CN113416682A - 一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用 - Google Patents

一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113416682A
CN113416682A CN202110523054.6A CN202110523054A CN113416682A CN 113416682 A CN113416682 A CN 113416682A CN 202110523054 A CN202110523054 A CN 202110523054A CN 113416682 A CN113416682 A CN 113416682A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
ahlx
pht01
expression vector
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110523054.6A
Other languages
English (en)
Inventor
韩笑笑
柳鹏福
储消和
陈艳
谢赛雪
陈天德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN202110523054.6A priority Critical patent/CN113416682A/zh
Publication of CN113416682A publication Critical patent/CN113416682A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01081—Quorum-quenching N-acyl-homoserine lactonase (3.1.1.81)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，尤其涉及一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其应用，所述构建方法为将酰基高丝氨酸内酯酶编码基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，去掉载体上调控蛋白编码基因lacI，再转入枯草芽孢杆菌，得到具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。本发明所构建的表达AHL内酯酶的重组枯草芽孢杆菌，不需要额外添加诱导剂就能持续性表达高活性的群体感应淬灭酶AhlX，所用的宿主为环境友好型的枯草芽孢杆菌，在防治植物细菌性病害方面有着天然的优势，与化学农药相比无污染，无毒害，无残留，对环境无伤害，是一个绿色防控措施，在防治细菌性病害方面具有很大的潜力。

Description

一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建 方法、应用
技术领域
本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，尤其涉及一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其应用。
背景技术
植物软腐病是由胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)引起的植物病害，欧文氏菌能够侵染植物组织或器官，使植物出现大面积的腐烂，对农业生产造成了巨大危害。目前对植物软腐病的防治方法有合理轮作、避免机械损伤、喷洒农药或植物水提液等，这些方法不仅增加了人力消耗，还会造成环境污染、危害人体健康。因此，新型环境友好型的病害防治策略亟需研究和开发。
群体感应(Quorum Sensing，QS)是指细菌通过感知自身所分泌的化学信号分子浓度，调控特定基因的表达，并协调细菌的一系列生物学行为的现象。在致病菌欧文氏菌(E.carotovora)中，同样存在这种群体感应现象，欧文氏菌通过分泌酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)，调控一些致病因子的表达，从而引起植物软腐病的发生。
群体淬灭(Quorum Quenching，QQ)通过抑制或干扰生物细胞间QS系统，阻断细胞间的“信息交流”，从而防御致病菌感染，因此被视为一种绿色环保型病害防治策略。其作为一种新型环境友好型的病害防治策略，能够有效抑制病原菌的致病性，并且不会引起细菌抗药性。
AhlX是一种金属-β-内酰胺类酰基高丝氨酸内酯酶，它能够水解AHLs信号分子的内酯环，从而起到降解信号分子的作用，其拥有独特的耐盐能力、热稳定性。
枯草芽孢杆菌B.subtilis 168是一种优良的生防菌，在环境中广泛存在，对人畜无害，在食品、饲料和农业方面应用广泛。目前，枯草芽孢杆菌本身作为一种生防菌已应用于植物病害的生物防治。
将AHL内酯酶表达在枯草芽孢杆菌B.subtilis 168中，可以集中二者的优势，有望代替化学农药，有效抑制植物软腐病的发生，符合“健康、绿色”的生活理念。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中存在的技术问题，提供了一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法。
本发明还提供了一种由上述构建方法得到的具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
本发明还提供了一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备防治胡萝卜软腐欧文氏菌所导致的植物软腐病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，将酰基高丝氨酸内酯酶编码基因(ahlX基因)克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，并转入枯草芽孢杆菌，得到具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
作为优选，所述表达载体以pHT01基础，去除其表达调控蛋白的编码基因lacI，使其能够在不添加诱导剂的条件下，在枯草芽孢杆菌中高效表达。
作为优选，所述酰基高丝氨酸内酯酶能够有效水解酰基高丝氨酸内酯类信号分子。
作为优选，所述表达载体的构建包括下步骤：
(1)将编码酰基高丝氨酸内酯酶的ahlX基因克隆到质粒pHT01中的BamH I和Xba I限制性酶切位点中；
