CN109988756A - N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂及其制备 - Google Patents

N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N‑酰基高丝氨酸内酯酶(AHL‑内酯酶)‑无机杂化纳米催化剂及其制备方法，该纳米催化剂是将有机组分——AHL‑内酯酶和无机组分——不溶性磷酸盐(如锌、镍、锰和钴等)组成，其制备方法为将AHL‑内酯酶和可溶性金属盐分别加入到磷酸盐缓冲液中，所得的混合液经静置、除去上层清液、真空干燥，即可得到粒径小、结构稳定的AHL‑内酯酶‑无机杂化纳米催化剂。本发明制备方法简单，所得的AHL‑内酯酶‑无机杂化纳米催化剂的活性较之游离酶得到显著提高，且热稳定性好，小粒径的复合物比表面积大，增加了其在反应中与底物的接触面积。且该酶底物谱广，能有效降解多种信号分子，具有较好的应用前景。

Description

N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂及其制备
技术领域
本发明属于酶的修饰技术领域，具体涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂及其制备方法。
背景技术
细菌可以通过监测胞外信号分子的浓度来感知种群密度的变化，当信号分子达到某一临界密度值时，会诱导启动特定基因的表达，协调群体行为，这种现象被命名为群体感应(Quorum Sensing，QS)。很多动植物病原菌的致病性都受群体感应系统的调控，而以细菌群体感应系统为靶标的群体淬灭(Quorum Quenching，QQ)已被证明是防治这一类细菌性病害的有效策略。可以通过抑制信号分子的合成、积累、监测，或对信号分子进行酶降解或修饰的机制来实现群体淬灭。其中利用群体感应淬灭酶降解信号分子的方法是群体淬灭策略的一种。
到目前为止，很多研究者对群体感应淬灭酶在动植物感染性疾病中的应用进行了研究，包括构建群体淬灭酶转基因植物；或将异源表达群体感应淬灭酶的基因工程菌或纯化的群体淬灭酶直接用于感染性疾病的防治。但由于目前大多数人对转基因食品的恐慌，使转基因植物的应用受到一定限制。而向环境中直接投放基因工程菌存在扩散的风险，对生态环境存在安全隐患。直接使用酶制剂进行群体淬灭又被其稳定性差的缺陷又限制了其应用效果。因此采用适当的方法提高群体淬灭酶稳定性显得尤为重要。
有机-无机杂化纳米材料是由有机组分——蛋白或酶和无机组分——金属磷酸盐等通过自组装的方式结合而成，该方法在制备时条件温和，不使用有毒有害试剂，制备过程无共价键的产生，因此不仅能避免由于发生载体与酶表面发生共价结合导致的酶结构变化和酶活性降低(Rai,S.K.,Narnoliya,L.K.,Sangwan,R.S.&Yadav,S.K.(2018).Self-Assembled Hybrid Nanoflowers of Manganese Phosphate and l-ArabinoseIsomerase:A Stable and Recyclable Nanobiocatalyst for Equilibrium LevelConversion of d-Galactose to d-Tagatose.ACS Sustainable Chemistry&Engineering6,6296-6304)。
发明内容
本发明的目的是提供一种N-酰基高丝氨酸内酯酶(AHL-内酯酶)-无机杂化纳米催化剂，是一种利用自组装法制备的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂，是为了解决现有群体淬灭酶稳定性不好，从而在实际应用中受限的技术问题。本发明所述的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂，由0.57％～31.48％的有机组分—N-酰基高丝氨酸内酯酶和68.52％～99.43％的无机组分——不溶性磷酸盐(如锌、镍、锰和钴等)组成。
所述N-酰基高丝氨酸内酯酶，是具有水解N-酰基高丝氨酸内酯分子的内酯键功能的一类生物酶。所述N-酰基高丝氨酸内酯酶来源于Halomonas salaria(CN105543193A)或其他微生物。
本发明的另一个目的是提供所述的一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂的制备方法，是通过将AHL内酯酶和可溶性磷酸盐及特定的金属离子在一定条件下混合，三者形成稳定的结构。
本发明所述的一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂的制备方法，通过以下步骤实现：向磷酸盐缓冲液中加入AHL-内酯酶，混合均匀后加入能与磷酸根形成沉淀的金属盐，再次均匀混合，所得到的混合液静置后离心除去上层清液，洗涤后再真空干燥，得到AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂。
本发明的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂优选由下述方法制备得到：在一定温度下，向特定pH值的磷酸盐缓冲液中加入一定浓度的AHL-内酯酶，混合均匀后加入特定浓度的能与磷酸根形成沉淀的金属盐(硫酸镍、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴)，再次混合均匀，所得的混合液在室温下静置一定时间后离心除去上层清液，再在室温下真空干燥。
