CN106520812B - 一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的方法 - Google Patents

一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的方法，通过在富马酸合成三个关键酶（丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶）的两端添加特异性标签，实现三个酶的共价结合，缩短底物通道，促进了富马酸在大肠杆菌体内的合成效率。

Description

一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及合成生物学的方法，特别涉及采用基因工程的技术手段缩减底物通道，在大肠杆菌中提高富马酸合成途径关键酶的催化效率。
背景技术
富马酸作为三羧酸循环的中间代谢产物，是一种重要的大宗化工产品，其广泛应用于涂料、树脂、医药、增塑剂等领域，被美国能源部列为优先发展的12 种生物基平台化合物之一，全球需求量达百万吨。目前工业上主要采用化学法合成富马酸，但其生产条件苛刻、催化剂毒性较大、环境污染严重；相对而言微生物发酵法合成富马酸，具有操作条件温和、环境污染小、原料来源广泛、可持续发展性强等优点。因此利用发酵法替代化学法合成富马酸越来越受到人们的广泛关注。
目前发酵法生产富马酸多以根霉菌为研究对象，但根霉菌作为一种丝状真菌，在其复杂的菌体形态会影响发酵过程的溶氧和传质，最终影响富马酸产量及对发酵过程的可操控性。并且米根霉的基因组信息未被完全解析，生理机制和遗传背景亦知之甚少，且其繁殖过程中会产生分生孢子，致使对根霉菌数进行基因工程改造存在诸多问题。
为了解决根霉菌所存在的问题，从而提高微生物发酵生产富马酸的效率，我们选择了简单培养基上可快速生长、遗传背景清晰、遗传改造操作简便的大肠杆菌作为研究对象。大肠杆菌作为一种原核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便，营养需求简单而成为发酵生产有机酸的潜在微生物。然而大肠杆菌自身并不具备过量积累富马酸的代谢途径，因此需对其进行遗传改造以促进目标产物富马酸的积累。对米根霉中富马酸的代谢途径进行分析，发现从丙酮酸出发，经三步酶催化反应生成富马酸。将催化这三个反应的模块整合入大肠杆菌将有可能实现大肠杆菌对富马酸的合成。但在这类多酶级联反应中，中间产物的扩散速度会极大的影响终产物的合成效率。据报道，当两个酶分子足够接近的时候，就会产生“底物通道”(Substrate channeling)现象，可以强化中间产物在酶与酶之间的传递过程，增加中间产物在催化活性中心附近的局部浓度，从而提高酶反应速率。
目前，如何通过基因工程的手段进一步提高大肠杆菌合成富马酸的效率，实现富马酸的在大肠杆菌中的高产，仍然具有较大空间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决大肠杆菌中富马酸合成的效率问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：通过合成生物学的手段，实现富马酸合成过程中三个关键酶，及丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶的整合。在完成此技术方案的过程中，本发明提供了特定的标签序列sc与st，可使得三个酶在表达后易于通过共价键结合。
具体的，本发明的技术方案为：
一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的方法，其中，在所述大肠杆菌中，同时含有丙酮酸脱氢酶基因ppc、苹果酸脱氢酶基因mdh、富马酸酶基因fumR的核苷酸序列；且在mdh和fumR的N端加有如标签st所述的SEQ ID NO.1核苷酸序列， pyc的N和C端加有如标签sc所述的SEQ ID NO.2核苷酸序列；本发明提供的标签sc与st可使三个基因在表达后易于产生共价结合。
用于提高大肠杆菌合成富马酸效率的核苷酸序列，命为st-linker-mdh，sc-linker-pyc-linker-sc和fumR-linker-st，其中，该核苷酸序列通过以下方法获得：
（1）提取米根霉mRNA，反转录获得cDNA，分别设计引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6，通过PCR的方法分别获得产物丙酮酸脱氢酶基因pyc，苹果酸脱氢酶基因mdh和富马酸酶基因fumR，胶回收PCR产物；
（2）以标签sc基因为模板，设计引物P1和引物P2，通过PCR的方法获得C端连有linker 的sc PCR产物，命名为sc-linker；
（3）以获得的pyc产物为模板，设计引物P3和引物P4，通过PCR的方法，获得N端连有linker的丙酮酸脱氢酶基因pyc的PCR产物，命名为linker-pyc；
（4）步骤（2）、（3）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P1、P4进行PCR获得sc-linker-pyc，胶回收PCR产物；
（5）以获得的pyc片段为模板，设计引物P5和引物P6，通过PCR的方法获得C端连有linker的丙酮酸脱氢酶基因pyc的PCR产物，命名为pyc-linker；
