CN107794271A

CN107794271A - 一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN107794271A
Application number: CN201711069144.2A
Authority: CN
Inventors: 何健; 李娜; 姚利; 丁德荣; 陶青
Original assignee: Nanjing Agricultural University; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Agricultural University; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2037-11-03
Also published as: CN107794271B

Abstract

本发明属于应用环境微生物和农业领域，公开了一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用。一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长1053bp，编码350个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。龙胆酸双加氧酶基因是首个公开能降解麦草畏中间代谢产物3‑氯龙胆酸的基因，它编码的蛋白能将龙胆酸和3‑氯龙胆酸开环降解。本发明提供的龙胆酸双加氧酶能在30min内降解100mg/l的龙胆酸和3‑氯龙胆酸。因此，龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建降解麦草畏转基因作物中应用潜能巨大，龙胆酸双加氧酶蛋白DsmD在降解麦草畏以及苯环类物质中应用前景很好。

Description

一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于环境微生物和农业领域，涉及一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用,具体涉及参与麦草畏微生物降解过程中的一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因的应用。

背景技术

化学农药是保障现代农业生产力的重要手段，合理使用农药可以有效的防治作物病害，提高作物产量，但是一旦农药使用不当会造成土壤、水体等环境药害。除草剂的使用能有效减轻农业劳动强度，提高作物产量，但是随着除草剂的大量使用，其残留对土壤造成的危害越来越严重。微生物修复技术是一种原位生物修复技术，效果好，费用低，无二次污染，适合大面积面源污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。抗除草剂转基因是解决除草剂药害的有效途径，而抗除草机的基因一般均来自微生物降解基因。

麦草畏(dicamba)属安息香酸系除草剂，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果。麦草畏用于苗后喷雾，药剂能很快被杂草的叶、茎、根吸收，通过韧皮部向上、下传导，多集中在分生组织及代谢活动旺盛的部位，阻碍植物激素的正常活动，从而使其死亡，能防除200多种杂草，广泛应用于玉米、高粱和小麦等农田杂草防治，目前全球使用量达1.5万吨。同时麦草畏因广谱、高效、低毒和杂草抗性产生慢等优点，被认为是理想的抗除草剂转基因靶标除草剂。麦草畏在土壤中稳定，一般能保持40天以上。麦草畏在环境中的降解的主力军是微生物，目前已筛选到多种麦草畏的降解菌株，克隆到多个麦草畏降解基因，关于麦草畏的微生物降解目前基本上第一步都是脱甲基生成无除草活性的3,6-二氯水杨酸3,6-DCSA，克隆到的基因和研究的酶均为麦草畏脱甲基酶。美国孟山都公司利用来自细菌的麦草畏脱甲基酶基因(dmo)(专利US7105724B2)成功构建抗麦草畏和草甘膦复合性状的转基因大豆和抗麦草畏、草甘膦和草铵膦的棉花，已经进入商品化阶段。可以预见，随着抗麦草畏转基因作物的商业化推广，麦草畏的使用量会大幅度提高。但是，到目前为止，微生物降解麦草畏微生物降解的第一步脱甲基产物3,6-DCSA的代谢途径及其分子机制还不清楚，这严重制约了对麦草畏的环境行为和生态安全方面的研究。因此有必要深入研究麦草畏的迁移、转化和降解等环境行为及生态安全性。

获得麦草畏脱微生物代谢过程中降解基因和酶在治理农药残留中主要具有以下作用，(一)通过现代微生物发酵技术将酶制剂实现土壤原位修复。(二)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，综上所述，开展麦草畏降解过程中的降解基因、酶的研究具有非常重要的理论和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有麦草畏降解途径的研究的缺乏，提供一个龙胆酸双加氧酶基因，该基因参与麦草畏下游降解路径，同时能降解龙胆酸，龙胆酸是苯环类物质降解的主要开环产物之一，龙胆酸双加氧酶基因的应用具有重要的价值。

本发明的又一目的是提供该龙胆酸双加氧酶基因编码的蛋白DsmD的应用。

一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD编码的双加氧酶蛋白DsmD，其氨基酸序列为SEQID NO.2。

