CN106399456A - 抑肽酶的用途及寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法 - Google Patents

抑肽酶的用途及寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑肽酶用于寨卡病毒非结构蛋白酶活性抑制剂的用途。本发明同时公开了一种寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，在测定过程中，选用抑肽酶Aprotinin作为寨卡病毒非结构蛋白酶中NS2B‑NS3的活性抑制剂，该测定方法证明了抑肽酶对寨卡病毒中对应非结构蛋白酶具有明显的抑制作用。本发明从利用抑肽酶抑制非结构蛋白酶活性这一出发，提出了预防和治疗寨卡病毒感染的新思路，进而为后续寨卡病毒药物研发确定了方向。

Description

抑肽酶的用途及寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法
技术领域
本发明涉及药物的技术领域，具体说是一种抑肽酶的用途及寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属黄病毒科(Fla.viviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，呈球形，直径约为40—70 nm，有包膜。黄热病病毒属于黄热病科黄热病毒属的病毒，为RNA病毒，具有嗜内脏性及嗜神经性，在室温下容易死基因组为单股正链RNA，长度约为10.8Kb。基因组包含一个开放阅读框(ORF)，编码一个多聚蛋白。
寨卡病毒最早于1947年从乌干达森林中的猕猴身上分离出来。1952年首次从人体分离出来。截至上世纪末，寨卡病毒感染被认为仅在赤周围的非洲、美洲、亚洲和太平洋地区散发，被证实的人类感染病例仅14例。该病毒自2007年开始出现暴发流行。2015年底至2016年初，美洲出现寨卡疫情，并通过旅游者输入到其他国家。截至2016年2月，美洲、非洲、亚洲等地已有超过30个国家出现寨卡病毒传播。虽然寨卡病毒感染者大部分症状较轻微，通常在发病3—7天后可自行痊愈，但医学界普遍认为这种快速传播的病毒可能与异常增多的新生儿小头畸形有关联。2016年2月1日，世界卫生组织召开紧急会议，宣布寨卡病毒的暴发和传播已经构成全球突发公共卫生事件。之后越来越多的证据显示寨卡病毒感染和胎儿畸形以及神经系统疾病之间存在因果关系。。寨卡病毒表达的蛋白酶是抗寨卡感染的理想靶标。
因此测出寨卡病毒表达的蛋白酶的活性并筛选出好的活性抑制剂对杀死这种病毒的传播起着至关重要的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抑肽酶的用途及寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
本发明的抑肽酶用于寨卡病毒非结构蛋白酶活性抑制剂的用途。
本发明还可以采用以下技术措施：
抑肽酶即为Aprotinin，针对寨卡病毒的非结构蛋白酶为NS2B-NS3。
本发明的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，包括以下步骤：
A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；
B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5:1至10:1的比率混合在16℃下连接10到18h；
C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；
D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；
E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG并于16℃培养16-18个小时；
F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌5-6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；
H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；
I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶部分；
J、寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC作为底物；荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent酶标仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；蛋白浓度为100nM,荧光底物选用多个浓度，分别进行测定；蛋白缓冲液组分为10 mM Tris,20%体积百分数的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；
K、分别独立进行多组测定，得到非结构蛋白酶在达到最大反应速度一半时的底物浓度Km和酶的最大反应速度Vmax；
L、选取最优荧光底物浓度，选择不同浓度的抑肽酶Aprotinin分别进行测定；
M、分别独立进行多组测定，将不同浓度下的反应数据进行IC50的拟合，根据Ki=IC50/(1+[S]/Km)计算出Ki。
步骤J中荧光底物的浓度分别选择150μM 、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM。
步骤L中，荧光底物的最优浓度为100μM，抑制剂浓度梯度为25μM、20μM、15μM 、10μM、5μM 、2.5μM 、1.25μM 、0.625μM 、0.3125μM。
利用底物AC-LKRR-AMC测得的蛋白酶活性的Km=85.32±2.11μM ，Kcat=1149.19±69.0710-3 s-1, Kcat/Km=13469M-1S-1；利用Aprotinin测得动力学抑制常数Ki=0.361±0.019 μM。
采用GraphPad Prism软件处理数据；不同底物浓度时的反应数据使用“nonlinear fit”-“straight line”来确定其拟合度，据此选择前300s的反应数据计算其初始线性反应速率；不同底物浓度下的初始线性反应速率中使用“nonlinear fit”“Michaelis–Menten”计算Km 与Vmax；将各底物浓度下的反应数据使用程序中“nonlinearfit”-“log(inhibitor) vs.response-Variable slope”来进行IC50的拟合。
本发明具有的优点和积极效果是:
本发明的抑肽酶能够寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性抑制剂，通过使用Aprotinin作为抑制剂的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，通过优选抑制剂的浓度，能够为抗寨卡病毒的感染找准方向，进而推动寨卡病毒的针对性药物研发进程。
附图说明
图1是本发明的寨卡病毒非结构蛋白酶活性抑制剂的测定方法过程中的Km荧光图；
图2是本发明的寨卡病毒非结构蛋白酶活性抑制剂的测定方法中的Aprotinin的IC50示意图。
具体实施方式
本发明的抑肽酶用于寨卡病毒非结构蛋白酶活性抑制剂的用途。
抑肽酶即为Aprotinin，针对寨卡病毒的非结构蛋白酶为NS2B-NS3。
A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；
B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5:1至10:1的比率混合在16℃下连接10到18h；
C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；
