CN117070512B - tRNA及其生物合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种tRNA及其生物合成方法。其中，该tRNA的生物合成方法包括：利用RNA连接酶将不同底物的3'端和5'端连接形成磷酸二酯键，形成tRNA，底物的数量≥2；RNA连接酶包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3和Rnl5中任意的一种或多种酶。能够解决现有技术中合成tRNA产率低的问题，适用于tRNA合成领域。

Description

tRNA及其生物合成方法
技术领域
本发明涉及tRNA合成领域，具体而言，涉及一种tRNA及其生物合成方法。
背景技术
tRNA是长度在70~120个核苷酸组成的核糖核酸分子，是蛋白质合成中的接合器分子。tRNA分子有100多种，各可携带一种氨基酸，将其转运到核蛋白体上，供蛋白质合成使用。tRNA的二级结构是倒三叶草的构型，一端有能连接氨基酸的3'-OH结构，另外一端具有反密码子，能与mRNA上的密码子碱基互补配对。RNA链通过自身回折，互补序列配对形成一段局部的双螺旋，称为茎（stem）或臂（arm）。两段之间未配对的碱基保持单链，形成突环（loop）。茎和突环构成了茎环结构（stem-loop）,也叫发夹结构（hairpin structure）。通常RNA回折比例越高，结构越稳定。tRNA不仅在生命体内发挥着重要作用，同时也有研究证明tRNA可用于治疗部分由于基因突变导致的疾病，如2021年Science上发表的《RNAoverexpression rescues peripheral neuropathy caused by mutations in tRNAsynthetase》表明基因突变导致的细胞内tRNA供应不足导致周围神经病变腓骨肌萎缩症。而提高甘氨酰-tRNA的水平或许有望作为一种潜在的治疗手段。因此tRNA疗法可能成为未来人类疾病治疗的有效方法。
目前RNA的合成主要靠固相合成来实现，然而，固定合成RNA的长度受限，一般tRNA的长度为70~120核苷酸，是固相合成不能合成的。目前tRNA的合成研究极少，主要合成途径来源于胞内的天然tRNA合成，再通过提取获得tRNA，产率极低，且过程易受核酸酶污染。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种tRNA及其生物合成方法，以解决现有技术中难以合成tRNA产率低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种tRNA的生物合成方法，该生物合成方法包括：利用RNA连接酶将不同底物的3'端和5'端连接形成磷酸二酯键，形成tRNA，底物的数量≥2；RNA连接酶包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3和Rnl5中任意的一种或多种酶。
进一步地，底物中包括一个或/多个非天然核苷酸，tRNA包括非天然tRNA。
进一步地，RNA连接酶包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、或SEQ ID NO：23所示的RNA连接酶中的一种或多种；或与SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10~SEQ ID NO：23中所示的任一种RNA连接酶具有70%以上同一性，且具有RNA连接酶活性的蛋白。
进一步地，非天然RNA包括颈环结构和互补区域，底物的连接位点位于非天然tRNA的颈环结构和/或互补区域。
进一步地，底物的3'端为羟基。
进一步地，底物包括第一底物和其他底物，第一底物的5'端形成非天然tRNA的5'端，其他底物的5'端为磷酸。
进一步地，底物中的非天然核苷酸的数量≥2。
进一步地，底物的5'端和/或3'端的核苷酸为非天然核苷酸。
进一步地，底物由非天然核苷酸组成。
进一步地，底物的数量为2-6个；底物的长度为15-60 nt。
进一步地，生物合成方法包括：底物退火和底物连接；底物退火包括：将底物溶于退火缓冲液中形成退火体系，将退火体系根据退火程序进行退火，退火程序包括：加热退火体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃后温浴10分钟，得到退火产物；底物连接包括：将退火产物、RNA连接酶和ATP配置为连接体系，进行底物连接。
进一步地，退火缓冲液包括：1 mM ~10 M NaCl，1 mM~10 M Tris-HCl，pH 4~10，0.1 mM ~10 M EDTA；底物连接的反应温度为0~70℃，反应时间为10 min~100 h；退火产物的浓度为10µM~2mM，RNA连接酶的浓度为0.02 ~4mg/mL，ATP与退火产物的摩尔比为1~10:1。
进一步地，连接体系还包括MgCl2和二硫苏糖醇；其中，MgCl2浓度为0.1 mM ~200M，二硫苏糖醇浓度为0.1 mM ~10 M。
进一步地，非天然核苷酸包括：具有如下一种或多种修饰的核糖核苷酸：核糖2'位修饰、核糖骨架修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰；核糖2'位修饰包括2'-甲氧基修饰、2'-氟修饰、2'-甲氧乙基修饰、2'-FANA修饰、锁核酸修饰或己糖醇核酸修饰；核糖骨架修饰包括将核苷酸中的核糖替换为ribuloNA、TNA、tPhoNA、或dXNA；碱基修饰包括脱氮腺嘌呤C7修饰、脱氮鸟苷C7修饰、胞嘧啶C5修饰或尿苷C5修饰；磷酸骨架修饰包括PS修饰。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种非天然tRNA，该非天然tRNA包括利用上述生物合成方法制备获得的非天然tRNA。
进一步地，上述tRNA包括利用上述生物合成方法制备获得的非天然tRNA。
应用本发明的技术方案，利用RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3、Rnl5中任意的一种或多种酶，生物合成tRNA，利用该生物合成方法，能够克服现有技术中tRNA产率低的问题。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例的非天然tRNA的结构示意图。
图2示出了根据本发明实施例2的底物1和底物2连接产物的PAGE电泳结果图。
图3示出了根据本发明实施例3的底物3和底物4连接产物的UPLC结果图。
图4示出了根据本发明实施例4的底物3和底物4连接产物的UPLC结果图。
图5示出了根据本发明实施例6的底物9和底物10连接产物的PAGE电泳结果图。
图6示出了根据本发明实施例7的底物11和底物12连接产物的UPLC结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，目前tRNA的合成研究极少，主要合成途径来源于胞内的天然tRNA合成，再通过提取获得tRNA，产率极低，且过程易受核酸酶污染。在本申请中发明人尝试探究一种tRNA的生物合成方法，实现了对于tRNA的高效制备，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种tRNA的生物合成方法，该生物合成方法包括：利用RNA连接酶将不同底物的3'端和5'端连接形成磷酸二酯键，形成tRNA，底物的数量≥2；RNA连接酶包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3和Rnl5中任意的一种或多种酶。