(2)通过反向PCR方法扩增质粒DNA，删除质粒pHT01上的调控区域基因lacI，构建表达载体。
作为优选，以枯草芽孢杆菌168(B.subtilis 168)为宿主菌。
作为优选，所述的构建方法包括以下步骤：
(1)根据ahlX的DNA序列(SEQ NO.1)设计上下游引物，上游引物F-A1：CGCGGATCCATGGCCGCTCCACGTCTCTATAT(SEQ No.2)；下游引物R-A2：TGCTCTAGATCAAGCGTAGTATTCCGGGGCGT(SEQ No.3)从实验室保存的pET28-ahlX中扩增，获得目的片段ahlX；
(2)SanPrep柱式质粒DNA小量抽提质粒pHT01(购自MoBiTec GmbH)；
(3)BamH I，Xba I分别双酶切质粒pHT01和目的片段ahlX基因，纯化后用T4连接酶进行连接，热激法转化大肠杆菌E.coli DH5α，挑取转化菌落测序验证，得到重组质粒pHT01(Pgrac)-ahlX；
(4)抽提pHT01(Pgrac)-ahlX，电转入枯草芽孢杆菌168菌株中，得到BSAHLX01菌株，即为具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
作为优选，所述表达载体为不同启动子的重组表达载体。
作为优选，所述启动子包括PgsiB、PaprE、PamyE、PamyQ、PsacB、PsrfA、PxylA、Phoiln、Phpall、Pshuttle-09和P43。
为了提高AhlX在枯草芽孢杆菌中的表达，增加群体淬灭活性，本发明还研究不同启动子对AhlX表达的影响，为此构建了具有不同启动子的重组表达载体，构建出不同的重组菌，测定并比较这些重组菌的酶活。具体构建方法为：
构建不同的启动子表达的重组枯草芽孢杆菌的具体操作为：
(A)拟采用的启动子分别是PgsiB、PaprE、PamyE、PamyQ、PsacB、PsrfA、PxylA、Phoiln、Phpall、Pshuttle-09、P43，(对应的启动子序列在本专利中的编号分别为SEQNo.4、SEQ No.5、SEQ No.6、SEQ No.7、SEQ No.8、SEQ No.9、SEQ No.10、SEQ No.11、SEQNo.12、SEQ No.13、SEQ No.14)，根据具体序列，合成启动子片段(南京金斯瑞公司)，用SpeI和BamH I克隆到pHT01(Pgrac)-ahlX上，用新的启动子替代原有的Pgrac启动子，以此构建不同启动子的ahlX表达质粒pHT01(PgsiB)-ahlX、pHT01(PaprE)-ahlX、pHT01(PamyE)-ahlX、pHT01(PamyQ)-ahlX、pHT01(PsacB)-ahlX、pHT01(PsrfA)-ahlX、pHT01(PxylA)-ahlX、pHT01(Phoiln)-ahlX、pHT01(Phpall)-ahlX、pHT01(Pshuttle-09)-ahlX、pHT01(P43)-ahlX。
(B)将构建成功的不同启动子的ahlX表达质粒分别电转入枯草芽孢杆菌168菌株中，得到BSAHLX02、BSAHLX03、BSAHLX04、BSAHLX05、BSAHLX06、BSAHLX07、BSAHLX08、BSAHLX09、BSAHLX10、BSAHLX11、BSAHLX12这些重组菌株。
原始的pHT01表达载体需要IPTG诱导，考虑到在植物病害防治时，无法额外加诱导剂，因此去掉原载体上的lacI区域，解除LacI蛋白对启动子的阻遏作用，构建了可以组成型表达AhlX蛋白的表达载体，转入枯草杆菌中，得到组成型表达的重组菌，编号为BSAHLX13。
重组枯草芽孢杆菌BSAHLX13的具体构建过程为：
设计上游引物F-△L1：CAAAATCGTCTCCCTCCGTTTGAATATTTGATTGA；下游引物R-△L2：AGGGAGACGATTTTGGCGCAACGCAATTAATGTGA，(在本专利中编号为SEQ No.15和SEQNo.16)，反向PCR扩增质粒pHT01(Pgrac)-ahlX，删除IPTG诱导的调控区域基因lacI，获得重组质粒pHT01(Pgrac-△lacI)-ahlX。将质粒电转入枯草芽孢杆菌168菌株，得到重组枯草芽孢杆菌BSAHLX13。
本发明还对构建的重组芽孢杆菌进行发酵培养，并检测重组菌的AHL内酯酶的活性，具体检测方法为：通过琼脂条扩散法检测群体淬灭活性，更具体方法为：
(S.1)制备寡营养培养基琼脂条，将寡营养固体培养基加入X-gal溶液，使其终浓度为20μg/ml，随后按25ml每板的量将配制好的培养基倒入100mm的一次性塑料平板上。待培养基冷却凝固之后，将培养基切成宽度约为6mm的琼脂条，用移液枪吸取0.5μl的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens NT1)的保藏液，紧密等间距的点涂于切好的琼脂条上，即获得寡营养培养基琼脂条；
(S.2)分别将构建的重组芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌B.subtilis 168接于TB培养基中培养至24h，取菌液检测酶活表达情况；
(S.3)首先将构建的所有菌株(BSAHLX01～BSAHLX13)按反应程序测活：35μl的菌液，5μl的20μM信号分子3-oxo-C8-HSL，室温反应2h后，加入10μl的10％SDS终止反应。在此反应体系中，BSAHLX01、BSAHLX13都表现出很高的群体淬灭活性；
(S.4)以上述相同的反应体系，缩短反应时间，改为反应30min，比较BSAHLX01和BSAHLX13的酶活；
(S.5)以上的反应结束后12000rpm离心1min，取10μl上清点涂于寡营养培养基琼脂条的前端，待上清吸收完毕，于30℃培养箱中倒置培养18h观察NT1菌斑颜色。结果显示：反应2h后，BSAHLX01、BSAHLX13的实验组无蓝色菌斑；将反应时间缩短为30min后，BSAHLX01实验组有蓝色菌斑，而BSAHLX13的实验组无蓝色菌斑，表明BSAHLX13能在30min内完全降解2μM的信号分子3-oxo-C8-HSL，BSAHLX13对信号分子有显著的降解作用，即BSAHLX13的酶活最高。
一种如上述任一所述的构建方法得到的具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌在发酵过程中，不需要额外添加诱导剂就能够组成型表达高活性酰基高丝氨酸内酯酶。
一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备防治胡萝卜软腐欧文氏菌所导致的植物软腐病药物中的应用。
