BR112018072729B1 - Ensaio para detectar infecção por flavivírus, cassete de expressão de dna recombinante e genoma de flavivírus recombinante - Google Patents

Ensaio para detectar infecção por flavivírus, cassete de expressão de dna recombinante e genoma de flavivírus recombinante Download PDF

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Abstract

As modalidades da invenção são dirigidas a clones de DNAc de comprimento total, estáveis, de uma cepa ZIKV de linhagem clínica, asiática. Determinadas modalidades da invenção são dirigidas a ensaios de alto rendimento para o diagnóstico de vírus ZIKV e da dengue (DENV).

Description

PARÁGRAFO DE PRIORIDADE
[001] Este pedido é um pedido internacional que reivindica prioridade para o Pedido Provisório US 62/330.958 depositado em 3 de maio de 2016 e Pedido US 62/455.846 apresentado em 7 de fevereiro de 2017, cada um dos quais é incorporado ao presente documento como referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO RELATIVA À INVESTIGAÇÃO FINANCIADA PELO GOVERNO
[002] Esta invenção foi concebida com o apoio do governo de acordo com o AI087856 concedido pelo National Institutes of Health. O governo detém certos direitos com relação à invenção.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[003] Uma listagem de sequências requerida de acordo com 37 CFR 1.821-1.825 está sendo submetida eletronicamente com este pedido. A listagem de sequências é incorporada ao presente documento como referência.
ANTECEDENTES
[004] A atual epidemia explosiva do vírus da Zica (ZIKV) nas Américas representa uma emergência global de saúde pública. O ZIKV é um membro do gênero Flavivirus da família Flaviviridae. Os flavivírus têm um genoma de RNA de filamento positivo de cerca de 11.000 nucleotídeos. O genoma flaviviral codifica três proteínas estruturais (capsídeo [C], pré-membrana / membrana [prM / M] e envelope [E]) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). As proteínas estruturais formam partículas virais. As proteínas não estruturais participam da replicação viral, montagem do vírion e evasão da resposta imune do hospedeiro (Lindenbach e outros (2013). Flaviviridae. p. 712-746. Em D.M. Knipe e P.M. Howley (ed), Fields virology, 6th, vol. 1. Lippincott William & Wilkins, Philadelphia, Pa.). Como o ZIKV, muitos flavivírus são patógenos humanos significativos, incluindo o vírus da febre amarela (YFV), o vírus do Nilo Ocidental (WNV), o vírus da encefalite japonesa (JEV), o vírus da encefalite transmitida por carrapatos (TBEV) e o vírus da dengue (DENV). O ZIKV é transmitido pelos mosquitos Aedes spp., que também transmitem YFV e DENV, assim como o vírus chikungunya. Além disso, o ZIKV também pode ser transmitido através de sexo, transfusão de sangue, transplante de órgãos e, potencialmente, através da urina ou saliva (Musso e outros, (2014) Euro Surveill 19; Musso e outros, (2015) Emerg Infect Dis 21, 359-61). Indivíduos com imunidade comprometida podem ser mais suscetíveis à infecção pelo ZIKV e ao desenvolvimento da doença (Shan e outros, (2016) ACS Infectious Diseases 2, 170-72).
[005] Sistemas experimentais, incluindo um sistema genético reverso do ZIKV, modelos animais e modelos de transmissão de mosquitos, são urgentemente necessários para abordar essas questões científicas fundamentais. Para modelos animais, A129 (sem receptores de interferon α / β), AG129 (sem interferon α / β e receptores y), e camundongos não desafiados triplos Irf3 -/- Irf5 -/- Irf-/- foram recentemente reportados como suscetíveis à infecção por ZIKV e ao desenvolvimento de doenças neurológicas (Lazear e outros, 2016) Um modelo de camundongo da patogênese do vírus da Zica, Cell Host & Microbe; Rossi e outros, (2016) Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus, Am J Trop Med Hyg; Zmurko e outros (2016). O inibidor da polimerase viral 7-deaza-2'-C- metiladenosina é um potente inibidor da replicação do vírus da zika in vitro e retarda a progressão da doença em um modelo robusto de infecção do camundongo. bioRxiv); A infecção de macacos rhesus com uma linhagem asiática ZIKV também foi relatada recentemente (Dudley e outros 2016). Natural history of Asian lineage Zika virus infection in macaques. bioRxiv). Para a infecção pelo mosquito, um estudo mostrou que os mosquitos A. aegypti e A. albopictus são vetores inesperadamente pobres para o ZIKV, com taxas de infecção disseminadas geralmente <50% após doses orais de titulação elevada (107 cultura infecciosa de tecido dose a 50%). Isso sugere a possibilidade de que outros vetores de mosquitos ou transmissão de humanos para humanos possam estar contribuindo para a propagação explosiva do vírus (Chouin-Carneiro e outros, (2016). PLoSNegl Trop Dis 10, e0004543).
[006] A potencial associação entre a microcefalia e outras anomalias congênitas com a infecção pelo vírus da Zica (ZIKV) durante a gravidez reforça a necessidade crítica de um diagnóstico rápido e preciso. Devido à curta duração da viremia por ZIKV em pacientes infectados, um ensaio sorológico que detecta respostas de anticorpos à infecção viral desempenha um papel essencial no diagnóstico de amostras de pacientes. O diagnóstico sorológico atual da infecção pelo ZIKV depende muito do teste de Neutralização de Redução de Placas (PRNT) que requer um tempo de resposta maior que uma semana e representa um grande obstáculo para o diagnóstico do paciente.
[007] Há necessidade de sistemas genéticos reversos adicionais para o vírus da Zica, bem como métodos adicionais de detecção e diagnóstico de infecções virais, como a infecção pelo vírus da Zica.
SUMÁRIO
[008] As modalidades da presente invenção fornecem composições e métodos adicionais para ultrapassar as limitações dos métodos atuais. Os inventores desenvolveram um ensaio de alto rendimento para o diagnóstico de vírus ZIKV e dengue (DENV) que pode atingir pelo menos a sensibilidade e a seletividade do atual ensaio PRNT. Os ensaios descritos no presente documento são homogêneos e utilizam vírus luciferase para quantificar as titulações neutralizantes em um formato de 96 poços. Os inventores demonstraram que o ensaio de diagnóstico do repórter da presente invenção possui uma gama dinâmica mais elevada e mantém a especificidade relativa do ensaio tradicional de PRNT. Além da melhoria do rendimento do ensaio, a tecnologia do vírus repórter também reduziu o tempo de resposta para menos de dois dias. Coletivamente, os resultados sugerem que, juntamente com o ensaio de RT-PCR viral, o ensaio sorológico com base no vírus repórter poderia ser prontamente utilizado como um teste de primeira linha para o diagnóstico clínico de infecção por ZIKV, bem como para ensaios clínicos de vacinas.
[009] Determinadas modalidades da invenção são dirigidas a um ensaio de diagnóstico de zika de alto rendimento para medir titulações neutralizantes de espécimes de pacientes utilizando um ZIKV repórter. O ensaio descrito no presente documento pode ter um intervalo dinâmico de diagnóstico aumentado e um tempo de rotação encurtado de mais de 7 dias para menos de 2 dias em um formato de 96 poços. O ensaio descrito no presente documento também pode ser utilizado em conjunto com ensaios de RT-PCR virais, o ensaio sorológico repórter pode servir como o teste de primeira linha para o diagnóstico de infecção por ZIKV. Em certos aspectos, a infecção pelo ZIKV é uma infecção primária pelo ZIKV. Como empregado no presente documento, o termo infecção viral "primária" se refere a uma infecção inicial ou original, por exemplo, após uma primeira exposição a um vírus. Em certos aspectos, uma infecção viral primária pelo ZIKV apresenta o ZIKV como a única infecção por flavivírus do indivíduo.
[010] Determinadas modalidades são dirigidas a um ensaio para detectar infecção por flavivírus por compreendendo a uma ou mais das seguintes etapas: (a) contatar uma amostra de um individuo suspeito de ter uma infecção por flavivírus com um zika repórter (rZIKV), o rZIKV configurado para produzir um sinal detectável quando expresso em células viáveis, formando uma mistura repórter e incubando a mistura repórter a uma temperatura de 35 a 40°C; (b) contato de uma monocamada de células hospedeiras com a mistura repórter em condições de crescimento celular a cerca de 37°C, formando uma monocamada de células inoculadas; (c) medição do sinal repórter produzido pela monocamada de células inoculadas e normalização do sinal medido para um controle; e (d) cálculo de uma títulação de anticorpo para ZIKV da amostra usando as medições de sinal de repórter. Em certos casos, os anticorpos presentes na amostra podem se ligar para neutralizar um vírus repórter, assim, um título de anticorpo mais elevado resulta em um sinal de repórter mais baixo devido à neutralização do vírus repórter. Em certos aspectos, uma diluição em série da amostra é contatada com o rZIKV. em um outro aspecto, uma pluralidade de amostras é ensaiada individualmente. A amostra pode ser uma amostra biológica, como uma amostra de sangue. Em certos aspectos, a amostra é de uma paciente grávida. O individuo pode ser um indivíduo mamífero, tal como um ser humano.
[011] O rZIKV pode ser um ZIKV repórter da luciferase. O ZIKV repórter da luciferase expressa uma molécula repórter ao infectar uma célula. Em certos aspectos, a luciferase é Renilla luciferase.
[012] A monocamada de células pode ser uma monocamada de células Vero, ou outra célula apropriada que pode ser infectada pelo vírus alvo e expressar o repórter. Em certos aspectos, as monocamadas de células são ensaiadas em uma placa de múltiplos poços, tal como uma placa de microtitulação de 96 poços. Em aspectos particulares, as células inoculadas são incubadas durante cerca de 12, 24, 36 ou 48 horas antes de medição do sinal de repórter.
[013] Os ensaios descritos nos presentes documentos podem ser utilizados para detectar múltiplos vírus, tais como o vírus da dengue. O ensaio pode ainda compreender: (e) contato de uma amostra de um individuo suspeito de ter uma infecção por flavivírus com um vírus da dengue repórter (rDENV), o rDENV configurado para produzir um sinal detectável ao infectar uma célula viável, formando uma mistura repórter e incubando a mistura repórter a uma temperatura de 35 a 40°C; (f) contato de uma monocamada de células hospedeiras com a mistura repórter em condições de crescimento celular a cerca de 37°C, formando uma monocamada de células inoculadas; (g) medição do sinal repórter produzido pela monocamada de células inoculadas e normalização do sinal medido para um controle; e (h) cálculo de uma titulação de anticorpo DENV da amostra usando as medições de sinal de repórter.
