CN105087453A - 用于生物催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程生物，尤其微生物如大肠杆菌，具有催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的活性。所述能催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的基因工程菌，即在细胞内共表达分别编码磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的4个基因；这些功能酶基因通过表达载体导入细胞得到基因工程菌。本发明的工程菌株是在添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的情况下诱导功能酶蛋白的表达，直接利用工程菌生物催化黄酮类化合物的葡萄糖醛酸苷化，同时细胞生长良好，发酵周期较短，成本低。

Description

用于生物催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的基因工程菌

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及利用合成生物学技术构建一种具有催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的基因工程微生物细胞。

背景技术

黄酮类化合物广泛存在于自然界，是多种药用植物的有效成分，在植物体内多以游离态或与糖结合成苷的形式存在；作为潜在的药物，具有很好的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性。如葡萄糖醛酸苷化的黄酮类化合物灯盏花乙素，在临床上广泛使用灯盏花注射液(商品名：朗瑞西乐)用于脑血栓、冠心病及心绞痛等缺血性心脑血管疾病，与灯盏细辛相关的产品实现工业销售收入约30亿元。由于大多数黄酮苷元及部分黄酮苷类在水相中溶解度低，限制了其制剂的开发。目前对黄酮类化合物进行分子修饰主要是以提高其在水中的溶解性为目的，而对其水溶性改性所涉及的化学反应主要是糖苷化。目前，糖苷化修饰研究最多的是葡萄糖苷化反应。

糖醛酸苷化的天然黄酮类化合物并不常见，但黄酮类化合物在体内主要以II相代谢产物葡萄糖醛酸苷的形式存在，并具有较好的生物活性，如灯盏花乙素即为葡萄糖醛酸苷化的野黄芩素(即4',5,6-三羟基黄酮-7-葡萄糖酸苷)。有关黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的研究报道较少，Nagashima等从中药黄芩中(ScutellariabaicalensisGeorgi.)纯化了UDP-葡萄糖醛酸转移酶，只对黄酮7位羟基的邻位上有取代基的黄酮(黄芩素、野黄芩素)具有催化活性(NagashimaS,HirotaniM,YoshikawaT.PurificationandcharacterizationofUDP-glucuronate:baicalein7-O-glucuronosyltransferasefromScutellariabaicalensisGeorgi.cellsuspensioncultures.Phytochemistry.2000Mar；53(5):533-8)，其对应的编码基因在美国基因数据库(GenBank)中注册(AB042277)。谢升谷等用昆虫病毒表达系统表达人GAT1A3进行体外催化芹菜素的葡萄糖醛酸苷化，目的是研究芹菜素的II相代谢(谢升谷，陈亚坤，陈枢青，曾苏.人UGT1A3重组酶催化芹菜素葡醛酸结合反应.中国药理学与毒理学杂志,2006,20(5)：405-409)。申请日2008年10月10日授权给三得利控股株式会社的中国专利CN10147816A中公开了来自唇形科植物金鱼草(Antirrhinummajus)的AmUGTcg10、屋九岛光紫黄芩(Scutellarialaeteviolacea)的SLUGT、紫苏(Perillafrutescens)的PfUGT50、芝麻(Sesamumindicum)的SiUGT23等4个UDP-糖基转移酶具有利用UDP-葡萄糖醛酸为糖基供体的葡萄糖醛酸苷化反应活性，其对应的编码基因在美国基因数据库注册，分别是AB362988、AB362989、AB362991和AB362990，该专利文献提供获得黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的方法是利用表达纯化的蛋白为催化剂和UDP-葡萄糖醛酸为糖基供体酶促催化反应制备，关于这4个UDP-糖基转移酶的活性也进行了非专利文献报道(NoguchiA,HorikawaM,FukuiY,etal.LocaldifferentiationofsugardonorspecificityofflavonoidglycosyltransferaseinLamiales.PlantCell,2009,21(5):1556-1572)。

发明内容

本发明目的是解决黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化反应中活化的UDP-葡萄糖醛酸供体的合成难题。

本发明目的在于解决天然黄酮类苷元化合物溶解度低的问题，提供一种生物催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的基因工程微生物细胞。

本发明以天然或化学合成的黄酮苷元为底物，通过葡萄糖醛酸苷化反应提高其水溶性，进而改善其生物利用率，对先导物进行葡萄糖醛酸化修饰后，部分药物可以提高药效，降低毒副作用，为黄酮类化合物新药研制提供一个新的途径。

本发明通过在宿主细胞内高表达磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶，提高细胞代谢池内UDP-葡萄糖醛酸的浓度。通常状态下细胞代谢池内UDP-葡萄糖醛酸浓度很低，仅用于保持生命活动过程中细胞壁的生物合成。为提高细胞代谢池UDP-葡萄糖醛酸的浓度，实现与UDP-葡萄糖醛酸转移酶的高效耦联，本发明采用诱导型T7启动子和含有复制子pSC101的质粒(pSLB208)实现磷酸葡萄糖变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在细胞内高表达，同时利用诱导型T7启动子和含有复制子colE1的质粒(pEG)实现UDP-葡萄糖脱氢酶的高表达，从而提高代谢池内UDP-葡萄糖醛酸水平；再利用诱导型T7启动子和含有复制子p15A的质粒(pACYC184)实现UDP-葡萄糖醛酸转移酶的高表达。其中，编码磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和UDP-葡萄糖脱氢酶基因如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示直接克隆宿主自身的功能基因，不需要对其进行宿主偏好密码的优化。

