CN116218824A - 一种具有分泌n-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的重组工程菌的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PvdQ重组工程菌的制备方法，PvdQ重组工程菌能够分泌N‑酰基高丝氨酸内酯酰化酶，具体包括如下步骤：S1：构建包含PvdQ基因的重组表达载体pET‑PvdQ；S2：将重组表达载体pET‑PvdQ转化大肠埃希氏菌BL21中得到PvdQ重组工程菌。本发明制备的重组工程菌能够高效分泌PvdQ酰化酶，该酰化酶能够抑制微生物群体感应（QS）系统，不仅能够控制细菌生物膜污染，还避免了致病菌耐药性的形成。
Description
技术领域
本发明涉及工程菌的基因改造领域，尤其涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶PvdQ重组工程菌的制备方法及应用。
背景技术
生物膜代表一种具有高度组织水平的生物系统，其中的微生物形成结构化、协调性和功能性的群落，使大多数微生物病原体对常用的抗生素和消毒剂具有抗性。众所周知，抗生素过度使用会对微生物带来选择压力，造成微生物耐药性的发展。在大多数情况下，生物膜使微生物引发的疾病状况恶化，据研究，生物膜状态细菌对抗生素的抗性是浮游状态的1000倍。可见，细菌疾病的感染以及耐药性的发展与生物膜形成问题密切相关，因此，需要新的抗生素替代策略控制生物膜污染。
为了形成生物膜这一协调合作的群体行为，细菌共享基于种群密度的细胞间信号传导机制，称为群体感应(QS)。QS作为微生物的细胞间通讯系统，通过统称为自诱导剂的信号分子来调节和监测种群密度的变化，这些信号分子在环境中局部积累，然后在达到适当的阈值浓度后，与受体蛋白相互作用并触发QS相关基因和性状的表达，包括酰基高丝氨酸内酯(Acyl Homoserine Lactone，AHL)、自诱导肽(AIP)或自诱导肽2(AI-2)，其中AHL信号分子介导的QS系统主要调控革兰氏阴性细菌性状。
因此，任何可以干扰或抑制细菌QS系统正常运转的方法都有可能被用作抗生素替代策略。QS抑制又被称为群体淬灭(Quorum Quenching,QQ)，通常包括抑制QS信号的产生、传递和识别，或使用酶降解QS信号。例如，一些被称为“群体淬灭菌”的细菌产生的酶降解AHL信号是实现QS抑制的最有效的策略之一。关于AHL的降解有两种不同的酶促机制：AHL-内酯酶裂解内酯环和AHL-酰化酶裂解酰胺键。AHL-酰化酶的反应产物可以被微生物用作碳和氮源，并且不能自发地形成功能性QS信号。此外，QQ酶本身不会杀死细菌，而是以QQ的方式抑制病原菌毒力因子的分泌，避免了细菌耐药性的产生。研究表明，一些细菌产生具有降解AHL能力的酶可用于控制和治疗人类以及农业和水产养殖中的细菌生物膜污染，包括aiiA内酯酶、AIIO-AIO6酰化酶。然而，对重组PvdQ酰化酶的QQ活性以及重组PvdQ工程菌在细菌生物膜污染方面的应用潜力了解较少。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶PvdQ重组工程菌的制备方法及其对生物膜抑制活性的检测，该制备方法能够重组PvdQ降解酶基因，重组后的PvdQ工程菌对铜绿假单胞菌和膜生物反应器中污泥细菌的生物膜的生长具有显著抑制作用。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种PvdQ重组工程菌的制备方法，PvdQ重组工程菌能够分泌N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶，具体包括如下步骤：
S1：构建包含PvdQ基因的重组表达载体pET-PvdQ；
S2：将重组表达载体pET-PvdQ转化大肠埃希氏菌BL21中得到PvdQ重组工程菌；
优选地，步骤S1具体又包括如下步骤：
S11：将铜绿假单胞菌接菌至LB培养基中，30℃培养12h；
S12：提取铜绿假单胞菌的基因组作为目的基因扩增模板，对重组前的PvdQ进行PCR扩增；
S13：对PCR扩增产物进行回收、纯化；
S14：用限制性内切酶BamH I、Hind III分别双酶切纯化后的PCR扩增产物和载体pET-28a(+)；
S15：将双酶切产物和载体骨架连接，得到重组表达载体pET-PvdQ。
优选地，PCR引物序列如下，下划线代表酶切位点：
PvdQ-F:GCGGATCCATGGGGATGCGTACCGTACTGAC；
PvdQ-R:GCAAGCTTGTTCGCGAATGCTTAGCCGTTGCA。
优选地，步骤S2具体包括如下步骤：
