CN111139248A - dicX5基因及其对除草剂的降解功能 - Google Patents

dicX5基因及其对除草剂的降解功能 Download PDF

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Abstract

本发明获得了一种具有降解除草剂的基因dicX5。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，具有降解除草剂的功能，可用于抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复。

Description

dicX5基因及其对除草剂的降解功能
技术领域
本发明涉及一种新的具有生物降解功能的基因，具体涉及一种具有降解除草剂功能的基因。
背景技术
微生物经过长期的压力选择，进化出一系列适应该生境的生存机制与功能基因。这些菌株基因组中蕴藏着丰富的基因资源，值得进行深入研究。
比如，从土壤样品的微生物宏基因组数据中有希望获得具有降解除草剂的基因，可用于抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复。
发明内容
本发明的目的是发现一种新的除草剂降解基因，其编码的蛋白质能够用于除草剂分子的降解。
具体研究工作如下：
1、获得了含有dicX5基因的重组工程菌株
1)通过PCR从南方某制药厂周围土壤样品的微生物宏基因组扩增出dicX5基因，其大小为1020bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
该基因编码339个氨基酸，将其克隆于载体pJET上，构建了含有完整dicX5基因的重组克隆质粒pJET-dicX5；
2)将dicX5基因连接于pRAD1质粒上，该质粒含组成型高表达groEL启动子，可高效持续表达下游靶标蛋白。构建完成的重组质粒pRAD-dicX5；
3)将导入dicX5基因的重组质粒pRAD-dicX5转入麦草畏降解基因筛选菌株大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM-dicX5(详见实施例1)；
2、表达dicX5的重组大肠杆菌工程菌株的催化活性实验
已有研究表明，除草剂麦草畏降解的关键步骤在于麦草畏分子的去甲氧基化反应。经过微生物酶的催化将除草剂麦草畏去甲氧基生成无除草剂活性3,6-二氯水杨酸(DCSA)。
实验证实，表达dicX5基因的重组工程菌能够在以麦草畏为唯一碳源的培养基中生长，具有降解除草剂麦草畏的能力。经过72小时孵育，表达dicX5的重组大肠杆菌工程菌株JM-dicX5能够将麦草畏分子完全降解，生成去甲基的无除草剂活性的DCSA。
实验表明，重组表达的dicX5蛋白质(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)具有降解除草剂麦草畏的催化功能，降解产物主要为DCSA。该基因在抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复方面具有应用潜力。
序列表信息
SEQ ID NO.1：dicX5基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2：DicX5的氨基酸序列。
附图说明：
图1标准品麦草畏与3,6-二氯水杨酸的HPLC检测图；其中
图A是麦草畏，检测波长λ＝275nm，出峰时间6min；
图B是DCSA，检测波长为λ＝319nm，出峰时间为5.1min；
图2工程菌株JM-dicX5对麦草畏降解效果。其中
图A中，孵育培养前，重组工程菌JM-dicX5培养基中的化合物峰型主要化合物峰为1号峰，为麦草畏化合物。
图B中显示，72h孵育培养后，重组工程菌JM-dicX5的主要产物为2号峰为DCSA化合物。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化降解的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；
表达质粒pRAD1：本实验室保藏；
大肠杆菌JM109：为北京全式金公司市售产品。
标准品麦草畏与3,6-二氯水杨酸：为sigma-aldrich公司市售产品。
实施例1土壤宏基因组中dicX5基因序列在大肠杆菌中的表达
一、实验材料
大肠杆菌JM109：为北京全式金公司市售产品。
PCR模板DNA：土壤宏基因组DNA
二、实验方法
1.根据测序获得的宏基因组基因序列设计1对PCR特异性引物：
dicX5-F：5′ACCACTAGTATGCCTTTCGTTTACAATGC 3′
dicX5-R：5′ACCCATATGTTACGCCGCCTCCACCCGCT 3′
2.通过PCR方法从宏基因组DNA中扩增出目的基因序列。
反应条件：95℃10min，[95℃30sec，60℃30sec，72℃1.0min]35个循环，72℃10min。
3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-dicX5，并测序验证；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的dicX5基因及含有groEL启动子的pRAD1载体，构建大肠杆菌表达载体pRAD-dicX5，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为JM-dicX5。含有pRAD1对照空质粒的E.coli JM109命名为JM-D1。
