CN101935640A

CN101935640A - 细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101935640A
Application number: CN2009100883174A
Authority: CN
Inventors: 张力群; 梅桂英
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2029-07-03
Also published as: CN101935640B

Abstract

本发明公开了一种细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用。所述降解酶是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与动植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的降解酶可以作为内酯酶，降解细菌群体感应信号N-酰基-_L-高丝氨酸内酯，破坏由群体感应系统调控的细菌致病性的表达，从而达到预防和治疗动植物细菌性病害的目的。

Description

细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用。

背景技术

细菌作为单细胞生物除了能够独立生存和繁殖以外，在漫长的进化历史中逐渐发展出不同个体、甚至不同种群间的信号交流途径。这种交流依赖于细菌自身分泌的小分子信号物质，如N-酰基-_L-高丝氨酸内酯(N-acyl-_L-homoserine lactones，AHLs)、寡肽分子(autoinducing polypepitides，AIP)、呋喃酰硼酸二酯(Furanosylboratediester，AI-2)等，其中研究最为深入的是AHLs类信号分子。细菌通过感知环境中此类信号分子的浓度，判断细菌群体密度的大小，从而启动或关闭相关基因的表达来适应环境的变化，这种细菌群体间的调控方式被称作群体感应(quorum sensing，QS)(Fuqua，C.，Parsek，M.R.& Greenberg，E.P.(2001).Regulation of gene expression by cell-to-cell communication：acyl-homoserine lactone quorum sensing.Annu Rev Genet.35，439-468.)。该调控系统是近年来倍受研究者重视的细菌学研究热点之一。

利用AHLs作为信号分子的群体感应系统调控着细菌许多重要生物学功能的执行，例如：毒性基因的表达，细菌的群游，生物膜的形成，抗生素的合成，生物发光，固氮基因的表达，Ti质粒的接合转移等。已知受QS调控的细菌表现型多与细菌和其寄主的互作有关，尤其是在动物和植物病原细菌与其寄主的互作中，QS系统常常控制病原细菌致病性相关性状的表达，如：人类机会病原菌铜绿假单胞(Pseudomonasaeruginosa)的致病性受两套QS系统的调控，Las系统产生信号分子N-3-Oxo-C12-HSL，调控毒力因子lasB、lasA和toxA的表达；Rhl系统产生信号分子C4-HSL，该系统调控rhlAB的表达。小鼠肺炎模型试验表明，缺失lasR后P.aeruginosa的毒力明显下降(Tang，H.B.，E.DiMango，R.Bryan，M.Gambello，B.H.Iglewski，J.B.Goldberg，and A.Prince(1996)Contribution of specific Pseudomonas aeruginosa virulence factors to pathogenesis of pneumonia in a neonatal mouse model of infection.Infect.Immun.64：37-43)。在同一个模型试验中，同时还对lasI突变、rhlI突变和lasI rhlI双突变进行分析，都表现毒力明显下降(Pearson，J.P.，M.Feldman，B.H.Iglewski，and A.Prince(2000)Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signaling is required for virulence in a model of acute pulmonary infection.Infect.Immun.68：4331-4334.)。在导致植物病害的病原细菌中，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中导致寄主植物根瘤的致病表现型Ti质粒的接合转移；胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)、玉米欧氏菌(E.stewartii)、菊欧氏菌(E.chrysanthem)和番茄青枯菌(Ralstonia solanacearum)中导致寄主病害的毒力基因表达的诱导(见综述Pierson III L.S.，Wood D.W.，Pierson E.A.1998.Homoserine lactone-mediated generegulation in plant-associated bacteria.Annu.Rev.Phytopathol.36：207-225；Melissa，B.Miller and Bonnie L.Bassler(2001)Quorum sensing in bacteria.Annu.Rev.Microbiol.55：165-199)。因此在这些病害系统中QS与植物病害的发生密切相关。胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种E.carotovora subsp.carotovora(Ecc)能够引起马铃薯、甘蓝、蕃茄、辣椒、胡萝卜、芹菜、洋葱、花椰菜等许多植物的软腐病。其侵染寄主植物时合成和分泌能够降解植物细胞壁的水解酶，如果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶等，瓦解植物组织结构，进而汲取养分支持其自身的生长和繁殖，导致病害症状产生。研究表明，启动Ecc编码这些胞外酶基因的关键信号分子是由其QS系统的AHLs类信号分子合成基因CarI合成的N-3-羰基己酸高丝氨酸内酯(N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone，N-3-oxo-C6-HSL)。N-3-oxo-C6-HSL的浓度随病原菌群体密度增高，当达到一定阈值时，N-3-oxo-C6-HSL与LuxR家族转录激活蛋白结合，启动致病因子的表达。如果将合成AHL信号的基因CarI失活，突变体则不能在马铃薯和烟草上引起病害，但是加入外源N-3-oxo-C6-HSL后，突变株的致病力随即得到恢复(Jones，S.，Yu，B.，Bainton，N.J.，Birdsall，M.，Bycroft，B.W.，Chhabra，S.R.，Cox，A.J.，Golby，P.，Reeves，P.J.and other authors(1993).The lux autoinducerregulates the production of exoenzyme virulence determinants in Erwinia carotovoraand Pseudomonas aeruginosa.EMBO J.12：2477-2482；Barnard，A.M.L.，Bowden，S.D.，Burr，T.，Coulthurst，S.J.，Monson，R.E.& Salmond，G.P.C.(2007).Quorum sensing，virulence and secondary metabolite production in plant soft-rotting bacteria.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 362：1165-1183.)。

