CN116004623B - 一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用。shRNA序列包括shLRP1‑1序列和/或shLRP1‑2序列，shLRP1‑1序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，shLRP1‑2序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及用于表达上述shRNA序列慢病毒表达载体。本发明基于LRP1基因的mRNA序列设计并合成shRNA分子，可通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人胃癌细胞，与LRP1基因的mRNA结合，高效地干扰其转录和翻译，降低LRP1基因在胃癌细胞中的表达，抑制胃癌细胞的增殖。

Description

一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用。

背景技术

目前，胃癌仍是我国最主要的癌症病种之一。根据全球最新癌症负担数据(Globocan 2020)，胃癌发病率居恶性肿瘤第五位，死亡率居第四位。近五年全球胃癌平均年发病例数为180.6万例，我国为68.9万例(38.2％)，疾病负担严重，是癌症防治的重点。

目前有关数据表明，胃癌早期患者通过系统的治疗，康复率很高，而胃癌中晚期患者即便经过系统的治疗，死亡率也依然很高。近年来有学者通过相关研究发现，对胃癌患者进行胃镜活检检查与病理结合诊断，能够快速且准确的帮助患者提高临床诊断率，并快速的确定治疗方案进行治疗，利于患者的身体快速恢复。由于胃癌有广泛的侵入性，能较早扩散到转移部位。目前应用于临床治疗的生物抑制剂较少，且诊断特异性并不理想。因此，新的靶向标志物的发现与应用对于胃癌诊断尤为重要。

低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(LRP1)作为一种内吞和细胞信号转导的受体蛋白，可与100多种不同的配体结合，通过与不同的细胞信号适配器和支架蛋白结合激活细胞信号转导。研究证实LRP1在不同肿瘤的生长和进展的过程中起调控作用，如SteffenE.Storck等人研究发现，LRP1通过促进血脑屏障(BBB)毛细血管中淀粉样蛋白-β(Aβ)的积累，驱动阿尔茨海默病(AD)的病理进程；Camille Boulagnon-Rombi等人通过分析LRP1突变、miRNA表达和甲基化在LRP1表达谱中的作用，确定LRP1表达与结肠癌的临床特征和转归相关。然而LRP1在胃癌中的研究甚少，因此探究其发挥的作用对胃癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是一种依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)。RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与shRNA慢病毒质粒表达载体。短发夹核糖核酸(shRNA)可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。RNAi具有特异性和高效性。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。

shRNA首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293T细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shRNA的沉默作用。在内切核酸酶的作用下，shRNA被裂解成核苷酸链，由正义链和反义链组成。反义链与特定的酶结合形成由RNA诱导的沉默复合物RISC(RISC复合物中含siRNA、核酸外切酶、核酸内切酶以及解旋酶等元件)，核苷酸双链会被活化后的RISC解聚成为两条单链，随后反义链识别并结合与其同源的靶mRNA，在反义链的引导下活化型RISC会切割靶mRNA的特定位置，同时切割的mRNA会被RISC复合物中的酶特异性降解，从而阻断mRNA的遗传信息传递。

针对癌症细胞相关基因设计的靶向药物已逐渐应用于临床。但目前还未有利用shRNA技术特异性针对胃癌细胞LRP1基因设计的shRNA，鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用。

本发明提供了一种用于靶向性沉默LRP1基因表达的shRNA序列，shRNA序列包括shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列，shLRP1-1序列的靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，shLRP1-2序列的靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

可选的，制备shLRP1-1序列的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQID NO.4所示。

可选的，制备shLRP1-2序列的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQID NO.6所示。

本发明提供了一种包含上述shRNA序列的慢病毒表达载体。

可选的，慢病毒表达载体由shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列克隆到慢病毒表达载体pLKO.1中得到。

本发明提供了上述慢病毒表达载体的构建方法，制备包括如下步骤：

S1、采用引物退火合成shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列；

S2、将合成的shLRP1-1和/或shLRP1-2序列克隆到慢病毒表达载体中。

本发明提供了上述shRNA序列在制备抑制LRP1基因表达的药物方面的应用。

本发明提供了上述shRNA序列在制备用于治疗/预防胃癌相关的药物中的应用。

本发明提供了一种用于治疗胃癌的药物，包含上述靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列。

本发明提供了一种被靶向沉默的LRP1基因序列，其靶点序列如SEQ IDNO.1或SEQID NO.2所示。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明基于LRP1基因的mRNA序列设计并合成shRNA分子，并构建shRNA的寡核苷酸序列，这两对shRNA序列通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人胃癌细胞，能够与LRP1基因的mRNA结合，高效地干扰其转录和翻译，降低LRP1基因在胃癌细胞中的表达，抑制胃癌细胞的增殖。本发明设计的shRNA序列限制抑制胃癌细胞AGS的生长速率，对胃癌的治疗具有十分重要的意义。为以LRP1抑制剂为核心的胃癌治疗新策略提供理论基础，有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的抗癌基因药物，尤其针对胃癌基因药物的研发，具有巨大的社会和经济效益。