三、实验结果
利用PCR技术成功克隆了土壤宏基因组中dicX5基因，成功构建了表达dicX5基因的重组大肠杆菌工程菌株。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为JM-dicX5。含有pRAD1对照空质粒的E.coli JM109，命名为JM-D1。
四、实验结论
完成表达dicX5的重组大肠杆菌工程菌株的构建。
实施例2表达dicX5的重组大肠杆菌工程菌株对除草剂的降解实验
一、实验材料
重组工程菌株：实施例1得到的表达dicX5基因的JM-dicX5菌株
对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM-D1菌株。
二、实验方法
1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；
2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃培养至指数中后期；
3.4000rpm,4min,离心收集菌体，用MSM培养基重悬、洗涤菌体两遍；
4.将菌株重悬于含有500mg/L麦草畏的50mL MSM培养基中；
5.分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h等不同时间点收菌，测定OD600，并取样用于HPLC测定培养液中麦草畏的含量。
利用惠普1050系列HPLC系统进行高效液相色谱分析。色谱柱为。样品上样量为100μL，麦草畏及其降解产物
过利用移动相的梯度变化进行稀释分析。移动相溶液B变化梯度为30min中从30％-95％。(A：超纯水：乙腈∶甲醇：乙酸＝58.4:31.7:7.5:2.4；B：100％乙腈)，流速为0.8mL/min。检测波长：麦草畏λ＝275nm；DCSA λ＝319nm。
三、实验结果
如图1所示，A中除草剂麦草畏的紫外检测波长为λ＝275nm，出峰时间约6min处；B中其降解产物DCSA峰为紫外检测波长为λ＝319nm，出峰时间约5.1min处。
如图2所示，表达dicX5基因的重组工程菌JM-dicX5具有降解除草剂麦草畏的催化功能。图2A中，孵育培养前，表达dicX5基因的重组工程菌JM-dicX5培养基中的化合物峰型主要化合物峰为1号峰，保留时间在6min处，
对照标准品结果该峰为麦草畏化合物。图2B中显示，72h孵育培养后，表达dicX5基因的重组工程菌JM-dicX5培养基中的化合物峰型发生了明显的变化，1号峰已经检测不到。重组工程菌JM-dicX5的主要产物为2号峰，保留时间在5.1min处，对照标准品结果该峰为DCSA化合物。
四、实验结论
重组表达的dicX5蛋白质具有降解除草剂麦草畏的催化功能，降解产物主要为DCSA。该基因在抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复方面具有应用潜力。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> dicX5基因及其对除草剂的降解功能
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1020
<212> DNA
<213> 宏基因组DNA（metagenome DNA）
<400> 1
atgcctttcg tttacaatgc ctggtacgta atcgcgctgc ccgatgaggt gatcgatcgg 60
ccgctggcgc ggaccgtgtt gggtatgccg ttggtgtcgt ttcgccagac cgacggtgcc 120
gcggcggtac tactggacct ctgcccacat cgatttgccg cgttgagcga cggttctgtc 180
gcaggcggca ggttgcaatg tccctatcac gggcttcaat tcgatggcgg ggggcggtgt 240
gttcacaacc cgcacggtaa tggcgcgcgc ccgtccacgc ttgacgtgcg atccttcccg 300
gtcgtcgaac gcgacgatct gatctggata tgggcgggtg acgcaggcga tgcggatccc 360
gccgatattc ccgacttcag atgccgcgtc gatcccgacc tgggccatgt cggcggctat 420
ggccatcttg gctgcaacta caggctgttg ctcgataacc tgatggatct cgggcatgcg 480
caatatgttc accgggcgaa tgcgcagtcc gatggctttg cgcggctgga acgtgatgtg 540
gtccgagagg atgacgatat tcatgcgttc atcaagatcc cgggcggcac gccgtccgtg 600
ttgatggcga agttcctgcg gggcgcgaac acgccggtcg acggatggag tgatgtgcgc 660
tggaacaagg tcagcgccac gttgaattat gtcgcctatg cccccgccgg atcggcgaag 720
gagagcagca tccacgcacg ggggacgcac attctgaccc cggaaagcga gggggcgacg 780
