CN104694586B - 一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法 - Google Patents

一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法。采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三羧酸循环中的编码富马酸酶的基因PSfum1和PSfum2，获得了富马酸酶缺失菌株；在所获得的菌株的基础上异源表达优化的富马酸还原合成模块，利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株；在酵母合成菌株的基础上，表达经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母的转运蛋白YMAE，获得了发酵木糖生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株；将获得的菌株在完全合成的发酵培养基中高效发酵木糖生产富马酸，发酵培养3～4天，温度30℃，150～200rpm，富马酸含量大于4g/L。

Description

一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建 方法
技术领域
本发明属于合成生物学和生物能源技术领域，具体涉及一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法。以树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitisCBS6054)为宿主，敲除富马酸酶基因(PSfum1，PSfum2)，异源表达经密码子优化的来自米根霉的富马酸还原合成途径和经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母的富马酸转运蛋白YMAE，获得了树干毕赤酵母合成菌株，在发酵培养基中高效发酵木糖生产富马酸的方法。
背景技术
富马酸是一种典型的C4二羧酸平台化合物，被美国能源部列为二十一世纪优先发展的12种平台化合物之一，可广泛应用于食品、化工、医药、涂料等行业，具有较高的附加值。现阶段，富马酸主要通过石油化工合成，然而随着资源、能源、环境危机的日益加剧，利用可再生资源生物合成富马酸，越来越受到关注目前，根霉菌是富马酸工业生物合成的主要生产者，在有氧限氮条件下能自然发酵并产生大量的富马酸，并具有较高的产率。例如，本课题组闻建平等(闻建平；于守智。飞秒激光诱变米根霉选育富马酸高产菌株的方法[P]。中国专利：CN102061294A，2011-05-18)利用飞秒激光诱变技术，选育出米根霉富马酸高产菌株，突变株正突变率8～21％，发酵单位比原始菌株提高15～50％。然而，由于根霉属真菌的复杂的生长形态，限制了发酵过程的可控性和工业化规模；同时由于丝状真菌，特异性重组频率低，基因工程手段在其菌种改造方面仍很困难，限制了富马酸产量的进一步提高。近年来，采用合成生物学，使非根霉菌生物合成富马酸的研究越来越深入，并得到了广泛的发展。刘立明等(刘立明；陈修来；杨松鑫；陈坚。一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用[p]。中国专利：CN102286387A，2011-12-21)以丙酮酸生产者光滑球拟酵母为宿主，过表达来源于米根霉的苹果酸脱氢酶基因和富马酸酶基因，获得了重组菌株T.glabrata FMME045，以葡萄糖为底物，发酵60h，富马酸产量比出发菌株增加了6倍，达到35mg/L。然而，利用经密码子优化的富马酸还原合成途径，以木糖等价格更为低廉的原料为底物发酵生产富马酸的研究尚未有报道。
木糖是木质纤维素的重要组成部分，是继葡萄糖之后自然界中最为丰富的糖类，在纤维素水解液中含量超过30％，在半纤维素水解产物中的含量超过90％，有效利用木糖是发展生物能源的关键问题之一。树干毕赤酵母具有宽广的碳源代谢能力，同时该菌具有低pH与高糖耐受性和低木糖醇产量等优点，并已应用于发酵生产乙醇等产物(HUGHESSTEPHEN R；GIBBONS WILLIAM R.Scheffersomyces stipitis strain for increasedethanol production and uses thereof[p].国外专利:US8609382,2013-12-17)。为实现木糖到富马酸转化提供了优秀合成菌种平台。
本发明首次以树干毕赤酵母(S.stipitis CBS6054)为宿主，敲除三羧酸循环中的富马酸酶基因PSfum1和PSfum2，异源表达经密码子优化的来自米根霉的富马酸还原合成途径和经密码子优化来自栗酒裂殖酵母的四碳二羧酸转运蛋白基因YMAE，获得了树干毕赤酵母合成菌株，在完全合成的发酵培养基中高效发酵木糖生产富马酸。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法。为了实现本发明的技术目的，本发明采用了如下技术方案。
一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法，其步骤如下：
(1)采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三羧酸循环中的编码富马酸酶的基因PSfum1和PSfum2，获得了富马酸酶缺失菌株；