本发明提供了一个获得具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化功能的基因工程微生物细胞，该细胞既能稳定高效合成活化的葡萄糖醛酸基供体尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖醛酸，又能实现胞内共表达的UDP-葡萄糖醛酸转移酶的级联催化反应，即是说这种能够实现自供给UDP-葡萄糖醛酸的活细胞可直接用作生物催化剂催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化反应。

本发明获得的工程化大肠杆菌细胞直接用作生物催化剂，把不同的黄酮苷元直接加入利用M9培养基培养的活细胞催化体系中进行葡萄糖醛酸苷化反应，反应结束后利用有机溶剂分离纯化获得葡萄糖醛酸苷化的黄酮类化合物。

本发明一个实施例提供了一个获得UDP-葡萄糖醛酸转移酶的方法。首先发明人在唇形科植物黄芩中克隆了11条编码UDP-葡萄糖醛酸转移酶基因，但研究发现美国基因数据库(GenBank)中注册号为AB042277的基因阅读框是缺失了N-端16个氨基酸残基(MEDTLVIYTTPEHMNT)的基因片段，其在大肠杆菌中被诱导表达，然后利用获得的纯酶所建立的催化体系没有催化活性；在非专利文献中，Noguchi等又克隆了该基因的全长编码框，在美国基因数据库(GenBank)中注册号为AB479151，他们的研究结果也再次印证了N-端16个氨基酸残基(MEDTLVIYTTPEHMNT)的肽段对其催化活性是必需的(NoguchiA,HorikawaM,FukuiY,etal.LocaldifferentiationofsugardonorspecificityofflavonoidglycosyltransferaseinLamiales.PlantCell,2009,21(5):1556-1572)，但在该文献也没有详细报道有关该基因所编码酶蛋白的功能活性结果。其中表1是以文献报道的BAH19313为对照，比较分析了克隆的11个基因和人工合成SEQIDNO:8DNA所编码黄酮-O-葡萄糖醛酸转移酶的不同氨基酸残基。人工合成SEQIDNO:8DNA的编码框是利用CondonUsageDatabase(http://www.kazusa.or.jp/codon/)将原始的11个编码基因序列综合在一起后人工合成为大肠杆菌所偏好的密码子而产生的。

表1.13个黄酮-O-葡萄糖醛酸转移酶基因所编码不同氨基酸残基序列的比较

生物材料样品保藏信息：

分类命名：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichiacoli；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所、保藏日期2014年2月14日、保藏编号CGMCCNO.8819。

附图说明

图1.UDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖醛酸的合成和代谢。Glc，葡萄糖；G6P，葡萄糖-6-磷酸；F6P，果糖-6-磷酸；G3P，甘油醛-3-磷酸；PEP，磷酸烯醇丙酮酸；PYR，丙酮酸；AcoA,乙酰辅酶A；TCAcycle，三羧酸循环；6PG，6-磷酸葡萄糖酸酯；R5P，5-磷酸核糖；PRPP，5-磷酸核糖-1-焦磷酸；UMP，尿苷酸；UDP，尿苷二磷酸；UTP，尿苷三磷酸；G1P，葡萄糖-1-磷酸；UDP-Glc，UDP-葡萄糖；UDP-Glu，UDP-葡萄糖醛酸；LPS，脂多糖；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；GalU，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；UGDH，UDP-葡萄糖脱氢酶；GAT，UDP-葡萄糖醛酸转移酶；Flavonoids，黄酮；Flavonoid-O-Glu黄酮-O-葡萄糖醛酸苷。

图2.大肠杆菌PGM、GalU、UGDH基因的DNA片段PCR扩增。Lane1&2，GalU；3&4,PGM；5&6,UGDH。

图3.黄芩GAT融合蛋白的表达和纯化。Lane1,pTWINB-GAT非诱导样品；Lane2,pTWINB-GAT诱导样品；Lane3,pTWINB-GAT诱导结合在几丁质胶上的融合蛋白样品；Lane4,pTWINB-GAT从几丁质胶上切割下来的纯蛋白样品。

图4.纯酶GAT催化黄芩素葡萄糖醛酸苷化反应的产物分析.1.实验组,色谱峰(箭头)为催化产物；2.对照组,色谱峰为底物。

图5.纯酶GAT催化11个黄酮类化合物的HPLC图。1.黄酮类底物的HPLC图；2.纯酶催化黄酮类化合物后的HPLC图。

图6.含有不同表达质粒的GAT工程细胞诱导表达后细胞内可溶性蛋白上清部分的SDS-PAGE分析。Lane1,对照pEG12；Lane2,pSLB208-PGM；Lane3,pSLB208-GalU；Lane4,pEG-UGDH；Lane5,pACYC184-GAT；Lane6,pSLB208-PGM-GalU；Lane7,pSLB208-PGM/pEG-UGDH/pACYC184-GAT；Lane8,pSLB208-GalU/pEG-UGDH/pACYC184-GAT；Lane9,pSLB208-PGM-GalU/pEG-UGDH/pACYC184-GAT；箭头对应4个不同的蛋白酶条带。

图7.含有GAT的不同酶蛋白组合表达的基因工程微生物细胞催化黄芩素的产率比较。1：BL21(DE3)/pSLB208-PGM/pACYC184-GAT；2:BL21(DE3)/pSLB208-GalU/pACYC184-GAT；3:BL21(DE3)/pEG-UGDH/pACYC184-GAT；4:BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU/pACYC184-GAT；5:BL21(DE3)/pSLB208-PGM/pEG-UGDH/pACYC184-GAT；6:BL21(DE3)/pSLB208-GalU/pEG-UGDH/pACYC184-GAT；7:BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU/pEG-UGDH/pACYC184-GAT；8:BL21(DE3)/pACYC184-GAT；

