CN106884017B - 用于包装柯萨奇病毒b5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法。包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒，pEGFP‑CV‑B5/417质粒表达的CV‑B5结构蛋白在细胞中可以包装pCVB3‑复制子转录的CV‑B3亚基因组RNA，产生的假病毒可以用来检测中和抗体。本发明公开了一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测CV‑B5中和抗体的方法。本发明非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群CV‑B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。

Description

用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂 盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的方法及其专用假病毒，具体涉及用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、制备该质粒的方法、假病毒及快速检测试剂盒。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackievirus,Cox V)是一种人类疾病严重的致病病原，其感染可以导致许多疾病，从较轻的呼吸道感染疾病，到比较严重的心肌炎、心包炎及神经系统的一些疾病，甚至可以引起婴幼儿死亡。基因组全长为7389～7402个核苷酸。柯萨奇病毒可以分为A、B两组，A组有24型病毒，B组有6型病毒。

柯萨奇病毒B组5型(Coxsakievirus B5,CV-B5)属于小核糖核酸病毒(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)。CV-B5为单股正链RNA病毒，病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，直径24～30nm，无包膜和突起。CV-B5基因组全长约7400bp，基因组仅有一个开放阅读框及2个非编码区(5’-UTR和3’-UTR)构成。开放阅读框编码含2185个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为3个前体蛋白(P1、P2、P3)，其中P1前体蛋白编码4个病毒衣壳蛋白(VP1～4)，P2和P3编码7个非结构蛋白(2A～2C和3A～3D)。CV-B5感染后引起的轻症包括上呼吸道感染、腹泻以及手足口病等，也可引起病毒性脑炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、扩张性心肌炎以及糖尿病等多种重症疾病，CV-B5感染也为导致胰岛素依赖型(I型)糖尿病的主要诱发因素之一(姚昕,卞莲莲,毛群颖等.柯萨奇病毒B组5型研究进展[J].国际生物制品学杂志,2015,38(5):234-238.)。此外还有文献报道，CV-B5感染可引起短暂性失语症和小儿急性横贯型脊髓炎等罕见临床症状。CV-B5与多起世界范围的病毒性脑炎爆发有关(姚昕,卞莲莲,毛群颖等.柯萨奇病毒B组5型研究进展[J].国际生物制品学杂志,2015,38(5):234-238.)。中和抗体的检测对CV-B5流行病学调查研究以及疫苗研发评价有很重要意义。

目前比较常用的检测中和抗体效价的方法有三大类：病毒中和试验，酶标记检测方法，抗原-抗体间接凝集抑制试验。(English reference:Stanley,Plotkin,WalterOrenstein,Paul Offit；Vaccines,Fifth edition；poliovirus vaccine(inactivated,IPV)Page 618-19；查锦芬，肖长义，佐满珍；疫苗中和抗体体外检测方法的研究进展；中国医药生物技术2008年10月第3卷第5期；374-377页)。

病毒的中和试验是一种以比较病毒受血清中和后残存的感染力为依据，进而判定免疫血清中和病毒能力的方法。早期的病毒中和试验用动物接种，检测病毒感染后血清中残留病毒的感染力，现在已全部被细胞水平的中和试验代替。此类方法均以判定残留的病毒感染力作为标准，主要包括以下几种方法：1.细胞病变中和试验。通过观察中和抗体中和病毒后的细胞病变程度来判定血清中和抗体的水平。但是观察到细胞病变需要时间较长，且受观察者主观因素的影响较大，并且很难根据细胞病变的程度对于中和抗体的活性给出一个定量的评估。2.斑点减少中和试验。正常细胞代谢时会摄入活性染料，但是在病毒感染导致细胞死亡时，细胞会丧失该能力，从而形成无色的噬斑。所以，如果病毒被中和，病毒感染导致的噬斑就会减少。与细胞病变一样，产生噬斑的时间也较长，因而根据其数量的变化从而判断残存的感染力同样也需要较长时间，而且受观察者主观因素的影响较大。3.快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)。将一定量的病毒与系列稀释的待测血清在体外中和后，加入敏感细胞孵育，最后用荧光标记的针对病毒衣壳蛋白的抗体染色，以检测未被抗体中和的残余病毒量(荧光灶)，最后与病毒对照组相比较，可以算出各种待测血清降低病毒的荧光灶50％的稀释度。最后与已知中和抗体滴度的参照血清比较，最终算出每种待测血清的中和抗体滴度(SirkkaVene,Mats Haglund,AkeLundkvist,Lars Lindquist,Marianne Forsgren；Study of the serological responseafter vaccination against tick-borne encephalitis in Sweden；Vaccine 25(2007)366–372)。病毒中和试验是WHO规定的目前检测中和抗体的参考方法，但该试验不仅耗时，而且由于试验中多使用活病毒，所以还需要相应的生物安全设备。试验对技术人员操作的要求高，成本也较昂贵，不适合大规模的筛选试验。此外，活病毒的传代易造成病原漂变，不利于试验的均一性。

酶标记检测方法可用于大量快速的中和抗体的定量检测。主要的酶标记检测方法有：1.ELISA方法。ELISA方法既简单(不需要特殊的试验设备)又安全(不需要活病毒)、可快速，定量检测抗体。Muhamuda等利用小鼠中和性单克隆抗体和人体免疫后血清抗体之间的竞争性建立了竞争性ELISA(即C-ELISA)方法检测狂犬病疫苗中和抗体，增加了ELISA方法的特异性(Kader Muhamuda,Shampur Narayan Madhusudana*,Vasanthapuram Ravi；Development and evaluation of a competitive ELISA for estimation of rabiesneutralizing antibodies after post-exposure rabies vaccination in humans；International Journal of Infectious Diseases(2007)11,441—445)。2.中和组织培养酶联免疫测定法。2005年，Eyal等(OsnatEyal,UdyOlshevsky,ShlomoLustig,NirParan,Menachem Halevy,Paula Schneider,Gil Zomber,Pinhas Fuchs；Development of atissue-culture-based enzyme-immunoassay method for the quantitation of anti-vaccinia-neutralizing antibodies in human sera；Journal of VirologicalMethods130(2005)15–21)提出了一个灵敏、可重复性高且快速的用来检测抗牛痘病毒中和抗体的中和组织培养酶联免疫测定方法(neutralization tissue-culture enzymeimmunoassay，NTC-EIA)。该方法的主要步骤为：用连续不同稀释度的血清中和一定量的牛痘病毒，再感染敏感细胞。最后再用ELISA方法测定残余病毒的量。3.酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)。Abai等(Anna Maria Abai,Larry R.Smith,MaryK.Wloch；Journal of Immunological Methods 322(2007)82–93)用ELISPOT的方法建立了适合在临床上评估HCMV疫苗效价的一种高通量微量中和试验方法。酶标记检测类的方法中ELISA的方法虽然有诸多优点，但是使用病毒的糖蛋白做ELISA检测，其结果与病毒中和试验的一致性欠佳。而其他相关性较高的酶标记检测方法则需要用到活病毒，这对技术人员的操作和安全设备要求比较高。此外，活病毒的传代易造成病原漂变，不利于试验的均一性。