[014] Em outros aspectos, o procedimento de ensaio pode compreender ainda a realização de amplificação de DNA específica do vírus utilizando uma segunda amostra do indivíduo suspeito de ter uma infecção por flavivírus. Em certos aspectos, a amplificação de DNA é um ensaio de RT-PCR viral.
[015] As modalidades da invenção são dirigidas a clones de DNAc de comprimentos totais estáveis de uma cepa ZIKV de linhagem clínica, asiática. O ZIKV derivado do clone de DNAc descrito no presente documento era virulento e causou doença neurológica em camundongos A129 e AG129. Além disso, o vírus recombinante foi altamente infeccioso para os mosquitos A. aegypti. Estes sistemas experimentais são essenciais para estudar da patogênese viral e transmissão vetorial, bem como para desenvolver uma vacina para ZIKV.
[016] Determinadas modalidades são dirigidas a um sistema genético inverso do vírus da Zica. Este sistema tem três aplicações principais. (1) Desenvolvimento de vacinas para vacina inativada e vacina atenuada. (2) Desenvolvimento terapêutico através do vírus repórter e triagem de alto rendimento. (3) Desenvolvimento de novos diagnósticos usando o vírus repórter e o vírus repórter projetado.
[017] Em certos aspectos, os ácidos nucleicos de ZIKV podem ter pelo menos 90, 95, 98, 99, 99,99, 99,991 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou qualquer 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000 segmentos de nucleotídeos consecutivos, incluindo todos os valores e intervalos entre eles. Em certos aspectos, um ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que é pelo menos 90, 95, 98, 99 ou 100% idêntica a toda ou parte da região codificadora da proteína não estrutural do ZIKV (nucleotídeos 2.490 a 10.376 da SEQ ID NO: l, ou quaisquer 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000 ou 7.000 segmentos de nucleotídeos consecutivos incluindo todos os valores e intervalos entre eles). Em outro aspecto, um ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que é pelo menos 90, 95, 98, 99 ou 100% idêntica a toda ou parte da região codificadora da proteína estrutural do ZIKV (nucleotídeos 474 a 2.489 da SEQ ID NO: l, ou qualquer 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, ou 10.000 segmentos de nucleotídeos consecutivos, incluindo todos os valores e intervalos entre eles).
[018] Os ácidos nucleicos do ZIKV podem ser ácidos nucleicos isolados ou recombinantes (por exemplo, DNA) ou incluídos em um replicon de flavivírus recombinante, um vírus, um flavivírus, uma partícula viral, uma partícula de flavivírus, um cassete de expressão, uma célula hospedeira, um vetor de flavivírus, e similar. Ainda em outro aspecto, uma sequência de ácido nucleico de um flavivírus pode compreender um segmento de ácido nucleico heterólogo. Em certos aspectos, o segmento de ácido nucleico heterólogo pode codificar uma proteína terapêutica, um antígeno, uma toxina ou um marcador (por exemplo, uma proteína repórter). Em certos aspectos, a proteína repórter é uma proteína fluorescente, como uma proteína verde fluorescente.
[019] Certos aspectos são dirigidos a um polipeptídeo ou peptídeo de ZIKV isolado, recombinante e / ou purificado possuindo pelo menos 90, 95, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 3 (poliproteína do ZIKV). O termo "poliproteína" se refere a um polipeptídeo que é clivado após tradução para produzir mais do que um polipeptídeo. "Polipeptídeo" se refere a qualquer peptídeo ou proteína compreendendo uma cadeia ou polímero de aminoácidos ligados um ao outro por ligações peptídicas. "Polipeptídeo" se refere a cadeias curtas de 100 aminoácidos ou menos, comumente designadas por peptídeos, e a cadeias mais longas, geralmente referidas como proteínas. Em certos aspectos, a proteína ZIKV isolada e / ou purificada tem pelo menos 85, 90, 95, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de uma proteína não estrutural de ZIKV. Em certos aspectos, o genoma do zika será mutado para codificar um ou mais aminoácidos associados à microcefalia.
[020] Outras modalidades são dirigidas a flavivírus compreendendo toda ou parte da sequência de ácido nucleico de ZIKV da SEQ ID NO: 1. Em certos aspectos, o flavivírus é um flavivírus recombinante. Determinadas modalidades são dirigidas a um flavivírus possuindo um genoma compreendendo (a) um segmento de ácido nucleico de flavivírus que é pelo menos 95, 98, 99 ou 100% idêntico a SEQ ID NO: 1 e (b) um segmento de ácido nucleico heterólogo. Em certos aspectos, o flavivírus é quimérico e compreende segmentos de um flavivírus ZIKV e segmentos correspondentes de outra cepa ZIKV ou um flavivírus diferente de ZIKV.
[021] Como empregado no presente documento, "controle" ou "controle adequado" é de um individuo ou amostra alternativa utilizada em um experimento para fins de comparação e incluída para minimizar ou distinguir o efeito de outras variáveis , além de uma variável independente. Um "controle" pode ser positivo ou negativo. Um "controle", tal como empregado no presente documento, se refere a um controle que permitirá a determinação da presença de um vírus ou infecção viral em um indivíduo. "Controle" inclui uma característica ou outro parâmetro em uma amostra tratada antes da administração de um componente descrito no presente documento ou antes de um regime de detecção. "Controle" pode representar um nível normal do parâmetro sendo medido em um assunto ou amostra.
[022] Como empregado no presente documento, "expressão" se refere ao processo pelo qual os polinucleotídeos são transcritos em transcritos de RNA. No contexto de RNAm e outras espécies de RNA traduzidas, "expressão" também se refere ao processo ou processos pelos quais o RNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.
[023] O termo "recombinante" se refere a uma combinação artificial de dois segmentos de ácido nucleico separados, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por técnicas de engenharia genética.
[024] O termo "flavivírus" tem o seu significado convencional e inclui as várias espécies de flavivírus, incluindo o vírus do Nilo Ocidental, vírus da dengue, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus da febre amarela, vírus da Zica e vários outros vírus que podem causar encefalite.
[025] O termo "replicon de flavivírus" é usado para se referir a uma molécula de ácido nucléico que expressa genes de proteínas não estruturais de flavivírus, de modo que possa direcionar sua própria replicação (amplificação).
[026] O termo "partícula de replicon de flavivírus" se refere a um complexo estrutural do tipo virion ou virion que incorpora um replicon de flavivírus.
[027] O termo "vírus repórter" se refere a um vírus que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência (s) ou gene (s) de interesse. A construção repórter pode incluir uma sequência 5' capaz de iniciar a transcrição de um ácido nucleico que codifica uma molécula repórter ou proteína tal como luciferase, proteína fluorescente, Neo, SV2 Neo, higromicina, fleomicina, histidinol e DHFR. O vírus repórter pode usar um indicador da infecção de uma célula por determinado vírus.
[028] O termo "vetor de expressão" se refere a um ácido nucleico que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência (s) ou gene (s) de interesse. A construção de vetor pode incluir uma sequência 5' capaz de iniciar a transcrição de um ácido nucleico, por exemplo, todo ou parte de um flavivírus. O vetor também pode incluir molécula (s) de ácido nucleico para permitir a produção de vírus, um promotor 5' que é capaz de iniciar a síntese de RNA viral in vitro a partir de DNAc, bem como um ou mais sítios de restrição e uma sequência de poliadenilação. Além disso, as construções podem conter marcadores selecionáveis, como Neo, SV2 Neo, higromicina, fleomicina, histidinol e DFIFR. Além disso, as construções podem incluir sequências de plasmídeo para replicação em células hospedeiras e outras funcionalidades conhecidas na técnica. Em certos aspectos, a construção vetorial é uma construção de DNA.
[029] "Cassete de expressão" se refere a um segmento de ácido nucleico capaz de dirigir a expressão de uma ou mais proteínas ou ácidos nucleicos.
[030] Outras modalidades da invenção são discutidas ao longo deste pedido. Qualquer modalidade discutida em relação a um aspecto da invenção aplica-se também a outros aspectos da invenção e vice-versa. Cada modalidade descrita no presente documento é entendida como sendo modalidade da invenção sendo aplicável a todos os aspectos da invenção. É contemplado que qualquer modalidade discutida no presente documento pode ser implementada em relação a qualquer método ou composição da invenção e vice-versa. Além disso, composições e kits da invenção podem ser usados para alcançar métodos da invenção.
[031] O uso da palavra "um" ou "uma" quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e / ou na especificação pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um".
[032] Em todo esse pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão de erro para o dispositivo ou método sendo empregado para determinar o valor.
[033] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e / ou", a menos que explicitamente indicado para se referir apenas a alternativas ou as alternativas sejam mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas a alternativas e "e / ou".
[034] "Como usado neste relatório descritivo e reivindicação (ões), as palavras "compreendendo" (e qualquer forma da palavra compreendendo, tal como "compreende" e "compreendem"), "tendo " (e qualquer forma de ter, tal como "tem" e "têm"), "incluindo" (e qualquer forma de inclusão, como "inclui" e "incluir") ou "contendo" (e qualquer forma de conter, como "contém" e "contêm") são inclusivas ou abertas e não excluem elementos adicionais não solicitados ou etapas de método.
[035] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicam modalidades específicas da invenção, são fornecidos apenas a título ilustrativo, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção tornar-se-ão evidentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[036] Os desenhos que se seguem fazem parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida com referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades do relatório descritivo apresentadas no presente documento.
[037] Figura 1. Construção do clone de DNAc completo do ZIKV. (A) A estratégia para construir o clone de DNAc completo do ZIKV. A organização do genoma, os sítios de restrição únicos e suas posições de nucleotídeos são mostrados. Cinco fragmentos de DNAc de A a E (representados por linhas grossas) foram sintetizados a partir de RNA genômico usando RT-PCR para cobrir o genoma completo do ZIKV. Os fragmentos individuais foram montados para formar o clone de DNAc completo do ZIKV (pFLZIKV). O DNAc completo do ZIKV é posicionado sob o controle dos elementos promotores de T7 para transcrição in vitro. Uma sequência de ribozima de HDVr foi manipulada na extremidade 3' do genoma viral para gerar uma extremidade 3' autêntica da sequência de RNA viral. Os números são as posições dos nucleotídeos com base na sequência da cepa ZIKV FSS13025 (número do GenBank JN860885). (B) Análise do transcrito de RNA do pFLZIKV em um gel de agarose nativo. Foi utilizada uma eletroforese em gel de agarose a 0,8% para analisar o transcrito de RNA do ZIKV juntamente com um RNA de DENV-2 de comprimento genômico.