图8.含有GAT的基因工程微生物细胞催化黄芩素的HPLC分析和MS鉴定.A.HPLC分析；1.反应产物；2.底物黄芩素；B.反应产物即保留时间为13.9min的(+)-ESI图，分子量为447[M+H]⁺。

图9.含有GAT的基因工程微生物细胞催化汉黄芩素的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物汉黄芩素；B.反应产物即保留时间为16.8min的(+)-ESI图，分子量为461[M+H]⁺。图10.含有GAT的基因工程微生物细胞催化木蝴蝶素A的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物木蝴蝶素A；B.反应产物即保留时间为15.4min的(+)-ESI图，分子量为461[M+H]⁺。

图11.含有GAT的基因工程微生物细胞催化野黄芩素的HPLC分析和MS鉴定。A.HPLC分析；1,产物；2,底物野黄芩素；B.反应产物即保留时间为8.9min的(+)-ESI图，分子量为463[M+H]⁺。

图12.含有GAT的基因工程微生物细胞催化5,7–二羟基黄酮的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物5,7–二羟基黄酮；B.反应产物即保留时间为15.9min的(+)-ESI图，分子量为431[M+H]⁺。

图13.含有GAT的基因工程微生物细胞催化3',4',5,7–四羟基黄酮的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物3',4',5,7–四羟基黄酮；B.反应产物即保留时间为12.0min的(+)-ESI图，分子量为463[M+H]⁺。

图14.含有UGT的基因工程微生物细胞催化4',5,7–三羟基黄酮的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物4',5,7–三羟基黄酮；B.反应产物即保留时间为11.6min的(+)-ESI图，分子量为447[M+H]⁺。

图15.含有GAT的基因工程微生物细胞催化杨梅素的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物杨梅素；B.反应产物即保留时间为11.6min的(+)-ESI图，分子量为495[M+H]⁺。

图16.含有GAT的基因工程微生物细胞催化槲皮素的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物槲皮素；B.反应产物即保留时间为12.2min的(+)-ESI图，分子量为479[M+H]⁺。

图17.含有GAT的基因工程微生物细胞催化山奈酚的HPLC分析和MS鉴定。1.反应产物；2.底物山奈酚；B.反应产物即保留时间为11.1min的(+)-ESI图，分子量为463[M+H]⁺。

图18.含有GAT的基因工程微生物细胞催化5,7–二羟基–4'–甲氧基异黄酮的HPLC分析和MS鉴定。A.HPLC分析；1.反应产物；2.底物5,7–二羟基–4'–甲氧基异黄酮；B.反应产物即保留时间为18.5min的(+)-ESI图，分子量为461[M+H]⁺。

图19.含有GAT的基因工程微生物细胞催化染料木素的HPLC分析和MS鉴定。A.HPLC分析；1.反应产物；2.底物染料木素；B.反应产物即保留时间为10.3min的(+)-ESI图，分子量为447[M+H]⁺。

图20.含有GAT的基因工程微生物细胞催化大豆黄酮的HPLC分析和MS鉴定。A.HPLC分析；1.反应产物；2.底物大豆黄酮；B.反应产物即保留时间为6.6min的(+)-ESI图，分子量为453[M+Na]⁺。

图21.含有GAT的基因工程微生物细胞催化3',4',7–三羟基异黄酮的HPLC分析和MS鉴定。A.HPLC分析；1.反应产物；2.底物3',4',7–三羟基异黄酮；B.反应产物即保留时间为8.8min的(+)-ESI图，分子量为447[M+H]⁺。

图22.含有GAT的基因工程微生物细胞催化柚皮素的HPLC分析和MS鉴定。A.HPLC分析；1.反应产物；2.底物柚皮素；B.反应产物即保留时间为12.4min的(+)-ESI图，分子量为449[M+H]⁺。

图23.含有GAT的基因工程微生物细胞催化不同化合物的转化率。柱形图上方数字为所对应的化合物的转化率。

具体实施方式

本发明获得具有黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化催化活性的基因工程微生物细胞的方法：1.本发明中编码PGM、GalU、UGDH的多核苷酸

本领域的技术人员应该理解，在实施例中工程化的大肠杆菌细胞内高表达的PGM、GalU、UGDH酶蛋白，其相应的多核苷酸是直接从宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)基因组中利用常规PCR方法扩增获得的，然后与噬菌体T7的启动子和终止子构建成融合基因，再亚克隆到质粒表达载体上诱导表达，目的是促进细胞代谢通路向着UDP-葡萄糖醛酸合成方向进行，进而提高细胞代谢池内UDP-葡萄糖醛酸的水平；对这3个功能酶基因而言，它们不仅限于细胞自身的功能基因，本发明的保护范围只受权利要求书的限制。将实施例中所使用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其它启动子(如trc启动子、tac启动子、lac启动子)和表达载体，或这3个功能基因也可以用相同功能的其它多核苷酸替换，这是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。

