CN117088989A - 一种荧光报告蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光报告蛋白，通过在野生型荧光蛋白内部的特定位置插入能被识别并裂解的外源氨基酸序列，而不影响荧光蛋白的发光功能，从而形成一种全新的荧光报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被识别并裂解后，直接破坏了荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭，基于这种现象，可以进行多种应用，比如对蛋白酶活性的评价，对蛋白酶抑制剂效果的评价、抗病毒药物的筛选等。

Description

一种荧光报告蛋白
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，特别涉及一种荧光报告蛋白。
背景技术
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（GFP）指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。
在维多利亚多管发光水母中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光谱中处于绿光偏蓝的位置。野生型绿色荧光蛋白，最开始是 约238 个氨基酸的肽链，约 25KDa。然后按一定规则，11 条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏；圆柱中，α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。发色图被围在中心，能避免偶极化的水分子、顺磁化的氧分子或者顺反异构作用与发色团，致使荧光猝灭。
在细胞生物学与分子生物学中，绿色荧光蛋白(GFP)基因常用做报告基因(reporter gene)。绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子)上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术，绿色荧光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色荧光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼（例如斑马鱼），植物，苍蝇，甚至人等哺乳动物的细胞。
此外，绿色荧光蛋白可以通过定点突变发出不同波长的光，如BFP为蓝色(当Tyr-66被His取代时)，CFP为青色(当Tyr-66被Trp取代时)，YFP为黄色(当Thr203被Tyr取代时)。绿色荧光蛋白及其红色、蓝色、黄色和橙色的近亲已经彻底改变了生物医学研究，使每一种主要疾病从因果关系的角度在实验室里“点亮”，供研究人员可视化、理解并最终征服它们。
基于GFP的诸多优点，譬如广谱性、稳定性、易于载体构建与检测、无毒害，GFP在细胞筛选、基因表达、细胞标记、遗传跟踪等领域被广泛应用。GFP作为一种活体报告蛋白同时它的荧光强度很高，易于活体观测和用仪器进行定量检测。GFP的三级结构对于荧光的产生是十分重要的，蛋白质变性及分离的发色团都无法产生荧光。通常情况下，为了不破坏GFP的三级结构，均是在其N端和C端进行多种蛋白质的融合。类似这样的改造荧光蛋白，虽然不影响GFP的发光，但是，外加的蛋白本身的断裂也不会影响GFP发光。
在病毒复制增殖过程中，均需要有蛋白酶的帮助。例如：人类免疫缺陷病毒（HIV，Human immunodeficiency virus）蛋白酶能够将HIV的gag基因和gag-pol基因表达的多聚蛋白裂解成病毒需要的蛋白。HIV蛋白酶在HIV病毒的成熟与复制过程中起到非常关键的作用，抑制该酶会产生无感染力的子代病毒，从而阻止病毒进一步感染；又如，新冠病毒的多聚蛋白由两种病毒蛋白酶进行裂解，木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro，papain-like protease）和3C样蛋白（3CLpro，3-chymotrypsin like protease），它们分别负责3个位点和11个位点的蛋白裂解。3CLpro是冠状病毒复制所必须的酶，3CLpro由于它的切割特异性很强，可避免脱靶的可能，可作为有效的抗病毒药物靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经改造的荧光报告蛋白，通过在野生型荧光蛋白内部的特定位置插入能被识别并裂解的外源氨基酸序列，而不影响荧光蛋白的发光功能，从而形成一种全新的荧光报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被识别并裂解后，直接破坏了荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭，基于这种现象，可以进行多种应用，比如对蛋白酶活性的评价，对蛋白酶抑制剂效果的评价、抗病毒药物的筛选等。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种荧光报告蛋白，通过改造荧光蛋白而成，具体为：在野生型荧光蛋白的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，插入的外源氨基酸序列不影响荧光蛋白的发光功能；