（6）以标签sc基因为模板，设计引物P7和引物P8，通过PCR的方法，获得N端连有linker的sc PCR产物，命名为linker-sc；
（7）步骤（5）、（6）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P5、P8进行PCR获得pyc-linker-sc，胶回收PCR产物；
（8）步骤（4）、（7）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P1、P8进行PCR获得sc-linker-pyc-linker-sc，胶回收PCR产物；
（9）以标签st基因为模板，以引物F1和引物F2，通过PCR的方法获得N端连有linker，的st PCR产物，命名为linker-st；
（10）以获得的mdh产物为模板，设计引物F3和引物F4，通过PCR的方法，获得C端连有linker，N端含EcoRI酶切位点的苹果酸脱氢酶基因mdh的PCR产物，命名为EcoRI-mdh-linker；
（11）步骤（9）、（10）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物F1、F4进行PCR获得EcoRI-mdh-linker-st，胶回收PCR产物；
（12）同理，以标签st基因为模板，以引物R1和引物R2，通过PCR的方法获得C端连有linker的st PCR产物，命名为st-linker；
（13）以获得的fumR产物为模板，设计引物R3和引物R4，通过PCR的方法，获得C端连有linker，N端含HindIII酶切位点的富马酸酶基因fumR的PCR产物，命名为linker-fumR-HindIII；
（14）步骤（12）、（13）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物R1、R4进行PCR获得st-linker-fumR-HindIII，胶回收PCR产物；
（15）以步骤（8）、（11）、（14）获得的胶回收PCR产物为目标片段，之后利用Gibson试剂盒将三个片段在金属反应器中进行反应，获得片段，并胶回收产物，命名为EcoRI-mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR-HindIII。一种用于提高大肠杆菌合成富马酸效率的载体，命名为pTrc99A-mdh-linker-st- sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR，其特征在于，该载体通过以下方法获得：将权利要求2步骤（15）获得的PCR产物及pTRC99a质粒分别用EcoRI和HindIII限制性内切酶进行酶切，并连接获得含目标片段的pTRC99a载体。
含有如上述载体的大肠杆菌。
通过上述大肠杆菌工程菌菌株发酵产富马酸，其所用发酵培养的培养基为：酵母膏5~10 g/L，葡萄糖10~20 g/L，KH2PO4 3~4g/L，K2HPO4 6~7 g/L，(NH4)2HPO4 3~4 g/L，CaCl20.01~0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5 g/L，硫胺素 0.001~0.005 g/L，AMP，1uL/ML；培养条件为：37℃，200rmp。
本发明所述的pyc、mdh、fumR基因，其中pyc基因的在NCBI数据库中的GeneID为:948457；mdh基因为GeneID:947854；fumR基因为GeneID:71025128。
在本发明的有益效果在于：通过在大肠杆菌中导入如上载体，相对于原始菌株，富马酸水平从原始的0.1g/L以下上升至6.772g/L，显著提高了富马酸合成的效率。
附图说明
图1为EcoRI-mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR-HindIII目标片段的构建过程。
图2 pTrc99A-mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR载体的构建过程。
图3单基因导入下的菌株富马酸产量随时间变化的对比图。
图4目标载体导入下的菌株富马酸产量随时间变化的对比图。
具体实施方式
实施例1
本实施例说明含特定标签的富马酸合成的酶催化体系的重组载体pTRC99A-mdh-linker-st-sc-linker-ppc-linker-sc-st-linker-fumR的构建过程，本实施例所使用的米根霉菌株保藏号为CCTCC：M207066
（1）提取米根霉mRNA，反转录获得cDNA，分别设计引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6，通过PCR的方法分别获得产物丙酮酸脱氢酶基因pyc，苹果酸脱氢酶基因mdh和富马酸酶基因fumR，胶回收PCR产物；
（2）以标签sc基因为模板，设计引物P1和引物P2，通过PCR的方法获得C端连有linker 的sc PCR产物，命名为sc-linker；
（3）以获得的pyc产物为模板，设计引物P3和引物P4，通过PCR的方法，获得N端连有linker的丙酮酸脱氢酶基因pyc的PCR产物，命名为linker-pyc；
（4）步骤（2）、（3）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P1、P4进行PCR获得sc-linker-pyc，胶回收PCR产物；