不同动植物病原细菌中QS调控致病性基因表达的机制相似，达到特定的AHLs浓度是引发病原菌表达致病因子的关键。因此，AHLs信号分子可能成为防治动植物细菌病害的新靶点，从而开辟一条防治细菌病害的新途径。自然界中通过长期的进化，有些生物已经进化出破坏病原细菌QS系统的功能。这种干扰作用主要表现在产生降解酶破坏AHLs信号分子，以降低信号分子在环境中的浓度。

许多原核和真核生物都可以产生QS信号分子降解酶，不同的微生物所产生的QS信号分子降解酶在结构和作用机制上也不同。其中首先报道的是从芽孢杆菌(Bacillus sp.)240B1中克隆得到的aiiA基因所编码一种AHL内酯水解酶(AHL-lactonase)，AiiA能够降解多种AHLs类的信号分子(Dong，Y.H.，Xu，J.L.，Li，X.Z.，and Zhang，L.H.(2000)AiiA，an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora.Proc Natl Acad Sci USA 97(7)：3526-3531.)；将该基因转入烟草和马铃薯可以提高植株的抗病性，证明利用信号分子降解酶干扰病原菌的QS系统可能成为防治细菌病害的新方法。目前发现的QS系统信号分子降解酶从作用机制上可以分为两类：酰基高丝氨酸内酯酶(AHL-lactonase)和酰基高丝氨酸酰基转移酶(AHL-acylase)，它们分别水解AHLs信号分子保守结构中的内酯环和酰胺键，破坏信号分子，从而干扰QS系统的功能(Wang，L.H，L.X.Weng，Y.H.Dong，and L.H.Zhang.(2004)Specificity and enzyme kinetics of the quorum-quenching N-Acyl homoserine lactone lactonase(AHL-lactonase).J.Biol.Chem.279：13645-13651.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌群体感应信号降解酶。

本发明提供的细菌群体感应信号降解酶，命名为AidH，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有内酯酶活性的由1)衍生的蛋白质。

序列表2为细菌群体感应信号降解酶的氨基酸序列，包括271个氨基酸，在该蛋白序列中，疏水氨基酸占117个，亲水氨基酸占144个，碱性氨基酸占33个，酸性氨基水占41个，该蛋白质的分子量为29.5KD，等电点为4.64，属于α/β水解酶。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。

为了使1)中的AidH便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的AidH可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的AidH的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第7到819位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明的另一目的在于提供细菌群体感应信号降解酶的编码基因，命名为AidH，也在本发明的保护范围内。

编码细菌群体感应信号降解酶的DNA，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)的核苷酸序列：

1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码上述降解酶的核苷酸序列；

3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码上述降解的核苷酸序列。

序列表中的序列1由828个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第7-819位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的AidH蛋白。