[038] Figura 2. O transcrito de RNA do pFLZIKV é infeccioso. (A) IFA da expressão de proteína viral nas células transfectadas com o RNA de ZIKV de comprimento total. Células Vero foram eletroporadas com 10 μg de RNA do ZIKV de comprimento genômico. A partir do dia 3 a 6 após transfecção (p.t), IFA foi realizado para examinar a expressão da proteína E viral utilizando um mAb de camundongo (4G2). Verde e azul representam proteína E e núcleos (corados com DAPI), respectivamente. (B) Análise por RT-PCR do RNA viral da progênie. O RNA viral foi extraído do sobrenadante da cultura no dia 6 após transfecção e utilizado como gabarito para RT-PCR utilizando o par de iniciadores específicos para ZIKV 1303-F e 2552-ClaI-R (Tabela 4). Como controle negativo, incluiu-se um RNA de comprimento genômico contendo uma mutação do sítio ativo da polimerase NS5 (GDD mutada para AAA). (C) Rendimento de ZIKV infeccioso após transfecção. As titulações virais dos sobrenadantes da cultura nos momentos indicados foram determinadas por ensaio de placa. (D) Efeito citopático em células Vero no dia 6 após transfecção.
[039] Figura 3. Caracterização de ZIKVs parentais e recombinantes em cultura de células. (A) Morfologia de placas de ZIKVs parentais e recombinantes. (B e C) Comparação da cinética de crescimento em células Vero e C6 / 36, respectivamente. As células Vero e C3 / 36 foram infectadas com vírus parentais e recombinantes a um MOI de 0,01. As titulações virais foram medidas nos pontos de tempo indicados utilizando ensaios de placa em células Vero. As médias e os desvios padrão de três repetições independentes são mostrados. As estatísticas foram realizadas usando o teste t de Student não pareado. *significante (valor de p <0,05); ** altamente significativo (valor de p <0,01). L.O.D., limitação de detecção (100 PFU / mL).
[040] Figura 4. Marcador genético foi modificado no ZIKV recombinante. Um local de clivagem de Sphl, localizado no gene E viral do vírus parental, foi eliminado no clone de DNAc para servir como um marcador genético para distinguir entre vírus recombinante e vírus parentais. Um fragmento de 1.258 pares de base (dos nucleotídeos 1.303 a 2.552) abrangendo o sítio Sphl foi amplificado utilizando RT- PCR a partir de RNA extraído de vírus recombinante ou vírus parentais. Os fragmentos de RT-PCR foram submetidos a digestão com Sphl. O fragmento de 1.258 pares de base derivado de vírus recombinante não deve ser clivável por Sphl; enquanto que o fragmento RT-PCR amplificado a partir do RNA viral parentais deve ser clivável por Sphl. (A) Desenho esquemático da análise de enzimas de restrição Sphl. Os tamanhos esperados dos produtos de digestão são indicados. (B) Análise em gel de agarose de produtos de digestão com Sphl. O padrão esperado de digestão, como mostrado no painel (A), foi observado.
[041] Figura 5. Comparação da virulência em camundongos A129 entre vírus recombinantes e parentais. Camundongos A129 com quatro semanas de idade foram infectados com 1 x 105 PFU por indivíduo por via intraperitoneal. Camundongos simulados ou infectados (n = 5 por grupo) foram monitorados quanto a perda de peso (A). A viremia nos primeiros três dias após infecção foi quantificada utilizando ensaio de placa (B). Médias e desvios padrão são mostrados. As estatísticas foram realizadas usando o teste t de Student não pareado. * significante (valor de p <0,05); ** altamente significativo (valor de p <0,01); *** extremamente significativo (valor de p <0,001).
[042] Figura 6. Virulência de ZIKVs parentais e recombinantes em camundongos AG129. Camundongos AG129 com seis semanas de idade foram inoculados por injeção intraperitoneal com 1 x 105 PFU (n = 4 para o vírus parental; n = 5 para vírus recombinante), 1 x 104 o PFU (n = 8 para vírus parentais; n = 5 para vírus recombinante), ou 1 x 103 o PFU (n = 4 para vírus parentais; n = 5 para vírus recombinante) do ZIKV. Os camundongos infectados foram monitorados quanto a perda de peso. Os camundongos foram eutanasiados quando a perda de peso foi excedeu 20%. Para cada dose de infecção, são apresentadas as curvas de perda de peso e sobrevida. Vírus parentais e recombinantes e suas doses de infecção são indicados. Os valores são o peso percentual médio comparado ao peso inicial.
[043] Figura 7. O clone de DNAc infeccioso do ZIKV (pFLZIKV) é estável. pFLZIKV foi propagado por cinco ciclos de transformação de plasmídeo, crescimento bacteriano e purificação de plasmídeo. O plasmídeo purificado do ciclo 5 foi utilizado para transcrever o RNA para teste de infectividade. (A) IFA de expressão da proteína E viral em células transfectadas com RNA pFLZIKV do ciclo 0 (R0) e do ciclo 5 (R5). As células Vero foram eletroporadas com 10 μg de RNAs de comprimento genômico do ZIKV. No dia 6, a IFA foi realizada para examinar a expressão da proteína E utilizando um mAb de camundongo (4G2). Verde e azul representam proteína E e coloração de núcleos, respectivamente. (B) Rendimentos de R0 e R5 ZIKVs no dia 6 após transfecção. Fluidos de cultura no dia 6 após transfecção foram medidos para vírus infecciosos usando ensaio de placa em células Vero. (C) Morfologia de placas de ZIKV recombinantes R0 e R5.
[044] Figura 8. Sequência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 1 com diferenças de aminoácido de poliproteína quando comparada à poliproteína codificada por vírus Zika associados a microcefalia destacada por sublinhado em negrito.
[045] Figura 9. Esquema experimental do ensaio de infecção com base em vírus repórter para medir as titulações de neutralização das amostras. Vide o texto para detalhes.
[046] Figura 10. Gráficos de dispersão de valores de NT90 derivados de ensaio de PRNT90 e derivados de ensaio de repórter para ZIKV e DENV.
[047] Figura 11. Otimização dos inócuos da Renilla luciferase (Rluc) ZIKV (A) e DENV-2 (B) para o ensaio de neutralização. O esquema experimental é representado na Figura 1 e o protocolo é detalhado em Materiais e Métodos. São apresentados diferentes MOIs de inócuo de vírus e suas atividades de luciferase em 24 h após infecção. As taxas dos sinais da luciferase derivados das infecções versus os sinais das células falsamente infectadas são indicados acima das barras que representam os sinais da luciferase. Os resultados médios de três experimentos independentes são apresentados.
DESCRIÇÃO
[048] Desde o seu primeiro isolamento em Uganda em 1947 (Dick e outros, (1952), Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 46, 50920), ZIKV tem sido predominantemente associado com ciclos de transmissão silvestre entre primatas e mosquitos arbóreos nas florestas, e por seis décadas raramente causaram doenças humanas, com apenas 13 casos relatados de doença adquirida naturalmente (Petersen e outros, (2016) Zika Vírus, N Engl J Med). Até 80% das pessoas infectadas são assintomáticas. Os sinais e sintomas da infecção por ZIKV incluem febre, letargia, conjuntivite, erupção cutânea e artralgia. No entanto, na última década, o ZIKV emergiu em ciclos de transmissão urbana entre humanos e mosquitos no Pacífico Sul e nas Américas, e causou doenças graves, incluindo Síndrome de Guillain-Barré e microcefalia congênita (Fauci e Morens, 2016). nas Américas - ainda outra ameaça de arbovírus, N Engl J Med).
[049] A análise filogenética indica que o ZIKV existe como linhagem africana e asiática. A linhagem asiática é responsável pelas epidemias recentes / atuais: causou uma epidemia em Yap Island, Micronésia em 2007; depois se espalhou de uma fonte desconhecida, provavelmente no sudeste da Ásia, para a Polinésia Francesa e outras regiões do Pacífico Sul e causou grandes epidemias em 2013-14; posteriormente, o ZIKV chegou às Américas em 2015 e levou a milhões de infecções humanas (Weaver e outros, (2016) Antiviral Res 130, 69-80; Weaver e outros, (2016) Zika Virus: History, Emergence, Biology, and Prospects for Control, Antiviral Res). Atualmente, não se sabe o que desencadeou o surto de epidemias recentes e doenças graves.
[050] O vírus da Zica (ZIKV) existe como duas linhagens principais: africana e asiática. Após sua descoberta em 1947, o ZIKV permaneceu obscuro com poucos casos humanos identificados e sintomas leves da doença. No entanto, desde 2007, a linhagem asiática tem causado epidemias frequentes associadas a sintomas graves, como microcefalia e síndrome de Guillain-Barré. Desvendar os mecanismos do aumento da transmissibilidade e da gravidade da doença requer vários sistemas experimentais, incluindo um sistema genético reverso do ZIKV, modelos animais e competência do vetor viral. Um clone de DNAc infeccioso de ZIKV usando um isolado clínico de linhagem asiática (com> 99% de identidade de aminoácido para as cepas americanas epidêmicas) é descrito no presente documento. O RNA transcrito a partir do clone de DNAc foi altamente infeccioso após transfecção em células Vero, gerando ZIKV recombinante com titulações de 2-8 x 106 PFU / mL. Um marcador genético foi modificado para o vírus recombinante para diferenciá-lo do parentais e de outras cepas do ZIKV. O vírus recombinante foi virulento em camundongos A129 e AG129 e camundongos infectados desenvolveram sinais neurológicos relevantes para doenças humanas. Além disso, o ZIKV recombinante foi altamente infeccioso para o Aedes aegypti (o suposto vetor urbano americano) com uma taxa de disseminação de 58% após refeições com aproximadamente 106 PFU / mL de vírus recombinante, sugerindo que este mosquito é um vetor eficiente. Coletivamente, o sistema genético reverso do ZIKV, juntamente com os modelos de infecção por camundongos e mosquitos, representam um grande avanço no sentido de decifrar os potenciais determinantes virais da virulência humana e da transmissão do mosquito urbano. O sistema genético permitirá o desenvolvimento rápido de uma vacina usando um design racional com base em alvos.