本发明还提供了具有AHL内酯酶活性的重组枯草芽孢杆菌在植物软腐病生物防治方面的应用。
将构建的枯草芽孢杆菌工程菌BSAHLX13和致病菌欧文氏菌共同接种于已灭菌的马铃薯、胡萝卜切片中，模拟实际环境，评估了其对植物软腐病的防治效果。结果显示BSAHLX13可有效减轻欧文氏菌引起的软腐病的发病症状，从而证实了本研究所构建的具有群体淬灭活性的工程菌BSAHLX13可用于欧文氏菌引起的植物软腐病的防治。
因此，本发明具有如下有益效果：利用本发明所构建的表达AHL内酯酶的重组枯草芽孢杆菌，能持续性表达高活性的群体感应淬灭酶AhlX，所用的宿主为环境友好型的枯草芽孢杆菌，在防治植物细菌性病害方面有着天然的优势，与化学农药相比无污染，无毒害，无残留，对环境无伤害，是一个绿色防控措施，在防治细菌性病害方面具有很大的潜力。
附图说明
图1是pHT01(Pgrac)-ahlX的质粒图谱。
图2是不同启动子的ahlX表达载体的质粒图谱。
图3是重组菌BSAHLX01～BSAHLX13的酶活表达效果图：1:PBS缓冲液；2：2μM 3-oxo-C8-HSL；3：B.subtilis 168；4：BSAHLX2；5：BSAHLX3；6：BSAHLX4；7：BSAHLX5；8：BSAHLX6；9：BSAHLX7；10：BSAHLX8；11：BSAHLX9；12：BSAHLX10；13：BSAHLX11；14：BSAHLX12；15：BSAHLX1；16：BSAHLX13。
图4是pHT01(Pgrac-△lacI)-ahlX的质粒图谱。
图5是BSAHLX01与BSAHLX13的酶活比较：
1：PBS缓冲液；2：2μM的3-oxo-C8-HSL；3：B.subtilis 168；4：BSAHLX1；5：BSAHLX13。
图6是重组菌BSAHLX13的生物防治效果图：1:PBS；2:E.carotovora；3:E.carotovora+B.subtilis 168；4:E.carotovora+BSAHLX13。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌BSAHLX01菌株的构建。
选用质粒pHT01本身所携带的诱导型启动子Pgrac表达群体淬灭酶AhlX，利用软件Primer 5设计扩增基因ahlX的带有BamH I，Xba I限制性酶切位点的上下游引物F-A1、R-A2，使用I-5TM 2×High-Fidelity Master Mix的DNA聚合酶扩增目的片段ahlX。用BamH I，Xba I限制性酶同时酶切得到的扩增产物ahlX和表达载体pHT01，将酶切产物与双酶切后的表达载体pHT01纯化后用T4连接酶置于16℃过夜连接，构建诱导型表达载体pHT01(Pgrac)-ahlX，(其质粒图谱在本专利附图1)，将构建成功的载体pHT01(Pgrac)-ahlX通过电击转入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168中，得到BSAHLX01菌株。
实施例2：不同来源启动子表达的重组枯草芽孢杆菌的构建。
采用的启动子分别是PgsiB、PaprE、PamyE、PamyQ、PsacB、PsrfA、PxylA、Phoiln、Phpall、Pshuttle-09、P43，(启动子序列在本专利中的编号分别为SEQ No.4、SEQ No.5、SEQNo.6、SEQ No.7、SEQ No.8、SEQ No.9、SEQ No.10、SEQ No.11、SEQ No.12、SEQ No.13、SEQNo.14)，根据具体序列，合成启动子片段(南京金斯瑞公司)，用Spe I和BamH I克隆到pHT01(Pgrac)-ahlX上，用新的启动子替代原有的Pgrac启动子，构建不同来源启动子的ahlX表达载体，(其质粒图谱在本专利附图2)。将构建成功的不同来源启动子的ahlX表达质粒分别电转入枯草芽孢杆菌168菌株中，得到BSAHLX02、BSAHLX03 BSAHLX04、BSAHLX05、BSAHLX06、BSAHLX07、BSAHLX08、BSAHLX09、BSAHLX10、BSAHLX11、BSAHLX12这些重组菌株。
实施例3：重组枯草芽孢杆菌工程菌B.subtilis 168/pHT01(Pgrac-△lacI)-ahlX的构建。
考虑到重组菌BSAHLX01需要IPTG诱导，在植物病害防治时，无法额外加诱导剂，因此去掉原载体上的lacI区域，解除LacI蛋白对启动子的阻遏作用，使表达质粒能在不添加诱导剂的情况下，持续高效的表达群体淬灭酶AhlX的同时，减少工业生产上的成本，构建可以组成型表达AhlX蛋白的表达载体pHT01(Pgrac-△lacI)-ahlX。
首先，以载体pHT01(Pgrac)-ahlX为模板，以F-△L1、R-△L2为上下游引物，用I-5TM2×High-Fidelity Master Mix的DNA聚合酶反向PCR扩增，删除pHT01(Pgrac)-ahlX上的调控区域基因lacI，获得重组表达载体pHT01(Pgrac-△lacI)-ahlX，其质粒图谱在本专利附图4。然后将重组质粒pHT01(Pgrac-△lacI)-ahlX通过电击转化的方法转入到枯草芽孢杆菌B.subtilis 168感受态细胞中，并通过加有5ug/ml Cm的LB平板筛选，获得表达群体淬灭酶AhlX的菌株B.subtilis 168/pHT01(Pgrac-△lacI)-ahlX，编号为BSAHLX13。
实施例4：寡营养培养基琼脂条的制备。
将根癌农杆菌A.tumefacies NT1接于寡营养液体培养基中培养过夜，吸取0.5ml于2ml的保种管中，并与灭菌的40％甘油等比例混合，置于-80℃备用。
将寡营养固体培养基加入X-gal溶液，使其终浓度为20μg/ml，随后按25ml每板的量将配制好的培养基倒入100mm的一次性塑料平板上。待培养基冷却凝固之后，将培养基切成宽度约为6mm的琼脂条，用移液枪吸取0.5μl上述NT1甘油保藏液，紧密等间距的点涂于切好的琼脂条上，即获得寡营养培养基琼脂条。
实施例5：重组菌BSAHLX01～BSAHLX13的酶活比较。
以根癌农杆菌A.tumefacies NT1为报告菌株，采用琼脂条扩散法来检测QQ酶活性。首先，将枯草芽孢杆菌B.subtilis 168，BSAHLX01～BSAHLX13分别接于TB培养基中培养24h。反应体系：35μl的菌液，5μl的20μM信号分子3-oxo-C8-HSL，室温反应2h后，加入10μl的10％SDS终止反应。反应结束后12000rpm离心1min，取10μl上清点涂寡营养培养基琼脂条的前端，待上清吸收完毕，于30℃培养箱中倒置培养18h观察NT1菌斑颜色，根据蓝色菌斑的多少来判断重组表达菌的酶活。酶活与蓝色菌斑成反比，酶活表达情况在本专利附图3，结果显示：反应2h后，BSAHLX01和BSAHLX13菌株完全降解了2μM的3-oxo-C8-HSL底物，即在此反应条件下BSAHLX01和BSAHLX13的酶活最高。
