に示されるように、１３８３塩基（核酸）からなる理論配列と同一であった。

実施例２：ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣプラスミドの発現

構築されたｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣを用いて、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上で、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。１２時間の増殖時間の後、幾つかのシングルコロニーを採取し、５０ｍＬのＬＢ培地に移した。該細胞を３７℃において２５０ｒｐｍで培養した。濁度ＯＤ_６００が０．６〜０．８のときに、ＩＰＴＧを０．４ｍＭの濃度になるように加えて、発現を誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、発現レベルを確認した。

実施例３：ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭプラスミドの構築

ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭプラスミドの構築用に制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩサイトを有する２つのプライマー（配列番号１および２）を、以下のとおり設計した。：
１−Ｆ：５'−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ−３'
２−Ｒ：５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＴＴＡＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＴＡＧ−３'

遺伝子クローニングの分野において一般的な実験手法を用いて、プラスミドｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭを調製した。まず、鋳型としてｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣプラスミドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣプラスミドを増幅した。増幅された遺伝子断片およびｐＥＴ３０ａ（＋）プラスミドを、それぞれ別々に制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて３７℃で一晩消化に供した。次いで、消化（切断）された断片を１６℃において一晩Ｔ４ＤＮＡリガーゼと混合した。ライゲーションされたプラスミドを用いてコンピテントＤＨ５（α）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。選択は、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレートで行った。幾つかのシングルコロニーを採取し、培養した。上記ライゲーションされたプラスミドを抽出し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて３７℃で１時間消化し、電気泳動することによってそのプラスミドを確認した。最後に、ｐＥＴ３０（＋）のバックボーンおよびヒトアルギナーゼ遺伝子（非コード配列を含まない）を含んでいる、ライゲーションされ抽出されたプラスミドをｐＥＴ３０（ａ）／ＡＲＧＭと命名した。その核酸配列をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ（上海）に送り、そこによってその核酸配列が確認された。その配列は、図４に示されるように、９９３塩基（核酸）からなる理論配列と同一であった。

実施例４：ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭプラスミドの発現

構築されたｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭを用いて、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレート上でコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。１２時間の増殖時間の後、幾つかのシングルコロニーを採取し、５０ｍＬのＬＢ培地に移した。該細胞を３７℃において２５０ｒｐｍで培養した。濁度ＯＤ_６００が０．６〜０．８のときに、ＩＰＴＧを０．４ｍＭの濃度になるように加えて、発現を誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、発現レベルを確認した。

実施例５：ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたヒトアルギナーゼＩ間の発現レベルの比較

図６は、ｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から得られたヒトアルギナーゼの発現レベルを示している。不純物が多い一方で、発現レベルは低いことが明らかである。図７は、ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から得られた組換えヒトアルギナーゼの発現レベルを示している。その内容物は、ｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣで形質転換された細胞と比べて純度が低いことが明らかである。その発現レベルは、図６のようにｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣによって発現されるレベルよりもわずかに高いが、発現されたヒトアルギナーゼＩの産生量は、なおも少ない。図８は、ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から得られたヒトアルギナーゼの発現レベルを示している。その内容物が、３つのプラスミドのうち最も純度が高く、発現レベルが最も高いことが分かる。

実施例６：ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるヒトアルギナーゼＩ間のプラスミド安定性の比較

表１、２および３は、プラスミドの安定性に関して、ｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣ、ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣおよびｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭでそれぞれ形質転換された各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の生理学的特徴の比較を示している。まず、ｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣおよびｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣでそれぞれ形質転換された各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、通常の増殖速度およびカナマイシン耐性を示した。−８０℃でグリセロール中に４ヶ月間保存した後、希釈倍率（ｄｉｌｕｔｉｏｎｆｏｌｄ）を１０ｅ４〜１０ｅ５に下げるまでコロニーは検出されず、培養液から遺伝子発現は検出されなかった。

まず、ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、１０ｅ９〜１０ｅ１０の希釈倍率において通常のカナマイシン耐性を示した。また、発現レベルが、１５％〜２５％であることが見出され、これは、ｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣおよびｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣでそれぞれ形質転換された各細胞のレベルよりもはるかに高かった。−８０℃でグリセロール中に６ヶ月間、保存した後、ｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＭで形質転換された細胞は、通常レベルのカナマイシン耐性を保持しており、発現レベルは、−８０℃での４ヶ月間の保存後のｐＡＥＤ−４／ＡＲＧＣおよびｐＥＴ３０ａ（＋）／ＡＲＧＣでそれぞれ形質転換された各細胞のレベルよりもはるかに高かった。