含有所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选是将所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD插入pET-24b(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。

含有所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的基因工程菌。

所述的基因工程菌的表达菌株优选大肠杆菌BL21(DE3)。

所述龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建麦草畏下游降解产物3-氯龙胆酸及龙胆酸转基因作物中的应用。

所述龙胆酸双加氧酶基因dsmD在降解龙胆酸及3-二氯龙胆酸中的应用。

所述龙胆酸双加氧酶DsmD在降解龙胆酸及3-二氯龙胆酸中的应用。

所述龙胆酸双加氧酶DsmD在去除土壤、水体中麦草畏中间产物3-氯龙胆酸和龙胆酸中的应用。

有益效果：

本发明提供的龙胆酸双加氧酶能在30min内降解100mg/l的龙胆酸和3-氯龙胆酸。因此，龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建降解麦草畏转基因作物中应用潜能巨大，龙胆酸双加氧酶蛋白DsmD在降解麦草畏以及苯环类物质中应用前景很好。

附图说明：

表1麦草畏高效降解菌Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20的底物谱

图1麦草畏脱甲基产物3,6-二氯水杨酸(3,6-DCSA)代谢途径的推测

图2龙胆酸双加氧酶DsmD SDS-PAGE

图3龙胆酸双加氧酶DsmD降解龙胆酸的紫外扫描图

图4：龙胆酸双加氧酶DsmD降解3-氯龙胆酸的紫外扫描图

图5：龙胆酸双加氧酶DsmD降解3,6-二氯龙胆酸的紫外扫描图

图6：龙胆酸双加氧酶DsmD降解3,6-二氯龙胆酸的HPLC

以上实施例中使用的微生物来源如下：大肠杆菌DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌高表达载体pET-24b(+)购自Novegen公司，表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。

生物材料保藏信息

Ndbn-20，分类命名为Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏日期为2014年11月5日，保藏编号为CCTCCNO:M2014550。

具体实施方式

实施例1.龙胆酸双加氧酶基因dsmD的克隆

1.1龙胆酸双加氧酶基因的查找

1.1.1麦草畏高效降解菌Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20的底物谱实验

本实验的研究材料为由本实验室成员分离得到的麦草畏高效降解菌Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20，该菌株保存于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2014550，保藏日期为2014年11月5日。Ndbn-20的底物谱实验是在无机盐培养基中，加入适当浓度的3,6-DCSA类似物，定时取样采用紫外扫描的方法检测降解情况，降解情况如表1。经过底物谱实验发现Ndbn-20能够降解龙胆酸，而不能降解邻苯二酚，因此推测3,6-DCSA降解反应的开环底物可能是龙胆酸或者龙胆酸的类似物3,6-二氯龙胆酸。

表1麦草畏高效降解菌Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20的底物谱

1.1.2查阅文献对麦草畏降解下游途径进行推测

通过查阅麦草畏及3,6-DCSA降解相关文献，在1998年，JO¨RN WERWATH研究发现在麦草畏降解菌株Sphingomonas sp.RW5中克隆到的龙胆酸双加氧酶基因gtdA(1053bp)经过诱导表达得到的龙胆酸双加氧酶，不仅能够降解龙胆酸(Km＝15mM)，而且能少量降解3,6-二氯龙胆酸(Km＝754mM)。而且Cork and Krueger在麦草畏降解菌株Stenotrophomonasmaltophilia DI-6中，采用TLC和HPLC的方法，初步推测3,6-DCSA第一步的代谢产物可能为3,6-二氯龙胆酸，然后在龙胆酸双加氧酶的作用下进行开环降解。因此我们推测3,6-DCSA降解的最有可能的降解途径是经由3,6-二氯龙胆酸进行开环降解,预测的3,6-DCSA降解途径如图1。