抗原-抗体间接凝集抑制试验利用抗原与抗体混合后不能再与致敏颗粒结合，因此不会出现凝集现象的原理检测中和抗体的滴度。Stephenson等(Iain Stephenson,RoseGaines Das,John M.Wood,Jacqueline M.Katz；Comparison of neutralising antibodyassays for detection of antibody to influenza A/H3N2 viruses:An internationalcollaborative study；Vaccine 25(2007)4056–4063)比较了用于检测抗流感病毒中和抗体的HI(haemagglutinin inhibition)试验和病毒中和(virus neutralization,VN)试验之间的可重复性，他们分别用这2种方法对8个国家11个试验室的血清样本进行了检测。HI法测定的抗体滴度可重复性较好，而VN法则在敏感性上优于HI法；HI法的另外一个缺点是每次观察凝集现象都必须采用新鲜的血细胞。此外，不是所有病毒的中和抗体都能抑制血凝作用，因此该方法比较适合配合病毒的中和试验一同使用，也不大适合于大规模的中和抗体的筛选试验。

目前，检测中和抗体的方法如活病毒的中和试验多采用完全具有传染性的病毒，此类方法的结果虽然可靠，但是缺点是活病毒在传代过程中易发生抗原漂移，更重要的是在试验操作过程中有危险性，因此对于技术人员的操作和安全设备都要求较高。而其他一些不需要用到活病毒的检测方法也存在各种缺陷。例如与作为标准的病毒中和试验的结果相关性不好(ELISA法)，操作繁琐(抗原-抗体间接凝集抑制试验)，成本昂贵(快速荧光灶抑制试验)，因此不适合大规模的快速筛选。

本发明利用CV-B5的假病毒系统检测中和抗体的方法，采用了单周期感染的假病毒系统，所以没有使用活病毒时的安全问题。该假病毒系统是一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。适合于快速、规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群CV-B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。

发明内容

本发明的一个主要目的是提供用于包装柯萨奇病毒B5(Coxsakievirus B5,简称CV-B5)假病毒的重组表达质粒、由重组表达质粒组装成的假病毒和由此制备的试剂盒，以及使用该质粒、假病毒或该试剂盒检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的方法。

所述重组表达质粒命名为pEGFP-CV-B5(417)质粒，表达质粒的氨基酸序列为SEQID NO：3或在SEQ ID NO：3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQID NO：3具有相同或相似功能的序列。

pEGFP-CV-B5(417)质粒使用绿色荧光蛋白报告基因，该报告基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。图一为肠道病毒基因组示意图。

所述SEQ ID NO：3第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3282位为CV-B5(417)所有结构蛋白的编码基因。

本发明的另一个方面，提供一种表达pEGFP-CV-B5(417)质粒重组蛋白的方法，包含以下步骤：1)将绿色荧光蛋白的基因序列与CV-B5(417)所有结构蛋白的基因序列拼接；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的C末端；3)设计引物；

其中，所述引物序列为：IF-pcDNA6-GFP-F:ACCCAAGCTGGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAG IF-pcDNA6-CB5 P1-R:GGTGATGATGACCGGTTTAGGTGGTCTGCATAGTTGTTATATC OL-GFP-AITTL-R:AAGGGTAGTAATGGCCTTGTACAG OL-AITTL-CB5P1-F:Gacgagctgtacaaggccattactacccttggagctcaagtatcaacac。

在一些优选的实施方案中，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因；

在另一些实施方案中，所有结构蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：1)其核苷酸序列为序列表中序列第733位到3282位所示；2)在严格条件下与1)所示的基因杂交且编码所述结构蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述结构蛋白的基因；

本发明的另一个方面，提供一种检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的重组表达质粒，重组表达质粒命名为pCVB3-复制子(pCVB3-replicon-fluc)，表达质粒的氨基酸序列为SEQ ID NO：4或在SEQ ID NO：4上添加、缺失或突变若干个氨基酸后得到的与SEQ ID NO：4具有相同或相似功能的序列。

所述pCVB3-复制子的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因。

在本发明的一个方面，提供上述结构蛋白重组表达质粒或由此制备的试剂盒在检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的应用。

本发明的另一个方面，提供一种假病毒，pEGFP-CV-B5(417)质粒表达的CV-B5结构蛋白和pCVB3-复制子转录的CV-B3亚基因组RNA在哺乳动物传代细胞中组装而成的CV-B5重组病毒，假病毒。该假病毒可用于检测肠道柯萨奇病毒B5特异性中和抗体。

本发明提供一种体外的、非诊断性检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的试剂盒，该试剂盒包含上述假病毒。

在一些实施方案中，所述假病毒是将用于包装肠道柯萨奇病毒B5假病毒的重组质粒转染293T细胞中包装得到的重组病毒。

本发明所提供一种检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的方法，包括以下步骤：

将所述假病毒与系列稀释的待测抗体样品(如血清等)混合，得到混合物；用所述混合物感染对肠道柯萨奇病毒B5敏感的细胞，根据所述对肠道病毒敏感的细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性检测待测样品中是否含有CV-B5特异性中和抗体或定量检测待测抗体样品中CV-B5特异性中和抗体的效价。

含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

基于以上方案，本发明提供了安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。由于采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。中和试验的病毒残余量则对应于进入细胞内的病毒RNA亚基因组(删除了结构基因，而代替以荧光素酶基因的病毒基因组)在细胞内表达得到荧光素酶的量。向细胞裂解液加入荧光素酶的底物发生化学发光反应后，荧光素酶的量可由化学发光仪精确定量。荧光素酶化学发光反应读数的对数在较大范围内和残留的病毒量有良好的线性关系。试验过程操作简便，对技术人员要求不高。从成本来说，该方法也比较低廉，可以在96孔细胞内进行大规模的筛选试验。

基于以上特点，该假病毒检测系统非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群手足口病、CV-B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示肠道病毒基因组示意图；