[051] A recomendação atual para o diagnóstico de infecção por ZIKV inclui três ensaios principais (Musso e Gubler, 2016 Clin Microbiol Rev 29, 487-524; Staples e outros, 2016 Interim Guidelines for the Evaluation and Testing of Infants with Possible Congenital Zika Virus Infection - United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 65, 63-67) (i) Detecção de RNA viral por RT-PCR. O ensaio de RT- PCR é relativamente simples e fiável com boa sensibilidade e especificidade (Lanciotti e outros, 2008 Emerg Infect Dis 14, 1232-39). (ii) Detecção de anticorpos IgM reativos com ZIKV por um ELISA. Uma grande fraqueza do atual teste IgM ELISA é a reatividade cruzada com outros flavivírus (como o DENV). Isto acontece porque o ensaio utiliza apenas proteínas estruturais virais (por exemplo, proteína E) que são as principais proteínas antigênicas conhecidas por anticorpos de reação cruzada ilícitos. Para reduzir a reatividade cruzada do ensaio, pode-se incluir proteínas virais não estruturais no ELISA. Esta ideia baseia-se na razão de que, durante a infecção por flavivírus, a resposta de anticorpos a proteínas virais não estruturais pode ser mais específica do vírus do que a das proteínas estruturais. De fato, vários estudos relataram que os flavivírus NS1, NS3 e NS5 poderiam ser usados para melhorar a especificidade do diagnóstico sorológico (Garcia e outros, 1997) American Journal of Tropical Medicine & Hygiene 56: 466-70; Shu e outros, 2000 Journal of Medical Virology 62: 224-32; Stettler e outrosf 2016 Science 353: 823-26; Wong e outros, 2003 J Clin Microbiol 41: 4217-23). Em apoio a esta justificativa, um ensaio multiplex Luminex empregando ZIKV E, NS1 e NS5 foi recentemente mostrado para melhorar significativamente a especificidade do ensaio (Wong e outros, 2017 EBioMedicine). No entanto, deve-se ressaltar que, embora a reatividade cruzada contra o ZIKV NSl e NS5 seja menor do que contra a proteína E, a reatividade cruzada residual deve ser eliminada para uma melhora adicional. Isto pode ser conseguido através da engenharia de antígeno (aplicável a proteínas estruturais e não estruturais) para remover os epítopos de reação cruzada. A engenharia de antígeno pode ser racionalmente guiada por estruturas de proteínas e seus perfis epitópicos. O emprego de tais proteínas específicas de vírus sem epítopos com reatividade cruzada irá melhorar ainda mais a especificidade do ensaio, (iii) Confirmação dos espécimes positivos para IgM ELISA utilizando um ensaio de PRNT. Embora o PRNT continue sendo o "padrão ouro" para a sorologia para arbovírus, a natureza de baixo rendimento do ensaio limita o número de amostras que poderiam ser diagnosticadas em tempo hábil. Essa limitação é particularmente premente no diagnóstico do ZIKV em pacientes grávidas.
[052] As modalidades da invenção descrita no presente documento se destinam a um ensaio rápido para substituir o ensaio tradicional de PRNT com base em placas. Os inventores tiraram vantagem do seu repórter luciferase ZIKV e DENV previamente construídos e desenvolveram um ensaio de neutralização homogêneo em um formato de 96 poços. Validação do ensaio repórter usando 91 resultados de diagnóstico gerados por soros humanos equivalentes ao PRNT tradicional. É importante ressaltar que o ensaio repórter melhorou significativamente o tempo de resposta do teste, a faixa dinâmica do ensaio e o rendimento do diagnóstico. Essas melhorias têm implicações práticas nas clínicas, superando o gargalo da capacidade de teste e alcançando os resultados dos testes em 48 horas. Como o algoritmo de diagnóstico atual se destina a confirmar as amostras positivas para IgM ELISA usando PRNT, o ensaio repórter pode ser usado diretamente para testar a titulação de neutralização de amostras de pacientes sem IgM ELISA prévio. Desta forma, o ensaio repórter poderia servir em conjunto com RT-PCR como o teste de primeira linha para o diagnóstico sorológico do ZIKV, a partir do qual os médicos seriam capazes de atingir os resultados do diagnóstico dentro de dois dias. Além disso, o ensaio repórter poderia ser utilizado para medir especificamente as titulações de neutralização IgM ou IgG quando outros tipos de anticorpos foram pré-esgotados dos soros dos pacientes.
[053] O ensaio de neutralização com base no vírus repórter pode ser expandido para outros flavivírus (Zhang e outros, 2016 Virus Res 211: 17-24), bem como para outros arbovírus (como o vírus chikungunya) que muitas vezes cocirculam em muitas regiões subtropicais. Além do uso no diagnóstico clínico, o vírus repórter também poderia ser útil para outros aspectos da pesquisa, como o rastreamento de infecções em mosquitos e em pequenos modelos de animais (Schoggins e outros, 2012 Proc Natl Acad Sci US 109: 14610-15), bem como para rastreio de bibliotecas de siRNA / CRISPR ou descoberta de fármacos antivirais (Puig-Basagoiti e outros, 2005 Antimicrob Agent Chemother 49: 4980-88). Para o diagnóstico sorológico, os vírus repórteres são superiores às partículas semelhantes a vírus empacotadas trans usando replicadores repórter (Hanna e outros, 2005 J Virol 79: 13262-74; Harvey e outros, 2004 J Virol 78: 531-38; Khromykh e outros, 1998 J Virol 72: 5967-5977) porque, uma vez estabelecidos os vírus repórter estáveis, eles poderiam ser produzidos em grande escala.
[054] Os inventores desenvolveram um ensaio ZIKV repórter que pode substituir o atual ensaio de PRNT "padrão ouro" para medir as titulações de neutralização dos espécimes de pacientes. Como o ensaio tem alto rendimento e um tempo de retorno inferior a 48 horas, ele pode ser usado como teste de diagnóstico de primeira linha sem o teste IgM ELISA anterior. O ensaio ZIKV repórter pode ser prontamente utilizado para diagnóstico clínico, vigilância sorológica e monitoramento da resposta de anticorpos no estudo de vacina. Este ensaio sorológico, juntamente com o bem estabelecido ensaio de RT-PCR viral, pode fornecer um diagnóstico rápido da infecção por ZIKV.
EXEMPLOS
[055] Os exemplos seguintes, bem como as figuras, são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos ou figuras representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como modos preferidos para a sua prática. Contudo, os versados na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que podem ser feitas muitas alterações nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obtêm um resultado semelhante ou semelhante sem se afastarem do espírito e âmbito da invenção.
EXEMPLO 1 UM CLONE INFECCIOSO DE DNAc DO VÍRUS DA ZICA PARA ESTUDO DA VIRULÊNCIA VIRAL E TRANSMISSÃO PELO MOSQUITO
[056] Construção do clone de DNAc completo do ZIKV. Os inventores escolheram um isolado clínico de ZIKV da linhagem asiática para construir o clone de DNAc. Esta cepa DE ZIKV (FSS13025) foi isolada de um paciente de três anos de idade do Camboja em 2010 (Heang e outros, (2012) Emerg Infect Dis 18, 349351). O RNA viral da passagem de células Vero de dois isolados foi sequenciado (GenBank número JN860885.1) e utilizado como molde para construir o clone de DNAc infeccioso. Cinco fragmentos de RT-PCR (A a E) abrangendo o genoma viral completo foram individualmente clonados e montados no DNAc completo de ZIKV (denominado pFLZIKV; figura 1A). Com base no experimento anterior com clones infecciosos de outros flavivírus (Li e outros 2014) J Gen Virol 95, 806-15; Shi e outros, (2002) J Virol 76, 5847-56; Zou e outros, (2011) Antiviral Res 91, 11-19), os inventores escolheram um plasmídeo de baixo número de cópias pACYC177 (15 cópias por célula de E. coli) para clonar os fragmentos A e B, bem como para montar o DNAc do genoma pleno. Este plasmídeo foi utilizado porque os fragmentos A e B, abrangendo os genes prM-E-NSl virais, eram tóxicos para E. coli durante o procedimento de clonagem; vetores de elevado número de cópias contendo estes fragmentos eram instáveis, conduzindo a deleções / mutações aberrantes das inserções (Shi e outros, (2002) J Virol 76, 5847-56). Em contraste, os fragmentos C, D e E não eram tóxicos para E. coli e podiam ser clonados individualmente em um plasmídeo com elevado número de cópias pCR2.1-TOPO. Um promotor T7 e uma sequência de ribozima do vírus da hepatite delta (HDVr) foram manipulados nas extremidades 5' e 3' do DNAc viral completo para transcrição in vitro e para geração da extremidade 3' autêntica do transcrito de RNA, respectivamente. A comparação da sequência do DNAc pFLZIKV completamente montado com o vírus parental revelou duas mutações sinônimas no gene E (Tabela 1), uma das quais foi derivada de um marcador genético modificado (vide abaixo). RNA sintetizado a partir do plasmídeo pFLZIKV (10.808 nucleotídeos [nt] sem HDVr) e RNA transcrito de um clone infeccioso DENV-2 (10.723 nt longo; (Zou e outros, (2011) Antiviral Res 91, 11-19)) migraram similarmente em um gel de agarose nativo (Figura 1B). Tabela 1. Diferenças de sequência entre o clone de DNAc infeccioso e o ZIKVa parentais
Figure img0001
ªA cepa ZSSV FSS13025 (número GenBank JN860885.1) foi utilizada no presente estudo. Após o sequenciamento desta linhagem FSS13025, encontramos um erro na sequência atual do GenBank. A sequência na posição do nucleotídeo 798 deve ser T e não C.
[057] Transcrito de RNA do clone de DNAc do ZIKV é altamente infeccioso. O transcrito de RNA pFLZIKV foi transfectado em células Vero para examinar a infecciosidade do clone de DNAc. As células transfectadas foram monitoradas quanto à expressão da proteína viral, síntese de RNA e produção de vírus. Como mostrado na figura 2A, um número crescente de células expressou a proteína E viral do dia 1 ao 6 após transfecção (p.t). A análise por RT-PCR detectou RNA de ZIKV em meio de cultura das células transfectadas; como um controle negativo, não foi detectado qualquer produto de RT-PCR a partir das células transfectadas com um RNA contendo os resíduos GDD do sítio ativo da polimerase mutados para AAA (figura 2B). Quantidades crescentes de vírus infecciosos foram produzidas a partir de células transfectadas com RNA de tipo selvagem, com titulações de pico de 1x10 6-7 unidades formadoras de placas (PFU) / mL nos dias 5-7 (figura 2C). Nos dias 6-7, as células transfectadas exibiram efeitos citopáticos (CPE; figura 2D). O sequenciamento do genoma completo do vírus recombinante não revelou nenhuma mudança além das duas mutações sinônimas que se originaram do pFLZIKV. Coletivamente, esses resultados demonstram que o clone de DNAc do ZIKV é altamente infeccioso.
