CN103881979B - 抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型的抗丙肝病毒药物高通量筛选模型，可应用于人类丙型肝炎病毒感染机制的研究及药物筛选，它是一种针对HCV侵染进行高效应答的报告系统。当HCV侵入细胞后，其所表达的蛋白酶NS3/4A将切割并释放通过蛋白MAVS锚定于线粒体外膜的四环素调控反式激活子rtTA，在强力霉素或四环素存在的情况下激活报告基因的表达，并在一定时间内观察到明显的荧光信号；或在GCV存在时导致细胞的死亡。该系统操作简单、实验周期短、效率高、稳定性强，可广泛应用于HCV侵染的实时定量观测、流式细胞分选、高通量化合物筛选、高通量宿主细胞靶基因筛选以及HCV侵染的分子机制研究。

Description

抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其应用

技术领域

本发明涉及医学、基因工程和细胞生物学领域，具体地说，涉及一种抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其应用。

背景技术

HCV（HepatitisCvirus）是一种直到1989年才被首次报道的肝炎病毒（Choo等,1989），是一种单链RNA病毒，其导致的丙型肝炎是引起人类病毒性肝炎的主要原因之一。截止2005年在全球约有3%的人口，超过1.7亿人被丙型肝炎病毒感染。HCV是一种不导致细胞病变的肝脏的病毒，是黄病毒科的成员，被感染后可能发生急性肝炎，急性肝炎可被治愈，而另有约70%会发展成慢性肝炎，并最终导致肝硬化、肝癌等严重疾病（Hoofnagle等,2002）。目前为止，还没有开发出抗HCV疫苗，而且对于6个亚型一直没有广谱高效的药物。临床上主要采用PEG-IFN-α和Ribavirin联合治疗(FriedandHoofnagle,1995;McHutchison,Gordon等,1998)，此疗法价格昂贵，并且只对其中某些亚型具有一定的疗效；2012年美国食品和药物管理局（FoodandDrugAdministration,FDA）批准上市了抑制HCV复制过程中的关键蛋白NS3/4A活性的小分子药物Telaprevir(VX-950)(Lin,Perni等,2006)和Boceprevir（SCH503034）（Njoroge,Chen等,2008），但是它们仅针对其中基因型I有比较好的疗效。

在针对HCV的研究方面，直到2005年，人类才分离出可以在体外培养的细胞中完成整个生命周期的HCVcc（Cellculture-derivedinfectiousHCV，HCVcc），从此对于HCV机制的研究进入了一个高速发展的时期(Cai,Zhang等,2005;Heller,Saito等,2005;Lindenbach,Evans等,2005;WakitaandKato,2006)。但是，因为HCV病毒并无细胞毒性，也没有明显的特征，所以就衍生出一系列针对HCV侵染的报告系统。因为在HCV的生命周期中，会首先转录出一条多蛋白的肽链，然后被不同的蛋白酶切开变成具有活性的蛋白，而其中最重要的蛋白酶当属HCV自带的NS3/4A，其能识别特定氨基酸序列并进行切割，于是报告系统和药物设计主要围绕NS3/4A展开。

2004年LauraPacini报道了一种报告系统，其是基于SEAP-1，它被插入一段可以被NS3/4A特异识别的肽段，插入位置在SEAP-1和一个内质网膜锚之间，当被NS3/4A切开，SEAP-1可以被分泌到细胞周围的培养基中（Pacini等,2004）。该系统构建原理也是利用了NS3/4A的活性，不过其检测方法是通过ELISA检测细胞培养基中SEAP-1的活性，检测过程比较复杂也难以保证精确性。

2006年Breiman报道了一个基于内质网膜蛋白PERK偶联Gal4VP16的报告系统。PERK蛋白定位在内质网ER上，通过NS3/4A特异性酶切位点NS5A/5B之间肽段偶联Gal4VP16，当HCV侵入细胞并表达NS3/4A时，Gal4VP16被释放，并且启动报告基因的表达，报告基因可以是荧光、自杀基因等（Breiman等,2006）。

2008年第四军医大学一个研究组开发了一个基于细胞的指示NS3/4A活性的报告系统，该系统中将重组的Caspase3（启动细胞凋亡程序中其关键作用的酶，诱导细胞凋亡）中原本的酶切位点改为NS3/4A的特异性酶切位点，这样当细胞被HCV侵染后，细胞表达NS3/4A，剪切Caspase3前体并释放出有活性的Caspase3，诱导细胞凋亡，并最终通过MTT检验细胞的存活率（Lei等，2008）。该方法利用了细胞凋亡机制，但是其最大的缺陷在于效率过低，在其实验中只得到了45%的死亡率，并且采用质粒转染的方法植入系统，不够稳定。

2009年，QingxiaHan报道了一组基于对2a型HCVcc（JFH-1）进行改造的报告系统（QingxiaHan等,2009）。其在HCVcc基因组NS5A的C端插入了eGFP，从而使得宿主细胞被改造后的HCVcc侵染后发出绿色荧光。这套系统读数方便，而且可以荧光定量，但是构造过程复杂，并且只能针对可以在细胞体外培养的HCVcc这一种基因型，其他型别的HCV很难嫁接。

