CN102618570B - 构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法。该构建方法主要包括失活或者敲除TCA循环中富马酸至苹果酸转化的关键酶富马酸酶，敲除抑制TCA循环的关键基因arcA。进一步地，还可以敲除丁二酸、乳酸、甲酸途径关键酶基因，实现厌氧条件下富马酸的积累。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法。
背景技术
富马酸是一种重要的四碳有机酸，酸度为柠檬酸的1.5倍，因含有一个双键，二个羧基的特殊分子结构，富马酸可进一步通过氨化、水合、加氢、异构、聚合等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、聚合物等，使其成为重要的平台化工原料而被广泛应用于树脂、涂料、增塑剂、食品、饲料等领域。目前，市场上所售的富马酸主要通过石化法获得，随着石油资源的不断消耗和石油价格的持续波动，以及化学法制备过程所产生的环境污染等原因，富马酸产业的可持续发展面临严峻的挑战。
现有技术报道的能够产生富马酸的微生物有霉菌、酵母和细菌，其中根霉菌被作为重点研究对象。近年来，发酵法制备富马酸的研究主要集中于菌种选育、培养条件优化及廉价底物的利用。Kang以紫外和γ射线诱变米根霉，筛选获得了一株富马酸产量提升1.9倍的突变株，5 L发酵罐水平为32.1 g/L。Zhou等通过优化米根霉种子培养过程，获得了较为理想的菌球状形态，在此条件下，富马酸产量为38.2 g/L。Fu等开发了双阶段溶氧调控的策略，富马酸产量达56.2 g/L，且过程能耗得到显著降低。Xu等采用双阶段利用木质纤维素的工艺路线，最终富马酸产量达27.7 g/L。
发酵法制备富马酸以可再生生物质资源为原料，不仅摆脱了对石油基资源的过分依赖，且过程温和，可控性强，有力的保证了富马酸产业的可持续发展。但常用的根霉菌生长速度缓慢、产品生产强度偏低、成本相对较高，且根霉菌遗传背景不清晰，基因操作难度大。故开发营养要求简单、生长迅速、生产强度高、背景清晰的富马酸生产菌株，是加速生物法替代石化法生产的关键。
大肠杆菌具有生长快速、培养条件简单、遗传背景清晰、价格低廉等诸多优点，利用大肠杆菌发酵生产有机酸是近年来研究开发的热点。Soon Ho Hong等人敲除了野生大肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因，减少了副产物甲酸、乳酸、乙酸及乙醇的积累，促进了丁二酸的生成。大肠杆菌具有富马酸的代谢途径，但一般不过多积累，要提高其产富马酸的能力，对现有菌株进行基因改造是重要途径。
关于利用基因工程菌产富马酸已有报道，刘立明等以光滑球拟酵母为宿主，过量表达来源于米根霉的苹果酸脱氢酶基因和富马酸酶基因，获得了一株产富马酸的工程菌，发酵液中富马酸产量达35 mg/L。姜岷等通过敲除富马酸还原酶（FRD）基因，过量表达苹果酸酶后，获得了产富马酸的大肠杆菌基因工程菌。但上述研究所涉及的富马酸基因或外源导入，或为混合酸途径中的相关基因，尚未见通过强化TCA中相关基因促进富马酸生成的相关报道。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种构建高产富马酸的基因工程菌株的方法，使得构建的菌株能厌氧高产富马酸。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用以下的技术方案。
一、一种构建产富马酸大肠杆菌（Escherichia coli）基因工程菌的方法，以大肠杆菌出发菌株，敲除其TCA循环途径中编码的富马酸酶（FUM）基因以阻断富马酸至苹果酸的转化途径；以及敲除抑制其TCA循环途径中的TCA循环抑制蛋白基因（arcA）实现厌氧条件下TCA循环的正常运作，得到可实现厌氧途径下富马酸高效积累的产富马酸大肠杆菌基因工程菌。
需要特别指出的是：上述敲除富马酸酶（FUM）基因和敲除TCA循环抑制蛋白基因（arcA）的步骤不分先后完成，即可以先敲除FUM基因再敲除arcA；而可以先敲除arcA再敲除FUM基因；两种顺序均能得到所述的产富马酸大肠杆菌基因工程菌。
进一步地，所述的方法还包括以下步骤：敲除富马酸还原酶（FRD）基因、丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）基因和乳酸脱氢酶（LDH）基因中的一种或多种。其中，敲除富马酸还原酶（FRD）基因，目的是阻断富马酸至丁二酸的转化，减少杂酸丁二酸的生成；敲除丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）基因，目的是降低代谢途径中甲酸生成；敲除乳酸脱氢酶（LDH）基因，降低代谢途径中乳酸生成。
其中，本发明所述的敲除其TCA循环途径中编码的富马酸酶（FUM）基因的方法，包括敲除FUM基因的完整基因片段，或者敲除FUM基因的亚基部分。例如，本发明所述的出发菌株E. coli MG1655的FUM基因涉及fumA、fumB、fumC三种亚基。
同理，本发明所述的敲除富马酸还原酶（FRD）基因的方法，也包括敲除FRD基因的完整基因片段，或者敲除FRD基因的亚基部分。例如，本发明所述的出发菌株E. coli MG1655的FRD基因涉及frdA、frdB、frdC、frdD四种亚基。
本发明所述的敲除乳酸脱氢酶（LDH）基因的方法，也包括敲除LDH基因的完整基因片段，或者敲除LDH基因的亚基部分。例如，本发明所述的出发菌株E. coli MG1655的LDH基因涉及ldhA一种亚基。
二、根据本发明所述的构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法构建得到的产富马酸大肠杆菌基因工程菌。