附图说明

图1是shLRP1对LRP1基因的表达水平Western blotting图；

图2和图3是shLRP1对AGS细胞增殖的影响图，NC组为对照组，shLRP1-1和shLRP1-2组是实验组。

图4是实施例5中对比例shRNA序列对人胃癌细胞AGS增殖的影响图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用。

本发明实施例提供了一种用于靶向性沉默LRP1基因表达的shRNA序列，本发明实施例的shRNA序列包括shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列，shLRP1-1序列的靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，shLRP1-2序列的靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。经筛选实验发现，该shRNA可有效抑制胃癌细胞的增殖。

可选的，制备shLRP1-1序列的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQID NO.4所示；制备shLRP1-2序列的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明实施例提供了一种包含上述shRNA序列的慢病毒表达载体。具体的，慢病毒表达载体由shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列克隆到慢病毒表达载体中得到。慢病毒表达载体可以选自：pLKO.1。

本发明提供了上述慢病毒表达载体的构建方法，制备包括如下步骤：

S1、采用引物退火合成shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列；

S2、将合成的shLRP1-1和/或shLRP1-2序列克隆到慢病毒表达载体中。

该构建方法还包括测序验证的步骤，具体包括：将构建得到的表达靶向性沉默LRP1的shRNA序列的慢病毒表达载体转入大肠杆菌感受态细胞，接种到含Amp的LB液体培养基过夜，得到细菌沉淀后加入内切核糖核酸酶进行酶切，将酶切的阳性质粒进行测序验证。

本发明提供了上述shRNA序列在制备抑制LRP1基因表达的药物方面的应用。

本发明提供了上述shRNA序列在制备用于治疗/预防胃癌相关的药物中的应用，即可以作为用作治疗/预防胃癌的药物或制剂。

本发明提供了一种用于治疗胃癌的药物，包含上述靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列。还可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

本发明提供了一种被靶向沉默的LRP1基因序列，其靶点序列如SEQ IDNO.1或SEQID NO.2所示。

以下实施例中，所用材料及试剂部分来源如下：shLRP1-1和shLRP1-2序列由亦欣生物科技(上海)有限公司合成，质粒pLKO.1、psPAX2和pMD2.G购于优宝生物，转染试剂Lipofectamine 2000购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。

实施例1：慢病毒载体的构建

根据GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)获得人源LRP1基因(NM_058243)的mRNA序列，根据shRNA设计原理，设计了针对人源LRP1基因的shRNA，其靶点序列分别如表1所示，用于沉默人源LRP1基因。

shRNA的靶位点核苷酸序列如表1所示，制备shRNA的正义链和反义链序列如表1所示。

表1

将上述4条双链寡核苷酸短片段分别连接到双酶切的慢病毒载体pLKO.1载体上。将连接产物通过将含有目的质粒的大肠杆菌接种到30～50mL的含Amp的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，200rpm/min，孵育12～16小时；将培养得到的菌液由摇床中取出，在室温条件下，3500～5000g离心10min；吸走上清，并将容器壁上多余的培养基弃除，得到细菌沉淀。向沉淀中加入2.5mL Solution I(已添加RNase A)，通过涡旋震荡将细菌沉淀重悬；收集菌体提取质粒，酶切验证质粒，将酶切的阳性质粒送于华大基因测序验证。测序显示构建成功的慢病毒质粒用于后续实验。

通过上述方法，分别构建得到含有目的质粒的慢病毒载体pLKO.1-shLRP1-1#和pLKO.1-shLRP1-2#。

实施例2：细胞慢病毒的制备及慢病毒转染细胞

参照Lipofectamine 2000试剂说明书包装慢病毒。

分别以实施例1所制备的两种慢病毒载体转染细胞作为实验组，同时以pLKO.1空载体转染细胞作为对照组。lipofectmin2000将核心质粒(pLKO.1-shLRP1-1#、pLKO.1-shLRP1-2#或pLKO.1)与包装质粒(psPAX2和pMD2.G)转入293T细胞中，制备并收集病毒，之后用含目标shLRP1序列的慢病毒感染人胃癌细胞AGS，用嘌呤霉素(puromycin)筛选出具有抗性的细胞用于实验。

