CN113122553B - 一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA及其应用 - Google Patents

一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物防治技术领域，本发明在前期研究中发现，硝基还原假单胞菌HS‑18能够高效降解C4～C14酰基链长的AHLs信号分子的基础上，通过分子生物学技术，克隆出了N‑酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因。本发明所述的N‑酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因对AHLs具有广谱的淬灭活性，对不同碳链长度及不同取代基修饰的N‑酰基高丝氨酸内酯都具有良好的降解效果。前人的研究结果表明大多数的N‑酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因对长链AHLs具有更好的淬灭活性。本发明为丰富N‑酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因资源奠定了重要基础。

Description

一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物防治技术领域，更具体地，涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA及其应用。
背景技术
农药和抗生素的使用是当下用于防治致病菌最普遍的方法，然而农药和抗生素的长期滥用已造成了对环境安全和人畜健康的威胁，甚至引起了微生物的耐药性。所以一种新型、环保的抗微生物方式亟待开发。
群体感应是一种细胞间的交流机制，细胞合成并分泌一种小分子化合物信号，细胞通过感知扩散至胞外的信号分子的浓度来确定种群的数量，当信号分子浓度到达一定阈值，细胞将通过一系列信号传导激活下游靶基因的表达。细菌通过群体感应信号分子调控自身多种生理生化功能，如：质粒转移、抗药性、运动性、生物发光、生物膜形成、抗药性、胞外酶的产生等，以调整自身对环境的适应性及生存能力。尤其地，许多革兰氏阴性致病菌利用群体感应系统调控自身毒力因子的产生及致病力，以获取对寄主更强的侵染力。
N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)是革兰氏阴性致病菌中最广泛存在的群体感应信号分子，负责调控多种革兰氏阴性致病菌中毒力因子的产生及致病力等，如：运动性、生物膜的形成以及胞外酶、胞外多糖、毒素的产生等。第一种AHLs信号分子发现于海洋细菌费氏弧菌(Vibrio fischeri)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的生物荧光研究。后续越来越多的AHLs得到鉴定，AHLs的分子结构较为保守，主要由N-酰基高丝氨酸内酯环和4～18个不同碳原子数且于3号碳位置具有不同取代基修饰的酰基链构成。
群体淬灭是一种能够阻断或破坏群体感应系统的方式，主要可通过三种途径实现：抑制群体感应信号合成酶活性、抑制群体感应信号受体蛋白活性以及利用淬灭酶对群体感应信号分子进行修饰或酶解。群体淬灭基因或淬灭酶的发现与应用已成为当下群体淬灭的研究热点之一。最早得到鉴定的AHLs淬灭酶是发现于苏云金芽孢杆菌的AHL内酯酶AiiA，AHL内酯酶能够破坏AHLs分子中内酯环的内酯键，从而失活AHL信号分子。AiiA在致病菌中的表达能够显著削弱病原菌毒力因子的产量及对寄主植物的毒力，AiiA在植物中的表达能够有效提高寄主植物对致病菌的抗病性。在AHL内酯酶得到鉴定之后，能够切割AHL内酯环与酰基链之间的酰胺键的AHL酰基转移酶和作用于侧链氢原子的AHL氧化还原酶也相继得到发现。
研究发现，大多数已得到鉴定的AHLs淬灭基因在致病菌中的表达都能削弱致病菌的毒力，AHLs淬灭基因在寄主植物中的表达能够提高寄主对致病菌的抵抗力，AHLs淬灭基因或AHLs淬灭基因的编码产物—AHLs淬灭酶已在农业、水产养殖业的生物防治方面以及污水处理的生物膜反应器上得到了广泛且有效的应用。因此AHLs淬灭基因挖掘、鉴定与应用将为丰富AHLs群体淬灭制剂资源奠定基础，对群体淬灭途径的生物防治具有巨大实际应用价值。
发明内容
本发明为了克服现有技术中存在的上述问题，首先提供了一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因。
本发明的第二个目的是提供含有N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因的重组载体。
本发明的第三个目的是提供含有重组载体的重组菌。
本发明的第四个目的是提供上述重组载体的应用。
本发明的第五个目的是提供上述重组菌的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA，该基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
本发明在前期研究中发现，硝基还原假单胞菌HS-18能够高效降解C4～C14酰基链长的AHLs信号分子的基础上，通过分子生物学技术，克隆出了N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因。
可以理解的是，上述含有所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因的重组载体也在本发明的保护范围内；含有所述重组载体的重组菌同样也在本发明的保护范围内。
作为一种优选的实施方式，所述的重组载体是将所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因插入广宿主载体pBBR1中得到用于异源表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因的重组载体。
