CN112410317A

CN112410317A - 一种n-酰基高丝氨酸内酯降解酶及其应用

Info

Publication number: CN112410317A
Application number: CN202011127496.0A
Authority: CN
Inventors: 徐颖; 郝凌云; 梁锦有; 尚琛晶; 张煜
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: CN112410317B; WO2022082961A1

Abstract

本发明公开一种N‑酰基高丝氨酸内酯降解酶及其应用，其中，所述降解酶含有基因AhlM，AhlM的核苷酸序列为SEQ NO.1。本发明的含有基因AhlM的N‑酰基高丝氨酸内酯降解酶能降解致病菌果胶杆菌属(Pectobacterium spp，Pec)产生的AHL，其热稳定性和pH稳定性好，能明显抑制致病菌Pec致作物软腐病。

Description

一种N-酰基高丝氨酸内酯降解酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物酶技术领域，尤其涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯降解酶及其应用。

背景技术

细菌性软腐病是一大类由果胶杆菌属(Pectobacterium spp，Pec)和一些其他的致病性细菌所引起的复合型病害，其不但致病宿主广泛，例如，能导致土豆、菜心、黄瓜、兰花和胡萝卜等多种作物致病，而且其在分布广泛。

目前，大多数作物缺乏针对软腐病的抗性良好的品种，该病的防治仍然依靠化学防治手段，包括使用农用抗生素、无机铜、有机铜以及噻唑类制剂等。然而，化学药剂的使用不仅导致环境污染和农药残留等问题，还容易导致耐药菌株的产生。与直接杀死细菌相比，干扰致病性的途径给病原菌的选择压力更小，更不容易产生耐药性。

细菌在生长过程中会产生并分泌自诱导分子，当自诱导分子浓度随着菌体密度增加到达一定阈值时，菌体识别感受自诱导分子，并调节相关基因的表达，从而调整相关生物学行为以适应外界环境变化，这种菌体之间的交流方式叫做“群感效应”(Quorum-sensing，QS)。病原菌的致病性和群感效应密切相关，如生物膜形成，菌体运动性和胞外酶等毒力因子的分泌都受群感效应调控，通过干扰病原菌之间的群感效应可以有效抑制其致病性。这种干扰群感效应的方式成为“群感淬灭”(Quorum-quenching，QQ)。群感淬灭可以通过干扰自诱导分子的合成、降解自诱导分子和抑制自诱导分子和受体结合来实现，而研究最多的是使用自诱导分子降解酶降解自诱导分子。大多数革兰氏阴性菌产生的自诱导分子为N-酰基高丝氨酸内酯 (N-acylhomoserinelactone，AHL)，目前已报道的AHL降解酶包括内酯酶、酰基转移酶和氧化还原酶三类。其中内酯酶能打开内酯环使自诱导分子失活，此反应在酸性条件下可逆，内酯环重新闭合，而酰基转移酶和氧化还原酶催化的反应不可逆。

目前，人们已经从土壤和植物叶片的样品中分离得到能产生AHL降解酶的菌株，其中一些产生的降解酶在离体植物组织上对Pec致病性有不同程度的抑制活性，但尚未在植物活体上进行系统研究，其应用前景仍不明朗，仍然需要寻找更高效的降解酶，并研究其在植物上的应用。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种N-酰基高丝氨酸内酯降解酶及其应用，旨在解决现有AHL降解酶在植物活体上对Pec致病性的抑制活性不高的问题。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，所述降解酶的基因为AhlM，AhlM的核苷酸序列为SEQ NO.1。

可选地，所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，其中，所述降解酶的氨基酸序列为SEQ NO.2。

可选地，所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，其中，所述降解酶为内酯酶。

可选地，所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，其中，所述降解酶由共附生于石磺海牛嘴中的XY-85产生，XY-85为Mesoflavibacter zeaxanthinifaciens。

第二方面，本发明提供一种如上所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属产生的自诱导分子中的应用。

