CN110358769A - 经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。所述miRNA类似物为在模拟miR‑15a序列的DNA单链的两端各有3个核苷酸进行了锁核酸修饰，并且位于两个核苷酸之间的磷酸均进行了硫代磷酸酯修饰。所述模拟miR‑15a的DNA单链序列为SEQ ID:No 1。经锁核酸修饰的LNA‑15a可明显抑制肿瘤增殖，促进肿瘤细胞凋亡。体内实验还显示LNA‑15a可以作为理想的治疗策略，在体内较好的模拟miR‑15a的抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡的功能；而且LNA‑15a还具有增强BTZ抗骨髓瘤的作用。本发明为临床应用miR‑15a类似物进行抗肿瘤治疗奠定了理论基础。

Description

经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物及其在制备抗肿瘤 药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是中老年人群常见的血液系统肿瘤，大约占所有恶性肿瘤的1％，血液系统恶性肿瘤的10％。随着我国快速进入老龄化，其发病率近年呈明显上升趋势。目前MM仍然是一种不可治愈的恶性肿瘤，几乎所有的MM均会复发并最终对治疗无效。
MicroRNA是一类小非编码RNA，一般由18-24个核苷酸组成。它可以与靶RNA分子的3’端的非编码区(3’UTR)结合并产生转录后抑制。越来越多的研究显示，肿瘤细胞存在microRNA表达异常，并与肿瘤的发生发展关系密切。最近的研究显示逆转肿瘤细胞microRNA的异常表达可发挥抗肿瘤作用，microRNA成为肿瘤治疗中引人注目的工具和靶点。
目前，microRNA的类似物以及拮抗物作为一种新兴的治疗方法，受到越来越多研究者的关注。现在，已有许多microRNA类似物或拮抗物进入临床试验研究。然而，目前microRNA类似物仅局限于小分子RNA双链，虽有少数microRNA类似物进入临床实验，结果并不理想。如miR-16类似物已完成Ⅰ期临床实验，22例可评估的进展期恶性胸膜间皮瘤患者，仅有1例达到治疗目标。反义寡核苷酸(ASO)具有与microRNA相似的核苷酸数量。根据其化学结构的不同主要分为单链DNA寡核苷酸(ODNs)和双链小分子RNA两大类。
发明内容
本发明提供一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，以填补该领域的空白。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物，所述miRNA类似物为miR-15a的DNA单链类似物。
进一步的，所述miRNA类似物为经锁核酸及硫代磷酸修饰的miR-15a的DNA单链类似物。
进一步的，所述miR-15a的DNA单链序列为SEQ ID:No 1，具体序列为：TAGCAGCACATAATGGTTTGTG。
进一步的，所述经锁核酸及硫代磷酸修饰的miR-15a的DNA单链的修饰方法为：在miR-15a的DNA单链序列的两端各有3个核苷酸进行了锁核酸修饰，并且位于两个核苷酸之间的磷酸均进行了硫代磷酸酯修饰。
一种上述经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，miRNA类似物具有明确的抗肿瘤作用，抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡。
进一步的，miRNA类似物能够增强硼替佐米的抗骨髓瘤作用。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明miR-15a的DNA单链类似物OMM-15a对肿瘤细胞增殖及凋亡没有明显影响。而经锁核酸修饰的LNA-15a可明显抑制肿瘤增殖，促进肿瘤细胞凋亡。体内实验还显示LNA-15a可以作为理想的治疗策略，在体内较好的模拟miR-15a的抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡的功能；而且LNA-15a还具有增强BTZ抗骨髓瘤的作用。本发明为临床应用miR-15a类似物进行抗肿瘤治疗奠定了理论基础，在抗击肿瘤方面具有较大潜能和应用价值。