在一种优选的实施例中，底物中包括一个或/多个非天然核苷酸，tRNA包括非天然tRNA。
在利用tRNA制备核酸类药物的过程中，由于天然的RNA易受胞内的核酸酶识别而酶切讲解，因此核酸药品大多通过人工非天然的修饰来增强其对核酸酶的抵抗能力，同时增强特异性和降低副作用。现有技术中对于非天然的tRNA合成未见有报道，而利用本申请的生物合成方法，不仅能够合成天然的tRNA，而且能够实现对于非天然tRNA的合成。
在一种优选的实施例中，RNA连接酶包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的RNA连接酶中的一种或多种；或与SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10~SEQ ID NO：23中所示的任一种RNA连接酶具有70%以上同一性的酶，优选为75%以上、80%以上、85%以上同一性、90%以上同一性、95%以上同一性、98%以上同一性、99%以上同一性、99.5%以上同一性、99.9%以上同一性，且具有RNA连接酶活性的蛋白。
在上述生物合成方法中，利用上述RNA连接酶，能够将含有非天然核苷酸的底物连接，并形成具有高级结构的tRNA。在上述生物合成方法中，由于目标产物tRNA具有较为复杂的高级结构，且目标产物为含有化学修饰的非天然tRNA，因此发明人从诸多RNA连接酶中筛选获得了上述具有催化活性的RNA连接酶，上述RNA连接酶不仅具有催化含有非天然核苷酸的RNA片段连接的活性，其活性口袋与tRNA的结构适配，能够催化tRNA中底物RNA片段间的缺刻以磷酸二酯键连接，形成具有高级结构的非天然tRNA。
本申请中的同一性（Identity）是指氨基酸序列或核酸序列之间的“同一性”，即氨基酸序列或核酸序列中的种类相同的氨基酸残基或核苷酸的比率的总计。氨基酸序列或核酸序列的同一性可以利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）、FASTA等比对程序来确定。
70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%以上（比如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%以上，甚至99.9%以上）同一性且具有相同功能的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制、蛋白结构等均和a）序列提供的蛋白质大概率相同。
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
取代、替换等规则，一般情况下，哪些氨基酸性质类似，替换后的效果也类似。例如，在上述同源蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸（Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu）被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸（Phe、Tyr、Trp）被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸（Arg、His、Lys）被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸（Ser、Thr、Asn、Gln）被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
在一种优选的实施例中，非天然tRNA包括颈环结构和互补区域，底物的连接位点位于非天然tRNA的颈环结构和/或互补区域。
在一种优选的实施例中，底物的3'端为羟基。
在一种优选的实施例中，底物包括第一底物和其他底物，第一底物的5'端形成非天然tRNA的5'端，其他底物的5'端为磷酸。
上述底物之间或底物内部具有能够碱基互补配对的片段，在生物合成反应的过程中，此种能够碱基互补配对的片段相互结合，形成非天然tRNA的互补区域（包括互补区域1、互补区域2、互补区域3和互补区域4）。在此种碱基互补配对完成后，非天然tRNA的高级结构初步形成，不同底物以碱基互补形成的氢键连接，不同底物的头尾碱基之间未互相连接，存在缺刻。上述缺刻，即底物的连接位点，位于非天然tRNA的颈环结构（包括颈环1、颈环2和颈环3）和/或互补区域。上述RNA连接酶的活性口袋，能够与非天然tRNA的立体结构适配，催化活性不受到立体结构的影响，连接催化底物之间以磷酸二酯键连接，从而修复位于非天然tRNA上的缺刻。上述非天然tRNA的结构示意图如图1所示。
在一种优选的实施例中，底物中的非天然核苷酸的数量≥2；优选地，底物的5'端和/或3'端的核苷酸为非天然核苷酸；优选地，底物由非天然核苷酸组成。
非天然核苷酸（xeno-nucleic acid，XNA）是一类具有非天然骨架或核酸碱基的核酸分子。非天然核糖核苷酸，即为具有非天然骨架或核酸碱基的核糖核苷酸。上述底物供中含有非天然核苷酸，连接制备的tRNA中即含有非天然核苷酸，属于非天然tRNA。若底物供体的3'端碱基和/或底物受体的5'端碱基为非天然碱基时，虽然连接处的碱基与天然碱基不同，属于人为创造的非天然碱基，上述RNA连接酶也能够发挥连接活性。
在一种优选的实施例中，底物的数量为2-6个，包括2、3、4、5和6个。若底物数量过多，则连接效率和底物转化率较低。
在一种优选的实施例中，底物的长度为15-60 nt，包括但不限于15、20、25、30、35、40、45、50、55和60nt。
在一种优选的实施例中，生物合成方法的反应条件包括：底物退火和底物连接；底物退火包括：将底物溶于退火缓冲液中形成退火体系，将退火体系根据退火程序进行退火，退火程序包括：加热退火体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃后温浴10分钟，得到退火产物；底物连接包括：将退火产物、RNA连接酶和ATP配置为连接体系，进行底物连接。
优选地，退火缓冲液包括：1 mM ~10 M NaCl、1 mM~10 M Tris-HCl，pH 4~10以及0.1 mM ~10 M EDTA；更优选地，退火缓冲液包括：10~500 mM NaCl、1~1000 mM Tris-HCl，pH 5~9以及0.1~10 mM EDTA；优选地，底物连接的反应温度为0~70℃，反应时间为10 min~100 h；更优选地，底物连接的反应温度为0~50℃，反应时间为0.2~72 h；优选地，退火产物的浓度为10µM~2mM，RNA连接酶的浓度为0.02 ~4mg/mL，ATP与退火产物的摩尔比为1~10:1；优选地，反应体系还包括MgCl2和二硫苏糖醇；优选地，MgCl2浓度为0.1 mM ~200 M，二硫苏糖醇浓度为0.1 mM ~10 M；更优选地，MgCl2浓度为1~20 mM，二硫苏糖醇浓度为0.1~10 mM。
