CN102972220A - 一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病效果的简易方法，属于基因功能鉴定技术领域，包括原核表达重组蛋白液的制备、青枯菌液的制备、灌根接种、对照试验等步骤：含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌经过接种、培育、破碎、离心等过程处理后得到原核表达重组蛋白上清液；将青枯菌分离出白色致病菌落，培养后稀释成含菌量10⁸cfu·mL^-1的菌悬液；取上述原核表达重组蛋白液青枯菌液混合后，进行灌根接种；以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，无明显的感病症状，说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生；该检验方法简便，结果准确，实用性强，容易实施。

Description

一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法

技术领域

本发明涉及一种基因原核表达产物抗病效果的检验方法，具体涉及一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病效果的简易方法，属于基因功能鉴定技术领域。

背景技术

一般认为单细胞生物的细菌不存在信息交流的现象，多细胞生物间才有信息交流。Nealson 等在1970年首次报道了一种海洋费氏弧菌( Vibrio fischeri)菌体密度与生物发光呈正相关，该种菌的发光行为受细菌本身的群体感应调节系统所控制。1994年，Fuqua首先提出群体感应（quorum sensing，QS）的概念，其定义是指随着细菌个体密度的增大，细菌产生并向环境中释放一种特殊的类似信号分子的物质，当这种信号分子积累到一定量时，调控细菌产生统一的群体行为，如病菌基因的表达等，这种通过细菌信号分子调控自身群体行为的现象就称为细菌的群体感应。越来越多的研究发现，大多数细菌利用群体感应系统调控体内特定的功能。到目前为止的研究都表明，革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌都是通过信号分子调控群体某一特定功能的发挥，存在群体感应调控系统。

研究发现充当细菌信号分子的物质是一种有机化学分子，他是由细菌自身产生并能通过一定的途径进入到环境中。革兰氏阴性菌利用具有不同酰基侧链的高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone，AHL)作为信号分子。此外，脂肪酸衍生物如3-羟基棕榈酸甲酯(3-hydroxypalmitic acid methyl ester)以及一些顺式不饱和脂肪酸(cis-unsaturated fatty acids)也可作为信号分子。例如青枯菌(Ralstonia solanacearum) 除了产生AHL作为信号分子外，还可产生的3-羟基棕榈酸甲酯，来充当信号分子调控青枯菌的密度效应及增殖。革兰氏阳性菌利用一些寡肽类(Autoinducing peptide，简称AIP)作为信号分子感知种内自身种群数量，协调多种基因的表达。还有一类信号分子是一种呋喃硼酸二聚酯(自体诱导子-2，autoinducer-2，简称AI-2)，这种信号分子属于吲哚及其衍生物的高级结构物。此外，也有报导称对苯二酚和(S)-3-hydroxytridecan-4-one也是群体感应的信号分子。许多植物病原细菌通过群体感应信号分子AHL调控毒性基因的表达和毒性因子的产生。

病原细菌对宿主植物的侵袭主要包括以下3个阶段：一是病菌对植物的侵袭和定殖，其次病原菌致病因子的产生和作用于宿主，最后就是产生对宿主的免疫抵抗。已有研究发现致病菌一旦失去了产生群体感应信号分子的能力，则致病性也随之失去，如果通过外加信号分子则又可恢复其致病性，从而说明信号分子是病菌的致病性关健。在动植物病原菌中表达异源的AHL内酯酶和AHL酰胺酶均能显著减轻致病菌的致病力，瓦解细胞密度依赖型细菌的侵染能力。许多能够合成AHL内酯酶的细菌如苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌等或携带外源AHL内酯酶基因的工程菌，与致病菌欧文氏胡萝卜软腐病菌混合接种马铃薯，发病程度远比单独接种病原菌的减弱。因此，以病原细菌QS系统及其信号分子为靶标，干扰和破坏病原细菌的群体感应系统，能有效地减弱或解除病原细菌的致病力。这种通过破坏AHL信号分子，以干扰细菌的群体感应的方法被称为群体猝灭（quorum quenching）。

根据植物对细菌QS系统的反应，培育产生AHL降解酶的转基因植物，进而猝灭病菌的群体感应，提高植物抗病性。实验研究已表明该方法可有效地减弱病原细菌的致病力，提高寄主植物的抗病性。Dong等从Bacillus 240B1菌株中克隆到了世界上第一个AHL内酯酶（acyl-homoserine lactonase，AHL-lactonase）基因aiiA，该基因的编码产物为一种可以水解AHL内酯键的酶，当植物中表达AHL内酯酶时，可水解信号分子AHL的内酯键，从而钝化AHL的活性，破坏病原细菌群体感应的信号传导系统，降低其致病能力。接着Lin 等又在雷尔氏属细菌也发现了存在这种类似基因，该基因编码产物为酰基转移酶，这种酶通过水解AHL酰胺键后钝化AHL信号分子的活性。Park等从链霉菌中成功克隆了能产生降解AHL酶的基因ahlM，当AhlM蛋白与铜绿假单胞菌共培养时，能够显著抑制铜绿假单胞菌毒性因子的产生。Chen等从青枯菌GMI1000菌株中成功克隆了一个酰基转移酶基因，并对其功能的研究表明，基因原核表达产物能显著降低混合接种菌株的致病力。邱健等发现AiiA蛋白可以显著降低胡萝卜软腐病菌胞外蛋白的产量，也能够降解8种AHL信号分子。张霞等将aiiA基因转入到一种荧光假单胞菌P303中，构建一种工程菌，该工程菌还对马铃薯软腐病和大白菜软腐病都有一定的抑制作用。张争等用PCR扩增获得青枯菌GMI1000菌株的aac 基因，构建原核表达载体后，经在大肠杆菌中表达得到AAC 融合蛋白，将AAC 融合蛋白与胡萝卜软腐欧氏杆菌混合后，接种于马铃薯块茎，结果发现AAC 融合蛋白能显著降低病菌的致病力。

