CN104498496A - 小分子novel-miR-1和骨肉瘤药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小分子novel-miR-1，具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列。本发明的小分子novel-miR-1，通过生物信息学分析表明，这一小分子的RNA是与骨肉瘤表达的潜在靶基因相关，同时进一步在上述基础上对筛选出的novel-miR-1表达的骨肉瘤细胞进行了一系列生长繁殖相关的细胞生物学实验，其结果表明，novel-miR-1转染的骨肉瘤细胞的周期呆滞，骨肉瘤细胞增殖受抑制，瘤细胞的迁移能力和成瘤能力下降；并且作为骨肉瘤的药物使用，只需将该novel-miR-1转染侵入至患病的骨肉瘤组织部位，其在转染之后其能通过改变骨肉瘤细胞内的基因表达，从而抑制骨肉瘤细胞的克隆和增殖。
Description
技术领域
本发明属于小分子RNA药物技术领域，具体涉及一种小分子novel-miR-1和骨肉瘤的药物。
背景技术
骨肉瘤是骨恶性肿瘤中最多见的一种，是从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。骨肉瘤经病理确诊后，传统的的治疗方法均在于，即开始前期的化学或放射性治疗，以及切除肿瘤组织等等。但是这一方法，对正常的骨组织细胞也有上较强的伤害，同时无法瘤细胞的再次复发。因此，现有越来越多的方法倾向于根治性方法，比如全面切除和免疫治疗。
其中，免疫治疗为静脉输入淋巴细胞或用干扰素和转移因子；通过诱导机体内细胞的免疫表达，从而使基体产生自主的抑制表达，但疗效尚不肯定。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种具有直接抑制骨肉瘤细胞生长的小分子novel-miR-1和骨肉瘤药物。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的小分子novel-miR-1。
本发明的小分子novel-miR-1，通过生物信息学分析表明，这一小分子的RNA是与骨肉瘤表达的潜在靶基因相关，同时进一步在上述基础上对筛选出的novel-miR-1表达的骨肉瘤细胞进行了一系列生长繁殖相关的细胞生物学实验，其结果表明，novel-miR-1转染的骨肉瘤细胞的周期呆滞，骨肉瘤细胞增殖受抑制，瘤细胞的迁移能力和成瘤能力下降。
本发明进一步还提出一种骨肉瘤药物，包含具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的小分子novel-miR-1。
本发明的骨肉瘤药物，只需将该novel-miR-1转染侵入至患病的骨肉瘤组织部位，其在转染之后其能通过改变骨肉瘤细胞内的基因表达，同时还能随着增殖而扩增，从而抑制骨肉瘤细胞的克隆和增殖。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例转染novel-miR-1后的U2-OS和MG-63的生长曲线图；
图2为本发明实施例转染novel-miR-1后的U2-OS和MG-63的平板克隆结果图；
图3为图2中平板克隆结果的数量统计直方图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种小分子novel-miR-1，本发明的小分子novel-miR-1具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列。
| 名称 | 序列(5’-3’) | 长度 | 序列号 |
| 小分子novel-miR-1 | TTTGTGTAAGGGCGCAGACT | 20bp | SEQ.ID.No.1 |
本发明的上述novel-miR-1为一种miRNA；miRNA是一组不编码蛋白质的短序列RNA，初始转录位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向重复序列上，其前体具有标志性的发夹结构，成熟体的形成由Dicer酶的剪切实现。
本发明的小分子novel-miR-1，通过生物信息学分析表明，这一小分子的RNA是与骨肉瘤表达的潜在靶基因相关，同时进一步在上述基础上对筛选出的novel-miR-1表达的骨肉瘤细胞进行了一系列生长繁殖相关的细胞生物学实验，其结果表明，novel-miR-1转染的骨肉瘤细胞的周期呆滞，骨肉瘤细胞增殖受抑制，瘤细胞的迁移能力和成瘤能力下降。
因此，基于上述研究，本发明中进一步将novel-miR-1制备成骨肉瘤药物，通过该小分子RNA药物的表达，从而抑制淋巴瘤细胞的增殖与侵袭。作为药物使用过程中只需将该novel-miR-1转染侵入至患病的骨肉瘤组织部位，其在转染之后其能通过改变骨肉瘤细胞内的基因表达，同时还能随着增殖而扩增，从而抑制骨肉瘤细胞的克隆和增殖。
而其中，miRNA的预测主要是通过针对miRNA的生物特征的筛选得到的，本发明的novel-miR-1的筛选，通过将预测到的新miRNA表达谱构建方法后，采用如下特定条件进行筛选获得，获得之后根据筛选的产物是否为目的产物进而验证筛选的条件是否成立。其中筛选的步骤和每个步骤中的条件为：
S10，一次筛选：候选的miRNA在基因组上的前体序列可以形成颈环结构，并且其成熟体序列位于前体的臂上；
S20，二次筛选：前体折叠后miRNA/miRNA*复合体两端有2nt的悬挂；
S30，三次筛选：前体臂上无较大的泡，同时没有较多的凸起；
S40，四次筛选：前体折叠后总体的最小自由能应不大于-18 kcal/mol；
S50，五次筛选：预测到前体的成熟体序列的比对结果中最小支持数应大于等于5，即获得小分子novel-miR-1。
按照本发明的上述方筛选方法，通过将预测到的新miRNA表达谱构建方法，针对预测到的miRNA其表达量的计算是根据比对结果，序列与成熟体序列在两端不超过3nt的错配，中间需完全匹配，符合这样条件的序列的表达量加和作为该miRNA的表达量。
具体在筛选的过程可以采用华大基因的Mireap软件进行，并且在实施过程中根据上述筛选条件设定如下参数：
Minimal miRNA sequence length(18)
Maximal miRNA sequence length(26)
Minimal miRNA reference sequence length(20)
Maximal miRNA reference sequence length(24)
Minimal depth of Drosha/Dicer cutting site(3)
Maximal copy number of miRNAs on reference(20)
Maximal free energy allowed for a miRNA precursor(-18 kcal/mol)
