CN108483643A - 一种厌氧氨氧化反应器及其启动方法和运行方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例涉及一种厌氧氨氧化反应器的启动方法，包括以下步骤：S1：厌氧氨氧化反应器接种厌氧氨氧化污泥；S2：厌氧氨氧化反应器中加入能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌；S3：厌氧氨氧化反应器进水。本发明实施例通过少量培养基因工程菌即可获得大量信号分子，大大降低成本；实施方法简单，可实现厌氧氨氧化反应器的快速启动；反应器运行过程中持续供给信号分子，使得信号分子AHLs能够应用于实际水处理工程。

Description

一种厌氧氨氧化反应器及其启动方法和运行方法

技术领域

本发明属于水处理技术领域，具体涉及一种厌氧氨氧化反应器及其启动方法和运行方法。

背景技术

厌氧氨氧化是一种高效节能的脱氮水处理工艺，该工艺直接将亚硝氮和氨氮在厌氧条件下转化为氮气。该工艺能够缩短硝化进程，更高效的进行氮脱除，且无需外加碳源，能够减少剩余污泥产生量和温室气体排放量。但是，厌氧氨氧化菌群生长缓慢，对环境波动敏感，导致厌氧氨氧化反应器启动时间过长，这一影响工艺应用的瓶颈问题有待解决，为此，现有技术中，有研究利用细菌的交流机制来快速启动厌氧氨氧化反应器。

细菌的交流是指细菌之间会通过特殊的信号分子进行交流从而表达一些在群体规模才会发生的生物特征，如加快细菌生长及生物膜形成。信号分子能作用于关键的基因，从而激活整个菌群的一些特殊生理行为。高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)由一个高丝氨酸内酯环和不同碳链长度的酰基侧链构成，是革兰氏阴性菌中广泛存在的信号分子。不同细菌在不同条件下产生不同种类的AHLs，用于调节群体的各种同步行为，如生长、衰亡、活性表达和成膜过程等，不同细菌能够识别不同的信号分子，不同信号分子的差异在于其酰基侧链的碳链长度不同。

现有技术中，有研究通过外源直接添加信号分子AHLs的方式提高厌氧氨氧化菌群的活性和增殖速率，该方法的缺陷在于，信号分子AHLs价格昂贵且难以购得，实际水处理工程中，一方面难以启动厌氧氨氧化反应器，另一方面反应器运行中也很难持续供给AHLs，使得AHLs在厌氧氨氧化水处理中的应用受到限制，难以应用于实际工程。

发明内容

为了解决上述AHLs信号分子难以实际应用于厌氧氨氧化水处理的技术问题，本发明实施例提出了一种厌氧氨氧化反应器的启动方法，包括以下步骤：S1：厌氧氨氧化反应器接种厌氧氨氧化污泥；S2：厌氧氨氧化反应器中加入能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌；S3：厌氧氨氧化反应器进水。

本发明实施例还提出了一种厌氧氨氧化反应器的运行方法，该方法利用能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌辅助运行所述厌氧氨氧化反应器。

进一步，所述信号分子为高丝氨酸内酯类信号分子，优选的，所述信号分子为3-oxo-C6-HSL。

进一步，所述基因工程菌为向宿主细菌中导入sprI基因片段的基因工程菌，优选的，所述基因工程菌为E.coli-sprI。

进一步，所述基因工程菌E.coli-sprI的构建方法如下：P1：合成能够释放信号分子3-oxo-C6-HSL的合成酶基因片段sprI；P2：构建重组质粒pET28a-sprI；P3：以大肠杆菌为宿主细菌，构建基因工程菌E.coli-sprI。

进一步，所述基因工程菌E.coli-sprI经包埋固定处理；优选的，所述基因工程菌E.coli-sprI经海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理。

进一步，所述海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理包括以下步骤：Q1：基因工程菌E.coli-sprI及其培养基混合液，培养到细菌的对数生长期，再向其中加入IPTG进行信号分子合成酶的诱导表达，释放所述信号分子；Q2：将重量百分比为2-5％，优选为3％的海藻酸钠溶液与步骤Q1获得的混合液以体积比为1:1～5:1，优选为2:1～4:1，更优选为3:1的比例混合，再向混合液中滴加重量百分比为2-5％，优选2％的CaCl₂溶液，形成直径为6-10mm，优选直径为大约8mm的小球。