实施例6：重组菌株BSAHLX01和BSAHLX13的酶活比较。
以琼脂条扩散法来比较重组菌株BSAHLX1和BSAHLX13的酶活，将这两种菌株和枯草芽孢杆菌B.subtilis 168接于TB培养基中培养至24h后，取菌液检测酶活表达情况。按实例5的反应体系，反应30min，反应结束后12000rpm离心1min，取10μl上清点涂于寡营养培养基琼脂条的前端，待上清吸收完毕，于30℃培养箱中倒置培养18h观察NT1菌斑颜色，同样根据蓝色菌斑的多少来判断重组表达菌的酶活。酶活表达情况在本专利附图5，构建的全部重组菌株的酶活表征即不同启动子的表达能力表征在本专利附表1，结果表明重组菌株BSAHLX13的酶活最高，即改造的组成型启动子Pgrac-△lacI最有利于ahlX在枯草芽孢杆菌中的表达。
表1不同启动子对ahlX的表达能力表征
菌株编号 启动子 表达能力
BSAHLX01 Pgrac ++++
BSAHLX02 PgsiB ++
BSAHLX03 PaprE +
BSAHLX04 PamyE +
BSAHLX05 PamyQ +
BSAHLX06 PsacB +
BSAHLX07 PsrfA +
BSAHLX08 PxylA ++
BSAHLX09 Phoiln +
BSAHLX10 Phpall +
BSAHLX11 Pshuttle-09 +
BSAHLX12 P43 +
BSAHLX13 Pgrac-△lacI +++++
实施例7：重组菌株BSAHLX13对病原菌欧文氏菌E.carotovora引起的植物软腐病的防治作用。
欧文氏菌可侵染多种寄主，包括十字花科，茄科，葫芦科等多种蔬菜，造成了农作物的巨大损失。
本实施例以欧文氏菌感染土豆，胡萝卜为例，研究重组菌株BSAHLX13对病原菌欧文氏菌的防治效果。首先，分别将将野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168和重组菌株BSAHLX13以及欧文氏菌分别接入LB培养基中过夜培养，对菌液进行稀释。将稀释过后的野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168和重组菌株BSAHLX13菌液分别与稀释过后的欧文氏菌的菌液按照1：1的比例混合，待用。
马铃薯，胡萝卜的处理：用75％的乙醇清洗马铃薯和胡萝卜表面，随后用无菌水漂洗干净。最后将马铃薯和胡萝卜用灭过菌的刀具切成厚度为0.3-0.4cm厚度的薄片，置于灭过菌的铺有滤纸片的培养皿中。将稀释过后的混合液和PBS缓冲液分别接种至处理好的马铃薯片和胡萝卜片中心位置，30℃培养32h观察马铃薯和胡萝卜的发病情况。
BSAHLX13的防治效果图在本专利附图6，马铃薯组：接种欧文氏菌和欧文氏菌与B.subtilis 168菌液的对照组均出现了严重的软腐病病发症状，而接种重组菌BSAHLX13与欧文氏菌菌液的实验组与PBS(0.01M,pH 7.4)对照组均无软腐病发病症状。胡萝卜组：接种欧文氏菌和欧文氏菌与B.subtilis 168菌液的对照组均出现了严重的软腐病病发症状，而接种工程菌BSAHLX13与欧文氏菌菌液的实验组只表现出轻微的软腐病病发症状。该结果表明重组菌株BSAHLX13对欧文氏菌引起的软腐病具有很好的防治效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> 酰基高丝氨酸内酯酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atggccgctc cacgtctcta tatgttccag acaggaacgc tgaagtgtcg tgtgtgcaac 60
atcaagatga acgcgggact ggatgattac gagatccccg ttccctggta tctgatcact 120
catcccaagg gcaacgtggt catcgacggc gggtgcgcgg tcgaatgcgc gagcgatccg 180
aagggatact ggggcgatat cacttctgtc tactggccgg tcatgcggga agaagagggc 240
tgcgtccagg ccttgaaggc gttcgggatc gaacccgccg acgttcgcta tgttctgcac 300
agccatctgc atctggacca caccggtgcc accgggcgct tcccgaatgc catccatatc 360
gtgcgacgct gcgaatacga gtatgcgatg gcgccggatt ggttttcggc gggtggctac 420
attcgtgcgg atttcgatcg gcccgacgtg aaatggcatc tgctggaaga ccacgacgat 480
ggctacgatg tcttcggcga cgacacgatc cggttcatct tcacgcctgg gcacgcgccg 540
ggacattcca gtttcctgct tcgcttgccg gaaaccgggc cggtgctgct ggccgtggat 600
gctgcctata ccaccgatca ttgggacgaa aaggctctgc cgggctttct ggcctcgacc 660
gtcgatgcgg tgcgctccgt tcgaaaactg catgccctgg cggaaaagac cggtgcgctg 720
gtggtgaccg gacacgatcc cgaggcatgg ccaaccttcc gtcacgcccc ggaatactac 780
gcttga 786
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly
1 5 10 15
Cys Thr Cys Cys Ala Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr Ala Thr Ala Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Gly Cys Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Gly
1 5 10 15
Thr Ala Gly Thr Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 318