所述特定位置包括插入区域、插入区域外单独的插入位点；
插入区域为第一插入区域、第二插入区域或第三插入区域，
第一插入区域为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第116-120位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
第二插入区域为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第154-160位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
第三插入区域为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第170-177位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
插入区域外单独的插入位点包括独立位点A、独立位点B，
独立位点A为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第10-11位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
独立位点B为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第139-140位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
所述绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示。
本发明中，第一插入区域为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第116-120位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；对应的氨基酸区域指的是与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上与GFP氨基酸序列的第116-120位氨基酸相对应的位置。其它类似表述的地方参考本处释义。
本发明中能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列可以是两种及以上不同序列的组合。
本发明中对于插入区域的限定还可采用以下方式：第一插入区域为SEQ ID No.2所示氨基酸序列区域（GFP氨基酸序列的第116-120位氨基酸），或与SEQ ID No.2所示氨基酸序列相比具有85%以上序列一致性的氨基酸序列区域；
第二插入区域为SEQ ID No.3所示氨基酸序列区域（GFP氨基酸序列的第154-160位氨基酸），或与SEQ ID No.3所示氨基酸序列相比具有85%以上序列一致性的氨基酸序列区域；
第三插入区域为SEQ ID No.4所示氨基酸序列区域GFP氨基酸序列的第170-177位氨基酸，或与SEQID No.4所示氨基酸序列相比具有85%以上序列一致性的氨基酸序列区域。
本发明经过研究，意外的发现，在荧光蛋白内的某些特定位置（3个区域和两个单独的插入点）插入特定长度的氨基酸序列后，荧光蛋白仍能维持原有发光功能，与现有的改造荧光蛋白在两端外侧的改造不同，本发明的这种改造的荧光插入位点在荧光蛋白序列内部，当插入序列受到破坏时，荧光蛋白的结构同时被破坏，导致荧光淬灭。这样的发现能够给荧光蛋白带来全新的应用，比如与病毒成熟与复制相关的蛋白酶，该类蛋白酶可以作为抗病毒药物的靶点，那么通过本发明的荧光报告蛋白则可以为筛选全新的抗病毒药物服务，当蛋白酶正常发挥功能时荧光蛋白被切割成两部分丧失功能，此时荧光消失；当蛋白酶被抑制时荧光蛋白能够正常发出荧光，根据荧光蛋白的荧光强度还能能正向反映蛋白酶抑制剂的抑制效果。而现有的抗病毒药物筛选方法由于微观不可见，只能通过反复试验再检测验证后确认，耗时耗力，不能直观观测到结果，本发明的荧光报告蛋白应用后则能完成克服。
与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列可以是黄色荧光蛋白YFP、蓝色荧光蛋白BFP、青色荧光蛋白CFP或者绿色荧光蛋白GFP的变体。
插入的外源氨基酸序列的长度小于等于17个氨基酸。插入的外源氨基酸序列过长则会破坏荧光蛋白的发光功能。