(2)在所获得的富马酸酶缺失菌株的基础上异源表达优化的富马酸还原合成模块，获得了利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株；
(3)在所获得的酵母合成菌株的基础上，表达经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母的转运蛋白YMAE，获得了发酵木糖生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株；
(4)将获得的树干毕赤酵母合成菌株在发酵培养基中发酵木糖生产富马酸，发酵培养3～4天，发酵条件为30℃，150～200rpm。
所述步骤(2)中异源表达优化的富马酸还原合成模块优选是，将来自米根霉的富马酸还原合成途径丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶的三个酶的基因，按照树干毕赤酵母的密码子偏好性分别进行优化，获得基因YPYC、YMDH、YFUM。
所述步骤(2)中利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株优选是：将含有YMDH和YFUM基因的质粒pYSS05和含有基因YPYC基因的质粒pBSS03导入富马酸酶缺失菌株中。
所述发酵培养基优选为：木糖50～60g/L，尿素0.1～0.2g/L，5～6g/L KH2PO4，2～5g/LMgSO4·7H2O，0.2～0.4mg/L生物素，1～2mg/L维生素B1，1～2mg/L维生素B6，1～2mg/L烟酸，0.2～0.4mg/L对氨基苯甲酸，1～2mg/L泛酸钙，10mL/L微量金属元素母液。
微量金属元素母液优选包括0.05～0.1g/L CuSO4·5H2O，2～5g/L FeSO4·7H2O，0.2～0.4g/L MnCl2·4H2O，2～3g/L CaCl2·2H2O，0.5～0.6g/L ZnCl2，0.04～0.1g/LNaMoO42H2O，0.03～0.1g/L CoCl2，0.1～0.2g/L H3BO4，0.01～0.05g/L KI。
具体方法为：
(1)采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三羧酸循环中的编码富马酸酶(FUM)基因，以阻断富马酸至苹果酸的转化途径。
S.stipitis中富马酸酶包含两个同工酶PSfum1和PSfum2。分别以S.stipitis基因组为模板，设计引物FUM1-5F/FUM1-5R，FUM1-3F/FUM1-3R和FUM2-5F/FUM2-5R，FUM2-3F/FUM2-3，其序列为SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，分别扩增PSfum1和PSfum2的上下游同源片段。通过同源重组的方法分别敲除基因PSfum1和PSfum2，获得了富马酸酶缺失菌株。
(2)将来自米根霉的富马酸还原合成途径的三个酶丙酮酸羧化酶(PYC)、苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸酶(FUM)的基因分别按照树干毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，获得基因YPYC、YMDH和YFUM，其序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
进一步在(1)所获得的酵母合成菌株的基础上，异源表达优化的富马酸还原合成途径模块，将含有YMDH和YFUM基因的质粒pYSS03(图1)和含有YPYC基因的质粒pBSS02(图2)导入树干毕赤酵母中，获得了初步利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株。
(3)将来自栗酒裂殖酵母的四碳二羧酸转运蛋白(SpMAE1)根据S.stipitis的密码子偏好性进行优化，获得基因YMAE，其序列为SEQ ID NO：5。
在(2)中所获得的富马酸合成菌株的基础上，将YMAE连接至质粒pBSS03获得质粒pBSS04(图3)。将质粒pBSS04导入(2)中所获得的酵母合成菌株中，以提高富马酸的转运能力，获得了发酵木糖高效生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株。
(4)将(3)中获得的树干毕赤酵母合成菌株接种至含有20～25mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养32h～40h至对数中期。然后离心收集酵母细胞，用新鲜的发酵培养基悬浮，接种至含有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中发酵木糖生产富马酸。
分批发酵的起始OD600为0.5～0.8，并加入5～15g/L CaCO3，发酵培养3～4天，发酵条件为30℃，150～200rpm。发酵培养基包括：木糖50～60g/L，尿素0.1～0.2g/L，5～6g/LKH2PO4,，2～5g/L MgSO4·7H2O，0.2～0.4mg/L生物素，1～2mg/L维生素B1，1～2mg/L维生素B6，1～2mg/L烟酸,0.2～0.4mg/L对氨基苯甲酸，1～2mg/L泛酸钙，10mL/L微量金属元素母液。微量金属元素母液包括0.05～0.1g/L CuSO4·5H2O，2～5g/L FeSO4·7H2O，0.2～0.4g/L MnCl2·4H2O，2～3g/L CaCl2·2H2O，0.5～0.6g/L ZnCl2，0.04～0.1g/L NaMoO42H2O，0.03～0.1g/L CoCl2，0.1～0.2g/L H3BO4，0.01～0.05g/L KI。
