CN105734121A - 乙醛脱氢酶1a3及其编码基因作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用 - Google Patents

乙醛脱氢酶1a3及其编码基因作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenases，ALDH)1A3及其编码基因作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用、作为结直肠癌独立预后判定因子的应用，以及ALDH1A3表达下调剂、活性抑制剂、过表达效应抑制剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用，对结直肠癌侵袭转移的预防、治疗，结直肠癌预后判定具有重要意义。

Description

乙醛脱氢酶1A3及其编码基因作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及乙醛脱氢酶1A3及其编码基因作为肿瘤侵袭转移预防或治疗靶点的应用。
背景技术
结直肠癌严重危害人类健康，而侵袭转移是结直肠癌患者最重要的死亡原因。因此，探寻针对结直肠癌侵袭转移的靶点和分子，进而开发相关的治疗药物，具有重要的临床意义。
人类乙醛脱氢酶(Aldehydedehydrogenases，ALDH)家族包含19个亚型，不同ALDH亚型亚细胞定位各不相同(包括细胞核、线粒体和细胞浆)且功能各异。既往认为，该家族能够通过将内生性醛催化形成酸，进而参与众多重要病理生理过程的调控，包括视觉、神经递质传递以及胚胎发育等等。随着研究的深入，ALDH家族成员的功能以一种令人惊讶的速度不断扩展，越来越多的结果表明，该家族成员在恶性肿瘤的发生、进展、治疗抵抗和复发过程中扮演举足轻重的角色。
然而，ALDH活性同结直肠癌细胞侵袭转移之间的关系、决定ALDH活性的具体亚型以及其表达同结直肠癌细胞侵袭转移和患者预后之间的关系、相关分子调控机制尚不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于研究ALDH活性同结直肠癌细胞侵袭转移之间的关系、决定ALDH活性的具体亚型以及其表达同结直肠癌细胞侵袭转移和患者预后之间的关系、相关分子调控机制等，以拓宽ALDH亚型在医药领域中的应用。
为此，本发明考察了ALDH活性同结直肠癌细胞侵袭转移之间的关系、决定ALDH活性的具体亚型以及其表达同结直肠癌细胞侵袭转移和患者预后之间的关系、相关分子调控机制。结果显示，ALDH+(Aldefluor+)的结直肠癌细胞侵袭转移能力明显强于ALDH-(Aldefluor-)亚群；结直肠癌细胞ALDH(Aldefluor)活性主要由ALDH1A3决定，干预ALDH1A3的表达能够显著地影响结直肠癌细胞的侵袭转移能力；进一步证实ALDH1A3通过如下机制调控结直肠癌细胞的侵袭转移能力：ALDH1A3过表达→增强糖酵解抑制有氧氧化→减少三羧酸循环(TCA)中间产物α-酮戊二酸(α-KG)的产生→抑制Fe(II)-α-酮戊二酸依赖性去甲基化酶介导的基因启动子去甲基化→促进miR200家族启动子高甲基化→抑制miR200家族表达→EMT转录因子ZEB1、SNAI2表达上调→EMT主要标志物CDH1/E-cadherin表达下降、CDH2/N-cadherin表达上升→结直肠癌细胞发生上皮-间质转化(EMT)→侵袭转移能力增强；根据上述调控机制，实验结果证实，通过下调ALDH1A3的表达、抑制ALDH1A3的活性、给予ALDH1A3过表达效应抑制剂如外源性的α-酮戊二酸、miR200家族启动子甲基化抑制剂、外源性的miR200家族成员等几种途径，都可以完全或部分逆转结直肠癌细胞的侵袭转移能力；最后，本发明还通过临床样本证实了ALDH1A3的mRNA和蛋白表达水平同结直肠癌的侵袭转移正相关，可以作为独立的结直肠癌预后判定因子。
根据上述研究结果，本发明提出如下技术方案：
1.乙醛脱氢酶1A3作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用。