附图说明
图1是本发明OMM-15a抗肿瘤活性实验图；
图2是本发明OMM-15a用3个浓度梯度(50nM、75nM和100nM)转染24h后，流式检测细胞凋亡情况图；
图3是本发明LNA-15a抑抗肿瘤活性实验图；
图4是本发明BTZ联合LNA-15a抗骨髓瘤实验结果图；
图5是本发明LNA-15a抗肿瘤活性的体内实验图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明。
1.材料与方法
1.1.细胞培养
人骨髓瘤细胞系ARP1和OCI-My5以及人乳腺癌细胞系MCF7(MCF7细胞株：购于ATCC；ARP1细胞株：美国爱荷华大学；OCI-MY5细胞株：美国爱荷华大学)。ARP1和OCI-My5用RPMI-1640完全培养基(HyCloneTM,Utah,USA)培养,MCF7用DMEM(高糖)完全培养基(HyCloneTM,Utah,USA)培养。完全培养基均含有10％胎牛血清(LifeTechnologies)和1％双抗(Life Technologies)。所有的细胞系均在37℃，含5％二氧化碳条件下培养。
1.2.寡脱氧核苷酸及锁核酸修饰
MiR-15a基因位于人类13号染色体。miR-15a的ODN命名为OMM-15a，通过LNA修饰对其进行改进,命名为LNA-15a。OMM-15a和LNA-15a均由擎科生物合成。OMM-15a序列为(5’→3’)：TAGCAGCACATAATGGTTTGTG。LNA-15a为锁核酸修饰后的OMM-15a，具体修饰方法为OMM-15a两端各有3个核苷酸进行了锁核酸修饰，并且位于两个核苷酸之间的磷酸均进行了硫代磷酸酯修饰。
1.3.细胞转染
OMM-15a或LNA-15a转染肿瘤细胞：所有细胞系均按Lipofectamine的操作说明进行转染。OMM-15a或LNA-15a转染浓度均为25nM，转染后24h、24h、48h及72h收集细胞，进行细胞增殖、凋亡等检测。
荧光素酶质粒的转染：购自广州复能基因公司。该质粒除具有荧光素酶基因以外，还有绿荧光蛋白基因及嘌呤霉素耐药基因。采用慢病毒包装试剂盒进行病毒包装(Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit，广州复能基因公司)，按说明书进行操作。在病毒转染细胞前，先将ARP1等肿瘤细胞接种于6孔板，每孔5×105细胞，1ml新鲜完全培养基。收集病毒上清液，1500rpm离心10min，再经0.45μm的膜过滤后获得用于后续细胞感染的病毒原液。将新鲜的病毒液加入已接种细胞的6孔板内，每孔给4mL病毒液，最后每孔加入polybrene 40μg，使其终浓度为8μg/mL。20小时后，用无polybrene的新鲜完全培养基给细胞换液。
1.4.凋亡分析
分别于转染前，以及转染后24h、48h及72h检测细胞凋亡。收集转染后的细胞，冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，然后用PE-annexin V及7AAD(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)标记细胞，室温孵育15min后，进行流式分析。凋亡比例通过FlowJo Software V10.0(Tree Star,Ashland,OR,USA)进行分析。
1.5.细胞计数
接种于6孔板的细胞分别在4个时间点(转染0h、24h、48h及72h)进行细胞计数，同时计数全部细胞及死细胞。每次计数均重复3次。
1.6.qRT-PCR
