CN102649819A - 一种hcv蛋白酶抑制剂筛选模型 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型。本发明提供了融合蛋白(a)或(b)：(a)自N端至C端依次含E173N片段、特异多肽片段和E173C片段；(b)自N端至C端依次含E173N片段、特异多肽片段、E173C片段、2A片段和NS3/4A片段；E173N片段如序列4第1至173位所示；E173C片段如序列4自第187至252位所示；特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别；2A片段如序列6第253至279位所示；NS3/4A片段如序列6第280至479位所示。利用上述融合蛋白可从蛋白、多肽文库以及天然产物中筛选NS3-4A蛋白酶抑制剂，为HCV感染治疗提供候选药物分子，并为高通量筛选多种蛋白酶抑制剂奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型，特别涉及一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型的构建与应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染严重危害人类生命健康。据世界卫生组织统计，全世界有超过1.7亿人受到HCV的慢性感染(Sy T，Jamal MM.Epidemiologyof hepatitis C virus(HCV)infection.Int J Med Sci.2006，3(2)：41-6)。我国有约4000万HCV感染患者，HCV感染已成为严重的世界公共卫生问题之一。HCV感染可转变为慢性肝炎，甚至发展为肝硬化和肝癌。当前采用的最有效的治疗方案是α-干扰素和利巴韦林联合治疗，但这种治疗方法疗效低于50％，且费用高，副作用大，因此，研制新的抗HCV药物是当前重要而且紧迫的任务。
HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股、正链RNA。HCV基因组全长约9.6kb，由两侧非编码区(UTR)及位于其间的单一开放阅读框组成。5′-UTR含有内部核糖体进入位点(IRES)，非常保守，核糖体与其结合启动翻译过程；3′-UTR对与复制起始有关。开放读码框编码大约3010～3033个氨基酸的多聚蛋白前体。该蛋白前体在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的共同作用下生成4个结构蛋白和至少6个非结构(non-structure，NS)蛋白。按顺序依次为core-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。其中，C2，E1，E2，P7为结构蛋白区，在宿主细胞信号肽的作用下分别裂解成核蛋白和包膜蛋白；NS2-NS5为非结构蛋白区。HCV多聚蛋白前体的加工过程是：结构蛋白core，E1，E2和P7被宿主信号肽酶切开，均固定在膜上。NS2的N端也被宿主信号肽酶切开，NS2 94-217位氨基酸与NS3 1-180位氨基酸构成NS2/3丝氨酸蛋白酶，在NS2-NS3连接处产生切割(顺式切割)，释放出NS3(NS3 181-631位氨基酸是RNA解旋酶)，NS3丝氨酸蛋白酶对其下游的四个连接位点进行切割，释放出NS4A，NS4B(内质网锚定蛋白)，NS5A(RNA结合蛋白)，NS5B(RNA依赖的RNA聚合酶)(Lorenz IC，Marcotrigiano J，Dentzer TG，et al.Structure of the catalytic domain of thehepatitis C virus NS2-3protease[J].Nature，2006，442(7104)：831-835.)。
HCV NS3蛋白是一个具有多功能生物活性的非结构蛋白，在HCV复制和致病机制中起着非常关键的作用(O tsuka M，Kato N，L an K，et al.Hepatitis C Virus CoreProtein Enhances p53 Function through Augmentation of DNA Binding Affinity andTranscriptional Ability[J].J Biol Chem.2000Nov 3；275(44)：34122-30.)。NS3基因位于丙型肝炎病毒全基因组序列约3300～5200nt区域，编码含有630个氨基酸(1027-1656aa)的NS3蛋白。其N末端1/3具有丝氨酸蛋白酶活性，C末端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPase)和RNA解旋酶活性。其中，NS3丝氨酸蛋白酶是HCV整个非结构蛋白加工和成熟过程中的关键酶，它必须在NS4A的辅助作用下，二者形成异源二聚体，才能发挥酶活性，因此又常被称为NS3/4A蛋白酶(Satoh S，Tanji Y，HijikataM，et al.TheN-terminal region of hepatitis C virus nonstructural protein 3(NS3)isessential for stable complex formation with NS4A[J].J Virol，1995，69(7)：4255-4260.)。晶体衍射结构表明，NS4A中间的中央疏水区(21～34aa)与NS3的N末端22个氨基酸形成β片层，是酶发挥活性的必需结构要求(Kim J L，Morgenstern K A，Lin C，et al.Crystal structure of the hepatitis C virus NS3 protease domaincomplexed with a synthetic NS4A cofactor peptide[J].Cell，1996，87(2)：343-355.)。而NS4A(21～34aa)可以被合成的多肽所代替，或通过连接子与NS3的N末端180aa直接相连为单链蛋白，不影响酶活性功能的发挥。NS3丝氨酸蛋白酶在4个连接区域切割多聚蛋白前体，以顺式方式催化NS3/NS4A裂解(自我剪切)，反式方式催化NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B裂解，释放出多个重要的病毒活性酶(Bartenschlager R，Ahlborn-Laake L，Mous J，Jacobsen H.Nonstructural protein3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase required forcleavage at the NS3/4and NS4/5junctions[J].J Virol.1993 Jul；67(7)：3835-44.；Eckart，M.R.，Selby，M.，Masiarz，F.，et al.The hepatitis C virus encodesa serine protease involved in processing of the putative nonstructural proteinsfrom the viral polyprotein precursor[J].Biochem Biophys Res Commun.1993 Apr30；192(2)：399-406.)。对各位点的切割效率大小比较为：NS5A/NS5B＞NS4A/NS4B＞＞NS4B/NS5A(Landro JA，Raybuck SA，Luong YP，et al.Mechanistic role of anNS4A peptide cofactor with the truncated NS3 protease of hepatitis C virus：elucidation of the NS4A stimulatory effect via kinetic analysis and inhibitormapping.Biochemistry[J].1997Aug 5；36(31)：9340-9348.；Steinkühler C，UrbaniA，Tomei L，Biasiol G，et al.Activity of purified hepatitis C virus proteaseNS3 on peptide substrates[J].J Virol.1996 Oct；70(10)：6694-700.)。NS3丝氨酸蛋白酶除参与病毒复制成熟的过程外，还可以抑制细胞内抗病毒因子IRF-3(IFN调节因子3)的活性和下游干扰素诱导的抗病毒效应，从而抑制细胞内抗病毒反应(Gale MJr，Foy EM.Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus[J].Nature.2005，436(7053)：939-945.)。也就是说，抑制NS3丝氨酸蛋白酶的活性，不仅可以阻断病毒复制，还可以提升的宿主抗病毒反应能力。因此，NS3丝氨酸蛋白酶已经成为研制抗HCV药物和疫苗的重要靶点。