本发明实施例还一种厌氧氨氧化反应器，所述厌氧氨氧化反应器中含有能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌；优选的，所述基因工程菌为向宿主细菌中导入sprI基因片段的基因工程菌，更优选的，所述基因工程菌为E.coli-sprI。

进一步，所述基因工程菌E.coli-sprI经包埋固定处理；优选的，所述基因工程菌E.coli-sprI经海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理。

进一步，所述海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理包括以下步骤：Q1：基因工程菌E.coli-sprI及其培养基混合液，培养到细菌的对数生长期，再向其中加入IPTG进行信号分子合成酶的诱导表达；Q2：将重量百分比为2-5％，优选为3％的海藻酸钠溶液与步骤Q1获得的混合液以体积比为1:1～5:1，优选为2:1～4:1，更优选为3:1的比例混合，再向混合液中滴加重量百分比为2-5％，优选2％的CaCl₂溶液，形成直径为6-10mm，优选直径为大约8mm的小球。

发明人首次意识到利用基因工程菌来获得信号分子能够解决上述技术问题，与现有技术相比，本发明实施例的有益效果至少包括：通过少量培养基因工程菌即可获得大量信号分子，能够大大降低成本；实施方法简单，仅需在厌氧氨氧化反应器中加入产生信号分子的基因工程菌，可实现厌氧氨氧化反应器的快速启动；基因工程菌的包埋小球能够在反应器中保持机械强度，反应器运行过程中持续供给信号分子，使得信号分子AHLs能够应用于实际水处理工程。

附图说明

图1是本发明实施例的基因工程菌E.coli-sprI的包埋小球。

图2是本发明实施例的基因工程菌E.coli-sprI的包埋小球的机械强度和水体中信号分子的浓度与海藻酸钠溶液和菌液比例的关系。

图3是本发明实施例中两个反应器运行90天的厌氧氨氧化菌生长速率和胞外多聚物的浓度。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。但本领域技术人员知晓，本发明并不局限于附图和以下实施例。

本发明的实质精神在于构建能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌，所述信号分子能够提高厌氧氨氧化菌增殖速率，利用基因工程菌产生信号分子，以快速启动厌氧氨氧化反应器，在反应器运行过程中持续供给信号分子，因此，尽管本发明的实施例以构建能够产生信号分子3-oxo-C6-HSL的基因工程菌为例，但不限于该信号分子，其它可用于调节厌氧氨氧化菌增殖速率的信号分子，例如高丝氨酸内酯类信号分子，均可应用本发明实施例的方法。

<S1构建基因工程菌>

以3-oxo-C6-HSL为例，其结构式如下。

该分子是厌氧氨氧化细菌释放并且特征性识别的信号分子之一。3-oxo-C6-HSL价格昂贵且难以获得，自然界中存在的能够产生3-oxo-C6-HSL的细菌的信号分子产生量极小。为方便、大量地获取信号分子3-oxo-C6-HSL，本实施例首先构建了产生信号分子3-oxo-C6-HSL的基因工程菌，包括如下步骤：

A1：通过美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation,NCBI)数据库查找能够释放信号分子3-oxo-C6-HSL的合成酶基因片段sprI，该基因片段公众可自上述数据库获得。

A2：合成上述基因片段sprI，其合成方法例如，首先设计多条互补的单链引物，再通过固相亚磷酰胺三酯法合成引物，再用PCR方法拼接合成的引物成双链基因，获得该基因片段。

为验证所合成基因片段的正确性，测得合成3-oxo-C6-HSL的SprI蛋白酶的氨基酸序列如下：

通过与NCBI数据库中的合成酶基因片段sprI序列对比，验证了所合成基因片段的正确性。

A3：酶切处理(优选双酶切方法)质粒pET28a，将基因片段sprI连接到载体pET28a，构建重组质粒pET28a-sprI。

A4：构建基因工程菌。将感受态大肠杆菌(E.coli)置于冰上融化后，向感受态E.coli中加入重组质粒pET28a-sprI，冰浴放置30分钟。离心管于42℃水浴60-90秒，然后快速转移到冰浴中，放置2-3分钟，再向离心管中加入500μL无菌无抗LB(Luria-Bertani)培养基，37℃，180rpm振荡培养1小时。取适量已转化的感受态细胞涂布含卡那抗生素的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆至1L含有卡那抗生素的LB培养基中培养，37℃，220转/分钟，培养至OD600为0.6，获得基因工程菌E.coli-sprI，该基因工程菌能够产生信号分子3-oxo-C6-HSL。