2.乙醛脱氢酶1A3编码基因作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用。
3.乙醛脱氢酶1A3活性抑制剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用。
优选的，所述乙醛脱氢酶1A3活性抑制剂为N,N-二乙基-4-氨基苯甲醛或双硫仑。
4、乙醛脱氢酶1A3表达下调剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用。
优选的，所述乙醛脱氢酶1A3表达下调剂为抑制乙醛脱氢酶1A3基因表达的shRNA，其编码DNA序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。
5、乙醛脱氢酶1A3过表达效应抑制剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用。
优选的，所述乙醛脱氢酶1A3过表达效应抑制剂为miR200b、miR200a、miR429、miR200c和miR141中的任一种或多种组合物，或5-氮杂-2’-脱氧胞苷，或α-酮戊二酸。
6、乙醛脱氢酶1A3作为结直肠癌独立预后判定因子的应用。
7、乙醛脱氢酶1A3编码基因作为结直肠癌独立预后判定因子的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了ALDH1A3及其编码基因作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用、作为结直肠癌独立预后判定因子的应用，以及ALDH1A3表达下调剂、活性抑制剂、过表达效应抑制剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用，对结直肠癌侵袭转移的预防、治疗，结直肠癌预后预测具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为ALDH+(Aldefluor+)结直肠癌细胞在荧光显微镜下的形态。
图2为ALDH+(Aldefluor+)结直肠癌细胞具备高侵袭转移能力。其中图2A为结肠癌细胞中ALDH(Aldefluor)的阳性率；图2B为ALDH+(Aldefluor+)/ALDH-(Aldefluor-)结肠癌细胞接种于裸鼠皮下所形成肿瘤的形态学表现；图2C为发生转移/未发生转移的结肠癌患者ALDH(Aldefluor)的阳性率；图2D为体外ALDH+(Aldefluor+)/ALDH-(Aldefluor-)亚群的侵袭能力，图2E为体外抑制ALDH活性后结肠癌细胞的侵袭转移能力；图2F为联合免疫缺陷小鼠原位/尾静脉移植，体内抑制ALDH活性后结肠癌细胞的侵袭转移能力。
图3为ALDH1A3决定结直肠癌细胞ALDH活性及侵袭转移能力。其中图3A为real-timePCR检测ALDH各亚型在结肠癌HCT116细胞中的表达情况(左)以及ALDH各亚型在结肠癌ALDH+(Aldefluor+)/ALDH-(Aldefluor-)亚群中的表达情况(右)；图3B为ALDH1A3和ALDH3A2的mRNA表达量同ALDH(Aldefluor)阳性率的相关性(左)ALDH1A3的蛋白表达同ALDH(Aldefluor)阳性率的相关性(右)；图3C为荧光显微镜检测干预ALDH1A3后ALDH(Aldefluor)活性的变化；图3D为流式细胞术检测干预ALDH1A3和其他ALDH亚型后ALDH(Aldefluor)活性的变化；图3E为敲低ALDH1A3后再超表达其他ALDH亚型ALDH(Aldefluor)活性的变化；图3F为干预ALDH1A3表达后结肠癌细胞体外侵袭转移能力变化；图3G为干预ALDH1A3表达后结肠癌细胞免疫缺陷小鼠体内侵袭转移能力变化。