このように、本発明の好ましい実施形態が、十分に説明される。この説明では、特定の幾つかの実施形態について言及したが、本発明がこれらの具体的な細部を変更して実施されうることは、当業者には明らかであろう。それゆえ、本発明は、本明細書中に示された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。

例えば、本発明では、Ｎｏｖａｇｅｎ製のｐＥＴ３０ａ（＋）ベクターの使用について言及したが、当業者は、ｐＴｒｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＢＶ２２０およびｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）などの他のベクターが使用されうることを理解し得る。

当業者はまた、本発明では、ｌａｃプロモーターの使用について言及したが、トリプトファンプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよび温度誘導性プロモーター（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｍｏｔｅｒ）などの他のプロモーターが使用されうることを理解し得る。

さらに、本発明では宿主としてＢＬ２１（ＤＥ３）の使用について言及したが、当業者は、ＴＯＰ１０、Ｍ１５およびＤＨ５ａ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの他の発現系（発現システム）が使用されうることを理解し得る。

本発明では、終止コドンＵＡＡに転写する最後のＴＡＡを含む９９０ｂｐからなる、ヒトアルギナーゼＩのコード領域の使用が説明されている。本発明の最も好ましい実施形態では、当該終端シグナルの発現をさらに確実にするために、さらにもう１セットの付加されたＴＡＡ塩基を含む９９３ｂｐからなるヒトアルギナーゼＩのコード領域を用いる。

Claims

組換えヒトアルギナーゼＩの発現用の、単離精製された核酸分子であって、
前記核酸分子は、ヒトアルギナーゼＩのコード配列と、所定の発現系において前記ヒトアルギナーゼＩの発現を促すための、前記コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーター配列とを含み、
前記核酸配列は、前記ヒトアルギナーゼＩｍＲＮＡにおける非コード配列を除外したものである、単離精製された核酸分子。
複数のヒスチジンをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の単離精製された核酸分子。
前記核酸配列は、少なくとも６つのヒスチジンをコードする配列を含む、請求項２に記載の単離精製された核酸分子。
組換えヒトアルギナーゼＩの発現用のプラスミドであって、
前記プラスミドは、ヒトアルギナーゼＩのコード配列と、所定の発現系において前記ヒトアルギナーゼＩの発現を促すための、前記コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーター配列とを含み、
前記プラスミドは、前記ヒトアルギナーゼＩｍＲＮＡにおける非コード配列を除外したものである、プラスミド。
複数のヒスチジンをコードする核酸配列を含む、請求項４に記載のプラスミド。
前記核酸配列は、少なくとも６つのヒスチジンをコードする配列を含む、請求項５に記載のプラスミド。
前記プロモーター配列は、前記ヒトアルギナーゼＩのコード配列に作動可能に連結されたｌａｃオペロンをコードしている、請求項４に記載のプラスミド。
組換えヒトアルギナーゼＩの発現用の、単離された大腸菌株であって、
前記大腸菌は、ヒトアルギナーゼＩのコード配列と、所定の発現系において前記ヒトアルギナーゼＩの発現を促すための、前記コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーター配列とを含む核酸分子を含み、
前記核酸配列は、前記ヒトアルギナーゼＩｍＲＮＡにおける非コード配列を除外したものである、単離された大腸菌株。
前記核酸分子が、複数のヒスチジンをコードする核酸配列を含む、請求項８に記載の単離された大腸菌株。
前記核酸配列は、少なくとも６つのヒスチジンをコードする配列を含む、請求項９に記載の単離された大腸菌株。
前記核酸分子は、前記核酸分子に作動可能に連結された、Ｔ７プロモーターの下流のｌａｃオペロン配列を含む、請求項８に記載の単離された大腸菌株。
組換えタンパク質を生産する方法であって：
ａ）請求項８に記載の組換え大腸菌株を構築する工程と；
ｂ）流加培養法を用いて前記組換え大腸菌細胞を培養する工程と；
ｃ）前記組換えタンパク質の発現を促すために前記組換え大腸菌細胞を誘導する工程と；
ｄ）前記培養の生成物から前記組換えタンパク質を精製する工程と
を含む、方法。
前記組換えヒトアルギナーゼＩが、それに連結された少なくとも６つのヒスチジンを有し、
前記精製工程は、キレートカラムによるアフィニティークロマトグラフィを包含する、請求項１２に記載の方法。