作为另一种优选的实施方式，所述的重组载体还可以是将所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因插入蛋白原核表达载体pET32a中得到用于N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶蛋白原核表达的重组载体。
作为一种优选的实施方式，优选地，所述的重组菌是将所述的于广宿主载体pBBR1中表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因的重组载体导入大肠杆菌DH5α中。
作为另一种优选的实施方式，所述的重组菌是将所述的于广宿主载体pBBR1中表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因的重组载体导入依赖AHL致病的病原菌中。
作为再一种优选的实施方式，所述的重组菌是将所述的于蛋白原核表达载体pET32a中表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中。
本发明还提供一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶，命名为AigA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供上述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的制备方法，是于蛋白原核表达载体pET32a中表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组菌进行发酵培养，将发酵培养后的重组菌菌株破碎，并进行分离纯化，得带有His标签的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶蛋白。
本发明还提供所述重组菌，或者所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶在降解AHLs信号分子中的应用。
优选的，所述AHLs信号分子包括C4-HSL、C6-SHL、3-O-C6-HSL、C8-HSL、3-OH-C8-HSL、C10-HSL、3-OH-C10-HSL、C12-HSL、3-O-C12-HSL、3-OH-C12-HSL、3-OH-C14-HSL；所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶对不同的AHLs信号分子具有广谱的淬灭活性，不同的底物和N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的反应活性可能不同。
本发明还提供所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因，或者所述重组载体，或者所述重组菌，或者权利要求4所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶在防治依赖AHLs致病的病原菌中的应用。
优选的，所述依赖AHLs致病的病原菌包括胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、洋葱伯克氏菌、铜绿假单胞菌、青枯劳尔氏菌、根癌农杆菌、水稻基腐病菌、欧文氏杆菌、玉米细菌性枯萎病菌。
作为一种优选的实施方式，当利用所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因时，是将N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因表达于AHLs介导的致病菌中，筛选成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌。
作为另一种优选的实施方式，当利用所述重组载体时，是将重组载体导入AHLs介导的致病菌中，筛选成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌。
作为再一种优选的实施方式，当利用所述重组菌时，是筛选成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌。
该筛选成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌显著削弱了病原菌毒力因子的产量和致病性。
优选的，所述病原菌为依赖C8-HSL致病的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)H111，依赖C4-HSL和3-OH-C12-HSL致病的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1。
作为一种优选的实施方式，与野生型病原菌相比，所述成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌具备以下至少一种性质：
(1)降低了AHLs的产量；和/或，
(2)降低了运动型；和/或，
(3)降低了生物膜的形成；和/或，
(4)减小了蛋白酶的生成量；和/或，
(5)削弱了致病力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在前期研究中发现，硝基还原假单胞菌HS-18能够高效降解C4～C14酰基链长的AHLs信号分子的基础上，通过分子生物学技术，克隆出了N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因。本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因对AHLs具有广谱的淬灭活性，对不同碳链长度及不同取代基修饰的N-酰基高丝氨酸内酯都具有良好的降解效果。前人的研究结果表明大多数的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因对长链AHLs具有更好的淬灭活性。本发明为丰富N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因资源奠定了重要基础。
