CN109971773A

CN109971773A - 一种编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI及其应用

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Publication number: CN109971773A
Application number: CN201910250897.6A
Authority: CN
Inventors: 李娜; 张�浩; 彭乾; 韦宇平
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Nanyang Normal University
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109971773B

Abstract

本发明属于环境微生物和农业领域，具体涉及一种编码可降解3‑氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI及其应用。基因dsmI参与除草剂麦草畏微生物降解中间产物3‑氯龙胆酸的降解。通过在大肠杆E.coli BL21(DE3)高效表达并纯化得到的蛋白DsmI能将龙胆酸和3‑氯龙胆酸快速降解。因此，龙胆酸双加氧酶基因dsmI在构建降解麦草畏转基因作物中应用潜能巨大，龙胆酸双加氧酶DsmI在降解麦草畏以及苯环类物质中有很好的应用前景。

Description

一种编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因 dsmI及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物和农业领域，具体涉及一种编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI及其应用。

背景技术

农药在现代农业生产中发挥重大的作用，但是农药的不科学、不合理使用导致水体、土壤和大气中农药残留超标，严重危害自然环境和人体健康。除草剂在提高劳动生产率的同时也带来了严重药害。据统计，我国每年除草剂药害土壤面积达3000万亩，其中严重受害500万亩以上，据测算，除草剂药害对农作物产量造成的损失可达总产的10％左右，造成巨大的农业损失。除草剂药害已成为一个迫切需要解决的问题。农药残留微生物降解技术是一种新型原位生物修复技术，主要用于农药面源污染、历史残留农药清源和除草剂药害的修复。其技术核心是从农药高效降解菌株中克隆鉴定关键降解基因，研究关键降解酶特性，从而制备菌剂、酶制剂用于修复污染土壤，或者利用降解基因研发转基因作物。

麦草畏(dicamba)属于苯甲酸类激素型除草剂，用于苗后喷雾，其除草机制为阻碍植物激素的正常活动从而导致杂草死亡。主要用于小麦、玉米、谷子和水稻等禾本科作物农田杂草防除，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果。麦草畏因广谱、高效、低毒、低成本和杂草抗性产生慢等优点，被认为是理想的抗除草剂转基因靶标除草剂。美国孟山都公司利用来自细菌的麦草畏脱甲基酶基因DMO(专利US7105724B2)成功构建抗麦草畏的转基因大豆和棉花，2015年已经进入商品化推广阶段，2017年在美国推广种植面积已经超过预期，随着转基因作物的推广和使用，麦草畏的年使用量将从1.5万吨急剧增加到6.0万吨以上。大量研究表明，麦草畏在环境消失的主要因素是微生物降解，目前国内外已筛选到多株麦草畏降解菌，已报道的麦草畏微生物降解的起始步骤均为脱甲基生成3,6-二氯水杨酸(3,6-DCSA)，但是目前关于3,6-DCSA及其下游代谢产物的降解过程和降解基因的研究相对较少。

目前，已公开的文献仍不能完全阐明麦草畏的降解路径，而且3,6-DCSA及其中间产物3,6-二氯龙胆酸、3-氯龙胆酸均为有毒难降解氯代芳香化合物，在土壤和农产品中累积对生态环境和人类健康具有潜在的危害。因此，需要进一步的研究，以便找到更好的完全去除麦草畏农药残留的方法。并且麦草畏是一种应用前景非常广阔的除草剂，因此有必要深入研究麦草畏在环境中的微生物降解机制，为评估麦草畏规模化应用后的环境行为和生态安全性提供理论依据。

获得麦草畏微生物代谢过程中降解基因和酶在治理农药残留中主要具有以下作用，(一)通过发酵制备成酶制剂实现农药污染土壤的原位修复。(二)采用转基因技术将降解基因导入作物构建相应的抗(耐)除草剂转基因作物。综上所述，开展麦草畏微生物降解机制的研究具有非常重要的理论和实际应用价值。

发明内容

本发明提供一种可降解3-氯龙胆酸的基因dsmI，可有效防止环境中3-氯龙胆酸的残留/污染。此外，3-氯龙胆酸为麦草畏的降解过程产物，基因dsmI的发现有助于阐明麦草畏的降解机理，进而有助于解决现有技术中残留麦草畏不能及时降解，污染环境的问题。