退火缓冲液中，NaCl的浓度包括但不限于1 mM、2 mM、3 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50mM、100 mM、200 mM、500 mM、1 M、2 M、3 M、5 M、7 M或10 M，Tris-HCl的浓度包括但不限于1mM、2 mM、3 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM、1 M、2 M、3 M、5 M、7 M或10 M，pH包括但不限于4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10；EDTA的浓度包括但不限于1 mM、2 mM、3 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM、1 M、2 M、3 M、5 M、7 M或10 M，MgCl2的浓度包括但不限于0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.5 M、1 M、2 M、3 M、5 M、10 M、20 M、30 M、40 M、50 M、70 M、100 M、150 M或200 M；二硫苏糖醇的浓度包括但不限于0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM、3 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200mM、500 mM、1 M、2 M、3 M、5 M、7 M或10 M。
反应温度包括但不限于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或70℃，反应时间包括但不限于10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、7 h、10 h、15 h、20 h、30 h、40 h、50 h、60 h、70 h、80 h、90 h或100 h。
在一种优选的实施例中，非天然核苷酸包括：具有如下一种或多种修饰的核糖核苷酸：核糖2'位修饰、核糖骨架修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰；优选地，核糖2'位修饰包括2'-甲氧基修饰、2'-氟修饰、2'-甲氧乙基修饰、2'-FANA修饰、锁核酸修饰或己糖醇核酸修饰；优选地，核糖骨架修饰包括将核苷酸中的核糖替换为ribuloNA、TNA、tPhoNA或dXNA；优选地，碱基修饰包括脱氮腺嘌呤C7修饰、脱氮鸟苷C7修饰、胞嘧啶C5修饰或尿苷C5修饰；磷酸骨架修饰包括PS修饰。
其中，锁核酸修饰为 ；己糖醇核酸修饰为/>；2'-甲氧乙基修饰为/>；2'-氟修饰为/> ；2'-FANA为/>；ribuloNA为/>；TNA为/>；tPhoNA为/>；dXNA为；PS修饰为 />。上述结构中Base均表示碱基，R表示羟基、氢、甲氧基、甲氧乙基或氟修饰。上述对于非天然核苷酸的修饰参见文献：Duffy K ,Arangundy-Franklin S , Holliger P . Modified nucleic acids: replication,evolution, and next-generation therapeutics[J]. BMC Biology, 2020, 18(1):112。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种tRNA，该tRNA包括利用上述生物合成方法制备获得的tRNA。
在一种优选的实施例中，tRNA包括利用上述生物合成方法制备获得的非天然tRNA。
本申请中使用的连接酶的序列、来源和所属家族如下。
连接酶L-1，SEQ ID NO：1，Escherichia phage JN02，RNA ligase 1（RNA连接酶家族Rnl1）：
HMEKLYYNLLSLCKSSSDRKFFYSDDVSPIGKKYRIFSYNFASYSDWLLPDALECRGIMFEMDGETPVRIASRPMEKFFNLNENPFTLSINLDDVKYLMTKEDGSLVSTYLDGGTVRFKSKGSIKSDQAVSATSILLDIDHKNLADRLLELCNDGFTANFEYVAPTNKIVLTYPEKRLILLNIRDNNTGEYIEYDDIYLDPVFRKYLVDRFEVPEGDWTSDVKSSTNIEGYVAVMKDGSHFKLKTDWYVALHTTRDSISSPEKLFLAIVNGASDDLKAMYADDEFSFKKVELFEKAYLDFLDRSFYICLDTYDKHKGKDRKTYAIEAQAVCKGAQTPWLFGIIMNLYQGGSKEQMMTALESVFIKNHKNFIPEGY。
连接酶L-2，SEQ ID NO：2，Bacteriophage AR1，RNA ligase 1：
MQELFNNLMELCKDSQRKFFYSDDVSASGRTYRIFSYNYASYSDWLLPDALECRGIMFEMDGEKPVRIASRPMEKFFNLNENPFTMNIDLNDVDYILTKEDGSLVSTYLDGDEILFKSKGSIKSEQALMANGILMNINHHQLRDRLKELAEDGFTANFEFVAPTNRIVLAYQEMKIILLNIRENETGEYISYDDIYKDAALRPYLVERYEIDSPKWVEEAKNAENIEGYVAVMKDGSHFKIKSDWYVSLHSTKSSLDNPEKLFKTIIDGASDDLKAMYADDEYSYRKIEAFETTYLKYLDRALFLVLDCHNKHCGKDRKTYAMEAQGVAKGAGMDHLFGIIMSLYQGYDSQEKVMCEIEQNFLKNYKKFIPEGY。
连接酶L-3，SEQ ID NO：3，Bacteriophage dhaeg，RNA ligase 2（RNA连接酶家族Rnl2）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLRTNGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDAVTCAKRTGPILPAEDFYGYEIVLKNYADSIKSIQDIMETSAAVSYQVFGEFAGTGIQKNVDYGDKDFYVFDIIVTTESGDVTYVDDYMMESFCKTFKFKMAPLLGRGKFEDLIKLPNDLDSVLPDYNFTVDNVGLAEANAHVWNAEAKGEVFTAEGYVLKPCYPLWLPNGNRVAIKCKNSKFSEKKKTDKPIKVAVVLSQDDLDLLQQFTDYVTVNRINNVISKIGEVSPKDFGKVMGLTVQDILEEAAREELELTDAENPVEVKKQLIECVKDTLRAVWIELVSK。
连接酶L-4，SEQ ID NO：4，Vibrio phage，RNA ligase 1：
MSFVKYTSLENSYRQAFVDKCDMLGVREWVALEKIHGANFSFIVEFKPNEAQDGAEFTVTPAKRTSTIGANVMGDYDFYGCTSVVEAHTAKMEAISNWLWARGIINVGETIIVYGELAGKGVQKEVNYGDKDFWAYDILLPETGKFLDWDVVLEACEFAKVKTTHEIARGTLDELLRIDPLFRSFHTPADVDGDNVAEGFVVKQLRNEKRLHNGSRAILKVKNDKFKEKKNKAGKTPRAAVVLTEEQEKLHAAFSCYLTENRLRNVLSKLETVTQKQFGMISGLFIKDAKDEFERDELNETAIARDDWDVIKRSLTNIANEILRKNWLDILDGNF。
连接酶L-5，SEQ ID NO：5，Archaea，RNA ligase 3（RNA连接酶家族Rnl3）：
MVSSVYKEILVKLGLTEDRIETLEMKGGIIEDEFDGIRYVRFKDSAGKLRRGTVVIDEEYVIPGFPHIKRIINLRSGIRRIFKRGEFYVEEKVDGYNVRVVMYKGKMLGITRGGFICPFTTERIPDFVPQEFFKDNPNLILVGEMAGPESPYLVEGPPYVKEDIQFFLFDVQEIKTGRSLPVEERLKIAEEYGINHVEVFGKYTKDDVDELYQLIERLSKEGREGIIMKSPDMKKIVKYVTPYANINDIKIGARVFYELPPGYFTSRISRLAFYLAEKRIKGEEFERVAKELGSALLQPFVESIFDVEQEEDIHELFKVRVKRIETAYKMVTHFEKLGLKIEIVDIEEIKDGWRITFKRLYPDATNEIRELIGGKAFVD。