可选地，所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属产生的自诱导分子中的应用，其中，所述降解酶的工作浓度为0.781μg/mL以上；所述降解酶的适用pH＝4～11；所述降解酶的适用温度为室温至100℃。

第三方面，本发明提供一种如上所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其中，将克隆有AhlM的菌株接种于植物，通过克隆有AhlM的菌株原位产生的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶抑制果胶杆菌属致作物软腐病。

可选地，所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其中，所述菌株为大肠杆菌。

可选地，所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其中，所述作物为蔬菜或观赏植物。

可选地，所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其中，所述作物为土豆或菜心。

有益效果：本发明的含有基因AhlM的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶能降解致病菌Pec产生的AHL，其热稳定性和pH稳定性好，能明显抑制致病菌Pec对作物的致病。

附图说明

图1为本发明实施例1中，XY-85降解致病菌Pec产生的AHL的结果图，NC为阴性对照(negative control)。

图2为本发明实施例2中，AHL的降解产物酸化后的恢复结果图，PC 为阳性对照(positive control)；a、b不同字母间有极显著差异，p<0.01。

图3为本发明实施例3中，AhlM的氨基酸序列信息和一些已报道的内酯酶的氨基酸序列进行clustalW比对的结果图；

图4为本发明实施例3中，用最大似然法构建的AhlM序列进化树图。

图5为本发明实施例6中，用不同浓度的AhlM在28℃降解信号分子2h后的OD₅₅₀的柱状图，NC：阴性对照(negative control)；用CV026检测残留的信号分子，有残留的信号分子会使CV026变紫，OD₅₅₀值升高。

图6为本发明实施例7中，AhlM在不同温度下孵育30min后的相对酶活的柱状图。

图7为本发明实施例8中，AhlM在不同pH下孵育3h后的相对酶活的柱状图。

图8为克隆有AhlM的大肠杆菌对Pec致土豆软腐病的抑制性的测定结果图，NC为阴性对照(negative control)；a、b不同字母之间有极显著差异， p<0.01。

具体实施方式

本发明提供一种N-酰基高丝氨酸内酯降解酶及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

海洋共附生微生物是指相对于游离生活在海水等自然环境中的微生物，它们和海洋动植物形成共生、共栖、寄生和附生关系。研究发现，多数海洋动植物天然产物是由其共附生微生物产生的；通过分离纯化海洋动植物的共附生微生物，进而研究其代谢产物，不但可以大大提高活性物质的产量，而且其代谢产物组成相对于动植物个体而言简单得多，更有利于下一步的分离纯化。

石磺海牛(Homoiodoris japonica)属于腹足纲裸鳃目动物，生活在潮间带到潮下带浅水区礁石下，个体较大，体长有20-80mm，外套膜较宽，覆盖住足盘。背部分布有许多凸起，形似石磺，头部有两个小触须，裸鳃呈羽状，5-6叶，三分歧式，鳃腔缘也有小突起围绕。石磺海牛为雌雄同体动物，一般5-6月交配产卵，交配时双方用阴茎刺向对方，优先刺破对方体壁的为雄性。石磺海牛的卵呈簇状，附着于固体表面。

基于此，下面结合实施例对本发明的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶进行详细描述。

实施例1XY-85的分离及XY-85降解Pec产生的AHL的活性测试

(1)XY-85的分离

海洋无脊椎动物于2017年3月采集于深圳大鹏自然保护区，鉴定为石磺海牛。样品采集完后保存于天然海水中，当天取回实验室。在超净工作台中用无菌海水将石磺海牛表面冲洗三次，用解剖刀将样品剖开，将觜、外表皮、内表皮、后鳃、内脏团、生殖器和卵分开。用解剖剪将觜剪碎，置于研钵中，加入液氮后充分研磨粉碎，用17g/L的无菌人工半海水将组织样品重悬。悬液100×g离心10min，收集上清，该步骤重复三次。上清在5,000×g离心15min，去除上清后用新的无菌人工半海水重悬沉淀，该步骤重复三次。用25％的无菌甘油重悬沉淀，分装1mL每管后置于-80℃保存。