本发明首次以树干毕赤酵母(S.stipitis CBS6054)为宿主，敲除三羧酸循环中的富马酸酶基因(PSfum1，PSfum2)，异源表达经密码子优化的来自米根霉的富马酸还原合成途径和经密码子优化来自栗酒裂殖酵母的四碳二羧酸转运蛋白基因YMAE，获得了能发酵木糖高效生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株。所获得的树干毕赤酵母合成菌株在发酵培养基中，以50～60g/L的木糖为底物，经3～4天发酵，富马酸含量大于4g/L，同野生型树干毕赤酵母菌株相比提高了30倍以上。
附图说明
图1：pYSS03质粒物理图谱；
图2：pBSS02质粒物理图谱；
图3：pBSS03质粒物理图谱；
图4：pYSS01质粒物理图谱；
图5：pBSS01质粒物理图谱；
图6：pSSH02质粒物理图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应当视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质有权利要求来限定。其中菌株EscherichiaColi DH5α、Scheffersomyces stipitis CBS6054、质粒pBlu2SKP、pY26TEF1-GPD和pSH47均有市售。以下实施例中未注明的具体的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》中所述的方法或厂商提供的方案进行。
实施例1构建尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型
(1)以S.stipitis基因组为模板，以引物URA3-5F/URA3-5R，URA3-3F/URA3-3R，其序列为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，分别PCR扩增尿嘧啶合成关键基因URA3基因上下游同源片段URAF和URAR，通过融合PCR的方法获得到同源重组敲除盒。酵母同源整合使URA3得到敲除，在含有5-FOA的筛选培养基上筛选尿嘧啶缺陷型菌株，最终获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株通过PCR进行检测验证。
(2)以S.stipitis基因组为模板，以引物LEU2-5F/LEU2-5R，LEU2-3F/LEU2-3R，其序列为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，分别PCR扩增获得LEU2基因上下游同源片段LEU2F和LEU2R，同带有loxP位点序列的URA3通过融合PCR的方法连接，构成LEU2基因同源重组敲除盒，酵母同源整合使LEU2得到敲除，采用包含亮氨酸的SD固体培养基筛选鉴定亮氨酸缺陷型菌株。转化带有Cre重组酶的质粒pSSH02移除标记基因URA3，获得了尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型菌株。所得尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型菌株通过PCR进行检测验证。PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物11.5μL，引物21.5μL，dNTP5μL。
PCR条件：Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 60℃ 30s，Step 4 72℃1min，Step 5 72℃ 10min，Step 6 4℃保温。
融合PCR条件及方法：(1)ddH2O 28μL，模板1 3μL，模板2 3μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 53℃ 30s，Step4 72℃ 1min，10个循环，Step 5 72℃ 10min。(2)ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 53℃ 30s，Step 4 72℃ 1min，30个循环，Step 5 72℃ 10min。
实施例2富马酸酶基因的敲除
(1)在尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型菌株的基础上，以S.stipitis基因组为模板，设计引物FUM1-5F/FUM1-5R，FUM1-3F/FUM1-3R，其序列为SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36，分别PCR扩增获得PSfum1基因上下游同源片段FUM1F和FUM1R，同带有loxP位点序列的URA3通过融合PCR的方法连接，构成PSfum1基因同源重组敲除盒，酵母同源整合使PSfum1得到敲除，在SD固体培养基筛选鉴定PSfum1缺陷型菌株。转化带有Cre重组酶的质粒pSSH02移除标记基因URA3，获得了PSfum1缺陷型菌株。所得菌株通过PCR检测进行验证。