2010年CharlesMRice的研究组报道了另一个针对HCV侵染的报告系统。因为HCV能够切割IPS-I(Seth等,2005;Xu等,2005;Meylan等,2005)，这些蛋白是NS3/4A的天然底物，其中IPS-1是定位在线粒体外膜上的蛋白，利用eGFP替换NS3/4A识别位点N端的部分，构建了一套荧光报告系统。当HCV入侵后，NS3/4A表达可以切割特异性酶切位点，导致eGFP从线粒体外膜上脱落下来，从点状聚集变化为弥散在细胞里(Jones等,2010)。该系统构建过程简单，也非常有效。但是最大的缺陷在于难以实现自动化监测，特别是无法经过FACS分选，故而难以应用于高通量筛选。

上述方法或存在操作过程或读取信息复杂，或存在应答效率不高，很多时候无法满足科学研究甚至药物筛选的需要。相较而言，CharlesRice小组研发的方法相对操作简单，易于观察，但是其依赖于细胞内荧光蛋白的图形模式变化（从点状聚集到弥散），人为因素及误差都较大，也难以实现高通量或自动化应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其应用。

本发明的另一目的是提供一种针对HCV侵染实现实时、定量检测的活细胞报告系统，达到操作简单、背景值低、灵敏度高、特异性强的目的，并可以实现高通量以及自动化，广泛应用于生物学病毒侵染机制研究，医疗诊断及药物筛选。

为了实现本发明目的，本发明的一种抗丙肝病毒药物高通量筛选模型，其构建方法包括以下步骤：

1）报告质粒的构建：以慢病毒包装质粒为骨架，其中至少串联连接有两个基因表达盒，一个基因表达盒用于表达rtTA-MAVS融合蛋白，另一个基因表达盒用于表达tight-TRE启动子下游的报告蛋白，两个基因表达盒之后连接有抗性基因，即构建得到报告质粒。

其中，rtTA为四环素调控反式激活子，其编码基因的核苷酸序列如SeqIDNo.5所示，MAVS为线粒体外膜蛋白，其编码基因的核苷酸序列如SeqIDNo.6所示，tight-TRE启动子的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。

2）采用慢病毒包装系统产生含有上述报告质粒的慢病毒，然后侵染HCV宿主细胞，将侵染的细胞作为针对HCVNS3/4A蛋白酶的抗丙肝病毒药物高通量筛选模型，向含有上述侵染细胞的培养基中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后，根据报告蛋白的表达和/或细胞的存活情况，来评价该药物化合物对丙肝病毒的抑制活性。

前述的筛选模型，步骤1）中所述慢病毒包装质粒为pLentiCMVMCSSBsd，质粒全序列如SeqIDNo.9所示。

前述的筛选模型，步骤1）中用于表达rtTA-MAVS融合蛋白的基因表达盒位于SV40启动子下游，且该融合蛋白的C端连有内部核糖体进入位点序列IRES（SeqIDNo.7）。

前述的筛选模型，步骤1）中所述报告蛋白为mCherry荧光蛋白和自杀基因Delta-tk之间通过2A序列连接。其中，自杀基因Delta-tk的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示，2A序列如SeqIDNo.3所示，编码荧光蛋白mCherry的核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。

前述的筛选模型，步骤1）中所述抗性基因优选为杀稻瘟菌素抗性基因。

前述的筛选模型，步骤1）中构建得到的报告质粒为pLenti-TK-mCherry-rtTA-MAVS，其核苷酸序列如SeqIDNo.8所示。

前述的筛选模型，步骤2）中所述HCV宿主细胞为Huh7.5细胞，培养细胞所使用的培养基为DMEM，其中还含有10%FBS、1×NEAA、1×青霉素链霉素双抗溶液和2μg/ml强力霉素，细胞培养条件为37℃，5%CO₂。

前述的筛选模型，步骤2）中使用流式细胞仪检测报告蛋白的表达和/或细胞的存活情况。

本发明还提供所述筛选模型在抗丙肝病毒药物高通量筛选中的应用。

本发明还提供所述筛选模型在研究HCV侵染宿主细胞的分子机制中的应用。

本发明利用HCV表达产生的NS3/4A对于定位于线粒体外膜蛋白MAVS上一段特异性氨基酸序列具有切割活性，将tight-TRE启动子所需要的转录因子rtTA通过该识别切割序列连接在MAVS的N端，从而确保了rtTA与启动子的空间分离。而tight-TRE启动子后连接了报告基因，该报告基因可根据实验需要，采用常规分子克隆的基本方法进行调整，并可以通过2A序列串联多个报告基因。当HCV侵入细胞并表达产生NS3/4A，其特异性的识别位于线粒体外膜的MAVS融合蛋白上的切割序列，从而切割并释放rtTA。在培养基中存在强力霉素（Doxycycline）的情况下，报告基因表达。涉及系统的所有分子生物元件通过慢病毒（lentivirus）转入细胞内，并利用该转入方式将所有功能序列整合入细胞。

本发明将荧光蛋白mCherry和自杀基因HSV-tk的变种Delta-tk作为双报告基因，两个蛋白采用2A序列连接，并整体插入启动子之后，确保报告基因等量表达。而功能序列中还包含SV40启动子，其后插入了rtTA-MAVS融合蛋白序列，然后通过IRES串联杀稻瘟菌素(Blasticidin,Bsd)抗性基因用于筛选成功植入功能序列的细胞。