附图说明
图1为本发明所述的于广宿主载体pBBR1中表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因的重组大肠杆菌DH5α(aigA)(图1B)及含有空载体的大肠杆菌DH5α(pBBR1)(图1A)培养36h后的AHLs降解效果图；
图2是本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶蛋白AigA进化树图；
图3是AigA蛋白的表达；M：蛋白Marker；1：表达AigA蛋白重组菌中总蛋白表达情况；2：含有空载体pET32a的BL21(DE3)总蛋白表达情况；3：表达AigA蛋白重组菌中胞内蛋白表达情况；4：含有空载体pET32a的BL21(DE3)中胞内蛋白表达情况；
图4是本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA在依赖AHL致病的病原菌洋葱伯克氏菌H111中表达对H111生长、自产的AHL产量以及毒力因子的影响；图4A显示洋葱伯克氏菌生长曲线；图4B显示胞内C8-HSL产量；图4C显示洋葱伯克氏菌运动性；图4D显示洋葱伯克氏菌生物膜的形成；图4E显示洋葱伯克氏菌蛋白酶产量；
图5是本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA在依赖AHL致病的病原菌洋葱伯克氏菌H111中表达对H111致病性的影响；
图6是本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA在依赖AHL致病的病原菌铜绿假单胞菌PAO1中表达对PAO1生长、自产的AHL产量以及毒力因子的影响；图6A显示铜绿假单胞菌生长曲线；图6B显示铜绿假单胞菌胞内C4-HSL产量；图6C显示铜绿假单胞菌胞内3-O-C12-HSL产量；图6D显示铜绿假单胞菌运动性；图6E显示铜绿假单胞菌蛋白酶产量；
图7是本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA在依赖AHL致病的病原菌铜绿假单胞菌PAO1中表达对PAO1致病性的影响，图7A显示对生菜致病性的影响，图7B显示对白菜致病性的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
MM无机盐培养基：K2HPO4，10.5g/L；KH2PO4，4.5g/L；(NH4)2SO4，2.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；FeSO4，0.005g/L；CaCl2，0.01g/L；MnCl2，0.002g/L；甘油，2.0g/L；甘露醇，2.0g/L；pH 6.8～7.2，121℃灭菌20min。
LB培养基：trypton 10.0g/L，yeast extract 5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH 6.8～7.2，121℃灭菌15～25min。
PBS磷酸盐缓冲液、X-gal以及培养基中需要的试剂均采购自广州齐湘、鼎国等生物试剂公司，本发明中用于检测降解活性的AHLs采购自上海有德化工科技有限公司和Sigma-Aldrich。
硝基还原假单胞菌HS-18分离于广州市华南农业大学附近长期被油污染的土样中，于2017年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2017257。利用LB培养基于30℃条件下培养HS-18。
实施例1 AHLs降解基因的获取和鉴定
根据前期工作中对硝基还原假单胞菌菌株HS-18的全基因组测序结果，利用基因组注释与生物信息学比对，发现了可能编码N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的基因aigA。利用软件MEGA 5.10对AigA及当下已知的N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的氨基酸序列进行比对，采用ClustalX1.8.3、邻接法，进行系统发育进化分析并构建进化树。结果如图2表明，AigA属于Penicillin G acylase family的AHLs酰基转移酶，且与已知的AHLs酰基转移酶中QuiP的氨基酸序列具有最高相似度(82.29％)。
设计引物分别扩增构建aigA插入广宿主载体pBBR1和蛋白原核表达载体pET32a重组载体的引物，引物序列如下：
pBBR1-aigA-F:gtcgacggtatcgataagcttTTCCGCGACCCTCTTTGTG
pBBR1-aigA-R:cgctctagaactagtggatccTCACTTCTCCGGCACCAGC
pET32a-aigA-F:gccatggctgatatcggatccATGGCCCCGCGTGCCTTC
pET32a-aigA-R:ctcgagtgcggccgcaagcttTCACTTCTCCGGCACCAGC
实施例2重组菌DH5α(aigA)对AHLs淬灭活性的检测
AHLs降解体系设定：于LB液体培养基中过夜培养成功构建的DH5α(aigA)获取OD600＝1.0的种子液，加入等体积新鲜LB液体培养基及外源的终浓度为10～50μM的不同碳链长度和不同取代基的AHLs及终浓度为50mM的MOPS以配制降解体系(不同AHLs信号根据对报告菌株显色的不同强度选择合适浓度)，于37℃，200rpm恒温摇床中培养36h，以DH5α(pBBR1)菌液及不加菌液的LB液体培养基为对照。其次，用等体积的乙酸乙酯对培养液进行萃取，利用报告菌株检测10μl乙酸乙酯萃取液中剩余的AHLs含量。