（5）以获得的pyc片段为模板，设计引物P5和引物P6，通过PCR的方法获得C端连有linker的丙酮酸脱氢酶基因pyc的PCR产物，命名为pyc-linker；
（6）以标签sc基因为模板，设计引物P7和引物P8，通过PCR的方法，获得N端连有linker的sc PCR产物，命名为linker-sc；
（7）步骤（5）、（6）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P5、P8进行PCR获得pyc-linker-sc，胶回收PCR产物；
（8）步骤（4）、（7）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P1、P8进行PCR获得sc-linker-pyc-linker-sc，胶回收PCR产物；
（9）以标签st基因为模板，以引物F1和引物F2，通过PCR的方法获得N端连有linker，的st PCR产物，命名为linker-st；
（10）以获得的mdh产物为模板，设计引物F3和引物F4，通过PCR的方法，获得C端连有linker，N端含EcoRI酶切位点的苹果酸脱氢酶基因mdh的PCR产物，命名为EcoRI-mdh-linker；
（11）步骤（9）、（10）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物F1、F4进行PCR获得EcoRI-mdh-linker-st，胶回收PCR产物；
（12）同理，以标签st基因为模板，以引物R1和引物R2，通过PCR的方法获得C端连有linker的st PCR产物，命名为st-linker；
（13）以获得的fumR产物为模板，设计引物R3和引物R4，通过PCR的方法，获得C端连有linker，N端含HindIII酶切位点的富马酸酶基因fumR的PCR产物，命名为linker-fumR-HindIII；
（14）步骤（12）、（13）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物R1、R4进行PCR获得st-linker-fumR-HindIII，胶回收PCR产物；
（15）以步骤（8）、（11）、（14）获得的胶回收PCR产物为目标片段，之后利用Gibson试剂盒将三个片段在金属反应器中进行反应，获得片段，并胶回收产物，命名为EcoRI-mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR-HindIII。（16）分别用EcoRI和HindIII限制性内切酶对步骤（15）获得的PCR产物及pTrc99A质粒进行酶切，并用连接酶连接获得含目标片段的pTRC99a载体，命名为：pTrc99A-mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR。
其中，所用到的引物序列如以下所示：
引物1：TAGCCGGTATTACGCATACCT；
引物2：ATGAACGAACAATATTCCGCA；
引物3：TTACTTATTAACGAACTCTTC；
引物4：ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGC；
引物5：TTTCCCCTTTATCTTTACTCG；
引物6：TTAATCCTTGGCAGAGTCATA；
引物P1：GAACCGTCCTAGACCTTATCGGAGTCGATGTTAGCATAAGTCAATTGGCAT；
引物P2：AATTAGCGCATGCACGAAGGCGGCGGTGGCGGCAGC；
引物P3：GGCGGTGGCGGCAGCTAGCCGGTATTACGCATACCT；
引物P4：ATGAACGAACAATATTCCGCA；
引物P5：TAGCCGGTATTACGCATACCT；
引物P6：ATGAACGAACAATATTCCGCAGGCGGTGGCGGCAGC；
引物P7：GGCGGTGGCGGCAGCCAAGGTACTAGTAATTCGAGA；
引物P8：GGCCTAGGATCCTTAGAGTTCATCGGGCAATTGCATGAGCCTGAGCTGGAT；
引物F1：GGCGGTGGCGGCAGCGGAATCCGATTCAGTAATTCGG；
引物F2：AAGTCCAGTGGCGTATGCAATGATCGGATTTCCAGTCAGAATTGGCAGTCA；
引物F3：GGAATTCTTACTTATTAACGAACTCTTC；
引物F4：ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGGCGGTGGCGGCAGC；
引物R1：GGATTCCAATCCGGGAATACAGGGTCACCAATGCTTAGTGGACTAGCTAG；
引物R2：GGCGGTGGCGGCAGCAATTCGGGCCA；
引物R3：GGCGGTGGCGGCAGCTTTCCCCTTTATCTTTACTCG；
引物R4：TTAATCCTTGGCAGAGTCATAAAGCTTGGG；
其中，下划线部分代表酶切位点，波浪线为linker序列,双划线代表同源序列。
其中，PCR反应的体系及条件如下所示：
反应体系（25uL）：
底物 体积/uL
10×buffer 2.5
ddH2O 15.7
MgCl2 1.5