D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；
E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG并于16℃培养16-18个小时；
F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌5-6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；
H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；
I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶部分；
J、寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC作为底物；荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent酶标仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；蛋白浓度为100nM,荧光底物选用多个浓度，分别进行测定；蛋白缓冲液组分为10 mM Tris,20%体积百分数的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；
K、分别独立进行多组测定，得到非结构蛋白酶在达到最大反应速度一半时的底物浓度Km和酶的最大反应速度Vmax；
L、选取最优荧光底物浓度，选择不同浓度的抑肽酶Aprotinin分别进行测定；
M、分别独立进行多组测定，将不同浓度下的反应数据进行IC50的拟合，根据Ki=IC50/(1+[S]/Km)计算出Ki。
实施例一：
本发明的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，包括以下步骤：
A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；
B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5:1的比率混合在16℃下连接10；
C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；
D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；
E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD600达到0.6时，加入IPTG并于16℃培养16个小时；
F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌5次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；
H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；
I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶部分；
J、寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC作为底物；荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent酶标仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；蛋白浓度为100nM,荧光底物选用多个浓度，分别进行测定；蛋白缓冲液组分为10 mM Tris,20%体积百分数的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；
K、分别独立进行多组测定，得到非结构蛋白酶在达到最大反应速度一半时的底物浓度Km和酶的最大反应速度Vmax；
L、选取最优荧光底物浓度，选择不同浓度的抑肽酶Aprotinin分别进行测定；
M、分别独立进行多组测定，将不同浓度下的反应数据进行IC50的拟合，根据Ki=IC50/(1+[S]/Km)计算出Ki。
实施例二：
本发明的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，包括以下步骤：
A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；
B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比10:1的比率混合在16℃下连接18h；
C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；
D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；
E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD600达到0.8时，加入IPTG并于16℃培养18个小时；
F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；
H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；
I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶部分；
J、寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC作为底物；荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent酶标仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；蛋白浓度为100nM,荧光底物选用多个浓度，分别进行测定；蛋白缓冲液组分为10 mM Tris,20%体积百分数的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；
K、分别独立进行多组测定，得到非结构蛋白酶在达到最大反应速度一半时的底物浓度Km和酶的最大反应速度Vmax；
L、选取最优荧光底物浓度，选择不同浓度的抑肽酶Aprotinin分别进行测定；
M、分别独立进行多组测定，将不同浓度下的反应数据进行IC50的拟合，根据Ki=IC50/(1+[S]/Km)计算出Ki。
实施例三：
本发明的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，包括以下步骤：
A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；
B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比8:1的比率混合在16℃下连接15h；
C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；
D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；
E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD600达到0.7时，加入IPTG并于16℃培养17个小时；
F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；
H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；
I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶部分；