短链AHLs(C4～C6)定量检测：利用报告菌株紫色杆菌CV026检测短链AHLs(C4～C6)。首先，LB固体平板活化CV026，用LB液体培养基于28℃，200rpm恒温摇床中过夜培养CV026。准备LB固体平板，并切成0.8cm宽的相间的琼脂条，在琼脂条上端上样10μl待测样品乙酸乙酯萃取液，于样品上样处下方连续点一列大小相近的报告菌株液滴。AHLs扩散到的区域可诱导紫色杆菌CV026产生紫色杆菌素而使菌体呈现紫色。呈现紫色的报告菌株CV026的距离与待检测的AHLs含量呈正比。待琼脂条上样品干后，于28℃恒温培养箱中培养16h，观察并统计出现紫色CV026的距离。根据图1的结果表明，DH5α(aigA)对用于检测的短链AHLs(C4-HSL、C6-HSL、3-O-C6-HSL)都具有显著且高效的AHLs淬灭活性。
中长链AHLs(C8～C14)利用报告菌株根癌农杆菌NT1检测。首先，LB固体平板活化NT1，用添加有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基于28℃，200rpm恒温摇床中过夜培养NT1。准备MM固体平板，并切成0.8cm宽的相间琼脂条，在琼脂条上端上样10μl待测样品乙酸乙酯萃取液，于样品上样处下方连续点一列大小相近的报告菌株液滴。AHLs扩散到的区域可诱导根癌农杆菌NT1产生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶分解X-gal使菌体呈现蓝色。根癌农杆菌NT1产生蓝色的距离与待检测的AHLs含量呈正比。待琼脂条上样品干后，于28℃恒温培养箱中培养16h，观察并统计呈现蓝色的NT1的距离。根据图1的结果表明，DH5α(aigA)对用于检测的中长链AHLs(C8-HSL、3-OH-C8-HSL、C10-HSL、3-OH-C10-HSL、C12-HSL、3-O-C12-HSL、3-OH-C12-HSL、3-OH-C14-HSL)都具有显著且高效的AHLs淬灭活性。
因此，aigA对待测的C4-C14不同链长及不同取代基的AHLs都具有高效且广谱的淬灭活性。
实施例3 AigA蛋白的原核表达
在添加有终浓度为100μg/ml氨苄霉素的LB液体培养基中过夜培养成功构建的重组菌BL21(DE3)(pET32a-aigA)，于37℃，200rpm恒温摇床中培养获得种子液。再将种子液以1：100加入新鲜的含有终浓度为100μg/ml氨苄霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm恒温摇床中培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，于18℃，200rpm恒温摇床中过夜培养。收集过夜培养的菌体，并进行细胞破碎，利用SDS-PAGE电泳鉴定AigA的表达。根据图3结果表明，携带His标签的AigA可进行正常的原核表达，大小约为112.27kDa。
实施例4 aigA的表达对AHL介导的致病菌H111的生长及胞内AHL产量的影响
过夜培养成功构建的重组菌H111(aigA)种子液至OD600＝0.5，以1：100比例加入含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，于30℃，200rpm恒温摇床中培养，每2h测一次OD600，H111(pBBR1)作为对照。生长曲线结果如图4A表明，aigA于H111中的表达不影响H111的生长。
对H111中胞内产生的AHL含量的检测：过夜培养种子液至OD600＝0.5，以1：100比例加入种子液于含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃，200rpm恒温摇床中培养17h，取等体积的乙酸乙酯萃取菌液，旋蒸干乙酸乙酯萃取液有机相，加入报告菌株NT1，培养8h，破碎培养液菌体，检测细胞破碎后上清中AHL诱导NT1产生的β-半乳糖苷酶的活性。结果如图4B可见，aigA于H111中的表达显著降低了H111中C8-HSL的产量。
实施例5 aigA的表达对AHL介导的致病菌H111的生物表型的影响
运动性的检测：准备用于检测H111运动性的半固体培养基(0.8％tryptone,0.5％glucose,0.3％agarose)。蘸取活化的重组菌H111(aigA)和对照H111(pBBR1)于运动性培养基平板中央，于30℃恒温培养箱中静置培养17h后，观察并统计运动直径。结果如图4C所示，aigA的表达显著削弱了H111的运动性。
生物膜检测：将过夜培养的种子液调整至OD600＝0.5，以1：100比例加入96孔板中含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的100μl LB液体培养基中，30℃，200rpm恒温摇床中培养9h进行生物膜测定，每个处理8个重复。首先测定OD600，再用移液枪小心吸走菌液弃掉，用无菌水小心清洗每个孔3次后，加入150μl 0.1％结晶紫，室温静置染色15min，用无菌水清洗每个孔3次，风干，再加入300μl 95％乙醇，静置10min，在595nm波长下测定吸光值，最后计算OD595/OD600定量菌株的生物膜形成。结果如图4D所示，aigA的表达显著削弱了H111的生物膜的形成。
蛋白酶活性检测：将过夜培养的种子液调整至OD600＝0.5，取20μl加入LB+1％skimmed milk平板上用打孔器打出的孔中，每个设置3个重复。将平板于30℃培养箱中静置培养17h，测定菌株在孔周围产生的透明圈大小以定量蛋白酶活性。结果如图4E所示，aigA的表达显著削弱了H111的蛋白酶产生。
实施例6 aigA的表达对AHL介导的致病菌H111的致病性的影响
过夜培养重组菌种子液，用PBS缓冲液重悬菌液至OD600＝1.0。取新鲜洋葱平均分为四份，剥取洋葱瓣片作为接种组织，用无菌小枪头对洋葱瓣片内侧中央轻戳伤口，取20μl菌悬液加在伤口上，每个处理设置三个重复，30℃保湿培养3天，观察并统计病斑大小。结果如图5所示，aigA的表达显著削弱了H111的致病力产生。