本领域技术人员知晓，上述构建基因工程菌的方法为优选方法，但本发明并不仅限于上述具体步骤流程，例如，宿主细菌不限于大肠杆菌，还可以是假单胞菌，枯草芽孢杆菌等。

<S2包埋固定基因工程菌>

获得基因工程菌E.coli-sprI后，对其进行包埋，完成固定化，提供适合的包埋机械强度，以便其作为能够较长时间地留存在厌氧氨氧化反应器中，同时，还需保证信号分子能够从包埋小球扩散到溶液中。本实施例的包埋固定方法包括如下步骤。

B1：上述步骤A4获得的基因工程菌E.coli-sprI及其培养基混合液，在37℃培养到细菌的对数生长期，再向其中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)进行信号分子合成酶的诱导表达。

B2：包埋固定E.coli-sprI菌。重量百分比为2-5％，优选为3％的海藻酸钠溶液与步骤B1获得的混合液以体积比为1:1～5:1，优选为2:1～4:1，更优选为3:1的比例混合，以均匀流速从距离约35cm的高处向海藻酸钠溶液与步骤2获得的菌液的混合液中滴加重量百分比为2-5％，优选2％的CaCl₂溶液中，形成直径为6-10mm，优选为大约8mm的小球。小球在CaCl₂溶液中，置于4℃条件下，静置6h，以加强包埋小球的机械强度，最终获得包埋E.coli-sprI的小球(如图1所示)。

为验证小球的机械强度保持性能，将包埋E.coli-sprI的小球置入的正常运行的反应器中，观察发现包埋E.coli-sprI的小球在反应器运行的沉降时间能够沉降到反应器底部，基本不随出水而流失，并且能够在较长时间内保持机械强度，仅需定期添加少量包埋小球即可维持反应器中信号分子浓度。包埋小球能够在4℃条件下保存4-5周，方便此后直接添加到反应器中。机械强度的测定的步骤如下：将包埋小球置于材料试验机台上，试验机以2mm/min的加载速率均匀施压于包埋小球。包埋小球开始被破坏时的压力值为包埋小球的抗压强度，其代表了包埋小球的机械强度。本实施例对浸泡2周和未浸泡的包埋小球进行机械强度测定表明浸泡过后的包埋小球仍旧能够维持其机械强度。

本实施例还对信号分子的含量进行测定，测定方法为：水体通过等体积的乙酸乙酯萃取后，氮吹蒸干，所得干粉再复溶后通过液相色谱串联质谱(LC-MS)进行测量。添加包埋小球的反应器中信号分子3-oxo-C6-HSL的浓度基本能够维持在2μM。

图2是本发明实施例的基因工程菌E.coli-sprI的包埋小球的机械强度和水体中信号分子的浓度与海藻酸钠溶液和菌液比例的关系，二者负相关，随着海藻酸钠溶液浓度的提高，包埋小球的机械强度提高，而释放出的信号分子的浓度降低。本领域技术人员可以根据实际需要，确定包埋固定过程的各项参数。

<S3启动厌氧氨氧化反应器>

本实施例厌氧氨氧化反应器的启动方法包括以下步骤：

C1：厌氧氨氧化反应器接种厌氧氨氧化污泥，使污泥浓度为0.18gVSS/L。

C2：加入前述包埋E.coli-sprI的小球5g。

C3：厌氧氨氧化反应器进水。在进水进入反应器前去除进水中的溶解氧以维持厌氧氨氧化反应器中的厌氧生长环境。进水氨氮浓度为200mg/L，亚硝酸氮的浓度为240mg/L，进水pH在7.2-7.5之间，控制反应器温度约为37℃，搅拌速度为100rpm。反应器序批式运行，一个运行周期包括，14min的进水，30min的沉降和5min的排水，水力停留时间逐步从12h缩短为6h。

为观察基因工程菌的对反应器启动和运行的影响效果，本实施例对比了添加包埋E.coli-sprI的小球的反应器A和不添加包埋E.coli-sprI的小球的反应器B的氮去除负荷情况。并在反应器启动后，每隔2天检测一次氮去除速率，反应器运行结束时检测反应器内厌氧氨氧化菌的生长速率和胞外多聚物的生成状况。