鉴于蛋白酶抑制剂在治疗HIV感染方面已有成功经验，以蛋白酶为靶标寻找特异有效的治疗药物成为HCV防治的研究热点。许多研究机构与制药企业已经开始了HCV NS3丝氨酸蛋白酶选择性抑制剂的研发。目前进入临床试验的候选药物VX-950，SCH-503034，ACH-806与MK-7009等与PEG-IFNα联用虽然都显著提高了SVR(提高至55-69％)，但是，他们也都具有较严重的副反应，包括皮疹、瘙痒、贫血甚至心、肾功能紊乱。因此，继续寻找安全有效的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂十分必要。
由于HCV体外复制模型和小动物感染模型尚未建立，目前主要通过评价病毒蛋白酶的活性来进行药物筛选。由于候选药物分子最好可在细胞内评价，因此，建立一种细胞水平上的酶活性检测系统，对于高通量筛选抗HCV药物具有重要意义。一般而言，评价任何酶抑制剂的体系有：动物模型、细胞模型和体外酶活性测定系统三个层次。动物模型虽然最接近于人体环境，但是由于操作繁琐，费用高昂，它不适合作为初筛特别是高通量筛选使用。而且针对HCV，尚无小动物感染模型。体外酶活性检测，是以NS3丝氨酸蛋白酶识别序列连接的融合蛋白为底物，纯化的NS3/4A融合蛋白作为酶，借助放射免疫检测、荧光检测等多种手段进行检测，虽然适用于高通量筛选，但是样品需要进行纯化，步骤繁琐而且活性较低，其反应条件也距离生理条件较远，也不是理想的筛选模型。细胞模型相比前两者具有诸多优势：1、待测分子可以在细胞内直接表达，其结构及活性都接近生理状态，同时可避免纯化蛋白的过程；2、可以同时测定药物的细胞毒性；3、可实现高通量筛选；4、有机会筛选到在细胞内代谢的药物，其代谢产物具有生物活性。因此，建立适当的细胞模型是当前各种酶抑制剂筛选的首选任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型，特别涉及一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型的构建与应用。
本发明提供了一种融合蛋白，为如下(a)或(b)：
(a)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白质：E173N片段、特异多肽片段和E173C片段；
(b)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白质：E173N片段、特异多肽片段、E173C片段、2A片段和识别所述特异多肽片段的蛋白酶；
所述(a)中：所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第1至173位氨基酸残基(与序列6自N末端第1至173位氨基酸残基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸残基所示(与序列6自N末端第187至252位氨基酸残基相同)；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别。所述(a)中，所述特异多肽片段可为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸残基(与序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸残基相同)所示。所述(a)具体可为序列表的序列4所示的蛋白质。
所述(b)中：所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第1至173位氨基酸残基(与序列4自N末端第1至173位氨基酸残基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸残基所示(与序列4自N末端第187至252位氨基酸残基相同)；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被所述蛋白酶识别。所述(b)中，所述特异多肽片段可为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸残基(与序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸残基相同)所示；所述蛋白酶的氨基酸序列可如序列表的序列6自N末端第280至479位氨基酸残基所示(NS3/4A片段)。所述(b)具体可为序列表的序列6所示的蛋白质。
编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因可为DNA分子甲或DNA分子乙。
所述DNA分子甲自5’末端至3’末端依次含有如下元件：E173N片段的编码基因、特异多肽片段的编码基因和E173C片段的编码基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第1至173位氨基酸残基(与序列6自N末端第1至173位氨基酸残基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸残基所示(与序列6自N末端第187至252位氨基酸残基相同)；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别。所述DNA分子甲中，所述特异多肽片段可为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸残基(与序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸残基相同)所示。所述DNA分子甲中，所述E173N片段的编码基因可如序列表的序列5自5’末端第1至519位核苷酸(与序列表的序列7自5’末端第1至519位核苷酸相同)所示；所述特异多肽片段的编码基因可如序列表的序列5自5’末端第520至558位核苷酸(与序列表的序列7自5’末端第520至558位核苷酸相同)所示；所述E173C片段的编码基因可如序列表的序列5自5’末端第559至756位核苷酸(与序列表的序列7自5’末端第559至756位核苷酸相同)所示。所述DNA分子甲具体可为序列表的序列5所示的DNA。
所述DNA分子乙自5’末端至3’末端依次含有如下元件：E173N片段的编码基因、特异多肽片段的编码基因、E173C片段的编码基因、2A片段的编码基因和蛋白酶的编码基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第1至173位氨基酸残基(与序列4自N末端第1至173位氨基酸残基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸残基所示(与序列4自N末端第187至252位氨基酸残基相同)；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被所述蛋白酶识别。所述DNA分子乙中，所述特异多肽片段可为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸残基(与序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸残基相同)所示；所述蛋白酶的氨基酸序列可如序列表的序列6自N末端第280至479位氨基酸残基所示(NS3/4A片段)。所述DNA分子乙中，所述E173N片段的编码基因可如序列表的序列7自5’末端第1至519位核苷酸(与序列表的序列5自5’末端第1至519位核苷酸相同)所示；所述特异多肽片段的编码基因可如序列表的序列7自5’末端第520至558位核苷酸(与序列表的序列5自5’末端第520至558位核苷酸相同)所示；所述E173C片段的编码基因可如序列表的序列7自5’末端第559至756位核苷酸(与序列表的序列5自5’末端第559至756位核苷酸相同)所示；所述2A片段的编码基因可如序列表的序列7自5’末端第757至837位核苷酸所示；所述蛋白酶的编码基因可如序列表的序列7自5’末端第838至1437位核苷酸所示。所述DNA分子乙具体可为序列表的序列7所示的DNA。