实施例7 aigA的表达对AHL介导的致病菌铜绿假单胞菌PAO1的生长及胞内AHLs产量的影响
过夜培养成功构建的重组菌PAO1(aigA)种子液至OD600＝0.5，以1：100比例加入种子液于含有终浓度为50μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中于37℃，200rpm恒温摇床中培养，每2h测一次OD600，PAO1(pBBR1)作为对照。生长曲线结果如图6A表明，aigA于PAO1中的表达不影响PAO1的生长。
对PAO1中胞内产生的AHLs含量的检测：过夜培养种子液至OD600＝0.5，以1：100比例加入种子液于含有终浓度为50μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中于37℃，200rpm恒温摇床中培养17h，取等体积的乙酸乙酯萃取菌液。PAO1可产生C4-HSL和3-O-C12-HSL两种AHLs。C4-HSL产量的检测：旋蒸干萃取液后，加入报告菌株CV026，过夜培养。离心获取菌体，取裂解液重悬菌体并裂解细胞，取裂解后的上清200μl于545nm吸收波长下检测CV026中由AHL诱导产生的紫色杆菌素吸光值。3-O-C12-HSL产量的检测：旋蒸干萃取液后，加入报告菌株NT1，过夜培养后破碎菌体，对破碎后的上清检测AHL诱导NT1产生的β-半乳糖苷酶的活性。结果如图6B和6C可见，aigA于PAO1中的表达显著降低了PAO1中C4-HSL和3-O-C12-HSL的产量。
实施例8 aigA的表达对AHL介导的致病菌PAO1的生物表型的影响
群集运动性的检测：准备用于检测PAO1群集运动性的半固体培养基(1％tryptone，0.5％NaCl，0.35％agarose)，用牙签蘸取活化的重组菌PAO1(aigA)和对照PAO1(pBBR1)，点于运动性培养基平板中央，于37℃恒温培养箱中静置培养17h后，观察并统计运动直径。结果如图6D所示，aigA的表达显著削弱了PAO1的运动性。
蛋白酶活性检测：过夜培养种子至OD600＝0.5，取20μl加入LB+1％skimmed milk平板上用打孔器打出的孔中，每个设置3个重复。将平板于37℃培养箱中静置培养17h，测定菌株在孔周围产生的透明圈大小以定量蛋白酶活性。结果如图6E所示，aigA的表达显著削弱了PAO1的蛋白酶产量。
实施例9 aigA的表达对AHL介导的致病菌PAO1的致病性的影响
过夜培养重组菌种子液，用PBS缓冲液重悬菌液至OD600＝1.0。取2cm*4cm新鲜生菜梗部位和5cm*4cm新鲜白菜梗部位，用无菌小枪头对生菜梗和白菜梗表面中央处轻戳伤口，取20μl菌悬液加在伤口上，每个处理设置三个重复，30℃保湿培养3天，观察并统计病斑大小。结果如图7所示，aigA的表达显著削弱了PAO1的致病力。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA及其应用
<130> ZM211073ZL
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2541
<212> DNA
<213> germ
<400> 1
atggccccgc gtgccttccg ccggcttccc agcttcggcc ttgccgccac cgtcactgcc 60
gctgtcagcc ttaccggctg ccagggctgg ctgaatgacc gctattccga cagcctgccg 120
ccgagctacg gcgtgcagcc gatcaagggc ctggccgaca acgtgtcgat ccgccgcaac 180
agcctgggca tgccgctgat cgagaccagc accttccacg acgcgctgtt caccctcggt 240
tatgtgcacg ccagcgaccg catcagccag atggtcggcc tgcgcctgat ggcccagggt 300
cgcctgtcgg aaatggtcgg ccccggcgcc ctggaaaccg accgattcat gcgcacggtg 360
aacctgaaga aggccgcgga cgccctctac gccggcgcct caccgcgcct caagcgtttc 420
ttcgagacct acgcgcgcgg cgtcaacgcc tacctgtacc gctaccgcga caagctgccg 480
atggacctcg ccgagtccgg ctaccgcccc gagtactgga agccggaaga ttccgcactg 540
gtcttcagcc tgctgaactt cggcctggcg gtgaacctgc aggaggaaat cgcctccctg 600
gtactggcgc agaaagtcgg tgccgacaag ctgccctggc tgacgccgat ctatccggac 660
gaagcgctgc cgttcgagga agcggacaaa ctcaagggcc tgcgcctgga cggcaggatc 720
gccggcctcg acgccctgga tcgtgcggca ggccaggtcg ccgccctgca gatgatgggc 780
gtcgccgcct ccaacaactg ggccatcgcc ccgcagcgca cgcgcagcgg caagagcatc 840
ctggccaacg acacccacct gccgctgtcc atgccctcgg tgtggaacta cgtgcagatc 900
cgctcgccga aatacaacgc cgcgggcgtc tccatcgccg gcgtaccggg cgtggtcgcc 960