dNTP 2
引物A 0.5
引物S 0.5
Ex Taq酶 0.3
模板 2
反应条件：
步骤 时间/s
（1）94℃变性 600
（2）94℃反应 30
（3）55℃退火 30
（4）72℃延伸 90
（5）重复步骤（2）-（4）30次
（6）72℃反应 600
（7）4℃保存 ∞
实施例2
本实施例说明含单基因的目标载体对富马酸产量的影响
超净台中挑取仅含单基因pyc的目标载体菌株的单菌落于50 mL的新鲜液体LB培养基中作为种子液，并添加终浓度为50mg/mL的AMP50 uL，37 ℃，200 rmp，培养10-12 h，按1%（体积比）的接种量接到50 mL新鲜的发酵培养基（加50 uLAMP），37 ℃，200 rmp培养12h，然后8000 rmp离心10 min，取上清，最终利用HPLC对富马酸进行含量测定，其产量达到1.372 g/L（图3）。
实施例3
本实施案例说明目标载体菌株对富马酸产量的影响
超净台中挑取原始菌株（作对照）目标标签载体菌株的单菌落于50 mL的新鲜液体LB培养基中作为种子液，并分别添加终浓度为50 mg/mL的AMP50 uL，37 ℃，200 rmp，培养10-12 h，按1%（体积比）的接种量接到50 mL新鲜的发酵培养基（加50 uLAMP），37 ℃，200rmp培养16 h，中间过程中每隔3个小时进行一次取样，然后8000 rmp离心10 min，取上清，最终富马酸产量达6.772 g/L（图4）。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的方法
<130> xb16051701
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 418
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sc
<400> 1
gtcttatcaa tgtatcaagg aagttagtac tattatagat ctgtatccag gaaacatttg 60
tcgaaaccgc agcgtttgag caaggtcagc atcgtttgct acggattcat accttgtagc 120
aactgcaaca cgtattaagc aattaaaatg gtgctaccca tctagtgatc aacaactatg 180
ttctcaaatc gtatcaccat cacccgcaga agtaatgagg caaagtccgc aattggttag 240
ctggatggcg gagctcataa agctgaatat cgtgtaaaac tcacgattat gagcatccca 300
acacctgtat tggttactgt attcagggcg cgtgatagac catacaggat ttccgactac 360
caccgaaaaa gtgtcaaata atggtttgag agatggagac ggcaatgccc aagatagg 418
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> st
<400> 2
gccataggat caagttccca tacaggatga atagctcca 39

Claims (5)

1. 一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的方法，其特征在于，在所述大肠杆菌中，同时含有来源于米根霉的丙酮酸脱氢酶基因pyc、苹果酸脱氢酶基因mdh、富马酸酶基因fumR的核苷酸序列；且在mdh的C端以及fumR的N端加有如标签st所述的SEQ ID NO.1核苷酸序列，pyc的N和C端加有如标签sc所述的SEQ ID NO.2核苷酸序列；其中，标签sc与st可使三个基因在表达后易于产生共价结合。
2.用于提高大肠杆菌合成富马酸效率的核苷酸序列，序列片段命名为mdh-linker-st，sc-linker-pyc-linker-sc和st-linker-fumR，且合成的核苷酸序列命名为mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR，其特征在于，该核苷酸序列通过以下方法获得：
（1）提取米根霉mRNA，反转录获得cDNA，分别设计引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6，通过PCR的方法分别获得产物丙酮酸脱氢酶基因pyc，苹果酸脱氢酶基因mdh和富马酸酶基因fumR，胶回收PCR产物；
（2）以标签sc基因为模板，设计引物P1和引物P2，通过PCR的方法获得C端连有linker的sc PCR产物，命名为sc-linker；
（3）以获得的pyc产物为模板，设计引物P3和引物P4，通过PCR的方法，获得N端连有linker的丙酮酸脱氢酶基因pyc的PCR产物，命名为linker-pyc；
（4）步骤（2）、（3）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P1、P4进行PCR获得sc-linker-pyc，胶回收PCR产物；
（5）以获得的pyc片段为模板，设计引物P5和引物P6，通过PCR的方法获得C端连有linker的丙酮酸脱氢酶基因pyc的PCR产物，命名为pyc-linker；