含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组质粒pET-28a-E1735AB、重组质粒pcDNA3.1-E1735AB或重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A；所述重组质粒pET-28a-E1735AB为将所述DNA分子甲插入pET-28a(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒pcDNA3.1-E1735AB为将所述DNA分子甲插入pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A为将所述DNA分子乙插入pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒。
所述重组菌为含有所述重组载体的宿主菌，所述宿主菌优选为大肠杆菌，如大肠杆菌(E.coli)DH5α或大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。
本发明还保护一种蛋白酶抑制剂筛选模型，为如下(I)或(II)：
(I)转入重组质粒甲和重组质粒乙的宿主菌；所述重组质粒甲含有所述DNA分子甲；所述重组质粒乙含有可识别所述特异多肽片段的蛋白酶的编码基因；
(II)转入重组质粒丙的哺乳动物细胞；所述重组质粒丙含有所述DNA分子乙。
所述蛋白酶抑制剂可为NS3-4A蛋白酶抑制剂；所述NS3-4A蛋白酶的氨基酸序列如序列表的序列2所示。
所述重组质粒乙中，所述蛋白酶可如序列表的序列2所示(NS3/4片段)。所述重组质粒乙可为重组质粒pET-22b-NS3/4A；所述重组质粒pET-22b-NS3/4A为将序列表的序列3所示DNA插入pET-22b(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒。
所述重组质粒甲具体可为所述重组质粒pET-28a-E1735AB。
所述重组质粒丙具体可为所述重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A。
所述宿主菌优选为大肠杆菌，如大肠杆菌(E.coli)DH5α或大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。
所述哺乳动物细胞优选为HEK293A或CHO-K1细胞。
所述蛋白酶抑制剂筛选模型可用于筛选蛋白酶抑制剂。所述蛋白酶具体可为序列表的序列2所示的NS3-4A蛋白酶。
丙型肝炎病毒感染是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要致病因素之一，已成为全球性的公共卫生问题。目前尚无疫苗和理想的治疗药物。由于尚未建立适用于不同亚型的HCV体外复制模型和小动物感染模型，极大地限制了抗HCV药物的筛选。因此目前主要通过评价病毒蛋白酶的活性来进行药物筛选。鉴于候选药物分子最好可在细胞环境中评价，因此，建立一种细胞水平上的酶活性检测系统，对于高通量筛选抗HCV药物具有重要意义。HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在病毒加工成熟中起着关键的作用，是开发抗HCV药物的理想靶点。本发明以EGFP为报告基因，利用NS3/4A蛋白酶对其底物的特异性识别与切割，在EGFP分子内适当位置插入一段含有NS3/4A蛋白酶识别序列的短肽，再将该EGFP分子与NS3/4A蛋白酶共表达，构建NS3/4A蛋白酶抑制剂筛选模型。由于NS3/4A蛋白酶可以识别并切割EGFP分子内部插入的短肽，从而将EGFP分为两段，筛选模型自身不能被激发出荧光。在筛选模型中加入候选的蛋白酶抑制剂后，如果该抑制剂可以抑制NS3-4A蛋白酶活性，EGFP分子就不会被切断，则筛选模型可以被激发出荧光。这样利用所述筛选模型，通过观测EGFP分子荧光信号的有无即可判断NS3-4A蛋白酶活性是否受到抑制，从而可以高通量的从蛋白与多肽文库以及天然产物中筛选NS3-4A蛋白酶抑制剂，为HCV感染治疗提供候选药物分子。此外，如果选用不同的酶及其相应底物替换NS3/4A蛋白酶及其识别序列，该模型尚可灵活应用于其它多种酶抑制剂的筛选，为今后高通量筛选多种其它蛋白酶抑制剂奠定基础。
附图说明
图1为获得E173N基因片段和E173C基因片段的PCR扩增鉴定电泳图；M：DL2000；1：E173N基因片段；2：E173C基因片段。
图2为E173N和E173C转化pET-28a-E173N和pET-22b-E173C重组菌重组质粒的菌落PCR鉴定电泳图；A：pET-28a-E173N，M为DL2000，1-7：菌落PCR鉴定为阳性克隆；B：pET-22b-E173C，M为DL2000，1-7：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图3为E1735AB基因片段构建过程的鉴定电泳图；A：E173N-5AB基因片段和5AB-E173C基因片段，M为DL2000，1和2为E173N-5AB基因片段，3和4为5AB-E173C基因片段；B：融合E173N-5AB基因片段和5AB-E173C基因片段获得了E1735AB基因片段，M为DL2000，1为E1735AB基因片段。
图4为转化pET-28a-E1735AB重组质粒的菌落PCR鉴定电泳图；M：DL2000；1-8：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图5为获得EGFP基因片段的PCR扩增电泳图；M：DL2000 plus；1：EGFP基因。
图6为转化pET-28a-EGFP重组质粒的菌落PCR鉴定电泳图；M：DL2000 plus；1-8：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图7为获得NS3/4A基因片段的PCR扩增电泳图；A：第一轮PCR扩增，M为DL2000，1为PCR扩增产物；B.：第二轮PCR扩增，M为DL2000 plus，1为PCR扩增产物。
图8为pET-22b-NS3/4A重组质粒的菌落PCR鉴定电泳图；M：DL2000plus；1-8：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图9为诱导前后重组菌I、II和IV菌液的SDS-PAGE电泳图；M：ProteinRuler II；1：诱导后的BL21(DE3)；2：诱导前的重组菌I；3：诱导后的重组菌I；4：诱导前的重组菌II；5：诱导后的重组菌II；6：诱导前的重组菌IV；7：诱导后的重组菌IV。
图10为诱导前后重组菌V、VI和VIII菌液的SDS-PAGE电泳图；M：ProteinRuler II；1：诱导后的BL21(DE3)；2：诱导前的重组菌VIII；3：诱导后的重组菌VIII；4：诱导前的重组菌V；5：诱导后的重组菌V；6：诱导前的重组菌VI；7：诱导后的重组菌VI。
图11为诱导前后重组菌III、VII和VIII菌液的SDS-PAGE电泳图；M：ProteinRuler II；1：诱导后的BL21(DE3)；2：诱导前的重组菌VIII；3：诱导后的重组菌VIII；4：诱导前的重组菌III；5：诱导后的重组菌III；6：诱导前的重组菌VII；7：诱导后的重组菌VII。
图12为诱导后重组菌的绿色荧光；A：重组菌I；B：重组菌II；C：重组菌III；重组菌IV。
图13为诱导后重组菌的绿色荧光；A：重组菌V；B：重组菌VI；C：重组菌III；重组菌VII。
图14为pcDNA3.1(+)质粒的线性化鉴定电泳图；M：DL2000plus；1：pcDNA3.1(+)；2、3：经Hind III和Xba I酶切处理的pcDNA3.1(+)。
图15为克隆E1735AB基因片段的PCR扩增和转化至pcDNA3.1-E1735AB重组菌的菌落PCR鉴定电泳图；A：PCR扩增电泳图，M为DL2000 plus，1为PCR扩增产物；B为菌落PCR电泳图，M为DL2000 plus，1-8：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图16为重叠延伸PCR扩增获得E173N-2A-E173C基因片段制备过程的电泳图；A：E173N-2A基因片段和2A-E173C基因片段，M为DL2000，1和2为E173N-2A基因片段，3和4为2A-E173C基因片段；B：E173N-2A-E173C基因片段，M为DL2000，1为E173N-2A-E173C基因片段。
图17为pcDNA3.1-E173N-2A-E173C重组菌的菌落PCR鉴定电泳图；M：DL2000 plus，1-7：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图18为重叠延伸PCR扩增获得E1735AB-2A-NS3/4A基因片段制备过程的电泳图；A：E1735AB-2A基因片段和2A-NS3/4A基因片段，M为DL2000，1和2为E1735AB-2A基因片段，3和4为2A-NS3/4A基因片段；B：E1735AB-2A-NS3/4A基因片段，M为DL2000，1为E1735AB-2A-NS3/4A基因片段。