采用Trizol法提取细胞总RNA，采用罗氏逆转录试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,USA)进行逆转录。逆转录过程为：55℃1h，85℃10min。逆转录产物cDNA经5倍稀释后，在QuantStudioTM 5Real-Time PCR Instrument(Applied Biosystems，Singapore)进行扩增，检测PHF19，BCL2and VEGF-A等基因表达水平(95℃30s，40个循环的95℃5s和60℃30s)。所得数据用ΔΔCt法进行分析。
表1各基因引物序列
Primer name Sequence(5’-3’)
GAPFH-F ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC
GAPDH-R AGTGAGCTTCCCGTTCAGCTC
BCL2-F GTGTGTGGAGAGCGTCAACC
BCL2-R GTTTGGGGCAGGCATGTTGAC
VEGF-A-F AGGGCAGAATCATCACGAAGT
VEGF-A-R AGGGTCTCGATTGGATGGCA
PHF19-F GTTTGGAGACCGGTTTTACCT
PHF19-R CTTGCTCTGTACCCCCAGATTATA
1.7.Western Blot
用RIPA(强)裂解液裂解细胞，裂解产物用Sure PAGE，Bis-Tris 4-20％预制胶(GenScript USA Inc，Piscataway，USA)进行电泳，然后转至PVDF膜(AmershamTMHybondTM，GE Healthcare Life science，Germany)。转膜后，用5％脱脂牛奶封闭1小时，然后一抗孵育过夜(anti-PHF19，-BCL2，-Cleaved Caspase-3(Asp 175)，-Caspase-3，-Cleaved PARP(Asp 214)，-PARP，β-Actin and-GAPDH(Cell Signaling Technology，Danvers，MA))。蛋白条带用ChemiDocTM Imaging System(BIO-RAD，Singapore)进行显影。
1.8.活体肿瘤异种移植模型
为了体内评估OMM-15a、LNA-15a抗肿瘤活性，在NOD/SCID小鼠右背部皮下注射肿瘤细胞(1.5×106/只ARP1-Luc+/GFP+)，注射肿瘤细胞后1周开始给予OMM-15a、LNA-15a等药物治疗。共有3组小鼠，每组3只。PBS组：PBS 100μL/只，皮下注射，每周1次，用药3次；OMM-15a组：OMM-15a 10mg/kg，皮下注射，每周1次，用药3次；LNA-15a组：LNA-15a 10mg/kg，皮下注射，每周1次，用药3次。用药1周后每周对小鼠进行活体成像观察体内肿瘤细胞增殖状态，共3次。最后一次用药1周后结束实验。用颈椎脱位法处死小鼠，剥离肿瘤，并记录肿瘤体积。肿瘤体积计算方法：(长×宽2)/2。活体实验的所有操作均已获得中国医学科学院血液学研究所动物伦理与使用委员会(IACUC)的批准。
1.9.活体成像
先用三溴乙醇350mg/kg腹腔注射麻醉小鼠。麻醉后，用D-荧光素75mg/kg腹腔注射。注射10min后用IVIS LuminaⅡ系统(Caliper Life Sciences,Hopkinton,USA)进行活体成像。曝光时间30s。(三溴乙醇用叔戊醇溶解)。
2.实验结果
2.1.OMM-15a无明显抗肿瘤活性
细胞计数及细胞凋亡分析结果显示：转染OMM-15a后24h、48h及72h，细胞增殖及凋亡均无明显变化(图1A和B)。由于天然状态的寡脱氧核苷酸容易被核酸酶降解，稳定性较差，从而限制了OMM-15a的抗肿瘤功能。OMM-15a 25nM转染细胞后，在mRNA水平，只能部分下调PHF19和BCL2这2个基因的表达，VEGF-A的表达在3个细胞中均不能被抑制(图1C)；在蛋白水平，PHF19的表达仅在ARP1细胞系被抑制，而BCL2的表达在3个细胞系中均无明显抑制(图1D)。
图1.OMM-15a抗肿瘤活性实验。(A)OMM-15a(25nM)转染前及转染后24h、48h及72h，肿瘤细胞(ARP1、OCI-My5、MCF7)增殖，细胞绝对计数。(B)OMM-15a转染细胞及空白对照细胞，在24h、48h及72h时凋亡分析对比结果。(C)OMM-15a转染前及转染后24h、48h及72h后，qRT-PCR检测其靶基因表达水平变化。(D)OMM-15a转染0h、24h、48h及72h后，肿瘤细胞中靶基因蛋白表达变化。