连接酶L-6，SEQ ID NO：6，fungus Deinococcus radiodurans，RNA ligase 5（RNA连接酶家族Rnl5）：
MAERQVIKERAQLFPHPNAERLELCKVGTFQLVVRKGEYRDGDPIVIAPEKAVLPPQLAGLYTNADTGASYLHGAEKNRVGSVRLRGEVSQGVILPLDGLEDAPFGEDLAERLGITFWEPPVPVSMAGEVEPRPPAQHYKHHDVEQFGIYVSEFASGEEVMVTEKLHGTQGVYFRTAEGRWLVTSKGLSRGGLTLREAASNVYWQAARNSNLFAEADAAFSGGEVQIFGEVVPVQKGFSYGQHKPTVFVFKVVYDGLRLPRRDWPQWVLDHAVPVLYEGPFDEATVRKLRGGLETVSGKGLHIREGVVVAPKVPRFAADGSDLSVKLISDAYAKKETGEEYS。
连接酶L-7，SEQ ID NO：7，Trypanosoma brucei brucei，RNA ligase 2：
MVGGDGSIFERYTEIDNSNERRINALKGCGMFEDEWIATEKVHGANFGIYSIEGEKMIRYAKRSGIMPPNEHFFGYHILIPELQRYVTSIREMLCEKQKKKLHVVLINGELFGGKYDHPSVPKTRKTVMVAGKPRTISAVQTDSFPQYSPDLHFYAFDIKYKETEGGDYTTLVYDEAIELFQRVPGLLYARAVIRGPMSKVAAFDVERFVTTIPPLVGMGNYPLTGNWAEGLVVKHSRLGMAGFDPKGPTVLKFKCTAFQEISTDRAQGPRVDEMRNVRRDSINRAGVQLPDLESIVQDPIQLEASKLLLNHVCENRLKNVLSKIGTEPFEKEEMTPDQLATLLAKDALKDFLKDTEPSIVNIPVLIRKDLTRYVIFESRRLVCSQWKDILKRQSPDFSE。
连接酶L-8，SEQ ID NO：8，Acidobacteriabacterium，RNA ligase 1：
MKQMYDNLKALTQKNDMFFSSIQTTPSNKPVEIFSYHIASYSDWLEPDAIECRGIMFDITDKENPVILSRPMEKFFNLGENPLALPEDVLPLVKTIEEKRDGSLISTYLDDGKLYTKSKGSLYSDQANDSNRFLMRSENKDFKQALKTLAELGYTANMEYTSPKNQIVLKYEKQELIVLNIRNTETGDYLTLDDLAELDAENPEHTIYTHIAERFVDYEEVDGMSDEDVERIRDMKGIEGYVLVGQNQRVKLKTDWYVNLHRLKDNINNNRRLVESVVESRTDDLRQLFEHDQGSIDKIKEFEQYVLSKIKSCLAEVRTVYERVKHLDRKHYAINAQRYVDYTPLFSVIMRQFDDYNEENVVENIKQIALKNVDDFIPMHYK。
连接酶L-9，SEQ ID NO：9，fungus Magnaporthe grisea，RNA ligase 5：
MEGDSPVVAVTSPTIPTDSTLAVSPTAEKAASTESFSAPAVRKLVTLRRISRIRPVKNAKLPKSKYVAITVDGWEVVVNAKRDQRRFREGQLVVFFQIDSFVPENDGNFWEEMSTSAELFQERRGFRIGTLRIGESSLISQGRVFHLGEYPRVEEVVAELQKVHGDKDGLEVAMQRSFDDVLGVVKWDVPEEHKGAHYGPPPPMIPRTALNRIQDVTQQLWERHAATRVQITEKLDSCPISIYFVRNDSPFAKCLPALHDFAGKPDAQRRQQQLCVFPHGRVGVCANRLEYVCAPGQRFWAVVERLGIPGRLAREGRTAVVQGELVAPDRGGPGGFYAFSLWTEGGKHGGFDGEETQRAALRRMGVPLVPLVGYRAIGEFASSTGEMLAKADGRGFRGQLREGFVLKNVKENIWVKVISNAWLEWYEE。
连接酶L-10，SEQ ID NO：10，Klebsiella phage KP15，RNA ligase 2：
MFKKYSSLTNHYEGKFINGVIMNGLTGGVWVAREKIHGANFSFITDDGITVTPAKRTDVVKPAEDFYGCSAVVAKYSPGIRKMWETLKKTGTYDDLVIQVYGEFAGRGVQKDVDYGEKDFYVFDIRVNGEFLPDNLCSLISRSHGLKMAPLLGYGTFEEIKELPITFESVVNKANSGIGSDNTVYGEFVYPIMDVEEGNIAEGFVMKPVSPAFMPNGERVAIKCKTTKFTEKKAKKATRFNAPVSLSEKDKNQLDEFVCYLTENRVKNVLSKLDLASITAKDFGRIMGLTVQDAIEEISRNHGPFIEQFEDPAMAKKLFVTEAQNMIRPVWGKILNHEF。
连接酶L-11，SEQ ID NO：11，Vibrio phage，RNA ligase 1：
MTTQELYNHLMTLTDDAEGKFFFADHISPLGEKLRVFSYHIASYSDWLLPGALEARGIMFQLDEQDKMVRIVSRPMEKFFNLNENPFTMDLDLTTTVQLMDKADGSLISTYLTGENFALKSKTSIFSEQAVAANRYIKLPENRDLWEFCDDLTQAGCTVNMEWCAPNNRIVLEYPEAKLVILNIRDNETGDYVSFDDIPLPALMRVKKWLVDEYDPETAHADDFVEKLRATKGIEGMILRLANGQSVKIKTQWYVDLHSQKDSVNVPKKLVTTILNNNHDDLYALFADDKPTIDRIREFDSHVSKTVSASFHAVSQFYVKNRHMSRKDYAIAGQKTLKPWEFGVAMIAYQNQTVEGVYEALVGAYLKRPELLIPEKYLNEA。
连接酶L-12，SEQ ID NO：12，Bacteriophage，RNA ligase 2：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLYSLGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDKVTCAKRTGPILPAEDFFGYEIILKNYADSIKAVQDIMETSAVVSYQVFGEFAGPGIQKNVDYCDKDFYVFDIIVTTESGDVTYVDDYMMESFCNTFKFKMAPLLGRGKFEELIKLPNDLDSVVQDYNFTVDHAGLVDANKCVWNAEAKGEVFTAEGYVLKPCYPSWLRNGNRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKAKVELSEADNKLVGILACYVTLNRVNNVISKIGEIGPKDFGKVMGLTVQDILEETSRE GITLTQADNPSLIKKELVKMVQDVLRPAWIELVS。
连接酶L-13，SEQ ID NO：13，bacteria，RNA ligase 2：
