CN100410387C - 丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，以及所述模型用于筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的用途。本发明另一方面涉及利用所述模型筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的方法，以及通过所述方法筛选的丙型肝炎病毒NS5bRNA聚合酶抑制剂。

Description

丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型及其用途

发明领域

本发明涉及一种丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，以及所述模型用于筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的用途。本发明另一方面涉及利用所述模型筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的方法，以及通过所述方法筛选的丙型肝炎病毒NS5bRNA聚合酶抑制剂。

发明背景

丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒，基因全长约9.4Kb，由5’末端，3’末端和位于两个末端之间的单一开放读码框架(ORF)三个部分组成(Major ME，SM Feinstone，The molecular virology ofhepatitis C Hepatology，1997.25：1527).单一的ORF长约9030bp，编码3010个氨基酸，称病毒多蛋白前体(Precursor Polyprotein).由于HCV基因序列存在高度的差异，导致HCV不同的分离株间核苷酸序列和氨基酸序列存在不同程度的差别，因此，HCV分为若干个型和亚型(Hu YW，Balaskas E，Furion M.，新基因分型方法的比较和应用，J.Clin.Microbiol.，2000Aug；38(8)：2807-2813)。

一方面，丙型肝炎病毒的基础和临床研究需要理想的HCV体外感染细胞和/或动物模型，以便于对病毒的致病作用，抗病毒药物的筛选和疾病治疗等的研究。另一方面，由于HCV存在多种亚型和变种，特别是据报道中国存在I-VI型HCV变异株(Tomei L，Vitale RL，IncittiI.等人，缺乏C-末端疏水序列之丙型肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的生物化学表征，J Gen Virol.，2000Mar；81pt 3：759-767)，因此尤其需要针对所述变异株的相关研究模型。

研究证明，丙型肝炎病毒RNA NS5b聚合酶具模板引物依赖性(Tanaka T，Sugiyama K，Ikeda M.等人，丙型肝炎病毒NS5B复制酶特异性结合核糖体，Microbiol.Immunol，2000；44(6)；543-550)，能在体外用HCV 3’端的相同核苷酸作为复制引物，起始HCV RNA负链的合成。这一研究成果为建立细胞外复制模型奠定了基础。理论上讲，阻断上述病毒复制周期的NS5b聚合酶，可抑制病毒复制。因此，HCV NS5b是理想的抗HCV药物的攻击靶点。建立HCV NS5bRNA聚合酶细胞外分子复制模型对于研究和发现抗HCV药物是非常重要的一步。

鉴于上述事实，本发明研究并首次得到了针对感染中国丙型肝炎患者的HCV病毒株的HCV NS5b RNA聚合酶之细胞外复制模型，以直接用于抗HCV药物的筛选和抗HCV药物机理的研究。

发明概述

本发明一方面涉及一种丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，其中包括：如SEQ ID NO：1所示丙型肝炎NS5b RNA聚合酶，包被有根据编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列SEQ ID NO：2之3′-NTR结构设计的捕捉模板的孔板，以及模拟生理环境的试剂，和用于检测生成的聚合酶相适应的检测试剂。

本发明另一方面涉及权利要求1所述的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型用于筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的用途。

本发明再一方面涉及一种筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的方法。

本发明还涉及本发明所述方法筛选得到的丙型肝炎病毒NS5bRNA聚合酶抑制剂。

发明详述

建立HCV NS5b RNA聚合酶细胞外复制模型，应从HCV NS5b与HCV 3’-NTR参与复制的相应结构入手(Hong Z，StandringDN，Baroudy B.等人，新抗丙型肝炎疗法的开发：丙型肝炎蛋白酶、螺旋酶聚合酶作为治疗靶点，Gastroenterol.2000Apr-Jun；63(2)：2210-212)。研究表明丙肝病毒3’-NTR区的结构，是由(1)长约30nt的核苷酸；(2)随基因型不同而长度多变的多聚U段；(3)多聚C/U核苷酸延伸；(4)一个高度保守的98nt基本序列组成的。3’端UTR最保守的区段连起来主要是包含多聚尿嘧啶的区段，为结合聚合酶蛋白的特异结合序列，定点突变揭示茎环结构内的特异核苷酸序列决定着与酶蛋白的特异结合。