2.本发明中编码GAT的多核苷酸

本发明利用不含有植物激素的MS固体培养基培养消毒处理过的黄芩种子，获得无菌苗；用QIANGENRNeasyPlantMiniKit纯化获得黄芩的总RNA，再利用Invitrogen公司的GeneRacer^TMRACEKit进行反转录获得cDNA，经巢式-PCR(Nested-PCR)方法得到基因片段，通过“TA”克隆到EZ-T载体上测序验证，共计获得11个编码黄芩的UDP-葡萄糖醛酸转移酶基因，亚克隆到大肠杆菌表达载体进行诱导表达，进行纯酶的体外催化活性分析，研究发现这些编码基因都具有催化活性，组合这11个基因片段的编码信息进行基因全合成为大肠杆菌偏好密码子的DNA，再亚克隆到表达载体与PGM、GalU、UGDH在大肠杆菌细胞内共表达，即获得具有催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化活性的工程化细胞。

3.黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化反应及其产物纯化

在LB培养基中诱导表达具有催化黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化活性的工程化细胞，工程化细胞诱导16h后，通过细胞量的不同，调节光密度为3.0，将细胞转入至10mlM9培养基中，加入20μl溶于DMSO的黄酮类化合物，使其浓度为0.6mM，于30℃反应24h后，冷冻干燥，冷干样品加入8ml85％热甲醇超声30min后离心，上清液过滤后经高效液相色谱分析。

通过以下的实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于实施例。

需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法。

实施例1：大肠杆菌基因组DNA提取：参照天根生化(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取细菌培养液1-5ml，10,000rpm离心1min，去上清。

(2)向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；加入4μlRNaseA(100mg/ml)溶液，振荡15sec，室温放置5min。

(3)向管中加入20μlProteinaseK溶液，混匀。

(4)加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec。

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

(9)重复操作步骤(8)。

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，即获得基因组DNA，-20℃保存备用。

实施例2：大肠杆菌BL21(DE3)PGM、GalU基因的获得和表达质粒的构建

大肠杆菌PGM基因的获得：

以基因数据库GenBank注册号为EG12144的核酸序列为基础设计合成PCR反应引物：

PGM_1:5′-ACGTTGCAGACAAAGGACAAAGCA-3′

PGM_2:5′-GATATACCATGGCAATCCACAATCGTGCAG-3′(下划线为NcoI位点)

PGM_3:5′-TGTGTGGCTAGCTTACGCGTTTTTCAGAACTTCGCTAAC-3′(下划线为NheI位点)

PGM_4:5′-GCGTAGCGCATCAGGCAATTCTGT-3′

以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA为模板，用引物PGM_1/4进行第一轮PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物PGM_2/3进行Nested-PCR扩增(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1700bp的DNA片段(图2)。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后用限制性内切酶NcoI和NheI酶切，再与用相同的内切酶酶切的载体pET28a(Novagen公司)进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性克隆，使用通用测序引物T7启动子和T7终止子进行测序验证，即得到含有如SEQIDNO:1所示基因PGM的质粒pET28a-PGM，其中SEQIDNO:1所编码的氨基酸残基序列如SEQIDNO:2。为实现PGM与其它功能酶基因的共表达，再利用限制性内切酶XbaI和XhoI亚克隆PGM基因片段到含有复制位点pSC101的表达质粒pSLB208/EG12上(王伟，孔建强，孟超，朱平，程克棣.大肠杆菌组合生物合成紫杉烯的研究.中国药学杂志，2005,40(18):1428-1431)，即得到含有PGM基因的表达载体pSLB208-PGM。

大肠杆菌GalU基因的获得：

以基因数据库GenBank注册号为NP_415752的核酸序列为基础设计合成PCR反应引物：

GALU_1:5′-GGGATGCGATACAGAAATATGAAC-3′

GALU_2:5′-GGAGAAACTAGTATGGCTGCCATTAATACGAAAGTC-3′(下划线为SpeI位点)

GALU_3:5′-GTCATTGGGATCCGTCCGGTTTAAGACAATTTAATAAG-3′(下划线为BamHI位点)

GALU_4:5′-GCACTTGCTTAAAATCCCGCCAGC-3′

以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA为模板，用引物GALU_1/4进行第一轮PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物GALU_2/3进行Nested-PCR扩增(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1000bp的DNA片段(图2)。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后用限制性内切酶SpeI和BamHI酶切，再与用限制性内切酶NheI和BamHI酶切的载体pET28a(Novagen公司)进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性克隆，使用通用测序引物T7启动子和T7终止子进行测序验证，即得到含有SEQIDNO:3所示基因GalU的质粒pET28a-GalU，其中SEQIDNO:3所编码的氨基酸残基序列如SEQIDNO:4。为实现GalU与其它功能酶基因的共表达，再利用限制性内切酶NdeI和XhoI亚克隆GalU基因片段含有复制位点pSC101的表达质粒pSLB208/EG12上，即得到含有GalU基因的表达载体pSLB208-GalU。

大肠杆菌PGM-GalU基因串联体的获得：

为促进PGM和GalU2个功能酶在细胞内高表达和催化活性高效耦联，这2步催化反应才有可能实现代谢流向UDP-葡萄糖。于是设计引物并利用PCR方法得到各自分别含有T7启动子和T7终止子融合基因串联体。其构建过程如下：

合成引物：

PGM_GALU1:5′-ACTGCGAAAGCTTCCTCGGTGA-3′(下划线为HindIII位点)

PGM_GALU2:5′-AGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTACGCGTTTTTCAGAACTTCG-3′

PGM_GALU3:5′-TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCT-3′

PGM_GALU4:5′-CCTATAGTGAGTCGTATTAACAAAAAACCCCTCAAGACC-3′

PGM_GALU5:5′-TTAATACGACTCACTATAGG-3′

PGM_GALU6:

5′-TCGAATTCGGATCCGCGACCCATGCTAGCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAG-3′(下划线为BamHI和NheI位点)

PGM_GALU7:

5′-GGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGCGAC-3′(下划线为XhoI位点)

利用上述3组不同的引物PGM_GALU1/2、PGM_GALU3/4、PGM_GALU5/6和含有PGM基因的质粒pET28a-PGM为模板进行PCR扩增(95℃，5min；95℃，30S，50℃，40S，72℃，15S，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，分别扩增出PGM基因3′-端片段108bp的DNA片段、T7终止子120bp的DNA片段、T7启动子120bp的DNA片段，纯化回收这3个DNA片段，各取2μl(约100ng)与PyroBestTaqDNApolymerase1U、2μlreactionbuffer、1μldNTPs(10mM)、ddH₂O等试剂组成20μl的反应体系，进行DNA片段的补平反应(95℃，2min；95℃，30S，50℃，40S，72℃，30S，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。然后利用补平反应后的DNA片段产物为模板，再利用引物PGM_GALU1/7进行PCR扩增(95℃，5min；95℃，30S，45℃，40S，72℃，30S，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到长度为339bp的DNA片段；利用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切并亚克隆到用相同内切酶处理的表达质粒pET28a-PGM(PGM基因的3′-端含有HindIII位点)中，即得到中间质粒pET28a-PGM-T7。利用限制性内切酶SpeI和BamHI酶切纯化回收GalU基因的DNA片段，然后与利用限制性内切酶NheI和BamHI酶切处理的质粒pET28a-PGM-T7进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性克隆，通过测序验证，即得到质粒pET28a-PGM-T7-GalU。为实现PGM-GalU基因串联体与其它功能酶基因的共表达，再利用限制性内切酶XbaI和XhoI亚克隆到含有复制位点pSC101的表达质粒pSLB208/EG12上，即得到含有PGM和GalU基因的表达载体pSLB208-PGM-GalU。

实施例3：大肠杆菌BL21(DE3)UGDH基因的获得和表达质粒的构建

大肠杆菌UGDH基因的获得：

以美国基因数据库GenBank注册号为EG13407的核酸序列为基础设计合成PCR反应引物：

UGDH_1:5′-AATAAATATCAGCTATTCTTATAAAGAAAATCTG-3′

UGDH_2:5′-GGATCCCATATGAAAATCACCATTTCCGG-3′(下划线为NdeI位点)

UGDH_3:

5′-AAGCTTGTCGACGGAGCTCGGATCCTAGTAAATCAATCAAATCAATCTGTTC-3′(下划线为SalI位点)

UGDH_4:5′-CATCTTGCCACGCCACAACTGCACT-3′

以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA为模板，用引物UGDH_1/4进行第一轮PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物UGDH_2/3进行Nested-PCR扩增(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1400bp的DNA片段(图2)。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后用限制性内切酶NdeI和SalI酶切，再与用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切处理的质粒载体pEG12(王伟，孟超，朱平，程克棣.绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建.2005,25(9):35-39)进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性克隆，使用通用测序引物T7启动子和T7终止子进行测序验证，即得到含有SEQIDNO：5所示基因UGDH的质粒pEG-UGDH，SEQIDNO:5所编码的氨基酸残基序列如SEQIDNO:6；该表达质粒具有复制子ColE1，能够与含有复制子pSC101的表达质粒在大肠杆菌细胞中相互兼容并可以同时诱导高表达。

实施例4：本发明中编码GAT的多核苷酸的获得和表达载体的构建

黄芩GAT基因的获得：

首先利用不含有激素的植物组织培养基(MS固体培养基)培养经70％乙醇和0.1％升汞消毒处理过的黄芩种子，获得无菌苗；用QIANGENRNeasyPlantMiniKit纯化获得黄芩的总RNA，参照美国基因数据库注册号AB479151的核酸序列合成引物：

GAT1:

5′-CGAGGACACTGACATGGACTGGACAAGGCCATGGAAGACACACTTGTGATCTACACAAC-3′(下划线为NcoI位点)

GAT2:

5′-GACAAGGCCATGGAAGACACACTTGTGATCTACACAACGCCGGAGCACAT-3′(下划线为NcoI位点)

GAT3：5′-CAGTGTACTCGAGTTAATCCCGAGTGGCGTGAAGAAA-3′(下划线为XhoI位点)

GAT4：5′-AATCCCACAATTTCTCATCTTACC-3′

GAT5：5′-CCCTCTTTAAATCACTCATAAATCG-3′

以GAT5为引导引物和利用Invitrogen公司的GeneRacer^TMRACEKit进行反转录获得cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，用引物GAT_1/4进行第一轮PCR(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物GAT_2/3进行Nested-PCR扩增(95℃，5min；95℃，50S，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，；4℃，10min)，得到一条长约为1400bp的DNA片段。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，通过“TA”克隆到EZ-T载体上测序验证，共获得如SEQIDNO：33～SEQIDNO：43所示的11个编码黄芩的UDP-葡萄糖醛酸转移酶基因，即获得质粒EZ-GAT。

质粒载体pTWINB的构建和表达载体pTWINB-GAT的构建：

为了方便GAT基因在质粒载体pTWIN1(NewEnglandBiolabs)系统上表达，于是对其进行多克隆位点的修饰，设计合成引物：

Twin1_B1:5′-GATATACCATGGGCAGCAGCCATCAT-3′(下划线为NcoI位点)