S21：取大肠杆菌感受态细胞冰上溶解，将所述重组表达载体pET-PvdQ加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上静置一段时间，然后42℃水浴一段时间，再冰上静置一段时间，然后加入无菌SOC培养基于一定温度的培养箱中振荡活化一段时间；
S22：取适量活化后的重组菌液涂布于含有X-Gal、Kan和IPTG的固体LB培养基中培养，挑取阳性单克隆工程菌进行测序，测序正确的工程菌即为PvdQ重组工程菌。
本发明还提供了一种PvdQ重组工程菌，采用上述制备方法制备。
本发明还提供了一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的制备方法，具体包括如下步骤：
S3：将PvdQ重组工程菌接种到培养基中培养，所述PvdQ重组工程菌采用上述制备方法进行制备。
优选地，所述步骤S3具体包括如下步骤：
S31：将PvdQ重组工程菌接种于IPTG诱导LB培养基增殖液体中培养；
S32：通过离心超声破碎获得重组蛋白PvdQ，即得到含N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的粗蛋白。
优选地，所述制备方法还包括步骤S4，对粗蛋白进行纯化，具体包括如下步骤：S41：在Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠中加入一定体积的Washing buffer，并洗涤磁珠至少三遍，弃去上清液；
S42：加入适量PvdQ酰化酶与Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠室温结合一段时间，再用Washing buffer洗涤三次并弃去上清液；
S43：向步骤S42得到的产物加入一定量的Elution buffer并收集上清液，即获得纯化后的PvdQ酰化酶。
本发明提供了一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶，采用上述制备方法制备。
本发明提供了一种PvdQ重组工程菌在抑制致病菌生物膜中的应用，其特征在于，所述PvdQ重组工程菌采用上述制备方法制备。
本发明提供了一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶在抑制致病菌生物膜中的应用，其特征在于，所述N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶采用上述N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用大肠杆菌重组了PvdQ基因，构建了PvdQ重组工程菌，构建的重组工程菌能够分泌N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶，N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶能够抑制致病菌的生物膜的形成，进而能够避免致病菌耐药性的产生。
附图说明
图1是本发明的PvdQ基因扩增电泳分析图；
图2是本发明的PvdQ蛋白酶电泳分析图和Western Blot实验结果图；
图3是对重组工程菌的活性验证图；
图4是重组工程菌对致病菌的活动性抑制作用的实拍图和显微图；
图5是重组工程菌对致病菌的生物膜的抑制情况对比图。
图6是重组工程菌对膜生物反应器(MBR)中的细菌生物膜的抑制情况对比图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。
实施例一
一种PvdQ重组工程菌的制备方法，PvdQ重组工程菌能够分泌N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶，具体包括如下步骤：
S1：构建包含PvdQ基因的大肠杆菌重组表达载体pET-PvdQ，重组前的PvdQ基因序列从NCBI GenBank中获取，参考序列号为ID:NC002516.2；
S2：将重组表达载体pET-PvdQ转化到大肠埃希氏菌(DE3)中，得到PvdQ重组工程菌。
步骤S1具体又包括如下步骤：
S11：将铜绿假单胞菌接菌至LB培养基中，30℃培养12h；
S12：提取铜绿假单胞菌的基因组作为扩增模板，用PvdQ-F和PvdQ-R组成的引物对重组前的PvdQ基因进行PCR扩增；铜绿假单胞菌购自广东环凯微生物科技有限公司，菌株编号FSCC206001；
S13：对PCR扩增产物进行纯化回收；
S14：用限制性内切酶BamH I、Hind III分别双酶切纯化后的PCR扩增产物和载体pET-28a(+)；
S15：将双酶切并纯化回收后的PvdQ基因和pET-28a载体骨架连接，得到重组表达载体pET-PvdQ。