图4为ALDH1A3通过ZEB1、SNAI2影响结直肠癌细胞EMT表型。其中图4A为干预ALDH1A3后结肠癌细胞形态变化；图4B为real-timePCR检测干预ALDH1A3后EMT相关标志物和相关转录因子的表达；图4C为Western-blotting检测干预ALDH1A3后EMT相关标志物和相关转录因子的表达；图4D为免疫荧光激光共聚焦显微镜检测干预ALDH1A3后EMT相关标志物和相关转录因子的表达；图4E为Western-blotting检测共干预ALDH1A3和ZEB1/SNAI2后EMT标志物和相关转录因子的表达；图4F为共干预ALDH1A3和ZEB1/SNAI2后细胞形态的变化。
图5为干预其他ALDH亚型后EMT相关标志物和转录因子的表达。其中图5A为real-timePCR检测过表达ALDH1A1、ALDH2、ALDH3A2、ALDH7A1、ALDH18A1后CDH1、CDH2、SNAI2、ZEB1mRNA的水平；图5B为westernblotting检测过表达ALDH1A1后E-cadherin、ZEB1、SNAI2的水平。
图6为ZEB1、SNAI25’-启动子与3’-非翻译区荧光素酶报告基因活性检测。其中图6A为5’-启动子荧光素酶报告基因活性检测结果；图6B为3’-非翻译区荧光素酶报告基因活性检测结果。
图7为miR200家族成员与ALDH1A3表达的关系(公共数据库)。
图8为ALDH1A3通过miR200家族调控结直肠癌细胞的EMT表型。其中图8A为real-timePCR检测干预ALDH1A3后miR200家族成员的表达变化；图8B为real-timePCR检测ALDH1A3/miR200共干预后ZEB1、SNAI2的mRNA表达变化；图8C为westernblotting检测ALDH1A3/miR200共干预后E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、SNAI2的蛋白表达变化；图8D为westernblotting检测ALDH1A3/ZEB1/SANI2/miR200共干预后E-cadherin的蛋白变化；图8E为ALDH1A3/miR200共干预后细胞形态的变化；图8F为ALDH1A3/ZEB1/SANI2/miR200共干预后细胞的形态变化。
图9为miR200家族两个启动子中3个高GC含量区域。
图10为ALDH1A3通过代谢-表观遗传学机制调控结直肠癌细胞的EMT表型。其中图10A为real-timePCR检测ALDH1A3/α-酮戊二酸/5-氮杂-2’-脱氧胞苷共干预后，结肠癌细胞miR200家族的2个启动子的3个高GC含量区域的甲基化程度；图10B为real-timePCR检测ALDH1A3/α-酮戊二酸/5-氮杂-2’-脱氧胞苷共干预后，结肠癌细胞miR200家族成员的表达；图10C为real-timePCR检测ALDH1A3/α-酮戊二酸/5-氮杂-2’-脱氧胞苷共干预后，结肠癌细胞miR200家族EMT转录因子ZEB1、SNAI2的表达；图10D为ALDH1A3/α-酮戊二酸/5-氮杂-2’-脱氧胞苷共干预后，结肠癌细胞E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、SNAI2的表达(上图，westernblotting检测)以及细胞形态的变化(下图)；图10E为ALDH1A3/α-酮戊二酸/5-氮杂-2’-脱氧胞苷/miR200共干预后，real-timePCR检测CDH1CDH2ZEB1SNAI2的表达(上图)，westernblotting检测E-cadherin(中图)、ZEB1、SNAI2(下图)的表达；图10F为过表达ALDH1A3后结肠癌细胞乳酸、α-酮戊二酸的浓度。
图11为核磁共振检测过表达ALDH1A3的结直肠癌细胞代谢谱变化。
图12为ALDH1A3的表达同结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系。其中图12A为远处正常结肠组织、腺瘤组织和结直肠癌组织ALDH1A3的mRNA表达水平；图12B为发生转移和未发生转移的结直肠癌患者ALDH1A3的mRNA表达水平；图12C为ALDH1A3的mRNA表达水平同结直肠癌患者未复发生存率的关系(左，数据库1；右，数据库2)；图12D为免疫组化检测ALDH1A3在结直肠癌组织中的表达；图12E为免疫组化检测发生转移和未发生转移的结直肠癌患者ALDH1A3的蛋白表达水平；图12F为ALDH1A3的蛋白表达水平同结直肠癌患者预后的关系。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
