CN107312760B - 一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其药物 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种N‑酰基高丝氨酸内酯酶及其药物，所述N‑酰基高丝氨酸内酯酶氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的序列至少90％同源并且具有N‑酰基高丝氨酸内酯酶活性；还提供了一种编码所述酶的核苷酸序列、表达载体和异源表达菌株；所述药物能够治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染。所述N‑酰基高丝氨酸内酯酶通过催化N‑酰基高丝氨酸内酯的内酯键水解使铜绿假单胞菌之间的信号分子猝灭从而干扰和抑制群感效应；所述N‑酰基高丝氨酸内酯酶与其他N‑酰基高丝氨酸内酯酶相比具有更广泛的底物适应性和更高效的降解活性，使其在作为药物治疗铜绿假单胞菌感染的过程中具有更好的效果。

Description

一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其药物

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其药物。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性条件致病菌，广泛分布于自然界和医院环境中，且是医院内感染的重要病原菌之一。铜绿假单胞菌可以引起伤口、眼睛和肺部等一系列器官的感染，尤其是非特异性免疫力较低的人群更易感染。铜绿假单胞菌对抗生素具有高度的多重耐药性，往往引起难以治愈的严重感染，对于患者生命造成巨大威胁。铜绿杆菌产生绿脓菌素、分泌胞外蛋白酶和形成生物膜受到群感效应系统的调控，引起复杂的生物膜相关的铜绿假单胞菌感染和抗药性。因此抑制群感效应能够抑制铜绿假单胞菌的致病性。

通过亟需利用信号分子类似物或者信号分子降解酶对铜绿假单胞菌的群感效应进行干扰和破坏，为铜绿假单胞菌的感染提供新的药物。

发明内容

本公开的目的是提供一种具有群感猝灭作用的信号分子降解酶及其药物，从而抑制铜绿假单胞菌的致病性。

为了实现上述目的，本公开提供一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的序列至少90％同源并且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶。

本公开还提供了一种编码上述N-酰基高丝氨酸内酯酶的核苷酸序列。

本公开还提供了一种包含如上所述核苷酸序列的表达载体。

本公开还提供了一种表达如上所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的菌株，所述菌株中具有如上所述的表达载体。

本公开还提供了一种含有所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的药物，其特征在于，所述药物能够治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染。

通过上述技术方案，本公开所述N-酰基高丝氨酸内酯酶来源于保藏号为ACCC06121的华癸库特氏菌(Kurthia huakuii LAM0618)，发明人将所述N-酰基高丝氨酸内酯酶命名为AiiK。所述AiiK是首次在Kurthia属中发现，AiiK可以通过催化N-酰基高丝氨酸内酯的内酯键水解使铜绿假单胞菌之间的信号分子猝灭从而干扰和抑制群感效应。AiiK与其他N-酰基高丝氨酸内酯酶相比具有更广泛的底物适应性和更高效的降解活性，使其在作为药物治疗铜绿假单胞菌感染的过程中具有更好的效果。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是AiiK蛋白纯化效果分析图；其中M为蛋白质Marker，1为对照组超声破碎后上清，2为AiiK组超声破碎后沉淀，3为AiiK组超声破碎后上清，4为超滤后的AiiK蛋白。

图2是生物膜的吖啶橙染色后荧光显微镜观察图；其中左上角为加入0μg/mL的AiiK后生物膜的生长情况图，右上角为加入5μg/mL的AiiK后生物膜的生长情况图，下方为加入10μg/mL的AiiK后生物膜的生长情况图。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面提供了一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的序列至少90％同源并且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性。

通过上述技术方案，本公开所述N-酰基高丝氨酸内酯酶来源于保藏号为ACCC06121的华癸库特氏菌(Kurthia huakuii LAM0618)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。发明人将所述N-酰基高丝氨酸内酯酶命名为AiiK。所述AiiK是首次在Kurthia属中发现，AiiK可以通过催化N-酰基高丝氨酸内酯的内酯键水解使铜绿假单胞菌之间的信号分子猝灭从而干扰和抑制群感效应。AiiK与其他N-酰基高丝氨酸内酯酶相比具有更广泛的底物适应性和更高效的降解活性，使其在作为药物治疗铜绿假单胞菌感染的过程中具有更好的效果。

根据本公开第一方面，为了使所述N-酰基高丝氨酸内酯酶保持更好的活性与底物适应性，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的序列至少95％同源并且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性；优选地，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的序列至少98％同源并且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性。

本公开第二方面提供了一种编码如上所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的核苷酸序列。

根据本公开第二方面，为了获得更高的表达效率，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本公开第三方面提供了一种包含如上所述核苷酸序列的表达载体。

所述表达载体可以用于转入基因工程菌株中以便获得更高的AiiK表达量，使其可以被工业化生产与利用。

根据本公开第三方面，为了使所述表达载体具有较高的表达效率，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述载体为pET32a。