PCR引物序列如下：
PvdQ-F:GCGGATCCATGGGGATGCGTACCGTACTGAC；
PvdQ-R:GCAAGCTTGTTCGCGAATGCTTAGCCGTTGCA；
下划线位置为酶切点。
步骤S2具体包括如下步骤：
S21：取100ul大肠杆菌感受态细胞(DE3)冰上溶解，取10ul重组表达载体pET-PvdQ加入DE3中轻轻混匀，冰上静置30min，然后42℃水浴90s，再立即冰上静置3min，然后加入800ul无菌SOC培养基于37℃培养箱振荡活化1h。S22：取适量活化后的重组菌液涂布于含有X-Gal(20mg·mL-1)、Kan(30mg·mL-1)和IPTG(0.1mM)的固体LB培养基中37℃培养24h，挑取阳性单克隆(白色菌斑，图1中的B图)往上海生工生物工程有限公司测序，将测序序列进行BLAST基因比对，比对正确说明重组表达载体pET-PvdQ构建完成并成功导入了大肠杆菌体内，将验证正确的重组工程菌命名为pET-PvdQ。如图1中的A图所示，经PCR扩增后在1％琼脂糖凝胶电泳上观察到2280bp处有清晰可见的亮带，即为PvdQ目的基因扩增条带。
如图1中的B图所示，将重组表达载体pET-PvdQ热击转化大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经蓝白斑筛选及基因组测序鉴定得到PvdQ重组工程菌。
实施例二该实施例是采用实施例一中的PvdQ重组工程菌制备N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶，采用以下步骤：
S3：将得到的PvdQ重组工程菌进行扩培，培养过程中采用IPTG诱导LB培养基培养，一方面能够实现PvdQ重组工程菌的扩培，另一方面在PvdQ重组工程菌生长的过程中分泌N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶。
步骤S3具体又包括如下步骤：
S31：将重组工程菌接种于0.1mM IPTG诱导LB培养基增殖液体中培养，温度为37℃，220rpm振摇培养过夜；
S32：通过离心超声破碎获得重组蛋白PvdQ，即得到含N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的粗蛋白。具体地，超声破碎菌体，每次4s，间歇10s，功率40～50％，持续50min至澄清，利用SDS-PAGE蛋白电泳以蛋白标准Marker为参照，对全蛋白表达量进行定量。
所述制备方法还包括以下步骤：
S4：利用Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠对步骤S3得到的N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶PvdQ进行纯化，具体包括如下步骤：
S41：在磁珠中共加入2-3倍柱体积的Washing buffer(WB)，洗涤并弃去过柱液体；加入适量PvdQ酰化酶与磁珠室温结合1-2h，再用2-3倍柱体积的Washing buffer(WB)洗涤三次并弃去过柱液体，其中，Washing buffer(WB):20mmol/LTris-HCl(pH 8.0)、150mmol/LNaCl、30mmol/L咪唑。
S42：最后向层析柱中加入适量的Elution buffer(EB)并收集过柱液体，即获得纯化后的PvdQ酰化酶，其中，Elution buffer(EB)：20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、150mmol/LNaCl、300mmol/L咪唑。
实施例三
该实施例用于对实施例一中得到的PvdQ重组工程菌进行蛋白表达情况分析。分别对载体pET-28a、N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶PvdQ重组工程菌进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，将得到的泳道1和泳道2进行对比并结合蛋白标准Marker分析得到箭头所指位置为目的蛋白条带，在84KDa大小处观察到明显的粗带，蛋白电泳结果符合预期，如图2中的A图所示。
对纯化后的PvdQ酰化酶进行Western Blot实验：转膜条件为150V、150min，冰浴，一抗(Anti-6×His Tag mouse monoclonal antibody)4℃孵育过夜，二抗(HRP-conjugated Rabbit anti-mouse IgG)室温孵育2h，EasyBlot ECL kit进行显色反应，得到图2中的B图所示的图像，可以看出在84KDa大小处获得明显的粗带，实验结果正确，表明重组PvdQ蛋白在大肠杆菌体内获得到高效表达。
