CN110872591A

CN110872591A - 除草剂麦草畏降解基因dicX1及其应用

Info

Publication number: CN110872591A
Application number: CN201910973295.3A
Authority: CN
Inventors: 周正富; 林敏�; 陆伟; 张维; 郭倩楠; 陈明
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Longping Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd.
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2039-10-14
Also published as: CN110872591B

Abstract

本发明在某土壤样品的宏基因组中获得了一种具有降解除草剂麦草畏的基因dicX1。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，具有降解除草剂麦草畏的功能，可用于抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复。

Description

除草剂麦草畏降解基因dicX1及其应用

技术领域

本发明属于生物降解技术领域，涉及dicX1基因表达蛋白质降解除草剂麦草畏的功能。

背景技术

除草剂(herbicide)是指利用各种机理和方法来除去杂草的试剂。除草剂在给杂草带来伤害的同时，也会损伤农作物，可能会造成农作物的减产等问题，这就大大的限制了除草剂的使用。为解决这个减产的问题，越来越多的人开始关注利用转基因的手段来培育抗除草剂作物。

麦草畏(Dicamba)，是一种具有选择性和内吸传导型苗后生长素类除草剂，属苯甲酸类除草剂，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果。目前，对麦草畏的降解机制还不清晰，无法针对靶蛋白进行研究。仅针对麦草畏降解酶基因的克隆和获取开展了部分研究。

发现新的麦草畏降解基因，并将其用于抗除草剂转基因农作物的培育，使植物吸收除草剂后仍能进行正常的生理代谢；通过修饰靶蛋白，使其与除草剂结合的效率降低提高植物的耐性；通过引入降解除草剂的酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒，是目前需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是发现一种新的除草剂麦草畏降解基因，其编码的蛋白质能够用于麦草畏分子的降解。

微生物经过长期的压力选择，进化出一系列适应该生境的生存机制与功能基因。这些菌株基因组中蕴藏着丰富的基因资源，值得进行深入研究。本发明从我国南方某制药厂周围土壤样品的微生物宏基因组数据中获得了一种具有降解除草剂麦草畏的基因dicX1。通过构建了该基因的表达载体，将其在除草剂降解筛选菌株大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，具有降解除草剂麦草畏的功能，可用于抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复。具体研究工作如下：

1、获得了含有dicX1基因的重组工程菌株

1)通过PCR从南方某制药厂周围土壤样品的微生物宏基因组扩增出dicX1基因，其大小为1020bp，该基因编码339个氨基酸，将其克隆于载体pJET上，构建了含有完整dicX1基因的重组克隆质粒pJET-dicX1；

2)将dicX1基因连接于pRAD1质粒上，该质粒含组成型高表达groEL启动子，可高效持续表达下游靶标蛋白。构建完成的重组质粒pRAD-dicX1；

3)将导入dicX1基因的重组质粒pRAD-dicX1转入麦草畏降解基因筛选菌株大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM-dicX1(详见实施例1)；

2、表达dicX1的重组大肠杆菌工程菌株的催化活性实验

已有研究表明，除草剂麦草畏降解的关键步骤在于麦草畏分子的去甲氧基化反应。经过微生物酶的催化将除草剂麦草畏去甲氧基生成无除草剂活性的3,6-二氯水杨酸(DCSA)。

实验证实，向培养基中添加除草剂麦草畏化合物后，经过48小时孵育，表达dicX1的重组大肠杆菌工程菌株JM-dicX1能够将麦草畏分子完全降解，生成去甲基的无除草剂活性的DCSA。

实验表明，重组表达的dicX1蛋白质具有降解除草剂麦草畏的催化功能，降解产物主要为无除草剂活性的3,6-二氯水杨酸DCSA。该基因在抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复方面具有应用潜力。

序列表信息

SEQ ID NO.1：dicX1基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：DicX1的氨基酸序列。

附图说明：

图1标准品麦草畏与3,6-二氯水杨酸的HPLC检测图。A，麦草畏，检测波长λ＝275nm，出峰时间6min；B，DCSA，检测波长为λ＝319nm，出峰时间为5.1min；

图2工程菌株JM-dicX1对麦草畏降解效果。图2A中，48h孵育培养后，表达dicX1基因的重组工程菌JM-dicX1(实线)培养基中麦草畏(1号峰)已经检测不到。图2B中显示，48h孵育培养后，重组工程菌JM-dicX1(实线)的主要产物为DCSA(2号峰)。而对照菌株JM-D1(虚线)未检测到2号峰物质麦草畏降解能力。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化降解的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