本公开第四方面提供了一种表达如上所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的菌株，所述菌株中具有如上所述的表达载体。所述菌株可以本领域技术人员常规使用的各种适用于表达异源蛋白的菌株，例如酿酒酵母、大肠杆菌，本公开对此没有特别的限制。

根据本公开第四方面，为了使所述AiiK具有较高的表达效率，在使用SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与pET32a载体进行转化获得较好的表达效果时，所述菌株可以为大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)菌株。

本公开第五方面提供了一种含有如上所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的药物，所述药物能够治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染。

根据本公开第五方面，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶对于铜绿假单胞菌的群感猝灭具有良好的效果；所述药物用于治疗铜绿假单胞菌时需将所述药物与铜绿假单胞菌直接接触。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

本实施例用于说明AiiK蛋白的纯化过程。

以保藏号为ACCC 06121的华癸库特氏菌DNA为扩增模板，使用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对进行扩增得到扩增产物；使用EcoRI和HindⅢ内切酶对扩增产物进行酶切并克隆至表达载体pET32a中，得到pET32a-aiiK原核表达质粒；将上述pET32a-aiiK原核表达质粒导入大肠杆菌BL21细胞中，得到E.coli BL21/pET32a-aiiK原核表达菌株。

将所述E.coli BL21/pET32a-aiiK原核表达菌株于LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中37℃、180r/min条件下振荡培养至OD₆₀₀≈0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃、120r/min条件下继续培养12h获得培养产物。对照组为E.coli BL21/pET32a原核表达菌株同样条件下培养12h获得的培养产物；非变性条件下纯化所述培养产物获得AiiK蛋白。

非变性条件下6×His标签重组AiiK蛋白的纯化方法参考QIAexpress Ni-NTAFast Start Handbook手册操作，利用Ni-NTA柱亲和纯化蛋白，洗脱液经10mM PBS(pH7.5)缓冲液反复超滤，脱盐和除去咪唑。SDS-PAGE电泳分析AiiK蛋白纯化结果。

经图1中对照组超声破碎后的上清液、AiiK组超声破碎后沉淀、AiiK组超声破碎后的上清液与纯化后的AiiK酶液比较可以看出目的蛋白AiiK已经纯化成功。

实施例2

本实施例测定25℃时AiiK的酶活力。

本实施例中以N-癸酰基高丝氨酸内酯(C₁₀-HSL)为底物测定酶活力。按反应体系(N-HSL 2.5μL，AiiK的终浓度4μg/mL，加10mM PBS到总体积500μL)将各成分加入2mL离心管混匀，于25℃反应10min，空白对照组以10mM PBS代替AiiK蛋白，反应完后向所述离心管中立即加入体积55.5μL浓度为20％的SDS(终浓度为2％)终止反应；向所述离心管中加乙酸乙酯漩涡萃取反应产物，萃取的反应产物在流氮下浓缩吹干，再复溶于甲醇，过0.22μm的滤膜后HPLC测定C₁₀-HSL的含量并计算酶活力。酶活力单位(U)为每分钟降解1μmol C₁₀-HSL所需的酶量。

经测定发现25℃时，经纯化的AiiK蛋白的比酶活为0.35U/mg。

实施例3

本实施例测定以及温度和其他酶对于AiiK酶活力的影响。

按照实施例2中所述的方法分别测定AiiK在37℃和45℃保温2h、4h、6h、12h、24h、36h后的酶活(以0h时的酶活为100％计)，具体结果见表1。

按照实施例2中所述的方法分别测定糜蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K分别处理AiiK蛋白30min、60min时对于AiiK酶活力的影响。对照组使用以10mM PBS代替糜蛋白酶并将酶活力计为100％。具体结果见表2。

表1

0h

1h

2h

4h

6h

12h

24h

36h

48h

37℃

100.0％

95.0％

89.6％

84.8％

54.6％

52.4％

20.4％

15.4％

8.9％

45℃

100.0％

93.4％

86.0％

83.8％

52.9％

40.4％

14.9％

10.5％

10.1％

表2

	PBS	糜蛋白酶	胰蛋白酶	蛋白酶K
					30min	100.0％	87.3％	103.3％	102.4％
60min	100.0％	101.3％	109.1％	108.1％

表1中AiiK蛋白于37℃和45℃条件下保温2h时，酶活都保持在86％以上，6h时酶活保持在52％以上，24h时酶活保持在14％以上；表2中，AiiK在糜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的作用下酶活力稳定性良好，只有在在糜蛋白酶处理30min时，AiiK活性下降了13％，其他条件下AiiK活性都有升高，同时在同一蛋白酶处理60min后的AiiK活性比处理30min的高。本公开中所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶在所测试的温度与所测试的其他酶的影响下具有良好的稳定性。