就RNA的远侧端而言，其高度有序的序列结构是病毒多聚酶的识别信号，HCV RNA3’端可自身在重复序列间配对构成发卡样结构，这个引物模板复合物在聚合酶的作用下，使负链RNA从此得以延伸。

因此，利用HCV RNA3’端相关序列作为模型中的模板，即“捕捉模板”，以多聚腺嘌呤为引物，同时模拟细胞内的相应离子浓度和pH环境，本发明人成功建立了获自感染丙型肝炎的中国患者血清型的HCV病毒株NS5b RNA聚合酶的细胞外分子复制模型，且有效满足了该酶反应的生理条件。

本发明的一个方面，提供了一种针对中国患者的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，其中包括：如SEQ ID NO：1所示丙型肝炎NS5b RNA聚合酶，包被有根据编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列SEQ ID NO：2之3′-NTR结构设计的捕捉模板的孔板，以及模拟生理环境的试剂，和用于检测生成的聚合酶相适应的检测试剂。

现有资料表明，HCV基因型存在地域分布的特征，有报道中国存在I-VI型HCV变异株。HCV为一高度变异的RNA病毒，不同的分离株其核苷酸和氨基酸序列不同。为获得针对中国患者的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶，本发明人首先根据HCV特征性序列设计扩增引物。现有资料显示(Qin W等人，丙型肝炎RNA依赖性RNA聚合酶的结构与功能的突变分析，Hepatology，2001MAR；33(3)：728-737)，HCV核苷酸序列变异较大，同型HCV株在非高变区核苷酸变异可达15％，不同型HCV株在非高变区核苷酸变异可以高达25％，这给引物设计带来了很大困难。

本实验在设计HCVNS5b区段扩增引物时，比较了Genebank中多株相同及不同基因型HCV相应区段的核苷酸序列同源性，寻找较保守序列，同时遵循引物设计的一般原则并借助Oligo 6.0软件对引物进行分析和设计。

本研究采用逆转录与第一轮PCR反应在同一反应管中进行，随后以第一轮PCR产物为模板，用内引物进行第二轮扩增的巢式PCR方法。由于HCV RNA在血清中的含量很低，10⁶拷贝/ml阳性血清的第一轮PCR产物无可见扩增带，二次PCR扩增后，则有明显的电泳带出现。得到了与预计片段大小相同(1773bp)的扩增产物。

HCV基因组中的变异并非均匀分布，不同区段的变异程度不同。以5’-非编码区、C区较为保守，其他区相对多变。NS5区存在插入和缺失所以长度不同，但某些具有重要功能的氨基酸序列则高度保守。NS5b RNA复制酶序列中的活性位点核苷酸及其相关氨基酸序列在所有的六型中均高度保守(Johnson RB等人，丙型肝炎RNA依赖性RNA聚合酶的特异性和机理分析，Arch.Biochem.Biophys.，2000May1；377(1)：129-134)，说明该序列对于RNA复制酶活性是必需的。所谓保守区，除了序列同源性比较高外，也允许序列间的保守替换，但替换后预测的结构及抗原性或酶活性不变。

经过对本发明所得扩增产物测序结果(参见SEQ ID NO：2)的分析，并与已发表的相关NS5bHCV RNA聚合酶序列比较，其核苷酸和氨基酸的同源性分别为69-92％及89-96％之间。表明核苷酸的变异意义有限。此外，本研究克隆的HCV NS5b基因片段的推测氨基酸序列与其余6株HCV的氨基酸序列比较发现，代表其活性的GDD及相关AlyAspAsp三联体结构序列高度保守(Ago H等人，丙型肝炎RNA-依赖性RNA聚合酶的晶体结构，Structure Fold Des.1999Nov15；7(11)：1417-1426)，无任何变异，预示该区在病毒复制过程中起重要的作用，这与相关的研究一致，也表明我们表达的蛋白是针对中国患者血清型的HCV聚合酶(参见SEQ ID NO：1)。

为有效进行NS5b聚合酶的细胞外分子复制，本发明还特别针对所得聚合酶编码序列设计捕捉模板：NH₃-C₃-AUCCCCCUUUUUUUUUUUU(SEQ ID NO：3)。

本发明所述聚合酶体外复制可以在多种本领域已知的固相支持物上进行。相应的，上述捕捉模板可以固定在包括但不限于聚乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃、硝酸纤维素膜等固相载体的表面。优选的，本发明所述捕捉模板固定在由聚苯乙烯材料制备的细胞培养孔板表面。