Twin1_B2:5′-TCAGTAAGATCTTTAGCAGCCGGATCTCAGTG-3′(下划线为BglII位点)以质粒pET-28a为模板，用PCR方法扩增(95℃，5min；95℃，30S，50℃，45S，72℃，15S，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)得到其多克隆位点区197bp的DNA片段，纯化回收后用限制性内切酶NcoI和BglII酶切处理，与经内切酶NcoI和BamHI酶切处理的质粒载体pTWIN1进行DNA连接反应，经CaCl₂转化法转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性克隆，使用通用测序引物T7终止子进行测序验证，即得到质粒载体pTWINB。利用限制性内切酶NcoI和XhoI酶切上述测序验证的质粒EZ-GAT，亚克隆到表达载体pTWINB，得到表达载体pTWINB-GAT。

实施例5野生型GAT纯酶的催化活性分析

融合蛋白的诱导表达：选取含有SEQIDNO：34所编码的UDP-葡萄糖醛酸转移酶(pTWINB-GAT2^#)为例说明其催化活性的鉴定，用CaCl₂法将质粒pTWINB-GAT2^#转化大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取培养过夜的单克隆接种到含有氨苄青霉素钠(100μg/ml)的30mlLB培养基中，在37℃、200rpm培养至OD₆₀₀到1左右；按1％的接种量转接到100ml含有氨苄青霉素钠(100μg/ml)的LB培养基中，在37℃、200rpm继续培养至OD₆₀₀到0.6左右，加入终浓度0.55mMIPTG诱导剂在16℃低温诱导表达18小时，离心收集菌体。

融合蛋白的纯化：

(1)亲和柱层析:用30ml的裂解缓冲液(BufferB1)(20mMNa-HEPES,pH8.5,500mMNaCl,1mMEDTA)将菌体重悬，每管加入30μL的PMSF(20mM)超声破碎细胞，使蛋白释放12500rpm离心15min，上清转入1.5mLEP管中，再17000rpm离心15min，上清过2.5μm滤膜，上样到BufferB1平衡后几丁质亲和层析柱，上样流速约为0.5-1.0ml/min。

(2)洗柱：用约20倍柱体积BufferB1洗去除杂蛋白；然后用用3倍柱体积BufferB2(20mMNa-HEPES,pH7.0,500mMNaCl,1mMEDTA)洗柱，恒温放置过夜。

(3)目标蛋白的洗脱：用3倍柱体积的BufferB2洗脱，将洗脱液收集。洗脱液经超滤处理(采用截留分子量10000Da的超滤管，4500g,30min)，将浓缩的蛋白同样采用超滤方式替换为反应缓冲液(重复操作6-8次)，获得催化反应的蛋白酶。用SDS-PAGE电泳进行电泳分析，结果见图3，泳道4所示的样品就是经过几丁质柱亲和层析后的纯酶蛋白。

(4).纯酶的活性分析

实验条件：以黄芩素为检测底物，在柠檬酸缓冲液(PH6.5,10mM)进行酶促活性分析。反应体系如下：

将对照组和实验组放置于37℃水浴中反应，分别于10min,30min,1h,4h取样，各取400μl；其中实验组取样后各加50μl色谱甲醇终止反应。冷干后各加入400μl色谱甲醇充分溶解样品，过滤，经液相色谱分析，色谱柱(Varian,C18,250×4.6mm)。色谱分析(HPLC)的方法：

注：A相:水+0.5％三氟乙酸(TFA)B相:90％乙腈(AcN)+0.5％TFA

图4是纯酶GAT催化黄芩素葡萄糖醛酸苷化反应产物的HPLC分析，结果表明保留时间31min的洗脱色谱峰(箭头所示)为黄芩素葡萄糖醛酸苷化产物。收集保留时间为31min的色谱峰的样品，并结合黄芩苷标准品的HPLC和ESI-MS/MS分析，确定保留时间为31min的色谱峰为黄芩苷，即证明了纯酶GAT可催化黄芩素转化为葡萄糖醛酸化的产物黄芩苷。

同时对5,7–二羟基黄酮、3',4',5,7–四羟基黄酮、槲皮素、4',5,7–三羟基黄酮、5,7–二羟基黄酮–4'–甲氧基异黄酮、染料木素、大豆黄酮、3',4',7–三羟基异黄酮、柚皮素、杨梅素和野黄芩素等11个黄酮类化合物的催化活性分析(如图5所示)，最终确定了pTWINB-GAT2^#克隆具有催化活性高、底物选择性广的编码UDP-葡萄糖醛酸转移酶的侯选基因。