(2)在(1)所获得的PSfum1缺陷型菌株基础上，以S.stipitis基因组为模板，设计引物FUM2-5F/FUM2-5R，FUM2-3F/FUM2-3R，其序列为SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39，分别PCR扩增获得PSfum2基因上下游同源片段FUM2F和FUM2R，同带有loxP位点序列的URA3通过融合PCR的方法连接，构成PSfum2基因同源重组敲除盒，酵母同源整合使PSfum2得到敲除，在SD固体培养基筛选鉴定PSfum2缺陷型菌株。转化带有Cre重组酶的质粒pSSH02移除标记基因URA3，获得了PSfum1和PSfum2双缺陷型菌株。所得菌株通过PCR检测进行验证。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：Step1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step3 60℃ 30s，Step4 72℃1min，Step5 72℃ 10min，Step6 4℃保温。
融合PCR条件及方法：(1)ddH2O 28μL，模板1 3μL，模板2 3μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step2 94℃ 30s，Step3 53℃ 30s，Step472℃ 1min，10个循环，Step5 72℃ 10min。(2)ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃30s，Step 3 53℃ 30s，Step 4 72℃ 1min，30个循环，Step 5 72℃ 10min。
实施例3载体质粒pYSS01、pBSS01和pSSH02的构建
(1)提取S.stipitis CBS6054基因组模板
S.stipitis CBS6054在YPD培养基(20～25g/L蛋白胨、10～20g/L酵母粉、20～25g/L葡萄糖)中，30℃150～200rpm培养40～48h后，利用基因组提取试剂盒(天根)提取总DNA。
(2)以S.stipitis CBS6054基因组为模板设计引物URA3-F/URA3-R，其序列为SEQID NO：17，利用PCR获得基因URA3，其序列为SEQ ID NO：11，用ApaI and NdeI双酶切后，连接至载体pY26TEF-GPD上，获得质粒pYSS；以S.stipitis CBS6054基因组为模板设计引物TDH3-1F/TDH3-1R和TEF1-1F/TEF1-1R，其序列为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，分别扩增出组成型强启动子TDH3p与TEF1p，其序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。通过融合PCR获得片段TDH3-TEF1，然后BamHI和NotI酶切连接至pYSS载体上，构建了表达质粒pYSS01(图4)。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 60℃ 30s，Step 4 72℃1min，Step 5 72℃ 10min，Step 6 4℃保温。
融合PCR条件及方法：(1)ddH2O 28μL，模板1 3μL，模板2 3μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 53℃30s，Step4 72℃1.5min，10个循环，Step 5 72℃10min。(2)ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 53℃ 30s，Step 4 72℃ 1.5min，30个循环，Step 5 72℃ 10min。
双酶切体系：基因URA3或质粒pY26TEF-GPD 20μL，ApaI 1μL，NdeI1μL，10×buffer5μL，ddH2O 23μL，37℃反应1h。
片段TDH3-TEF1或质粒pYSS 20μL，BamHI 1μL，NotI 1μL，10×buffer 5μL，ddH2O23μL，37℃反应1h。
连接体系：基因URA3片段16μL，pY26TEF-GPD片段1μL，T4连接酶0.5μL，10×buffer2μL，22℃反应1h。
片段TDH3-TEF1 16μL，质粒pYSS 1μL，T4连接酶0.5μL，10×buffer 2μL，22℃反应1h。
(3)以S.stipitis CBS6054基因组为模板，设计引物PsARS2-F/PsARS2-R和LEU2-MF/LEU2-MR，其序列为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，利用PCR获得基因ARS2和LEU2，其序列分别为SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。采用融合PCR的方法获得片段LEU2-ARS2，经SacI和HindIII酶切连接至穿梭质粒pBlu2SKP上获得质粒pBSS。以S.stipitis CBS6054基因组为模板，设计引物TDH3-2F/TDH3-2R、TEF1-2F/TEF1-2R、XYL1-F/XYL1-R和XYL2-F/XYL2-R，其序列为SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21。利用PCR获得启动子TEF1p、TDH3p和终止子XYL1t、XYL2t，其序列为SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。采用融合PCR的方法获得片段XYL1t-TEF1p-TDH3p-XYL2t，片段XYL1t-TEF1p-TDH3p-XYL2t用KpnI和HindIII酶切连接至pBSS质粒中，构建了表达质粒pBSS01(图5)。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 60℃ 30s，Step 4 72℃1min，Step 572℃ 10min，Step 6 4℃保温。