将保存的样品从-80℃冰箱取出，恢复到室温后用17g/L的无菌人工半海水稀释十倍，混合均匀后取100μL样品稀释液涂布到添加了17g/L海盐的 R2A平板上。正置平板，等平板表面的水分完全干燥后倒置室温培养3-4d。挑取单菌落，用平板划线法接种到新鲜的MA培养基，倒置室温培养3-4d后再次挑取单菌落用平板划线法接种到新的MA培养基上，倒置室温培养 3-4d，得到纯化的菌株，接着通过对AHL降解活性效率的筛选得到目的菌株，命名为XY-85。通过16s rRNA序列比对分析，得到XY-85的16S rRNA序列与 Mesoflavibacterzeaxanthinifaciens的16S rRNA序列(核糖体的RNA序列，用来衡量两个菌之间在进化上的差异)的相似度为99.62％。表明确定XY-85 为Mesoflavibacter zeaxanthinifaciens(是一种玉米黄质酸杆菌)，XY-85的共附生生态位为石磺海牛的嘴。

XY-85已于2020年8月13日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center，CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20528，分类命名为：Mesoflavibacterzeaxanthinifaciens

(2)XY-85降解Pec产生的AHL的活性测试实验

(2.1)提供XY-85菌液：刮取少量冻存菌体划线到MA培养基中，28℃倒置培养3d。取XY-85单菌落(接种到10mL SGTYP培养基(葡萄糖5g/L，可溶性淀粉5g/L，胰蛋白胨1g/L，酵母提取物1g/L，蛋白胨1g/L，pH＝7.5) 中，28℃，200rpm摇培2d。

(2.2)用乙酸乙酯将致病菌Pec产生的AHL萃取出来，然后加到步骤(1) 提供的XY-85菌液中，摇培1d后用紫色色杆菌CV026检测残留的AHL，紫色色杆菌CV026不产生紫色色素，说明AHL被XY-85降解了。

并将菌液离心，去除上清，向菌体加入100μL的DMSO萃取菌体内的紫色素。再次离心，取100μL上清加到酶标板中，用酶标仪测OD₅₅₀。

阴性对照实验：将乙酸乙酯萃取出来的AHL加到SGTYP培养基中，摇培1d后用紫色色杆菌CV026检测AHL。

每组实验做4个平行，阳性结果实验至少重复三次。

用酶标仪测得XY-85降解致病菌Pec产生的AHL的结果如图1所示，其中，NC为阴性对照实验的测试结果；该测试结果进一步证实AHL被XY-85 降解了。

实施例2AHL降解产物酸化恢复实验

往XY-85菌液中加入购买的自诱导分子(C6-HSL，结构为

)，摇培1d后，离心取上清。用盐酸将上清的pH调节到 1，在酸性条件下孵育1d，再用氢氧化钠将上清调节回中性，用紫色色杆菌 CV026检测上清中的AHL；上清重新让紫色色杆菌CV026产生紫色素，说明 XY-85菌液降解自诱导分子的产物在酸性条件下活性恢复，这表明XY-85产生的AHL降解酶是内酯酶。

阳性对照实验：将购买的自诱导分子用10mM的氢氧化钠室温降解 30min，用盐酸将pH调节到1，在酸性环境下孵育1d，再用氢氧化钠将pH调节到中性，用紫色色杆菌CV026检测上清中的AHL。

每组实验做4个平行，阳性结果实验至少重复三次。

用酶标仪测得酸化前后XY-85降解C6-HSL的结果对比如图2所示，其中，PC为阳性对照实验在酸化前后的测试对比结果；该测试结果进一步证实XY-85菌液降解自诱导分子的产物在酸性条件下活性恢复，这表明XY-85 产生的AHL降解酶是内酯酶。