上述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也在本发明的保护范围内。

本发明的另一目的在于提供上述蛋白作为内酯酶的应用。

本发明的另一目的在于提供上述蛋白在降解N-酰基-_L-高丝氨酸内酯中的应用。

本发明的又一目的在于提供上述基因在培育抗病转基因植物中的应用。

所述抗病转基因植物为抗细菌性病害转基因植物。

所述细菌性病害是致病性与群体感应相关的细菌性病害。

本发明的又一目的在于提供上述蛋白或其基因在制备人或动物细菌性病害治疗药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供上述蛋白或其基因在制备防治植物细菌性病害的药物中的应用。

本发明提供的细菌群体感应信号降解酶，能够降解酰基高丝氨酸内酯，经实验证实，该细菌群体感应信号降解酶是内酯酶。本发明开辟一条动植物细菌性病害防治的新途径。

附图说明

图1为筛选到的菌株(Ochrobactrum sp.T63)的生防能力测定。

图2为AidH基因的克隆酶切电泳图谱，1和8泳道为marker，其余为亚克隆片段，大小约为2.3kb。

图3为AidH基因的原核表达SDS-PAGE图谱。

图4为AidH纯化蛋白的体外活性检测，A为AidH蛋白纯化后的电泳图；B为纯化后AidH蛋白的活性检测。

图5为AidH的降解机制解析(LC-MS)，A上：不加C6HSL的反应溶液；A中：加C6HSL的不反应对照；A下：加C6HSL后反应30min；B：22.1min的ESI图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明的实施例中所用到的材料如下：

载体pBluescript II SK(+)和pET-22b(+)分别购自Stratagene和Novagen公司；限制性内切酶、修饰酶等试剂购自中佳信德、通宝达、诺赛公司；酰基高丝氨酸内酯信号分子购自sigma公司。

LB培养基：每升中含蛋白胨10克、酵母粉5克、NaCl 5克，pH为7.0。

实施例1.AidH基因的合成及其表达

一、AidH基因的克隆

1、具有降解群体感应信号分子功能的菌株的筛选

称取1g植物根围土壤，加入9ml灭菌蒸馏水，振荡，使其充分混匀，然后按10^-1系列稀释，取100μl稀释液涂于LB平板(不含任何抗生素)，在超净台晾干，28℃培养24-36h，直至形成明显单菌落。

挑选不同菌落形态的单菌落，于液体LB培养基中，28℃，120rpm/min，培养19h。然后与群体感应信号分子混合，相同条件下共培养3-4h。用乙酸乙酯萃取混合培养液，并用旋转蒸发仪真空抽干。用甲醇溶解。溶解的混合物用高压液相色谱(HPLC)分析，条件为：色谱柱：Agilent TC-C18 4.6×250mm，5μm；检测器：紫外210nm；流动相：甲醇/水(40∶60)；流速：0.25ml/min；柱温：23℃；进样量：5μL。如果信号分子被降解，则从HPLC峰图中能明显看到标准信号分子峰的减小，并且产生另外一个新的峰；反之，如果信号分子不被降解，则产生的峰和不降解对照一致。

将筛选到的菌株与软腐病病原菌(Erwinia sp.)按不同的体积比接种大白菜，培养一段时间，观察发病情况，以无菌水和病原菌分别作为对照，结果如图1所示，病原菌与筛选到的菌株(T63)混合后，几乎不发病或发病减轻。

2、AidH基因的克隆及序列测定

构建菌株T63的基因组文库。用上述相同的方法筛选具有降解信号能力的转化子，然后进行亚克隆。用EcoRI和SalI双酶切，得到一个约5kb的有活性的片段。再用HindIII酶切，得到一个2.3kb的活性片段(图2)。该片段连到pBluescript II SK(+)上，测定核苷酸序列。该序列如序列表中序列1所示的自5’端第4-825位的核苷酸序列。序列表中的序列1由828个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第7-819位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的AidH蛋白。