综上所述，关于病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病功能的检测，未见直接与致病的青枯菌混合接种植株来检量其抗病效果的报导。本发明操作简便，结果准确，实用性强。

发明内容

本发明的目前是提供一种病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病功能的简易检测方法，以筛选有效的病原菌群体猝灭基因，应用于抗病转基因育种研究。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病效果的简易方法，包括以下步骤：

1、取50 μL含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌接种至到5 mL含100 μg·mL^-1 Amp的LB培养液中，160 rpm转速摇菌12 h，然后再取5 μL菌液接种到含100 μg·mL^-1 Amp 5 mL LB培养液中，200rpm转速摇至菌液OD600为0.6~1.0时，加入终浓度为0.4 mmol·L^-1的IPTG，诱导培养9 h，室温下8,000 rpm离心5 min，将离心管中沉淀菌体重悬于预冷的PBS溶液（150 mmol NaCl，16 mmol Na₂HPO₄，4 mmol NaH₂PO₄，pH 7.3）中，用超声破碎法破碎菌体4 min，12,000 rpm离心10 min，取上清液备用；

2、将青枯菌画线于含放线菌酮1g·L^-1，新霉素2 g·L^-1的TTC 培养基，分离出红色和白色菌落，挑白色致病性青枯菌单菌落于Tm培养基中培养，再将培养液稀释成含菌量10⁸ cfu·mL^-1的菌悬液备用；

3、将漂洗干净的组培苗置于高锰酸钾溶液中浸泡30秒，取出后，用无菌水漂洗；分别取上述步骤1中的原核表达重组蛋白液与上述步骤2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖头镊子伤根处理1月苗龄桉树苗后，在离植株茎基部3-5cm处土壤中注射上述混合液4mL进行灌根接种，24 h后观察植株病症情况；

4、以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，对照植株接种青枯菌24 h后，表现出缺水迹象，植株萎蔫、叶片下垂，浇水不能减轻缺水症状，而混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，无明显的感病症状，说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生。

由于采用了上述的方法，本发明具有下述的有益效果：本发明所采用的方法操作简便，结果准确，实用性强，容易实施。

具体实施方式

实施例1

一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法，具体包括以下步骤：

1、取50 μL含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌接种至到5 mL含100 μg·mL^-1 Amp的LB培养液中，160 rpm转速摇菌12 h。然后再取5 μL菌液接种到含100 μg·mL^-1 Amp 5 mL LB培养液中，200rpm转速摇至菌液OD600为0.6~1.0时，加入终浓度为0.4 mmol·L^-1的IPTG，诱导培养9 h，室温下8,000 rpm离心5 min。将离心管中沉淀菌体重悬于预冷的PBS溶液（150 mmol NaCl，16 mmol Na₂HPO₄，4 mmol NaH₂PO₄，pH 7.3）中，用超声破碎法破碎菌体4 min，12,000 rpm离心10 min，用上清液备用；

2、将青枯菌画线于含放线菌酮1g·L^-1，新霉素2 g·L^-1的TTC 培养基，分离出红色和白色菌落。挑白色致病性青枯菌单菌落于Tm培养基中培养，再将培养液稀释成含菌量10⁸ cfu·mL^-1的菌悬液备用；

3、将漂洗干净的组培苗置于高锰酸钾溶液中浸泡30秒，取出后，用无菌水漂洗；分别取上述步骤1中的原核表达重组蛋白液与上述步骤2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖头镊子伤根处理1月苗龄桉树苗后，在离植株茎基部3-5cm处土壤中注射上述混合液4mL进行灌根接种，24 h后观察植株病症情况；

4、以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，对照植株接种青枯菌24h后，表现出轻微的缺水迹象，顶端叶片萎蔫、叶片下垂，浇水不能减轻缺水症状。而混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，无异常症状出现，说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生。