1.1.3通过比对野生株和突变株的基因组查找龙胆酸双加氧酶基因

实施例1.3,6-DCSA羟基化酶基因的克隆

1.1突变菌株的筛选

本实验的研究材料为由本实验室成员分离得到的麦草畏高效降解菌Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20(CCTCC NO:M 2014550)。通过在没有添加3,6-DCSA的新鲜1/5LB平板上传代培养，采用菌泥进行传代划线，传了大约25代，将平板上的菌洗下，经过一定的稀释涂布在1/5LB(1/5LB为最适Ndbn-20生长的培养基)上，然后将长出的菌落分别采用灭菌的牙签点在1/5LB和添加了1Mm 3,6-DCSA为唯一碳源的MSM培养基上，将能够在1/5LB上生长而不能在MSM培养基上生长的菌株挑选出来，对其降解3,6-DCSA能力进行验证，通过3,6-DCSA的降解实验，得到了一株能将麦草畏降解为3,6-DCSA，但是不能降解3,6-DCSA的突变菌株，紫外图谱见图2。将筛选得到的失去降解3,6-DCSA功能的突变株命名为Ndbn-20m。

基础盐培养基(MSM)配方：1.5g K₂HPO₄·3H₂O；0.5g KH₂PO₄；1.0g NH₄NO₃；0.5gNaCl；0.2g MgSO₄·7H₂O，加去离子水定容至1L，固体培养基中每升加入15.0g琼脂。

测定野生菌株和该突变株的基因组，通过比对基因组发现，在Ndbn-20m缺失的大片段中有一个ORF，长度为1053bp，NCBI比对注释结果为gentisate 1,2-dioxygenase，与Sphingomonas sp.RW5中龙胆酸双加氧酶基因gtdA(1053bp)基因在DNA和氨基酸水平的同源性均为51％，将此龙胆酸双加氧酶基因命名为dsmD。基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2.

实施例2龙胆酸双加氧酶基因在BL21(pET-24b(+))中的高效表达

2.1龙胆酸双加氧酶基因的PCR扩增

以正向引物：5’-CGGGAATTCCATATGACTGCTACGTCGATCAAACAC-3’(SEQ ID NO.3)和反向引物：5’-CCGCTCGAGCGCGCTACGCCAAAGGCCCAG-3’(SEQ ID NO.4)为引物，用PCR从Ndbn-20基因组DNA中扩增出龙胆酸双加氧酶基因片段。

扩增体系：

PCR扩增程序：

a.98℃变性3min；

b.98℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.0min，进行30个循环；

c.72℃延伸10min，冷却到室温。

2.2PCR产物和质粒的双酶切、产物纯化和酶连

PCR产物使用凝胶纯化回收试剂盒，具体方法参考试剂盒说明书。纯化后的PCR产物与质粒分别用相应的酶进行酶切，以序列两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点，酶切体系如下：

10×M Buffer 5μL

Nde I(10U·μL^-1)2.0μL

Xho I(10U·μL^-1)2.0μL DNA(纯化后的PCR或质粒)30μL

ddH₂O 11μL

37℃酶切30min，0.75％的琼脂糖核酸电泳检测酶切效果。然后使用凝胶纯化回收试剂盒纯化回收相应的DNA片段，然后用T4连接酶与同样双酶切的表达载体pET-24b(+)进行酶连，酶连体系如下：

10×T4ligase buffer 1.0μL

DNA(PCR双酶切)4.0μL

pBBR1MCS-2 2.0μL

T4ligase 0.5μL

ddH₂O 2.5μL

16℃温浴12h。

2.3酶连产物转化和阳性转化子的筛选

从-70℃取一管E.coli BL21(DE3)感受态细胞(100μL)，握在掌心融化后，加入10μL的酶连产物(体积不超过感受态细胞的10％)，轻轻转动管体混匀，静置于冰上30min。轻轻将离心管放入42℃水浴锅热激60-90s，然后将离心管重新置于冰上，10min。加入500-800μLLB培养基，将离心管放到37℃摇床，150rpm，45-60min复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因。离心管5,000rpm，2min，弃部分上清，留约200μL，用枪吹打将菌体混匀，吸取100μL混合液均匀涂布到含有卡那霉素100mg/L的LB平板上，37℃过夜培养，挑取长出的单菌落，测序验证目的基因连接到载体上而且末端连有6个His-tag，将此转化子保存。