表达质粒pRAD1：本实验室保藏；

大肠杆菌JM109：为北京全式金公司市售产品。

标准品麦草畏与3,6-二氯水杨酸：为sigma-aldrich公司市售产品。

实施例1土壤宏基因组中dicX1基因序列在大肠杆菌中的表达

一、实验材料

大肠杆菌JM109：为北京全式金公司市售产品。

PCR模板DNA：土壤宏基因组DNA

二、实验方法

1.根据测序获得的宏基因组基因序列设计1对PCR特异性引物：

dicX1-F：5′ACCACTAGTATGCCTTTCGTTTACAATGC 3′

dicX1-R：5′ACCCATATGTCAGGCGGCTTCCACCCGCTG 3′

2.通过PCR方法从宏基因组DNA中扩增出目的基因序列。

反应条件：95℃10min，[95℃30sec，58℃30sec，72℃1.0min]35个循环，72℃10min。

3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-dicX1，并测序验证；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的dicX1基因及含有groEL启动子的pRAD1载体，构建大肠杆菌表达载体pRAD-dicX1，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为JM-dicX1。含有pRAD1对照空质粒的E.coli JM109命名为JM-D1。。

三、实验结果

利用PCR技术成功克隆了土壤宏基因组中dicX1基因，成功构建了表达dicX1基因的重组大肠杆菌工程菌株。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为JM-dicX1。含有pRAD1对照空质粒的E.coli JM109，命名为JM-D1。

四、实验结论

完成表达dicX1的重组大肠杆菌工程菌株的构建。

实施例2表达dicX1的重组大肠杆菌工程菌株的催化活性实验

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达dicX1基因的JM-dicX1菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM-D1菌株。

二、实验方法

1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；

2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃培养至指数中后期；

3. 4000rpm,4min,离心收集菌体，用MSM培养基重悬、洗涤菌体两遍；

4.将菌株重悬于含有500mg/L麦草畏的50mL MSM培养基中；

5.分别在0h、24h、48h和76h等不同时间点收菌，测定OD₆₀₀，并取样用于HPLC测定培养液中麦草畏的含量。

利用惠普1050系列HPLC系统进行高效液相色谱分析。色谱柱为。样品上样量为100μL，麦草畏及其降解产物

过利用移动相的梯度变化进行稀释分析。移动相溶液B变化梯度为30min中从30％-95％。(A：超纯水：乙腈∶甲醇：乙酸＝58.4:31.7:7.5:2.4；B：100％乙腈)，流速为0.8mL/min。检测波长：麦草畏λ＝275nm；DCSAλ＝319nm。

三、实验结果

如图1所示，A中除草剂麦草畏的紫外检测波长为λ＝275nm，出峰时间约6min处；B中其降解产物DCSA峰为紫外检测波长为λ＝319nm，出峰时间约5.1min处。

表达dicX1基因的重组工程菌JM-dicX1与含有空质粒的对照菌株JM-D1菌株产物峰型显著不同。图2A中，48h孵育培养后，对照菌株JM-D1(虚线)的培养基中的主要化合物峰仍为1号峰，保留时间在6min处，对照标准品结果该峰为麦草畏化合物。而图2A中，表达dicX1基因的重组工程菌JM-dicX1(实线)培养基中的化合物峰型发生了明显的变化，1号峰已经检测不到。图2B中显示，48h孵育培养后，重组工程菌JM-dicX1(实线)的主要产物为2号峰，保留时间在5.1min处，对照标准品结果该峰为DCSA化合物。而对照菌株JM-D1(虚线)未检测到2号峰物质产生。

四、实验结论

重组表达的DicX1蛋白质具有降解除草剂麦草畏的催化功能，降解产物主要为无除草剂活性的3,6-二氯水杨酸(DCSA)。该基因在抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复方面具有应用潜力。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 除草剂麦草畏降解基因dicX1及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1020