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 4
actagtctat cgagacacgt ttggctggaa aaaacttttc cagatagtgc cggttgccgg 60
aatggttttt ggcgccgctg ccaatcgctc aacattaaac gacattaccg agacaggcat 120
gatgctgtac aaaaagaggc gcattcttga acgactgaaa gaaacagaac gagagatgga 180
atagcagaaa gcagacggac accgcgatcc gcctgctttt tttagtggaa acatacccaa 240
tgtgttttgt ttgtttaaaa gaattgtgag cgggaataca acaaccaaca ccaattaaag 300
gaggaattca aaggatcc 318
<210> 5
<211> 637
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 5
actagtagct gggtaaagcc tatgaattct ccattttctt ctgctatcaa aataacagac 60
tcgtgatttt ccaaacgagc tttcaaaaaa gcctctgccc cttgcaaatc ggatgcctgt 120
ctataaaatt cccgatattg gttaaacagc ggcgcaatgg cggccgcatc tgatgtcttt 180
gcttggcgaa tgttcatctt atttcttcct ccctctcaat aattttttca ttctatccct 240
tttctgtaaa gtttattttt cagaatactt ttatcatcat gctttgaaaa aatatcacga 300
taatatccat tgttctcacg gaagcacacg caggtcattt gaacgaattt tttcgacagg 360
aatttgccgg gactcaggag catttaacct aaaaaagcat gacatttcag cataatgaac 420
atttactcat gtctattttc gttcttttct gtatgaaaat agttatttcg agtctctacg 480
gaaatagcga gagatgatat acctaaatag agataaaatc atctcaaaaa aatgggtcta 540
ctaaaatatt attccatcta ttacaataaa ttcacagaat agtcttttaa gtaagtctac 600
tctgaatttt tttaaaagga gagggtaaag aggatcc 637
<210> 6
<211> 360
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 6
actagtggcg gcgttctgtt tctgcttcgg tatgtgattg tgaagctggc ttacagaaga 60
gcggtaaaag aagaaataaa aaagaaatca tcttgaaaaa tagatggttt ctttttttgt 120
ttggaaagcg agggaagcgt acacagtctc gggcagtttt ttttatagga acattgattt 180
gtattcactc tgccaagttg ttttgataga gtgattgtga taatttaaaa tgtaagcgtt 240
aacaaaattc tccagtcttc acatcagctt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 300
gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaggatcc 360
<210> 7
<211> 395
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 7
actagtggcg gcgttctgtt tctgcttcgg tatgtgattg tgaagctggc ttacagaaga 60
gcggtaaaag aagaaataaa aaagaaatca tcttgaaaaa tagatggttt ctttttttgt 120
ttggaaagcg agggaagcgt tcacagtttc gggcagcttt ttttatagga acattgattt 180
gtattcactc tgccaagttg ttttgataga gtgattgtga taatttaaaa tgtaagcgtt 240
aacaaaattc tccagtcttc acatcaggtt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 300
gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaatgttt 360
gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgccg gatcc 395
<210> 8
<211> 552
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 8
actagtccca tcacatatac ctgccgttca ctactattta gtgaaatgag atattatgat 60
attttctgaa ttatgattaa aaaggcaact ttatgcccat gcagcagaag ctataaaaaa 120
tacagagaat gaaaagaaac agatagattt tttagttctt taggcccgta tcccgcaaat 180
ccttttatga ttttctatca aacaaaagag gaaaatagac cagttgcaat ccaaacgaga 240
gtctaataga atgaggtcga aaagtaaatc gcgcgggttt gttactgact aaagcaggca 300
agacctaaaa tgtgtaaagg gcaaagtgta tactttggcg tcagccctta catattttag 360
gtcttttttt attgtgcgta actaacttgc catcttcaaa caggagggct ggaaaaagca 420
gaccgctaac acagtacata caaaaaggag acatgaacga tgaacatcaa aaagtttgca 480