优选实施例中，抑制ALDH1A3基因表达的shRNA的编码DNA序列为下述三条序列(下划线部分为loop序列)中的任一条：
1：gctgtattagaaccctcagatctccgggatccaagagatctgagggttctaatacagcttttttg(SEQIDNo.1)；
2：gccgaatacacagaagtgaaactccggatccaagagtttcacttctgtgtattcggcttttttg(SEQIDNo.2)；
3：aaccaatactgaagttcaactccgggatccaagagttgaacttcagtattggttgcttttttg(SEQIDNo.3)。
ALDH1A3基因shRNA表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)根据上述三条shRNA的编码DNA序列及PLVshRNA-eGFP克隆表达载体的多克隆位点，分别合成以下正义寡核苷酸和反义寡核苷酸；
1A：gatccgctgtattagaaccctcagatctccgggatccaagagatctgagggttctaatacagcttttttg(SEQIDNo.4)；
1B：aattcaaaaaagctgtattagaaccctcagatctcttggatcccggagatctgagggttctaatacagca(SEQIDNo.5)；
2A：gatccgccgaatacacagaagtgaaactccgggatccaagagtttcacttctgtgtattcggcttttttg(SEQIDNo.6)；
2B：aattcaaaaaagccgaatacacagaagtgaaactcttggatcccggagtttcacttctgtgtattcggca(SEQIDNo.7)；
3A：gatccaaccaatactgaagttcaactccgggatccaagagttgaacttcagtattggttgcttttttg(SEQIDNo.8)；
3B：aattcaaaaaagcaaccaatactgaagttcaactcttggatcccggagttgaacttcagtattggttgca(SEQIDNo.9)；
2)将正义寡核苷酸(1A、2A或3A)与其对应的反义寡核苷酸(1B、2B或3B)退火形成双链DNA；
3)将所得双链DNA用BamHI和EcoRI双酶切后，与经同样双酶切的pLVshRNA-eGFP克隆表达载体连接，即获得ALDH1A3基因shRNA表达载体pLVshRNA-eGFP-ALDH1A3。
一、结直肠癌细胞ALDH+(Aldefluor+)亚群具有高侵袭转移能力
采用aldefluor检测了5个结直肠癌细胞系(HCT116、LOVO、SW480、SW620、HT29)和8例结直肠癌原代标本(原代1-8)，发现这些样本中均存在ALDH+细胞，比例从0.3～35％不等(图1，图2A)。将来源于5个结直肠癌细胞系的ALDH+(Aldefluor+)亚群、ALDH-(Aldefluor-)亚群分别移植到免疫缺陷动物体内，都能够形成移植瘤。对这些移植瘤的病理组织学特征进行分析发现：来源于ALDH-(Aldefluor-)亚群的移植瘤大都具有明显的包膜，同周围正常的组织界限明显，向深部组织的浸润性生长不明显，坏死区少见，核分裂相较少而间质血管丰富。相反，来源于ALDH+(Aldefluor+)亚群的移植瘤，包膜多不完整，甚至完全缺如，向深部肌肉组织和脂肪组织的浸润性生长非常明显，可以看到明显的静脉癌栓，还可以观察到较多的坏死区和核分裂相，间质血管相对稀少(图2B)。上述结果提示，ALDH(Aldefluor)的活性可能同结直肠癌的侵袭转移潜能有关。