所述外源氨基酸序列包括能被病毒蛋白酶切割的蛋白酶切割序列，所述蛋白酶包括与病毒复制相关的蛋白酶。
与病毒复制相关的蛋白酶包括与新型冠状病毒复制相关的蛋白酶、与艾滋病病毒复制相关的蛋白酶、与脊髓灰质炎病毒复制相关的蛋白酶、与登革热病毒复制相关的蛋白酶、与西尼罗河病毒复制相关的蛋白酶、与丙型肝炎病毒复制相关的蛋白酶、与单纯疱疹病毒复制相关的蛋白酶、与手足口病病毒复制相关的蛋白酶、与乙型脑炎病毒复制相关的蛋白酶、与非洲猪瘟病毒复制相关的蛋白酶、与猪繁殖与呼吸综合症病毒复制相关的蛋白酶、与口蹄疫病毒复制相关的蛋白酶、与猫冠状病毒复制相关的蛋白酶。
与新型冠状病毒复制相关的蛋白酶包括3CLpro。
能被病毒蛋白酶切割的蛋白酶切割序列选择SEQ ID No.5- SEQ ID No.34所示序列中的一种或多种的组合。
所述第一插入区域包含多个插入位点，第一插入区域内任意两个氨基酸之间构成插入位点。
所述第二插入区域包含多个插入位点，第二插入区域内任意两个氨基酸之间构成插入位点。
所述第三插入区域包含多个插入位点，第三插入区域内任意两个氨基酸之间构成插入位点。
具体地，当荧光蛋白为GFP时：
所述第一插入区域包括4个插入位点，4个插入位点分别为：GFP氨基酸序列的第116-117位氨基酸，GFP氨基酸序列的第117-118位氨基酸，GFP氨基酸序列的第118-119位氨基酸，GFP氨基酸序列的第119-120位氨基酸。
所述第二插入区域包括6个插入位点，6个插入位点分别为：GFP氨基酸序列的第154-155位氨基酸，GFP氨基酸序列的第155-156位氨基酸，GFP氨基酸序列的第156-157位氨基酸，GFP氨基酸序列的第157-158位氨基酸，GFP氨基酸序列的第158-159位氨基酸，GFP氨基酸序列的第159-160位氨基酸。
所述第三插入区域包括7个插入位点，7个插入位点分别为：GFP氨基酸序列的第170-171位氨基酸，GFP氨基酸序列的第171-172位氨基酸，GFP氨基酸序列的第172-173位氨基酸，GFP氨基酸序列的第173-174位氨基酸，GFP氨基酸序列的第174-175位氨基酸，GFP氨基酸序列的第175-176位氨基酸，GFP氨基酸序列的第176-177位氨基酸。
所述野生型荧光蛋白选择绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白YFP、蓝色荧光蛋白BFP、青色荧光蛋白CFP中的一种。
一种荧光检测试剂盒，包括所述的荧光报告蛋白。
一种核苷酸，其编码所述的荧光报告蛋白。
本发明的有益效果是：本发明通过在野生型荧光蛋白内部的特定位置插入能被识别并裂解的外源氨基酸序列，而不影响荧光蛋白的发光功能，从而形成一种全新的荧光报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被识别并裂解后，直接破坏了荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭，基于这种现象，可以进行多种应用，比如对蛋白酶活性的评价，对蛋白酶抑制剂效果的评价、抗病毒药物的筛选等。
附图说明
图1是GFP的不同位置中插入3CLpro的切割序列后的荧光图；
图2是GFP插入区域115~122aa中插入3CLpro的切割序列后的荧光图；
图3是GFP插入区域153~161aa 中插入3CLpro的切割序列后的荧光图；
图4是GFP插入区域169~178aa中插入3CLpro的切割序列后的荧光图；
图5是GFP上可插入区域示意图；
图6是艾滋病病毒一型的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-HIVcut1代表在GFP的site20位置插入HIV蛋白酶切割序列cut1: RVLAEA，依此类推；
图7是脊髓灰质炎病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-PVcut1代表在GFP的site20位置插入PV蛋白酶切割序列cut1: ALFQGP，依此类推；
图8是登革热病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-DVcut1代表在GFP的site20位置插入DV蛋白酶切割序列cut1: AGRKSLTL，依此类推；
图9是西尼罗病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-WNVcut1代表在GFP的site20位置插入WNV蛋白酶切割序列cut1: SGKRSQIG，依此类推；
图10是单纯疱疹病毒1型的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP8-HSVcut1代表在GFP的site8位置插入HSV蛋白酶切割序列cut1: LVNASSAA，依此类推；
图11是手足口病病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-EV71cut1代表在GFP的site20位置插入EV71蛋白酶切割序列cut1: AVTQGF，依此类推；