实施例3XY-85内酯酶序列分析

通过全基因组序列测序分析，得到XY-85全基因组序列信息，并将序列信息和KEGG数据库中已报道的内酯酶序列进行比对，最后筛选得到 XY-85内酯酶(即AHL降解酶)的氨基酸序列信息(SEQ NO.2)，并命名为AhlM。将AhlM的氨基酸序列信息和一些已报道的内酯酶的氨基酸序列进行clustalW比对，对比结果如图3所示，显示AhlM具有保守氨基酸D (59号)和H(260号)，此外在110号氨基酸和120号氨基酸之间含有保守区域(带*氨基酸)。

为了探究AhlM和已报道内酯酶在进化上的亲缘关系，用最大似然法构建如图4所示的AhlM蛋白质序列进化树，可知AhlM在进化上亲缘关系最近的是Aii20J内酯酶。

实施例4将XY-85内酯酶的基因AhlM克隆到大肠杆菌中表达及其 AHL降解活性验证的实验

将XY-85活化到MA培养平板，28℃倒置培养3d后用

SPIN Kit for Soil试剂盒提取基因组DNA，用nanodrop 2000C测定DNA浓度和纯度。用XY-85的基因组DNA作为模板，用引物85NH-F(核苷酸序列为 SEQ NO.3)和85NH-R(核苷酸序列为SEQ NO.4)PCR扩增(PCR体系见下述(4.1)，PCR程序见下述(4.2))AhlM(核苷酸序列为SEQ NO.2)。

(4.1)PCR体系：

PrimeSTAR Max DNA聚合酶25μL；

(4.2)PCR程序：

获得的扩增片段和pET28a载体用Nco I和Xho I内切酶37℃进行双酶切(酶切体系和酶切程序下述(4.3)、(4.4))。将酶切好的目的片段DNA 和载体混合，用T₄连接酶连接12h，连接产物(pET28a::N6His:AhlM质粒) 电转到大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α，缩写为E.coli DH5α)中。挑选阳性克隆进行PCR测序验证，取序列正确的克隆提取质粒DNA，并将质粒DNA电转到表达载体大肠杆菌BL21(DE3)(Escherichia coli BL21 (DE3)，缩写为E.coli BL21(DE3))中，挑取具有AHL降解活性的阳性克隆(E.coli BL21(DE3)pET28a::N6His:AhlM)保存。

(4.3)酶切体系：

(4.4)酶切程序：

37℃ 1h；

65℃ 20min；

4℃ ∞。

实施例5AhlM的蛋白纯化实验

将AHL降解验证阳性的菌株(E.coli BL21(DE3)pET28a::N6His:AhlM) 活化到LB+Kana50培养平板，37℃倒置培养1d。取单菌落接种到100mL 新鲜的LB+Kana50培养基，37℃，200rpm过夜摇培。取种子液1:20接种到1L新鲜的LB+Kana50培养基，37℃，200rpm摇培2h至OD₅₉₅＝0.7-0.8。加入IPTG至终浓度0.1mM，18℃，200rpm过夜摇培。菌液在10,000rpm， 4℃离心5min，去除上清。菌体用balance buffer(其配方如表1所示)重悬，加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至终浓度200g/mL，加入DNaseI(脱氧核糖核酸酶I)至终浓度5μg/mL。用预冷的高压破碎仪破碎菌体5-6次，压力 800bar。菌液在15,000×g，4℃离心10min，将上清转移到干净的离心管，沉淀用5mL balance buffer重悬，将上清和重悬的沉淀再次在15,000×g，4℃离心10min，将上清都混合转移到干净的离心管，上清用0.22μm滤头过滤。

将Ni-NTA凝胶柱子接到bio-rad NGC液相系统中，用ddH₂O(双蒸水) 洗去柱子中的乙醇，流速5mL/min。用0.5M的氢氧化钠溶液冲洗柱子至电导率上升到不再改变，流速5mL/min。用ddH₂O冲洗柱子至电导率归零，流速5mL/min。用硫酸镍溶液冲洗柱子至电导率不再变化，柱子完全变成绿色后用ddH₂O将没有吸附的Ni²⁺洗掉，电导率归零。用balancebuffer冲洗柱子至电导率不再改变，将吸光度调零。上过滤后的蛋白上清，流速 3mL/min，用balance buffer冲洗柱子，洗掉没有吸附的蛋白，直至吸光度不再改变。用10mM的咪唑冲洗柱子，直至吸光度不再改变后换20mM的咪唑冲洗，接着用40mM的咪唑冲洗，最后用60mM的咪唑冲洗柱子，将弱吸附的杂蛋白洗掉。最后用500mM的咪唑洗脱蛋白，即得到纯的AhlM。