（6）以标签sc基因为模板，设计引物P7和引物P8，通过PCR的方法，获得N端连有linker的sc PCR产物，命名为linker-sc；
（7）步骤（5）、（6）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P5、P8进行PCR获得pyc-linker-sc，胶回收PCR产物；
（8）步骤（4）、（7）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物P1、P8进行PCR获得sc-linker-pyc-linker-sc，胶回收PCR产物；
（9）以标签st基因为模板，以引物F1和引物F2，通过PCR的方法获得N端连有linker，的st PCR产物，命名为linker-st；
（10）以获得的mdh产物为模板，设计引物F3和引物F4，通过PCR的方法，获得C端连有linker，N端含EcoRI酶切位点的苹果酸脱氢酶基因mdh的PCR产物，命名为mdh-linker；
（11）步骤（9）、（10）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物F1、F4进行PCR获得mdh-linker-st，胶回收PCR产物；
（12）同理，以标签st基因为模板，以引物R1和引物R2，通过PCR的方法获得C端连有linker的st PCR产物，命名为st-linker；
（13）以获得的fumR产物为模板，设计引物R3和引物R4，通过PCR的方法，获得C端连有linker，N端含HindIII酶切位点的富马酸酶基因fumR的PCR产物，命名为linker-fumR；
（14）步骤（12）、（13）获得的PCR产物混合，作为模板，以引物R1、R4进行PCR获得st-linker-fumR，胶回收PCR产物；
（15）以步骤（8）、（11）、（14）获得的胶回收PCR产物为目标片段，之后利用Gibson试剂盒将三个片段在金属反应器中进行反应，获得片段，并胶回收产物，命名为mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR，
其中，所用到的引物序列如以下所示：
引物1：TAGCCGGTATTACGCATACCT
引物2：ATGAACGAACAATATTCCGCA
引物3：TTACTTATTAACGAACTCTTC
引物4：ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGC
引物5：TTTCCCCTTTATCTTTACTCG
引物6：TTAATCCTTGGCAGAGTCATA
引物P1：GAACCGTCCTAGACCTTATCGGAGTCGATGTTAGCATAAGTCAATTGGCAT
引物P2：AATTAGCGCATGCACGAAGGCGGCGGTGGCGGCAGC
引物P3：GGCGGTGGCGGCAGCTAGCCGGTATTACGCATACCT
引物P4：ATGAACGAACAATATTCCGCA
引物P5：TAGCCGGTATTACGCATACCT
引物P6：ATGAACGAACAATATTCCGCAGGCGGTGGCGGCAGC
引物P7：GGCGGTGGCGGCAGCCAAGGTACTAGTAATTCGAGA
引物P8：GGCCTAGGATCCTTAGAGTTCATCGGGCAATTGCATGAGCCTGAGCTGGAT
引物F1：GGCGGTGGCGGCAGCGGAATCCGATTCAGTAATTCGG
引物F2：AAGTCCAGTGGCGTATGCAATGATCGGATTTCCAGTCAGAATTGGCAGTCA
引物F3：GGAATTCTTACTTATTAACGAACTCTTC
引物F4：ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGGCGGTGGCGGCAGC
引物R1：GGATTCCAATCCGGGAATACAGGGTCACCAATGCTTAGTGGACTAGCTAG
引物R2：GGCGGTGGCGGCAGCAATTCGGGCCA
引物R3：GGCGGTGGCGGCAGCTTTCCCCTTTATCTTTACTCG
引物R4：TTAATCCTTGGCAGAGTCATAAAGCTTGGG。
3.一种用于提高大肠杆菌合成富马酸效率的载体，命名为pTrc99A-mdh-linker-st-sc-linker-pyc-linker-sc-st-linker-fumR，其特征在于，该载体通过以下方法获得：将权利要求2步骤（15）获得的PCR产物及pTRC99a质粒分别用EcoRI和HindIII限制性内切酶进行酶切，并连接获得含目标片段的pTRC99a载体。
4.含有如权利要求3所述载体的大肠杆菌。
5.一种提高大肠杆菌合成富马酸效率的发酵培养基，其特征在于，所述培养基由下述配方组成，酵母膏5~10 g/L，葡萄糖10~20 g/L，KH2PO4 3~4g/L，K2HPO4 6~7 g/L，(NH4)2HPO43~4 g/L，CaCl2 0.01~0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.5 g/L，硫胺素 0.001~0.005 g/L，AMP，1uL/mL。
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