在本发明中，术语“HCV”为丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus）。

在本发明中，术语“NS3/4A”为丙型肝炎病毒基因组在宿主细胞内表达产生的蛋白酶名称，其在病毒正常生命周期起关键作用。

在本发明中，术语“线粒体外膜蛋白MAVS”是一种正常生理状态下严格将C端锚定于细胞器线粒体外膜的蛋白，MAVS是其蛋白名称，在细胞质与细胞核中不游离分布。它是NS3/4A的天然受体，其中第462-540位氨基酸包含NS3/4A识别切割序列。

在本发明中，术语“tight-TRE启动子”是一种tet-on型启动子，即转录因子rtTA和强力霉素的共同作用下启动下游蛋白的表达，缺一不可。

在本发明中，术语“rtTA”为tight-TRE启动子所需转录因子。

在本发明中，术语“强力霉素（Doxycycline）”是一种四环素类抗生素药物。

在本发明中，术语“2A”是具有自剪切活性的一段包含21个氨基酸的多肽，来自于病毒porcineteschovirus-1。

在本发明中，术语“慢病毒（lentivirus）”是一种常用的分子生物学工具，可用于将所需要的DNA序列随机插入宿主细胞的基因组中。所需要传递的DNA序列需要克隆在特定的一类质粒上。

在本发明中，术语“荧光蛋白”是一种报告基因编码的蛋白，表达出的该蛋白在特定激发光激发下，可以发出特定波长的荧光。

在本发明中，术语“mCherry”是荧光蛋白的一种，激发光峰值587nm，发射光峰值610nm。

在本发明中，术语“Delta-tk”是自杀基因中的一种，来源于单纯性孢疹病毒胸苷激酶（HerpesSimplexVirusThimidineKinase，HSV-tk），是经过修改的变种，具有更高的生物学活性。其可将正常状态下无毒的化合物更昔洛韦（Gancilovir，GCV）磷酸化，磷酸化后的GCV对细胞有毒，可以高效杀死细胞。

在本发明中，术语“SV40启动子”是一种常用的启动子，其特性是可以持续性的转录连接在其下游的基因序列。

在本发明中，术语“IRES”是内部核糖体进入位点序列（Internalribosomeentrysite）的缩写，是转录产生的RNA内部一段功能序列，可以启动其下游RNA序列的翻译。用IRES连接的两个基因，其下游基因表达量相较于上游会衰减。

在本发明中，术语“杀稻瘟菌素”是一种真核细胞抗生素，Blasticidin简称BSD，生物学研究中通常用于杀死不含抗性基因的真核细胞。

本发明通过常用分子克隆手段将以上元件按照特定顺序克隆于pLentiCMVMCSSBsd质粒，质粒图谱如图1所示。然后采用标准慢病毒包装系统产生慢病毒，并侵染HCV宿主细胞，然后采用BSD进行筛选，挑选出单克隆细胞系。植入该系统的细胞系即可用于HCV侵染的检测，原理示意图如图2所示。

当含有上述报告系统的宿主细胞Huh7.5培养基中含有HCVcc时，HCVcc会侵入细胞并表达NS3/4A蛋白酶，当培养基中含有强力霉素时，被侵染细胞会在72小时以内发出mCherry红色荧光，在普通荧光显微镜下采用激发光光谱范围内的激光激发下可以观察到红色荧光，而同时此活动受到强力霉素存在与否的严格调控，如图3所示。当向培养基中加入更昔洛韦（2μg/ml），120小时后可以观察到明显的细胞死亡，如图4所示。

含有上述报告系统的宿主细胞可以应用于药物筛选，当药物可以抑制HCV入胞并成功表达出NS3/4A，其切割并释放rtTA之前的任何一步生理活动，都可以通过报告基因的信号找到特定的化合物。为此，发明人特地选取了NS3/4A的特异性抑制剂VX-950（Telaprivir），当培养基中VX-950的浓度不断提高时，可以明显看到发出红色荧光的细胞比例减少，直至完全被抑制，如图5所示。

本发明基于荧光信号作用机理，可应用于流式细胞仪进行分选，并通过分选实现遗传筛选，而且其灵敏性、稳定性和效率都足以保证将HCV侵染应答的假阴性率控制在4%以内，如图6所示。如果将病毒浓度按照一定梯度逐级稀释，在侵染72小时后可通过流式细胞仪分析发出mCherry荧光的细胞的比例，其数值与病毒浓度呈严格线性正相关，如图7所示。同时，从图7可以看出，在病毒滴度在102个/ml量级就已经可以明显监测到数据变化，体现了系统的高度灵敏性，由此可应用于临床监测。

本发明提供的高通量筛选模型可应用于人类丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus)感染机制的研究及药物筛选，是一种针对HCV侵染进行高效应答的报告系统。当HCV侵入细胞后，其所表达的蛋白酶NS3/4A将切割并释放通过蛋白MAVS锚定于线粒体外膜的四环素调控反式激活子rtTA，在强力霉素或四环素存在的情况下激活报告基因的表达，并在一定时间内观察到明显的荧光信号；或在GCV存在时导致细胞的死亡。该系统操作简单、实验周期短、效率高、稳定性强，可广泛应用于HCV侵染的实时定量观测、流式细胞分选、高通量化合物筛选、高通量宿主细胞靶基因筛选以及HCV侵染的分子机制研究。