为了恰当模拟本发明所述聚合酶体外复制的生理环境，本发明人经过长期充分研究，找出了参与体外复制的诸因素的最适反应浓度和反应条件。

具体的，在每100μl反应体系中，NS5b聚合酶的量在40-120μg/ml之间，优选为80μg/ml；捕捉模板的量在1-6μg，优选3μg捕捉模板；经标记UTP，CTP，GTP，ATP，各自的含量在0.25-1mM之间，优选为0.5mM；多聚腺苷酸的含量可以在0.05-0.4之间，优选为0.2μg poly A。本领域周知，所述UTP，CTP，GTP和ATP可以用放射性同位素、生物素、碱性磷酸酶等加以标记。优选的，本发明采用便于操作的生物素加以标记。

本领域技术人员知晓，为保证上述聚合酶体外复制的完成，所述反应体系中还应当存在相应的无机盐离子和缓冲液，为避免反应体系中存在不期望的RNA干扰，还可以加入适当量的RNA酶。本发明中，上述反应体系中还优选的包含4mM DTT，6mM醋酸镁，6μM氯化锌，50mM Hepes缓冲液，以及20U RNasin。

相应的，本领域技术人员知晓如何选择用于检测本发明所述体外模型中制备的上述聚合酶的检测试剂。针对用生物素标记的UTP，ATP，CTP和GTP，本发明选择亲和素标记的辣根过氧化物酶作为检测试剂。

本发明另一方面，还涉及一种筛选针对中国患者血清型的丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的方法，包括：

1)采用本发明所述的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，测定在标准条件下生成的负链RNA的量；

2)向本发明所述丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型中加入待测化合物，测定如步骤1)中所采用的标准条件下生成的负链RNA的量；

3)确定丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂。

本发明所述的“抑制”是指使聚合酶的活性降低，优选的使活性下降5％，更优选的，下降30％，更优选的下降50％，特别优选的是使活性下降75％，最优选的是使活性下降95％，甚至完全失活。

本发明中采用如下方法测定抑制百分率：

在本发明所述聚合酶细胞外分子复制模型最佳反应条件，同时设(即酶液反应)对照，DDw(即底物本底，不加酶)对照。加终止液，测活，计算抑制百分率。再按Reed-Mench方法计算样品对聚合酶的50％抑制浓度(IC₅₀)和90％抑制浓度(IC₉₀)。

在本发明中，所述标准条件为pH6-9，优选为pH7.7；反应温度为20-45℃，优选为37℃。

通过比较加入待测化合物引起的聚合酶活性降低，可以初步筛选到本发明所述丙型肝炎NS5b RNA聚合酶抑制剂。

因此，本发明的又一方面，涉及本发明所述丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型用于筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的用途。

本发明的再一方面，涉及通过本发明所述方法筛选得到的丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂。

下面结合附图和具体实施例，进一步举例说明本发明。

实施例

除非特别说明，本发明中涉及的分子生物学常规操作均参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验指南，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；以及Frederick M.精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley & Sons，Inc.，1995中所给出的方法进行。所述酶切条件均参照厂商推荐的条件。

实施例1中国患者血清型丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶的制备

丙型肝炎血清得自河南洛阳血站丙型肝炎阳性献血员，由河南华美生物公司提供，是该公司HCV RNA 106拷贝/ml内部参考血清。

Tris、酵母粉和胰蛋白胨，琼脂糖、SDS、甘氨酸、EB、氨苄青霉素、IPTG，DTT、卡那霉素为promega公司(2800 Woods HollowRoad-Madison，WI53711-5399U.S.A)分析纯产品；甘油、尿素为国产分析纯试剂。

pfuDNA聚合酶，T4DNA连接酶为Promega(2800Woods HollowRoad-Madison，WI53711-5399U.S.A)产品；玻璃奶为原平皓公司产品；溶菌酶为华美生物公司产品；PCR Marker为Promega(2800WoodsHollow Road-Madison，WI53711-5399U.S.A)公司及大连宝生物产品；各种限制性内切酶为大连宝生物公司产品，中分子量标准蛋白为中科院上海生化研究所产品。

pET-30a。为NOVAGEN公司(TB055 9thEdition05/00)产品，是T7启动子高效表达载体。中国预防医学科学院病毒所毕胜利教授提供。

PCR仪为中国杭州生物仪器公司产品；电泳仪为北京生物仪器公司产品；垂直板电泳槽、半干胶电转仪、酶标仪、为美国BIO-RAD公司产品；高速冷冻离心机(Universall6R)为德国Hettich zentrigugen公司产品；凝胶成像仪为美国COLD SPRINGS产品产品；超声波细胞破碎仪为英国MES公司产品；亲和层析柱和组氨酸亲和树脂为瑞典典Phamacia公司产品。

