CN110607326B - 非强启动式的外源基因表达法及其在具有毒性的目标蛋白表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种非强启动式的外源基因表达法及其在CHO细胞中的应用该方法，通过定点整合的方式，将外源蛋白编码序列定点整合插入至宿主细胞自身基因的启动子下游，并利用宿主自身基因的启动子以及相关转录起始或翻译起始调控序列实现外源基因的转录、表达。利用宿主细胞自身的启动子以及调控机制，实现外源基因非强启动式的表达，从而避免由于外源毒性蛋白在宿主细胞强启动式表达造成的细胞死亡，和加速死亡，实现先增殖后表达，从而在宿主细胞生长后期获得大量毒性目标蛋白。填补了目前现有技术中的空白，为有关毒性蛋白基因工程技术的研究发展开拓了新的方向。
Description
技术领域
本发明公开一种非强启动式的外源基因表达法及其在CHO细胞中的应用，属于生物技术领域，特别是生物技术领域中的基因重组改造方面。
背景技术
外源基因是相对内源基因命名的，对于一个细胞来说，内源基因是其基因组的序列，也就是该生物本身所具有的基因（DNA）序列，而外源基因则是一段来自其他物种，或者是人工合成的基因片段。我们将外源基因引入至宿主细胞，并通过宿主细胞进行高效的表达，从而收获外源基因编译的目标蛋白。
目前现有技术中，外源基因通过基因工程技术或者病毒感染等途径引入宿主靶细胞的基因片段。
病毒感染是一种随机的引入途径，通过重组的病毒感染宿主细胞，自然选择插入位点，从而将外源基因随机的整合在宿主细胞的内源基因上。这是一种随机整合方式。
科学家们经过对感染过程的研究以及感染后重组基因的测序等方式，发现了一些经常性的，具有一定规律性的位点。从而逐步形成了定点基因组整合重组表达的阶段。
所谓的定点整合，就是指利用基因工程技术手段，将一段完整的基因表达盒整合到染色体的某一位点。
无论是通过基因工程技术，还是通过病毒感染的途径，用于重组的这段基因片段均为一段完整的基因表达盒。将这一完整的基因表达盒整合进入染色体某位点后，依靠表达盒中的外源启动子，实现重组蛋白的表达。为了能够保证外源基因的表达，目前现有技术中通常采用强启动子或者是弱化内源基因启动子的方式，实现外源基因的强启动。
在这个过程中，内源基因的表达是否受到影响，是否能够正常转录、表达均不需要考虑。因此，外源基因的整合位点的选择基本位于宿主细胞染色体相对稳定且转录活跃的区域，满足插入序列不会伴随染色体的复制而丢失并可高效转录的要求即可。至于这一插入位点对宿主细胞本身相关基因的转录、表达等均无需考虑。
随着重组蛋白表达技术的不断发展，越来越多的目标蛋白通过基因重组的方式设计，并借助宿主细胞表达获得。
这其中就包含了一些具有细胞毒性的蛋白，这些蛋白的表达会对宿主细胞产生影响，使得宿主细胞死亡，或者加速宿主死亡的进程。宿主细胞是重组蛋白表达的载体，如果宿主细胞死亡，那么就无法获得更多的蛋白。在宿主细胞的基因中，增加插入位点，可以在初期获得更多的目标蛋白，但是这些蛋白的毒性使得宿主细胞更快死亡。因此，现有技术中一直无法解决如何能够利用基因重组技术在宿主细胞中高产量的获得具有细胞毒性的蛋白。
发明内容
本发明的目的是解决目前现有技术中具有毒性的目标蛋白容易造成宿主细胞死亡，从而无法获得预期重组转录表达效果的问题。
为了解决这一问题，本发明公开了一种非强启动式的外源基因表达法，该方法通过定点整合的方式，将外源蛋白编码序列定点整合插入至宿主细胞自身基因的启动子下游，并利用宿主自身基因的启动子以及相关转录起始或翻译起始调控序列实现外源基因的转录、表达。
具体包括以下步骤：
S1：选择宿主细胞，并根据宿主细胞中不同内源蛋白的表达规律，选择满足目标外源蛋白表达时间要求的内源蛋白，并根据GenBank确定该内源蛋白基因的表达盒序列；
S2：选择用于定点插入的基因编辑系统；