片段LEU2-ARS2融合PCR条件及方法：(1)ddH2O 28μL，模板1 3μL，模板2 3μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 54℃ 30s，Step 4 72℃ 2min，10个循环，Step 5 72℃ 10min。(2)ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。Step 194℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 53℃ 30s，Step 4 72℃ 2min，30个循环，Step 5 72℃ 10min。
片段XYL1t-TEF1p-TDH3p-XYL2t融合PCR条件及方法：(1)ddH2O 28μL，模板1 5μL，模板2 3μL，模板3 3μL模板4 5μL。Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，dNTP 5μL。Step 194℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 56℃ 30s，Step 4 72℃ 2min，10个循环，Step 5 72℃ 10min。
(2)ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 54℃ 30s，Step 4 72℃ 2min，30个循环，Step 5 72℃ 10min。
双酶切体系：片段LEU2-ARS2或质粒pBlu2SKP 20μL，SacI 1μL，HindIII 1μL，10×buffer5μL，ddH2O 23μL，37℃反应1h。
片段XYL1t-TEF1p-TDH3p-XYL2t或质粒pBSS 20μL，KpnI 1μL，HindIII 1μL，10×buffer1μL，ddH2O 23μL，37℃反应1h。
连接体系：片段LEU2-ARS2 16μL，质粒pBlu2SKP 1μL，T4连接酶0.5μL，10×buffer2μL，22℃反应1h。
片段XYL1t-TEF1p-TDH3p-XYL2t 16μL，质粒pBSS 1μL，T4连接酶0.5μL，10×buffer2μL，22℃反应1h。
(4)以S.stipitis CBS6054基因组为模板，设计引物TEF1-3F/TEF1-3R和CYC1-F/CYC1-R，其序列为SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27。利用PCR获得启动子TEF1p和终止子CYC1t，其序列为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14。同人工合成经密码子优化的Zeocin抗性基因YBle进行融合，其序列为SEQ ID NO：6，构成YBle表达盒。将人工合成的经密码子优化的Cre重组酶基因YCre，其序列为SEQ ID NO：4，经XbaI和XhoI酶切连接至穿梭载体在pSH47上，获得质粒pSSH01。利用内切酶ApaI和PstI酶切YBle表达盒连接至pSSH01上，形成Cre重组酶表达载体pSSH02(图6)。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 60℃ 30s，Step 4 72℃1min，Step 5 72℃ 10min，Step 6 4℃保温。
融合PCR条件及方法：(1)ddH2O 28μL，模板1 3μL，模板2 3μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 54℃ 30s，Step4 72℃ 1.5min，10个循环，Step 5 72℃ 10min。(2)ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 353℃30s，Step 4 72℃ 1.5min，30个循环，Step 5 72℃ 10min。
实施例4富马酸合成途径的重组质粒pYSS03和pBSS02构建
(1)根据树干毕赤酵母菌株非传统性的密码子系统以及同米根霉密码子偏好性的不同，将来自米根霉的富马酸还原合成途径的三个酶丙酮酸羧化酶(PYC)、苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸酶(FUM)的基因分别按照树干毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，优化后的序列交由Genewiz Biotechnology Co.,Ltd合成，最终获得基因YPYC，YMDH，YFUM，其序列分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