本发明的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂优选由下述方法制备方法，所用条件如下：
制备温度为4～37℃，优选25℃；
所用pH为7～9.4，优选为9.4；
所用AHL-内酯酶浓度为3.19～25.52μM；
所用的金属盐为硫酸镍、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴，优选为硫酸镍。
所用金属盐浓度为3～15mM，优选为5mM；
静置时间为0.5～36h；
所用AHL-内酯酶为具有AHL降解能力的酶，优选为来源于Salinicola salaria1A01339(CN105543193A)。
因此，本发明的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂更优选由下述方法制备得到：在25℃下，向pH值为9.4的磷酸盐缓冲液中加入优选的来自于Salinicola salaria 1A01339的AHL-内酯酶，混合均匀后加入5mM的硫酸镍，再次混合均匀，所得的混合液静置0.5h后离心除去上层清液，再在室温下真空干燥。
本发明直接在磷酸盐缓冲液中加入AHL-内酯酶和硫酸镍(或硫酸锌、硫酸锰、氯化钴)，这些金属离子与AHL-内酯酶分子表面的羧基、氨基、羟基及酰胺键等官能团配位，形成晶核，然后在结构引导剂AHL-内酯酶的作用下，晶核之间通过AHL-内酯酶分子的黏合作用逐渐生长成，并最终自组装成立体结构的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂。
本发明方法制备的Zn3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂的催化活性较游离酶提高了1.40倍，Co3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂较游离酶的活性提高了1.90倍，Mn3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂的催化活性较游离酶提高了3.12倍，Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂较游离酶的活性提高了10.59倍。其中Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂具有良好的稳定性。该杂化纳米催化剂室温存放40天后酶活无明显降低，而游离酶存放40天后只剩余26.52％的酶活；60℃热处理48h后酶活仍剩余80.26％，而游离酶60℃存放24h后酶活已经完全丧失。并且该杂化纳米催化剂重复使用性能好，重复使用8次后剩余酶活仍高达72.90％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂制备方法简单，制备条件温和。
2、制备过程不适用有毒有害试剂，制备过程无共价键的产生，不损失酶活，且制备的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂催化活性得到了显著的提高。
3、本发明制备的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂稳定性得到了提高，同时具有较好的重复利用率，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是不同金属离子制备合成的AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂的活性示意图。
图2是Ni3(PO4)2无机化合物和Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂的扫描电镜图。
图3是Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂的傅里叶变换红外光谱图。
图4是Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂的X射线能谱图。
图5是Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂在不同温度下的稳定性曲线图。
图6是Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂在室温(25℃)下的稳定性曲线图。
图7是Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂在60℃下的稳定性曲线图。
图8是Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂的重复使用性能示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
实施例1