三、根据本发明所述的构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法构建得到的产富马酸大肠杆菌基因工程菌发酵生产富马酸的方法。
具体步骤：按体积比1%接种量将构建得到的产富马酸大肠杆菌基因工程菌接种入种子培养基进行有氧种子培养，当OD达到3时，按体积比10%的接种量接种至发酵培养基进行厌氧发酵。
本发明的有益效果在于：
（1）现有技术主要涉及的是非TCA途径的改造，一般只涉及线粒体外基因改造或外源富马酸相关基因的导入；而本申请改造的特殊性在于，针对TCA途径进行了与富马酸生成相关基因的改造，实现了厌氧条件下富马酸的积累。
（2）主要通过敲除富马酸酶（FUM）基因以阻断从富马酸到苹果酸途径，并敲除了TCA循环抑制蛋白（arcA）基因，最终实现积累富马酸；进一步地，本发明还可以敲除富马酸还原酶（FRD）基因阻断富马酸到丁二酸途径，以及敲除一些副产物途径（LDH和PFL基因）的基因，使得通过本发明的优化方法得到的基因工程菌的累积产酸效果更佳理想。
（3）利用本发明实施例的发酵结果表明，实施例中新构建的重组大肠杆菌E.coliHH5能够大量积累富马酸，且乳酸、乙酸、丁二酸等的积累较少。
附图说明
图1大肠杆菌（Escherichia coli）的代谢途径示意图。
其中，FRD、FUM、LDH、PFL、arcA表示本发明构建方法中所敲除的基因。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作了详细说明，但对本发明没有限制。
基本来源信息：
1、出发菌株：E. coli MG1655，清华大学陈国强老师赠送。
其中，E. coli MG1655的FRD、FUM、LDH、PFL、arcA基因序列来源于GENE BANK，其序列号分别为：fumA（EG 10356）、fumB（EG 10357）、fumC（EG 10358）、frdA（EG 10330）、frdB（EG 10331）、frdC（EG 10332）、frdD（EG 10333）、arcA（EG 11703）、ldhA（EG13186）、pflB（EG 10701）。
2、质粒：pKD3、pKD46、pCP20，均由清华大学陈国强老师赠送。
PKD3、pKD46、pCP20是实现RED重组的3个质粒，其中pKD3主要提供引物模板（用于合成具有抗生素标记的外源基因片段），pKD46作用是实现外源基因与目标片段的整合，目标基因片段的敲除。pCP20的主要作用是将外源基因片段从宿主中剔除（抗生素标记剔除），以实现目标基因片段的无痕敲除。
获得第1和第2点的生物材料的途径：申请人通过非专利文献“Zheng-jun Li, Zhen-yu Shi, Jia Jian, et al. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic Engineering. 12(2010). 352-359.”中的发明人信息（第352页左下角有传真010-62794217和电子邮件chengqmail.tsinghua.edu.cn）获得了主要发明人清华大学陈国强老师的联系方式，并通过陈国强老师获赠了上述生物材料。并且申请人在此声明，保证从本申请的申请日起二十年内向公众发放上述生物材料。
实施例1
本实施例说明利用RED重组技术敲除出发菌株亲本E. coli MG1655中编码TCA循环富马酸酶（FUM）基因的方法。
1、利用LB培养基，于37℃，有氧条件下培养E. coli MG1655至OD600=0.6，制备成电转化感受态。
2、将质粒pKD46导入感受态大肠杆菌，30℃培养过夜，次日接种至LB培养基（含氨苄青霉素，100 μg/L），30℃培养至OD=0.25，在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于37℃下诱导质粒pKD46表达EXo、Bet和Gam三个蛋白，再次制备感受态E. coli MG16551。
3、以两侧带有FRT位点的，具有氯霉素抗性的pKD3为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有fumA同源片段的扩增引物，扩增获得线性DNA同源片段。同理，结合各种亚基，即fumA、fumB、fumC亚基基因序列设计引物，引物序列如下：
上游同源臂引物H1-P1(fumA)，单下划线同源片段：
5’TCTTTTTTGAGTGGAAAAGGAGCCTGATAATGAAAGGGTTTGTTTGACATGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游同源臂引物H1-P2(fumA)，单下划线同源片段：
5’ATGTCAAACAAACCCTTTCATTATCAGGCTCCTTTTCCACTCAAAAAAGATTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
上游同源臂引物H2-P1(fumB)，单下划线同源片段：
5’TCTTTCCCCATCGGGAAAGGTGCCTGGTAGATAAAGGGTTTGTTTGACAT GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游同源臂引物H2-P2(fumB)，单下划线同源片段：
5’ATGTCAAACAAACCCTTTATCTACCAGGCACCTTTCCCGATGGGGAAAGA TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
上游同源臂引物H3-P1(fumC)，单下划线同源片段：