S3：在内源蛋白基因的表达盒序列中按照以下规则选择均满足条件的位点作为定点插入点，a.位于该内源蛋白基因的转录起始位点上游，b.位于该内源蛋白编码基因的启动子下游，c.满足定点插入基因编辑系统的识别操作要求；
S4：根据插入位点，设计合成包含插入位点上游同源序列、loxP511序列、eGFP编码序列、loxP序列、IRES2序列、插入位点下游同源序列的荧光标记外源基因序列；
S5：利用S2中选择的基因编辑系统将S4中获得的外源基因序列插入至S3筛选获得的插入点中；
S6：经PCR特异性扩增片段并测序验证，获得在不同插入位点处整合插入外源基因序列的重组细胞克隆；
S7：考察不同插入位点定点整合插入的重组细胞中eGFP的转录水平，选择eGFP转录水平与S1中所选内源基因转录水平变化基本一致的插入位点，分别标记为靶向位点1、靶向位点2、……靶向位点n；
S8：以“宿主细胞-内源蛋白-靶向位点n”为格式记录形成可插入位点表单；
S9：采用Cre/loxp系统在外源基因序列的loxP511和loxP之间进行目标蛋白编码序列与eGFP编码序列的置换，得到目标外源基因序列；
S10：将S9中的目标外源基因序列按照S5的方式插入S8中某一或者某几个“宿主细胞-内源蛋白-靶向位点n”插入位点中，获得目标蛋白。
由于目标蛋白在插入时不含有启动子，其利用宿主细胞内本身的启动子开始转录、翻译，因此，目标蛋白的表达是随其插入位点所在的内源蛋白的表达而启动的。而在宿主细胞内的这一内源蛋白的启动、转录起始、以及翻译起始均受到调控序列的调控，因此目标蛋白的表达同时也就受到这一调控序列的控制。从而实现一种非强启动式的外源基因表达法。通过这种非强启动式的外源基因表达法，外源基因可以按照表达时间的需要，选择不同的内源蛋白，从而在宿主细胞不同的生长阶段表达。
并且，利用这一非强启动式的外源基因表达法，将具有毒性的目标蛋白编码序列插入至宿主细胞生长后期表达的蛋白中，就可以在宿主细胞生长的后期表达该毒性蛋白。由于宿主细胞经过前期和中期大量的生长增殖，已经具有一定量的规模，此时表达毒性蛋白，获得的目标蛋白量更大，且该表达对宿主细胞本身的生长-死亡历程影响小。
进一步优选地，本发明还公开所述的宿主细胞为CHO细胞。
CHO细胞是目前生物医药产业中应用最为广泛的重组蛋白表达宿主细胞，能够应用在CHO细胞中的定点整合方法有多种，这些方法大都是特异整合位点的同源重组技术，依靠位点特异性重组酶，在基因组和外源DNA载体上的重组酶特异识别位点间实现基因片段置换、基因敲除、基因敲入等遗传工程操作。因此，利用CHO细胞作为宿主细胞更加成熟、稳定。
更为优选地，内源蛋白为硫氧还蛋白互作蛋白（Txnip）。
进一步，优选地，采用CRISPR/Cas9系统作为定点插入位点系统。
与之相对应的，满足定点插入基因编辑系统的识别操作要求的序列为（5’-N(N…N)19NGG-3’）。
进一步，本发明还公开利用CRISPR/Cas9系统定点插入外源基因的步骤包括3个转染操作载体：1）根据插入位点的上下游序列构建的含有上下游同源序列以及插入序列的同源重组载体，2）构建可识别插入位点的sgRNA载体，3）含有完整Cas9表达盒的载体。
更进一步优选的，还包括步骤：将3个载体转染至CHO细胞中，转染后经传代培养至第5天，采用流式细胞仪将具有绿色荧光的CHO细胞分选至96孔板中，并使其每孔仅含有一个细胞克隆。
同时，本发明中还进一步公开，考察不同插入位点定点整合插入的重组细胞中eGFP的转录及表达水平的方式为：在一个培养周期内，对于CHO细胞来说为6天，考察绿色荧光报告基因的转录水平以及绿色荧光强度水平的变化。
本发明同时还公开了一种不含有启动子的外源基因表达序列，该外源基因表达序列区别于现有的外源基因表达盒，不含有启动子，更加不含有强启动子，其应用于本发明公开的非强启动式外源基因表达法中，通过内源蛋白基因表达盒中的启动子启动。