MSFVKYTSLENSYRQAFVDKCDMLGVRDWVALEKIHGANFSFIVEFDGGYTVTPAKRTSIIGATATGDYDFYGCTSVVEAHKEKVELVANFLWLNEYINLYEPIIIYGELAGKGIQKEVNYGDKDFWAFDIFLPQREEFVDWDTCVAAFTNAEIKYTKELARGTLDELLRIDPLFKSLHTPAEHEGDNVAEGFVVKQLHSEKRLQSGSRAILKVKNEKFKEKKKKEGKTPTKLVLTPEQEKLHAEFSCYLTENRLKNVLSKLGTVNQKQFGMISGLFVKDAKDEFERDELNEVAIDRDDWNAIRRSLTNIANEILRKNWLNILDGNF。
连接酶L-14，SEQ ID NO：14，Vibrio phage phi-ST2，RNA ligase 2：
MNVQELYKNLMSLADDAEGKFFFADHLSPLGEKFRVFSYHIASYSDWLLPGALEARGIMFQLDDNDEMIRIVSRPMEKFFNLNENPFTMELDLTTTVQLMDKADGSLISTYLSGENFALKSKTSIFSEQAVAANRYIKKPENRDLWEFCDDCTQAGLTVNMEWCAPNNRIVLEYPEAKLVILNIRDNETGDYVSFDDIPQSALMRVKQWLVDEYDPATAHEPDFVEKLRDTKGIEGMILRLANGQSVKIKTQWYVDLHSQKDSVNVPKKLVTTILNGNHDDLYALFADDKPTIERIREFDSHVTKTLTNSFNAVRQFYARNRHLARKDYAIAGQKVLKPWEFGVAMIAYQKQTVEGVYESLVTAYLKRPELAIPEKYLNGV。
连接酶L-15，SEQ ID NO：15，Vibrio phage JN02，RNA ligase 2：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLYTNGLTTGVWVAREKIHGTNFSLIIERDNVTCAKRTGPILPAEDFYGYEIVLKKYDKAIKAVQEVMESISTSVPVSYQVFGEFAGGGIQKGVDYGEKDFYVFDIIINTESDDTYYMSDYEMQDFCNTFGFKMAPMLGRGTFDSLIMIPNDLDSVLAAYNSTASEDLVEANNCVFDANVIGDNTAEGYVLKPCFPKWLSNGTRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPVKTQVPLTEIDKNLLDVLACYVTLNRVNNVISKIGTVTPKDFGKVMGLTVQDILEETSREGIVLTSSDNPNLVKKELVRMVQDVLRPAWIELVS。
连接酶L-16，SEQ ID NO：16，Vibrio phage JS98，RNA ligase 2：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLRTNGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDAVTCAKRTGPILPAEDFYGYEIVLKNYADSIKSVQHLIESINYQSYQIYGELAGPGIQKNVDYGDKDFYVFDIRVTKEDGTESVLTDTLMEAFCIIHKFKVAPCLATGSFEDLIKLPNDFDSVIPDYNFAVDNAGLTIANSTDFIPKVEGKVFTAEGFVLKPDIPTWLPNGNRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKAAVVLSQDDMDLMWQFTDYVTVNRINNVISKIGEVSKKDFGKVMGLTVQDILEEAAREELELTDAENPVEVKKQLVECVKDTLRAVWIELVS。
连接酶L-17，SEQ ID NO：17，Trypanosoma brucei gambiense，RNA ligase 2：
MLRCLGVRHFRRTPLLFVGGDGSIFERYTEIDNSNERRINALKGCGMFEDEWIATEKVHGANFGIYSIEGEKMIRYAKRSGIMPPNEHFFGYHILIPELQRYVTSIREMLCEKQKKKLHVVLINGELFGGKYDHPSVPKTRKTVMVAGKPRTISAVQTDSFPQYSPDLHFYAFDIKYKETEGGDYTTLVYDEAIELFQRVPGLLYARAVIRGPMSKVAAFDVERFVTTIPPLVGMGNYPLTGNWAEGLVVKHSRLGMAGFDPKGPTVLKFKCTAFQEISTDRAQGPRVDEMRNVRRDSINRAGVQLPDLESIVQDPIQLEASKLLLNHVCENRLKNVLSKIGTEPFEKEEMTPDQLATLLAKDAMKDFLKDTEPSIVNIPVLIRKDLTRYVIFESRRLVCSQWKDILKRQSPDFSE。
连接酶L-18，SEQ ID NO：18，Bacteriophage RB69，RNA ligase 1：
MEKLYYNLLSLCKSSSDRKFFYSDDVSPIGKKYRIFSYNFASYSDWLLPDALECRGIMFEMDGETPLRIASRPMEKFFNLNENPFTLSIDLNDVKYLMTKEDGSLVSTYLDGNMVRFKGSIKSDQAASATSILLDINHKDLADRLLELCNDGFTANFEYVAPSNKIVLTYPEKRLILLNIRDNNTGKYIEYDDIYLDPVFRKYLVDRFEAPEGDWVPGVKSSTNIEGYVAVMKDGSHFKLKTDWYVALHTTRDSISSPEKLFLAIMNGASDDLKAMYADDEFSFKKVELFEKAYLDFLDRSFYICLDAYDKHKGKDRKTYAIEAQAICKGAQSPWLFGIIMNLYQGGSKEQMMTALESVFIKNHKNFIPEGY。
连接酶L-19，SEQ ID NO：19，Bacteriophage，RNA ligase 1：
MQELFNNLMELCKDSQRKFFYSDDVSASGRTYRIFSYNYASYSDWLLPDALECRGIMFEMDGEKPVRIASRPMEKFFNLNENPFTMNIDLNDVDYILTKEDGSLVSTYLDGDEILFKSKGSIKSEQALMANGILMNINHHRLRDRLKELAEDGFTANFEFVAPTNRIVLAYQEMKIILLNVRENETGEYISYDDIYKDATLRPYLVERYEIDSPKWIEEAKNAENIEGYVAVMKDGSHFKIKSDWYVSLHSTKSSLDNPEKLFKTIIDGASDDLKAMYADDEYSYRKIEAFETTYLKYLDRALFLVLDCHNKHCGKDRKTYAMEAQGVAKGAGMDHLFGIIMSLYQGYDSQEKVMCEIEQNFLKNYKKFIPEGY。
连接酶L-20，SEQ ID NO：20，bacterial，RNA ligase 3：
MNSMNSDIPFDLIQERTGVPSSRLKVAFARGSLRLLESAGMQALLFKKPLGDLEAGTVIYLGDETEVIRGFPKIRRTLLLSPTIQEHFRDRVAVEEKMNGYNVRIACLSSGETVALTRGGHVCPFTTRKAQELLDLSEFFREHPDLVICGEMIGRDNPYVSQDYPEVGPLGFRVFDLREKNTNRPLPVEERRALLDSYGLPNVRLFGVYPIEEAASEVADIIRALGMAGREGVVMKDPSMEVPPLKYTSSQAHARELAYAFSYPFDFGRPFFFSRVIREGFQAYELDESDDETRERARRLGEAIIYPMLERIKSISAGEAAYEDTVIDVEDREAAEEFIRHLVRLGVSATLADYRDGRATIRRFYQSTTDRINNYLKGGLY。