表1 balance buffer的配方

实施例6AhlM的适用工作浓度的测定

将纯化好的XY85内酯酶(AhlM)加到ddH₂O中至终浓度100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.563μg/mL， 0.781μg/mL，0.391μg/mL，0.195μg/mL，0.098μg/mL，取1mL AhlM溶液到 24孔板，加入C6-HSL至终浓度20μM。在28℃，200rpm摇培2h，1:1加入ACN(乙腈)终止反应。取10μL溶液和90μL过夜摇培的紫色色杆菌 CV026菌液(OD₅₉₅＝0.1-0.2)到96孔板，28℃，200rpm摇培12h。菌液在 15,000rpm离心5min，去除上清，加入100μL DMSO萃取紫色素。再次 15,000rpm离心5min，取上清测OD₅₅₀。测得的不同AhlM浓度的上清的 OD₅₅₀的如图5所示，可知，显示，100μg/mL的AhlM在28℃孵育2h能够将AHL失活，说明AhlM表达纯化成功。经过倍半稀释后，0.391μg/mL的 AhlM在2h内已经不能完全将10μM的C6-HSL完全降解，然而0.781μg/mL 的AhlM在2h内还能将加入的AHL完全降解；表明AhlM的适用工作浓度为0.781μg/mL以上。

实施例7AhlM的热稳定性的测定

往1×PBS中加入纯化好的XY-85内酯酶(AhlM)至终浓度0.8μg/mL，将菌液分别在28℃，40℃，60℃，80℃和100℃孵育30min。恢复室温后，取1mL酶液到24孔板，加入终浓度为20μM的C6-HSL，28℃，200rpm摇培2h。往溶液中1:1加入ACN(乙腈)终止反应。取10μL溶液和90μL过夜摇培的紫色色杆菌CV026菌液(OD595＝0.1-0.2)到96孔板，28℃，200rpm 摇培12h。菌液在15,000rpm离心5min，去除上清，加入100μL DMSO萃取紫色素。再次15,000rpm离心5min，取上清测OD₅₅₀；并用阴性对照组的吸光度减去处理组的吸光度的值除以阴性对照组的吸光度来计算相对酶活。测得AhlM在不同温度下孵育30min后的相对酶活(RelativeAHL degrading bioactivities，％)如图6所示。可知，尽管在100℃下加热30min， AhlM内酯酶依然保留有90％左右的AHL降解活性。而已报道的内酯酶类一般在温度超过60℃就失活了：例如AiiM在70℃下只有60％活性，80℃只有40％活性；AidC在60℃只有40％活性，80℃下只有20％活性；MomL 在60℃只有30％活性，80℃下只有15％活性；AiiA在45℃下完全失活。表明AhlM的热稳定性很强，其适用温度为室温至100℃。