2.4 DsmD的表达、纯化和功能验证

BL21(DsmD)在LB培养基中，37℃，150rpm摇床培养至OD 600nm为0.4到0.6之间，然后加IPTG至浓度0.05mM，16C诱导培养8个小时。100ml菌液离心收集菌体，采用PBS(50mM,pH7.0)将菌体洗两遍，用10ml的PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science,UH-650Bultrasonic processor,30％intensity)5-10分钟，12000rpm离心40min，收集上清，用镍离子亲和层析柱对DsmD进行纯化，纯化后的酶进行蛋白质电泳，见图2。

2.5 DsmD活力测定

酶活反应体系(1ml)：加有PBS(50mM,pH 7.0)，0.1mM龙胆酸，3-氯龙胆酸，3,6-二氯龙胆酸，反应酶量(2.4中纯化所得)10μl，30℃反应。每个反应以加入酶开始计时，通过紫外扫描进行定时检测。龙胆酸的紫外吸收峰最高是320nm，经过龙胆酸开环降解后为顺丁烯二酸单酰丙酮酸，此物质的紫外吸收峰为330nm，因此通过紫外扫描(200nm-400nm)可以看到紫外峰会发生偏移，降解情况见图3。而在降解3-氯龙胆酸的试验中我们也采用紫外扫描的方法，可以看到随着加入龙胆酸双加氧酶DsmD进行反应后，3-氯龙胆酸的紫外峰型也发生了偏移，见图4。在降解3,6-二氯龙胆酸的试验中，3,6-二氯龙胆酸的紫外峰一直未发生变化，见图5。将酶反应足够长的时间，采用HCl酸化，然后用乙酸乙酯萃取，取上层有机相，采用无水硫酸钠吸干水分，再采用氮气将溶剂乙酸乙酯吹干，用甲醇溶解，采用的滤膜对样品进行过滤，进行HPLC检测发现3,6-二氯龙胆酸的峰没有下降，见图6。酶降解试验表明纯化后的龙胆酸双加氧酶DsmD能快速降解龙胆酸和3-氯龙胆酸，但是不能降解3,6-二氯龙胆酸。这与已报道的Sphingomonas sp.RW5中的的龙胆酸双加氧酶GtdA的功能不一样，GtdA能够降解龙胆酸和3,6-二氯龙胆酸，而龙胆酸双加氧酶DsmD则不能降解3,6-二氯龙胆酸。

序列表

<110> 南京农业大学

北京大北农生物技术有限公司

<120> 一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> Ndbn-20(Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20)

<400> 1

atgactgcta cgtcgatcaa acacgccccg tctgacgttg aggaagtgcg gcaggcgttc 60

tacaaagata tcgccaggga cgaccttgcg gcgctctgga acgtcatggg taatttcgta 120

aagccggagc ctgatgggcc ggcgaaacca gccctttgga attactccgt ggtgcgtgag 180

cacctgcgga ctgcgggcga gcttatcacg gcagaggaag cggagcgtcg cgtccttatc 240

ctccaaaatc cgggccttcc gggatcatcg cttatcacgc gcagtctctt cgcagcactt 300

cagctcgtcc ggcccgggga gatagctccg tgtcaccgtc atagccaaaa cgcactgcgt 360

ctcatcatcg agggaggggg cgcgttcacc gctgtcaacg gcgagaaggt ttatatggag 420

ccgtttgatc tgatcctgac cccggcgatg cactggcacg atcatggcaa tactaccgaa 480

caggacgtgg tctggctcga tggcctcgat ctcggtattg ttcagctttt cgaggcgagc 540

ttcgccaatc atttcgacgg gaaagtccat ccggagactc gtccggccgg cgatggcttc 600

gtgcgttttg gcaatcacgc gcgtccgttg acgggaattt cggactacga caccacccgc 660

tacggcctct atcattatcc ctataagcag tggtgtgcga cactcgaaca gatgcgcagt 720

gacgcaccgg acccgcgcca tgctcacatg attgaattta ctaaccctac cgatggtggg 780

ccggttctcg acaccatctc ctgcttcgcg caactggtgc cgggcgggat gtcaacaaag 840

tcagcgcgct cttccgacgg tatggtcggc accgtggtct ctggcagtgg ggcggcgatt 900

atcagtggcg aacgcttcaa acttaccgag aaggacatgt tcattgtgcc atcctggatg 960

cctcttgaac taaaggccga agcagatctg actatattct ggttttcgga ccgggcagct 1020

cagaagaaac tgggcctttg gcgtagcgcg tga 1053

<210> 2

<211> 3

<212> DNA

<213> Ndbn-20(Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20)