2.2.增加OMM-15a浓度并未明显增加其抗肿瘤活性
为排除OMM-15a抗肿瘤活性不明显是因为浓度偏低引起的，故将OMM-15a的浓度倍增以后，再次进行凋亡检测。结果显示：单纯增加OMM-15a作用浓度，细胞凋亡并未明显增加(图2)。
2.3.LNA-15a具有明显的抗肿瘤活性
对OMM-15a进行了锁核酸修饰和硫代磷酸酯修饰后，采用相同剂量感染肿瘤细胞，细胞计数结果显示：LNA-15a转染后，肿瘤细胞增殖均明显受抑制，凋亡明显增加，其中以贴壁生长的乳腺癌细胞系MCF7最为显著(图3A)。凋亡检测也证实增加细胞LNA-15a的表达，肿瘤细胞凋亡增加(图3B)，凋亡相关信号通路关键蛋白，如caspase3和PARP的剪切体明显增加，提示凋亡通路被激活(图3B)。LNA-15a促进细胞凋亡的作用存在明显的细胞特异性：ARP1和OCI-My5在转染后24h细胞凋亡最为明显，而MCF7在转染72h最为明显。对于靶基因的抑制作用，结果显示LNA-15a可明显抑制PHF19、BCL2以及VEGF-A的表达水平。在蛋白水平，PHF19及BCL2的表达在3个细胞系中均明显被抑制，而且在MCF7细胞系中，有随时间延长而逐渐增强的趋势。在ARP1细胞系中，其对BCL2及VEGF-A的抑制明显增强；在OCI-My5细胞系中，其对PHF19及VEGF-A的抑制明显增强；在MCF7细胞系，其对PFH19及BCL2的抑制增强(图3C&CD)。
图3.LNA-15a抑制肿瘤增殖，促进凋亡。(A)LNA-15a转染不同时间后，细胞计数及细胞活力分析肿瘤细胞增殖情况。(B)LNA-15a转染细胞对细胞凋亡的影响。(C&D)LNA-15a(25nM)转染不同时间点，对其靶基因表达影响。
2.4.LNA-15a增强BTZ的抗骨髓瘤作用
蛋白酶体抑制剂硼替佐米是骨髓瘤临床治疗的常用药物，具有理想的抗MM效应，然而较大的毒副作用以及在治疗过程中形成的耐药性亟待解决。硼替佐米(BTZ)购自西安杨森公司。本发明对比了BTZ单药(10nM)及BTZ(10nM)联合LNA-15a(25nM)的抗骨髓瘤效应，细胞凋亡情况。结果显示：联合LNA-15a后，细胞的凋亡显著增加，尤其在OCI-My5细胞系(图4A&4B)。用CompuSyn软件分析LNA-15a和BTZ之间是否有协同作用，结果显示：在ARP1细胞系，两者无协同作用。不过在OCI-My5细胞系，两者有很好的协同作用，以LNA-15a 25nM和BTZ 10nM联合用药的协同作用最强(图4C和D)。
图4.LNA-15a增强BTZ的抗骨髓瘤作用。(A)ARP1及OCI-My5在经BTZ 10nM单药或BTZ 10nM&LNA-15a 25nM处理24h后，凋亡分析结果。(B)ARP1及OCI-My5在经BTZ 10nM单药及BTZ 10nM&LNA-15a 25nM处理24h后，对3次凋亡结果的统计分析。(C)OCI-My5细胞在BTZ及LNA-15a不同浓度组合下的凋亡分析结果及统计分析结果。(D)用Compusyn软件分析的BZT和LNA-15a在OCI-My5中的协同结果。
2.5.LNA-15a抗肿瘤活性的体内实验
为进一步验证LNA-15a的抗肿瘤活性，本发明采用MM皮下成瘤动物模型。皮下注射肿瘤细胞，7天后给予LNA-15a进行皮下注射治疗。结果显示：LNA-15a能够明显抑制肿瘤的生长而OMM-15a组肿瘤抑制不明显(图5A&5B)。qRT-PCR结果显示：miR-15a的靶基因PHF19、BCL2以及VEGF-A在LNA-15a组小鼠肿瘤组织中均被抑制。而在OMM-15a组，除BCL2被明显抑制外，PHF19和VEGF-A抑制不明显(图5C)。Western blot结果显示，LNA-15a组PHF19以及BCL2的蛋白表达也均被抑制，而在OMM-15a组，除1号鼠瘤组织仅BCL2明显抑制外，其余小鼠瘤组织的这2个蛋白的表达抑制均不明显。