ggtttcaacg gcaagctggc ctggggcatg accatggtca tgggcgacaa ccaggacctt 1020
ttccttgagc aggtgaagcc ccagggcggc aagctctact acctcgccga tggccagtgg 1080
aaaccggcca tcgagcgcaa tgaaaccttc ttcatcaagg gccagagccc ggtccgcgaa 1140
gtcatctacg agactcgcca cggcccgctg ctcaacagcg cgctgggcga gcgcaagcac 1200
gacctgcaac cgctgccgct gtccagcggc tacggcatcg cctaccagag catccagggc 1260
gagaccgacc gcaccctcga cgccttcttc gacctgtccc gcgcgaagaa cgtcgagcag 1320
gccttcgacg ccacccgcga cgtgcgcgcc atggcgctga acatcgtgtt cgccgacgag 1380
aagcacatcg gctggcaggt caccgggcgc ttccccaacc gcaaggaagg ccgcggcctg 1440
ctgccttcgc ccggctggga cggccgctat gactgggacg gctacgccga tccgatcctc 1500
cacccgtccg accaggaccc gcagcagggc tggctgggca ccgccaacca ccgcagcgtg 1560
cagccaggct acggcgcgca gctgtccagt tcctggtact acccggagcg ctacgagcgc 1620
atcgcccaac tcgccggcgg cagcaagagc cacgactacc gcagcatgat cgccatgcag 1680
tacgaccaga ccacgccctt tgccggcaag ctgcaggcca tgttcgatgc accgggcatg 1740
gcgcagccgc tgaagaaagc catcgacgcc ctgcccgccg accagcgcgc ccgcgcccgc 1800
gaagcgctgg accggatcat ggcgttcgac ggcaagctct cggcgacctc cggcgacgcc 1860
gccctgtacg aagccttcct gcaggagagc agcaagcaga tcttcctcga tgaactgggc 1920
ccggaggaca gcccgtcctg gaaagccttc gtcgagaccg ccaacctctc ctactcggcc 1980
caggccgacc acctgctggg ccgtgacgac agcccgttct gggatgacac ccgcaccccg 2040
cagaaggaag acaaaccgac catcctcgcc cgcagcctgg ccgccgccac cgccttctgc 2100
gaacagaagc tgggcagcga ccgccgtacc tggcagtggg gcaagctgca cacctacgag 2160
tgggtcagcg acagcaccaa gatggcgccc aacctcagtg ccggcgagcg cgccagcctc 2220
ggcgcgatca agggctacct ggaccgcggc ccctacccgg ccggcggcga ccacagcacg 2280
ctgaacgtct cggcctacca ctggggccag gacttcaaca cctggctgat cccggccatg 2340
cgcatcgtcg tcgacttcgg ccagagcgaa ccgatgatcg gccttaacag cagtggccag 2400
tccggcaacc cggccagccc gcactacgca gacggcatcg acgcctggct gaagggcaac 2460
tacatgagct tccccttcca gtcgcagaac cttgagaagg tctacggcgt gaagcgcctg 2520
acgctggtgc cggagaagtg a 2541
<210> 2
<211> 846
<212> PRT
<213> germ
<400> 2
Met Ala Pro Arg Ala Phe Arg Arg Leu Pro Ser Phe Gly Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Val Thr Ala Ala Val Ser Leu Thr Gly Cys Gln Gly Trp Leu Asn
20 25 30
Asp Arg Tyr Ser Asp Ser Leu Pro Pro Ser Tyr Gly Val Gln Pro Ile
35 40 45
Lys Gly Leu Ala Asp Asn Val Ser Ile Arg Arg Asn Ser Leu Gly Met
50 55 60
Pro Leu Ile Glu Thr Ser Thr Phe His Asp Ala Leu Phe Thr Leu Gly
65 70 75 80
Tyr Val His Ala Ser Asp Arg Ile Ser Gln Met Val Gly Leu Arg Leu
85 90 95
Met Ala Gln Gly Arg Leu Ser Glu Met Val Gly Pro Gly Ala Leu Glu
100 105 110
Thr Asp Arg Phe Met Arg Thr Val Asn Leu Lys Lys Ala Ala Asp Ala
115 120 125
Leu Tyr Ala Gly Ala Ser Pro Arg Leu Lys Arg Phe Phe Glu Thr Tyr
130 135 140