图2示单周期感染假病毒示意图；

图3a-3d示定量检测待测血浆中和抗体滴度的结果；

图4示假病毒检测和传统CPE检测方法结果相关性；

图5示CV-B5假病毒做中和试验特异性结果分析；

图6示CV-B5(417)假病毒系统的线性范围。

具体实施方式

下面结合实施例和附图阐释本发明的原理。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为市售。

RD细胞(来源于人横纹肌肉瘤)(购自ATCC，产品目录号为CCL-136^TM)和293T细胞(来源于人胚胎肾细胞)(购自ATCC，产品目录号为CRL-11268^TM)在10％ FBS(胎牛血清，购自GIBCO,产品目录号为10099-141)的DMEM中培养。RD细胞为用于检测中和抗体试验的敏感细胞系。293T细胞被用来包装EV71的假病毒。

实施例检测肠道病毒CV-B5的中和抗体

一、定性检测肠道病毒CV-B5的中和抗体的有效性及定量检测肠道病毒CV-B5的中和抗体的效价

1、构建CV-B5结构蛋白表达质粒和CV-B3复制子质粒

(1)制备CV-B5 cDNA

取CV-B5的活病毒CV-B5 417/JS/CHN/2013(可从中国食品药品检定研究院获得)，CV-B5 417的RNA用TrizolReagent提取(购自Invitrogen，产品目录号为15596-018)。所得的RNA被用作反转录PCR的模板，用Random Pimer(购自Takara,产品目录号为3801)作为引物，反转录出cDNA。

(2)构建CV-B5(417)结构蛋白表达质粒

以反转录出的cDNA为模板，PCR扩增获得CV-B5(417)的结构蛋白编码区段，并在病毒基因组结构蛋白N’端插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因。将绿色荧光蛋白(EGFP)的基因序列与CV-B5(417)所有结构蛋白的基因序列拼接，并将2A蛋白酶的酶切位点插入EGFP基因的C末端，拼接得到融合基因I(如图2所示)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

其中，第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3282位为CV-B5(417)所有结构蛋白的编码基因，编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，即CV-B5(417)的所有结构蛋白(如图1所示的VP4、VP2、VP3和VPl表示CV-B5(417)的所有结构蛋白)。

同时，通过引物在拼接得到DNA片段的5’端和3’端分别引入15bp长度的与NheI/AgeI双酶切后产生的线性化pCDNA6/HisA的载体末端互补的序列。pCDNA6/HisA用NheI(购自New England BioLabs，产品目录号为R0131)和AgeI(购自New England BioLabs，产品目录号为R0552)酶切，然后将插入片段用In-Fusion连接克隆到pCDNA6/HisA的载体(购自Takara,产品目录号为638909)上，得到重组质粒，命名为pEGFP-CV-B5(417)capsid(质粒)。

重组质粒验证方法：

①转化后挑取单克隆，LB摇菌后，进行菌液PCR，提取质粒；

②用NheI和AgeI对重组质粒进行双酶切鉴定；

③挑选酶切图谱正确的克隆送奥科测序公司进行测序。

PCR构建引物如下：

IF-pcDNA6-GFP-F:ACCCAAGCTGGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAG

IF-pcDNA6-CB5 P1-R:GGTGATGATGACCGGTTTAGGTGGTCTGCATAGTTGTTATATC

OL-GFP-AITTL-R:AAGGGTAGTAATGGCCTTGTACAG

OL-AITTL-CB5P1-F:Gacgagctgtacaaggccattactacccttggagctcaagtatcaacac

(3)构建含有表达荧光素酶基因的CV-B3的复制子质粒。

具体方法如下：

CV-B3复制子(CV-B3 subgenomic replicon)DNA分子是将柯萨奇病毒B组3型的亚基因组RNA对应的cDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA，DNA分子为SEQ ID NO：4中序列第1位到6520位所示的DNA分子。

将CV-B3(Nancy)的5’UTR，荧光素酶基因和CV-B3基因组的非结构蛋白基因及其之后的序列用重叠PCR方法拼接，得到融合基因II，其核苷酸序列SEQ ID NO：4所示，其中第1位到742位为CV-B3(Nancy)的5’UTR核苷酸序列；第743位到2392位为荧光素酶基因的核苷酸序列。第2393位到2410位为2A蛋白酶的识别位点；第2411位到6520位为CV-B3(Nancy)非结构蛋白的编码基因；同时在所得到的融合基因II的5’UTR前引入T7promoter的序列(如图2所示)。

克隆CV-B3复制子的步骤：

①以CV-B3(Nancy)全长感染性克隆质粒为模板进行PCR扩增，分别得到CV-B3(Nancy)的5’UTR(UTR,untraslated region；非编码区)，非结构蛋白基因，3’UTR；以pLuc(购自Agilent Technologies，产品目录号为219087)为模板扩增firefly Iuciferase基因。

②将第一步所得到的片段通过PCR拼接起来得到CV-B3(Nancy)-Fluc。

③通过引物再拼接得到CV-B3(Nancy)-Fluc DNA片段的5’端和3’端分别引入15bp长度的与PstI(购自New England BioLabs；产品目录号为R3140)/MluI(购自New EnglandBioLabs；产品目录号为R0198)双酶切后产生的线性化pSPORT1的载体末端互补的序列，然后用In-Fusion将片段插入PstI/MluI双酶切后产生的线性化pSPORT1载体(购自Takara,产品目录号为638909)上，得到重组质粒。

克隆鉴定方法：①转化后挑取单克隆，LB摇菌后，进行菌液PCR，提取质粒。②用PstI和MluI对所得重组质粒用酶切鉴定。③挑选酶切图谱正确的单克隆测序。测序结果表明，在pSPORT1载体上插入了序列表所示的DNA序列，说明重组质粒构建正确，将所得的重组质粒命名为pCVB3-replicon-fluc。

2、DNA的转染与产假病毒

转染前12-14小时在10cm²的细胞培养板上铺293T细胞。

转染当天，293T的密度应该达到80-90％。

转染前一小时，用无抗生素的10％ FBS-DMEM(购自Invitrogen公司，产品目录号为11965500BT)培养293T细胞。用(购自Polyplus，产品目录号为114-15)转染10μg三种质粒混合物pEGFP-CV-B5(417)capsid，pCVB3 replicon，pcDNA3.0A-T7polymerase(三种质粒等质量混合)，在37℃细胞培养箱内培养。

24h后在荧光显微镜下观察EGFP荧光蛋白从而判断结构蛋白的表达水平。48h后，将细胞上清收集到15ml管中，在细胞表面留下约500μl的培养基。用剩余培养基将293T细胞重悬起来，并用干冰反复快速冻融两次。将之前收集的培养基上清和冻融过的沉淀混匀，然后再用离心机2，500g离心15分钟，弃沉淀，收集上清，并分装到I.5ml的EP管中，贮存在-80℃冰箱备用。