在1mL pH为8.0的10mM磷酸盐缓冲液中加入5.0μL 0.65μM来自于Salinicolasalaria 1A01339的AHL-内酯酶纯化酶，混合均匀后加入26μL 200mM的氯化钴，然后将所得混合液置于25℃静置0.5h后离心除去上层清液，沉淀用超纯水清洗3次，再真空干燥，得到AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂——Co3(PO4)2@AHL-内酯酶。
实施例2
在1mL pH为8.0的10mM磷酸盐缓冲液中加入5.0μL 0.65mM来自于Salinicolasalaria 1A01339的AHL-内酯酶纯化酶，混合均匀后加入26μL 200mM的硫酸锰，然后将所得混合液置于25℃静置0.5h后除去上层清液，沉淀用超纯水清洗3次，再真空干燥，得到AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂——Mn3(PO4)2@AHL-内酯酶。
实施例3
在1mL pH为8.0的10mM磷酸盐缓冲液中加入5.0μL 0.65mM来自于Salinicolasalaria 1A01339的AHL-内酯酶纯化酶，混合均匀后加入26μL 200mM的硫酸锌，然后将所得混合液置于25℃静置0.5h后除去上层清液，沉淀用超纯水清洗3次，再真空干燥，得到AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂——Zn3(PO4)2@AHL-内酯酶。
实施例4
在1mL pH为9.4的10mM磷酸盐缓冲液中加入5.0μL 0.65mM来自于Salinicolasalaria 1A01339的AHL-内酯酶纯化酶，混合均匀后加入26μL 200mM的硫酸镍，然后将所得混合液置于25℃静置0.5h后除去上层清液，沉淀用超纯水清洗3次，再真空干燥，得到AHL-内酯酶-无机杂化纳米催化剂——Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶。
实施例5
将实施例1～4所得产品用pH为8.0的10mM磷酸盐缓冲液配成AHL-内酯酶浓度为3.19μM的溶液。分别取上述溶液和3.19μM游离AHL-内酯酶各5μL，加入到含2.07mM OOHL的pH为8.0的磷酸盐缓冲体系中，总反应体积为200μL，分别在30℃反应10min，用终浓度为5％的SDS终止酶反应。然后用HPLC分析反应的产物组分，以降解掉的OOHL的含量来表示酶活力的大小，以游离AHL-内酯酶样品测得的酶活力为100％，结果见图1。Zn3(PO4)2@AHL-内酯酶、Co3(PO4)2@AHL-内酯酶、Mn3(PO4)2@AHL-内酯酶和Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶活性分别较游离酶提高了1.40、1.90、3.12和10.59倍。
对比例1
在1mL pH为9.4的10mM磷酸盐缓冲液中加入26μL 200mM的硫酸镍溶液，均匀混合后置于25℃静置0.5h，离心除去上清，沉淀用超纯水清洗3次，再置于真空干燥箱中室温干燥。
实施例6
采用S-4700型场发射扫描电子显微镜(日本HITACHI公司)和Nicolet is10型号傅立叶变换红外光谱仪(美国赛默飞公司)分别对实施例4和对比例1所得产品进行表征，结果见图2～4。由图2(a、b分别为放大50k、100k的Ni3(PO4)2结晶，其由小球形的颗粒组成；c、d为放大50k、100k的珊瑚状Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶结晶)可见，对比例1中未添加AHL-内酯酶得到的产品虽然也为小球状结构，但不具有由小球状结构组成的立体的珊瑚状结构，说明珊瑚状结构是通过AHL-内酯酶分子的黏合作用形成的。由图3可见，实施例4所得产品不仅具有对比例1所得产品在1050cm-1处的强P-O伸缩振动吸收峰，在1650cm-1处的P-O伸缩振动和弯曲振动的合频峰；还同时具蛋白质二级结构谱带：酰胺I带(1700～1600cm-1)、酰胺II带(1600～1500cm-1)和酰胺III带(1340～1220cm-1)，分别出现在1650cm-1、1542cm-1和1237cm-1处，与游离AHL-内酯酶相比，其酰胺I、酰胺II和酰胺III谱带未发生明显峰位移，表明实施例4所得产品是由AHL-内酯酶和Ni3(PO4)2通过分子间作用力结合而成珊瑚状结构，没有共价键键的生成。由图4可见，实施例4所得产品由C、O、Ni和P这四种元素组成，其中Ni和P来自Ni3(PO4)2，C来自AHL-内酯酶，O来自Ni3(PO4)2和AHL-内酯酶。
实施例7：实施例4所得产品的热稳定性分析
(1)实施例4所得产品在不同温度下的稳定性
将实施例4所得产品用pH为8.0的磷酸盐缓冲液配成AHL-内酯酶浓度为3.19μM的溶液，和3.19μM游离AHL-内酯酶一起在0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100℃下放置30min。分别取5μL上述溶液，加入到含2.07mM OOHL的pH为8.0的磷酸盐缓冲体系中，总反应体积为200μL，分别在30℃反应10min，用终浓度为5％的SDS终止酶反应。然后用HPLC分析反应的产物组分，以降解掉的OOHL的含量来表示酶活力的大小，以0℃放置30min的样品测得的酶活力为100％，结果见图5。结果表明Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂和游离酶在温度≤60℃时，放置30min不影响酶活，当温度＞60℃时，酶活逐渐降低，在100℃放置30min后，酶活基本丧失。