aaacaagcaa cagtattgac ctttactact gcactgctgg caggaggcgc aactcaagcg 540
tttgcgggat cc 552
<210> 9
<211> 621
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 9
actagtatcg acaaaaatgt catgaaagaa tcgttataag acgctcttcg caagggtgtc 60
tttttttttg cctttttttc ggtttttgcg cggtacacat agtcatgtaa agattgtaaa 120
ttgcattcag caataaaaaa agattgaacg cagcagtttg gtttaaaaat ttttattttt 180
ctgtaaataa tgtttagtgg aaatgattgc ggcatcccgc aaaaatatcc ctgtaaataa 240
actggaatct ttcggcatcc cgcatgaaac ttttcaccca tttttcggtg ataaaaacat 300
ttttttcatt taaagtgaac ggtagtaaga taaaaaatat tgaaaacaat gaataaatag 360
ccaaaattgt ttcctattag gataggggat cttgcggtct ttatccactt atgttaaacg 420
ccgcaatgct gactgacggc tgcccgtttt aatagcggca atctgttttt ttgtttggaa 480
gctctgcttt ttaagtgtag tactttgggc tatttcggct gttagttcat aagaattaaa 540
agctgatatg gataagaaag agaaaatgcg ttgcacatgt tcactgctta taaagattag 600
gggaggtatg acaatggatc c 621
<210> 10
<211> 518
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 10
actagtaggt cttcttccgc cacttgattt tccttgacct atttcaaata ccagattttc 60
tttcattaac gtgtttacct gtgatgaaac agttgattta tttaatccag tcatttcaga 120
taattttgct cttgaaatag gtgaattttt aaggatttct tttaataata acttttgatt 180
tacttttttg acaaaggttt gatcagcgat atccacttca tccactccat ttgtttaatc 240
tttaaattaa gtatgaacat agtacatagc gaatcttccc tttattatat ctaatgtgtt 300
cataaaaaac taaaaaaaat attgaaaata ctgatgaggt tatataagat gaaaataagt 360
tagtttgttt aaacaacaaa ctaataggta acttacaaga tgaaataaaa tgaatttgta 420
tttgaatgaa tttattttta agggggaaat cacatggctc aatctcattc cagttcaatt 480
aactattttg gaagcgcaaa caaagtggtt taggatcc 518
<210> 11
<211> 246
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 11
actagtagaa ctaattagta gcgctttcca atggaggcgc ttttttattt gggtagttgc 60
ataccactaa agatgttcag gtgcacatga gcattggagg aaaggaacgc tttaggggga 120
agggaaacct tttgacagtc ttaatccccc ttgatataat gttctctgta aactgcgtcc 180
ggtaaatctc aggattgaca atcggcggtt aacggctata attgcggggg cagtttagaa 240
ggatcc 246
<210> 12
<211> 284
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 12
actagttact acctgtccct tgctgatttt taaacgagca cgagagcaaa accccccttt 60
gctgaggtgg cagagggcag gtttttttgt ttcttttttc tcgtaaaaaa aagaaaggtc 120
ttaaaggttt tatggttttg gtcggcactg ccgacagcct cgcagagcac acactttatg 180
aatataaagt atagtgtgtt atactttact tggaagtggt tgccggaaag agcgaaaatg 240
cctcacattt gtgccaccta aaaaggagcg atttacatgg atcc 284
<210> 13
<211> 309
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 13
actagtgtca caatgcgcca tcaaaccgtt gacaagcgtc cccgtcagat ggccgggagc 60
cggatgaacc accattccgc gcggcttgtt gacgacaaga acgtcctgat cttattataa 120
tataagcaaa aaactcataa aaaggaaaag cattgacctg aaaacttatc ggtaaagtat 180
gatataatac aaaaagaccg attagagggg agagaggaaa catgccttca gttgaaagtt 240
ttgaacttga ccataatgca gtaaaagcgc cttacgtcag acactgcggc gtccataaag 300
tggggatcc 309
<210> 14
<211> 345
<212> DNA
<213> 启动子(Artificial Sequence)
<400> 14