操作优点，易于标准化：产生假病毒时，只需要先对293T细胞转染包含了假病毒的结构基因的质粒，然后再转染病毒的RNA复制子。病毒的结构蛋白基因被构建在质粒上，可以在-20℃稳定地贮存。因此，假病毒系统可以克服活病毒在传代过程中易发生抗原漂移的缺点。采用假病毒系统做中和抗体的检测，试验的稳定性高，易于标准化。

3、假病毒的中和试验

在96孔的细胞培养板(购自Becton Dickinson，产品目录号为353078)上接种RD细胞，放在37℃，5％ CO₂的细胞培养箱内培养。接种时，需注意保证细胞均匀的分布在培养板上。感染当天，细胞需达到80％左右的密度。

将待测血清56℃灭活30分钟后，在96孔U形孔板(购自产品目录号为3879)中用DMEM培养基从1:8到1:2048进行2倍梯度稀释，每个梯度做2-3个复孔，每孔50μl。然后，分别与等体积的CV-B5假病毒混匀，置于37℃孵育1小时。再将混合液悬空加入到100μl的RD细胞(5×10⁴cells/well)中，最终体积为200μl。然后，将96孔板转移到37℃CO₂培养箱中孵育，孵育后16小时后去掉上清，每孔加入50μl被动细胞裂解液(Promega)(购自Promega，产品目录号为E1941)反复冻融两次裂解细胞，取30μl细胞裂解液，以D-Iuciferin(购自Becton Dickinson,产品目录号为556678)为底物，设置程序后，用化学发光仪(购自Berthold，产品名称为Centro LB960)检测化学发光反应的读数。然后再加入50μl D-荧光素酶底物，室温避光10min。通过荧光测定仪检测确定荧光素酶活性，由光强度表示。每板中同时设置细胞对照、病毒对照、样品对照。

CV-B5(417)假病毒报告系统可以定量检测样品中抗CV-B5(417)中和抗体滴度：

待测样品对假病毒的抑制率(％inhibition)＝100×(阴性对照血清组的化学发光读数-待测血清组的化学发光读数)/阴性对照血清组的化学发光读数。

中和抗体滴度定义为：待测样品对假病毒的抑制率为50％时，待测样品的稀释倍数，即IC50。

将待测血浆用10％ FBSDMEM从1：10依次两倍系列稀释至2560倍，并用其对假病毒做中和试验，以得到的抑制率为纵坐标，相应的待测血浆稀释倍数的对数为横坐标作曲线图；由曲线图可以计算出当待测血浆对假病毒的抑制率为50％时，待测血浆的稀释倍数也即该待测血浆的IC50。

定量检测待测血浆含中和抗体滴度的结果如图3a-图3b所示，血浆201(图3a)、血浆206(图3b)、血浆216(图3c)和血浆223(图3d)均含有抗CV-B5的中和性抗体。计算中和抑制率后对数据进行非现象拟合计算IC50，即可得出在各份血浆样品抗CV-B5中和抗体滴度分别为1904.8、1157.1、332.3和267.5。IC50的数值越高，说明抗体的滴度也越高。以上数据说明该假病毒系统在检测血清中的特异性的中和抗体时，可实现定量检测。

实验相对简便：假病毒的中和试验可以在96孔细胞培养板上进行，每种血清的不同稀释梯度可以做多个复孔，从统计学的角度来讲可以消除孔间差异。假病毒和检测样品的混合物加入细胞培养板后10-20小时，即可将用裂解液裂解细胞，并用排枪取10ul-30ul裂解样品用于化学发光仪的读数。获取数据时，只需要用化学发光仪自动读取荧光素酶化学发光反应的读数即可。化学发光反应所需要的试剂包括裂解液,荧光素酶的底物，荧光素酶的反应缓冲液，成本低廉。因此假病毒系统检测中和抗体方法快速简便而且数据可靠，成本低廉。

单周期感染的优点：假病毒颗粒的包装系统由两部分组成。一个质粒上构建了病毒的结构蛋白基因，另一个质粒上构建了病毒的RNA复制子。CV-B5的假病毒进入细胞时将脱衣壳，并把病毒的复制子RNA释放到细胞内部。复制子的5’末端为核糖体内部进入位点(IRES)。因此，该元件后的荧光素酶以及非结构蛋白基因都可以被细胞内的核糖体直接翻译。非结构蛋白被翻译后可帮助复制子在细胞内进行复制。假病毒颗粒内的单链正义RNA基因组的结构蛋白基因被删除了，并且为荧光素酶基因所代替。因此，假病毒在单次侵入细胞之后，不能够翻译出结构蛋白，所以无法组装出新的感染性病毒颗粒。假病毒感染系统消除了活病毒首次感染后，重复进入细胞的问题。在同一种细胞系上进行感染试验时，假病毒最终感染细胞所得的荧光素酶化学发光反应的读数只受到病毒颗粒在侵入细胞时受到干扰因素(如中和抗体)的影响。

二、检验本发明的方法与经典的活病毒中和试验的一致性

平行地用野生型CV-B5活病毒和CV-B5假病毒检测一组人血浆样品的中和抗体滴度。比较双盲试验结果，发现相关性很高。野生型的CV-B5病毒株为CV-B5 417/JS/CHN/2013，检定血浆样品来源于健康献血员(来自中国食品药品检定研究院)。对两组检测结果做相关性分析，结果表明假病毒系统在检测病毒中和抗体时与经典的活病毒中和试验有很好的一致性。假病毒检测和传统CPE检测方法结果相关性如图4所示。

三、检验CV-B5假病毒做中和试验

为了检验CV-B5(417)假病毒系统的特异性，使用小鼠来源的针对CV-B5(417)的特异性抗血清(来自用CV-B5(417)灭活病毒免疫过的SPF级BALB/c小鼠的血清)，小鼠来源的针对EV-A71(FY)的特异性抗血清(来自用EV-A71(FY)灭活病毒免疫过的SPF级BALB/c小鼠的血清),小鼠来源的针对CV-B3(112)的特异性抗血清(来自用CV-B3(112)灭活病毒免疫过的SPF级BALB/c小鼠的血清),小鼠来源的针对CV-A16(G10)的特异性抗血清(来自用CV-A16(G10)灭活病毒免疫过的SPF级BALB/c小鼠的血清),小鼠来源的针对CV-A6(TW)的特异性抗血清(来自用CV-A6(TW)灭活病毒免疫过的SPF级BALB/c小鼠的血清)和小鼠来源的针对戊型肝炎HEV的特异性抗血清(来自用万泰沧海公司生产的戊型肝炎疫苗免疫过的SPF级BALB/c小鼠的血清)(对SPF级BALB/c小鼠的眼眶采血所得到的血清，此为常规制法；SPF级BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司)对CV-B5(417)假病毒做中和试验。结果如图5所示。