<400> 2

<210> 3

<211> 350

<212> PRT

<213> Ndbn-20(Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20)

<400> 3

Met Thr Ala Thr Ser Ile Lys His Ala Pro Ser Asp Val Glu Glu Val

1 5 10 15

Arg Gln Ala Phe Tyr Lys Asp Ile Ala Arg Asp Asp Leu Ala Ala Leu

20 25 30

Trp Asn Val Met Gly Asn Phe Val Lys Pro Glu Pro Asp Gly Pro Ala

35 40 45

Lys Pro Ala Leu Trp Asn Tyr Ser Val Val Arg Glu His Leu Arg Thr

50 55 60

Ala Gly Glu Leu Ile Thr Ala Glu Glu Ala Glu Arg Arg Val Leu Ile

65 70 75 80

Leu Gln Asn Pro Gly Leu Pro Gly Ser Ser Leu Ile Thr Arg Ser Leu

85 90 95

Phe Ala Ala Leu Gln Leu Val Arg Pro Gly Glu Ile Ala Pro Cys His

100 105 110

Arg His Ser Gln Asn Ala Leu Arg Leu Ile Ile Glu Gly Gly Gly Ala

115 120 125

Phe Thr Ala Val Asn Gly Glu Lys Val Tyr Met Glu Pro Phe Asp Leu

130 135 140

Ile Leu Thr Pro Ala Met His Trp His Asp His Gly Asn Thr Thr Glu

145 150 155 160

Gln Asp Val Val Trp Leu Asp Gly Leu Asp Leu Gly Ile Val Gln Leu

165 170 175

Phe Glu Ala Ser Phe Ala Asn His Phe Asp Gly Lys Val His Pro Glu

180 185 190

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Phe Val Arg Phe Gly Asn His Ala Arg

195 200 205

Pro Leu Thr Gly Ile Ser Asp Tyr Asp Thr Thr Arg Tyr Gly Leu Tyr

210 215 220

His Tyr Pro Tyr Lys Gln Trp Cys Ala Thr Leu Glu Gln Met Arg Ser

225 230 235 240

Asp Ala Pro Asp Pro Arg His Ala His Met Ile Glu Phe Thr Asn Pro

245 250 255

Thr Asp Gly Gly Pro Val Leu Asp Thr Ile Ser Cys Phe Ala Gln Leu

260 265 270

Val Pro Gly Gly Met Ser Thr Lys Ser Ala Arg Ser Ser Asp Gly Met

275 280 285

Val Gly Thr Val Val Ser Gly Ser Gly Ala Ala Ile Ile Ser Gly Glu

290 295 300

Arg Phe Lys Leu Thr Glu Lys Asp Met Phe Ile Val Pro Ser Trp Met

305 310 315 320

Pro Leu Glu Leu Lys Ala Glu Ala Asp Leu Thr Ile Phe Trp Phe Ser

325 330 335

Asp Arg Ala Ala Gln Lys Lys Leu Gly Leu Trp Arg Ser Ala

340 345 350

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggaattcc atatgactgc tacgtcgatc aaacac 36

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagc gcgctacgcc aaaggcccag 30

Claims

1.一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD编码的角度双加氧酶蛋白DsmD，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.含有权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于是将权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD插入pET-24b(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。

5.含有权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1所述龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建麦草畏下游降解产物龙胆酸及3-二氯龙胆酸转基因作物中的应用。

8.权利要求1所述龙胆酸双加氧酶基因dsmD在降解龙胆酸及3-二氯龙胆酸中的应用。

9.权利要求2所述龙胆酸双加氧酶DsmD在降解龙胆酸及3-二氯龙胆酸中的应用。

10.权利要求2所述龙胆酸双加氧酶DsmD在去除土壤、水体中二苯醚和2-苯氧基苯甲酸中的应用。