图19为pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A重组质粒的菌落PCR鉴定电泳图；M：DL2000plus，1-10：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图20为重叠延伸PCR扩增获得EGFP-2A-NS3/4A基因片段制备过程的电泳图；A：EGFP-2A基因片段和2A-NS3/4A基因片段，M为DL2000，1和2为EGFP-2A基因片段，3和4为2A-NS3/4A基因片段；B：EGFP-2A-NS3/4A基因片段，M为DL2000，1为EGFP-2A-NS3/4A基因片段。
图21为pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A重组菌的菌落PCR鉴定电泳图；M：DL2000 plus，1-8：菌落PCR鉴定为阳性克隆。
图22为不同质粒转染后细胞的绿色荧光情况；A：pcDNA3.1-EGFP；B：pcDNA3.1-E1735AB；C：pcDNA3.1-E173N-2A-E173C。
图23为不同质粒转染后细胞的绿色荧光情况；甲：HEK293A细胞，乙：CHO-K1细胞；图甲和图乙中：A：pcDNA3.1-EGFP，B：pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A，C：pcDNA3.1-E1735AB，D：pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自试剂供应商购买得到的。ATCC即American type culture collection的缩写，网址为www.atcc.org。大肠杆菌(E.coli)DH5α和大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)购自北京天根生物技术有限公司。pIRES2-EGFP载体购自Clontech公司。pET-28a(+)载体和pET-22b(+)载体为Merck公司产品。pcDNA3.1(+)载体为invi trogen公司产品。HEK293A细胞：ATCC产品，ATCC编号为CRL-1573。CHO-K1细胞：ATCC产品，ATCC编号为CCL-61。
RB2-HCV质粒由Sollazo教授惠赠；公众可以从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得；参考文献Dimasi N，Pasquo A，Martin F，Di Marco S，SteinkühlerC，Cortese R，Sollazzo M.Engineering，characterization and phage display ofhepatitis C virus NS3 protease and NS4A cofactor peptide as a single-chainprotein.Protein Eng.1998 Dec；11(12)：1257-65.
实施例1、原核细胞中E1735AB片段对NS3/4A片段的识别作用
一、重组质粒的构建
1、重组质粒pET-28a-E173N的构建
(1)E173N基因片段的克隆
设计正向引物E173N-FP和反向引物E173N-RP。
E173N-FP：5’-ATA CCATGG TGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3’：
E173N-RP：5’-AA GGATCC TCATTATTAGCAGCAGACGACGTCCTCGCTAGCCTCGATGTTGTGGCGGAT-3’。
正向引物含有Nco I酶切位点；反向引物含有BamH I酶切位点，并引入终止密码子和NS5A序列(下划线标注NS5A序列)。靶序列为EGFP基因(序列表的序列1)自5’末端第1至519位核苷酸。
以pIRES2-EGFP质粒为模板，用E173N-FP和E173N-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约540bp的E173N基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1的泳道1。
(2)重组质粒pET-28a-E173N的构建
回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Nco I和BamH I双酶切后连接到进行相同酶切处理的pET-28a(+)载体上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用E173N-FP和E173N-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图2A。由图可见，PCR鉴定全为阳性克隆，且片段大小与预期相同。
挑取2个阳性克隆测序，测序结果表明，得到了重组质粒pET-28a-E173N。
2、重组质粒pET-22b-E173C的构建
(1)E173C基因片段的克隆
设计正向引物E173C-FP和反向引物E173C-RP。
E173C-FP：5’-AA CATATG TCGATGTCCTACACAGACGGCAGCGTGCAGCTCGCC-3’；
E173C-RP：5’-AA GGATCC TCATTATTA CTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。
正向引物含有Nde I酶切位点，并引入NS5B序列(下划线标注NS5B序列)；反向引物含有BamH I酶切位点，并引入终止密码子。靶序列为EGFP基因(序列表的序列1)自5’末端第520至717位核苷酸。
以pIRES2-EGFP质粒为模板，用E173C-FP和E173C-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约210bp的E173C基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1的泳道2。
(2)重组质粒pET-22b-E173C的构建
回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切后连接到进行相同酶切处理的pET-22b(+)载体上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用E173C-FP和E173C-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图2B。由图可见，PCR鉴定全为阳性克隆，且片段大小与预期相同。
挑取2个阳性克隆测序，测序结果表明，得到了重组质粒pET-22b-E173C。
3、重组质粒pET-28a-E1735AB的构建
(1)E1735AB基因的克隆
①E173N-5AB基因片段的克隆
扩增E173N-5AB基因片段的引物为正向引物E173N-FP和反向引物E173N-L-RP。
E173N-L-RP：5’-TCGAGCAGCAGACGACGTCCTCGCTAGCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTG-3’。
反向引物引入NS5A序列(下划线标注NS5A序列)，作为接头序列。靶序列为EGFP基因(序列表的序列1)自5’末端第1至519位核苷酸。
以pIRES2-EGFP质粒为模板，用E173N-FP和E173N-L-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约550bp的E173N-5AB基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图3A的泳道1和泳道2。
②5AB-E173C基因片段的克隆
扩增E173N-5AB基因片段的引物为正向引物E173C-L-FP和反向引物E173C-RP。
E173C-L-FP：5’-CGTCGTCTGCTGCTCGATGTCCTACACAGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCG-3’。
正向引物引入NS5B序列(下划线标注NS5B序列)，作为接头序列。靶序列为EGFP基因(序列表的序列1)自5’末端第520至717位核苷酸。
以pIRES2-EGFP质粒为模板，用E173C-L-FP和E173C-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约220bp的5AB-E173C基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图3A的泳道3和泳道4。
③采用重叠PCR的方法扩增E1735AB基因片段