实施例4

本实施例用于测定AiiK对于铜绿假单胞菌生物膜形成的影响。

先将铜绿假单胞菌菌株PAO1预培养于TSB培养基并在37℃、150rpm条件下过夜培养，然后离心收集菌体并用无菌10mM PBS漂洗3次，接着将菌体悬浮于M9培养基使菌体密度达到OD₆₀₀≈0.2；将悬浮物分别与0μg/mL、5μg/mL或10μg/mL AiiK混合得到PAO1细胞/AiiK混合培养物。

取200μL PAO1细胞/AiiK混合培养物加入96孔板中于37℃静置培养24h。培养完全后吸取悬浮细胞测定OD₆₀₀(游离细胞数量)，同时将96孔板底部中的细胞用20μL浓度为0.2％的结晶紫染色15min，后用无菌水清洗细胞3次，观察PAO1生物膜的完整程度。最后加入100μL浓度为95％的乙醇萃取剩余结晶紫并测定OD₅₉₀(形成生物膜的细胞数量)，具体结果见表3。

另取2mL PAO1细胞/AiiK混合培养物加入无菌PA瓶中，并在PA瓶中放入无菌的5×5mm载玻片，后将PA瓶置于37℃静置培养24h。最后取出载玻片用浓度为0.1％吖啶橙染色2.5min后置于荧光显微镜(激发光490nm，发射光525nm)下观察生物膜细胞的紧密程度，具体结果见图1。

表3

	0μg/mL AiiK	5μg/mL AiiK	10μg/mL AiiK
				游离细胞数量(OD<sub>600</sub>)	0.53	0.48	0.54
生物膜细胞数量(OD<sub>590</sub>)	0.91	0.62	0.54

经表3中各浓度AiiK下生物膜细胞数量的比较可以看出，随着AiiK使用量的增多对于PAO1生物膜的形成越来越差，添加10μg/mL AiiK对于PAO1生物膜形成的抑制率达到40％左右，并且经图1中各生物膜比较可以看出添加10μg/mL AiiK使PAO1的生物膜细胞的数量和紧致程度都明显降低，并且生物膜的完整度下降。AiiK具有使铜绿假单胞菌之间的信号分子猝灭从而干扰和抑制群感效应，最终导致PAO1致病性和生物膜抗药性降低。

实施例5

本实施例用于测定AiiK对PAO1胞外蛋白酶水解活性的影响。

将PAO1菌株分别接种于含有分别与0μg/mL、5μg/mL或10μg/mL AiiK的PB培养基中，并于37℃、150rpm条件下培养24h；测定培养物在590nm处的吸光值。离心培养物获得上清液检测PAO1胞外蛋白酶水解活性；所述检测PAO1胞外蛋白酶水解活性的反应体系包含150μL上清液、250μL浓度为2％偶氮酪蛋白溶液，将所述反应体系于37℃反应30min，然后加1.2mL浓度为10％三氯乙酸终止反应；离心反应产物获得的1.2mL上清液，将所述上清液和1.2mL浓度为1M的NaOH混匀后测定440nm处吸光值。以OD₄₁₅/OD₅₉₀表示PAO1胞外蛋白酶水解活性。

以加入0μg/mL AiiK的组为对照组，其PAO1胞外蛋白水解酶的活性计为100％，加入5μg/mL AiiK的组PAO1胞外蛋白水解酶的活性为79％，加入5μg/mL AiiK的组PAO1胞外蛋白水解酶的活性为52.7％。胞外蛋白水解酶持续作用造成患处的溃烂、阻止患处的愈合，AiiK可以显著抑制PAO1胞外蛋白水解酶的活性，使其生物膜的形成受阻，抑制PAO1的致病性。

实施例6

本实施例用于测定AiiK对PAO1绿脓菌素产生的影响。

分别接种PAO1在加入0μg/mL、5μg/mL或10μg/mL AiiK的PB培养基中，并在37℃、150rpm条件下培养18h。离心所述培养产物得到上清液，将5mL的上清液与3mL氯仿混匀后再加入1mL浓度为0.2M的HCl反萃取得到萃取产物。测定萃取产物在520nm处的吸光值，绿脓菌素的浓度表示为OD₅₂₀×17.072，具体结果见表4。

表4

AiiK使用量(μg/mL)	OD<sub>520</sub>	绿脓菌素产量(μg/mL)
			0	0.223±0.013	3.807±0.222
5	0.207±0.011	3.534±0.188
			10	0.064±0.007	1.092±0.120