本发明的另一目的在于：提供一种可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI。

本发明的另一目的在于：提供一种含有基因dsmI的重组载体。

本发明的另一目的在于：提供一种含有基因dsmI的基因工程菌。

本发明的另一目的在于：提供一种表达龙胆酸双加氧酶DsmI的方法。

本发明的另一目的在于：提供了基因dsmI的用途。

本发明的目的还在于：提供一种用于降解包括3-氯龙胆酸在内的组合物。

本发明的编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI采用如下技术方案：一种编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶的基因dsmI，其特征在于，所述基因dsmI的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI，所述龙胆酸双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有权利要求1所述的基因dsmI的重组载体。

优选的，如上所述的重组载体，是将如上所述的基因dsmI插入pET-24b(+)的NdeI和Hind III位点之间所得。

优选的，所述重组载体的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

含有如上所述的基因dsmI的基因工程菌。

一种表达如上所述的龙胆酸双加氧酶DsmI的方法，包括下述步骤：(1)用权利要求3所述的重组表达载体转化适于其表达的菌株，获得重组表达基因工程菌；(2)将重组表达基因工程菌进行发酵，诱导所述龙胆酸双加氧酶的表达；以及(3)在发酵结束后，回收并纯化所表达的龙胆酸双加氧酶。

如上所述的基因dsmI在构建麦草畏下游降解产物3-氯龙胆酸转基因作物中的应用。

用于降解包括3-氯龙胆酸在内的底物的组合物，所述组合物包括如上所述的基因工程菌和/或龙胆酸加氧酶DsmI。所述组合物还可包括赋形剂和用于降解环境(水/土壤)中的其他污染物的原料。所述组合物可为颗粒剂、粉剂、溶液或本领域其他常见形式的制剂。

优选的，所述组合物还包括抗氧化剂。抗氧化剂可起到防止3,6-二氯龙胆酸氧化的作用，所述抗氧化剂可为还原型谷胱甘肽。

本发明的有益效果是：本发明的基因dsmI编码的龙胆酸双加氧酶DsmI可用于降解3-氯龙胆酸，可有效防止环境中3-氯龙胆酸的残留。

本发明的龙胆酸双加氧酶DsmI在降解3-氯龙胆酸、龙胆酸等苯环类物质中有很好的应用前景。

本发明的基因dsmI可用于构建重组载体和基因工程菌，进而应用于去除环境中的降解3-氯龙胆酸。

本发明提供的表达龙胆酸双加氧酶DsmI的方法，可用于诱导表达龙胆酸双加氧酶DsmI，进而用于去除环境中的降解3-氯龙胆酸。

本发明的基因工程菌和龙胆酸双加氧酶DsmI还可与其他原料或赋形剂制备用于降解包括3-氯龙胆酸在内的底物的组合物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：龙胆酸双加氧酶DsmI的SDS-PAGE图谱，其中：泳道1的样品为实施例2制备的纯化前的龙胆酸双加氧酶DsmI，泳道2为纯化后的龙胆酸双加氧酶DsmI；

图2：3-氯龙胆酸的质谱(图2A)及核磁氢谱(图2B)检测结果

图3：龙胆酸双加氧酶DsmI降解龙胆酸(图3A)和3-氯龙胆酸的紫外扫描图(图3B)；

图4：龙胆酸双加氧酶DsmI降解3,6-DCGA(图4A)和6-氯龙胆酸的紫外扫描图(图4B)；

图5：紫外扫描监测3,6-DCGA在PBS缓冲液中的变化，其中图5A为体系中未加入任何抗氧化剂的情况下3,6-DCGA在PBS缓冲液中的变化；图5B位体系中加入GSH的情况下3,6-DCGA在PBS缓冲液中的变化；

图6：各种突变株降解3-氯龙胆酸的降解曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所使用的微生物来源具体如下：Ndbn-20分类命名为Rhizorhabdusdicambivorans Ndbn-20，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏日期为2014年11月20日，保藏编号为CCTCC M 2014550。Ndbn-20m为本人筛选到的一株丢失降解3,6-DCSA能力的突变株。

大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli HB101(pRK600)购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌高效表达载体pET-24b(+)购自Novegen公司，表达宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司，自杀型质粒pJQ200SK购买自淼灵生物资源保藏中心。