Ala Arg Gly Val Asn Ala Tyr Leu Tyr Arg Tyr Arg Asp Lys Leu Pro
145 150 155 160
Met Asp Leu Ala Glu Ser Gly Tyr Arg Pro Glu Tyr Trp Lys Pro Glu
165 170 175
Asp Ser Ala Leu Val Phe Ser Leu Leu Asn Phe Gly Leu Ala Val Asn
180 185 190
Leu Gln Glu Glu Ile Ala Ser Leu Val Leu Ala Gln Lys Val Gly Ala
195 200 205
Asp Lys Leu Pro Trp Leu Thr Pro Ile Tyr Pro Asp Glu Ala Leu Pro
210 215 220
Phe Glu Glu Ala Asp Lys Leu Lys Gly Leu Arg Leu Asp Gly Arg Ile
225 230 235 240
Ala Gly Leu Asp Ala Leu Asp Arg Ala Ala Gly Gln Val Ala Ala Leu
245 250 255
Gln Met Met Gly Val Ala Ala Ser Asn Asn Trp Ala Ile Ala Pro Gln
260 265 270
Arg Thr Arg Ser Gly Lys Ser Ile Leu Ala Asn Asp Thr His Leu Pro
275 280 285
Leu Ser Met Pro Ser Val Trp Asn Tyr Val Gln Ile Arg Ser Pro Lys
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Gly Val Ser Ile Ala Gly Val Pro Gly Val Val Ala
305 310 315 320
Gly Phe Asn Gly Lys Leu Ala Trp Gly Met Thr Met Val Met Gly Asp
325 330 335
Asn Gln Asp Leu Phe Leu Glu Gln Val Lys Pro Gln Gly Gly Lys Leu
340 345 350
Tyr Tyr Leu Ala Asp Gly Gln Trp Lys Pro Ala Ile Glu Arg Asn Glu
355 360 365
Thr Phe Phe Ile Lys Gly Gln Ser Pro Val Arg Glu Val Ile Tyr Glu
370 375 380
Thr Arg His Gly Pro Leu Leu Asn Ser Ala Leu Gly Glu Arg Lys His
385 390 395 400
Asp Leu Gln Pro Leu Pro Leu Ser Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Gln
405 410 415
Ser Ile Gln Gly Glu Thr Asp Arg Thr Leu Asp Ala Phe Phe Asp Leu
420 425 430
Ser Arg Ala Lys Asn Val Glu Gln Ala Phe Asp Ala Thr Arg Asp Val
435 440 445
Arg Ala Met Ala Leu Asn Ile Val Phe Ala Asp Glu Lys His Ile Gly
450 455 460
Trp Gln Val Thr Gly Arg Phe Pro Asn Arg Lys Glu Gly Arg Gly Leu
465 470 475 480
Leu Pro Ser Pro Gly Trp Asp Gly Arg Tyr Asp Trp Asp Gly Tyr Ala
485 490 495
Asp Pro Ile Leu His Pro Ser Asp Gln Asp Pro Gln Gln Gly Trp Leu
500 505 510
Gly Thr Ala Asn His Arg Ser Val Gln Pro Gly Tyr Gly Ala Gln Leu
515 520 525
Ser Ser Ser Trp Tyr Tyr Pro Glu Arg Tyr Glu Arg Ile Ala Gln Leu
530 535 540
Ala Gly Gly Ser Lys Ser His Asp Tyr Arg Ser Met Ile Ala Met Gln
545 550 555 560
Tyr Asp Gln Thr Thr Pro Phe Ala Gly Lys Leu Gln Ala Met Phe Asp
565 570 575
Ala Pro Gly Met Ala Gln Pro Leu Lys Lys Ala Ile Asp Ala Leu Pro
580 585 590
Ala Asp Gln Arg Ala Arg Ala Arg Glu Ala Leu Asp Arg Ile Met Ala
595 600 605
Phe Asp Gly Lys Leu Ser Ala Thr Ser Gly Asp Ala Ala Leu Tyr Glu
610 615 620
Ala Phe Leu Gln Glu Ser Ser Lys Gln Ile Phe Leu Asp Glu Leu Gly
625 630 635 640
Pro Glu Asp Ser Pro Ser Trp Lys Ala Phe Val Glu Thr Ala Asn Leu
645 650 655
Ser Tyr Ser Ala Gln Ala Asp His Leu Leu Gly Arg Asp Asp Ser Pro
660 665 670