本发明中仅提供了激发两种信号的基本使用方法，一种是荧光信号，一种是死亡信号。其他基于此功能的应用都可在此基本使用方法基础上衍生。

1、通过荧光定性验证HCVcc的侵染

（1）需要研究的细胞系通过上述构建方法植入报告系统，并挑选出性能良好的单克隆细胞株；如果涉及到指定基因的过表达、基因干涉（RNAi）或基因敲除，也可以在已构建野生型细胞株的基础上进一步操作；以HCV领域研究常用的宿主细胞系Huh7.5为例。

（2）细胞根据实验需要提前培养于细胞培养板上，要求细胞正常贴壁，状态良好。培养基为DMEM（LifeTechnologies）、10%FBS（ThermoScientific）、1×NEAA（LifeTechnologies）并包含1×的双抗（penicillin-streptomycin），细胞在37℃，二氧化碳浓度5%的培养箱中培养。

（3）在培养基中加入强力霉素，终浓度为2μg/ml，同时根据实验需要加入适量含有HCVcc病毒的培养基，在正常培养环境中培养，如果中途需要更新培养基，消化传代都可在24小时后正常操作，但要确保强力霉素的浓度。

（4）72小时后可以在显微镜下观察，激发光波长参考mCherry激发光光谱。

2、通过细胞死亡与否验证HCVcc入侵

培养环境与侵染与上述（1）-（2）相同，只是需要在（3）中同时加入2μg/ml的更昔洛韦，并在其后的所有操作中维持该浓度。120小时后可观察到明显的死亡信号。

本发明具有以下优点：

（一）本发明原理简单明确，充分考察了丙型肝炎病毒HCV的生理特性以及宿主细胞的天然受体（该受体对多种亚型的HCV病毒株敏感），提供一种基于宿主细胞的报告系统，该系统的构建过程简单易行，而且NS3/4A是HCV最核心的功能蛋白，进化上具有保守性，理论上可针对各种亚型的HCV，相较于通过对HCV病毒基因组的改造实现应答更加简单方便。

（二）本发明对丙型肝炎病毒的监测信号明显，现有的报告系统只是有或无的显著差别，而非程度的差别或图形的变化。

（三）本发明操作简单易行，实验周期短，对实验条件和操作人的经验没有过高的要求，可在72小时观察到明显的信号。

（四）本发明对HCV侵染具有高度的灵敏性，当培养基中HCV的滴度低达10²个/ml量级时，即可在流式细胞仪分析中观察到明显的变化，因此可用于临床诊断。

（五）本发明可适用于流式细胞仪分析、分选，具备实现高通量自动化筛选的性能要求。

（六）本发明对于HCV侵染单一因素的因果关系要求严格，不同实验组中阳性率与病毒滴度严格线性正相关，R²=0.99517。

（七）本发明提供的高通量筛选模型稳定性强、效率高，通过流式细胞仪分析可最高达近到97%的阳性率，从而大大降低了高通量自动化遗传筛选的假阴性率。

（八）本发明可应用于药物的规模化筛选，通过机器读取荧光或死亡信号的有无来锁定具有潜在临床价值的化合物。

（九）本发明再开发性强，可基于基本功能衍生出多种应用。

（十）本发明具有高度的移植性，可根据实验需要通过简单的分子克隆方法替换为其他的报告基因。

（十一）可根据研究需要，用标准分子生物学方法改变NS3/4A识别位点，为不同亚型的HCV研究提供便利，并可用于筛选或验证新的NS3/4A识别位点。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建的报告系统质粒图谱。质粒骨架为慢病毒包装质粒，可用于包装慢病毒，并将两个LTR之间的部分随机插入细胞基因组。功能部分主要包括tight-TRE启动子启动的报告基因Delta-tk和mCherry，二者通过2A序列连接；另一部分是SV40启动子启动的rtTA-MAVS(C)融合蛋白，并通过IRES连接BSD抗性基因。

图2为本发明报告系统的工作原理示意图。当报告系统转入细胞后，持续的表达产生定位于线粒体外膜的rtTA-MAV(C)融合蛋白，rtTA此时被锚定在线粒体上。当HCV入侵细胞并表达了NS3/4A，其识别并剪切MAVS上的识别序列，释放游离的rtTA，在强力霉素Dox存在时，共同激活tight-TRE（P_tight）启动子，启动下游报告基因的表达。2A肽段发生自剪切，产生等量的mCherry和Delta-tk蛋白。此时可以直接观察mCherry红色荧光或利用其进行流式细胞仪分析；而Delta-tk并无毒性，当加入无毒化合物更昔洛韦（GCV）后，GCV被Delta-tk磷酸化并具有强烈的细胞毒性，导致细胞死亡。

图3为本发明系统报告基因mCherry对HCVcc入侵进行应答。当细胞被丙型肝炎病毒HCVcc侵染72小时，且培养环境中含有Doxycycline时，mCherry红色荧光被激活，而且信号受到tight-TRE启动子的严格调控，缺少其中任何一个因素，都将无法激活信号。比例尺：200μm。