图12是乙型脑炎病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-JEVcut1代表在GFP的site20位置插入JEV蛋白酶切割序列cut1: AGKRSAIS，依此类推；
图13是猫冠状病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-FCoVcut1代表在GFP的site20位置插入FCoV蛋白酶切割序列cut1: STLQSGLR，依此类推；
图14是非洲猪瘟病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-ASFVcut1代表在GFP的site20位置插入ASFV蛋白酶切割序列cut1: GYFNGGGDK，依此类推；
图15是口蹄疫病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-FMDVcut1代表在GFP的site20位置插入FMDV蛋白酶切割序列cut1: AEKQLKAR，依此类推；
图16是猪蓝耳病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP20-PRRSVcut1代表在GFP的site20位置插入PRRSV蛋白酶切割序列cut1: SLLEGAFR，依此类推；
图17是丙肝病毒的蛋白酶切割序列插入GFP三个插入区域后的荧光图，GFP24-HCVcut1代表在GFP的site24位置插入HCV蛋白酶切割序列cut1: DEMEECSQHL；
图18是不同外源蛋白酶切割序列的组合插入GFP之后的荧光图
图19是改造后的GFP在蛋白酶共表达时效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
pcDNA3.1(+),pCMV,pCAGGS是目前最常用的哺乳动物表达载体, 载体具有高拷贝数与高表达量的优点，可用于本发明中的质粒构建与外源基因表达。本发明实施例以pcDNA3.1(+)表达载体为例对具体发明内容进行阐述，具体质粒构建过程：一、利用DNA聚合酶（Primer Star）进行PCR扩增得到相应片段；二、各片段利用同源重组酶（Uniclone OneStep Seamless Cloning Kit试剂盒）进行重组并转化到感受态细胞中；三、挑取单菌落并使用通用载体引物及Taq酶进行菌落PCR，送测正确条带大小的PCR产物；四、对测序正确的菌落克隆提取质粒。
GFP的氨基酸序列：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*（SEQ ID No.1）。
实施例1：
本实施例以新冠病毒3C样蛋白酶（3CLpro）和该酶相应的切割序列AVLQSGFR （SEQID No.5）进行实施。
一、GFP中可插入蛋白酶切割序列位置的初步寻找
按照Primer Star酶（Takara）说明书对GFP和常用表达载体进行PCR扩增，本发明实施例以pcDNA3.1(+)载体（市售）为例。将GFP基因序列（SEQ ID NO.36）通过同源重组方式（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）克隆到pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点（MCS）之间构建pGFP质粒，作为后续的模板和对照。
随后通过同源重组技术（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）在GFP的不同位置中插入3CLpro的切割序列SEQ ID NO.5：AVLQSGFR（编码核苷酸序列为SEQID NO.35：gctgttttgcagagtggttttaga）构建一系列表达改造GFP的质粒pGFP1-COVID19，pGFP2-COVID19，pGFP3-COVID19,…,pGFP 45-COVID19。其中，GFP1~45代表在表1中对应的site1~45插入蛋白酶切割序列后，所形成的含有蛋白酶切割序列的荧光蛋白，例如：GFP8代表在GFP的119~120aa（site8）位置氨基酸之间插入蛋白酶切割序列；GFP8-COVID19则代表在GFP的119~120aa（site8）位置氨基酸之间插入蛋白酶切割序列AVLQSGFR；对应的，pGFP8-COVID19代表在GFP的119~120aa（site8）位置氨基酸之间插入蛋白酶切割序列AVLQSGFR后所形成的质粒。
表1.site1~45位点位置
对构建好的pGFP1~45-COVID19质粒进行转染。293T细胞具有生长快和蛋白表达水平高等优点，因此本发明选择293T细胞为质粒转染的对象。准备生长良好的293T细胞，向293T细胞中加入10%FBS DMEM培养基，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。待293T细胞生长到70%~80%密度时进行转染实验，根据孔板大小确定质粒转染量，在本实施例中，6孔板质粒转染量为2μg。转染后每隔24 h观察细胞状态，48h后进行荧光拍照。