龙胆酸和还原型谷胱甘肽购买自摩贝化学品电商综合服务平台，3,6-二氯龙胆酸是采用3,6-DCSA在DsmABC催化下制备，6-氯龙胆酸是采用6-氯水杨酸在DsmABC的催化下制备，参考文献(Li et al.,2018,84(4):AEM.02133-17)，3-氯龙胆酸的制备方法详见实施例2。

实施例1.编码龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI的发现

1.1编码龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI的相关研究

1.1.1麦草畏高效降解菌Ndbn-20及其突变株Ndbn-20m的降解底物谱

本实验的研究材料为麦草畏高效降解菌Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20和3,6-DCSA降解能力丢失的突变菌株Ndbn-20m，检测野生株Ndbn-20和Ndbn-20m的底物谱，实验降解情况如表，经过底物谱实验发现Ndbn-20和Ndbn-20m均能够降解龙胆酸。突变株Ndbn-20m丢失了3,6-DCSA降解基因簇dsm，其中包括龙胆酸双加氧酶基因dsmD，但是Ndbn-20m仍然能降解龙胆酸，表示Ndbn-20m中还有龙胆酸双加氧酶基因。野生菌株Ndbn-20和突变菌株Ndbn-20m底物谱详见下表1。

表1野生菌株Ndbn-20和突变菌株Ndbn-20m底物谱(+：降解，-：不降解)

1.1.2基因组比对分析

通过查阅麦草畏及龙胆酸降解相关文献，将已报道的龙胆酸双加氧酶基因序列与Ndbn-20的基因组比对分析，经比对结果发现在突变株Ndbn-20m中有一个龙胆酸双加氧酶基因与专利文献CN107794271A中公开的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的核苷酸具有51％的同源性，与已报道的来自Sphingomonas sp.RW5中的龙胆酸双加氧酶基因gtdA(1053bp)核苷酸序列相同。将菌株Ndbn-20中此基因命名为dsmI，基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。已报道gtdA编码的龙胆酸双加氧酶GtdA不仅能够降解龙胆酸(K_m＝15μM)，而且能降解3,6-二氯龙胆酸(3,6-DCGA)(K_m＝754μM)。因此以前一直推测麦草畏脱甲基产物3,6-DCSA降解途径为：3,6-DCSA首先在5-羟基化酶的作用下生成3,6-二氯龙胆酸，然后在龙胆酸双加氧酶的作用下开环降解。

实施例2编码龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI在BL21(pET-24b(+))中的高效表达

2.1编码龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI的PCR扩增

采用正向引物：5’-GGAATTCCATATGCAGCCAGTATTGGCCAATGATCAGC-3’(SEQ IDNO.3)和反向引物：5’-CCCAAGCTTTAGATTTTCCTCTCGGAACAGCCC-3’(SEQ ID NO.4)。以Ndbn-20的DNA为模板扩增dsmI基因片段。

扩增体系：

PCR扩增程序：

a.98℃变性3min；

b.98℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.0min，进行30个循环；

c.72℃延伸10min，冷却到室温。

2.2PCR产物和质粒的双酶切、产物纯化和酶连

PCR扩增产物采用凝胶纯化回收试剂盒纯化。纯化后的PCR产物与表达载体pET-24b(+)分别采用Nde I和Hind III进行双酶切，酶切体系如下：

10×M Buffer 5μL

Nde I(10U·μL^-1)2.0μL

Hind III(10U·μL^-1)2.0μL

DNA(纯化后的PCR或质粒)30μL

ddH₂O 11μL

37℃温浴30min

采用0.75％的琼脂糖核酸电泳检测酶切效果。回收相应的DNA片段，然后用T4连接酶与同样双酶切的表达载体pET-24b(+)进行酶连，酶连体系如下：

10×T4ligase buffer 1.0μL

DNA(PCR双酶切)4.0μL

pET-24b(+)2.0μL

T4ligase 0.5μL

ddH₂O 2.5μL

16℃温浴12h。

2.3酶连产物转化和阳性转化子的筛选

从-70℃取E.coli BL21(DE3)感受态细胞(100μL)，握在掌心融化后，加入10μL的酶连产物，轻轻转动管体混匀，静置于冰上30min。轻轻将离心管放入42℃水浴锅热激60-90s，然后将离心管重新置于冰上10min。加入500-800μL LB培养基，将离心管放到37℃摇床，150rpm，复苏45-60min。5,000rpm，离心2min，弃部分上清，留约200μL，用枪吹打将菌体混匀，吸取100μL菌液均匀涂布到LB(卡那霉素100mg/L)平板上，37℃过夜培养，挑取长出的单菌落，提质粒测序验证目的基因是否连接到载体上而且末端连有6个His-tag，将此阳性转化子BL21(DsmI)保存。