图4为本发明系统报告基因Delta-tk在GCV存在时对HCVcc的入侵应答。当培养环境中同时加入了更昔洛韦（GCV,2μg/ml），HCVcc侵染120小时后，可以看出明显的细胞死亡，并且死亡信号受到HCVcc、Doxycycline和GCV三重因素的严格调控。比例尺：200μm。

图5表示NS3/4A抑制剂可明显抑制本发明报告系统对HCVcc信号的应答。荧光信号随NS3/4A抑制物VX-950浓度的提高而不断衰减。图中从左到右VX950浓度不断增高，浓度为0nM的用DMSO代替，可以明显看出从200nM开始红色荧光明显减弱，到500nM的浓度红色荧光几乎完全抑制。比例尺：200μm。

图6表示本发明的报告系统可应用于流式细胞仪分选并对不同HCVcc病毒滴度得到的阳性率。通过流式细胞仪分析不同HCVcc病毒滴度下的阳性率，纵坐标为细胞个数，横坐标为荧光强度。左图为未用HCVcc侵染的对照组，通过流式细胞仪分析，划定阈值；中图为病毒滴度为1.1967×10⁴FFU/ml时，细胞中相当一部分越过了阈值，即为显示红色荧光的阳性细胞样本；右图为当病毒滴度达到1.077×10⁵FFU/ml时，已有96.8%的细胞显示红色荧光。

图7为本发明实施例3中将病毒滴度按照一定梯度逐级稀释，对应得到的阳性率分别按照指数坐标和线性坐标作图。将不同HCVcc滴度浓度梯度与对应的阳性率作图并拟合曲线，纵坐标为阳性率，横坐标为HCVcc病毒滴度，a图采用指数坐标，b图采用线性坐标。从a图中可以明显看出当滴度达到405FFU/ml时，曲线开始上扬，达到1215FFU/ml时已接近拐点，说明系统对HCVcc的敏感性很高；从b图可见阳性率与病毒滴度存在显著的线性正相关，说明系统对于NS3/4A这一影响因子因果关系的严谨性和稳定性。

图8为本发明实施例4中采用TALEN基因敲除技术敲除CLDN1、OCLN两个基因。a.针对CLDN1设计的一对TALEN分别针对的序列；b.测序结果表明插入31bp，造成移码突变；c.针对OCLN设计的一对TALEN分别针对的序列；d.发生了17bp的缺失，造成移码突变。

图9表示本发明实施例4中CLDN1、OCLN基因敲除可以完全抑制HCVcc的cell-free入胞过程。a.将野生型细胞（CLDN^+/+）与CLDN1^-/-、CLDN1^-/-/CLDN1分别平铺于12孔板中，HCVcc侵染72小时后，CLDN1敲除细胞系完全抑制了红色荧光，而当外源回补表达了该蛋白，红色荧光又重新出现；b.有关OCLN也得到同样的实验结果。比例尺：100μm。

图10为本发明实施例5中用于检测HCVcc通过cell-to-celltransmission方式传播的原理。绿色标记的为预先36小时用HCVcc侵染的donor细胞，将其与带有报告系统的待检测细胞混合。如果E2蛋白被抗体封闭或因相关基因的敲除可以阻断cell-free传播途径，与donor细胞接触的带有报告系统的细胞可能会通过cell-to-celltransmission的方式被HCVcc侵染并发出红色荧光。

图11表示本发明实施例5中CLDN1敲除可以完全抑制HCVcc的细胞间传递，而OCLN在这一过程中并非必须。利用报告系统通过Transmissionassay研究CLDN1、OCLN在HCV通过cell-to-celltransmission传播的作用。提前36小时用HCVcc（HCVcc基因组经过改造，有绿色荧光标记以便观察）对“donor”细胞进行侵染，然后与各细胞系混合并继续培养，72小时后观察。左图标“—”的为“donor”细胞，没有与其他细胞混合；从中、右两图可以明显看出，CLDN1-/-中可以完全没有发出红色荧光，也就是说CLDN1的敲除完全阻断了HCV通过cell-to-celltransmission的方式在细胞间传播，而OCLN^-/-中依然可以进行。比例尺：100μm。

图12为本发明实施例1中pLentiCMVMCSSBsd质粒图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1抗丙肝病毒药物高通量筛选模型及其构建方法

1、报告系统质粒的构建

以质粒pLentiCMVMCSSBsd作为骨架，质粒图谱如图12所示，质粒全序列如SeqIDNo.9所示。

克隆分为两步：

第一步：Delta-tk、2A、mCherry报告基因模块分别对应于表1中引物1-6，采用PCR进行扩增，基因模板由北京大学生命科学学院魏文胜实验室库存。然后分别采用相应的限制性内切酶进行酶切，顺次装载入pEN_TTmcs质粒tight-TRE启动子后的多克隆位点。由此得到完整的从tight-TRE到mCherry（包含终止密码子）的完整序列。

然后，将pLentiCMVMCSSBsd质粒自带的CMV启动子用限制性内切酶ClaI和BamHI切掉，切胶回收质粒主体部分；同时用表1中引物7和8扩增tightTRE-DeltaTK-2A-mCherry完整序列并分别用ClaI和BglII进行酶切并回收片段。最后将片段插入pLenti的ClaI和BamHI两酶切位点之间。转化此连接产物至DH5α感受态细胞中，并涂平板，筛选单克隆，测序验证插入序列正确。