actagttcag cattattgag tggatgatta tattcctttt gataggtggt atgttttcgc 60
ttgaactttt aaatacagcc attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc 120
ctcttgctaa agcggccaag gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt 180
cgtgtatcat tggtttactt atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat 240
ttattttaca tttttagaaa tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag 300
tgatagcggt accattatag gtaagagagg aatgtacacg gatcc 345
<210> 15
<211> 35
<212> PRT
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 15
Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys
1 5 10 15
Cys Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr
20 25 30
Thr Gly Ala
35
<210> 16
<211> 35
<212> PRT
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 16
Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly
1 5 10 15
Cys Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly
20 25 30
Thr Gly Ala
35

Claims (10)

1.一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，将酰基高丝氨酸内酯酶编码基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，去掉载体上调控蛋白编码基因lacI，再转入枯草芽孢杆菌，得到具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体以pHT01基础，去除其表达调控蛋白的编码基因lacI，使其能够在不添加诱导剂的条件下，在枯草芽孢杆菌中高效表达。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述酰基高丝氨酸内酯酶能够有效水解酰基高丝氨酸内酯类信号分子。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体的构建包括下步骤：
（1）将编码酰基高丝氨酸内酯酶的ahlX基因克隆到质粒pHT01中的BamH I和Xba I限制性酶切位点中；
（2）通过反向PCR方法扩增质粒DNA，删除质粒pHT01上的调控区域基因lacI，构建表达载体。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌168为宿主菌。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）根据ahlX的DNA序列（SEQ NO.1）设计上下游引物，上游引物F-A1：CGCGGATCCATGGCCGCTCCACGTCTCTATAT（SEQ No.2）；下游引物R-A2：TGCTCTAGATCAAGCGTAGTATTCCGGGGCGT（SEQ No.3）从pET28-ahlX中扩增，获得目的片段ahlX；
（2）SanPrep柱式质粒DNA小量抽提质粒pHT01；
（3）BamH I，Xba I分别双酶切质粒pHT01和目的片段ahlX基因，纯化后用T4连接酶进行连接，热激法转化大肠杆菌E. coli DH5α，挑取转化菌落测序验证，得到重组质粒pHT01(Pgrac)-ahlX；
（4）抽提pHT01(Pgrac)-ahlX，电转入枯草芽孢杆菌168菌株中，得到BSAHLX01菌株，即为具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为不同启动子的重组表达载体。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述启动子包括PgsiB、PaprE、PamyE、PamyQ、PsacB、PsrfA、PxylA、Phoiln、Phpall、Pshuttle-09和P43。
9.一种如权利要求1-8任一所述的构建方法得到的具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌在发酵过程中，不需要额外添加诱导剂就能够组成型表达高活性酰基高丝氨酸内酯酶。
10.一种如权利要求9所述的具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌在防治胡萝卜软腐欧文氏菌所导致的植物软腐病中的应用。
CN202110523054.6A 2021-05-13 2021-05-13 一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用 Pending CN113416682A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110523054.6A CN113416682A (zh) 2021-05-13 2021-05-13 一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110523054.6A CN113416682A (zh) 2021-05-13 2021-05-13 一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113416682A true CN113416682A (zh) 2021-09-21

Family