[058] Comparação do crescimento da cultura celular entre vírus parentais e recombinantes. Os vírus recombinantes e parentais foram comparados em cultura celular. Como mostrado na figura 3A, o vírus recombinante produziu morfologia de placas homogênea, enquanto o vírus parental gerou tamanhos de placa heterogêneos. A diferença na morfologia das placas não foi surpreendente porque os vírus recombinantes foram derivados de uma população homogênea de transcritos de RNA, enquanto o vírus parental provavelmente era composto por uma quase-espécie. De acordo com esta noção, o vírus recombinante exibiu cinética de replicação atenuada nas células Vero e mosquito C6 / 36 de mamífero (figura 3B e figura 3C), indicando que o nível de replicação do vírus recombinante foi atenuado em cultura de células.
[059] ZIKV recombinante reteve um marcador genético projetado. Para excluir a possibilidade do vírus recombinante recuperado representar contaminação com o vírus parental, os inventores construíram um marcador genético no vírus recombinante, no qual foi eliminado um sítio de clivagem Sphl no gene E do vírus parental (figura 4A). Um fragmento de 1.257 pares de base abrangendo nucleotídeos 1.301-1.252 do genoma viral foi amplificado utilizando RT-PCR a partir de RNAs extraídos dos vírus parentais e recombinantes. O produto de RT-PCR do vírus parental foi prontamente clivado por Sphl, enquanto que o produto de RT-PCR do vírus recombinante foi resistente à digestão com Sphl (Figura 4B). Estes resultados demonstram que o vírus recombinante foi produzido a partir do transcrito de RNA derivado de DNAc. O marcador genético permite a diferenciação e quantificação entre o vírus recombinante e potencialmente outros ZIKV isolados (que possuem o sítio Sphl); isso poderia ser usado para estudar a aptidão viral quando o vírus recombinante serve como um padrão interno para avaliar a aptidão viral de outras cepas de ZIKV em um ensaio de competição (Fitzpatrick e outros, (2010) Virology 404, 89-95).
[060] O clone de DNAc infeccioso do ZIKV é estável. Uma vez que os clones de DNAc infecciosos de flavivírus são conhecidos por serem instáveis e deletérios para o hospedeiro bacteriano (Khromykh e Westaway, (1994) Journal of Virology 68, 4580-88; Lai e outros (1991) PNAS USA 88, 5139-43; Mandel e outros, (1997) Journal of General Virology 78, 1049-57; Rice e outros, (1989) New Biologist 1, 28596; Sumiyoshi e outros, (1992) Journal of Virology 66, 5425-31), a estabilidade de pFLZIKV foi examinada através de cinco ciclos de transformação de plasmídeo, crescimento bacteriano e purificação de plasmídeo. O plasmídeo purificado da 5a rodada foi utilizado para transcrever o RNA para um teste de infecciosidade. A transfecção do RNA da 5a rodada no interior das células Vero gerou células expressando a proteína E viral (figura 7A) e vírus infeccioso (figura 7B) em níveis equivalentes aos derivados do RNA pFLZIKV original sem passagem (figura 7A e 7B). Observou-se morfologia de placa semelhante para os vírus recombinantes originais e derivados de RNA da 5a rodada (figura 7C). Estes resultados demonstram a estabilidade do clone infeccioso do ZIKV.
[061] Virulência em camundongos A129 e AG129. Os inventores compararam a virulência dos ZIKVs parentais e recombinantes em dois modelos de camundongo: A129 (sem receptor interferon α / β) e AG129 (sem receptores interferon α / β e Y). Os camundongos AG129 foram recentemente relatados como mais suscetíveis à doença induzida pelo ZIKV do que os camundongos A129 (Rossi e outros, (2016) Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus, Am J Trop Med Hyg). Nos camundongos A129, a infecção intraperitoneal (i.p.) com o vírus parental (105 PFU) conduziu a perda de peso e doença caracterizada por postura arqueada e pelos despenteados, todos os camundongos infectados foram eutanasiados devido a > 20% de perda de peso no dia 9 após a infecção (p.i.; figura 5A). Em contraste, a infecção com o mesmo inócuo de ZIKV recombinante resultou em menos perda de peso, mas nenhum dos camundongos infectados morreu (figura 5A). De acordo com estas observações, o vírus recombinante gerou viremia significativamente mais baixa do que o vírus parental no dia 1 p.i. nos camundongos A129; enquanto as diferenças na viremia dos dias 2 e 3 não foram estatisticamente significativas entre os dois vírus (figura 5B). Os resultados sugerem que a cinética de replicação mais lenta do vírus recombinante pode ser responsável por sua virulência atenuada.
[062] Em camundongos AG129, i.p. a injeção de ZIKVs parentais e recombinantes (1x103-5 PFU) conduziu a doença neurológica, perda de peso e morte (devido a > 20% de perda de peso; figura 6). A doença neurológica foi caracterizada por hiperatividade, movimentos descoordenados, incapacidade de endireitar o corpo, giro corporal e paralisia dos membros posteriores. A cinética da perda de peso foi dependente da dose viral: os camundongos infectados com o vírus recombinante exibiram uma perda de peso mais lenta e uma sobrevivência mais longa do que os infectados com o vírus parental (figura 6). Estes resultados demonstram que o vírus recombinante é menos virulento do que o vírus parental in vivo; no entanto, a infecção por AG129 com o vírus recombinante ainda leva a doença neurológica, consistente com evidências de que o ZIKV causa distúrbios congênitos do neurodesenvolvimento em fetos humanos.
[063] Infecção por mosquitos e disseminação. Para comparar a aptidão viral entre os vírus parentais e recombinantes em mosquitos, os inventores determinaram a suscetibilidade oral de A. aegypti usando refeições de sangue humano artificial contendo ZIKV. Como resumido na Tabela 2, o vírus recombinante apresentou taxas de infecção e infecção disseminadas mais elevadas do que o vírus parental, o que pode ter refletido a titulação da refeição de sangue ligeiramente superior do vírus recombinante. As taxas gerais de disseminação (número de mosquitos disseminados / número de mosquitos infectados x 100%) foram equivalentes entre os vírus parentais e recombinantes, sugerindo que o vírus recombinante possui um fenótipo do tipo selvagem em mosquitos A. aegypti. Estes resultados demonstram que o vírus recombinante é altamente infeccioso para A. aegypti, e as taxas de infecção disseminadas sugerem que esta espécie é um vetor eficiente para o ZIKV. Tabela 2. Infecção e disseminação da linhagem asiática ZIKV cepa FSS13025 (Camboja, 2010) em Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus, Am J Trop Med Hyg A. aegypti
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aTaxa de infecção = Número de mosquitos infectados / número de mosquitos ingurgitados x 100% bTaxa de infecção disseminada = Número de mosquitos disseminados / número de mosquitos ingurgitados x 100% c Taxa de dissolução (%) = Número de mosquitos disseminados / número de mosquitos infectados 100%
[064] O sistema genético reverso descrito no presente documento, juntamente com a infecção do mosquito e os modelos de camundongos A129 / AG129, fornecem uma plataforma tratável para explorar os mecanismos responsáveis pelas epidemias explosivas e o aumento da gravidade da infecção pelo ZIKV desde 2007. Vários mecanismos não exclusivos são possíveis: (i) o ZIKV passou por uma evolução adaptativa que melhorou a transmissão do mosquito, levando à rápida disseminação do vírus e a um maior número de infecções humanas. Esta hipótese poderia ser testada por comparações da infectividade do mosquito das cepas mais antigas do ZIKV com isolados recentes, seguida pelo uso do sistema genético reverso para testar os efeitos de mutações recentes na transmissão do mosquito. Esse mecanismo foi responsável pelo surgimento do vírus chikungunya, no qual uma série de mutações nos genes do envelope viral aumentaram a transmissão viral por A. albopictus através do aumento da infecção de células epiteliais no intestino médio (Tsetsarkin e outros (2014) Nature communications 5, 4084; Tsetsarkin e Weaver, (2011) PLoS Pathog 7, e 1002412). (ii) A linhagem asiática do ZIKV se adaptou para gerar maior viremia em humanos, levando a uma infecção cruzada placentária e microcefalia. Esta hipótese pode ser testada por mutações adaptativas de engenharia dos isolados recentes no clone de DNAc infeccioso, gerando vírus mutantes e quantificando o efeito mutacional na virulência viral no camundongo A129 / AG129 e no desenvolvimento de microcefalia (o modelo animal para microcefalia continua a ser estabelecido), (iii) Introdução estocástica do ZIKV em uma população (no Pacífico e nas Américas) sem imunidade de rebanho, levando a uma maior suscetibilidade à infecção por ZIKV e à transmissão eficiente de mosquitos. A soro-prevalência e sua correlação com a transmissão do ZIKV e frequência de surtos precisam ser estabelecidas para responder a essa hipótese, (iv) Infecção anterior pelo DENV pode exacerbar a gravidade da doença pelo ZIKV porque os dois vírus compartilham aproximadamente 43% de identidade de aminoácidos e extensa reatividade cruzada (Alkan e outros 2015). J Virol 89, 11773-85; Lanciotti e outros (2008) Emerg Infect Dis 14, 1232-39). Esta hipótese pode ser testada no camundongo AG129 porque este camundongo é suscetível à infecção tanto com o DENV como com o ZIKV. (v) A predisposição genética humana pode ser responsável pelos desfechos severos da doença. Qualquer infecção viral é modulada por fatores do hospedeiro pró-viral e antiviral. A interação entre os fatores virais e do hospedeiro determina a eficiência da infecção, patogenicidade, transmissão e potencial epidêmico. Portanto, variações do (s) fator (es) crítico (s) do hospedeiro entre indivíduos infectados podem contribuir para diferentes gravidades da doença.
[065] Em comparação com o vírus parental, a eficiência de replicação do vírus recombinante foi reduzida em células Vero e C6 / 36 (figura 3). Esta replicação atenuada do vírus recombinante em células Vero foi traduzida para a virulência atenuada nos camundongos A129 e AG129 (figura 5 e figura 6). As diferenças (na replicação e na virulência) entre os vírus parentais e recombinantes podem ser devidas à heterogeneidade genética limitada da população de vírus recombinantes e à natureza de espécies quase mais genéticas do vírus parental. Curiosamente, embora a replicação do vírus recombinante tenha sido reduzida em células C6 / 36, produziu uma taxa de infecção disseminada em mosquitos A. aegypti semelhante à do vírus parental, indicando que o sistema de cultura de células não recapitula necessariamente os resultados in vivo. Tal discrepância não é surpreendente por causa das interações mais complexas do vírus hospedeiro in vivo.