分别回收步骤①和步骤②的PCR扩增产物。同时将步骤①和步骤②的PCR扩增产物作为模板，用E173N-FP和E173C-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约750bp的E1735AB基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图3B。
(2)重组质粒pET-28a-E1735AB的构建
回收步骤(1)的PCR扩增产物，用限制性内切酶Nco I和BamH I双酶切后连接到进行相同酶切处理的pET-28a(+)载体上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用用E173N-FP和E173C-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图4。由图可见，PCR鉴定全为阳性克隆，且片段大小与预期相同。
挑取2个阳性克隆测序，测序结果表明，得到了重组质粒pET-28a-E1735AB。重组质粒pET-28a-E1735AB：在骨架载体pET-28a(+)的Nco I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的DNA(序列5所示DNA编码序列表的序列4所示的蛋白质)。
序列5所示DNA中，自5’末端第1至519位核苷酸为E173N基因片段，第520至558位核苷酸为识别短肽NS5A/5B的编码序列(其中第520至543位为NS5A序列，第544至558位为NS5B序列)，第559至756位核苷酸为E173C基因片段。序列4所示蛋白质中，自N末端第1至173位氨基酸残基为E173N片段，第174至186位氨基酸残基为识别短肽NS5A/5B，第187至252氨基酸残基为E173C片段。
4、重组质粒pET-28a-EGFP的构建
(1)EGFP基因的克隆
以pIRES2-EGFP为模板，用E173N-FP和E173C-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约710bp的EGFP基因)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图5。
(2)重组质粒pET-28a-EGFP的构建
回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Nco I和BamH I双酶切后连接到进行相同酶切处理的pET-28a(+)载体上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用E173N-FP和E173C-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图6。由图可见，PCR鉴定只有一个阳性克隆(泳道1)，长度与理论大小相符。
取片段大小相符的阳性克隆测序，结果表明，得到了重组质粒pET-28a-EGFP。重组质粒pET-28a-EGFP：在骨架载体pET-28a(+)的Nco I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列1所示的DNA。
5、重组质粒pET-22b-NS3/4A的构建
(1)NS3/4A基因片段的克隆
在HCV的基因阅读框中，NS3基因位于NS4A基因上游。为扩增MAPI-NS4A(21-34aa)-GG-NS3(2-181aa)，在扩增NS3基因的同时，利用引物带入法将NS4A基因带入到NS3基因上游。由于NS4A(21-34aa)序列比较长，故采用两步PCR的方法，通过两次引物延长，带入NS4A基因。NS4A(21-34aa)编码NS4A蛋白自N末端第21至34位氨基酸残基。NS3(2-181aa)编码NS3蛋白自N末端第2至181位氨基酸残基。
以RB2-HCV质粒为模板，用NS3/4A-FP1和NS3/4A-RP组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物(约590bp)。以第一轮PCR扩增产物为模板，用NS3/4A-FP2和NS3/4A-RP组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(约600bp的NS3/4A基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图7。
NS3/4A-FP1(引入部分NS4A序列)：
5’-ATCATCGGCCGCTTGCACGTCAACCAGCGAGGTGGCCCCATCACTGCTTATGCCCAGC-3’；
NS3/4A-RP(引入BamH I酶切位点)：
5’-AAGGATCCCTATTAAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGTCTCAACGGGGATGAAATC-3’；
NS3/4A-FP2(引入整个NS4A序列和Nde I酶切位点)：
5’-AA CATATG GCGCCTATCGGATGCGTTTCCATCATCGGCCGCTTGCAC-3’。
(2)重组质粒pET-22b-NS3/4A的构建
回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切后连接到进行相同酶切处理的pET-22b(+)载体上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用NS3/4A-FP2和NS3/4A-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图8。由图可见，PCR鉴定全为阳性克隆，且除泳道5，其它片段大小均与预期相同。
取片段大小相符的阳性克隆测序，结果表明，得到了重组质粒pET-22b-NS3/4A。重组质粒pET-22b-NS3/4A：在骨架载体pET-22b(+)的Nde I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的DNA(序列3所示DNA编码序列表的序列2所示的蛋白质)。序列3中，自5’末端第1至42位核苷酸为NS4A的编码序列，第61至600位核苷酸为NS3的编码序列。
二、重组菌的构建
1、重组菌I的构建
将重组质粒pET-28a-E173N转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)的感受态，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)的平板，得到含有重组质粒pET-28a-E173N的大肠杆菌，将其命名为重组菌I。
2、重组菌II的构建
将重组质粒pET-22b-E173C转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)的感受态，涂于含50μg/ml氨苄青霉素(amp)的平板，得到含有重组质粒pET-22b-E173C的大肠杆菌，将其命名为重组菌II。
3、重组菌III的构建
将重组质粒pET-28a-E1735AB转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)的感受态，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)的平板，得到含有重组质粒pET-28a-E1735AB的大肠杆菌，将其命名为重组菌III。
4、重组菌IV的构建
将重组质粒pET-28a-E173N转化重组菌II，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)和50μg/ml氨苄青霉素(amp)的平板，通过双抗筛选出同时含有重组质粒pET-28a-E173N和重组质粒pET-22b-E173C的大肠杆菌，将其命名为重组菌IV。
5、重组菌V的构建
将重组质粒pET-28a-EGFP转化感受态大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)的平板，得到含有重组质粒pET-28a-EGFP的大肠杆菌，将其命名为重组菌V。
6、重组菌VI的构建
将重组质粒pET-22b-NS3/4A转化重组菌V，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)和50μg/ml氨苄青霉素(amp)的平板，通过双抗筛选出同时含有重组质粒pET-28a-EGFP和重组质粒pET-22b-NS3/4A的大肠杆菌，将其命名为重组菌VI。
7、重组菌VII的构建
将重组质粒pET-22b-NS3/4A转化重组菌III，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)和50μg/ml氨苄青霉素(amp)的平板，通过双抗筛选出同时含有重组质粒pET-28a-E1735AB和重组质粒pET-22b-NS3/4A的大肠杆菌，将其命名为重组菌VII。