实施例8AhlM的pH稳定性的测定

用磷酸/氢氧化钠将1/10×PBS的pH调节到2-12(间隔1)，用0.22μm 滤头过滤后加入XY-85内酯酶(AhlM)至终浓度0.89μg/mL，对照组加入等体积的5％甘油(AhlM溶解于5％甘油)。取900μL酶液到24孔板，在 28℃，200rpm摇培3h，加入100μL 1M的PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)将 pH值调节到中性。加入C6-HSL至终浓度20μM，28℃，200rpm摇培2h。往溶液中1:1加入ACN终止反应。取10μL溶液和90μL过夜摇培的紫色色杆菌CV026菌液(OD₅₉₅＝0.1-0.2)到96孔板，28℃，200rpm摇培12h。菌液在15,000rpm离心5min，去除上清，加入100μLDMSO萃取紫色素。再次15,000rpm离心5min，取上清测OD₅₅₀。并用阴性对照组的吸光度减去处理组的吸光度的值除以阴性对照组的吸光度来计算相对酶活。测得AhlM在不同pH下孵育3h后的相对酶活(Relative AHL degrading bioactivities，％) 如图7所示。可知，AhlM的pH耐受范围广，在pH＝4-11的环境下孵育3h 依然保留100％的活性，而在pH＝3的环境下孵育3h也能保留75％的AHL 降解活性，在pH＝12的环境处理3h也保留有接近40％的活性。而已报道的内酯酶AiiM在pH＝6时只有40％活性，AidC和MomL在pH＝6时只有50％活性。表明AhlM的抗逆能力远远比已报道的内酯酶强，其超强的抗逆性使得其应用范围更加广泛，其适用pH＝4-11。

实施例9AhlM对Pec致土豆软腐病的抑制性的测定

将克隆有AhlM的基因(命名为：AhlM)的大肠杆菌(E.coli BL21(DE3) pET28a::N6his:AhlM)活化到LB+Kana50平板，37℃倒置培养1d。取单菌落接种到新鲜的LB+Kana50培养基，37℃，200rpm过夜摇培。取种子液 1:20接种到新鲜的LB+Kana50培养基，37℃，200rpm摇培2h至OD₅₉₅≈0.8，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度0.1mM，18℃，200rpm过夜摇培。将Pec活化到LB培养平板，28℃倒置培养1d，刮取菌体重悬到ddH₂O中。菌液在15,000rpm离心5min，去除上清，菌体用ddH₂O洗两次。BL21(DE3)用ddH₂O重悬到10¹¹CFU/mL，加入重悬的Pec至终浓度 10⁵CFU/mL，室温静置孵育10min。将超市购买的土豆用水洗干净表面的泥土，依次用1％的次氯酸钠和75％乙醇将土豆进行表面消毒30s，用ddH₂O 将表面冲洗干净后室温晾干。将消毒好的土豆切成7mm厚的土豆片，置于培养皿中，取5μL混合菌液注射到土豆片中。将装有土豆片的培养皿置于密封袋中，密封袋放置用ddH₂O蘸湿的吸水纸保湿。

对照组为：转化了空载体pET28a的E.coli BL21(DE3)重悬到 10¹¹CFU/mL，加入Pec至终浓度10⁵CFU/mL，室温静置孵育10min后取5μL 接种到土豆片中。

将密封袋正置于28℃培养箱中培养48h，量取致病斑面积；实验组和对照组的致病斑的测试结果如图8所示。可知，E.coli BL21(DE3) pET28a::N6His:AhlM和Pec共接种到土豆片后，Pec致病斑明显比对照组小，致病效果明显减轻，说明E.coli BL21(DE3)pET28a::N6His:AhlM能够有效抑制Pec对土豆的致病作用，这表明了E.coli BL21(DE3) pET28a::N6His:AhlM原位产生的AhlM可有效抑制Pec致作物软腐病。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

<110> 深圳大学

<120> 一种N-酰基高丝氨酸内酯降解酶及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

gatgtaaaat atattgccct atcgcataca cattttgacc attctggatc tgcatctaaa 60

ttaccaaacg ccatttggat cgttcaagaa aacgagtata actttgtaac tagcgaagaa 120

caaaaaaaac aaagtccaga caactttaac gcgataaaaa acttaaaagc tttaaagaaa 180

ataaatggta attatgatgt ttttggtgac ggaagagttg ttatagtatc aactccaggt 240

catacgccag gtcaccaatc tttatttgta gatttagaac aagaaggacc attaatgctt 300

acaggagaca tgtatcacat ggaagaaagc agagaaaact ctagagtacc aatctttaat 360

catgatgttg accaaacttt agcatcaatg gaagtttttg aaacatttgc aaaagaaaaa 420

ggagcacgtg ttattataca acattcaaca aaagattata acagtttaaa tccagcacca 480

gaaccaattc aatag 495

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Met Lys Lys Leu Ile Ile Leu Leu Ile Thr Leu Ser Leu Phe Val Ala