图5.LNA-15a抗肿瘤活性的体内实验。(A)PBS组、OMM-15a组以及LNA-15a组小鼠在皮下成瘤后2周、3周及4周的活体成像结果。(B)PBS组、OMM-15a组以及LNA-15a组小鼠在实验结束后，小鼠体内分离得到的肿瘤组织及其体积。(C)用qRT-PCR分析OMM-15a组以及LNA-15a组瘤组织细胞PHF19、BCL2及VEGF-A相对表达量。(D)OMM-15a组以及LNA-15a组瘤组织细胞PHF19及BCL2的Western blot结果，以GAPDH为内参。
本发明合成了2种形式ODN，均为miR-15a的DNA单链类似物。一种是未经任何修饰的ODN(OMM-15a)，以及经锁核酸(LNA)及硫代磷酸修饰的OMM-15a(LNA-15a)。肿瘤细胞系ARP1,OCI-My5和MCF7经OMM-15a或LNA-15a转染，分别在24h，48h及72h后收集细胞，细胞计数以及细胞凋亡检测，体外观察对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响；采用实时定量PCR(qRT-PCR)、Western blot(WB)分别从mRNA，蛋白水平探讨对miR-15a调控靶基因(PHF19、BCL2和VEGF-A)的影响；并对荷瘤小鼠进行治疗，观察其对肿瘤体内治疗的作用。
结果显示miR-15a单链类似物OMM-15a对肿瘤细胞增殖及凋亡没有明显影响。即使增加OMM-15a的浓度，也不能抑制肿瘤增殖。经过LNA修饰以后，LNA-15a表现出明确的抗肿瘤作用，细胞增殖明显受抑，细胞凋亡明显增加。并且LNA-15a还可增加骨髓瘤常用临床药物硼替佐米(万珂)的抗肿瘤效应。本发明比较了硼替佐米(BTZ)单药及BTZ联合LNA-15a对MM细胞凋亡的影响，显示LNA-15a可以明显增强BTZ的治疗效果。机制研究发现LNA-15a可在mRNA及蛋白水平显著下调其靶基因PHF19(促增殖)、BCL-2(抗凋亡)的表达水平。

Claims (7)

1.一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物，其特征在于，所述miRNA类似物为miR-15a的DNA单链类似物。
2.根据权利要求1所述的一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物，其特征在于，所述miRNA类似物为经锁核酸及硫代磷酸修饰的miR-15a的DNA单链类似物。
3.根据权利要求2所述的一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物，其特征在于，所述miR-15a的DNA单链序列为SEQ ID:No 1。
4.根据权利要求3所述的一种经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物，其特征在于，所述经锁核酸及硫代磷酸修饰的miR-15a的DNA单链的修饰方法为：在miR-15a的DNA单链序列的两端各有3个核苷酸进行了锁核酸修饰，并且位于两个核苷酸之间的磷酸均进行了硫代磷酸酯修饰。
5.一种权利要求1-4所述的经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：miRNA类似物具有明确的抗肿瘤作用，抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡。
7.根据权利要求5所述的经锁核酸和硫代磷酸修饰的miRNA类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：miRNA类似物能够增强硼替佐米的抗骨髓瘤作用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107236735A (zh) * 2012-06-21 2017-10-10 米拉根医疗股份有限公司 包含锁核酸基序的基于寡核苷酸的抑制剂

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