经表4中各组比较可以看出，AiiK能够抑制绿脓菌素的合成显示AiiK抑制了PAO1的群感效应，使其绿脓菌素的表达量下降。

AiiK可以使铜绿假单胞菌之间的信号分子猝灭从而干扰和抑制群感效应。AiiK与其他N-酰基高丝氨酸内酯酶相比具有更广泛的底物适应性和更高效的降解活性，使其在作为药物治疗铜绿假单胞菌感染的过程中能够有更好的效果。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 一种N-酰基高丝氨酸內酯酶及其药物

<130> 1537CAAS

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 278

<212> PRT

<213> Kurthia huakuii

<400> 1

Met Cys Gln Asn Lys Lys Leu Tyr Val Leu Asp Thr Gly Thr Met Lys

1 5 10 15

Met Asp Lys Asn Tyr Met Ile Ala Met His Asn Pro Ala Thr Ile Asp

20 25 30

Ala Pro Thr Lys Pro Ala Glu Phe Val Glu Phe Pro Val Tyr Ala Val

35 40 45

Leu Ile Asp His Pro Glu Gly Lys Ile Leu Phe Asp Thr Gly Cys Asn

50 55 60

Pro Asp Ser Met Asn Glu Asp Gly Pro Trp Pro Glu Gly Ile Arg Arg

65 70 75 80

Ala Phe Pro Thr Phe Ala Thr Glu Glu Cys Tyr Leu Ile Asn Arg Leu

85 90 95

Glu Gln Leu Lys Val Arg Pro Glu Asp Ile Lys Tyr Val Val Ala Ser

100 105 110

His Leu His Leu Asp His Ala Gly Cys Leu Glu Leu Phe Thr Asn Ala

115 120 125

Glu Ile Ile Val His Asp Ala Glu Leu Ala Ser Val Met Lys Ser Phe

130 135 140

Ala Met Thr Arg Asp Met Gly Ala Tyr Ile Trp Ala Asp Val Met Ser

145 150 155 160

Trp Val Gln Lys Gln Leu Arg Trp Arg Thr Val Lys Val Trp Gln Lys

165 170 175

Glu Leu Gln Leu Val Glu Gly Ile Lys Ile Ile Asn Phe Gly Pro Gly

180 185 190

His Ala Tyr Gly Met Leu Gly Leu His Val Glu Leu Pro Gly Tyr Gly

195 200 205

Asn Val Leu Leu Ala Ser Asp Ala Val Tyr Thr Lys Glu Ser Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Ile Lys Pro Pro Gly Ile Leu Tyr Asp Ser Val Gly Tyr Asn

225 230 235 240

Gln Thr Val Glu Arg Ile His Gln Phe Ala His Glu His Lys Ser Glu

245 250 255

Val Trp Phe Gly His Asp Ala Glu Gln Phe Lys Ser Phe Arg Lys Ser

260 265 270

Thr Glu Gly Tyr Tyr Glu

275

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> Kurthia huakuii

<400> 2

atgtgtcaaa ataaaaagtt gtacgtatta gatacaggga cgatgaaaat ggacaaaaat 60

tacatgattg cgatgcataa tccagcaaca attgatgcac ctacaaagcc agcagaattt 120

gtagaatttc cggtttacgc tgtactaatc gatcatccag aagggaaaat tttgtttgat 180

acagggtgta atcccgacag tatgaatgag gatggaccat ggccagaggg gatacgacgt 240

gcgtttccga catttgcgac agaggaatgt tatttaatta atcgtttaga acaactaaag 300

gtgcggccag aggatattaa gtatgtcgta gcatcgcatt tgcatttgga ccatgcgggt 360

tgtttagagt tatttacgaa tgctgaaatt atcgtccatg acgcagaact tgcgagtgtg 420

atgaaatctt ttgcgatgac gcgagatatg ggggcgtata tttgggcaga cgtcatgagt 480

tgggtacaaa aacaattgcg ctggcgcacg gttaaggtgt ggcaaaaaga actacagctt 540

gtcgaaggca ttaaaattat taactttgga ccgggccacg cgtatggtat gttagggctg 600

catgtagagt taccgggata tggtaacgtg ctcctcgcgt ccgatgcggt ttacacaaaa 660

gagtcgtatg gaccgccaat taagccgccg ggtattttgt atgactcggt tggttacaat 720

caaacggttg aacgtattca tcaatttgca cacgagcata agagtgaagt ttggtttggg 780

cacgatgctg agcaatttaa atcgtttaga aaatcaacgg aagggtatta cgaataa 837

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Seqence

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 3

ccggaattca tgtgtcaaaa taaaaagttg tac 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 4

cccaagcttt tattcgtaat acccttccgt tga 33

Claims (2)

1.一种含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N-酰基高丝氨酸内酯酶的药物，其特征在于，所述药物能够治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染。

2.根据权利要求1所述的药物，其中，所述药物用于治疗铜绿假单胞菌时需将所述药物与铜绿假单胞菌直接接触。

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