8、重组菌VIII的构建
将重组质粒pET-22b-NS3/4A转化感受态大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞，涂于含50μg/ml氨苄青霉素(amp)的平板，得到含有重组质粒pET-22b-NS3/4A的大肠杆菌，将其命名为重组菌VIII。
三、重组菌的SDS-PAGE电泳和绿色荧光检测
1、重组菌的培养
分别将重组菌I、重组菌II、重组菌III、重组菌IV、重组菌VI、重组菌VII和重组菌VIII进行用诱导表达(诱导表达的条件为：1mM终浓度的IPTG，30℃诱导4小时)。
2、SDS-PAGE电泳
诱导前后分别取菌液进行SDS-PAGE电泳(15％的分离胶，5％的积层胶；上样量：Maker 8μl，大肠杆菌BL21(DE3)8μl，未诱导样品(-)8μl，诱导样品(+)12μl)。
重组菌I、II和IV的电泳图见图9。诱导后的重组菌I可见大小约为19.8kDa的E173N蛋白条带，诱导后的重组菌II可见大小约为7.7kDa的E173C蛋白条带，诱导后的重组菌IV可见大小约为19.8kDa和7.7kDa的两条清晰的条带(即实现了E173C和E173N的共表达)。
重组菌V、VI和VIII的电泳图见图10。诱导后的重组菌VIII可见大小约为22.2kDa的NS3/4A对应蛋白条带。诱导后的重组菌V中不能看见清晰的理论大小为26.2kDa的EGFP蛋白条带，可能原因是蛋白表达量过低而未显示出来，但因之后的显微镜下观察有绿色荧光，所以说明该菌体中还是表达了EGFP蛋白。诱导后的重组菌VI中，可见大小约为22.2kDa的NS3/4A对应蛋白条带，未见EGFP蛋白条带，可能原因是EGFP蛋白表达量过低而未显示出来，因为是将pET-22b-NS3/4A质粒转化到含有pET-28a-EGFP的BL21(DE3)中，电泳结果显示NS3/4A已得以表达，所以可以认为泳道6和泳道7对应的菌体中，同时含有pET-22b-NS3/4A和pET-28a-EGFP两个质粒，即实现了共表达。
重组菌III、VII和VIII的电泳图见图11。诱导后的重组菌VIII可见大小约为22.2kDa的NS3/4A对应蛋白条带。诱导后的重组菌III中不能看见理论大小为27.5kDa的EGFP5AB蛋白条带，可能原因是蛋白表达量过低，但因之后的显微镜下观察有绿色荧光，所以说明该菌体中还是表达了EGFP5AB蛋白。诱导后的重组菌Ⅶ中，可见大小约为22.2kDa的NS3/4A对应蛋白条带，未见EGFP5AB蛋白条带，可能原因是EGFP5AB蛋白表达量过低，因为是将pET-22b-NS3/4A质粒转化到含有pET-28a-EGFP5AB的BL21(DE3)中，电泳结果显示NS3/4A已得以表达，所以可以认为lane 4对应的菌体中，同时含有pET-22b-NS3/4A和pET-28a-EGFP5AB两个质粒，即实现了共表达。
三、绿色荧光检测
诱导前后分别取重组菌I、II、III、IV、V、VI和VII的菌液在荧光显微镜下观察(目镜10×，物镜20×，蓝光激发，曝光时间2s)。
重组菌I、II、III和IV的结果见图12。重组菌I和重组菌II不能被激发出绿色荧光，即EGFP在173位氨基酸处被切开形成的单独N端、C端不能被激发出绿色荧光。重组菌III被激发出绿色荧光，即E1735AB基因片段编码的蛋白可以被激发出绿色荧光，说明在EGFP的173位氨基酸处插入NS5A/5B，仍能维持其空间结构。重组菌IV不被激发出或只被激发出强度很弱的绿色荧光，说明EGFP在173位氨基酸处切分开的单独N端，C端两个蛋白相互作用很弱，很难重新形成接近野生型的EGFP的空间结构，从而无法被激发出强烈的绿色荧光。
重组菌III、V、VI和VII的结果见图13。重组菌V中，EGFP单独表达时可以被激发出强烈的绿色荧光。重组菌VI中，EGFP和NS3/4A共表达时，可以被激发出强烈的绿色荧光，说明NS3丝氨酸蛋白酶对EGFP的空间结构未产生显著影响，荧光强度比EGFP组轻微减弱，可能是由于质粒共表达的菌体中对荧光蛋白的表达量会减少。重组菌III中，EGFP5AB可以被激发出绿色荧光，但强度比重组菌V弱。重组菌VII中，EGFP5AB和NS3/4A共表达时，只有极微弱的绿色荧光，说明EGFP5AB的可发荧光的空间结构被破坏。
实施例2、真核细胞中E1735AB片段对NS3/4A片段的识别作用
2A(2A肽)发现于小核糖体核酸病毒，有不同的亚型，一般由18-22个氨基酸组成，其中包括一个高度保守的基序D(V/I)EXNPGP(Doronina VA，et al.Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon[J].Mol Cell Biol.2008 Jul；28(13)：4227-39.)。2A具有如下优点：可以实现同一个开放读框中多顺反子的表达；可以实现上下游蛋白等量表达(Fang J，Qian JJ， Yi S，Harding TC，Tu GH，et al.Stable antibody expression at therapeutic levels usingthe 2A peptide[J].Nat Biotechnol.2005May；23(5)：584-90；Szymczak AL，WorkmanCJ，Wang Y，et al.Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single‘self-cleaving’2A peptide-based retroviral vector[J].Nat Biotechnol.2004May；22(5)：589-94.)，可以在多种细胞类型中表达(Hasegawa，K.，Cowan，A.B.，Nakatsuji，N.& Suemori，H.Efficient multicistronic expression of a transgenein human embryonic stem cells[J].Stem Cells.2007 Jul；25(7)：1707-12.；SzymczakAL，Workman CJ，Wang Y.et al.Correction of multi-gene deficiency in vivo usinga single‘self-cleaving’2A peptide-based retrovifal vector[J].NatureBiotechnol.2004 May；22(5)：589-94.)。
本实施例所用的2A序列来自口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)，简写为F2A，序列为5’-AAA ATT GTC GCT CCT GTC AAA CAA ACT CTT AAC TTT GAT TTACTC AAA CTG GCT GGG GAT GTA GAA AGC AAT CCA GGT CCA-3’，编码蛋白KIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。
一、重组质粒的构建
1、pcDNA3.1(+)质粒载体的双酶切处理
用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切pcDNA3.1(+)质粒，回收载体骨架。
酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图见图14。环形pcDNA3.1(+)质粒被切下大小约为80bp的小片段和清晰单一的大片段条带(载体骨架)。
2、重组质粒pcDNA3.1-E1735AB的构建
设计正向引物zE173N-FP和反向引物zE173C-RP。
zE173N-FP：5’-CCC AAGCTT ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’；
zE173C-RP：5’-GC TCTAGA TCATTATTA CTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。
正向引物含有Hind III酶切位点；反向引物含有Xba I酶切位点并引入终止密码子。
以重组质粒pET-28a-E1735AB为模板，用zE173N-FP和zE173C-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约750bp的E1735AB基因片段)，电泳图见图15A。回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切后连接到步骤1得到的载体骨架上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用zE173N-FP和zE173C-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图15B。由图可见，PCR鉴定基本全为阳性克隆，且片段大小与预期相同。