第二步按照类似思路，利用表1中引物9-12，分别进行PCR获得rtTA和MAVS(C)序列，分别采用对应的限制性内切酶将目的片段顺次连接入质粒pCDNA6HASIRESPURO（质粒序列如SeqIDNo.10所示），由此在该质粒上得到rtTA-MAVS(C)-IRES完整片段。随后以此完整片段为模板，用表1中引物13和14进行PCR扩增，纯化产物并用XhoI进行酶切并回收酶切片段。同时将第一步得到的中间产物质粒用XhoI单酶切并去磷酸化，得到含有XhoI限制性内切酶粘性末端的开环质粒。最后将带有XhoI粘性末端的rtTA-MAVS(C)-IRES插入上述开环质粒粘性末端之间。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并涂平板，筛选单克隆，测序验证插入序列正确。

得到包含正确序列插入片段的菌株后，保存菌株并扩增，得到报告系统质粒（图1）。

表1报告系统质粒构建中涉及的引物序列（5′-3′）

注：根据引物名称命名原则，第一个单词为组件名称，“F”和“R”分别表示正向和反向引物，

“/”后表示引物对应的限制性内切酶名称。

2、包装lentivirus

采用pVSV-G、pR8.74质粒包装系统，与上述获得的报告系统质粒按照10:1:10的质量比，共计8.4μg一同转染293T细胞系，48小时后收集细胞培养基，其中包含所需要的慢病毒。

3、采用lentivirus载体将报告系统转入宿主细胞系

将Huh7.5细胞系培养于六孔板中，待细胞长势良好，密度约50%时，向含有Polybrene（8μg/ml）的培养基中加入上述收集的慢病毒适量（可根据病毒滴度做一定的浓度梯度），48小时后加入杀稻瘟菌素BSD（2.5μg/ml）筛选，待具有抗性的细胞单克隆长至肉眼可见，挑选并扩增。

挑选出来的若干单克隆，可直接使用HCVcc或表达NS3/4A蛋白酶的慢病毒监测其性能，向培养基中加入2μg/ml的强力霉素，72小时后在荧光下观察mCherry效果。不同单克隆之间要根据荧光强度强弱，反应时间长短，阳性率高低，以及是否存在缺少某一关键因子的自发荧光等标准来挑选一个性能最好的单克隆细胞株。

实施例2NS3/4A特异性抑制剂VX-950可显著抑制系统荧光信号

本实施例根据HCVNS3/4A蛋白酶的生理活性进行开发，为了验证实施例1中构建的报告系统的严谨性、灵敏性，以及是否可以应用于化合物筛选，设计如下实验：

将含有报告系统的HCV宿主细胞Huh7.5以每孔10⁵个细胞均匀平铺于12孔板上。使用DMEM培养基在37℃，5%二氧化碳浓度的培养箱中进行培养。

所述DMEM培养基为DMEM（LifeTechnologies）、10%FBS（ThermoScientific）、1×NEAA（LifeTechnologies）并包含1×的双抗（penicillin-streptomycin）。

次日，用含有强力霉素（2μg/ml）和HCVcc（3.6×10⁴FFU/ml）的DMEM更新每孔中的培养基。

同时，以DMSO为对照组，实验组中每孔中加入不同体积VX-950储液，使得各孔浓度依次为50、100、200、500nM。

72小时后在荧光显微镜下观察各孔报告系统对HCV侵染的应答状况，实验结果如图5所示。从结果可以看出，随着VX-950浓度的增高，发出红色荧光细胞的比例在不断下降，从200nM开始明显抑制了红色荧光信号，直至500nM的浓度几乎完全抑制，所有试验表现与文献中所报道的VX-950对NS3/4A活性的抑制效果是一致的。由此可以证明本发明可用于对抗HCV小分子化合物的药物筛选。

实施例3使用流式细胞仪（FACS）实现高通量分析

为了进一步验证本发明报告系统对HCVcc侵染的灵敏性，以及能否成功采用FACS进行高通量分析，设计如下实验：

1、准备细胞，设置分析样本

以每孔2×10⁵个细胞的密度将实施例1中挑选出性能最好的单克隆Huh7.5细胞依次平铺于6孔板，总计14个孔，包括一个对照组和13个实验组。

次日，参照实施例2中荧光信号的使用方法，用含有强力霉素的DMEM更新培养基，每孔2ml。在最高浓度（第14孔）加入0.6mlHCVcc病毒储液和0.4mlDMEM培养基（并补充1μl浓度为2mg/ml的强力霉素储液），共3ml，计算得到病毒滴度为1.077×10⁵FFU/ml。

然后用移液器混匀，并吸取1ml第14孔的培养基加入第13孔中，混匀后以此类推直到第2孔。每孔中HCVcc的滴度则以3倍的梯度逐级稀释，并可以简单计算出每孔中的HCVcc病毒滴度。

2、FACS分析

72小时后，用胰酶消化各孔的细胞，并将收集的细胞悬浮于PBS中准备做FACS分析。

在BDFACSAria^TMIII流式分析仪上进行分析，激发光采用561nm激光器，滤光片选用610/20nm通道。首先分析对照组并设定“阳性”阈值（细胞可能会有不同程度的自发荧光，根据对照组划定阈值），然后依照HCVcc滴度从低到高的顺序依次分析每个样本，并记录阳性率。