为了进一步验证这种可能性，首先在发生转移和未发生转移的结直肠癌患者中比较了ALDH的阳性率，结果发现，前者的ALDH(Aldefluor)阳性率显著高于后者(图2C)。接下来，采用基质胶侵袭实验，在体外比较了来源于4个结直肠癌细胞系(HCT116、SW480、SW620、HT29)和1例结直肠癌原代标本(原代2)的ALDH+(Aldefluor+)亚群、ALDH-(Aldefluor-)亚群的侵袭潜能，结果显示，这些样本中ALDH+(Aldefluor+)亚群的体外基质胶侵袭能力都显著高于ALDH-(Aldefluor-)亚群(图2D)；而给予ALDH活性抑制剂(DEAB或DS)后，ALDH+(Aldefluor+)亚群的侵袭能力显著降低(图2E)，尤其以DS的效应更为明显。进一步，分别将ALDH+(Aldefluor+)亚群和ALDH-(Aldefluor-)亚群接种于联合免疫缺陷小鼠，在体内显示出ALDH+(Aldefluor+)亚群的高侵袭转移能力(图2F)。
上述结果表明，ALDH(Aldefluor)的活性与结直肠癌细胞的侵袭转移能力关系密切。
二、ALDH1A3决定结直肠癌细胞ALDH活性
由于ALDH家族具有19个亚型，不同亚型的亚细胞定位各不相同且功能各异，了解哪个或哪些亚型决定结直肠癌细胞ALDH的活性是进行特异性干预的前提。因此，利用来自于R2的DNA芯片表达谱数据(SieberSmith-355，包含355例结直肠癌患者的基因表达谱信息)，观察了19个ALDH亚型在结直肠癌中的表达情况。结果发现，19个ALDH亚型中有7个亚型(ALDH1A2、ALDH1L2、ALDH3A1、ALDH3B1、ALDH3B2、ALDH4A1、ALDH8A1)在结直肠癌患者中基本不表达(表1)。
表1.ALDH各亚型在355例结直肠癌患者中的表达情况
接下来，采用real-timePCR在5个结直肠癌细胞系(HCT116、LOVO、SW480、SW620、HT29)检测了另外12个ALDH亚型的表达，发现仅有7个亚型(ALDH1A3，ALDH3A2，ALDH5A1，ALDH6A1，ALDH7A1，ALDH9A1，ALDH18A1)在所有的5个结直肠癌细胞系中均表达(图3A左半部分)。接下来，又采用real-timePCR分别在ALDH+(Aldefluor+)亚群、ALDH-(Aldefluor-)亚群中比较了这7个ALDH亚型的表达情况，结果发现，除了ALDH1A3显著升高，ALDH3A2略有升高外，其他各亚型在ALDH+(Aldefluor+)亚群中的表达并不高于ALDH-(Aldefluor-)亚群(图3A右半部分)，说明ALDH1A3和/或ALDH3A2可能决定了结直肠癌细胞ALDH(Aldefluor)的活性。为了进一步探讨这种可能性，比较了5个结直肠癌细胞系(HCT116、LOVO、SW480、SW620、HT29)中ALDH1A3、ALDH3A2的表达同ALDH(Aldefluor)阳性率之间的相关性，发现ALDH1A3的mRNA表达水平同ALDH(Aldefluor)阳性率之间的相关性显著高于ALDH3A2(图3B，左侧部分)，荧光双标证实ALDH1A3阳性的细胞占ALDH+(Aldefluor+)亚群的62％以上(图3B，右侧部分)。进一步，在HCT116细胞系不同ALDH亚群中，对ALDH1A3和其他5个ALDH亚型进行了干预。结果发现，shRNA(其编码DNA序列如SEQIDNo.1～3中任一序列所示，以其构建的ALDH1A3基因shRNA表达载体为pLVshRNA-eGFP-ALDH1A3)对ALDH1A3表达的下调显著降低了ALDH的阳性率，ALDH1A3过表达载体的转染明显地增高了ALDH的阳性率(图3C，流式细胞术检测；图3D，荧光显微镜检测)；而下调ALDH1A3后再过表达其他5个ALDH亚型(ALDH1A1、ALDH2、ALDH3A2、ALDH7A1、ALDH18A1)，ALDH(Aldefluor)的阳性率并未表现出显著的上升(图3E)。
上述结果表明，ALDH1A3是决定结直肠癌ALDH活性的亚型。
三、干预ALDH1A3的表达显著影响结直肠癌细胞的侵袭转移能力