在293T细胞(要求细胞密度90％左右)中进行慢病毒包装。在150μL无血清培养液中加入Lipofectamine-2000转染试剂，静置5min；将包装质粒psPAX2和pMD2.G按3：1的比例共1.5μg和1.5μg的核心质粒共同加入150μL无血清培养液中；

将转染混合液加入35mm的细胞培养皿的细胞培养液中，混匀。待6～8h后，换成2mL新鲜DMEM完全培养基(10％FBS)；36～48h后收集病毒，8000g离心5min，收集全部的上清液，经0.45μm滤膜过滤后将病毒上清液转移至新的收集管中，-20℃保存。

用慢病毒包装得到的病毒上清感染AGS细胞(细胞接种密度控制在50％左右)。根据病毒滴度确定需要加入病毒的量，同时加10μg/μL的polybrene(1:1000稀释)，通过电荷作用加快病毒进入细胞。12h后进行换液处理，24～48h之后病毒在细胞中表达。感染48h后，更换含有嘌呤霉素(1μg/mL)的新鲜培养基。每隔2天，换液1次，约7天后选取阳性克隆进行检测。

实施例3：Western blot检测LRP1基因在AGS细胞中的蛋白表达水平

收集实施例2获得的病毒感染的AGS细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，将蛋白变性之后跑胶转膜，5％脱脂牛奶封闭膜2小时之后，使用LRP1抗体和GAPDH抗体过夜孵育，然后用连有辣根过氧化物酶的山羊抗鼠的抗体室温孵育1小时，抗体孵育过后，用TBS-T溶液室温洗膜3次，每次5min后，通过BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)于ChemiDoc^TM XRS+(Bio-Rad)成像系统进行显影。Western blotting检测不同组细胞中目的蛋白LRP1的表达情况。实验结果如图1所示。

图1是shLRP1对LRP1基因的表达水平Western blotting图；图中，GAPDH为内参蛋白，NC为用pLKO.1空载体感染的对照组，shLRP1-1和shLRP1-2为分别用pLKO.1-shLRP1-1#和pLKO.1-shLRP1-2#感染的实验组。

由图1可见，与对照组NC相比，shLRP1-1#和shLRP1-2#均能显著沉默AGS细胞中LRP1的表达，对AGS细胞中LRP1的表达有显著的沉默作用。

实施例4：EdU增殖实验检测shLRP1对AGS细胞增殖的影响

参照BeyoClick^TM EdU-488细胞增殖检测试剂盒说明书对NC、shLRP1-1和shLRP1-2组细胞增殖进行检测。结果如图2和图3所示：shLRP1-1和shLRP1-2组均能显著抑制胃癌细胞AGS的增殖。NC组为对照组，shLRP1-1和shLRP1-2组是实验组。

实施例5：

采用如下三组siRNA序列：

siLRP1-1正义链：ccaggucagaugccauuuatt(SEQ ID NO.7)；

siLRP1-1反义链：uaaauggcaucugaccugaccuggtt(SEQ ID NO.8)。

siLRP1-2正义链：ccaccugcaugaguuuaatt(SEQ ID NO.9)；

siLRP1-2反义链：uuaaacucauagcagguggtt(SEQ ID NO.10)。

siLRP1-3正义链：ggccguggauuaucacaautt(SEQ ID NO.11)；

siLRP1-3反义链：auugugauaauccacggcctt(SEQ ID NO.12)。

按照实施例3的方法进行Western blot检测，实验结果如图4所示，上述三组siRNA序列无法有效沉默AGS细胞中LRP1的表达。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种用于靶向性沉默LRP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括shLRP1-1和/或shLRP1-2，

所述shLRP1-1的靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述shLRP1-2的靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

制备所述shLRP1-1序列的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示；

制备所述shLRP1-2序列的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种包含如权利要求1所述shRNA序列的慢病毒表达载体。

3.根据权利要求2所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体由shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列克隆到慢病毒表达载体中得到。

4.一种如权利要求2所述的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，制备包括如下步骤：

S1、采用引物退火合成shLRP1-1序列和/或shLRP1-2序列；

S2、将合成的shLRP1-1和/或shLRP1-2序列克隆到慢病毒表达载体中。

5.根据权利要求1所述的shRNA序列在制备抑制LRP1基因表达的药物方面的应用。

6.根据权利要求1所述的shRNA序列在制备用于治疗/预防胃癌相关的药物中的应用。

7.一种用于治疗胃癌的药物，其特征在于，包含如权利要求1所述的靶向沉默LRP1基因表达的shRNA。