利用BCA Protein Assay Kit试剂盒检测PvdQ蛋白酶浓度，蛋白浓度标准曲线公式为:y＝0.5717x-0.0052，R2＝0.9998；测得纯化后的PvdQ蛋白酶浓度可达2.87mg/ml。
实施例四
该实施例用于对实施例中得到的N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的活性进行验证。如图3所示，实验分为五组，采用含X-Gal的Agrobacterium tumefaciens A136菌液作为检测AHLs的指示菌，第1组仅包含A136菌液，第2组包含A136菌液+C12-HSL，第3组包含A136菌液+E.coli-pET-28a，第4组包含A136菌液+重组工程菌，第5组包含A136菌液+C12-HSL+重组工程菌，将上述五组实验菌液放到同样的环境中一段时间，发现：第1组为A136菌液本身的颜色(浅黄色)；第2组为A136菌液遇到C12-HSL显现的颜色，颜色为较深的蓝色；第3组中为A136菌液遇到E.coli-pET-28a菌液的颜色，为较浅的蓝色；第4组为与第1组相同的颜色；第5组为与第1组相同的颜色。A.tumefaciens菌用于AHL信号分子的检测。AHL在这里作为信号分子，诱导在A136菌中的β-半乳糖苷酶基因表达，当β-半乳糖苷酶酶作用于其底物X-Gal时，它会产生绿色，进而判断环境中AHL信号分子的存在。从图中对比分析可以看出，在仅含有外源性C12-HSL的孔观察到其颜色从浅黄色变为较深的蓝绿色；仅含有pET-28a质粒的E.coli菌作为革兰氏阴性菌本身产生少量AHL，导致孔中液体呈现较浅的蓝色；而经过改造后含有pET-PvdQ质粒的E.coli工程菌拥有了AHL降解活性，并将其周围的AHL降解，液体不再呈现出蓝色；并且，对比观察第2、5组可以看出，重组工程菌能够将C12-HSL完全降解，使得液体不再呈现出蓝绿色，说明重组工程菌具有高效的AHL降解活性。
实施例五
该实施例是对N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶对致病菌的运动附着的抑制作用进行的验证。
如图4中的A排所示，实验分为四组，所述其生物膜形成模式细菌采用铜绿假单胞菌PAO1，先将一定量纯化后得到的PvdQ酰化酶分别均匀涂板到四个琼脂培养皿(60mm)上，然后往不同的琼脂平板中心点样铜绿假单胞菌PAO1的菌液，第1组的重组PvdQ酰化酶的浓度为0，第2组的PvdQ酰化酶的浓度为0.1mg/ml，第3组的PvdQ酰化酶的浓度为0.3mg/ml，第4组的PvdQ酰化酶的浓度为0.5mg/ml。图4中A排是24h后铜绿假单胞菌PAO1的长势图。
如图4中的B排所示，根据所述工程菌株对PAO1生物膜形成的显微分析：在添加不同浓度降解酶(0，0.1，0.3和0.5mg/mL)的四组6孔板中，每个孔含有1×1cm的盖玻片。将铜绿假单胞菌PAO1接种进去，37℃孵育24h。然后，用蒸馏水仔细清洗盖板玻璃，并用0.1％(m/v)结晶紫染色，使用光学显微镜600倍(40×)下观察生物膜附着情况。图3中B排是对应的是铜绿假单胞菌生物膜附着的光学显微镜图片，可以看出，随着重组PvdQ酰化酶浓度的增加，铜绿假单胞菌PAO1的表面覆盖率有着明显的下降，即PvdQ酰化酶的浓度越高，对铜绿假单胞菌PAO1的生物膜附着抑制效果就越好。
实施例六
在96微孔板中通过结晶紫染色法测定了不同细胞比例(1：1、1:2、1：3)的重组PvdQ菌株对铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成量(Biofilm formation index，BFI)的影响。如图5所示，与PAO1纯培养(PAO1 Cells)和添加转化pET-28a空载的大肠杆菌(E.coli Cells)对照相比，添加重组PvdQ菌株组(PvdQ Cells)显著抑制了PAO1生物膜形成，并表现出细胞密度依赖性；此外，经过细胞破碎获得的PvdQ蛋白上清液对PAO1生物膜形成也表现出浓度依赖的显著抑制作用。总体而言，PvdQ工程菌株对PAO1生物膜形成观察到约51％～75％的抑制(p<0.05)。在96微孔板中通过结晶紫染色法测定了不同细胞比例(1：1、1:3、1：5)的重组PvdQ菌株对MBR反应器中好氧活性污泥细菌生物膜形成量(Biofilm formation index，BFI)的影响。如图6所示，与原始污泥细菌组和添加转化pET-28a空载的大肠杆菌(E.coliCells)对照组相比，添加重组PvdQ菌株组(PvdQ Cells)显著抑制了PAO1生物膜形成，并在细胞浓度比为1:3时表现出显著的抑制效果。总体而言，PvdQ工程菌对MBR反应器中好氧活性污泥细菌生物膜形成量观察到约42％～85％的抑制(p<0.05)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一种PvdQ重组工程菌的制备方法，PvdQ重组工程菌能够分泌N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶，具体包括如下步骤：