当过表达ALDH1A3后，结直肠癌细胞HCT116的体外侵袭转移能力显著增强，反过来，当下调ALDH1A3的表达后，其体外侵袭转移能力随之降低(图3F)。采用联合免疫缺陷小鼠移植模型，同样在体内证实了体外的结果(图3G)。接下来，利用来自于R2的DNA芯片表达谱数据(SieberSmith-355)，比较了ALDH1A3的表达同侵袭转移相关基因表达的关系，发现在结直肠癌中，ALDH1A3的表达同基质金属蛋白酶家族、CXC趋化因子受体家族、整合素家族、血管内皮细胞生长因子家族、解聚素金属蛋白酶家属等侵袭转移相关基因表达呈明显的正相关(表2)。
表2.ALDH1A3与侵袭转移相关基因表达的相关性
四、ALDH1A3通过代谢-表观遗传途径调控EMT表型，影响结直肠癌细胞的侵袭转移
研究过程中发现，过表达和下调ALDH1A3的结直肠癌细胞在形态上存在明显的差异(图4A)。这种形态学上的差异同上皮-间质转换(EMT)相符合，提示ALDH1A3有可能通过EMT调控结直肠癌细胞的侵袭转移。
为此，首先利用不同的DNA芯片表达谱数据库，了解ALDH1A3的表达与两个EMT主要标志物CDH1(编码E-cadherin)与CDH2(编码N-cadherin)的关系。结果在SieberSmith-355数据库中发现，ALDH1A3的表达与CDH1负相关，与CDH2正相关，而其他ALDH亚型同CDH1、CDH2之间不存在这种相关性。上述结果在其他7个DNA芯片表达谱数据库中也获得了证实(表3-5)。
表3.ALDH1A3同EMT相关基因表达的关系
表4.CDH1与其他ALDH亚型表达的关系
表5.CDH2与其他ALDH亚型表达的关系
接下来，考察了干预ALDH1A3后两个EMT主要标志物(CDH1、CDH2)的表达情况。发现，过表达ALDH1A3时，CDH1表达下降，而CDH2表达上升；反过来，下调ALDH1A3时，CDH1表达上升，而CDH2表达下降。进一步，通过Westernblotting、免疫荧光证实，在蛋白水平上也有一致的变化(图4B-F)。然而，过表达其他ALDH亚型(ALDH1A1，ALDH2，ALDH3A2，ALDH7A1，ALDH18A1)，却未能观察到CDH1/E-cadherin的下调和CDH2的上调(图5)。
接下来，又考察了激活EMT过程的8个主要转录因子(SNAI1、SNAI2、TWIST1、ZEB1、ZEB2/SIP1、FOXC2、E47/TCF3、Goosecoid)中到底哪些与ALDH1A3有关。通过基因表达谱数据库分析发现，在结直肠癌中只有SNAI2、ZEB1、ZEB2和TWIST1的表达同ALDH1A3正相关(表3)。于是通过在结直肠癌中干预ALDH1A3的表达，考察上述四个转录因子的水平是否会发生变化。结果发现，TWIST1的水平并未随着ALDH1A3的变化而变化，而SNAI2、ZEB1、ZEB2的表达随着ALDH1A3的水平正向变化，不过ZEB2的相对表达量很低，因此，在westernblotting中只能显示出SNAI2和ZEB1的变化(图4B-D)。然而，过表达其他ALDH亚型，却未能观察到SNAI2和ZEB1的上调(图5)。这些结果提示，ALDH1A3介导的EMT可能同这两个转录因子的表达相关。
接下来，考察ALDH1A3怎么影响这两个EMT相关转录因子(SNAI2、ZEB1)的表达。从前面的结果可以看出，干预ALDH1A3后，这两个转录因子在mRNA水平就发生了明显的变化(图4B)，表明ALDH1A3应该是在转录或者mRNA水平影响这两个转录因子的表达。也就是说，存在两种可能性：在5’启动子区调控转录或者在3’非翻译区影响mRNA的稳定性。于是，首先构建两个转录因子5’启动子的荧光素酶报告基因载体，将其转染到ALDH1A3过表达的结直肠癌细胞系中，发现，同对照组相比，ALDH1A3过表达并未影响5’启动子的转录活性(图6A)；接下来，又构建了两个转录因子3’非翻译区的荧光素酶报告基因载体，并将其转染到ALDH1A3过表达的结直肠癌细胞系中，令人兴奋的是，ALDH1A3的过表达导致了荧光信号的显著变化(图6B)，从而提示，ALDH1A3是通过3’非翻译区影响这两个EMT转录因子的mRNA水平。换句话说，microRNA可能在ALDH1A3介导的EMT过程中扮演重要的角色。