取片段大小相符的阳性克隆测序，结果表明，得到了重组质粒pcDNA3.1-E1735AB。
3、重组质粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C的构建
(1)E173N-2A-E173C基因的克隆(重叠PCR)
以重组质粒pET-28a-E1735AB为模板，用zE173N-FP和zE173N-L-RP组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物-1(约590bp的E173N-2A基因片段)。以重组质粒pET-28a-E1735AB为模板，用zE173C-L-FP和zE173C-RP组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物-2(约260bp的2A-E173C基因片段)。同时以第一轮PCR扩增产物-1和第一轮PCR扩增产物-2为模板，用zE173N-FP和zE173C-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(约830bp的E173N-2A-E173C基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图16。
zE173N-L-RP：5’-AGTTTGAGTAAATCAAAGTTAAGAGTTTGTTTGACAGGAGCGACAATTTTGCAGCAGACGACGTCCTCGCTAGC-3’；下划线标记引入的部分2A序列。
zE173C-L-FP：5’-ACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCATCGATGTCCTACACAGACGGCAGC-3’；下划线标记引入的部分2A序列。
(2)重组质粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C的构建
回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切后连接到步骤1得到的载体骨架上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用zE173N-FP和zE173C-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图17。由图可见，泳道1、6、7的片段大小与理论值相同。
取片段大小相符的阳性克隆测序，结果表明，得到了重组质粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C。
4、重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A的构建
(1)E1735AB-2A-NS3/4A基因的克隆(重叠PCR)
以重组质粒pET-28a-E1735AB为模板，用zE173N-FP和zE173C-2A-L-RP组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物-1(约800bp的E1735AB-2A基因片段)。以重组质粒pET-22b-NS3/4A为模板，用NS3/4A-2A-L-FP和NS3/4A-2A-RP组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物-2(约650bp的2A-NS3/4A基因片段)。同时以第一轮PCR扩增产物-1和第一轮PCR扩增产物-2为模板，用zE173N-FP和NS3/4A-2A-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(约1390bp的E1735AB-2A-NS3/4A基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图18。
zE173C-2A-L-RP：5’-AGTTTGAGTAAATCAAAGTTAAGAGTTTGTTTGACAGGAGCGACAATTTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’；下划线标记引入的部分2A序列。
NS3/4A-2A-L-FP：5’-ACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCAATGGCGCCTATCGGATGCGTTTCC-3’；下划线标记引入的部分2A序列。
NS3/4A-2A-RP：5’-GC TCTAGA TCATTATTA AGACCTTGTAACAACGTCGAGTGT-3’。
(2)重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A的构建
回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切后连接到步骤1得到的载体骨架上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用zE173N-FP和NS3/4A-2A-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图19。由图可见，除泳道4，其他克隆出的片段大小均与理论相符。
取片段大小相符的阳性克隆测序，结果表明，得到了重组质粒
pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A。重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A：在骨架载体pcDNA3.1(+)的Hind III和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的DNA(序列7所示DNA编码序列表的序列6所示的蛋白质)。
序列7所示DNA中，自5’末端第1至519位核苷酸为E173N基因片段，第520至558位核苷酸为识别短肽NS5A/5B的编码序列，第559至756位核苷酸为E173C基因片段，第757至837位核苷酸为2A基因序列，第838至1437位核苷酸为NS3/4A的编码序列。序列6所示蛋白质中，自N末端第1至173位氨基酸残基为E173N片段，第174至186位氨基酸残基为识别短肽NS5A/5B，第187至252位氨基酸残基为E173C片段，第253至279位氨基酸残基为2A片段，第280至479位氨基酸残基为NS3/4A片段。
5、重组质粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A的构建
(1)EGFP-2A-NS3/4A基因的克隆(重叠PCR)
以重组质粒pIRES2-EGFP为模板，用zE173N-FP和zE173C-2A-L-RP组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物-1(约760bp的EGFP基因片段)。以重组质粒pET-22b-NS3/4A为模板，用NS3/4A-2A-L-FP和NS3/4A-2A-RP组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物-2(约650bp的2A-NS3/4A基因片段)。同时以第一轮PCR扩增产物-1和第一轮PCR扩增产物-2为模板，用zE173N-FP和NS3/4A-2A-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(约1430bp的EGFP-2A-NS3/4A基因片段)。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图20。
(2)重组质粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A的构建
回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切后连接到步骤1得到的载体骨架上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，用zE173N-FP和NS3/4A-2A-RP组成的引物对对菌斑进行菌落PCR鉴定，见图21。由图可见，泳道3和泳道5克隆片段大小正确。
取片段大小相符的阳性克隆测序，结果表明，得到了重组质粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A。
6、重组质粒pcDNA3.1-EGFP的构建