[066] O clone de DNAc infeccioso do ZIKV facilitará o desenvolvimento de vacinas através do design racional. A atenuação com base no alvo do ZIKV pode ser obtida através da mutação dos componentes de replicação viral (RNA viral e complexo de replicação) ou através da remoção de componentes virais necessários para a evasão da resposta imune do hospedeiro (Li e outros 2013) J Virol 87, 581219; Whitehead e outros, (2007) Nat Rev Microbiol 5, 518-28; Zust e outros ( 2013) PLoS Pathog 9, e1003521). A cepa ZIKV usada no estudo atual é apropriada para essa vacina atenuada devido à sua alta similaridade de sequência com as cepas epidêmicas americanas. Como resumido na Tabela 3, apenas foram observadas 19 diferenças de aminoácidos entre o vírus derivado de clone infeccioso descrito no presente documento e cepas recentemente isoladas de fetos de microcefalia (Calvet e outros (2016). Detecção e sequenciamento do vírus da Zica do líquido amniótico de fetos com microcefalia no Brasil: um estudo de caso, The Lancet Infectious diseases; Faria e outros (2016). Zika virus in Américas: Early epidemiological and genetic findings. Science; Mlakar e outros (2016) N Engl J Med 374, 951-58), representando > 99% de identidade de aminoácido. Além disso, o vírus recombinante foi atenuado em ambos os camundongos A129 e AG129, ainda replicado robustamente em células Vero (uma linhagem celular aprovada para produção de vacina) para titulações acima de 1 x 106 PFU / mL. Além de sua aplicação para o desenvolvimento de vacinas, o clone infeccioso também pode ser usado como um ZIKV repórter (por exemplo, GFP ou luciferase), o que facilita o rastreamento da replicação viral in vivo e triagem de inibidores antivirais de alto rendimento (Shan e outros (2016) ACS Infectious Diseases 2, 170-72). Tabela 3. Diferenças de aminoácidos entre o clone de DNAc infeccioso e os isolados de ZIKV da microcefalia
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aA posição do aminoácido da poliproteína é numerada com base na cepa do clone de DNAc infeccioso FSS13025 (número do GenBank JN860885) bAs três cepas de ZIKV provenientes de fetos com microcefalia são listadas para comparação de sequências: cepa Fss13025 (número do GenBank KU497555) e Natal RGN (número do GenBank KU527068). Os números do GenBank são indicados. cOs resíduos em negrito são do clone de DNAc infeccioso que são consistentemente diferentes das duas cepas de microcefalia.
[067] Em resumo, a presente invenção fornece uma plataforma de múltiplos componentes para estudar a transmissão do ZIKV e a patogênese da doença e para desenvolver contramedidas. Materiais e métodos
[068] Células, vírus e anticorpos. As células Vero foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) e mantidas em um meio de Eagle modificado por Dulbecco com alto teor de glicose (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (HyClone Laboratories, Logan, UT) e 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen) a 37°C com 5% de CO2. Cultivaram-se células de A. albopictus C6 / 36 (C6 / 36) em RPMI1640 (Invitrogen) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina a 28°C com 5% de CO2. A cepa parental de ZIKV do Camboja FSS13025 (número do GenBank JN860885.1) foi isolada em 2010 a partir do sangue de um paciente do Camboja. Os seguintes anticorpos foram utilizados neste estudo: um anticorpo monoclonal de camundongo (mAb) 4G2 reativo de forma cruzada com a proteína E de flavivírus (ATCC) e anti-IgG de camundongo de cabra conjugado com Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific).
[069] Síntese e clonagem de DNAc. O RNA viral foi extraído de estoques virais usando QIAamp Viral RNA Kits (Qiagen). Os fragmentos de DNAc que cobrem o genoma completo foram sintetizados a partir de RNA genético utilizando Superscript III (RT) -PCR empregando iniciadores (Tabela 4) de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). A figura 1A descreve o esquema para clonar e montar o genoma completo do ZIKV. O plasmídeo pACYC177 (New England Biolabs, Ipswich, MA) foi utilizado para clonar os fragmentos B e A + B. Utilizou-se o plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen) para clonar o fragmento individual C, D e E. O DNAc genético de comprimento total foi montado utilizando o plasmídeo pACYC177. A cepa bacteriana Top 10 (Invitrogen) foi utilizada como hospedeiro de E. coli para construção e propagação de clones de DNAc. Um procedimento de clonagem padrão foi utilizado, como relatado anteriormente para fazer WNV (Shi e outros, (2002) J Virol 76, 5847-56) e DENV (Zou e outros, (2011) Antiviral Res 91, 11-19) infecciosa clones. A sequência específica do vírus de cada clone intermediário foi validada por sequenciamento de DNA de Sanger antes de ser utilizada em etapas subsequentes de clonagem. O plasmídeo final contendo DNAc de comprimento total de ZIKV (pFLZIKV) foi sequenciado para assegurar que não existissem mutações indesejadas. Todas as endonucleases de restrição foram adquiridas da New England Biolabs (Beverly, Mass.).
[070] Transcrição e transfecção de RNA. O plasmídeo pFLZIKV, contendo o DNAc completo do ZIKV, foi amplificado em E. coli Top 10 e purificado utilizando MaxiPrep PLUS (Qiagen). Para transcrição in vitro, 10 μg de pFLZIKV foram linearizados com a enzima de restrição Clal. O plasmídeo linearizado foi extraído com fenol-clorofórmio e clorofórmio, precipitado com etanol e ressuspenso em 15 μL de água isenta de RNase (Ambion, Austin, TX). O kit mMESSAGE mMACHINE (Ambion) foi usado para transcrever in vitro o RNA em uma reação de 20 μL com um adicional de 1 μL de solução de GTP 30 mM. A mistura reacional foi incubada a 37°C durante 2 h, seguida da adição de DNase I para remover o molde de DNA. O RNA foi precipitado com cloreto de lítio, lavado com etanol a 70%, ressuspenso em água isenta de RNAase, quantificado por espectrofotometria e armazenado a -80°C em alíquotas. Para transfecção, aproximadamente 10 μg de RNA foram eletroporados a 8x 106 células Vero em 0,8 mL de Solução de Eletroporação Ingenio® (Mirus, Madison, WI), em cuvetas de 4 mm com o aparelho GenePulser (Bio-Rad) em configurações de 0,45 kV e 25 μF, pulsando três vezes, com intervalos de 3 segundos. Após uma recuperação de 10 min. temperatura ambiente, as células transfectadas foram misturadas com o meio e incubadas em um frasco T-175 (5% de CO2 a 37°C). Em diferentes momentos após a eletroporação (p.t), vírus recombinantes em meio de cultura de células foram colhidos, clarificados por centrifugação a 500xg, armazenados em alíquotas a -80°C e submetidos à análise.
[071] Ensaios de imunofluorescência indireta (IF A). O IFA foi realizado para detectar a expressão da proteína viral em células Vero transfectadas com RNA de ZIKV. Células Vero transfectadas com RNA viral foram cultivadas em uma câmara Lb-Tek de 8 poços (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Nos pontos de tempo indicados, as células foram fixadas em 100% de metanol a -20°C durante 15 min. Após uma incubação de 1 hora em um tampão de bloqueio contendo 1% FBS e 0,05% de Tween-20 em PBS, as células foram tratadas com um anticorpo monoclonal de camundongo 4G2 durante 1 h e lavadas três vezes com PBS (5 min. para cada lavagem). As células foram então incubadas com IgG anti-camundongo de cabra Alexa Fluor488 durante 1 h em tampão de bloqueio, após o que as células foram lavadas três vezes com PBS. As células foram montadas em um meio de montagem com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol; Vetor Laboratories, Inc.). Imagens de fluorescência foram observadas sob um microscópio de fluorescência equipado com um sistema de documentação de vídeo (Olympus).
[072] Análise de digestão por enzima de restrição para diferenciar entre vírus parentais e recombinantes. Um sítio de endonuclease de restrição para SphI existente no ZIKV parental foi eliminado no clone de DNAc e no vírus recombinante resultante. O desaparecimento do sítio SphI foi utilizado para distinguir entre os vírus parentais (com sítio SphI) e recombinantes (sem sítio SphI). O vírus recombinante (recolhido do meio de cultura no dia 6 p.a.) e o vírus parental foram submetidos a extração de RNA utilizando Kits de RNA Viral QIAamp (Qiagen). Os RNA virais extraídos foram utilizados para amplificar os fragmentos de 1.258 pares de base abrangendo o sítio Sphl utilizando os iniciadores E-1303V e NSl-2552-ClaI-R (Tabela 4). Os produtos de RT-PCR foram digeridos com SphI e analisados em um gel de agarose a 0,8%. Tabela 4. Oligonucleotídeos usados para construir o DNAc completo do
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aOs primers foram nomeados após a posição nucleotídica da sequência viral e polaridade. F, sentido do genoma viral; R, sentido complementar. A numeração de nucleotídeos é com base na cepa ZIKV FSS13025 (GenBank número JN860885). bAs sequências virais e não virais estão em maiúsculas e minúsculas, respectivamente. A mutação silenciosa para eliminar o sítio de restrição Sphl no gene E também é descrita em letras minúsculas.
[073] Ensaio de placa. As amostras virais foram dobradas dez vezes em série e diluída seis vezes em DMEM. Para cada diluição, 100 μL de amostra foram adicionados a uma placa de 12 poços contendo células Vero a cerca de 90% de confluência. As células infectadas foram incubadas durante 1 h e agitadas a cada 15 min. para assegurar a cobertura completa da monocamada para infecção uniforme. Após a incubação, adicionou-se 1 mL de revestimento de metilcelulose contendo 5% de FBS 1% P / S a cada poço e a placa foi incubada a 37°C durante quatro dias. Após a incubação, o revestimento de metilcelulose foi removido; a placa foi lavada duas vezes com PBS, fixada com formaldeído a 3,7% e incubada à temperatura ambiente durante 20 min. Depois de remover o fixador, a placa foi corada com cristal a 1% violeta durante 1 min. As placas visíveis foram contadas e as titulações virais (PFU / mL) foram calculadas.