2.4龙胆酸双加氧酶DsmI的表达、纯化和功能验证

1％的接种量接种BL21(DsmI)到LB中，摇床培养至OD_600nm为0.4～0.6，添加IPTG至终浓度为0.05mM，16℃低温诱导8h。12000rpm离心5min收集菌体，采用4℃的PBS缓冲液(50mM,pH 7.4)洗涤菌体，然后采用适量PBS重悬菌体，冰浴条件下超声波破碎5～10min，12000rpm离心40min，收集上清。采用钴离子亲和层析柱进行蛋白纯化，SDS-PAGE电泳检测纯化效果，结果见图1。

2.5 3-氯龙胆酸的制备

从菌株Ndbn-20中PCR扩增基因dsmH2，将该基因构建高效表达载体pET-24b-dsmH2，转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达和纯化得到酶DsmH2(具体步骤详见CN108441503A说明书[0040]-[0065]段)，该酶能够将3,6-DCGA6-脱氯生成3-氯龙胆酸。加足量的酶，并且酶反应时间足够长，尽可能使酶反应体系中的3,6-DCGA完全转化为脱氯产物。脱氯产物的纯化方法：在酶反应液中加入HCl调节pH至2.0左右，采用等体积的乙酸乙酯萃取2次，用过量的无水硫酸钠除去乙酸乙酯中残留的水分，采用氮气流吹干乙酸乙酯，最后用少量甲醇溶解，通过此方法制备足够量的脱氯产物。采用薄层层析色谱法(TLC)对溶液进行纯化除去残留的底物3,6-DCGA及其它杂质。TLC的展开剂选用的是体积比为10:6:1的乙酸乙酯、氯仿和甲酸的混合液。纯化产物采用液质及核磁氢谱分析，质谱及核磁检测结果如图2，经分析纯化产物为3-氯龙胆酸。

2.6龙胆酸双加氧酶DsmI酶活测定

酶活反应体系(1ml)：50mM PBS(pH 7.0)，1μg龙胆酸双加氧酶DsmI，1mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM底物(龙胆酸、3-氯龙胆酸、3,6-DCGA、6-氯龙胆酸)。酶反应以加入酶开始计时，采用紫外分光光度计每隔30s扫描一次，扫描范围为200～400nm。在酶反应过程中，龙胆酸和3-氯龙胆酸的紫外峰型均发生偏移，如图2所示，即龙胆酸双加氧酶DsmI能够降解龙胆酸(图3A)和3-氯龙胆酸(图3B)；而3,6-DCGA和6-氯龙胆酸的紫外峰型未发生任何变化(图4)，即DsmI不能降解3,6-DCGA(图4A)和6-氯龙胆酸(图4B)。

进一步将以龙胆酸和3-氯龙胆酸为底物的DsmI酶反应液分别于30℃水浴反应10min终止反应，酶反应样品经处理后使用HPLC检测底物的降解量。一个酶活力单位(U)定义为：在pH 7.4，30℃条件下1min内转化1μmol的底物所需要的酶的量，计算出DsmI降解龙胆酸和3-氯龙胆酸的比酶活分别为1.4±0.06U/mg和0.5±0.01U/mg。

这与1998年Werwath et al.发表在Journal of Bacteriology上的研究结果相矛盾，已报道Sphingomonas sp.RW5中的龙胆酸双加氧酶GtdA能够降解3,6-二氯龙胆酸。实验的过程中我们发现3,6-DCGA在水或者缓冲液中很容易被氧化，氧化后的3,6-DCGA的紫外检测峰型有明显的变化(图5A)，因此会影响酶活的检测，在Werwath et al.文章中并没有提到此情况，因此推测可能由于此原因导致实验结果出现错误，实际上GtdA不能催化3,6-DCGA的开环。通过实验发现加入GSH在30min以内3,6-DCGA的紫外峰型基本未发生变化(图5B)，因此在做龙胆酸双加氧酶降解3,6-DCGA的体外酶促反应时，需加入适量的GSH。