连接酶L-21，SEQ ID NO：21，Klebsiella phage KP179，RNA ligase 1：
MLELYKNLMNLCESSEVAKFFYKDFTGPMDGKFRVFSYHYASYSEWLKPDALECRGIMFEMDGDTPIRIASRPMEKFFNLNENPLTMGIDISDVEYIMDKADGSLVSSYVDDGYLYLKSKTSLYSDQARQASALLNSEEYSSLHQVILELTLDGYTVNMEFVSPNNRVVLAYQEPQLFVLNVRNNTTGEYIKYDDLYANAKIRPYLINAYGISDPTTWVEGVRELEGVEGYIAVLNTGQRFKVKTEWYSALHHTKDSITSNERLFASVVSANSDDLRSLFAGDEYAIKKISAFEQAYLDYLGKSLELCQSFYDEYRGRARKDYAIAAQKATVNQRHLFGVIMNMYEGTVDVDKLLKDLERVFLKYWAGYVPKEYEKEIELSEE。
连接酶L-22，SEQ ID NO：22，Vibrio phage nt-1 rnlA，RNA ligase 2：
MNELYNNLMTLAESAEGKFFFADHLSPQGEKFRVFSYHIASYSDWLLPDALEARGIMFQLDENDEMIRIVSRPMEKFFNLGENPFTMDLDLTTTVQLMDKADGSLISTYLTGDNFALKSKTSIYSEQAVAANRYIKHVDNRDLWEFCDDCAAQNFTVNMEWCAPNNRIVLEYTEPKLIILNIRDNETGQYVSFDDIPIGALTRIKKWLVDEYDPMTAHVDDFVETLKAKKGIEGMILRLASGQSVKIKTTWYVDLHAQKDSVNSPKKLVTTILNKNHDDLYALFADDKPTIERIREFDDHVSKKVVESFHAVSQYYTKNRHLSRKDFAIAGQKALKPWEFGVAMIAYQNQTVEGVVTMLINAYLKRPELLIPEKYLSEV。
连接酶L-23，SEQ ID NO：23，Vibrio phage phi-ST2，RNA ligase 2：
MSFVKYTSLENSYRQAFVDKCDMLGVKEWVALEKIHGANFSFIVEFKPSTEEVPGEMSVTPAKRTSTIGANAMGDYDFYGCTSVVEAHIEKMQDISNWLFANDFIKNDETIIVYGELAGKGIQKEVNYGDKDFWAYDILCPETGEFLDWDVVLKACKFAGVKTTHEIARGTLDELLKIDPLFRSFHTPADVDSENVAEGFVVKQLKAEKRLHNGSRAILKVKNEKFKEKKNKQGKTPRAKVVLTEEQEKLHAAFSCYLTENRLRNVLSKIGKVEAKQFGMVSGLFVKDAKDEFERDERDEVAIPRDDWDVIKRSLVNVANEILRKNWLNIVDGTF。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1 RNA连接酶纯化制备
连接酶的蛋白经密码子优化为在大肠杆菌中重组表达的宿主菌，优化后的密码子经合成获得目的基因，将分别将目的基因以NcoI和XhoI为酶切位点构建至pET28a(+)表达载体上，在N端带有10个his标签。带有连接酶基因的重组质粒转化至克隆菌株DH5a中，在含50µg/mL的卡那霉素的LB+1.5%琼脂的培养基上进行过夜培养，获得单克隆。单克隆经测序确认序列。单克隆挑单至含50µg/mL的卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，离心菌体，弃掉上清获得菌泥。将获得的菌泥以质粒提取试剂盒提取质粒，获得的质粒转化BL21（DE3）表达菌株，在含50µg/mL的卡那霉素的LB+1.5%琼脂的培养基上进行过夜培养，获得单克隆。将获得的单克隆挑单至5mL含50µg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养16h，获得种子液。将种子液以0.1%的接种量接种至500mL的LB培养基中（含50µg/mL的卡那霉素），37℃培养至OD=0.6，加入0.1M的IPTG进行诱导，培养温度调至20℃，220rpm诱导16h，即获得了诱导表达的连接酶大肠杆菌菌液。将菌液8000rpm离心，弃上清后获得诱导表达的大肠杆菌菌泥。粗酶液中加入10mM咪唑，用0.22µm滤膜过滤后得到的酶液用镍柱进行纯化，经过脱盐换液后，用强阴离子柱进行二次纯化，得到的酶液经脱盐换液后储存与30%甘油中。
实施例2 RNA连接催化合成天然的tRNA
将底物1和底物2以200 µM终浓度溶于退火缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA），缓慢退火，退火程序为加热体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃，温浴10分钟。底物1和底物2的序列如表1所示。
将退火后的底物1和底物2加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物1和底物2的浓度为100µM，ATP浓度为0.4mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT（二硫苏糖醇）浓度为1 mM，连接酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，质谱鉴定产物生成，结果连接酶L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6、L-11、L-18、L-19、L-20、L-21、L-22、L-23的反应体系中均检测到的分子量为23571±2，理论分子量为23568±5。表明生成了tRNA产品。L-7、L-8、L-9的反应体系中未检测到产品分子量，表明未生成tRNA产品。对部分反应体系进行PAGE胶图检测，电泳图如图2所示，其中泳道1为利用连接酶L-9催化的反应体系，泳道2为利用连接酶L-1催化的反应体系，泳道3为利用连接酶L-2催化的反应体系，泳道4为未加入连接酶的阴性对照组，泳道5为利用连接酶L-3催化的反应体系，泳道6为利用连接酶L-11催化的反应体系，泳道7为利用连接酶L-7催化的反应体系，泳道8为利用连接酶L-8催化的反应体系。
发现由于片段长度较大，PAGE胶检测不能有效区分两个底物，底物1和底物2在同样的位置出峰，导致未加酶的反应体系中仅有一条核酸条带，即底物1和底物2的混合条带。同时发现L-7,8,9的反应体系中无新峰的生成，而检测到产品分子量的体系中有新峰的生成，表明试验方案的可行性。上述连接的缺刻位置在tRNA的颈环结构。
表1
。
在本申请中，P表示5'端核苷酸的5号位C原子上的磷酸基团。
实施例3 RNA连接催化合成非天然的tRNA
将底物3和底物4以200 µM终浓度溶于退火缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA），缓慢退火，退火程序为加热体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃，温浴10分钟。底物3和底物4的序列如表2所示。