5’AACCCGACGCTCATATTGGCACTGGAAGCCGGGGCATAAACTTTAACCAT GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游同源臂引物H3-P2(fumC)，单下划线同源片段：
5’ATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTT TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
对模板pKD3进行PCR反应，反应条件：95 ℃变性5min，经94℃ 30 sec，52℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，降温至37℃，加入适量核酸内切酶DpnI（购自Takara）去除模板，获得的PCR产物经电泳分析确认。
电转线性DNA片段（含有氯霉素基因）至E. coli MG16551感受态（含有pKD46），并涂布于带有氯霉素的LB平板筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，获得敲除了FUM基因的菌株E.coli MG16552。进行E.coli MG16552的感受态制备，导入能够诱导表达FLP重组酶（FLP是一个单体蛋白，在质粒pCP20诱导下表达，该蛋白表达后，可以消除由质粒pKD3引入的外源基因）的质粒pCP20)，42℃下诱导表达FLP重组酶，消除质粒pKD3引入的的氯霉素基因。基于敏感型筛选，构建获得缺失FUM基因的突变株E.coli HH1。
实施例2
本实施例说明以E.coli HH1为出发菌株，利用RED重组技术，敲除抑制TCA循环的蛋白基因（arcA），实现无氧条件下TCA循环的正常开启的方法。
1、利用LB培养基，于37℃，有氧条件下培养E. coli HH1至OD600=0.6，制备成电转化感受态。
2、将质粒pKD46导入感受态大肠杆菌，30℃培养过夜，次日接种至LB培养基（含氨苄青霉素，100 μg/L），30℃培养至OD=0.25，在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于37℃下诱导质粒pKD46表达EXo、Bet和Gam三个蛋白，再次制备感受态E. coli HH11。
2、以两侧带有FRT位点的，具有氯霉素抗性的pKD3为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有FRD同源片段的扩增引物，扩增获得线性DNA同源片段。结合arcA基因序列设计引物，引物序列如下：
上游同源臂引物H4-P1，单下划线同源片段：
5’TTGCGTGTTACCAACTCGTCTTCAACGATAAGAATGTGCGGGGTCTGCAT GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游同源臂引物H4-P2，单下划线同源片段：
5’ATGCAGACCCCGCACATTCTTATCGTTGAAGACGAGTTGGTAACACGCAA TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
对模板pKD3进行PCR反应，反应条件：95 ℃变性5min，经94℃ 30 sec，52℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，降温至37℃，加入适量核酸内切酶DpnI去除模板，获得的PCR产物经电泳分析确认。
电转线性DNA片段（含有氯霉素基因）至E. coli HH11感受态（含有pKD46），并涂布于带有氯霉素的LB平板筛选阳性重组子，进行PCR鉴定，获得敲除了arcA基因的菌株E.Coli HH12。进行E.Coli HH12的感受态制备，导入能够诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，42℃下诱导表达FLP重组酶，消除质粒pDK3引入的的氯霉素基因。基于敏感型筛选，构建获得缺失arcA、FUM基因的突变株E.coli HH2。
实施例3
本实施例为在实施例2基础上的优化实施方案，说明以E.coli HH2为出发菌株，利用RED重组技术，敲除富马酸还原酶FRD的一个亚基frdB，以实现对FRD的破坏，阻断富马酸至丁二酸的转化。
1、利用LB培养基，于37℃，有氧条件下培养E. coli HH2至OD600=0.6，制备成电转化感受态。
2、将质粒pKD46导入感受态大肠杆菌，30℃培养过夜，次日接种至LB培养基（含氨苄青霉素，100 μg/L），30℃培养至OD=0.25，在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于37℃下诱导质粒pKD46表达EXo、Bet和Gam三个蛋白，再次制备感受态E. coli HH21。
2、以两侧带有FRT位点的，具有氯霉素抗性的pKD3为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有frdB同源片段的扩增引物，扩增获得线性DNA同源片段。结合frdB基因序列设计引物，引物序列如下：
上游同源臂引物H5-P1（frdB），单下划线同源片段：
5’TCCGGGTTATAGCGCACCACCTCAATTTTCAGGTTTTTCATCTCAGCCAT GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游同源臂引物H5-P2（frdB），单下划线同源片段：