以重组质粒pIRES2-EGFP为模板，用zE173N-FP和zE173C-RP组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约760bp的EGFP基因片段)。回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切后连接到步骤1得到的载体骨架上，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞，得到重组质粒pcDNA3.1-EGFP。
二、绿色荧光现象
将HEK293A细胞(或CHO-K1细胞)用胰酶消化后，按1.2-2×105个细胞的密度接种于24孔板中，用lipo2000进行转染。
转染设有五个组：
第一组：转染重组质粒pcDNA3.1-EGFP；
第二组：转染重组质粒pcDNA3.1-E1735AB；
第三组：转染重组质粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C；
第四组：转染重组质粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A；
第五组：转染重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A。
重组质粒转染细胞48h后，用荧光显微镜观察(目镜10×，物镜10×，蓝光激发，曝光时间2s)。
第一组、第二组和第三组的照片见图22。第一组可以被激发出强烈的绿色荧光，说明质粒转染成功。第二组中细胞呈绿色，荧光强度与第一组相比较偏弱，不过仍可说明E1735AB可以被激发出绿色荧光。第三组基本无荧光，说明在2A的作用下，E173N和E173C基因片段分别表达，这两部分不能相互作用形成一个完整的桶状的EGFP结构，因此不能被激发产生荧光。
第一组、第二组、第四组和第五组的照片见图23。第一组可以被激发出强烈的绿色荧光，说明质粒转染成功。第二组细胞也呈现出明显的绿色荧光现象，说明E1735AB在真核细胞中仍能维持其空间结构。第四组细胞也呈现出较明显的绿色荧光现象，即EGFP-2A-NS3/4A在2A的作用下，实现了EGFP和NS3/4A丝氨酸蛋白酶的共表达，仍然能被激发出绿色荧光，说明NS3/4A丝氨酸蛋白酶未显著破坏EGFP的结构。第五组中基本无荧光，E1735AB-2A-NS3/4A在2A的作用下，实现了E1735AB和NS3/4A丝氨酸蛋白酶的共表达，绿色荧光消失，说明NS3/4A丝氨酸蛋白酶破坏了E1735AB的结构。
Claims (10)
1.一种蛋白质，为如下(a)或(b)：
(a)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白质：E173N片段、特异多肽片段和E173C片段；
(b)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白质：E173N片段、特异多肽片段、E173C片段、2A片段和蛋白酶；
所述(a)中：所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第1至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别；
所述(b)中：所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第1至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸残基所示；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被所述蛋白酶识别。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：
所述(a)中，所述特异多肽片段为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸残基所示；
所述(b)中，所述特异多肽片段为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸残基所示；所述蛋白酶的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第280至479位氨基酸残基所示。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如序列表的序列4或序列表的序列6所示。
4.编码权利要求1所述蛋白的基因，为DNA分子甲或DNA分子乙；
所述DNA分子甲自5’末端至3’末端依次含有如下元件：E173N片段的编码基因、特异多肽片段的编码基因和E173C片段的编码基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第1至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别；
所述DNA分子乙自5’末端至3’末端依次含有如下元件：E173N片段的编码基因、特异多肽片段的编码基因、E173C片段的编码基因、2A片段的编码基因和蛋白酶的编码基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第1至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸残基所示；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被所述蛋白酶识别。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：
所述DNA分子甲中，所述特异多肽片段为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸残基所示；
所述DNA分子乙中，所述特异多肽片段为识别短肽NS5A/5B；所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸残基所示；所述蛋白酶的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第280至479位氨基酸残基所示。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于：
所述DNA分子甲中，所述E173N片段的编码基因如序列表的序列5自5’末端第1至519位核苷酸所示；所述特异多肽片段的编码基因如序列表的序列5自5’末端第520至558位核苷酸所示；所述E173C片段的编码基因如序列表的序列5自5’末端第559至756位核苷酸所示；
所述DNA分子乙中，所述E173N片段的编码基因如序列表的序列7自5’末端第1至519位核苷酸所示；所述特异多肽片段的编码基因如序列表的序列7自5’末端第520至558位核苷酸所示；所述E173C片段的编码基因如序列表的序列7自5’末端第559至756位核苷酸所示；所述2A片段的编码基因如序列表的序列7自5’末端第757至837位核苷酸所示；所述NS3/4A片段的编码基因如序列表的序列7自5’末端第838至1437位核苷酸所示。
7.含有权利要求4或5或6所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
8.如权利要求7所述的重组载体或重组菌，其特征在于：
所述重组载体为重组质粒pET-28a-E1735AB、重组质粒pcDNA3.1-E1735AB或重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A；所述重组质粒pET-28a-E1735AB为将所述DNA分子甲插入pET-28a(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒pcDNA3.1-E1735AB为将所述DNA分子甲插入pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A为将所述DNA分子乙插入pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒。
所述重组菌为含有所述重组载体的宿主菌，所述宿主菌优选为大肠杆菌。
9.蛋白酶抑制剂筛选模型，为如下(I)或(II)：
(I)转入重组质粒甲和重组质粒乙的宿主菌；所述重组质粒甲含有权利要求4至6中任一所述的DNA分子甲；所述重组质粒乙含有可识别所述特异多肽片段的蛋白酶的编码基因；
(II)转入重组质粒丙的哺乳动物细胞；所述重组质粒丙含有权利要求4至6中任一所述的DNA分子乙。
10.权利要求9所述模型在筛选蛋白酶抑制剂中的应用。
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