采用异硫氰酸胍法提取HCV RNA用于RT-PCR

选择HCVNS5b启动子及终止子保守区域设计扩增引物(引物序列位置以L02836为准)如下：

        编号       引物序列

        正向引物5’GCCAGTGAGGACGTCTGCTGCTCAATG    3’

        (SEQ ID NO：4)

7236    7263

        反向引物5’TTGTGTCGACTCACCGGTTGGGGAG 3′(SEQ

                   ID NO：5)

9036    9025

        正向引物5’TATGGATCCTCGATGTCCTATTCCTG 3′(SEQ

                   ID NO：6)

7261    7274

        反向引物5’TCCTCACCGGTTGGGGAGGAGGTAGAT    3’

                   (SEQ ID NO：7)

9042    9016

注：黑体字部分为限制性内切酶识别位点，正向引物其5’端为三个保护碱基。GGATCC为BaMHI识别位点；反向引物其5’端为四个保护碱基GTCGAC为SalI识别位点。

RT-PCR法扩增DNA片段

取已提取的RNA模板，分别加50pmol正反向引物，再加DEPC处理水至终体积20μl，置70℃，3分钟后迅速转至冰浴。反应体系中再依次加入21μl promega水，5μl10×PCR pfu Buffer0.5μlRNasin，0.5μlAMV反转录酶，1μl pfu DNA聚合酶，2μl 10mmol dNTP。总反应体系为50μl。PCR仪上设置下列程序：42℃30min反转录；95℃变性1.5min，60℃退火1.5min，72℃延伸4.5min，35个循环；最后72℃延伸10分钟。第二次扩增：5μl 10×PCR pfu Buffer，1μlpfu DNA聚合酶，2μl 10mmoldNTP。50pmol正反向引物，第一次扩增产物2μl，加ddH20至总反应体系为50μl。PCR仪上设置下列程序：42℃30min反转录；95℃变性1.5min，56℃退火1min，72℃延伸4.5min，35个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR产物的克隆及测序

经玻璃奶方法纯化PCR产物，将所得PCR片段与pET-30a载体连接得到连接方向正确的阳性克隆质粒pET-30a/NS5b。转化大肠杆菌，挑选阳性克隆。利用Wizard plus Minipreps DNA纯化试剂盒制备DNA测序模板，由北京奥科生物工程公司利用ABl377自动荧光测序仪，用载体上T7启动子、T7终止子引物双向测定重组片段序列。

序列的比较分析

将由上述操作得到的中国血清型HCV NS5B序列，与基因数据库(EMBLGenebank)中几株亚洲分布的具有代表性的HCV核苷酸序列进行同源性比较分析；通过BIAST软件，与Genebank中序列进行同源性搜索，利用DNASIS软件预测序列的读码框架，并根据该读码框架翻译得到相应氨基酸序列，与已知HCV氨基酸序列进行同源性比较。证实所得产物为中国血清型丙型肝炎RNA聚合酶NS5B序列。

含有本发明所述质粒的pET-30a/NS5b基因工程菌的诱导表达

取过夜培养的阳性克隆菌，按1％转接含Kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养4小时左右，OD(550nm).＝0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃振荡培养4小时，取菌液离心收集菌体，加水重悬菌体后加等体积2x上样缓冲液SDS-PAGE凝胶电泳。对表达产物进行凝胶扫描分析，显示目的蛋白表达量分别占菌体总蛋白的18.54％。在最佳的表达条件下，最大的表达量可占菌体总蛋白的18.9％。

目的基因片段表达产物的纯化

将诱导表达后的菌体离心收集后，用裂解液悬浮，超声波破碎后，离心分离上清和沉淀，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，以确定表达产物的存在形式。结果发现，所有重组蛋白都主要存在于沉淀中(图3.5)，以重组质粒pET-30a表达的凝胶电泳分析结果说明表达产物在细胞内的存在形式为沉淀蛋白。因此要采用针对不溶性蛋白的提纯方法进行纯化。