[074] Curvas de replicação. As células Vero e C6 / 36 subconfluentes em placas de 12 poços foram inoculadas com ZIKV parental ou recombinante a uma MOI de 0,01 em poços em triplicata. Estoques de vírus foram diluídos em DMEM contendo 5% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. Cem microlitros de vírus foram adicionados a cada poço das placas de 12 poços. Após 1 h de ligação (5% de CO2 a 37°C para células Vero e a 28°C para células C6 / 36), os inócuos foram removidos. As monocamadas de células foram lavadas três vezes com PBS. Depois, adicionou-se 1 mL de meio DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina a cada poço. As placas foram incubadas por até 6 dias. O meio foi recolhido diariamente e submetido a ensaio de placas como descrito acima.
[075] Virulência em camundongos. Camundongos A129 e AG129 foram usados para examinar a virulência de ZIKVs parentais e recombinantes. Os detalhes da infecção parental por ZIKV em camundongos A129 foram relatados recentemente (Rossi e outros, (2016) Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus, Am J Trop Med Hyg). Resumidamente, camundongos A129 de quatro semanas de idade foram infectados com 1 x 105 PFU por via intraperitoneal. Cinco camundongos por grupo foram utilizados para vírus parentais e recombinantes. PBS foi usado para diluir os estoques de vírus para a concentração desejada. O inócuo foi titulado de volta para verificar a dose viral. Os camundongos infectados por simulação receberam PBS pela mesma via. Os camundongos foram pesados e monitorados diariamente em busca de sinais de doença (postura curvada, pelo despenteado, letargia, etc.). Os camundongos foram sangrados dia sim dia não, através do seio retro-orbital (RO) após serem anestesiados. O sangue foi clarificado após a coleta por centrifugação a 3.380 x g por 5 min. e imediatamente armazenado a -80°C. As titulações virais foram determinadas por ensaio de placa em células Vero. Os camundongos foram considerados moribundos se não responderam aos estímulos, não conseguiram permanecer em pé ou perderam 20% ou mais de seu peso inicial (consistente com o protocolo aprovado).
[076] Os camundongos AG129 foram criados e mantidos em instalações para animais na University of Texas Medical Branch (UTMB). Animais adultos jovens (6 semanas de idade) foram inoculados por injeção intraperitoneal com ZIKV parental ou recombinante usando uma variedade de inócuos. Após a inoculação, os camundongos foram pesados diariamente e visualmente monitorizados para determinar o curso da infecção. Os camundongos que exibem perda de peso > 20% do peso corporal inicial ou doença neurológica foram eutanaziados. Animais eutanizados foram contados como mortos no dia seguinte para análise. Todo o trabalho com animais foi concluído em conformidade com a política da UTMB, conforme aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
[077] Infeccão experimental de mosquitos com ZIKV. Os mosquitos da colônia A. aegypti derivados de Galveston, Texas, foram alimentados por 30 min. em refeições de sangue, consistindo de 1% (peso / volume) de sacarose, 20% (vol / vol) de FBS, 5 mM de ATP, 33% (vol / vol). Células sanguíneas humanas lavadas com PBS (Banco de Sangue UTMB) e meio DMEM a 33% (vol / vol) e combinadas com 1 mL de vírus oferecidas em reservatórios aquecidos de 2 mL Hemotek (Discovery Workshops) cobertos com pele de camundongo. A titulação de vírus nas refeições de sangue variou de 6,2 a 6,5 log10 FFU / mL. As refeições de sangue infecciosas foram carregadas em caixas contendo A. aegypti. Os mosquitos ingurgitados foram incubados a 28°C, 80% de umidade relativa em um ciclo claro - escuro de 12: 12 h com acesso livre a 10% de solução de sacarose durante 14 dias e depois congelados a -20°C durante a noite. Para avaliar infecção e disseminação, corpos e pernas foram homogeneizados individualmente (Retsch MM300 homogeneizador, Retsch Inc., Newton, PA) em DMEM com 20% de soro bovino fetal (FBS) e 250 μg / mL de anfotericina B. As amostras foram centrifugadas por 10 min. a 5.000 rpm e 50 μL de cada sobrenadante da amostra foram inoculados em placas de 96 poços contendo células Vero a 37°C e 5% > CO2 por 3 dias, quando foram fixados com uma mistura de solução de acetona gelada e metanol (1: 1) e imunocorada como descrito abaixo. A infecção foi determinada pela recuperação do vírus a partir do corpo homogeneizado e a disseminação da via alimentar para o hemocele foi determinada pela recuperação do vírus das pernas. A taxa de infecção foi registrada como a fração de corpos positivos para o vírus dividida pelo número total de corpos de mosquitos ingurgitados e a taxa de infecção disseminada é o número de pernas positivas para o vírus dividido pelo número total de mosquitos ingurgitados.
[078] Ensaios de formação de focos e imunocoloração. Diluições em série de dez vezes do vírus em DMEM suplementado com 2% de FBS e 250 μg / mL de anfotericina B (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram adicionadas a monocamadas de células Vero confluentes ligadas as placas de 96 poços Costar (Corning, NY) e incubadas por 1 h com balanço suave periódico para facilitar a adsorção do vírus a 37°C. Os poços foram então revestidos com 150 μL de DMEM suplementado com 2% de FBS e 250 μg / mL de anfotericina B e incubados não perturbados por 3 dias a 37°C. O revestimento do meio foi aspirado e as monocamadas de células foram lavadas uma vez com PBS, pH 7,4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), fixadas com uma mistura de acetona gelada e metanol (1: 1) e deixadas incubar durante 30 min. à temperatura ambiente. A solução de fixação foi aspirada e as placas foram deixadas secar ao ar. As placas foram lavadas três vezes com PBS suplementado com 3% > FBS, seguido por 1 h de incubação com UMAF específica para ZIKV (fluido ascítico hiperimune). As placas foram lavadas três vezes seguidas por uma incubação de uma hora de duração com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre (KPL, Gaithersburg, MD). A detecção prosseguiu com a adição de substrato de aminoetilcarbazol (ENZO Life sciences, Farmingdale, MA) preparado de acordo com as instruções do vendedor. Tabela 5. Visão geral d a ID SEQ NO: 1
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EXEMPLO 2 TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO DE REDUÇÃO DE PLACA DO VÍRUS DA ZICA (PRNT)
[079] Projeto de ensaio. Os inventores escolheram infectar células Vero com Renilla luciferase ZIKV e DENV-2 em um formato de 96 poços para o desenvolvimento do ensaio. Como o objetivo é medir as titulações de neutralização dos soros que impedem o vírus de infectar as células, os inventores limitaram o tempo de infecção a 24 horas para evitar múltiplas rodadas de infecções. Substrato permeável às células O ViviRen foi selecionado para medir a atividade da luciferase porque ela pode penetrar nas células para gerar sinais de luciferase sem lise celular. Os inventores primeiro determinaram o inócuo de vírus ótimo por poço (semeado com uma monocamada quase confluente de células Vero) para obter uma gama de revestimento de sinal de luciferase às 24 h após a infecção (p.i.; figura 11). Os inventores escolheram a dose de infecção de multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 para o ensaio de neutralização; nesta dose de infecção, o ensaio gerou consistentemente sinais de luciferase de 100 a 110 vezes superiores aos das células infectadas de forma simulada (figura 11). A figura 9 resume o protocolo de ensaio ideal. Especificamente, as células Vero (1,5 x 104 em 50 μL de meio sem vermelho de fenol por poço) foram semeadas em uma placa branca de 96 poços opaca. Após uma cultura durante a noite, as células foram infectadas com ZIKV repórter ou DENV repórter que tinha sido pré-incubado com soros de pacientes diluídos em série a 37°C durante 60 min. Vinte e quatro horas após a infecção, o substrato da luciferase foi adicionado às células infectadas. As placas foram quantificadas para atividades de luciferase. As curvas de resposta à dose da atividade da luciferase foram utilizadas para calcular a titulação de 90% de neutralização (NT90) de cada soro utilizando o Software Prism. O ensaio repórter é homogêneo (isto é, adiciona células / vírus / substrato e mede a atividade da luciferase sem quaisquer etapas de aspiração ou lavagem do meio) e pode ser completado em menos de 48 horas.
[080] Seleção de soros de pacientes. Um total de 91 soros humanos foram selecionados para validar o ensaio de neutralização com base no vírus repórter. Esses soros foram categorizados em quatro grupos com base em seus valores conhecidos de ZIKV e DENV PRNT90 que haviam sido previamente determinados pelo ensaio de placa tradicional. Os valores de PRNT90 de <, = e > 10 são definidos como negativos, marginalmente positivos e positivos em atividades neutralizantes, respectivamente. Como mostrado na Tabela 6, os espécimes do grupo I (n = 10; espécimes de número 1 a 10) foram negativos na neutralização do ZIKV e do DENV. As amostras do grupo II (n = 6; amostras 11 a 16) foram negativas ou marginalmente positivas no ZIKV neutralizante, mas positivas na neutralização do DENV. As amostras do grupo III (n = 23; amostras de número 17 a 39) foram positivas na neutralização do ZIKV, mas negativas ou marginalmente positivas na neutralização do DENV. Os espécimes do grupo IV (n = 43 pacientes; número de espécime 40-91) foram positivos na neutralização do ZIKV e do DENV. Vale ressaltar que, devido à possível neutralização cruzada de anticorpos entre ZIKV e DENV, pacientes do grupo IV poderiam ter uma das três possíveis infecções: (i) infecções com ZIKV e DENV, (ii) infecção apenas com ZIKV mas com anticorpos que reagem de forma cruzada ao DENV, ou (iii) infecção apenas com o DENV, mas com anticorpos que reagem de forma cruzada ao ZIKV.