ID=77712375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110523054.6A Pending CN113416682A (zh) 2021-05-13 2021-05-13 一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113416682A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114507685A (zh) * 2022-03-04 2022-05-17 郑州大学 一种枯草芽孢杆菌多基因模块化组装和诱导表达质粒及其构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543193A (zh) * 2016-02-26 2016-05-04 中国科学院上海高等研究院 一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543193A (zh) * 2016-02-26 2016-05-04 中国科学院上海高等研究院 一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU PF等: "AhlX, an N-acylhomoserine Lactonase with Unique Properties", 《MARINE DRUGS》 *
LIU P等: "登录号：KY783591.1", 《GENBANK》 *
梁倩怡等: "重组枯草芽孢杆菌诱导表达AiiA及酶活性鉴定", 《生物技术》 *
陈嘉蔚等: "含P43启动子aiiA基因重组枯草芽孢杆菌的构建与表达", 《广东农业科学》 *
陈珺君等: "芽孢杆菌aiiA基因抗病研究进展", 《长江蔬菜》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114507685A (zh) * 2022-03-04 2022-05-17 郑州大学 一种枯草芽孢杆菌多基因模块化组装和诱导表达质粒及其构建方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110564663B (zh) 微生物的受控生长
CN110343157B (zh) 棉花黄萎病相关基因GhBONI及其编码蛋白与应用
CN107058348B (zh) 一种提高植物赤霉病抗性的小麦基因及其应用
Guo et al. Ketoglutarate transport protein KgtP is secreted through the type III secretion system and contributes to virulence in Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Li et al. Suppressing Erwinia carotovora pathogenicity by projecting N-acyl homoserine lactonase onto the surface of Pseudomonas putida cells
US20080182790A1 (en) Bacterial strains, genes and enzymes for control of bacterial diseases by quenching quorum-sensing signals
CN118256519B (zh) 抗病相关蛋白TaMYB22在调控植物条锈病抗性中的应用
CN113416682A (zh) 一种具有群体淬灭活性的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法、应用
CN117430678B (zh) 一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白质及其相关生物材料与应用
CN101457228A (zh) 青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程应用
CN109467594B (zh) Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控灰霉菌致病力与分生孢子产生中的应用
KR101641578B1 (ko) 프로모터 변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법
CN1982464B (zh) 一种与致病力相关的稻瘟菌基因及其应用
CN115976052A (zh) 小麦茎基腐病抗性基因TaHSP18．6、其表达产物、重组载体及应用
CN101429515A (zh) 拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因
CN111808832B (zh) 一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用
Jones et al. Co-transformation of the sclerotial mycoparasite Coniothyrium minitans with hygromycin B resistance and β-glucuronidase markers
CN103525837B (zh) Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因及其应用
CN111778266A (zh) 一种群体感应信号分子降解基因aidf及其编码的降解酶AidF和应用
Mahmoudi et al. Host-induced gene silencing of Pectobacterium carotovorum quorum sensing gene enhances soft rot disease resistance in potato plants
CN101413007B (zh) 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽胞杆菌cry8Ⅰ基因、蛋白及其应用
CN110878293A (zh) 缺失yceD基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用
CN101003570A (zh) 植物抗病相关蛋白rar1及其编码基因与应用
CN115851774B (zh) 一种编码BT蛋白Vip3Aa7的基因及其应用
CN1100143C (zh) 白纹病的控制

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210921

RJ01 Rejection of invention patent application after publication