计算抗血清的相对抑制百分率的公式如下：

待测血清对假病毒的抑制率(％inhibition)＝(阴性对照血清组的化学发光读数-待测血清组的化学发光读数)/阴性对照血清组的化学发光读数。

结果表明CV-B5(417)的假病毒能够选择性地被CV-B5(417)的特异中和抗体所中和，但是不能够被其它抗血清中和。因此，CV-B5(417)的假病毒能够特异性地检测到针对CV-B5(417)的中和抗体。并且假病毒系统对于检测中和抗体有很高的灵敏度,仅需少量的血清便检测血清中特异的中和抗体。

四、CV-B5(417)假病毒系统的线性范围

将假病毒原液做系列稀释，感染RD细胞，纵坐标为荧光蛋白素的化学发光反应的读数即相对光单位(RLU,relative light unit)的对数值。对数据进行线性回归分析，得到一个假病毒系列稀释感染的趋势图，如图6所示，由图可见，化学发光仪所读出的荧光素酶化学发光反应读数的对数(lg RLU)的线性范围为从4.5至8，即RLU的读数在之内。

基于上述实施例，本发明提供了安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法，可以在96孔细胞内进行大规模的筛选试验。产假病毒时，只需要先对293T细胞转染包含了假病毒的结构基因的质粒，然后再转染病毒的RNA复制子。病毒的结构蛋白基因被构建在质粒上，可以在-20℃稳定地贮存。假病毒克服活病毒在传代过程中易发生抗原漂移和操作安全性低等缺点。并且假病毒对于检测中和抗体有很高的灵敏度,仅需少量的血清便检测血清中特异的中和抗体。对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群CV-B5特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国食品药品检定研究院

<120> 用于包装柯萨奇病毒B5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法

<130> 2016

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> 绿色荧光蛋白报告基因核苷酸序列

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 850

<212> PRT

<213> 柯萨奇病毒B5(417)结构蛋白氨基酸序列

<400> 2

Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Thr Gly Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile Ile His Tyr Thr Asn Ile Asn Tyr Tyr

20 25 30

Lys Asp Ala Ala Ser Asn Ser Ala Asn Arg Gln Asp Phe Thr Gln Asp

35 40 45

Pro Gly Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Ile Met Ile Lys Ser Met

50 55 60

Pro Ala Leu Asn Ser Pro Ser Ala Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg

65 70 75 80

Val Arg Ser Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys

85 90 95

Ala Asn Val Val Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Thr Tyr Leu Lys Asp

100 105 110

Asp Glu Ala Thr Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr

115 120 125

Cys Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Met Trp Gln Gln Ser Ser Pro

130 135 140

Gly Trp Trp Trp Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Asn Met Gly Leu Phe

145 150 155 160

Gly Gln Asn Met Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ala Gly Tyr Thr Val

165 170 175

His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val

180 185 190

Val Cys Val Pro Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Ala Asn Lys

195 200 205

Pro Asp Gln Lys Ser Leu Ser Asn Gly Glu Thr Ala Asn Met Phe Glu

210 215 220

Ser Gln Asn Ser Thr Gly Gln Thr Ala Val Gln Ala Asn Val Ile Asn

225 230 235 240

Ala Gly Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln

245 250 255

Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr

260 265 270

Ile Asn Ser Val Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Phe Thr

275 280 285

Leu Met Ile Ile Pro Phe Ala Pro Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Thr

290 295 300

Thr Tyr Val Pro Ile Thr Val Thr Val Ala Pro Met Cys Ala Glu Tyr

305 310 315 320

Asn Gly Leu Arg Leu Ala Gly Lys Gln Gly Leu Pro Thr Met Leu Thr

325 330 335

Pro Gly Ser Asn Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Ser

340 345 350

Ala Met Pro Gln Phe Asp Val Thr Pro Glu Met Asp Ile Pro Gly Gln

355 360 365

Val Asn Asn Leu Met Glu Ile Ala Glu Val Asp Ser Val Val Pro Val

370 375 380

Asn Asn Thr Glu Gly Lys Val Leu Ser Ile Glu Ser Tyr Gln Ile Pro

385 390 395 400

Val Gln Ser Asn Ser Thr Asn Gly Ser Gln Val Phe Gly Phe Pro Leu

405 410 415

Met Pro Gly Ala Ser Ser Val Leu Asn Arg Thr Leu Leu Gly Glu Ile

420 425 430

Leu Asn Tyr Tyr Thr His Trp Ser Gly Ser Ile Lys Leu Thr Phe Met

435 440 445

Phe Cys Gly Ser Ala Met Ala Thr Gly Lys Phe Leu Leu Ala Tyr Ser

450 455 460

Pro Pro Gly Ala Gly Ala Pro Thr Thr Arg Lys Glu Ala Met Leu Gly

465 470 475 480

Thr His Val Ile Trp Asp Val Gly Leu Gln Ser Ser Cys Val Leu Cys

485 490 495

Ile Pro Trp Ile Ser Gln Thr His Tyr Arg Tyr Val Val Val Asp Glu

500 505 510

Tyr Thr Ala Gly Gly Tyr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Thr Asn Ile Val

515 520 525

Val Pro Ala Asp Thr Gln Ser Asp Cys Lys Ile Leu Cys Phe Val Ser

530 535 540

Ala Cys Asn Asp Phe Ser Val Arg Met Leu Lys Asp Thr Pro Phe Ile

545 550 555 560

Lys Gln Asp Asn Phe Tyr Gln Gly Pro Thr Gly Glu Ala Val Glu Arg

565 570 575

Ala Ile Ala Arg Val Ala Asp Thr Ile Gly Ser Gly Pro Val Asn Ser

580 585 590

Glu Ser Ile Pro Ala Leu Thr Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser Gln