由图1可知，在所选择的45个插入3CLpro蛋白酶切割序列的位点中，仅有19个位点，即 site8/11/15/19/20/23/24/25/28/31/34/35/36/37/38/39/40/43/45（备注：“/”表示“或”的意思，下同）能够兼容外源蛋白酶切割序列且对GFP荧光发生不产生影响或者产生有限影响。其余位点在插入3CLpro蛋白酶切割序列后，均不能检测到GFP的荧光，例如site6/10/13/22/27等。其中，Site19、Site25为单独的插入位点在插入3CLpro蛋白酶切割序列后仍能激发出绿色荧光。
在寻找GFP可插入蛋白酶切割序列位置的时候，发明人的思路如下：
1.首先，随机选择了site1~30构建了相应的pGFP1~30-COVID19质粒进行细胞转染。在转染后发现，在以上30个位点中，site8/20/23位点在GFP的位置上接近，site15/24位点在GFP的位置上接近，site11/28位点在GFP的位置上接近，因此推测，在GFP中存在较为灵活的位点区域，在该区域插入蛋白酶切割序列后，GFP的发光功能不受影响，仍然能够激发出绿色荧光。
2.随后，在以上位点的上下游区域进一步探索是否存在其他位点可以兼容外源蛋白酶切割序列。为此，发明人构建了pGFP31~45-COVID19质粒转染细胞并观测荧光表达情况。经过验证，GFP中确实存在高灵活性区域，最终筛选到三个高灵活性区域，分别如表2-表4所示。
对应的，参见图2可知，当插入位点位置位于116~120aa（site23/20/31/8）时，改造后的GFP仍能激发出不同程度的绿色荧光。即，GFP氨基酸序列中存在外源蛋白酶切割序列可插入区域1:116~120aa（参见表2），该区域氨基酸序列为SEQ ID NO.2：EGDTL，区域近邻位点Site22和Site32/33均检测不到荧光。
表2.区域1及附近位点位置
。
参见图3可知，当插入位点位置位于154~160aa（site34/35/36/15/24/43）时，改造后的GFP仍能激发出不同程度的绿色荧光。即，GFP氨基酸序列中存在外源蛋白酶切割列可插入区域2：154~160aa（参见表3），该区域氨基酸序列为SEQ ID NO.3：MADKQKN，区域近邻位点Site42和Site27均检测不到荧光。
表3.区域2及附近位点位置
。
参见图4可知，当插入位点位置位于170~177aa（site37/38/39/11/39/28/40）时，改造后的GFP仍能激发出不同程度的绿色荧光。GFP氨基酸序列中存在外源蛋白酶切割序列可插入区域3：170~177aa（参见表4），该区域的氨基酸序列为SEQ ID NO.4：HNIEDGSV，区域近邻位点Site44和Site41均检测不到荧光。
表4.区域3及附近位点位置
。
上述结果表明，在GFP上存在部分区域在插入数个蛋白酶切割序列后，GFP仍能发出绿色荧光，这些区域包括：区域1：116~120aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；区域2：154~160aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示 以及区域3：170~177aa，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示（图5）。
实施例2-29
为了验证上述三个区域能够兼容外源病毒蛋白酶切割序列，发明人验证了其他病毒蛋白酶切割序列插入GFP上述三个区域后，GFP荧光情况，质粒构建方法参考实施例1。其他病毒及蛋白酶切割序列见表5。
表5.病毒及对应的蛋白酶切割序列
。
如图6~17所示，结果表明，在GFP上本发明限定的三个插入区域内，插入不同病毒和本发明限定长度内不同大小的蛋白酶切割序列，GFP仍能发出绿色荧光。
为了进一步验证上述位点/区域可兼容不同外源蛋白酶切割序列的组合以及探索最大插入长度，本发明将两种病毒来源的蛋白酶切割序列连接插入GFP。
如图18所示，不同外源蛋白酶切割序列的组合插入GFP之后，仍然能够检测到荧光表达。
验证改造后的GFP在蛋白酶共表达时效果
为了验证蛋白酶对改造后的GFP的裂解效果，选择实施例1中的质粒 pGFP8-COVID19, pGFP20-WNVcut2和pGFP15-EV71cut1，利用PCR扩增（Primer Star）及同源重组技术（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）在这些质粒的GFP后插入对应病毒的蛋白酶，中间用P2A进行连接，获得可以共表达蛋白酶的质粒pGFP8-COVID19-P2A-3CLpro，pGFP20-WNVcut2-P2A- NS2B/NS3以及pGFP15-EV71cut1-P2A-3C。