Phe Trp Asp Asp Thr Arg Thr Pro Gln Lys Glu Asp Lys Pro Thr Ile
675 680 685
Leu Ala Arg Ser Leu Ala Ala Ala Thr Ala Phe Cys Glu Gln Lys Leu
690 695 700
Gly Ser Asp Arg Arg Thr Trp Gln Trp Gly Lys Leu His Thr Tyr Glu
705 710 715 720
Trp Val Ser Asp Ser Thr Lys Met Ala Pro Asn Leu Ser Ala Gly Glu
725 730 735
Arg Ala Ser Leu Gly Ala Ile Lys Gly Tyr Leu Asp Arg Gly Pro Tyr
740 745 750
Pro Ala Gly Gly Asp His Ser Thr Leu Asn Val Ser Ala Tyr His Trp
755 760 765
Gly Gln Asp Phe Asn Thr Trp Leu Ile Pro Ala Met Arg Ile Val Val
770 775 780
Asp Phe Gly Gln Ser Glu Pro Met Ile Gly Leu Asn Ser Ser Gly Gln
785 790 795 800
Ser Gly Asn Pro Ala Ser Pro His Tyr Ala Asp Gly Ile Asp Ala Trp
805 810 815
Leu Lys Gly Asn Tyr Met Ser Phe Pro Phe Gln Ser Gln Asn Leu Glu
820 825 830
Lys Val Tyr Gly Val Lys Arg Leu Thr Leu Val Pro Glu Lys
835 840 845
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> germ
<400> 3
gtcgacggta tcgataagct tttccgcgac cctctttgtg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> germ
<400> 4
cgctctagaa ctagtggatc ctcacttctc cggcaccagc 40
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> germ
<400> 5
gccatggctg atatcggatc catggccccg cgtgccttc 39
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> germ
<400> 6
ctcgagtgcg gccgcaagct ttcacttctc cggcaccagc 40

Claims (8)

1.一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因aigA，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.含有权利要求1所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因的重组载体。
3.含有权利要求2所述重组载体的重组菌。
4.一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.权利要求3所述重组菌，或者权利要求4所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶在降解AHLs信号分子中的应用，其特征在于，所述AHLs信号分子为C4-HSL、C6-SHL、3-O-C6-HSL、C8-HSL、3-OH-C8-HSL、C10-HSL、3-OH-C10-HSL、C12-HSL、3-O-C12-HSL、3-OH-C12-HSL、3-OH-C14-HSL。
6.权利要求1所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因，或者权利要求2所述重组载体，或者权利要求3所述重组菌，或者权利要求4所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶在防治依赖AHLs致病的病原菌中的应用，其特征在于，所述依赖AHLs致病的病原菌为洋葱伯克氏菌、铜绿假单胞菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，当利用权利要求1所述N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因时，是将N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶编码基因表达于依赖AHLs致病的病原菌中，筛选成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌；当利用权利要求2所述重组载体时，是将重组载体导入依赖AHLs致病的病原菌中，筛选成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌；当利用权利要求3所述重组菌时，是筛选成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，与野生型病原菌相比，所述成功表达N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶的重组病原菌：
（1）降低了AHLs的产量；和/或，
（2）降低了运动性；和/或，
（3）降低了生物膜的形成；和/或，
（4）减小了蛋白酶的生成量；和/或，
（5）削弱了致病力。
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