595 600 605

Val Val Pro Ala Asp Thr Met Gln Thr Arg His Val Lys Asn Tyr His

610 615 620

Ser Arg Ser Glu Ser Thr Val Glu Asn Phe Leu Cys Arg Ser Ala Cys

625 630 635 640

Val Phe Tyr Thr Thr Tyr Arg Asn His Gly Thr Asp Gly Asp Asn Phe

645 650 655

Gly Tyr Trp Val Ile Ser Thr Arg Gln Val Ala Gln Leu Arg Arg Lys

660 665 670

Leu Glu Met Phe Thr Tyr Ala Arg Phe Asp Leu Glu Leu Thr Phe Val

675 680 685

Ile Thr Ser Thr Gln Glu Gln Ser Thr Ile Lys Gly Gln Asp Ser Pro

690 695 700

Val Leu Thr His Gln Ile Met Tyr Val Pro Pro Gly Gly Pro Val Pro

705 710 715 720

Thr Lys Val Asn Ser Tyr Ser Trp Gln Thr Ser Thr Asn Pro Ser Val

725 730 735

Phe Trp Thr Glu Gly Ser Ala Pro Pro Arg Met Ser Ile Pro Phe Ile

740 745 750

Ser Ile Gly Asn Ala Tyr Ser Met Phe Tyr Asp Gly Trp Ala Lys Phe

755 760 765

Asp Lys Gln Gly Thr Tyr Gly Ile Asn Thr Leu Asn Asn Met Gly Thr

770 775 780

Leu Tyr Met Arg His Val Asn Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ile Val Ser

785 790 795 800

Thr Val Arg Ile Tyr Phe Lys Pro Lys His Val Lys Thr Trp Val Pro

805 810 815

Arg Pro Pro Arg Leu Cys Gln Tyr Gln Lys Ala Gly Asn Val Asn Phe

820 825 830

Glu Pro Thr Gly Val Thr Glu Ser Arg Thr Asp Ile Thr Thr Met Gln

835 840 845

Thr Thr

850

<210> 3

<211> 3282

<212> DNA

<213> 融合基因ICV-B5-EGFP-capsid expresser

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggcc 720

attactaccc ttggagctca agtatcaaca cagaagactg gtgcacacga aaccggtttg 780

agtgctagtg gtaactccat catccactat acaaatataa attattataa ggatgccgcc 840

tcaaactcag caaatagaca ggacttcact caagatccag ggaagtttac agaacctgtg 900

aaggacatta tgatcaagtc gatgcctgct ctcaactctc cgtcagcaga ggagtgtggt 960

tacagtgata gggtaaggtc catcaccttg ggtaattcaa ctataacaac tcaggagtgt 1020

gcaaatgtgg ttgtaggata tggagtgtgg cccacctatt taaaggatga tgaagcaaca 1080

gcagaagacc aacctacgca accagacgtg gctacgtgca ggttttacac gcttgaatcc 1140

gtaatgtggc aacagagctc gccggggtgg tggtggaaat tccctgacgc actatctaac 1200

atgggcttgt tcgggcaaaa catgcaatac cattaccttg gaagggctgg atacacggtg 1260

cacgtgcagt gcaatgcatc taaatttcat caggggtgtc tgttggtagt atgtgtgcca 1320

gaggcggaga tggggtgcgc cacgttggcc aataaacctg accagaagag cctgagcaac 1380

ggggagaccg ccaacatgtt tgaatcccaa aactccacag ggcagacagc agtccaggcc 1440

aacgtgatta atgctggtat gggggttgga gtcggcaatc tgaccatatt cccgcatcag 1500

tggatcaacc tgcgcactaa caatagtgcg acgattgtca tgccgtacat aaatagtgtg 1560

cccatggata acatgtttag gcacaataac ttcaccctta tgatcatccc gtttgccccg 1620

ctgagttata gtacaggtgc taccacatac gtgccaatta cagtgacagt ggcgccgatg 1680

tgtgctgaat acaatgggtt gcgcttggcc ggcaagcagg gcttacccac gatgttaaca 1740

cctggtagta accagtttct cacatctgat gatttccaat ctccctcagc tatgccacag 1800

tttgatgtca cccctgaaat ggatatccca gggcaggtca acaacttgat ggaaatcgca 1860

gaggtggact ccgtggtacc cgttaataac actgaaggga aagtgttatc cattgagtca 1920

taccagatcc ctgttcagtc gaattcaaca aacggttccc aggtctttgg gtttccactg 1980

atgccaggag ctagcagtgt attgaacagg acactgttgg gggaaatatt aaactactac 2040

acccattggt cgggcagcat caagttaaca ttcatgttct gtgggtcagc aatggcaacg 2100

ggcaaattcc tgctggcgta ttcaccacca ggtgctggtg caccgactac acgcaaggag 2160

gcaatgctgg gcactcatgt gatctgggat gtggggttgc aatcgagctg cgtgttgtgc 2220

attccatgga tcagtcaaac acactataga tacgtggttg tggatgaata tactgctggt 2280

gggtatataa catgttggta ccagacgaac attgtggtgc ctgcggacac ccaaagtgat 2340

tgcaagatct tgtgttttgt gtcggcttgc aacgatttct ctgtcaggat gctcaaggat 2400

acgcccttta taaagcagga caacttctac caagggccca caggtgaggc agtggagagg 2460

gctattgcac gcgtcgctga caccattggg agcggtccag tcaactcaga gtctattcca 2520

gccttgactg ccgcagaaac gggacatacg tcacaggtgg taccagcaga cacaatgcaa 2580

accagacatg taaaaaacta tcattcaaga tcggagtcga cggtggagaa ctttctgtgt 2640

agatcagcat gcgtctttta caccacatat agaaatcatg gtactgatgg tgacaacttt 2700

ggttattggg tgatcagcac gcgccaggtg gctcaactac ggcgcaagct tgagatgttt 2760

acatatgcaa gatttgatct cgagctaacc tttgtgatca cgagcactca agaacagtcc 2820

accataaaag gccaggattc accagtgctc acacatcaaa tcatgtatgt gcccccaggt 2880

ggcccagtgc ctacgaaagt gaatagctac agctggcaga cgtccaccaa ccctagcgtg 2940

ttctggacag aagggagtgc accaccccgt atgtcaatac cgttcatcag cataggtaat 3000

gcatatagta tgttctatga tgggtgggcg aagtttgaca agcaaggaac atatggtata 3060

aatacactaa ataacatggg gacactgtac atgagacacg tgaatgatgg cagccccggc 3120

ccaattgtga gtaccgtacg catatacttc aaaccaaagc atgttaagac atgggttcca 3180

aggccaccca gattatgcca gtaccagaag gcaggcaacg tgaattttga acctactggt 3240

gtgaccgaaa gtaggacaga tataacaact atgcagacca cc 3282

<210> 4

<211> 6520

<212> DNA

<213> 融合基因II CV-B3复制子（CV-B3 subgenomic replicon）

<400> 4

ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca cagggcccat tgggcgctag cactctggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatac cccctccccc aactgtaact tagaagtaac 120