S1：构建包含PvdQ基因的重组表达载体pET-PvdQ；
S2：将重组表达载体pET-PvdQ转化到大肠埃希氏菌BL21中，得到PvdQ重组工程菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1具体又包括如下步骤：
S11：将铜绿假单胞菌接菌至LB培养基中，30 ℃培养12h；
S12：提取铜绿假单胞菌的基因组作为目的基因扩增模板，对重组前的PvdQ进行PCR扩增；
S13：对PCR扩增产物进行回收、纯化；
S14：用限制性内切酶BamH I、Hind III分别双酶切纯化后的PCR扩增产物和载体pET- 28a ( + )；
S15：将双酶切产物和载体骨架连接，得到重组表达载体pET-PvdQ。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PCR引物序列如下，下划线代表酶切位点：
PvdQ-F:GCGGATCCATGGGGATGCGTACCGTACTGAC；
PvdQ-R:GCAAGCTTGTTCGCGAATGCTTAGCCGTTGCA。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括如下步骤：
S21：取大肠杆菌感受态细胞冰上溶解，将所述重组表达载体pET-PvdQ加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上静置一段时间，然后42℃水浴一段时间，再冰上静置一段时间，然后加入无菌SOC培养基于一定温度的培养箱中振荡活化一段时间；
S22：取适量活化后的重组菌液涂布于含有X-Gal、Kan和 IPTG的固体LB培养基中培养，挑取阳性单克隆工程菌进行测序，测序正确的工程菌即为PvdQ重组工程菌。
5.一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S3：将PvdQ重组工程菌接种到培养基中培养，所述PvdQ重组工程菌采用权利要求1-4任一项所述的制备方法制备。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括如下步骤：
S31：将PvdQ重组工程菌接种于IPTG诱导LB培养基增殖液体中培养；
S32：通过离心超声破碎获得重组蛋白PvdQ，即得到含N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的粗蛋白。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤S4，对粗蛋白进行纯化，具体包括如下步骤：
S41：在Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠中加入一定体积的Washing buffer，清洗磁珠并弃去上清液；
S42：向清洗后的Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠中加入所述粗蛋白并在室温下结合一段时间，再用Washing buffer洗涤三次并弃去上清液；
S43：向步骤S42得到的产物加入一定量的 Elution buffer并收集上清液，即获得纯化后的PvdQ酰化酶。
8.一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶，采用权利要求5-7任一项所述的制备方法制备。
9.一种PvdQ重组工程菌在抑制致病菌生物膜中的应用，其特征在于，所述PvdQ重组工程菌采用权利要求1-4任一项所述的制备方法制备。
10.一种N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶在抑制致病菌生物膜中的应用，其特征在于，所述N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶采用权利要求8所述的N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶。
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