并且酶活实验表明龙胆酸双加氧酶DsmI能够降解3-氯龙胆酸，此功能为该酶新发现的功能，并且DsmI可能参与麦草畏中间代谢产物3-氯龙胆酸的降解。

实施例3编码龙胆酸双加氧酶龙胆酸双加氧酶的基因dsmI在菌株Ndbn-20中的生理功能的验证

3.1构建插入突变载体

采用正向引物(如SEQ ID NO.5所示)：

5’-CTTGATATCGAATTCCTGCAGGTCTGGAGGGATCGTCGGCCATAAC-3’；

反向引物(SEQ ID NO.6所示)：

5’-GCTCTAGAACTAGTGGATCCCAGGATTGGTGAATTCGAGTGCGTG-3’，PCR扩增出dsmI’。插入突变载体采用pJQ200SK，构建载体的方法见实施例2。将构建好的载体转化进入E.coliDH5α中。

3.2插入突变菌株的构建

将供体菌DH5α(pJQdsmI)、受体菌Ndbn-20或者Ndbn-20m、辅助菌E.coli HB101(pRK600)分别接入加有相应抗生素的LB液体培养基中培养至对数期，离心后收集菌体，分别用无菌水洗涤3次，将供体菌、受体菌及辅助菌按1:2:1的体积比在离心管中均匀混合。将无菌滤膜放置在无抗性的1/5LB平板中央，吸取混合菌液200μL加至滤膜上，30℃静置培养48h后。将接合好的菌株经过适当稀释涂布到加有Gm 10mg·L^-1和Str 100mg·L^-1双抗1/5LB平板上。30℃恒温培养箱培养10天左右，挑选长出的接合子，通过PCR验证是否插入突变成功，得到插入突变成功的突变菌株Ndbn-20ΔdsmI、Ndbn-20mΔdsmI，进行降解3-氯龙胆酸的实验。

3-氯龙胆酸降解实验：在1/5LB液体培养基中培养Ndbn-20、Ndbn-20m、Ndbn-20ΔdsmI、Ndbn-20mΔdsmI低速离心收集菌体，以相同接种量分别接种到加有0.5mM 3-氯龙胆酸为唯一碳源的无机盐培养基中，每隔6h取样，采用高效液相色谱检测3-氯龙胆酸的浓度，做出相应的降解曲线。实验结果证明Ndbn-20ΔdsmI降解3-氯龙胆酸速率下降，具有dsmI基因的Ndbn-20m能够降解3-氯龙胆酸(见图6)，说明龙胆酸双加氧酶基因dsmI参与了麦草畏微生物降解代谢产物3-氯龙胆酸的降解。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南阳师范学院

<120> 一种编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcagccag tattggccaa tgatcagcag gctcaactca ctgcgcttta tgatgaaatg 60

cggccggctg ggctgaagcc gttgtgggaa gtgctgcatg ctctggtgct ggcggaaccg 120

gcgtcgctcg cgcgtgcgca tcattggcat tatggtgagg ttcgcgactt tttactgcgg 180

tccggcgatc tgatttctgc cgagcaggcg gaacgacgcg tgctgattct ggaaaatccg 240

ggtctggagg gatcgtcggc cataaccccc agcctctatg ccgggcttca actcattttg 300

ccgggcgaag tcgccccatg tcatcgccac acgcaatgtg cgctgcggtt cattctcgag 360

ggggaggggg cctataccgc tgtggacggc gagaaagctg tgatgtcgcc tttcgaccta 420

gtcctcaccc ctggcggtca atggcatgac catgggaacg ggacggacca accgatgatc 480

tggctcgacg ggctggatat tccaacggtg cgccatttcg acgccagttt cgcggaaaaa 540

tggccgcagg cgcaacatcc tgaaatggcc ccgcctgggg acagtctggc gcgctatggg 600

cataatttgc ggccgatgcg gggcaccagc gccgaccgcc gaccgaccag tcagccgcta 660

ttccattatc cctacaagca gtggcgaccc gcgcttgatc atctggcatc gactgcgcag 720

gtcgatccgc atcttggtca cgcactcgaa ttcaccaatc ctgcggatgg cggaccggtg 780

atggaaacca tttccgccca tgtgcgactg atcccgcgcg gcatggaaac cgcgccgcgc 840

aggtcgaccg acggcacgat ctttgtcgtc gtggagggga aaggacaggt cgagatcgac 900

ggagtttcga cccgtctgtc tccccgtgat gtcgtggtca tcccatcctg gaaacgacat 960

cgatttcacg ccgaagacga actcatcatc ttcggctttt cagacaaggc ctgccagcaa 1020

aagctcgggc tgttccgaga ggaaaatcta tga 1053

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Pro Val Leu Ala Asn Asp Gln Gln Ala Gln Leu Thr Ala Leu