3、数据分析

各实验组阳性率和病毒滴度如表2所示。

表2各实验组数据

编号	阳性率（%）	病毒滴度（FFU/ml）
			1	0.1	0
2	0.1	0
			3	0.1	1
4	0.2	2
			5	0.1	5
6	0	16
			7	0.3	49
8	0.9	148
			9	1.9	443
10	5.2	1330
			11	14.6	3989
12	38.4	11967
			13	96.1	35900
14	96.8	107700

以病毒滴度和发出红色荧光的细胞阳性率为坐标作图分析。以病毒滴度FFU/ml为横轴，阳性率为纵轴，选取其中编号分别作3指数坐标和线性坐标并拟合曲线，结果如图7所示（在BDFACSAria^TMIII分析中，误差率约为0.1%，故实验组2-6可以认为已经检测不到阳性样本）。从图7a可以看出，该报告系统非常灵敏，在病毒滴度为10²FFU/ml量级时阳性率开始明显变化，滴度达到10³FFU/ml量级时阳性率变化曲线接近拐点；而图7b则体现出系统对于HCVcc滴度这一单一变量呈严格的线性正相关，一方面充分证明了系统严格的因果关系，另一方面为进一步精确定量实验提供了保证。

另外可以看出，从第13孔开始，基本达到饱和，离开数据的线性空间，最高可以达到96.8%的阳性率，如图6所示，极高的阳性率在高通量FACS筛选时可以降低阴性率，为筛选的准确性提供保障。

实施例4利用报告系统结合真核基因敲除技术研究HCVcc表面受体在cell-free入胞途径中的作用

本发明可与真核基因敲除技术相结合，从而验证特定基因在HCV完成生命周期过程中是否起关键作用。一方面，系统的灵敏性与稳定性为实验结果的准确性提供了充分保障；另一方面，基因敲除技术不同于传统的基因干涉，也是“有”或“无”的差别。本实施例以此为切入点，结合TALEN基因敲除技术，验证CLDN1、OCLN是否为HCVcc侵入宿主细胞的必需受体。

相对而言，HCV是一个发现比较晚的感染性病毒。在体外培养中可实现完整生命周期的HCVcc直到2005年才被分离出来，对于它的入胞机制还有很多尚不清楚之处。目前学术界相对公认的有CLDN1(Evans,vonHahn等,2007)、OCLN（Ploss,Evans等,2009）、CD81(Pileri,Uematsu等,1998)、SR-BI(Scarselli,Ansuini等,2002)等细胞膜蛋白在HCV入胞中起关键作用，而除了这四个相对公认的细胞膜表面受体之外，还包括LDLR(Lv等,2009)、ApoE(Huang,Sun等,2007)、ApoB(Zhu等,2009)、NPC1L1（BSainzJr等2012）、EGFR、EphA2（JoachimLupberger等,2011）等蛋白也不断报道出来，在HCV入胞过程中起重要作用，HCV的入胞机制依然存在诸多不确定。

本发明为解决这些难题提供了一个综合有效的解决方案。本实施例以CLDN1、OLCN为例，采用TALEN基因敲除技术，分别设计了两对TALEN，如表3所示。

表3TALEN序列（5′-3′）

TALEN识别位点如图8a、8c所示。采用CN102864158A中公开的TALEN构建技术，构建TALEN序列，将重复序列装入真核表达系统的TALEN载体，由于载体上不带筛选基因，分别将两对TALEN载体和带Puromycin抗性筛选基因的质粒载体pcDNA6puro利用电转的方法，共同转入含报告系统的野生型Huh7.5细胞中（wildtype，WT），筛选含有Puromycin抗性的细胞克隆，并进一步PCR测序基因组（测序及扩增引物见表4）的方法来寻找被TALEN成功基因敲除的克隆，分别得到CLDN1、OCLN两基因被敲除的Huh7.5细胞系，分别表示为CLDN1^-/-、OCLN^-/-，单克隆基因组测序如图8b、8d所示，分别形成31bp的插入和17bp的缺失，导致基因失去功能。

表4鉴定CLDN1、OCLN敲除的扩增及测序引物序列（5′-3′）

同时，为了进一步验证该基因的作用，又分别构建了基于慢病毒表达载体的可外源回复表达CLND1、OCLN的表达质粒，并包装成慢病毒，再次侵染CLDN1^-/-、OCLN^-/-，分别得到外源回复表达被敲除蛋白的细胞系，表示为CLDN1^-/-/CLDN1、OCLN^-/-/OCLN。

按照报告系统基本使用方法，参照实施例2中的具体参数，以带有报告系统的野生型Huh7.5细胞作为对照，在被HCVcc侵染72小时后在显微镜下观察，结果如图9所示，CLDN1^-/-、OCLN^-/-细胞系中完全观察不到红色荧光，而在回补外源表达了相关蛋白之后，HCVcc可以再次使其发出红色荧光，说明这两个基因确实在HCVcc的入胞过程中起到不可或缺的作用。