<212> DNA

<213> 宏基因组DNA（metagenome DNA）

<400> 1

atgcctttcg tttacaatgc ctggtacgta atcgcgctgc ccgatgaggt gatcgatcgg 60

ccgctggcgc ggaccgtgtt gggtatgccg ttggtgtcgt ttcgccagac cgacggtgcc 120

gcggcggtac tactggacct ctgcccacat cgatttgccg cgttgagcga cggttctgtc 180

gcaggcggca ggttgcaatg tccctatcac gggcttcaat tcgatggcgg ggggcggtgt 240

gttcacaacc cgcacggtaa tggcgcgcgc ccgtccacgc ttgacgtgcg atccttcccg 300

gtcgtcgaac gcgacgatct gatctggata tgggcgggtg acgcaggcga tgcggatccc 360

gcctccatcc ccgacttcgc gtgccgcgtc gatccctcct tcaagtccgt cggcggctat 420

gcgcatctgg aatgcaactt ccggctgctg ctggacaacc tgatggacct cggccacgcc 480

caatatgtcc atcgcgccaa cgcccagtcc gactccttcg aacgggtgga tcgcgatgtg 540

gtgctggcgg aagcggatat acgggcggtg atccgggtgc ccggcggcac gccgagcgtg 600

ctgatggcca agttcctgcg cggcgccaat acccccgtcg actcctggga tgacgtgcgc 660

tgggatcggg tgagcgcgat cctcaactac gtggcgatcg cgccggatgg ctccgcgaag 720

gagcggagcg tgaatacgaa gggtacccat atcctgaccc ccgagtccga gtccacgtcc 780

cattatttct tcggctcctc gcgcaatttc ggcatcgacg atccggagat ggacggcgtg 840

ctgcgcagct ggcaggctca ggcgctgatc cgggaggaca agatcgtcgt cgagtccgtg 900

gataagcgca aggcctatat cgatgcggat gcggtgaagc cggcgatgct gtcgtgcgac 960

gaagccgcag tccgtgtcag ccgcgagatc gatcggcttg agcgggtgga agccgcctga 1020

<210> 2

<211> 339

<212> PRT

<213> 宏基因组DNA（metagenome DNA）

<400> 2

MET Pro Phe Val Tyr Asn Ala Trp Tyr Val Ile Ala Leu Pro Asp Glu

1 5 10 15

Val Ile Asp Arg Pro Leu Ala Arg Thr Val Leu Gly MET Pro Leu Val

20 25 30

Ser Phe Arg Gln Thr Asp Gly Ala Ala Ala Val Leu Leu Asp Leu Cys

35 40 45

Pro His Arg Phe Ala Ala Leu Ser Asp Gly Ser Val Ala Gly Gly Arg

50 55 60

Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Gln Phe Asp Gly Gly Gly Arg Cys

65 70 75 80

Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ser Thr Leu Asp Val

85 90 95

Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Asp Leu Ile Trp Ile Trp Ala

100 105 110

Gly Asp Ala Gly Asp Ala Asp Pro Ala Ser Ile Pro Asp Phe Ala Cys

115 120 125

Arg Val Asp Pro Ser Phe Lys Ser Val Gly Gly Tyr Ala His Leu Glu

130 135 140

Cys Asn Phe Arg Leu Leu Leu Asp Asn Leu MET Asp Leu Gly His Ala

145 150 155 160

Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Ser Asp Ser Phe Glu Arg Val

165 170 175

Asp Arg Asp Val Val Leu Ala Glu Ala Asp Ile Arg Ala Val Ile Arg

180 185 190

Val Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu MET Ala Lys Phe Leu Arg Gly

195 200 205

Ala Asn Thr Pro Val Asp Ser Trp Asp Asp Val Arg Trp Asp Arg Val

210 215 220

Ser Ala Ile Leu Asn Tyr Val Ala Ile Ala Pro Asp Gly Ser Ala Lys

225 230 235 240

Glu Arg Ser Val Asn Thr Lys Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu Ser

245 250 255

Glu Ser Thr Ser His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly Ile

260 265 270

Asp Asp Pro Glu MET Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln Ala

275 280 285

Leu Ile Arg Glu Asp Lys Ile Val Val Glu Ser Val Asp Lys Arg Lys

290 295 300

Ala Tyr Ile Asp Ala Asp Ala Val Lys Pro Ala MET Leu Ser Cys Asp

305 310 315 320

Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Asp Arg Leu Glu Arg Val

325 330 335

Glu Ala Ala

Claims

1.SEQ ID NO:1所示序列的基因。

2.含有SEQ ID NO:1所示序列基因的质粒。

3.权利要求1所述基因的应用，是在抗除草剂转基因作物培育和环境生物修复降解除草剂中的应用。

4.权利要求3所述的应用，所述的降解是将有毒性的除草剂化合物降解为无毒性的化合物的催化反应。

5.权利要求3或4所述的应用，所述的除草剂是麦草畏。

6.权利要求2所述的质粒在抗除草剂转基因作物培育及除草剂降解中的应用。

7.权利要求1所述DNA序列编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示。