1 5 10 15

Tyr Asp Glu Met Arg Pro Ala Gly Leu Lys Pro Leu Trp Glu Val Leu

20 25 30

His Ala Leu Val Leu Ala Glu Pro Ala Ser Leu Ala Arg Ala His His

35 40 45

Trp His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Phe Leu Leu Arg Ser Gly Asp Leu

50 55 60

Ile Ser Ala Glu Gln Ala Glu Arg Arg Val Leu Ile Leu Glu Asn Pro

65 70 75 80

Gly Leu Glu Gly Ser Ser Ala Ile Thr Pro Ser Leu Tyr Ala Gly Leu

85 90 95

Gln Leu Ile Leu Pro Gly Glu Val Ala Pro Cys His Arg His Thr Gln

100 105 110

Cys Ala Leu Arg Phe Ile Leu Glu Gly Glu Gly Ala Tyr Thr Ala Val

115 120 125

Asp Gly Glu Lys Ala Val Met Ser Pro Phe Asp Leu Val Leu Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Gln Trp His Asp His Gly Asn Gly Thr Asp Gln Pro Met Ile

145 150 155 160

Trp Leu Asp Gly Leu Asp Ile Pro Thr Val Arg His Phe Asp Ala Ser

165 170 175

Phe Ala Glu Lys Trp Pro Gln Ala Gln His Pro Glu Met Ala Pro Pro

180 185 190

Gly Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Gly His Asn Leu Arg Pro Met Arg Gly

195 200 205

Thr Ser Ala Asp Arg Arg Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe His Tyr Pro

210 215 220

Tyr Lys Gln Trp Arg Pro Ala Leu Asp His Leu Ala Ser Thr Ala Gln

225 230 235 240

Val Asp Pro His Leu Gly His Ala Leu Glu Phe Thr Asn Pro Ala Asp

245 250 255

Gly Gly Pro Val Met Glu Thr Ile Ser Ala His Val Arg Leu Ile Pro

260 265 270

Arg Gly Met Glu Thr Ala Pro Arg Arg Ser Thr Asp Gly Thr Ile Phe

275 280 285

Val Val Val Glu Gly Lys Gly Gln Val Glu Ile Asp Gly Val Ser Thr

290 295 300

Arg Leu Ser Pro Arg Asp Val Val Val Ile Pro Ser Trp Lys Arg His

305 310 315 320

Arg Phe His Ala Glu Asp Glu Leu Ile Ile Phe Gly Phe Ser Asp Lys

325 330 335

Ala Cys Gln Gln Lys Leu Gly Leu Phe Arg Glu Glu Asn Leu

340 345 350

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattccat atgcagccag tattggccaa tgatcagc 38

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt agattttcct ctcggaacag ccc 33

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttgatatcg aattcctgca ggtctggagg gatcgtcggc cataac 46

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctctagaac tagtggatcc caggattggt gaattcgagt gcgtg 45

Claims

1.一种编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI，其特征在于，所述基因dsmI的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI，其特征在于，所述龙胆酸双加氧酶DsmI的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的基因dsmI的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，是将权利要求1所述的基因dsmI插入pET-24b(+)的NdeI和Hind III位点之间所得。

5.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.含有权利要求1所述的基因dsmI的基因工程菌。

7.一种表达如权利要求2所述的龙胆酸双加氧酶DsmI的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)用权利要求3所述的重组载体转化适于其表达的菌株，获得重组表达基因工程菌；

(2)将重组表达基因工程菌进行发酵，诱导所述龙胆酸双加氧酶DsmI的表达；以及

(3)在发酵结束后，回收并纯化所表达的龙胆酸双加氧酶DsmI。

8.根据权利要求1所述的基因dsmI在构建麦草畏下游降解产物3-氯龙胆酸转基因作物中的应用。

9.用于降解包括3-氯龙胆酸在内的底物的组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求6所述的基因工程菌和/或如权利要求2所述的龙胆酸双加氧酶DsmI。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括抗氧化剂。