cactatttct tcgggtcgtc gcgcaacttc ggcatagacg accctgaaat ggatggcgtg 840
ctgcgctcct ggcaggcgca ggcgctgacg cgcgaggata aggtggtggt agagcaggtc 900
gaggcgcgct cggcctatgc gcgggcccac gagttcacgc ctgccatgct gagctgcgac 960
gaggcagccg ttcgtgtgtc gcgcgaaatc gatcggctgg agcgggtgga ggcggcgtaa 1020
<210> 2
<211> 339
<212> PRT
<213> 宏基因组DNA（metagenome DNA）
<400> 2
MET Pro Phe Val Tyr Asn Ala Trp Tyr Val Ile Ala Leu Pro Asp Glu
1 5 10 15
Val Ile Asp Arg Pro Leu Ala Arg Thr Val Leu Gly MET Pro Leu Val
20 25 30
Ser Phe Arg Gln Thr Asp Gly Ala Ala Ala Val Leu Leu Asp Leu Cys
35 40 45
Pro His Arg Phe Ala Ala Leu Ser Asp Gly Ser Val Ala Gly Gly Arg
50 55 60
Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Gln Phe Asp Gly Gly Gly Arg Cys
65 70 75 80
Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ser Thr Leu Asp Val
85 90 95
Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Asp Leu Ile Trp Ile Trp Ala
100 105 110
Gly Asp Ala Gly Asp Ala Asp Pro Ala Asp Ile Pro Asp Phe Arg Cys
115 120 125
Arg Val Asp Pro Asp Leu Gly His Val Gly Gly Tyr Gly His Leu Gly
130 135 140
Cys Asn Tyr Arg Leu Leu Leu Asp Asn Leu MET Asp Leu Gly His Ala
145 150 155 160
Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Ser Asp Gly Phe Ala Arg Leu
165 170 175
Glu Arg Asp Val Val Arg Glu Asp Asp Asp Ile His Ala Phe Ile Lys
180 185 190
Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu MET Ala Lys Phe Leu Arg Gly
195 200 205
Ala Asn Thr Pro Val Asp Gly Trp Ser Asp Val Arg Trp Asn Lys Val
210 215 220
Ser Ala Thr Leu Asn Tyr Val Ala Tyr Ala Pro Ala Gly Ser Ala Lys
225 230 235 240
Glu Ser Ser Ile His Ala Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu Ser
245 250 255
Glu Gly Ala Thr His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly Ile
260 265 270
Asp Asp Pro Glu MET Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln Ala
275 280 285
Leu Thr Arg Glu Asp Lys Val Val Val Glu Gln Val Glu Ala Arg Ser
290 295 300
Ala Tyr Ala Arg Ala His Glu Phe Thr Pro Ala MET Leu Ser Cys Asp
305 310 315 320
Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Asp Arg Leu Glu Arg Val
325 330 335
Glu Ala Ala

Claims (6)

1.SEQ ID NO:1所示序列的基因。
2.含有SEQ ID NO:1所示序列基因的质粒。
3.权利要求1所述基因的应用，是在抗除草剂转基因作物培育和环境生物修复降解除草剂中的应用。
4.权利要求3所述的应用，所述的降解是将有毒性的除草剂化合物降解为无毒性的化合物的催化反应。
5.权利要求2所述的质粒在抗除草剂转基因作物培育及除草剂降解中的应用。
6.权利要求1所述DNA序列编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示。
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