将退火后的底物3和底物4加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物3和底物4的浓度为100µM，ATP浓度为0.4mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT浓度为1 mM，连接酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，质谱鉴定产物生成，结果连接酶L1、L2、L3、L4、L5、L6、L-11、L-18、L-19、L-20、L-21、L-22、L-23的反应体系中均检测到的分子量为24530±2，理论分子量为24526±5。表明生成了非天然tRNA产品。L-7、L-8、L-9的反应体系中未检测到产品分子量，表明未生成tRNA产品。对L-1的反应体系进行UPLC检测，发现有新峰的生成，表明试验方案的可行性，UPLC结果如图3所示。利用UPLC进行对反应体系进行检测，发现有出峰时间为25.822 min的新峰生成，结合质谱结果确认新峰为产品。上述连接的缺刻位置在tRNA的颈环结构。
表2
。
其中，A、C、G或U前的m表示对于该核糖核苷酸的2'甲氧基修饰，P表示5'端核苷酸的5号位C原子上的磷酸基团。
底物3和底物4的所有核糖核苷酸均具有2'甲氧基修饰。
实施例4 RNA连接催化合成非天然的tRNA
将底物5和底物6以200 µM终浓度溶于退火缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA），缓慢退火，退火程序为加热体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃，温浴10分钟。底物5和底物6的序列如表3所示。
将退火后的底物5和底物6加入到干净的试剂瓶中（，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物5和底物6的浓度为100µM，ATP浓度为0.4mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT浓度为1 mM，连接酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，质谱鉴定产物生成，结果连接酶L1、L2、L3、L4、L5、L6、L-11、L-18、L-19、L-20、L-21、L-22、L-23的反应体系中均检测到的分子量为24171±2，理论分子量为24166±5。表明生成了非天然tRNA产品。L-7、L-8、L-9的反应体系中未检测到产品分子量，表明未生成tRNA产品。对L-1的反应体系进行UPLC检测，发现有新峰的生成，表明试验方案的可行性，UPLC结果如图4所示。利用UPLC进行对反应体系进行检测，发现有出峰时间为20.512 min的新峰生成，结合质谱结果确认新峰为产品。上述连接的缺刻位置在tRNA的颈环结构。
表3
。
其中，A、C、G或U前的m表示对于该核糖核苷酸的2'甲氧基修饰，f表示对于该核糖核苷酸的2'氟修饰，r表示对于该核糖核苷酸的2'羟基修饰（即未修饰的核糖核苷酸），P表示5'端核苷酸的5号位C原子上的磷酸基团。
底物5的第1和3位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，2、36和37位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，4-35位为未修饰的核糖核苷酸。
底物6的第1、2、33和34位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，3-32、35-37位为未修饰的核糖核苷酸。
实施例5 RNA连接催化合成非天然的tRNA
将底物7和8以200µM终浓度溶于退火缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH7.5，1 mM EDTA），缓慢退火，退火程序为加热体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃，温浴10分钟。底物7和底物8的序列如表4所示。
将退火后的底物7和底物8加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物7和底物8的浓度为100µM，ATP浓度为0.4mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT浓度为1 mM，连接酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，质谱鉴定产物生成，结果连接酶L1、L2、L3、L4、L5、L6、L-11、L-18、L-19、L-20、L-21、L-22、L-23的反应体系中均检测到的分子量为26367±2，理论分子量为26364±5。表明生成了非天然tRNA产品。L-7、L-8、L-9的反应体系中未检测到产品分子量，表明未生成tRNA产品。上述连接的缺刻位置在tRNA的颈环结构。
表4
。
其中，A、C、G或U前的m表示对于该核糖核苷酸的2'甲氧基修饰，r表示对于该核糖核苷酸的2'羟基修饰（即未修饰的核糖核苷酸），s代表硫代磷酸酯修饰，P表示5'端核苷酸的5号位C原子上的磷酸基团。
底物7的所有核糖核苷酸上均具有2'甲氧基修饰，2-37位核糖核苷酸上具有硫代磷酸酯修饰。
底物8的第1-35位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，1-35位核糖核苷酸上具有硫代磷酸酯修饰，第36-38位核糖核苷酸为未修饰的核糖核苷酸。
实施例6 RNA连接催化合成天然的tRNA
将底物9和底物10以200µM终浓度溶于退火缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA），缓慢退火，退火程序为加热体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃，温浴10分钟。底物9和底物10的序列如表5所示。
将退火后的底物9和底物10加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物9和底物10的浓度为100µM，ATP浓度为0.4mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT浓度为1 mM，连接酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，质谱鉴定产物生成，结果连接酶L1、L2、L3、L4、L5、L6、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17的反应体系中均检测到的分子量为23560.3，理论分子量为23564±5。表明生成了天然tRNA产品。L-7、L-8、L-9的反应体系中未检测到产品分子量，表明未生成tRNA产品。对以上部分反应样品进行PAGE胶检测，电泳结果图如图5所示，发现有反应的体系中有新条带的生成，而质谱无产品响应的体系中无条带的生成，与未加酶的阴性对照反应条带一致。上述连接的缺刻位置在tRNA的互补区域。图5中泳道1为未加入连接酶的阴性对照组，泳道2为利用连接酶L-10催化的反应体系，泳道3为利用连接酶L-11催化的反应体系，泳道4为利用连接酶L-12催化的反应体系，泳道5为利用连接酶L-1催化的反应体系，泳道6为利用连接酶L-2催化的反应体系，泳道7为利用连接酶L-7催化的反应体系。
表5
。
P表示5'端核苷酸的5号位C原子上的磷酸基团。