Maximal space between miRNA and miRNA*(35)
Minimal base pairs of miRNA and miRNA*(14)
Maximal bulge of miRNA and miRNA*(4)
Maximal asymmetry of miRNA/miRNA*duplex(5)
Flank sequence length of miRNA precursor(10)。
当然，根据上述筛选得到的产物测序之后，进行功能验证，结果中表明条件成立。
为使本发明的上述方法过程更加易于理解，以及使本领域技术人员能明确本novel-miR-1获得的细节，并且能更加突出其在骨肉瘤治疗中的突出效果，以下通过实施例进行举例说明：
按下述方法荧光定量PCR检测正常骨组织和骨肉瘤细胞novel-miR-1表达情况：(以手术中切除的新鲜骨肉瘤组织和旁边配对的正常骨组织为组织样本)
S10，组织(正常骨组织和骨肉瘤分别进行)中总RNA的提取：
S11，取骨组织块直接放入研钵中，加少量液氮迅速研磨，待组织变软；再加少量液氮，再研磨，如此三次，得研磨组织；
S12，按50-100mg组织/ml Trizol提取液的比例，向研磨组织加入Trizol；同时控制组织体积不能超过Trizol体积的10％，否则匀浆效果会不好；然后转入离心管并将具有Trizol提取液的组织匀浆用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟；室温放置5min，使其充分裂解；
S13，将裂解混合液12000rpm离心5min，弃沉淀；并向清液中按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min后；4℃12000g离心15min；
S14，吸取上层水相，至另一离心管中；按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
S15，按1ml75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀后4℃8000g离心5min，尽量弃上清；室温晾干或真空干燥5-10min；即为提取的RNA样品；
S16，然后用50ul H2O，TE buffer或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃、5-10min，测O.D值定量RNA浓度；选取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间的合格样本进行后续步骤。
S20，荧光定量PCR(该步骤中的RT-PCR试剂盒采用Ambion公司的TaqMan MicroRNA assays kit)：
S21，反转录：每个反转录反应包括10ng总RNA、1mM dNTPs、50UMultiscribe Reverse Transcriptase、1.5μl 10×RT buffer、0.188μl RNase inhibitor、and3μl5×TaqMan MicroRNA RT primer；反转录的条件如下：16℃for30分；42℃for30分；85℃for5分钟；
S22，PCR：将反转录后的cDNA产物稀释15倍，按照1.33μl的cDNA、1μl的TaqMan MicroRNA Assay和10μl的TaqMan Universal PCR Master Mix，总反应体积是20μl进行PCR。反应过程是：95℃10分钟，接下来是40个循环，每个循环是95℃15秒，60℃1分钟，72℃1分钟；通过PCR过程中的检测表达的水平，相对表达水平用RNU6B表达水平校正。
经检测，表达水平的结果对比如下表：
从上表中，novel-miR-1在骨肉瘤中的表达水平是正常骨组织中的表达水平的0.0016，从结果中可以看出novel-miR-1在骨肉瘤组织中显著降低(P＝1.83E-4)。
进一步在上述基础上，将本发明的novel-miR-1作为药物治疗过程中的效果：
分别转染100nM的novel-miR-1进入骨肉瘤细胞株U2-OS和MG-63，然后对细胞株U2-OS和MG-63的生长和克隆情况进行检测，其结果参见图1-3所示。
其中，从图1中的WST-1检测曲线结果中，转染了novel-miR-1后骨肉瘤细胞MG-63和U2-OS生长减慢。图2的骨肉瘤细胞MG-63和U2-OS转染了novel-miR-1后骨肉瘤的平板克隆的结果对照图；图3为图2中生长克隆数的统计直方图。从结果中，转染了novel-miR-1后的实验也明显可以看出novel-miR-1能抑制MG-63和U2-OS细胞生长。其中，图表中所有的数据显示为平均数±SD；*,P<0.05；***,P<0.001。
从上述本发明的novel-miR-1作为药物以转染的方式，进行模拟治疗的结果中，明显可以看出该novel-miR-1具有非常优秀的骨肉瘤生长抑制的效果。并且基于现有的生产技术，在确定上述碱基序列的基础上，可以直接大量进行合成生产，简洁便易。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种小分子novel-miR-1，其特征在于，具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列。
2.一种骨肉瘤药物，其特征在于，包含权利要求1所述的小分子novel-miR-1。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHIARA NOVELIO ET AL.: "miRNA expression profile in human osteosarcoma:Role of miR-1 and miR-133b in proliferation and cell cycle control", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY》 * |
| 汤海明等: "新一代测序技术应用于microRNA检测", 《遗传》 * |
| 田大为等: "骨肉瘤miRNA的研究进展", 《中国骨与关节杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105506156A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-04-20 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 诊断骨肉瘤的分子标志物 |
| CN105506156B (zh) * | 2016-01-29 | 2018-04-17 | 固安博健生物技术有限公司 | 诊断骨肉瘤的分子标志物 |
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