acacgccgat caacagtcag cgtggcacac cagccacgtt ttgatcaagc acttctgtta 180

ccccggactg agtatcaata gactgctcac gcggttgaag gagaaagcgt tcgttatccg 240

gccaactact tcgaaaaacc tagtaacacc gtggaagttg cagagtgttt cgctcagcac 300

taccccagtg tagatcaggt cgatgagtca ccgcattccc cacgggcgac cgtggcggtg 360

gctgcgttgg cggcctgccc atggggaaac ccatgggacg ctctaataca gacatggtgc 420

gaagagtcta ttgagctagt tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg 480

cggagcacac accctcaagc cagagggcag tgtgtcgtaa cgggcaaccc tgcagcggaa 540

ccgactactt tgggtgtccg tgtttcattt tattcctgta ctggccgctt atggtgacaa 600

ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgaccaat agagctatta 660

tatatctctt tgttgggttt ataccactta gcttgaaaga ggttaaaaca ttacaattca 720

ttgttaagtt gaatacagca aaatggaaga cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc 780

attctatcct ctagaggatg gaaccgctgg agagcaactg cataaggcta tgaagagata 840

cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat atcgaggtga acatcacgta 900

cgcggaatac ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa 960

tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt caattcttta tgccggtgtt 1020

gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga 1080

attgctcaac agtatgaaca tttcgcagcc taccgtagtg tttgtttcca aaaaggggtt 1140

gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaaatt accaataatc cagaaaatta ttatcatgga 1200

ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc 1260

tcccggtttt aatgaatacg attttgtacc agagtccttt gatcgtgaca aaacaattgc 1320

actgataatg aattcctctg gatctactgg gttacctaag ggtgtggccc ttccgcatag 1380

aactgcctgc gtcagattct cgcatgccag agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc 1440

ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt tttggaatgt ttactacact 1500

cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt 1560

tttacgatcc cttcaggatt acaaaattca aagtgcgttg ctagtaccaa ccctattttc 1620

attcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa atacgattta tctaatttac acgaaattgc 1680