(2)以YMDH-F/YMDH-R引物，其序列为SEQ ID NO：42，扩增YMDH基因，用BamHI和XhoI双酶切连接至pYSS01质粒上，形成质粒pYSS02。以YFUM-F/YFUM-R引物，其序列为SEQID NO：43，扩增YFUM基因，用NotI和SpeI双酶切连接至pYSS02质粒上，形成质粒pYSS03(图1)。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 60℃ 30s，Step 4 72℃1min，Step 5 72℃ 10min，Step 6 4℃保温。
双酶切体系：基因YMDH或者质粒pYSS0120μL，BamHI 1μL，XhoI1μL，10×buffer 5μL，ddH2O 23μL，37℃反应1h。基因YFUM或者质粒pYSS0220μL，NotI 1μL，SpeI 1μL，10×buffer 5μL，ddH2O 23μL，37℃反应1h。
连接体系：基因双酶切片段16μL，质粒双酶切片段1μL，T4连接酶0.5μL，10×buffer 2μL，22℃反应1h。
(3)以引物YPYC-F/YPYC-R引物，其序列为SEQ ID NO：41扩增YPYC，SalI和NdeI双酶切连接至载体pBSS01上，获得质粒pBSS02(图2)。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 60℃ 30s，Step 4 72℃2min，Step 5 72℃ 10min，Step 6 4℃保温。
双酶切体系：基因YPYC或者质粒pBSS0120μL，SalI 1μL，NdeI1μL，10×buffer 5μL，ddH2O 23μL，37℃反应1h。
连接体系：基因双酶切片段16μL，质粒双酶切片段1μL，T4连接酶0.5μL，10×buffer 2μL，22℃反应1h。
实施例5利用木糖发酵富马酸的树干毕赤酵母合成菌株的构建
(1)树干毕赤酵母感受态的制备方法步骤如下：
1)平板活化出发菌，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养至饱和；
2)以1％的接种量至新的YPD液体培养基中，装液量为50mL/250mL，30℃，200rpm培养到细胞OD600值为1.0-1.2；
3)将培养液分装到两个预冷的50mL无菌离心管中，4℃，4000rpm，5min离心去上清，每管加入8mL无菌ddH2O重悬后合为一管，然后依次加入2mL10×TE缓冲液(pH7.5)，4mL0.2mol/L的醋酸锂和0.5mL 1mol/L的DTT，旋转混匀，30℃，水浴1小时；
4)4℃，4000rpm，5min离心去上清；
5)用预冷的ddH2O洗涤两次，然后用预冷1mol/L的山梨醇溶液洗涤一次；
6)沉淀细胞中加入200μL1mol/L的山梨醇重悬，分装于灭菌的EP管中，每管80μL，直接转化或保存于-80℃。
(2)电转化方法：
1)将预先需要转化的质粒样品用PCR试剂盒纯化，洗脱体系中含有的离子。
2)将8μL pYSS03和pBSS02质粒(约8μg)加入80μL感受态中，冰中预冷30分钟。同时将电击杯放置冰上30min。
3)将感受态细胞转入预冷的2mm电转杯中，然后用电转仪进行转化。转化条件为：电压1.5KV，电容25μF，电阻200Ω，电击4ms。
4)电击完毕后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液混匀，然后转至无菌的1.5mLEP管中，30℃水浴锅温育1-2h，5000rpm离心30s，吸去800μL上清，剩余菌体进行涂布在不含尿嘧啶和亮氨酸的SD培养基上进行筛选。
5)倒置培养皿，30℃培养3-4天。
(3)富马酸合成菌株的鉴定
将平板上的单克隆挑取至SD液体培养基中进行过夜培养，采用试剂盒提取质粒，进行双酶切和PCR验证。验证正确后的菌株为能初步利用木糖发酵富马酸的树干毕赤酵母合成菌株。
实施例6异源表达密码子优化的转运蛋白YMAE
(1)根据树干毕赤酵母菌株非传统性的密码子系统以及同米根霉密码子偏好性的不同，将来自栗酒裂殖酵母的四碳二羧酸转运蛋白基因SpMAE1按照树干毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，优化后的序列交由Genewiz Biotechnology Co.,Ltd合成，最终获得基因YMAE，其序列为SEQ ID NO：5。
(2)设计YMAE-F/YMAE-R引物，其序列为SEQ ID NO：44，扩增YMAE基因，用BamHI和NotI双酶切连接至pBSS02质粒上，形成质粒pBSS03(图3)。
(3)质粒pBSS03导入实施例5所获得的菌株的中，获得了能高效发酵木糖生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板1μL，Fastpfu buffer 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：Step 1 94℃ 4min，Step 2 94℃ 30s，Step 3 60℃ 30s，Step 4 72℃1min，Step 5 72℃ 10min，Step 6 4℃保温。