实施例6突变型GAT基因(SEQIDNO：8)DNA的合成

为使GAT在大肠杆菌细胞内高表达并提高其催化活性，综合所克隆的编码基因信息将基因全合成为大肠杆菌偏好密码子的DNA，SEQIDNO：8序列的合成可使用SEQIDNO：46～SEQIDNO：79通过连续重叠PCR方法来合成，具体方法如下：将整个DNA片段分成前后两个部分GAT-F1和GAT-F2分别合成，然后通过限制性内切酶HpaI酶切使两个片段连接成一个完整的片段。其中GAT-F1片段的合成使用SEQIDNO：46～SEQIDNO：61进行连续重叠PCR扩增合成，首先采用引物GAT_F1-8和GAT_F1-9进行DNA片段的补平反应(95℃，4min；95℃，10S，45℃，30S，72℃，10S，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)；然后利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用引物GAT_F1-7和GAT_F1-10进行进行第一轮PCR扩增(95℃，4min；95℃，30S，45℃，40S，72℃，15S，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)；其扩增产物作为下一组引物GAT_F1-6和GAT_F1-11进行PCR扩增反应的模板，再进行第二轮PCR扩增反应(95℃，5min；95℃，30S，45℃，40S，72℃，20S，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)；随后依次进行PCR扩增的引物为GAT_F1-5和GAT_F1-12、GAT_F1-4和GAT_F1-13、GAT_F1-3和GAT_F1-14、GAT_F1-2和GAT_F1-15、GAT_F1-1和GAT_F1-16；每延长一组引物的PCR扩增反应，其PCR反应的延伸时间增加5S，经过7轮PCR扩增反应，扩增得到约657bp的DNA片段；通过TA克隆到载体EZ-T上进行测序验证，得到质粒EZ-GAT-F1。其中GAT-F2片段的合成使用SEQIDNO：62～SEQIDNO：79进行连续重叠PCR扩增合成，具体的连续重叠PCR扩增反应步骤与GAT-F1片段的过程相同，经过8轮PCR扩增反应，扩增得到约744bp的DNA片段；通过TA克隆到载体EZ-T上进行测序验证，得到质粒EZ-GAT-F2；最后利用利用限制性内切酶HpaI和HindIII酶切EZ-GAT-F2，纯化回收GAT-F2的DNA片段并与相同内切酶处理质粒EZ-GAT-F1连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并进行DNA测序验证，得到完整的如SEQIDNO：8所示的GAT编码基因，即质粒EZ-GAT，其中SEQIDNO：8所编码如SEQIDNO：7的氨基酸残基序列；最后再利用内切酶NcoI和XhoI亚克隆到表达载体pTWINB，得到表达载体pTWINB-GAT。为实现GAT与其它3个基因的共表达，利用内切酶NdeI和XhoI把整个融合蛋白的阅读框亚克隆到以质粒pACYC184为克隆载体所构建的质粒pAI上(王伟，孔建强，孟超，朱平，程克棣.大肠杆菌组合生物合成紫杉烯的研究.中国药学杂志，2005,40(18):1428-1431)，该表达质粒含有p15A复制位点，能与具有复制子ColE1的表达质粒pEG-UGDH和含有复制子pSC101的表达质粒pSLB208-PGM-GalU在大肠杆菌细胞中相互兼容并可以同时诱导高表达。

实施例7：突变型GAT和其它酶蛋白组合表达的催化活性分析

用CaCl₂转化法将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，制备含有不同质粒组合的工程菌见下表：

挑取单克隆接种到含有抗生素的30mlLB培养基中，在37℃、200rpm培养至OD₆₀₀到1.0左右；按1％的接种量转接到100ml含有不同抗生素的LB培养基中，在37℃、200rpm继续培养至OD₆₀₀到0.6左右，加入终浓度0.55mMIPTG诱导剂在16℃低温诱导表达18小时，首先取少量样品进行SDS-PAGE分析，结果如图6所示4个融合蛋白共表达会导致GalU和UGDH的表达量降低，而GAT融合蛋白较大本身可溶性表达较低。

进行不同功能基因组合的工程化细胞以及不含有GAT的对照组(BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU/pEG-UGDH)的催化活性分析，向上述不同组合的工程化细胞菌液中加入20μl底物黄芩素(溶于DMSO中，浓度为81mg/ml)，使反应体系中黄芩素浓度为0.6mM；将上述反应体系置于摇床中(30℃，150rpm)反应6h。葡萄糖醛酸苷化反应结束后，将各反应体系转移至30ml离心管中，冷干，8ml85％热甲醇超声30min后离心，上清液经0.22μm膜过滤后，即得到反应产物，进行HPLC分析，进样体积为20μL,根据产物的相对峰面积计算转化率，转化产率结果如图7所示。

反应产物的色谱分析(HPLC)的方法：

注：A相:水+0.5％三氟乙酸(TFA)B相:100％乙腈(AcN0

结果表明，缺失pACYC184-GAT的葡萄糖醛酸苷化工程化菌无活性，而pEG-UGDH为葡萄糖醛酸苷化工程化大肠杆菌细胞的关键酶，并且缺失pEG-UGDH的工程化细胞产率低，而四种基因都存在的葡萄糖醛酸苷化工程化大肠杆菌细胞催化黄芩素得到的产率最高。