对以上质粒参照实施例1的方法进行细胞转染，并观察荧光强度。
实验结果如下：图19可见，含有蛋白酶切割序列的GFP和对应病毒蛋白酶共表达后，绿色荧光明显消失，说明蛋白酶可以切割改造后的GFP，即改造后的GFP可以成为指示蛋白酶活性的报告蛋白。
GFP基因序列：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA（SEQ ID NO.36）。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (11)

1.一种荧光报告蛋白，其特征在于：通过改造野生型荧光蛋白而成，具体为：在野生型荧光蛋白的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，插入的外源氨基酸序列不影响荧光蛋白的发光功能；
所述特定位置包括插入区域、插入区域外单独的插入位点；
插入区域为第一插入区域、第二插入区域或第三插入区域，
第一插入区域为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第116-120位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
第二插入区域为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第154-160位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
第三插入区域为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第170-177位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
插入区域外单独的插入位点包括独立位点A、独立位点B，
独立位点A为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第10-11位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
独立位点B为绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列的第139-140位氨基酸，或与绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列相比具有95%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
所述绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的荧光报告蛋白，其特征在于：插入的外源氨基酸序列的长度小于等于17个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的荧光报告蛋白，其特征在于：所述外源氨基酸序列包括能被病毒蛋白酶切割的蛋白酶切割序列，所述蛋白酶包括与病毒复制相关的蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的荧光报告蛋白，其特征在于：与病毒复制相关的蛋白酶包括与新型冠状病毒复制相关的蛋白酶、与艾滋病病毒复制相关的蛋白酶、与脊髓灰质炎病毒复制相关的蛋白酶、与登革热病毒复制相关的蛋白酶、与西尼罗河病毒复制相关的蛋白酶、与丙型肝炎病毒复制相关的蛋白酶、与单纯疱疹病毒复制相关的蛋白酶、与手足口病病毒复制相关的蛋白酶、与乙型脑炎病毒复制相关的蛋白酶、与非洲猪瘟病毒复制相关的蛋白酶、与猪繁殖与呼吸综合症病毒复制相关的蛋白酶、与口蹄疫病毒复制相关的蛋白酶、与猫冠状病毒复制相关的蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的荧光报告蛋白，其特征在于：与新冠病毒复制相关的蛋白酶包括3CLpro。
6. 根据权利要求3所述的荧光报告蛋白，其特征在于：能被病毒蛋白酶切割的蛋白酶切割序列选择SEQ ID No.5- SEQ ID No.34所示序列中的一种或多种的组合。
7.根据权利要求1所述的荧光报告蛋白，其特征在于：所述第一插入区域包含多个插入位点，第一插入区域内任意两个氨基酸之间构成插入位点。
8.根据权利要求1所述的荧光报告蛋白，其特征在于：所述第二插入区域包含多个插入位点，第二插入区域内任意两个氨基酸之间构成插入位点。
9.根据权利要求1所述的荧光报告蛋白，其特征在于：所述第三插入区域包含多个插入位点，第三插入区域内任意两个氨基酸之间构成插入位点。
10.一种荧光检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的荧光报告蛋白。
11.一种核苷酸，其特征在于：其编码权利要求1所述的荧光报告蛋白。
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