由于近年来的研究结果表明，miR200家族通过抑制ZEB1、ZEB2、SNAI2的表达，在EMT过程中扮演重要的角色。那么，miR200家族是否同ALDH1A3介导的EMT有关，为了清楚上述问题，首先通过TCGA的数据库分析了结直肠癌中ALDH1A3与5个miR200家族成员(miR200b、miR200a、miR429、miR200c、miR141)表达的相关性。结果惊奇地发现，ALDH1A3的表达同除miR141外的其他4个miR200家族成员的表达呈显著的负相关(图7)。紧接着，在结直肠细胞中过表达ALDH1A3，证实5个miR200家族成员的表达的确显著下降(图8A)。进一步，当给予外源性的miR200家族任一成员或所有成员的组合物后，过表达ALDH1A3所引起的EMT相关效应和表型(EMT转录因子的高表达、E-cadherin的表达下降、Vimentin的表达上升、结直肠癌细胞的形态学变化等)都得到了完全或部分的逆转(图8B，图8C，图8E，All表示给予miR200家族所有成员的组合)。共干预ALDH1A3/ZEB1/SNAI2/miR200，EMT相关效应和表型回复(图8D，图8F)。从而提示，ALDH1A3介导EMT与miR200家族成员的表达下调相关。
近年来的研究成果还提示，启动子甲基化介导的miR200表达下调与EMT转录因子SNAI2、ZEB1、ZEB2的高表达显著相关。那么，ALDH1A3介导miR200表达下调是否同启动子甲基化这种表观遗传学修饰机制有关。为此，采用甲基化DNA免疫共沉淀real-timePCR检测了miR200家族两个启动子中3个高GC含量区域(图9)的甲基化水平。发现，同对照组相比，ALDH1A3过表达导致上述3个区域的甲基化水平显著提高，尤其是区域1和区域2(图10A)。进一步，给予甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza)后，ALDH1A3过表达所引起的效应(miR200家族成员启动子高甲基化、miR200家族成员的低表达、EMT转录因子的高表达、E-cadherin的表达下降、N-cadherin的表达上升、结直肠癌细胞的形态学变化以及侵袭转移能力的变化等)都得到了完全或部分的逆转(图10A-D)。进一步，进行ALDH1A3/5-Aza/miR200共干预，加入miR200的抑制剂AMO-miR200后，5-Aza所引起的EMT标志物(CDH1/E-cadherin，CDH2/N-cadherin)、EMT转录因子(SNAI2、ZEB1)的mRNA和蛋白变化恢复(图10E)。结果提示，ALDH1A3介导的EMT与miR200家族成员启动子高甲基化有关。
最后，考察ALDH1A3引起miR200启动子高甲基化的机制。既往认为，ALDH1A3主要负责将醛转变成羧酸，进一步通过ACSS1将羧酸转变为乙酰辅酶A，从而在糖酵解和糖异生途径中扮演重要的角色。理论上讲，ALDH1A3高表达会促进糖酵解而抑制有氧氧化(三羧酸循环)，导致α-酮戊二酸等三羧酸循环的中间产物生成减少。值得注意的是，α-酮戊二酸是Fe(II)/α-酮戊二酸-依赖性双加氧酶家族的共底物。很多证据表明，Fe(II)/α-酮戊二酸-依赖性双加氧酶家族主要负责将碱基上的甲基脱去，其活性的降低会导致许多基因启动子的甲基化水平升高，从而在肿瘤发生中扮演重要的角色。这些基因中就包括miR200家族。因此推测，ALDH1A3可能通过如下能量代谢-表观遗传学信号途径调控miR200家族成员启动子的甲基化：ALDH1A3过表达→促进糖酵解→抑制有氧氧化三羧酸循环→α-酮戊二酸生成减少→下调α-酮戊二酸依赖性DNA脱甲基化→miR200家族成员启动子高甲基化。为了验证这个假说，首先采用核磁共振检测了过表达ALDH1A3后细胞内代谢物谱的变化，令人兴奋的是，细胞内糖酵解的活性显著增强(图11)；接下来，又采用可见光谱法证实，过表达ALDH1A3后，细胞内糖酵解产物L-乳酸的浓度显著上升，而有氧氧化的中间产物α-酮戊二酸显著下降(图10F)。当给予外源性α-酮戊二酸时，过表达ALDH1A3所引起的效应和表型(miR200家族成员启动子高甲基化、miR200家族成员的低表达、EMT转录因子的高表达、E-cadherin的表达下降、N-cadherin的表达上升、结直肠癌细胞的形态学变化以及侵袭转移能力的变化等)都得到了完全或部分的逆转(图10A-D)。