本发明是一个创新性的发明，解决了目前业内毒性蛋白无法高产量表达的困境。通过利用宿主细胞自身的启动子以及调控机制，实现外源基因非强启动式的表达，从而避免由于外源毒性蛋白在宿主细胞强启动式表达造成的细胞死亡和加速死亡，实现先增殖后表达，从而在宿主细胞生长后期获得大量毒性目标蛋白。填补了目前现有技术中的空白，为有关毒性蛋白基因工程技术的研究发展开拓了新的方向。
附图说明
图1为靶向识别位点在CHO-K1细胞Txnip基因序列中的位置特征示意图。
图2为定点整合载体的示意图。
图3为CHO细胞克隆PCR产物电泳图。
图4为CHO定点整合重组克隆的eGFP转录水平测定结果示意图。
图5为定点整合插入的重组CHO细胞克隆10-6-G的eGFP表达水平示意图。
图6为C端截短的猪瘟病毒E2蛋白的内源非强启动式表达结果示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
实施例1
首先，在本实施例中我们选择CHO细胞作为宿主细胞。因为本实施例中，我们的目标是表达具有细胞毒性的外源蛋白，所以我们需要选择能够在细胞前期和中期不表达，而在细胞高速生长并达到高细胞密度后才开始转录表达的蛋白作为满足时间要求的内源蛋白。因此，在本实施例中我们选择Txnip（硫氧还蛋白互作蛋白）作为待插入的内源蛋白。该硫氧还蛋白互作蛋白是在CHO细胞生长后期才开始高效表达的内源蛋白。
然后，根据GenBank中关于中国仓鼠Cricetulus griseus 1.0版本的基因组整合数据（GCF_000223135.1） 中NW_003613699.1的序列，确定Txnip（硫氧还蛋白互作蛋白）的表达盒序列。
再次，我们确定在本实施例中采用CRISPR/Cas9系统作为定点插入的基因编辑系统。该系统是第三代基因编辑技术，可以在真核细胞中实现基因组上的定点敲除、突变和敲入。
根据本发明公开，下面我们需要在内源蛋白基因的表达盒序列中按照以下规则选择均满足条件的位点作为定点插入点，a.位于该内源蛋白基因的翻译起始位点上游，b.位于该内源蛋白基因的启动子下游，c.满足定点插入基因编辑系统的识别操作要求；
对于本实施例来说，我们选择在Txnip编码序列第一个外显子（exon 1）的上游，转录调控元件TATA序列的下游筛选满足CRISPR/Cas9系统可识别并操作的序列，如图1中所示。
满足上述要求的插入位点的基因组DNA序列如表1所示：
表1：
| 序号 | 序列名称 | 插入位点的基因序列 |
| 1 | SEQ NO：1 | ACTCGCCACCCCTCATCTCGTGG |
| 2 | SEQ NO：2 | CTCGCCACCCCTCATCTCGTGGG |
| 3 | SEQ NO：3 | CCCTCATCTCGTGGGTTTCCTGG |
| 4 | SEQ NO：4 | CCAGCAGGGTCGAAGCTCTCAGG |
| 5 | SEQ NO：5 | CACCGTTTCGAGAAGTTGTTGGG |
| 6 | SEQ NO：6 | ACCGTTTCGAGAAGTTGTTGGGG |
| 7 | SEQ NO：7 | ACCCCAACAACTTCTCGAAACGG |
| 8 | SEQ NO：8 | GGCTCCTTTAGCTTTTCGTTTGG |
| 9 | SEQ NO：9 | CACTCTCCGGAAGGCAGACAGGG |
| 10 | SEQ NO：10 | TCACTCTCCGGAAGGCAGACAGG |
| 11 | SEQ NO：11 | TGAAGAGTTCACTCTCCGGAAGG |
| 12 | SEQ NO：12 | CAGATGAAGAGTTCACTCTCCGG |