ttctgggggc gcacctcttt cgaaagaagt cggggaagcg gttgcaaaac gcttccatct 1740

tccagggata cgacaaggat atgggctcac tgagactaca tcagctattc tgattacacc 1800

cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt 1860

tgtggatctg gataccggga aaacgctggg cgttaatcag agaggcgaat tatgtgtcag 1920

aggacctatg attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga 1980

caaggatgga tggctacatt ctggagacat agcttactgg gacgaagacg aacacttctt 2040

catagttgac cgcttgaagt ctttaattaa atacaaagga tatcaggtgg cccccgctga 2100

attggaatcg atattgttac aacaccccaa catcttcgac gcgggcgtgg caggtcttcc 2160

cgacgatgac gccggtgaac ttcccgccgc cgttgttgtt ttggagcacg gaaagacgat 2220

gacggaaaaa gagatcgtgg attacgtcgc cagtcaagta acaaccgcga aaaagttgcg 2280

cggaggagtt gtgtttgtgg acgaagtacc gaaaggtctt accggaaaac tcgacgcaag 2340

aaaaatcaga gagatcctca taaaggccaa gaagggcgga aagtccaaat tgaccaacac 2400

tggagccttc ggacaacaat caggggcagc gtatgtgggg aactacaggg tagtaaatag 2460

acatctagct accagtgctg actggcaaaa ctgtgtgtgg gaaagttaca acagagacct 2520

cttagtgagc acgaccacag cacatggatg tgatattata gccagatgtc agtgcacaac 2580

gggagtgtac ttttgtgcgt ccaaaaacaa gcactaccca atttcgtttg aaggaccagg 2640

tctagtagag gtccaagaga gtgaatacta ccccaggaga taccaatccc atgtgctttt 2700

agcagctgga ttttccgaac caggtgactg tggcggtatc ctaaggtgtg agcatggtgt 2760

cattggcatt gtgaccatgg ggggtgaagg cgtggtcggc tttgcagaca tccgtgatct 2820

cctgtggctg gaagatgatg caatggaaca gggagtgaag gactatgtgg aacagcttgg 2880

aaatgcattc ggctccggct ttactaacca aatatgtgag caagtcaacc tcctgaaaga 2940

atcactagtg ggtcaagact ccatcttaga gaaatctcta aaagccttag ttaagataat 3000

atcagcctta gtaattgtgg tgaggaacca cgatgacctg atcactgtga ctgccacact 3060

agcccttatc ggttgtacct cgtccccgtg gcggtggctc aaacagaagg tgtcacaata 3120

ttacggaatc cctatggctg aacgccaaaa caatagctgg cttaagaaat ttactgaaat 3180

gacgaatgct tgcaagggta tggaatggat agctgtcaaa attcagaaat tcattgaatg 3240

gctcaaagta aaaattttgc cagaggtcag ggaaaaacac gaattcctga acagacttaa 3300

acaactcccc ttattagaaa gtcagatcgc cacaatcgag cagagcgcgc catcccaaag 3360

tgaccaggaa caattatttt ccaatgtcca atactttgcc cactattgca gaaagtacgc 3420

tcccctctac gcagctgaag caaagagggt gttctccctt gagaagaaga tgagcaatta 3480

catacagttc aagtccaaat gccgtattga acctgtatgt ttgctcctgc acgggagccc 3540

tggtgccggc aagtcggtgg caacaaactt aattggaagg tcgcttgctg agaaactcaa 3600

cagctcagtg tactcactac cgccagaccc agatcacttc gacggataca aacagcaggc 3660

cgtggtgatt atggacgatc tatgccagaa tcctgatggg aaagacgtct ccttgttctg 3720

ccaaatggtt tccagtgtag attttgtacc acccatggct gccctagaag agaaaggcat 3780

tctgttcacc tcaccgtttg tcttggcatc gaccaatgca ggatctatta atgctccaac 3840

cgtgtcagat agcagagcct tggcaaggag atttcacttt gacatgaaca tcgaggttat 3900

ttccatgtac agtcagaatg gcaagataaa catgcccatg tcagtcaaga cttgtgacga 3960

tgagtgttgc ccggtcaatt ttaaaaagtg ctgccctctt gtgtgtggga aggctataca 4020

attcattgat agaagaacac aggtcagata ctctctagac atgctagtca ccgagatgtt 4080

tagggagtac aatcatagac atagcgtggg gaccacgctt gaggcactgt tccagggacc 4140

accagtatac agagagatca aaattagcgt tgcaccagag acaccaccac cgcccgccat 4200

tgcggacctg ctcaaatcgg tagacagtga ggctgtgagg gagtactgca aagaaaaagg 4260

atggttggtt cctgagatca actccaccct ccaaattgag aaacatgtca gtcgggcttt 4320

catttgctta caggcattga ccacatttgt gtcagtggct ggaatcatat atataatata 4380

taagctcttt gcgggttttc aaggtgctta tacaggagtg cccaaccaga agcccagagt 4440

gcctaccctg aggcaagcaa aagtgcaagg ccctgccttt gagttcgccg tcgcaatgat 4500

gaaaaggaac tcaagcacgg tgaaaactga atatggcgag tttaccatgc tgggcatcta 4560

tgacaggtgg gccgttttgc cacgccacgc caaacctggg ccaaccatct tgatgaatga 4620

tcaagaggtt ggtgtgctag atgccaagga gctagtagac aaggacggca ccaacttaga 4680

actgacacta ctcaaattga accggaatga gaagttcaga gacatcagag gcttcttagc 4740

caaggaggaa gtggaggtta atgaggcagt gctagcaatt aacaccagca agtttcccaa 4800

catgtacatt ccagtaggac aggtcacaga atacggcttc ctaaacctag gtggcacacc 4860

caccaagaga atgcttatgt acaacttccc cacaagagca ggccagtgtg gtggagtgct 4920

catgtccacc ggcaaggtac tgggtatcca tgttggtgga aatggccatc agggcttctc 4980

agcagcactc ctcaaacact acttcaatga tgagcaaggt gaaatagaat ttattgagag 5040

ctcaaaggac gccgggtttc cagtcatcaa cacaccaagt aaaacaaagt tggagcctag 5100

tgttttccac caggtctttg aggggaacaa agaaccagca gtactcagga gtggggatcc 5160

acgtctcaag gccaattttg aagaggctat attttccaag tatataggaa atgtcaacac 5220

acacgtggat gagtacatgc tggaagcagt ggaccactac gcaggccaac tagccaccct 5280

agatatcagc actgaaccaa tgaaactgga ggacgcagtg tacggtaccg agggtcttga 5340

ggcgcttgat ctaacaacga gtgccggtta cccatatgtt gcactgggta tcaagaagag 5400

ggacatcctc tctaagaaga ctaaggacct aacaaagtta aaggaatgta tggacaagta 5460

tggcctgaac ctaccaatgg tgacttatgt aaaagatgag ctcaggtcca tagagaaggt 5520

agcgaaagga aagtctaggc tgattgaggc gtccagtttg aatgattcag tggcgatgag 5580

acagacattt ggtaatctgt acaaaacttt ccacctaaac ccaggggttg tgactggtag 5640

tgctgttggg tgtgacccag acctcttttg gagcaagata ccagtgatgt tagatggaca 5700

tctcatagca tttgattact ctgggtacga tgctagctta agccctgtct ggtttgcttg 5760

cctaaaaatg ttacttgaga agcttggata cacgcacaaa gagacaaact acattgacta 5820

cttgtgcaac tcccatcacc tgtacaggga taaacattac tttgtgaggg gtggcatgcc 5880

ctcgggatgt tctggtacca gtattttcaa ctcaatgatt aacaatatca taattaggac 5940

actaatgcta aaagtgtaca aagggattga cttggaccaa ttcaggatga tcgcatatgg 6000

tgatgatgtg atcgcatcgt acccatggcc tatagatgca tctttactcg ctgaagctgg 6060

taagggttac gggctgatca tgacaccagc agataaggga gagtgcttta acgaagttac 6120

ctggaccaac gtcactttcc taaagaggta ttttagagca gatgaacagt accccttcct 6180

ggtgcatcct gttatgccca tgaaagacat acacgaatca attagatgga ccaaggatcc 6240

aaagaacacc caagatcacg tgcgctcatt gtgtctatta gcttggcata acggggagca 6300

cgaatatgag gagttcatcc gtaaaattag aagcgtccca gtcggacgtt gtttgaccct 6360

ccccgcgttt tcaactctac gcaggaagtg gttggactcc ttttagatta gagacaattt 6420

gaaataattt agattggctc aaccctactg tgctaaccga accagataac ggtacagtag 6480

gggtaaattc tccgcattcg gtgcggaaaa aaaaaaaaaa 6520

<210> 5

<211> 159

<212> PRT

<213> 引物序列

<400> 5

Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Gly Cys

1 5 10 15

Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly

20 25 30

Ala Gly Ile Phe Pro Cys Asp Asn Ala Cys Asx Gly Gly Thr Gly Ala

35 40 45

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ala Gly Gly

50 55 60

Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Ala Gly Thr Thr Gly Thr

65 70 75 80

Thr Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Thr Ala Cys Ala Gly Gly Ala

100 105 110

Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys

115 120 125

Ala Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Gly

130 135 140

Cys Thr Cys Ala Ala Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Cys

145 150 155

Claims (3)

1.一种假病毒，其特征在于，由重组表达质粒pEGFP-CV-B5/417表达的柯萨奇病毒B5结构蛋白和重组表达质粒pCVB3-复制子转录的CV-B3亚基因组RNA组装而成；

所述重组表达质粒pEGFP-CV-B5/417使用绿色荧光蛋白报告基因，且含有融合基因I，所述融合基因I是通过将绿色荧光蛋白EGFP的基因序列与CV-B5/417所有结构蛋白的基因序列拼接，并将2A蛋白酶的酶切位点插入EGFP基因的C末端拼接得到，所述融合基因I的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；所述重组表达质粒pCVB3-复制子的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因，且含有融合基因II，所述融合基因II是通过将CV-B3/Nancy的5’UTR，荧光素酶基因和CV-B3基因组的非结构蛋白基因及其之后的序列用重叠PCR方法拼接，得到，所述融合基因II的核苷酸序列为SEQ ID NO：4；

所述SEQ ID NO：3第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3282位为CV-B5/417所有结构蛋白的编码基因，编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述SEQ ID NO：4第1位到742位为CV-B3/Nancy的5’UTR核苷酸序列；第743位到2392位为荧光素酶基因的核苷酸序列，第2393位到2410位为2A蛋白酶的识别位点；第2411位到6520位为CV-B3/Nancy非结构蛋白的编码基因；

所述重组表达质粒pCVB3-复制子中在融合基因II的5’UTR前引入T7promoter的序列。

2.一种体外的、检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的假病毒。

3.一种检测肠道柯萨奇病毒B5中和抗体的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)将权利要求1所述假病毒与系列稀释的待测抗体样品混合，得到混合物；

2)用所述混合物感染肠道柯萨奇病毒B5敏感的细胞，根据敏感的细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性或定量检测待测样品中柯萨奇病毒B5特异性中和抗体的效价。