5’ATGGCTGAGATGAAAAACCTGAAAATTGAGGTGGTGCGCTATAACCCGGA TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
同理，结合各种亚基，即frdA、frdC、frdD亚基基因序列设计引物，引物序列如下：
上游引物（frdA）：
5’CCCGCGCCACCGGCGCCTACAATGGCAAGATCGGCTTGAAAGGTTTGCAC GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游引物（frdA）：
5’GTGCAAACCTTTCAAGCCGATCTTGCCATTGTAGGCGCCGGTGGCGCGGG TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
上游引物（frdC）：
5’CACCAGGTGGACGTCATTGGCCGTACATACGGTTTACGTTTAGTCGTCAT GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游引物（frdC）：
5’ATGACGACTAAACGTAAACCGTATGTACGGCCAATGACGTCCACCTGGTG TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
上游引物（frdD）：
5’AGGCCCCAGAATACCGGTTCGTCAGAACGCTTTGGATTTGGATTAATCAT GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游引物（frdD）：
5’ATGATTAATCCAAATCCAAAGCGTTCTGACGAACCGGTATTCTGGGGCCT TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
对模板pKD3进行PCR反应，反应条件：95 ℃变性5min，经94℃ 30 sec，52℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，加入适量核酸内切酶DpnI去除模板，获得的PCR产物经电泳分析确认。
电转线性DNA片段（含有氯霉素基因）至E. coli HH21感受态（含有pKD46），并涂布于带有氯霉素的LB平板筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，获得敲除了FRD基因的菌株E.Coli HH22。进行E.Coli HH22的感受态制备，导入能够诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，42℃下诱导表达FLP重组酶，消除质粒pDK3引入的的氯霉素基因。基于敏感型筛选，构建获得缺失FUM、arcA、FRD基因的突变株E.coli HH3。
实施例4
作为实施例3的进一步优化实施例，本实施例说明以E.coli HH3为出发菌株，利用RED重组技术，敲除甲酸途途径关键酶基因PFL，减少甲酸的积累，实现富马酸的高效积累。
1、利用LB培养基，于37℃，有氧条件下培养E. coli HH3至OD600=0.6左右，制备成电转化感受态。
2、将质粒pKD46导入感受态大肠杆菌，30℃培养过夜，次日接种至LB培养基（含氨苄青霉素，100 μg/L），30℃培养至OD=0.25，在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于37℃下诱导质粒pKD46表达EXo、Bet和Gam三个蛋白，再次制备感受态E. coli HH31。
2、以两侧带有FRT位点的，具有氯霉素抗性的pKD3为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有pflB同源片段的扩增引物，扩增获得线性DNA同源片段。结合pflB基因序列，设计引物，引物序列如下：
上游同源臂引物H6-P1，单下划线同源片段：
5’TTGGTAAAACCTTCCCAGGCTGTGGCTAACTTTTCATTAAGCTCGGACAT GAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’；
下游同源臂引物H6-P2，单下划线同源片段：
5’ATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACAGCCTGGGAAGGTTTTACCAA TTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’。
对模板pKD3进行PCR反应，反应条件：95 ℃变性5min，经94℃ 30 sec，52℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，加入适量核酸内切酶DpnI去除模板，获得的PCR产物经电泳分析确认。
电转线性DNA片段（含有氯霉素基因同源臂）至E. coli HH31感受态（含有pKD46），并涂布于带有氯霉素的LB平板筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，获得敲除了PFL基因的菌株E.Coli HH32。进行E.Coli HH32的感受态制备，导入能够诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，42℃下诱导表达FLP重组酶，消除质粒pDK3引入的的氯霉素基因。基于敏感型筛选，构建获得缺失FUM、arcA、FRD、PFL基因的突变株E.coli HH4。
实施例 5