实施例5验证HCV在细胞间传递（cell-to-celltransmission）途径中关键基因的作用

目前已知HCV包含两种传播途径，一种称为cell-free的HCV病毒直接通过表面受体侵入细胞，这种途径又称为CD81-dependent途径；另一种称为cell-to-celltransmission，后者不同于前者，是通过细胞间紧密连接（tightjunction）蛋白直接发生传导，也称为CD81-independent(TimpeJM等,2008;WitteveldtJ等,2009)。越来越多的体外研究发现，第二种途径在细胞间传播的速度更快，甚至在某些基因型中起主导性作用(BrimacombeCL等,2011)，然而对该途径的机制研究却非常匮乏（LukeW.Meredith等2012）。根据已有报道，CLDN1、OCLN均在该过程中起决定性作用（ClaireL.Brimacombe等2010;CiesekS等2011）。

本发明为检测HCV细胞间传递提供了一种简单易行的解决方案。现有的研究细胞间传递方法，或者需要大量的抗体进行染色标记（JoachimLupberger等,2011），费时费力并且耗费昂贵，或是依赖细胞图形变化的报告系统（ChristopherTJones等,2010），可以方便地检测到HCV是否在细胞间发生传递，但只能依赖肉眼观察，方法不够灵敏也无法实现自动化，更不能结合FACS技术对样本进行搜集并进行下一步研究。本发明建立的方法学除了简单易行之外，还可以依赖仪器进行自动化筛选。

实验方案如图10所示，先将“donor”细胞，不含报告系统的野生型Huh7.5细胞作为供体，预先36小时用足量HCVcc进行侵染，当细胞混合在一起，同时用抗体封闭HCV表面蛋白E2组织cell-free的入胞途径（当所研究蛋白的敲除本身可以完全阻断cell-free的入胞途径则可省略这一步），72小时后如果被研究细胞系发出红色荧光，则说明HCV通过cell-to-celltransmission途径发生了传递。

实验时，将实施例4中带有报告系统的WT（wildtype）、CLDN1^-/-、OCLN^-/-、CLDN1^-/-/CLDN1、OCLN^-/-/OCLN分别进行消化、计数，与预先侵染的“donor”细胞均匀混合于12孔板里（1:1比例，共计20万/孔）。培养基中保持2μg/ml强力霉素浓度恒定，维持培养72小时。

72小时候后可在显微镜下分别观察每孔的红色荧光状况，由于CLDN1、OCLN在实施例4中已经确认可以完全阻止HCVcc的cell-free入胞途径，因而不必用抗体封闭E2蛋白，实验结果如图11所示。

根据实验结果可以清楚地得出结论，CLDN1在cell-to-celltransmission中同样是必须的，但是OCLN不同于文献报道，敲除OCLN并不能完全抑制HCV以cell-to-celltransmission的方式向相邻细胞传播。

该方案不仅可以简单方便地判定某个细胞系是否可以通过cell-to-celltransmission的方式传播，结合基因敲除技术更可以直接、准确地验证某个基因在HCV两种传播途径中是否起到必不可少的作用。同时，该方案还可以结合FACS，将发出红色荧光的细胞分离，并进一步研究深入机制，具体方法参见实施例3。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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Claims (7)

1.抗丙肝病毒药物高通量筛选模型，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：

1)报告质粒的构建：以慢病毒包装质粒为骨架，其中至少串联连接有两个基因表达盒，一个基因表达盒用于表达rtTA-MAVS融合蛋白，另一个基因表达盒用于表达tight-TRE启动子下游的报告蛋白，两个基因表达盒之后连接有抗性基因，即构建得到报告质粒；

其中，rtTA为四环素调控反式激活子，MAVS为线粒体外膜蛋白；

2)采用慢病毒包装系统产生含有上述报告质粒的慢病毒，然后侵染HCV宿主细胞，将侵染的细胞作为针对HCVNS3/4A蛋白酶的抗丙肝病毒药物高通量筛选模型，向含有上述侵染细胞的培养基中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后，根据报告蛋白的表达和/或细胞的存活情况，来评价该药物化合物对丙肝病毒的抑制活性；

步骤1)中所述慢病毒包装质粒为pLentiCMVMCSSBsd，序列如SeqIDNo.9所示；

步骤1)中用于表达rtTA-MAVS融合蛋白的基因表达盒位于SV40启动子下游，且该融合蛋白的C端连有内部核糖体进入位点序列IRES；

步骤1)中所述报告蛋白为mCherry荧光蛋白和自杀基因Delta-tk之间通过2A序列连接；

其中，自杀基因Delta-tk的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示，2A序列如SeqIDNo.3所示。

2.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征在于，步骤1)中所述抗性基因为杀稻瘟菌素抗性基因。

3.根据权利要求1或2所述的筛选模型，其特征在于，步骤1)中构建得到的报告质粒为pLenti-TK-mCherry-rtTA-MAVS，其核苷酸序列如SeqIDNo.8所示。

4.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征在于，步骤2)中所述HCV宿主细胞为Huh7.5细胞，培养细胞所使用的培养基为DMEM，其中还含有10％FBS、1×NEAA、1×青霉素链霉素双抗溶液和2μg/ml强力霉素，细胞培养条件为37℃，5％CO₂。

5.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征在于，步骤2)中使用流式细胞仪检测报告蛋白的表达和/或细胞的存活情况。

6.权利要求1-5任一项所述的筛选模型在抗丙肝病毒药物高通量筛选中的应用。

7.权利要求1-5任一项所述的筛选模型在研究HCV侵染宿主细胞的分子机制中的应用。