(2)实施例4所得产品在室温(25℃)下的稳定性
将实施例4所得产品用pH为8.0的磷酸盐缓冲液配成AHL-内酯酶浓度为3.19μM的溶液，和3.19μM游离AHL-内酯酶一起在室温(25℃)下放置0～40天。分别取5μL上述溶液，加入到含2.07mM OOHL的pH为8.0的磷酸盐缓冲体系中，总反应体积为200μL，分别在30℃反应10min，用终浓度为5％的SDS终止酶反应。然后用HPLC分析反应的产物组分，以降解掉的OOHL的含量来表示酶活力的大小，以室温放置0天样品测得的酶活力为100％，结果见图6。结果表明Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂室温稳定性较游离AHL-内酯酶好，存放40天后酶活无明显降低，而游离酶存放40天后只剩余26.52％的酶活。
(3)实施例4所得产品在60℃下的稳定性
将实施例4所得产品用pH为8.0的磷酸盐缓冲液配成AHL-内酯酶浓度为3.19μM的溶液，和3.19μM游离AHL-内酯酶一起在60℃下放置0～48h。分别取5μL上述溶液，加入到含2.07mM OOHL的pH为8.0的磷酸盐缓冲体系中，总反应体积为200μL，分别在30℃反应10min，用终浓度为5％的SDS终止酶反应。然后用HPLC分析反应的产物组分，以降解掉的OOHL的含量来表示酶活力的大小，以60℃放置0天的样品测得的酶活力为100％，结果见图7。结果表明Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂60℃稳定性较游离AHL-内酯酶优异，存放48h后酶活仍剩余80.26％，而游离酶60℃存放24h后酶活已经完全丧失。
实施例8：实施例4所得产品的重复使用性能分析
将实施例4所得产品用pH为8.0的磷酸盐缓冲液配成AHL-内酯酶浓度为3.19μM的溶液。分别取5μL上述溶液，加入到含2.07mM OOHL的pH为8.0的磷酸盐缓冲体系中，总反应体积为200μL，分别在30℃反应10min，12000rpm离心1min。沉淀加含200μL 2.07mM OOHL的pH为8.0的磷酸盐缓冲体系重复上述反应，共重复反应8次。将每次所得的上清液用HPLC分析反应的产物组分，以降解掉的OOHL的含量来表示酶活力的大小，以第一次反应测得的酶活力为100％，结果见图8。结果表明Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂重复使用性能好，重复使用8次后，剩余酶活仍高达72.90％。

Claims (7)

1.一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂，其特征在于，由0.57％～31.48％的有机组分和68.52％～99.43％的无机组分组成，其中有机组分为N-酰基高丝氨酸内酯酶，无机组分为不溶性磷酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂，其特征在于，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶，是具有水解N-酰基高丝氨酸内酯分子的内酯键功能的一类生物酶。
3.根据权利要求2所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂，其特征在于所述N-酰基高丝氨酸内酯酶来源于Halomonas salaria或其他微生物。
4.一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：向可溶性磷酸盐缓冲液中加入AHL-内酯酶，混合均匀后加入能与磷酸根形成沉淀的金属盐，然后将所得混合液静置后除去上层清液，再干燥，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂。
5.根据权利要求4所述的一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：向pH为7～9.4的磷酸盐缓冲液中加入N-酰基高丝氨酸内酯酶，混合均匀后加入3～5mM的能与磷酸根形成沉淀的金属盐，然后将所得混合液4-25℃下静置0.5h以上后除去上层清液，再干燥，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂。
6.根据权利要求4所述的一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂，其特征在于，通过以下步骤实现：向pH为8～9.4的0.01～0.1M磷酸盐缓冲液中加入来自于Halomonassalaria的N-酰基高丝氨酸内酯酶，使其终浓度为3.19～25.52μM，混合均匀后加入3～5mM的硫酸镍，然后将所得混合液置于25℃下静置后0.5h后除去上层清液，再在室温下真空干燥，得到珊瑚状Ni3(PO4)2@AHL-内酯酶杂化纳米催化剂。
7.根据权利要求4或5所述的一种N-酰基高丝氨酸内酯酶-无机杂化纳米催化剂，其特征在于，能与磷酸根形成沉淀的金属盐选用硫酸镍、硫酸锰、硫酸锌或氯化钴中的一种。
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