本实施例说明以E.coli HH4为出发菌株，利用red重组技术，敲除乳酸途途径关键酶基因LDH，减少乳酸的积累，实现富马酸的高效积累。
1、利用LB培养基，于37℃，有氧条件下培养E. coli HH4至OD600=0.6左右，制备成电转化感受态。
2、将质粒pKD46导入感受态大肠杆菌，30℃培养过夜，次日接种至LB培养基（含氨苄青霉素，100 μg/L），30℃培养至OD=0.25，在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于37℃下诱导质粒pKD46表达EXo、Bet和Gam三个蛋白，再次制备感受态E. coli HH41。
2、以两侧带有FRT位点的，具有氯霉素抗性的pKD3为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有ldhA同源片段的扩增引物，扩增获得线性DNA同源片段。结合ldhA基因序列，设计引物，引物序列如下：
上游同源臂引物H7-P1，单下划线同源片段：
5’TGCAGGTACTTCTTGTCGTACTGTTTTGTGCTATAAACGGCGAGTTTCATGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3’
下游同源臂引物H7-P2，单下划线同源片段：
5’ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCATTAATTAACGGCTGACATGGGAATTAG3’
对模板pKD3进行PCR反应，反应条件：95 ℃变性5min，经94℃ 30 sec，52℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，加入适量核酸内切酶DpnI去除模板，获得的PCR产物经电泳分析确认。
电转线性DNA片段（含有氯霉素基因同源臂）至E.Coli HH41感受态（含有pKD46），并涂布于带有氯霉素的LB平板筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，获得敲除了LDH基因的菌株E.Coli HH42。进行E.Coli HH42的感受态制备，导入能够诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，42 ℃下诱导表达FLP重组酶，消除质粒pDK3引入的的氯霉素基因。基于敏感型筛选，构建获得缺失FUM、arcA、FRD、PFL、LDH基因的突变株E.coli HH5。
实施例 6
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌菌株E.coli HH2、E.coli HH5与出发菌株E.coli MG1655发酵产酸能力的对比。
按体积比1%接种量将菌株接种入种子培养基进行有氧种子培养，当OD达到3时，按体积比10%的接种量接种至发酵培养基进行厌氧发酵，发酵时间为48h。发酵结束时利用HPLC测定发酵液中富马酸含量（紫外条件，210 nm，C18柱）。
其中，所述的种子培养基配方：LB。
所述的发酵培养基配方：LB+葡萄糖（20 g/L）+碳酸钙（10 g/L）。
所述的HPLC条件：BIO-RAD Aminex HPX - 87H色谱柱，UV检测器；流动相：5mmol/ L 硫酸水溶液；流速：0.8mL/ min；进样量：20μL；柱温：65℃。
结果见表1。
Claims (6)
1.一种构建产富马酸大肠杆菌（Escherichia coli）基因工程菌的方法，以大肠杆菌出发菌株，敲除其TCA循环途径中的富马酸酶基因以阻断富马酸至苹果酸的转化途径；以及敲除抑制其TCA循环途径中的TCA循环抑制蛋白基因实现厌氧条件下TCA循环的正常运作；进一步敲除富马酸还原酶基因、或者进一步敲除富马酸还原酶基因和丙酮酸甲酸裂解酶基因、或者进一步敲除富马酸还原酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因，得到可实现厌氧途径下富马酸高效积累的产富马酸大肠杆菌基因工程菌。
2.根据权利要求１所述的构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于所述的敲除其TCA循环途径中的富马酸酶基因的方法，包括敲除富马酸酶基因的完整基因片段，或者敲除富马酸酶基因的亚基部分。
3.根据权利要求1所述的构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于所述的敲除富马酸还原酶基因的方法，包括敲除富马酸还原酶基因的完整基因片段，或者敲除富马酸还原酶基因的亚基部分。
4.根据权利要求1所述的构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于所述的敲除乳酸脱氢酶基因的方法，包括敲除乳酸脱氢酶基因的完整基因片段，或者敲除乳酸脱氢酶基因的亚基部分。
5.根据权利要求1所述的构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法构建得到的产富马酸大肠杆菌基因工程菌。
6.根据权利要求1所述的构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法构建得到的产富马酸大肠杆菌基因工程菌发酵生产富马酸的方法：按体积比1%接种量将构建得到的产富马酸大肠杆菌基因工程菌接种入种子培养基进行有氧种子培养，当OD达到3时，按体积比10%的接种量接种至发酵培养基进行厌氧发酵。
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