[081] Tabela 6. Comparação das titulações de neutralização do ensaio de placa (PRNT90) e ensaio do vírus repórter (NT90)*
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[082] Comparação dos ensaios tradicionais de PRNT e vírus repórter. Todas as 91 amostras de pacientes foram submetidas ao ensaio ZIKV repórter e DENV. A Tabela 6 resume os valores de NT90 derivados do ensaio de repórter bem como os resultados de PRNT90 derivados do ensaio de placa tradicional. Uma vez que os valores de NT90 do ensaio de repórter foram calculados utilizando o Software Prism, a maioria destes números caiu entre duas diluições de soro que imprensaram a inibição de 90% dos sinais de luciferase. A comparação dos resultados de neutralização dos dois ensaios revelou três características, (i) Para qualquer amostra dada, as titulações de neutralização relativa contra ZIKV e DENV estão em total concordância entre os ensaios de repórter e de placa. A figura 10 mostra o gráfico de dispersão de 90% de titulações de neutralização derivadas dos dois formatos de ensaio para ZIKV e DENV, sugerindo uma concordância geral entre os ensaios repórter e de placa, (ii) Espécimes dos grupos II e III exibiram atividades neutralizadoras específicas do tipo de vírus contra DENV e ZIKV, respectivamente, quando testados com ambos os ensaios de vírus de placa e repórter (Tabela 6). Essa especificidade foi particularmente notável para os espécimes 36-39 que neutralizaram potentemente os valores de ZIKV (PRNT90 ou NT90 de 469-1280), mas não conseguiram neutralizar ou neutralizaram fracamente DENV (todos os valores de NT90 de <10, exceto o espécime 37 com NT90 de 30). (iii) As titulações de neutralização derivadas do ensaio ZIKV repórter e DENV foram, em média, 2,5 e 2,4 vezes mais elevadas do que os derivados do ensaio correspondente de placas ZIKV e DENV, respectivamente. Esta observação está de acordo com um estudo recente relatando que as titulações de neutralização medidas por um ensaio de infecção de um único ciclo usando partículas de replicon WNV GFP eram mais elevadas do que o ensaio de placa tradicional (Dowd e outros, 2016 Science 354: 237-40). A maior faixa dinâmica do ensaio do vírus repórter sugere uma sensibilidade maior do que o ensaio de placa na diferenciação das titulações de neutralização dos espécimes do paciente. Coletivamente, os resultados demonstram que o ensaio do vírus repórter tem um alcance de diagnóstico mais dinâmico e mantém a especificidade relativa do ensaio de placa tradicional. Materiais e Métodos
[083] Células e vírus. Células Vero e BHK-21 foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) e mantidas em um meio de Eagle modificado por Dulbecco com alto teor de glicose (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino a 10% (FBS; HyClone Laboratories, South Logan, UT) e 1% de penicilina / estreptomicina a 37°C com 5% de CO2. Para o tradicional ensaio PRNT, os inventores usaram a cepa PRVABC59 e DENV-2 New Guinea (NGC) da ZIKV Puerto Rico. Renilla luciferase ZIKV (cepa FSS 13025) e DENV-2 (cepa NGC) foram preparados a partir dos clones de DNAc infecciosos previamente construídos (Shan e outros., 2016 ACS Infectious Diseases 2: 170-72; Zou e outros, 2011 Antiviral Res 91 : 11-19). Resumidamente, os plasmídeos de DNAc foram utilizados para transcrever in vitro RNA genômicos. Os transcritos de RNA de luciferase ZIKV e DENV foram transfectados em células Vero e BHK-21, respectivamente. As células transfectadas foram cultivadas em DMEM sem vermelho de fenol (para eliminar a sua interferência com a medição do sinal da luciferase). Nos dias 10 e 6 após transfecção (quando os efeitos citopáticos começaram a aparecer nas células transfectadas com ZIKV e DENV-2, respectivamente), os fluidos das culturas foram recolhidos e quantificados para titulações virais usando um ensaio de imunocoloração e ensaio de placa, respectivamente, como anteriormente relatado (Shan e outros, 2016 Cell Host Microbe 19: 891-900).
[084] Amostras de soro. Um total de 91 soros de espécimes clínicos sem identificação foi utilizado no estudo. Os espécimes vieram de duas fontes: 10 amostras do Ramo Médico da Universidade do Texas (UTMB) que foram submetidas à triagem de rotina para agentes que não o vírus da Zica e 81 amostras do Departamento de Saúde do Estado de Nova York que foram submetidas ao ELISA para captura de ZIKV IgM e teste MIA de Arbovirus [um imunoensaio de microesferas com base na proteína WNV E como relatado anteriormente (Wong e outros, 2003 J Clin Microbiol 41: 4217-23)]. As amostras de UTMB foram cuidadosamente selecionadas dos pacientes com menor possibilidade de exposição à infecção por ZIKV e DENV. Conforme descrito recentemente (Wong e outros, 2017 EBioMedicine), os soros do Departamento de Saúde do Estado de Nova York foram quase todos coletados de residentes do estado de Nova York que retornaram de viagens para áreas de epidemia do ZIKV (incluindo Caribe, América Central e do Sul) a partir do final de 2015 a outubro de 2016. A maioria dos soros foi coletada dentro de dois meses após a viagem com possível exposição ao ZIKV. Em alguns casos, os pacientes solicitaram testes diagnósticos em momentos posteriores. Como muitos indivíduos eram assintomáticos, as datas de início da doença não eram conhecidas. O perfil demográfico desta população é de aproximadamente 19% de hispânicos e 6% de asiáticos não hispânicos e das ilhas do Pacífico. Com base nesse perfil demográfico, não é de surpreender que muitos desses indivíduos possam ter imunidade aos flavivírus, principalmente ao DENV e outros flavivírus, bem como às vacinas contra febre amarela. As informações sobre o histórico do paciente com relação à vacinação e infecções anteriores por flavivírus não estão disponíveis.
[085] Ensaio de neutralização com base em vírus repórter. ZIKV repórter e DENV-2 contendo um gene Renilla luciferase foi usado para medir as titulações de neutralização dos soros de pacientes contra ZIKV ou DENV-2 em um formato de placa de 96 poços. Resumidamente, as células Vero (1,5 x 104 células por poço) foram semeadas em uma placa branca opaca de 96 poços (Corning Costar, St. Louis, MO) um dia antes da infecção. Os soros dos pacientes foram inicialmente diluídos em 10 vezes em meio DMEM isento de vermelho de fenol (ThermoFisher Scientific, Sugar Land, TX) contendo 2% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina, seguido por 2 diluições em série (21 a 29). Trinta microlitros de cada diluição de soro foram misturados completamente com 30 μL de ZIKV repórter ou DENV-2 e incubados a 37°C por 1 hora para formar complexos anticorpo-vírus. Posteriormente, foram inoculadas 50 μm de misturas soro-vírus na monocamada de células Vero (contendo 50 μm de meio DMEM isento de vermelho de fenol com 2% de SFB e 1% de penicilina / estreptomicina). A placa foi incubada a 37 durante 24 horas. Os sinais de luciferase intracelular foram medidos utilizando substratos ViviRen (Promega, Madison, WI) no Leitor Multi-Modo de Imagem Celular Cytation 5 (Biotek, Winooski, VT) de acordo com as instruções do fabricante. Meio contendo as mesmas quantidades de ZIKV repórter ou DENV-2, mas sem amostras de soro, foi usado como controle sem tratamento. Os sinais de luciferase dos controles sem tratamento foram fixados em 100%. Os sinais de luciferase de cada amostra tratada com soro diluído foram normalizados para aqueles dos controles sem tratamento. Um modelo sigmoidal (logístico) de quatro parâmetros no software GraphPad Prism 7 foi utilizado para calcular as titulações de neutralização que suprimiram 90% dos sinais de luciferase do controle sem tratamento (NT90).
[086] Teste de neutralização por redução de placa (PRNT). Foi realizado um ensaio padrão de placas de dupla camada (Shi e outros, 2002 J Virol 76: 5847-56) para determinar os PRNTs de cada soro de paciente. Os inventores utilizaram a cepa PRVABC59 de ZIKV Puerto Rico e a cepa Nova Guiné de DENV-2 no ensaio PRNT. Especificamente, diluições em série de amostras de soro (1/10 para a primeira diluição seguida por diluições de 1/2 em série) foram misturadas com uma quantidade igual de suspensão de vírus contendo 200 unidades formadoras de placas (PFU) em 0,1 mL. Após incubação das misturas a 37°C durante 1 hora, cada amostra de soro diluída por vírus (0,1 mL) foi inoculada em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços contendo uma monocamada confluente de células Vero. Após incubar a placa a 37°C durante 1 hora, adicionou-se uma cobertura de agar à monocamada de células infectadas e a placa foi ainda incubada a 37°C. Quando as placas de vírus se tornaram visíveis, uma segunda camada contendo vermelho neutro foi adicionada, e as placas foram contadas. A titulação de anticorpo foi determinada como a diluição do soro que inibiu 90% do inócuo de vírus testado (PRNT90).

Claims (19)

1. Ensaio para detectar infecção por flavivírus, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: contato de uma amostra de um indivíduo suspeito de ter uma infecção com flavivírus com um vírus Zika repórter (rZIKV), o rZIKV configurado para produzir um sinal detectável quando expresso em célula viável, formando uma mistura repórter e incubando a mistura repórter a uma temperatura de 35°C a 40°C; contato de uma monocamada de célula hospedeira com a mistura repórter em condições de crescimento celular a cerca de 37°C formando uma monocamada de células inoculadas; medição do sinal repórter produzido pela monocamada de células inoculadas e normalização do sinal medido para um controle; e cálculo da titulação do ZIKV da amostra usando as medições de sinal do repórter.
2. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por uma diluição em série da amostra contatada com o rZIKV.
3. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que uma pluralidade de amostras é ensaiada individualmente.
4. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue.
5. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é de um indivíduo grávido.
6. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo mamífero.
7. Ensaio, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é humano.
8. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o rZIKV é um ZIKV repórter de luciferase.
9. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a luciferase é Renilla luciferase.
10. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a monocamada de células é uma monocamada de células Vero.
11. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as monocamadas de células são analisadas em uma placa de múltiplos poços.
12. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as células inoculadas são incubadas durante cerca de 12, 24, 36 ou 48 horas antes de medição do sinal do repórter.
13. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda: contato de uma amostra de um indivíduo suspeito de ter uma infecção por flavivírus com um vírus repórter da dengue (rDENV), o rDENV configurado para produzir um sinal detectável ao infectar uma célula viável, formando uma mistura repórter e incubação da mistura repórter a uma temperatura de 35°C a 40°C; contato de uma monocamada de célula hospedeira com a mistura repórter em condições de crescimento celular a cerca de 37°C formando uma monocamada de células inoculadas; medição do sinal do repórter produzido pela monocamada de células inoculadas e normalização do sinal medido para um controle; e cálculo de uma títulação de DENV da amostra usando as medições de sinal do repórter.
14. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda realização de amplificação de DNA de vírus específico usando uma segunda amostra do indivíduo suspeito de ter uma infecção por flavivírus.
15. Ensaio, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação de DNA é um ensaio de PCR-RT viral.
16. Cassete de expressão de DNA recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um segmento de ácido nucleico de flavivírus possuindo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1.
17. Genoma de flavivírus recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 e um segmento de ácido nucleico heterólogo.
18. Flavivírus recombinante, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento de ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína repórter.
19. Flavivírus recombinante, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína repórter é uma proteína fluorescente.
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