实施例7 RNA连接催化合成非天然的tRNA
将底物11和底物12以200µM终浓度溶于退火缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA），缓慢退火，退火程序为加热体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃，温浴10分钟。底物11和底物12的序列如表6所示。
将退火后的底物11和底物12加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物11和底物12的浓度为100µM，ATP浓度为0.4mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT浓度为1 mM，连接酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，质谱鉴定产物生成，结果连接酶L1、L2、L3、L4、L5、L6、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17的反应体系中均检测到的分子量为 24601.6，理论分子量为 24606.2±5。表明生成了非天然tRNA产品。L-7、L-8、L-9的反应体系中未检测到产品分子量，表明未生成tRNA产品。对L1的反应体系用UPLC检测产品的生成，结果显示有新峰的生成，表明技术是可行的，UPLC结果如图6所示。利用UPLC进行对反应体系进行检测，发现有出峰时间为21.045 min的新峰生成，结合质谱结果确认新峰为产品。上述连接的缺刻位置在tRNA的互补区域。
表6
。
其中，A、C、G或U前的m表示对于该核糖核苷酸的2'甲氧基修饰，P表示5'端核苷酸的5号位C原子上的磷酸基团。
底物11和底物12的所有核糖核苷酸上均具有2'甲氧基修饰。
实施例8 RNA连接催化合成非天然的tRNA
尝试更多的片段进行合成tRNA，将底物13、14和底物15以300µM终浓度溶于退火缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA），缓慢退火，退火程序为加热体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃，温浴10分钟。底物13、14和底物15的序列如表7所示。
将退火后的底物13、14和底物15加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物13、14和底物15的浓度为100µM，ATP浓度为0.4mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT浓度为1 mM，连接酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，质谱鉴定产物生成，结果连接酶L1、L2、L4的反应体系中均检测到的分子量为24601.6，理论分子量为24606.2±5。表明生成了非天然tRNA产品。上述连接的缺刻位置在tRNA的颈环部结构。
表7
。
其中，A、C、G或U前的m表示对于该核糖核苷酸的2'甲氧基修饰，P表示5'端核苷酸的5号位C原子上的磷酸基团。
底物13、底物14和底物15的所有核糖核苷酸上均具有2'甲氧基修饰。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明发现了部分RNA连接酶能够实现对于含有非天然核苷酸的非天然tRNA的生物合成，能够用于tRNA、乃至非天然tRNA的生物合成，利用该生物合成方法，能够高效率地制备tRNA，产物的产率和纯度高，且能够制备现有技术中难以合成的非天然tRNA。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种tRNA的生物合成方法，其特征在于，所述生物合成方法包括：
利用RNA连接酶将不同底物的3'端和5'端连接形成磷酸二酯键，形成所述tRNA，所述底物的数量≥2；
所述底物中包括一个或/多个非天然核苷酸，所述tRNA为非天然tRNA；
所述生物合成方法包括：不同所述底物以碱基互补形成的氢键连接，不同所述底物的头尾碱基之间未互相连接；利用所述RNA连接酶将所述底物之间以所述磷酸二酯键连接，形成所述tRNA；
所述非天然tRNA包括颈环结构和互补区域，所述底物的连接位点位于所述颈环结构和/或所述互补区域；
所述底物中的非天然核苷酸的数量≥2；
所述底物的5'端和/或3'端的核苷酸为所述非天然核苷酸；
所述RNA连接酶为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的RNA连接酶中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物的3'端为羟基。
3.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物包括第一底物和其他底物，所述第一底物的5'端形成所述非天然tRNA的5'端，所述其他底物的5'端为磷酸。
4.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物由所述非天然核苷酸组成。
5.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物的数量为2-3个；
所述底物的长度为15-40 nt。
6.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述生物合成方法包括：底物退火和底物连接；
所述底物退火包括：将所述底物溶于退火缓冲液中形成退火体系，将所述退火体系根据退火程序进行退火，所述退火程序包括：加热所述退火体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃后温浴10分钟，得到退火产物；
所述底物连接包括：将所述退火产物、所述RNA连接酶和ATP配置为连接体系，进行所述底物连接。
7.根据权利要求6所述的生物合成方法，其特征在于，
所述退火缓冲液包括：1 mM ~10 M NaCl、1 mM~10 M Tris-HCl，pH 4~10以及0.1 mM ~10 M EDTA；
所述底物连接的反应温度为16℃，反应时间为16 h；
所述退火产物的浓度为10µM~2mM，所述RNA连接酶的浓度为0.2 mg/mL，所述ATP与所述退火产物的摩尔比为1~10:1。
8.根据权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，
所述连接体系还包括MgCl2和二硫苏糖醇，其中，
MgCl2浓度为0.1 mM ~200 M，二硫苏糖醇浓度为0.1 mM ~10 M。
9.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述非天然核苷酸包括：具有如下一种或多种修饰的核糖核苷酸：核糖2'位修饰、核糖骨架修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰；
所述核糖2'位修饰包括2'-甲氧基修饰、2'-氟修饰、2'-甲氧乙基修饰、2'-FANA修饰、锁核酸修饰或己糖醇核酸修饰；
所述核糖骨架修饰包括将核苷酸中的核糖替换为ribuloNA、TNA、tPhoNA或dXNA；
所述碱基修饰包括脱氮腺嘌呤C7修饰、脱氮鸟苷C7修饰、胞嘧啶C5修饰或尿苷C5修饰；
所述磷酸骨架修饰包括PS修饰。
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