实施例2

一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法，具体包括以下步骤：

1、取50 μL含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌接种至到5 mL含100 μg·mL^-1 Amp的LB培养液中，160 rpm转速摇菌12 h。然后再取5 μL菌液接种到含100 μg·mL^-1 Amp 5 mL LB培养液中，200rpm转速摇至菌液OD600为0.6~1.0时，加入终浓度为0.4 mmol·L^-1的IPTG，诱导培养9 h，室温下8,000 rpm离心5 min。将离心管中沉淀菌体重悬于预冷的PBS溶液（150 mmol NaCl，16 mmol Na₂HPO₄，4 mmol NaH₂PO₄，pH 7.3）中，用超声破碎法破碎菌体4 min，12,000 rpm离心10 min，用上清液备用；

2、将青枯菌画线于含放线菌酮1g·L^-1，新霉素2 g·L^-1的TTC 培养基，分离出红色和白色菌落，挑白色致病性青枯菌单菌落于Tm培养基中培养，再将培养液稀释成含菌量10⁸ cfu·mL^-1的菌悬液备用；

3、将漂洗干净的组培苗置于高锰酸钾溶液中浸泡30秒，取出后，用无菌水漂洗；分别取上述步骤1中的原核表达重组蛋白液与上述步骤2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖头镊子伤根处理1月苗龄桉树苗后，在离植株茎基部3-5cm处土壤中注射上述混合液4mL进行灌根接种，72 h后观察植株病症情况；

4、以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，对照植株接种青枯菌72 h后，表现出缺水迹象，植株萎蔫、枝条下垂，幼叶卷曲，浇水不能减轻缺水症状。而混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，无明显的感病症状，说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生。

实施例3

一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法，具体包括以下步骤：

1、取50 μL含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌接种至到5 mL含100 μg·mL^-1 Amp的LB培养液中，160 rpm转速摇菌12 h。然后再取5 μL菌液接种到含100 μg·mL^-1 Amp 5 mL LB培养液中，200rpm转速摇至菌液OD600为0.6~1.0时，加入终浓度为0.4 mmol·L^-1的IPTG，诱导培养9 h，室温下8,000 rpm离心5 min。将离心管中沉淀菌体重悬于预冷的PBS溶液（150 mmol NaCl，16 mmol Na₂HPO₄，4 mmol NaH₂PO₄，pH 7.3）中，用超声破碎法破碎菌体4 min，12,000 rpm离心10 min，用上清液备用；

2、将青枯菌画线于含放线菌酮1g·L^-1，新霉素2 g·L^-1的TTC 培养基，分离出红色和白色菌落。挑白色致病性青枯菌单菌落于Tm培养基中培养，再将培养液稀释成含菌量10⁸ cfu·mL^-1的菌悬液备用；

3、将漂洗干净的组培苗置于高锰酸钾溶液中浸泡30秒，取出后，用无菌水漂洗；分别取上述步骤1中的原核表达重组蛋白液与上述步骤2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖头镊子伤根处理1月苗龄桉树苗后，在离植株茎基部3-5cm处土壤中注射上述混合液4mL进行灌根接种，7天后观察植株病症情况；

4、以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，对照植株接种青枯菌7天后，大部分幼叶枯黄，整个植株萎蔫。而混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，仅有顶端幼叶表现轻微失水症状；说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生。

总之，本发明虽然例举了上述优选实施方式，但是应该说明，虽然本领域的技术人员可以进行各种变化和改型，除非这样的变化和改型偏离了本发明的范围，否则都应该包括在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）原核表达重组蛋白液的制备：取50 μL含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌接种至到5 mL含100 μg·mL^-1 Amp的LB培养液中，160 rpm转速摇菌12 h；然后再取5 μL菌液接种到含100 μg·mL^-1 Amp 5 mL LB培养液中，200rpm转速摇至菌液OD600为0.6~1.0时，加入终浓度为0.4 mmol·L^-1的IPTG，诱导培养9 h，室温下8,000 rpm离心5 min；将离心管中沉淀菌体重悬于预冷的PBS溶液中，用超声破碎法破碎菌体4 min，12,000 rpm离心10 min，取上清液备用；

（2）青枯菌液的制备：将青枯菌画线于含放线菌酮1g·L^-1，新霉素2 g·L^-1的TTC 培养基，分离出红色和白色菌落；挑白色致病性青枯菌单菌落于Tm培养基中培养，再将培养液稀释成含菌量10⁸ cfu·mL^-1的菌悬液备用；

（3）灌根接种：分别取上述步骤1中的原核表达重组蛋白液与上述步骤2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖头镊子伤根处理1月苗龄桉树苗后，在离植株茎基部3-5cm处土壤中注射上述混合液4mL进行灌根接种，24 h后观察植株病症情况；

（4）对照试验：以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，对照植株接种青枯菌24 h后，表现出缺水迹象，植株萎蔫、叶片下垂，浇水不能减轻缺水症状；而混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，无明显的感病症状，说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生。

2.根据权利要求1所述的一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法，其特征在于：所述的PBS溶液中NaCl含量为 150 mmol，Na₂HPO₄的含量为16 mmol，NaH₂PO₄的含量为4 mmol。

3.根据权利要求1所述的一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法，其特征在于：所述的PBS溶液的pH值为7.3。