双酶切体系：基因YMAE或者质粒pBSS0220μL，BamHI 1μL，NotI 1μL，10×buffer 5μL，ddH2O 23μL，37℃反应1h。
连接体系：基因双酶切片段16μL，质粒双酶切片段1μL，T4连接酶0.5μL，10×buffer 2μL，22℃反应1h。
实施例7合成菌株利用木糖高效发酵富马酸的分批发酵实验
(1)富马酸发酵用到的培养基：木糖50～60g/L，尿素0.1～0.2g/L，5～6g/LKH2PO4,，2～5g/L MgSO4·7H2O，0.2～0.4mg/L生物素，1～2mg/L维生素B1，1～2mg/L维生素B6，1～2mg/L烟酸，0.2～0.4mg/L对氨基苯甲酸，1～2mg/L泛酸钙，10mL/L微量金属元素母液。微量金属元素母液包括0.05～0.1g/L CuSO4·5H2O，2～5g/L FeSO4·7H2O，0.2～0.4g/L MnCl2·4H2O，2～3g/L CaCl2·2H2O，0.5～0.6g/L ZnCl2，0.04～0.1g/L NaMoO42H2O，0.03～0.1g/L CoCl2，0.1～0.2g/L H3BO4，0.01～0.05g/L KI。CaCO35～15g/L用于发酵培养基的缓冲剂。种子培养基包括10～20g/L木糖，6～7g/L YNB，5～6g/L硫胺素，pH为5.5～6.0。
(2)富马酸微氧发酵实验：将树干毕赤酵母合成菌株接种至含有20～25mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养32h～40h至对数中期。然后离心收集酵母细胞，用新鲜的发酵培养基悬浮，接种至含有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，起始OD600为0.5～0.8，并加入5～15g/L CaCO3。发酵条件为30℃，150～200rpm，恒温振荡培养。发酵培养72h～96h后取培养液，10000rpm离心，并0.22μm膜过滤，取上清测定富马酸含量。
(3)富马酸含量测定：采用Agilent1100高效液相色谱，色谱柱为Aminex HPX-87H色谱柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，流动相为5mmol/L的稀硫酸，流速为0.6mL/min，温度为30℃。

Claims (5)

1.一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法，其特征是步骤如下：
(1)采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三羧酸循环中的编码富马酸酶的基因PSfum1和PSfum2，获得了富马酸酶缺失菌株；
(2)在所获得的富马酸酶缺失菌株的基础上异源表达优化的富马酸还原合成模块，获得了利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株；
(3)在所获得的酵母合成菌株的基础上，表达经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母的转运蛋白YMAE，其序列为SEQ ID NO：5，获得了发酵木糖生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株；
(4)将获得的树干毕赤酵母合成菌株在发酵培养基中发酵木糖生产富马酸，发酵培养3～4天，发酵条件为30℃，150～200rpm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中异源表达优化的富马酸还原合成模块是，将来自米根霉的富马酸还原合成途径丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶的三个酶的基因，按照树干毕赤酵母的密码子偏好性分别进行优化，获得基因YPYC、YMDH、YFUM；其基因序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株是：将含有YMDH和YFUM基因，其基因序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的质粒pYSS05和含有基因YPYC基因，其基因序列为SEQ ID NO：1的质粒pBSS03导入富马酸酶缺失菌株中。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵培养基为：木糖50～60g/L，尿素0.1～0.2g/L，5～6g/L KH2PO4，2～5g/L MgSO4·7H2O，0.2～0.4mg/L生物素，1～2mg/L维生素B1，1～2mg/L维生素B6，1～2mg/L烟酸，0.2～0.4mg/L对氨基苯甲酸，1～2mg/L泛酸钙，10mL/L微量金属元素母液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：微量金属元素母液包括0.05～0.1g/LCuSO4·5H2O，2～5g/L FeSO4·7H2O，0.2～0.4g/L MnCl2·4H2O，2～3g/L CaCl2·2H2O，0.5～0.6g/L ZnCl2，0.04～0.1g/L NaMoO4 2H2O，0.03～0.1g/L CoCl2，0.1～0.2g/L H3BO4，0.01～0.05g/L KI。
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