J、寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC作为底物；荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent酶标仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；蛋白浓度为100nM,荧光底物选用多个浓度，分别进行测定；蛋白缓冲液组分为10 mM Tris,20%体积百分数的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；
K、分别独立进行多组测定，得到非结构蛋白酶在达到最大反应速度一半时的底物浓度Km和酶的最大反应速度Vmax；
L、选取最优荧光底物浓度，选择不同浓度的抑肽酶Aprotinin分别进行测定；
M、分别独立进行多组测定，将不同浓度下的反应数据进行IC50的拟合，根据Ki=IC50/(1+[S]/Km)计算出Ki。
上述各实施例中的步骤J中荧光底物的浓度分别选择150μM 、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM。
步骤L中，荧光底物的最优浓度为100μM，抑制剂浓度梯度为25μM、20μM、15μM 、10μM、5μM 、2.5μM 、1.25μM 、0.625μM 、0.3125μM。
利用底物AC-LKRR-AMC测得的蛋白酶活性的Km=85.32±2.11μM ，Kcat=1149.19±69.0710-3 s-1, Kcat/Km=13469M-1S-1；利用Aprotinin测得动力学抑制常数Ki=0.361±0.019 μM。[1]
采用GraphPad Prism软件处理数据；不同底物浓度时的反应数据使用 “nonlinearfit”-“straight line”来确定其拟合度，据此选择前300s的反应数据计算其初始线性反应速率；不同底物浓度下的初始线性反应速率中使用“nonlinear fit”“Michaelis–Menten”计算Km 与Vmax，结果如图1所示；将各底物浓度下的反应数据使用程序中“nonlinearfit”-“log(inhibitor) vs.response-Variable slope”来进行IC50的拟合，结果如图2所示，可以得出抑肽酶Aprotinin对寨卡病毒的非结构蛋白酶中的NS2B-NS3具有明显的抑制作用。
荧光底物AC-LKRR-AMC为上海吉尔生化有限公司的产品。
Fluoraskan Ascent荧光仪为美国Thermo Scientific的产品。
抑肽酶Aprotinin为Sigma-Aldrich公司产品。
目标载体pET-duet-1为Novagene公司产品。
应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
本文中所涉及的各种实验用品（包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等）之中，对于那些特殊的或者不宜获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式（例如购买、自行制备等）很方便地获得。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种抑肽酶用于寨卡病毒非结构蛋白酶活性抑制剂的用途。
2.根据权利要求1所述的抑肽酶的用途中，抑肽酶即为Aprotinin，针对寨卡病毒的非结构蛋白酶为NS2B-NS3。
3.一种寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，包括以下步骤：
A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；
B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5:1至10:1的比率混合在16℃下连接10到18h；
C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；
D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；
E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG并于16℃培养16-18个小时；
F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌5-6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；
H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；
I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶再用HiTrap Q阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶部分；
J、寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC作为底物；荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent酶标仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；蛋白浓度为100nM,荧光底物选用多个浓度，分别进行测定；蛋白缓冲液组分为10 mM Tris,20%体积百分数的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；
K、分别独立进行多组测定，得到非结构蛋白酶在达到最大反应速度一半时的底物浓度Km和酶的最大反应速度Vmax；
L、选取最优荧光底物浓度，选择不同浓度的抑肽酶Aprotinin分别进行测定；
M、分别独立进行多组测定，将不同浓度下的反应数据进行IC50的拟合，根据Ki=IC50/(1+[S]/Km)计算出Ki。
4.根据权利要求3中所述的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，其特征在于：寨卡病毒的非结构蛋白酶为NS2B-NS3。
5.根据权利要求4中所述的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，其特征在于：步骤J中荧光底物的浓度分别选择150μM 、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM。
6.根据权利要求5中所述的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，其特征在于：步骤L中，荧光底物的最优浓度为100μM，抑制剂浓度梯度为25μM、20μM、15μM 、10μM、5μM 、2.5μM、1.25μM 、0.625μM 、0.3125μM。
7.根据权利要求6中所述的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，其特征在于：利用底物AC-LKRR-AMC测得的蛋白酶活性的Km=85.32±2.11μM ，Kcat=1149.19±69.0710-3 s-1, Kcat/Km=13469M-1S-1；利用Aprotinin测得动力学抑制常数Ki=0.361±0.019 μM。
8.根据权利要求3至7中任一权利要求所述的寨卡病毒非结构蛋白酶活性的测定方法，其特征在于：采用GraphPad Prism软件处理数据；不同底物浓度时的反应数据使用“nonlinear fit”-“straight line”来确定其拟合度，据此选择前300s的反应数据计算其初始线性反应速率；不同底物浓度下的初始线性反应速率中使用“nonlinear fit”“Michaelis–Menten”计算Km 与Vmax；将各底物浓度下的反应数据使用程序“nonlinearfit”-“log(inhibitor)vs.response-Variable slope”来进行IC50的拟合。
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