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，15V电转移30分钟，封闭液封闭4℃过夜，与NS5b单抗封闭，室温摇摆平台过夜，与羊抗人抗体温育2小时，二氨基联苯显色。结果可见：有特异的印迹反应，在约65kDa处形成显色条带；空白载体对照末见明显显色带。表明所得蛋白为NS5b聚合酶。

将变性溶解的蛋白，经0.22μM滤膜过滤，取过滤液以备按照如下方法进一步纯化。

采用固定金属离子亲和层析(IMAC)法纯化目的蛋白

入KTA Purifierl00紫外(波长为280，260，214nm)监测自动收集流出液，分别取少量以上各步流出液样品，进行SDS-PAGE分析。

经上述纯化后得到了单一条带的目的蛋白。将纯化产物凝胶扫描，得到纯化产物浓度为92.83％。由此，我们得到了可以建立本发明细胞外分子复制模型中的HCV NS5b聚合酶蛋白。

实施例2丙型肝炎NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的建立

DNA-BAND培养板96孔板：美国Corning公司产品；捕捉模板(SEQ ID NO：3)：美国Copenhagen公司合成；poly A美国PROMIGE公司产品；BIO-UTP，BIO-DUTP由ROCHE公司合成；亲和素-辣根过氧化物酶HRP由美国PHARMCIA公司合成；

HCV建立ELISA法检测HCV NS5b聚合酶活性

捕捉模板(NH3-C3-5′AUCCCCCUUUUUUUUUUUU)包被浓度及反应条件的确定

(1)加入不同浓度包被捕捉模板的DNA-BAND培养板96孔板，将纯化后的聚合酶梯度稀释，分别加入PolyA，BIO-UTP，NTP，和一定浓度的反应缓冲液，37℃混育1小时，，甩弃液体，PBST洗三次，扣干。

(2)每孔加亲和素-HRP，37℃温育1小时。甩弃液体，扣干。

(3)加50μL底物和显色液，37℃温育20分钟。

(6)每孔加50μL 2N H2SO4终止反应，450nm测OD值。

(7)选择不同的最佳包被浓度及离子浓度，PH值，温度按上述操作分别包板反应。

(8)均以三次反应结果的平均值做图，标注正负标准误差，以下做图方式与此相同。

包被捕捉模板浓度的确定

使用美国Corning公司DNA-BAND板，利用国外建立的HCV聚合酶放射性同位素法细胞外分子复制模型的相关反应条件，改变包被捕捉模板的包被量检测复制模型的相关条件。分别加入1，2，3，4，5，6，7和8μg的捕捉模板，在反应中，3μg捕捉模板重复出现最高反应OD值，在以后反应中，我们使用的捕捉模板为3μg。

Bio-UTP浓度在复制模型中的确定

在反应系统中改变Bio-UTP浓度，测定不同的反应OD值。在其他反应条件不变的情况下，我们在反应体系中加入0.25mM，0.5mM，0.75mM，1.0mM的Bio-UTP。结果表明，反应以0.5mM为最佳条件，在以后反应中，我们使用的Bio-UTP浓度为0.5mM。

Poly-A浓度在反应系统中的确定

在反应系统中改变Poly-A浓度，测定不同的反应速度。我们在同一体积反应体系中分别加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8μg的Poly-A。反应以0.2μg时OD值最高，我们认为是最佳条件。HCV NS5b聚合酶的酶浓度的确定

在反应体系中分别加入10，20，40，60，80，100，120或140μg/ml的HCV NS5b酶。发现反应以80μg/ml为最佳条件。

由上，我们得到了本发明所述丙型肝炎NS5b聚合酶细胞外分子复制模型中主要反应因子的有关参数，成功的在体外模拟了生理条件下丙型肝炎NS5b聚合酶细胞外分子复制模型。

实施例3利用本发明所述丙型肝炎NS5b聚合酶细胞外分子复制模型筛选聚合酶抑制剂

采用本发明上述获得的聚合酶细胞外分子复制模型，选择15-80℃之间的不同温度孵育，结果在37℃出现最高峰，表明最佳反应温度为37℃。同时考察了不同pH值对酶复制模型的影响，其中利用NaOH或HCl配制成pH为3.0；4.0；5.0；6.0；7.0或8.0的反应体系，观察pH值对HCV NS5b聚合酶的酶促反应体系的影响。结果选定了最佳反应pH值为7.7。