实施例8葡萄糖醛酸苷化工程化大肠杆菌细胞的制备及催化产物的分离鉴定

用CaCl₂法将质粒pSLB208-PGM-GalU转化大肠杆菌BL21(DE3)中，在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上培养过夜，挑取单克隆接种到含有卡那霉素(50μg/ml)的30mlLB培养基中，在37℃、200rpm培养至OD₆₀₀到0.6左右；在超净台中将培养液转入1.5ml离心管，8000rpm离心1min，弃上清；用800μl预冷的100mM的CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30min，然后8000rpm离心1min，弃上清；再加入100μl预冷的含有15％甘油、100mM的CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，即获得感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU；感受态细胞可继续进行其它质粒的转化，或-70℃低温冰箱保存备用，可保存半年以上。取感受态细胞BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU，继续利用CaCl₂法转化质粒pEG-UGDH，然后在含有卡那霉素(50μg/ml)、氨苄青霉素钠(100μg/ml)的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到含有卡那霉素和氨苄青霉素钠的30mlLB培养基中，在37℃、200rpm培养至OD₆₀₀到0.6左右；继续参照上述方法制备感受态细胞BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU/pEG-UGDH；再用CaCl₂法转化第3个质粒pACYC184-GAT，然后在含有卡那霉素(50μg/ml)、氨苄青霉素钠(100μg/ml)、氯霉素(25μg/ml)的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到含有卡那霉素、氨苄青霉素钠和氯霉素的30mlLB培养基中，在37℃、200rpm培养至OD₆₀₀到1.0左右；按1％的接种量转接到100ml含有卡那霉素、氨苄青霉素钠和氯霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm继续培养至OD₆₀₀到0.6左右，加入终浓度0.55mMIPTG诱导剂在16℃低温诱导表达18小时；测定诱导表达的工程菌液光密度(O.D_600nm)，根据光密度值取不同体积(V×O.D_实测＝10×3.0，使离心的菌体悬浮于10mlM9培养基中的光密度值为3.0)的菌液于8000rpm离心1min收集菌体，弃培养基。然后用10ml的M9培养基(1xM9salts、2mMMgSO₄、0.1mMCaCl₂、2％glucose)漂洗菌体一次，同样经8000rpm离心1min收集菌体，弃培养基。再用M9培养基重悬菌体，再加入卡那霉素、氨苄青霉素钠、氯霉素和IPTG，其终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、25μg/ml和0.55mM；同时再向工程化细胞BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU/pEG-UGDH/pACYC184-GAT菌液中加入待葡萄糖醛酸苷化修饰的底物，如加入20μl底物黄芩素(溶于DMSO中，浓度为81mg/ml)，使反应体系中黄芩素浓度为0.6mM；将上述反应体系置于摇床中(30℃，150rpm)反应6h。葡萄糖醛酸苷化反应结束后，将各反应体系转移至30ml离心管中，冷干，8ml85％热甲醇超声30min后离心，上清液经0.22μm膜过滤后，即得到反应产物，待经HPLC和HPLC-MS/MS分析，结果如图8-22所示。其中化合物黄芩素、野黄芩素、3',4',5,7–四羟基黄酮、4',5,7–三羟基黄酮、槲皮素、染料木素、大豆黄酮、3',4',7–三羟基异黄酮和柚皮素的色谱分析(HPLC)的方法：

注：A相:水+0.5％三氟乙酸(TFA)B相:100％乙腈(AcN)

化合物汉黄芩素、木蝴蝶素A、5,7–二羟基黄酮、杨梅素、山奈酚和5,7–二羟基黄酮–4'–甲氧基异黄酮的色谱分析(HPLC)的方法：

注：A相:Water+0.5％TFAB相:100％AcN

其中，各反应产物采用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用系统进行HPLC-MS/MS质谱分析，结果显示，反应产物的分子量为相应的底物分子量增加176，即为葡萄糖醛酸苷化的黄酮产物。

利用产物峰面积除以底物的峰面积和产物的峰面积的和计算得到化合物的转化率，结果如下表所示：

Claims (21)

1.一种基因工程菌，其特征在于：在细胞内共表达编码磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的基因。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是原核微生物细胞。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的原核微生物细胞是大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为生物保藏编号为CGMCCNo.8819的菌种。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的编码磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的基因表达使用组成型启动子或诱导型启动子启动其高表达。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的编码磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的基因通过整合型或质粒型载体高表达。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的磷酸葡萄糖变位酶基因是如SEQIDNO:1所表示的碱基序列组成的多核苷酸。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的磷酸葡萄糖变位酶是如SEQIDNO:2所表示的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的磷酸葡萄糖变位酶具有催化葡萄糖-6-磷酸转变成葡萄糖-1-磷酸的酶活性。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因是如SEQIDNO:3所表示的碱基序列组成的多核苷酸。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是如SEQIDNO:4所表示的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

12.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶具有催化葡萄糖-1-磷酸和三磷酸尿苷形成尿苷二磷酸葡萄糖的酶活性。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因是如SEQIDNO:5所表示的碱基序列组成的多核苷酸。

14.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶是如SEQIDNO:6所表示的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

15.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶具有催化尿苷二磷酸葡萄糖形成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的酶活性。

16.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的特征在于：

⑴SEQIDNO:7所示的氨基酸残基序列；或

⑵SEQIDNO:7所示的氨基酸残基经替换、添加或缺失1-100个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸残基序列。

17.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因是如SEQIDNO:8所表示的碱基序列组成的多核苷酸。

18.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因选自如SEQIDNO:33-SEQIDNO:43所示的任一个碱基序列组成的多核苷酸。

19.权利要求1-18中任一项所述的基因工程菌的在生物催化如下底物中的形成相应的葡萄糖醛酸苷的应用，所述的底物选自⑴黄酮底物；⑵黄酮醇底物；⑶异黄酮底物；⑷二氢黄酮底物。

20.根据权利要求19的应用，其特征在于，

⑴所述的黄酮底物选自黄芩素、野黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A、5,7–二羟基黄酮、3',4',5,7–四羟基黄酮、4',5,7–三羟基黄酮；

⑵所述的黄酮醇底物选自槲皮素、山奈酚；

⑶所述的异黄酮底物选自5,7–二羟基黄酮–4'–甲氧基异黄酮、3',4',7–三羟基异黄酮、染料木素、大豆黄酮；

⑷所述的二氢黄酮底物选自柚皮素。

21.根据权利要求19-20中任一项的应用，其特征在于，所述的应用是利用活细胞作为生物催化剂，直接生物催化或生物合成黄酮类化合物形成黄酮-O-葡萄糖醛酸苷。