实验结果表明，培养50天后，反应器A氮去除负荷已经达到1.4gN/(L·d)，反应器B在第64天氮去除负荷才能够达到1.4gN/(L·d)。添加本发明的包埋E.coli-sprI的小球的反应器的启动时间显著缩短。

图3是本发明实施例中两个反应器运行90天的厌氧氨氧化菌生长速率和胞外多聚物的浓度。可知，添加包埋E.coli-sprI的小球后，除了反应器启动时间缩短以外，经过90天培养，反应器A与反应器B内厌氧氨氧化菌的生长速率也存在显著差异，A反应器中厌氧氨氧化菌的生长速率和胞外多聚物中的多糖和蛋白的产生量比B反应器分别大幅提高38％，9％，24％。

上述实验表明，上述包埋E.coli-sprI的小球能够分泌大量信号分子3-oxo-C6-HSL，对厌氧氨氧化菌的生长和胞外多聚物的分泌进行调控，提高其增殖速率，能够克服厌氧氨氧化菌生长缓慢且对环境波动敏感的缺点，可用于实现厌氧氨氧化反应器的快速启动，并在反应器运行过程中持续供给信号分子。

<运行厌氧氨氧化反应器>

反应器启动后，在反应器运行过程中，适量包埋E.coli-sprI的小球能够促进厌氧氨氧化菌的增殖，从而加快水处理进程，高效脱氮。运行中可根据包埋E.coli-sprI的小球的实际破裂和流失情况及反应需要，补充包埋E.coli-sprI的小球，即可维持反应器的稳定运行。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种厌氧氨氧化反应器的启动方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：厌氧氨氧化反应器接种厌氧氨氧化污泥；

S2：厌氧氨氧化反应器中加入能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌；

S3：厌氧氨氧化反应器进水。

2.一种厌氧氨氧化反应器的运行方法，其特征在于，利用能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌辅助运行所述厌氧氨氧化反应器。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述信号分子为高丝氨酸内酯类信号分子，优选的，所述信号分子为3-oxo-C6-HSL。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌为向宿主细菌中导入sprI基因片段的基因工程菌，优选的，所述基因工程菌为E.coli-sprI。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌E.coli-sprI的构建方法如下：

P1：合成能够释放信号分子3-oxo-C6-HSL的合成酶基因片段sprI；

P2：构建重组质粒pET28a-sprI；

P3：以大肠杆菌为宿主细菌，构建基因工程菌E.coli-sprI。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌E.coli-sprI经包埋固定处理；优选的，所述基因工程菌E.coli-sprI经海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理包括以下步骤：

Q1：基因工程菌E.coli-sprI及其培养基混合液，培养到细菌的对数生长期，再向其中加入IPTG进行信号分子合成酶的诱导表达，释放所述信号分子；

Q2：将重量百分比为2-5％，优选为3％的海藻酸钠溶液与步骤Q1获得的混合液以体积比为1:1～5:1，优选为2:1～4:1，更优选为3:1的比例混合，再向混合液中滴加重量百分比为2-5％，优选2％的CaCl₂溶液，形成直径为6-10mm，优选直径为大约8mm的小球。

8.一种厌氧氨氧化反应器，其特征在于，所述厌氧氨氧化反应器中含有能够产生厌氧氨氧化菌交流信号分子的基因工程菌；优选的，所述基因工程菌为向宿主细菌中导入sprI基因片段的基因工程菌，更优选的，所述基因工程菌为E.coli-sprI。

9.如权利要求8所述的厌氧氨氧化反应器，其特征在于，所述基因工程菌E.coli-sprI经包埋固定处理；优选的，所述基因工程菌E.coli-sprI经海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理。

10.如权利要求9所述的厌氧氨氧化反应器，其特征在于，所述海藻酸钠包埋固定和CaCl₂溶液强化处理包括以下步骤：

Q1：基因工程菌E.coli-sprI及其培养基混合液，培养到细菌的对数生长期，再向其中加入IPTG进行信号分子合成酶的诱导表达；

Q2：将重量百分比为2-5％，优选为3％的海藻酸钠溶液与步骤Q1获得的混合液以体积比为1:1～5:1，优选为2:1～4:1，更优选为3:1的比例混合，再向混合液中滴加重量百分比为2-5％，优选2％的CaCl₂溶液，形成直径为6-10mm，优选直径为大约8mm的小球。