将待选的如下抑制剂筛选样品各稀释成不同浓度，加入细胞外分子复制模型，同时设对照(即酶液反应)，DDw(即底物本底，不加酶)对照。加终止液，测活，计算抑制百分率。再按Reed-Mench方法计算样品对聚合的50％抑制浓度(IC₅₀)和90％抑制浓度(IC₉₀)。

其中：NA＝无活性

由上述结果筛选出1个阳性抑制剂，GLB，其对丙型肝炎病毒聚合酶的半数抑制浓度IC₅₀。范围为4.12±1.20mM，90％抑制浓度(IC90)为7.64±1.64mM。其它无抑制作用。

序列表

<110>中国药品生物制品检定所，中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型及其用途

<130>IDC030009

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>590

<212>PRT

<213>Hepatitis C virus

<400>1

Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu

1                5                    10                   15

Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His

             20                   25                   30

His Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Leu Arg Gln

         35                   40                   45

Lys Lys Val Ala Phe Asp Arg Met Gln Val Leu Asp Asp His Tyr Arg

    50                   55                   60

Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys

65                   70                   75                    80

Leu Leu Ser Ile Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala

                 85                   90                   95

Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser

             100                  105                  110

Lys Ala Val Asn His Ile Arg Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp

         115                  120                  125

Asn Glu Thr Pro Ile Asn Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe

    130                  135                  140

Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val

145                  150                  155                  160

Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp

                 165                  170                  175

Val Val Ser Thr Leu Pro Gln Pro Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe

             180                  185                  190

Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Leu Asn Ala Trp Lys

         195                  200                  205

Ser Lys Glu Asn Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp

    210                  215                   220

Ser Thr Val Thr Gln Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gln

225                  230                  235                   240

Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Ile Lys Ser Leu Thr

                 245                  250                  255

Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln Asn

             260                 265                  270

Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys

        275                  280                   285

Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala

    290                  295                   300

Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Leu Val

305                  310                   315                 320

Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg

                 325                   330                 335

Val Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Leu

             340                  345                  350

Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn

         355                  360                  365

Val Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr

    370                  375                  380

Arg Asp Pro Thr Ile Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg

385                  390                   395                 400

His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala Pro

                 405                   410                 415

Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile Leu

             420                  425                  430

Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr Gly

         435                  440                  445

Ala Tyr Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu Arg

    450                  455                   460

Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly Glu

465                  470                  475                  480

Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro Leu

                 485                  490                  495

Arg Val Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Lys Leu Leu Ser

             500                  505                 510

Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp Ala

        515                  520                  525

Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Arg Leu

    530                  535                  540

Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr

545                  550                  555                  560

His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Leu Cys Leu Leu

                 565                  570                  575

Leu Leu Ser Val Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg

             580                  585                  590

<210>2

<211>1773

<212>DNA

<213>Hepatitis C virus

<400>2

atgtcctata catggacagg cgccttgatc acgccatgtg ctgcggagga gagcaagctg    60

cccatcaacc cgctgagcaa ctccttgctg cgtcaccaca acatggtcta tgctacaaca    120

tcccgcagtg caagcctacg gcagaagaag gtcgcttttg acagaatgca agtcctggac    180

gaccactacc gggacgtgct caaggagatg aaggcgaagg cgtccacagt taaggctaaa    240

ctcctatcca tagaagaggc ctgcaagctg acgcccccac attcagccaa atccaaattt    300

ggctatgggg caaaagacgt ccggaaccta tccagcaagg ccgttaacca catccgctcc    360

gtgtggaagg acttgttgga agacaatgag acaccaatca ataccaccat catggcaaaa    420

aatgaggttt tctgcgtcca accagagaaa ggaggccgta agccagctcg ccttatcgta    480

ttcccagact tgggagtccg tgtgtgcgag aagatggccc tttatgacgt ggtctccacc    540

cttcctcagc ccgtgatggg ctcctcatac ggattccagt actctcctgg gcagcgggtc    600

gaattcctgc taaatgcctg gaaatcaaag gaaaacccta tgggcttctc atatgacacc    660

cgctgttttg actcaacggt cactcagaac gacatccgtg ttgaggagtc aatttaccaa    720

tgttgtgact tggcccccga ggccagacgg gccataaagt cgctcacaga gcggctctat    780

atcgggggtc ccctgactaa ttcaaaaggg cagaactgcg gttatcgccg gtgccgcgca    840

agtggcgtgc tgacgaccag ctgcggtaat acccttacat gttacttgaa ggcctctgcg    900

gcctgtcgag ctgcgaagct gcaggactgc acgatgctcg tgaacggaga cgaccttgtc     960

gttatctgtg aaagcgcggg aactcaagag gatgcggcga gcctacgagt cttcacggag    1020

gctatgacta ggtactctgc cccccctggg gacctgcccc aaccagaata cgacttggag    1080

ctaataacat catgctcctc caatgtgtca gtcgcccacg atgcatctgg caaaagggtg    1140

tactacctca cccgtgaccc caccatcccc ctcgcgcggg ctgcgtggga gacagctaga    1200

cacactccag tcaactcctg gctaggcaac atcatcatgt atgcgcccac tctatgggca    1260

aggatgattc tgatgactca cttcttctcc atccttctag ctcaggagca acttgagaaa    1320

gccctggatt gccaaatcta cggggcctac tactccattg agccacttga cctacctcag    1380

atcattgaac gactccatgg ccttagcgca ttttcactcc atagttactc tccaggtgag    1440

atcaataggg tggcgtcatg tctcaggaaa cttggggtac cacccttgcg agtctggaga    1500

catcgggcca gaagcgtccg cgctaagcta ctgtcccagg gggggagggc cgccacttgt    1560

ggcaagtacc tcttcaactg ggcagtaaag accaagctta aactcactcc aatcccggct    1620

gcgtcccggt tggacttgtc cggctggttc gttgctggtt acagcggggg agacatatat    1680

cacagcctgt ctcgtgcccg accccgttgg ttcatgttgt gcctactcct actttctgta    1740

ggggtaggca tctacctgct ccccaaccgg tga                                 1773

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>artifical

<400>3

aucccccuuu uuuuuuuuu                                                  19

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>primer

<400>4

gccagtgagg acgtctgctg ctcaatg                                         27

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>primer

<400>5

ttgtgtcgac tcaccggttg gggag                                           25

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>primer

<400>6

tatggatcct cgatgtccta ttcctg                                          26

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>primer

<400>7

tcctcaccgg ttggggagga ggtagat                                         27

Claims (7)

1. 一种丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，其中包括：如SEQ ID NO：1所示丙型肝炎NS5b RNA聚合酶，包被有根据编码SEQ IDNO：1的核苷酸序列SEQ ID NO：2之3′一NTR结构设计的捕捉模板的孔板，以及模拟生理环境的试剂，和用于检测在聚合酶作用下产生的丙型肝炎病毒负链RNA相适应的检测试剂，其中所述捕捉模板为SEQ ID NO：3所示的序列，NS5b聚合酶的量在40-120μg/ml之间，所述模拟生理环境的试剂包括：每100μl反应液中捕捉模板在1-6μg；bio-16-UTP，CTP，GTP，ATP在0.25-1mM之间；多聚腺苷酸在0.05-0.4μg之间。

2. 权利要求1所述的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，其中所述模拟生理环境的试剂包括每100μl反应液中：3μg捕捉模板；bio-16-UTP，CTP，GTP，ATP为0.5mM；多聚腺苷酸的含量为0.2μg。

3. 权利要求1所述的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，其中所述模拟生理环境的试剂中还包括DTT，醋酸镁，氯化锌，50mMHepes缓冲液以及RNasin。

4. 权利要求1所述的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，其中所述检测试剂为亲和素标记的辣根过氧化物酶。

5. 一种筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的方法，包括：

1)采用权利要求1所述的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型，测定在标准条件下生成的丙型肝炎病毒负链RNA的量；

2)向权利要求1所述丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型中加入待测化合物，测定如1)中所采用的标准条件下生成的丙型肝炎病毒负链RNA的量；

3)确定丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂。

6. 权利要求5所述的筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的方法，其中所述标准条件为pH 6-9，且温度为20-45℃。

7. 权利要求1所述的丙型肝炎病毒NS5b聚合酶细胞外分子复制模型用于筛选丙型肝炎病毒NS5b RNA聚合酶抑制剂的用途。