进一步，进行ALDH1A3/α-KG/miR200共干预，加入miR200的抑制剂AMO-miR200后，α-KG所引起的EMT标志物(CDH1/E-cadherin，CDH2/N-cadherin)、EMT转录因子(SNAI2、ZEB1)的mRNA和蛋白变化恢复(图10E)。上述结果提示，ALDH1A3通过如下能量代谢-表观遗传学机制调控结直肠癌细胞的EMT表型：ALDH1A3过表达→增强糖酵解抑制有氧氧化→减少三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸的产生→抑制Fe(II)-α-酮戊二酸依赖性去甲基化酶介导的基因启动子去甲基化→促进miR200家族启动子高甲基化→抑制miR200家族表达→EMT转录因子ZEB1、SNAI2表达上调→EMT标志物CDH1/E-cadherin表达下降、CDH2/N-cadherin表达上升。
五、ALDH1A3表达同结直肠癌的侵袭转移关系密切，是结直肠癌的独立预后判定因子
首先利用4个来自R2的AffymetrixDNA芯片数据库(Skrzypczak-145,Matsuyama-111,SieberSmith-355,andCIT-Marisa-566)的资料，分析了ALDH1A3的mRNA表达水平同结直肠癌患者临床病理特性/预后之间的关系。结果表明：(1)结直肠癌组织中ALDH1A3的mRNA表达水平显著高于远处正常结肠组织和结肠腺瘤组织(图12A)；(2)发生了转移的结直肠癌组织中，ALDH1A3的mRNA表达水平远远高于未发生转移的结直肠癌患者(图12B)；(3)更为重要的是，ALDH1A3的mRNA表达水平同结直肠癌患者的预后呈负相关(图12C)。接下来，在111例结直肠癌患者中，进一步观察了ALDH1A3的蛋白表达水平同结直肠癌患者临床病理特性/预后之间的关系(图12D-F)，结果表明：(1)ALDH1A3高表达患者的预后(中位生存时间＝35.6月)明显差于ALDH1A3低表达的患者(中位生存时间＝53.6月)；(2)单因素/多因素风险评估结果表明，ALDH1A3的表达水平可以作为结直肠癌患者的独立预后判定因素(HR2.188,95％CI:0.991–4.832)(表6，表7)。
表6.ALDH1A3的表达同结直肠癌患者临床病理参数的关系
表7.单因素/多因素预后回归分析
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.乙醛脱氢酶1A3作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用。
2.乙醛脱氢酶1A3编码基因作为结直肠癌侵袭转移预防或治疗靶点的应用。
3.乙醛脱氢酶1A3活性抑制剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乙醛脱氢酶1A3活性抑制剂为N,N-二乙基-4-氨基苯甲醛或双硫仑。
5.乙醛脱氢酶1A3表达下调剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述乙醛脱氢酶1A3表达下调剂为抑制乙醛脱氢酶1A3基因表达的shRNA，其编码DNA序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。
7.乙醛脱氢酶1A3过表达效应抑制剂在制备逆转结直肠癌侵袭转移药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述乙醛脱氢酶1A3过表达效应抑制剂为miR200b、miR200a、miR429、miR200c和miR141中的任一种或多种组合物，或5-氮杂-2’-脱氧胞苷，或α-酮戊二酸。
9.乙醛脱氢酶1A3作为结直肠癌独立预后判定因子的应用。
10.乙醛脱氢酶1A3编码基因作为结直肠癌独立预后判定因子的应用。
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