二、AidH基因的合成和原核表达

人工合成序列表中序列1的所示核苷酸序列。其中第4位至9位为NdeI酶切位点，第819-825位为XhoI酶切位点，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第7-819位碱基。确定序列正确无误之后，克隆到pET-22b(+)载体的NdeI和XhoI位点间，形成重组表达载体，命名为pET-813，将之转化大肠杆菌BL21，得到转入pET-813的重组菌株，名称为pET-813/BL21。将pET-813/BL21接种于LB培养基中，37℃培养8小时后，用IPTG分别在28℃和37℃进行诱导表达8小时，其中，IPTG终浓度为0.8mM。将诱导表达后的发酵液离心得到上清和菌体，没有离心的发酵液称为全菌发酵液。然后将表达产物经SDS-PAGE电泳后。同时以pET-22b(+)转化大肠杆菌BL21得到的转入pET-22b(+)的重组大肠杆菌pET-22b(+)/BL21作为空载体对照。

结果如图3所示，其中2、4、6、8均为pET-813/BL21经诱导后产物的图谱(2：37℃诱导8h后上清；4：28℃诱导8h后上清；6：28℃诱导8h后菌体；8：28℃诱导8h后全菌)；1是2的空载体对照；3是4的空载体对照；5是6的空载体对照；7是8的空载体对照；9为marker。

从图3可以看出：pET-813/BL21在不同温度下均诱导表达出了31Kda左右的蛋白。

AidH蛋白表达量为20mg/ml。其中AidH蛋白表达量的计算方法是考马斯亮蓝比对法。

蛋白活性检测：用Ni⁺柱和分子筛纯化28℃诱导后菌体中蛋白，结果如图4A所示，得到了纯化的31kDa左右的蛋白。然后用下述方法检测该纯化蛋白的体外降解信号活性，其中空载体对照为pET-22b(+)/BL21经同样方法诱导并纯化后的蛋白，结果如图4B所示(ck为标准信号分子C6HSL对照；p为空载体对照的蛋白活性检测图；pA为pET-813/BL21诱导表达纯化得到的蛋白活性检测图)，从图中可以看出，pET-813/BL21诱导表达纯化得到的蛋白具有降解信号分子的活性。

检测纯化蛋白的体外降解信号活性的方法：500μl体系，其中纯蛋白的含量为50μg，加入5μl标准信号分子C6HSL，信号分子的终浓度为100μM，37℃反应30min。用等体积的乙酸乙酯萃取3次，真空抽干，用50μl甲醇溶解，用HPLC检测信号分子浓度的变化，条件为：色谱柱：Agilent TC-C184.6×250mm，5μm；检测器：紫外210nm；流动相：甲醇/水(40∶60)；流速：0.25ml/min；柱温：23℃；进样量：5μL。

实施例2.AidH基因的降解机制解析

纯化的AidH蛋白与信号分子(C6HSL、N-hexanoyl-L-homoserine lacone)混合，37℃培养30min，用乙酸乙酯萃取，并用旋转蒸发仪真空抽干。用甲醇溶解。溶解的混合物用高压液相色谱(HPLC)分析，条件为：色谱柱：Agilent TC-C184.6×250mm，5μm；检测器：紫外210nm；流动相：甲醇/水(40∶60)；流速：0.25ml/min；柱温：23℃；进样量：5μL。

从图5A可以看出，与A中(即加C6HSL的不反应对照)相比，A下(加C6HSL反应)显示出蛋白与信号混合反应一段时间后，在22.1min处有一个新的峰，说明这个峰是产物峰，原信号分子C6HSL的保留时间是25.4min。分别收集22.1min和25.4min的溶液，用ESI-MS分析。25.4min的m/z(M+Na)为222.1；22.1min的m/z(M-H)为216.1(图5B)，与原信号的分子量(199)相比，增加了18，相当于一个水分子，说明AidH断开了信号分子的内酯键。即AidH是一个内酯酶。