1 5 10 15

Cys Lys Lys Asp Lys Lys Glu Thr Ser Val Glu Gln Thr Glu Thr Glu

20 25 30

Val Lys Lys Glu Pro Ile Lys Met Phe Met Phe Asp Gly Gly Thr Val

35 40 45

Gln Val Asn Met Leu Glu Ile Phe Ser Gln Asp Asp Ala Tyr Lys Gly

50 55 60

Gln Ser Lys Thr Phe Ala Asp Ala Phe Tyr Leu Ile Gln His Pro Asp

65 70 75 80

Gly Asn Leu Leu Trp Asp Ala Gly Leu Ser Glu Asp Leu Ile Gly Lys

85 90 95

Glu Pro Phe Thr Thr Pro Glu Gly Ala Phe Thr Val Ser Arg Lys Thr

100 105 110

Gly Ile Glu Glu Gln Leu Lys Ser Ile Gly Leu Ser Thr Asn Asp Val

115 120 125

Lys Tyr Ile Ala Leu Ser His Thr His Phe Asp His Ser Gly Ser Ala

130 135 140

Ser Lys Leu Pro Asn Ala Ile Trp Ile Val Gln Glu Asn Glu Tyr Asn

145 150 155 160

Phe Val Thr Ser Glu Glu Gln Lys Lys Gln Ser Pro Asp Asn Phe Asn

165 170 175

Ala Ile Lys Asn Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ile Asn Gly Asn Tyr Asp

180 185 190

Val Phe Gly Asp Gly Arg Val Val Ile Val Ser Thr Pro Gly His Thr

195 200 205

Pro Gly His Gln Ser Leu Phe Val Asp Leu Glu Gln Glu Gly Pro Leu

210 215 220

Met Leu Thr Gly Asp Met Tyr His Met Glu Glu Ser Arg Glu Asn Ser

225 230 235 240

Arg Val Pro Ile Phe Asn His Asp Val Asp Gln Thr Leu Ala Ser Met

245 250 255

Glu Val Phe Glu Thr Phe Ala Lys Glu Lys Gly Ala Arg Val Ile Ile

260 265 270

Gln His Ser Thr Lys Asp Tyr Asn Ser Leu Asn Pro Ala Pro Glu Pro

275 280 285

Ile Gln

290

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

ataccatggg ccatcatcat catcatcaca aaaaactaat cattcttctt attacc 56

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

cgcctcgagc tattgaattg gttctggtg 29

Claims

1.一种N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，其特征在于，所述降解酶含有基因AhlM，AhlM的核苷酸序列为SEQ NO.1。

2.根据权利要求1所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，其特征在于，所述降解酶的氨基酸序列为SEQ NO.2。

3.根据权利要求1所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，其特征在于，所述降解酶为内酯酶。

4.根据权利要求1所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶，所述降解酶由共附生于石磺海牛的嘴中的XY-85产生，XY-85为Mesoflavibacter zeaxanthinifaciens。

5.一种如权利要求1～4任意一项所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属产生的自诱导分子中的应用。

6.根据权利要求5所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属产生的自诱导分子中的应用，其特征在于，所述降解酶的适用工作浓度为0.781μg/mL以上；所述降解酶的适用pH＝4～11；所述降解酶的适用温度为室温至100℃。

7.一种如权利要求1～4任意一项所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其特征在于，将克隆有AhlM的菌株接种于植物，通过克隆有AhlM的菌株原位产生的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶抑制果胶杆菌属致作物软腐病。

8.根据权利要求7所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。

9.根据权利要求7所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其特征在于，所述作物为蔬菜或观赏植物。

10.根据权利要求9所述的N-酰基高丝氨酸内酯降解酶在抑制果胶杆菌属致作物软腐病中的应用，其特征在于，所述作物为土豆或菜心。