序列表

<110>中国农业大学

<120>细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用

<130>CGGNARL92382

<160>1

<210>1

<211>828

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

gaccatatga caatcaatta tcacgaactt gaaaccagcc atggccgcat tgctgtgcgt 60

gaaagcgagg gcgagggcgc tccgctgctg atgatccatg gcaattcaag ttcgggtgcc 120

atttttgcgc cgcagctcga aggagaaatc ggcaagaagt ggcgtgtgat cgcgcctgat 180

cttccgggcc atggcaaatc aaccgatgcc atcgaccccg accgcagcta ttcgatggaa 240

ggctatgcgg acgcgatgac ggaagtcatg caacagctcg ggattgccga tgcggtggtt 300

ttcggctggt cgctcggcgg acatatcggc atcgagatga ttgcccgtta tcctgaaatg 360

cggggcctga tgatcactgg gacgccgcct gtcgcgcgcg aagaagtagg gcaggggttc 420

aagagcggtc ctgatatggc actcgccgga caggaaatct tttcggaacg cgatgtggaa 480

tcctacgctc gcagcacctg cggtgaacca ttcgaggcat cgcttctcga tatcgttgca 540

cgcaccgacg gacgcgcacg ccgcatcatg tttgaaaaat ttggctctgg caccggcggc 600

aaccagcgcg acatcgtagc ggaagcacaa ctccctatcg cggtcgtcaa tggccgtgac 660

gagccttttg ttgaactcga tttcgtgtcg aaagtgaaat tcggcaatct gtgggaaggt 720

aaaacccacg ttatcgacaa tgcaggtcat gcgccattcc gtgaagcacc cgcagaattt 780

gacgcctatc tcgcgcgctt tatccgcgat tgcacacaac tcgagctc 828

<210>2

<211>271

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>

<400>2

Met Thr Ile Asn Tyr His Glu Leu Glu Thr Ser His Gly Arg Ile Ala

1 5 10 15

Val Arg Glu Ser Glu Gly Glu Gly Ala Pro Leu Leu Met Ile His Gly

20 25 30

Asn Ser Ser Ser Gly Ala Ile Phe Ala Pro Gln Leu Glu Gly Glu Ile

35 40 45

Gly Lys Lys Trp Arg Val Ile Ala Pro Asp Leu Pro Gly His Gly Lys

50 55 60

Ser Thr Asp Ala Ile Asp Pro Asp Arg Ser Tyr Ser Met Glu Gly Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Ala Met Thr Glu Val Met Gln Gln Leu Gly Ile Ala Asp Ala

85 90 95

Val Val Phe Gly Trp Ser Leu Gly Gly His Ile Gly Ile Glu Met Ile

100 105 110

Ala Arg Tyr Pro Glu Met Arg Gly Leu Met Ile Thr Gly Thr Pro Pro

115 120 125

Val Ala Arg Glu Glu Val Gly Gln Gly Phe Lys Ser Gly Pro Asp Met

130 135 140

Ala Leu Ala Gly Gln Glu Ile Phe Ser Glu Arg Asp Val Glu Ser Tyr

145 150 155 160

Ala Arg Ser Thr Cys Gly Glu Pro Phe Glu Ala Ser Leu Leu Asp Ile

165 170 175

Val Ala Arg Thr Asp Gly Arg Ala Arg Arg Ile Met Phe Glu Lys Phe

180 185 190

Gly Ser Gly Thr Gly Gly Asn Gln Arg Asp Ile Val Ala Glu Ala Gln

195 200 205

Leu Pro Ile Ala Val Val Asn Gly Arg Asp Glu Pro Phe Val Glu Leu

210 215 220

Asp Phe Val Ser Lys Val Lys Phe Gly Asn Leu Trp Glu Gly Lys Thr

225 230 235 240

His Val Ile Asp Asn Ala Gly His Ala Pro Phe Arg Glu Ala Pro Ala

245 250 255

Glu Phe Asp Ala Tyr Leu Ala Arg Phe Ile Arg Asp Cys Thr Gln

260 265 270

Claims

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内酯酶活性的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)的核苷酸序列：

1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列；

3)与序列表中序列1所示的自5′末端第7-819位核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.一种表达权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求2或3所述基因通过表达载体pET-22b(+)导入大肠杆菌得到重组大肠杆菌，表达得到权利要求1所述蛋白。

6.权利要求1所述蛋白作为内酯酶的应用。

7.权利要求1所述蛋白在降解N-酰基-_L-高丝氨酸内酯中的应用。

8.权利要求2或3所述基因在培育抗病转基因植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗病转基因植物为抗细菌性病害转基因植物；所述细菌性病害是致病性与群体感应相关的细菌性病害。

10.权利要求1所述的蛋白或其编码基因在制备细菌性病害的治疗药物中的应用，所述细菌性病害是致病性与群体感应相关的人或动物或植物的细菌性病害。