| 13 | SEQ NO：13 | AACTCTTCATCTGCTGTGAAGGG |
| 14 | SEQ NO：14 | CTCTCCCGCCTCCGTTTATCTGG |
| 15 | SEQ NO：15 | GGTTCCAGATAAACGGAGGCGGG |
| 16 | SEQ NO：16 | GGGTTCCAGATAAACGGAGGCGG |
| 17 | SEQ NO：17 | AGCGGGTTCCAGATAAACGGAGG |
| 18 | SEQ NO：18 | TTCAGCGGGTTCCAGATAAACGG |
然后，我们设计合成包含插入位点上游同源序列、loxP511序列、eGFP编码序列、loxP序列、IRES2序列、插入位点下游同源序列的荧光标记外源基因序列；该定点整合载体序列特征如图2所示；
对应插入位点，这些荧光标记外源基因序列如表2：
表2：
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 序列名称 | SEQ NO：19 | SEQ NO：20 | SEQ NO：21 | SEQ NO：22 | SEQ NO：23 | SEQ NO：24 | SEQ NO：25 | SEQ NO：26 | SEQ NO：27 | SEQ NO：28 |
| 序号 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | ||
| 序列名称 | SEQ NO：29 | SEQ NO：30 | SEQ NO：31 | SEQ NO：32 | SEQ NO：33 | SEQ NO：34 | SEQ NO：35 | SEQ NO：36 |
获得表2中的荧光标记外源基因序列后，我们分别利用CRISPR/Cas9系统将其插入至表1对应的插入位点处；具体的插入方式是：包含3个转染操作载体，1）根据插入位点的上下游序列构建的含有上下游同源序列以及插入序列的同源重组载体，2）构建可识别插入位点的sgRNA载体，3）含有完整Cas9表达盒的载体。将3个载体转染至CHO细胞中，转染后经传代培养至第5天，采用流式细胞仪将具有绿色荧光的CHO细胞分选至96孔板中，并使其每孔仅含有一个细胞克隆。
经PCR特异性扩增片段并测序验证，获得在不同插入位点处整合插入外源基因序列的重组CHO细胞克隆；PCR引物的序列如表3所示：
表3：
| CHO-P1 | SEQ NO：37 | GACTGAAGAGACTTGGGGAAAAGCAAC |
| CHO-P2 | SEQ NO：38 | GTCAATGGGGGTGGGGCTTTTAG |
| CHO-P3 | SEQ NO：39 | TAAACAGTCGCCTCGAAATGAATTGC |
| CHO-P4 | SEQ NO：40 | TCTGTGAAAACTGGGCAGCAGACAAG |
两组PCR扩增产物的电泳结果如图3所示。其中细胞克隆1-1-D，1-6-E，1-10-C，8-6-C，9-9-F，10-6-G，15-7-G的PCR产物经测序证明外源基因序列分别插入至表1中的若干位点。同时考察不同插入位点定点整合插入的重组细胞中eGFP的转录水平（如图4所示），选择在一个培养周期内（6天），该荧光报告基因的的转录水平变化与Txnip基因的转录水平变化一致的插入位点，分别标记为靶向位点1、靶向位点2、……靶向位点n。根据Txnip基因的转录水平可见，细胞克隆1-1-D，1-6-E，8-6-C，9-9-F，10-6-G的eGFP的转录强度随培养时间的延长逐步增强，体现出Txnip蛋白的转录、表达特征。具体的细胞克隆1-1-D的插入位点标记为靶向位点1，细胞克隆1-6-E的插入位点标记为靶向位点2，细胞克隆8-6-C的插入位点标记为靶向位点3，细胞克隆9-9-F的插入位点标记为靶向位点4，细胞克隆10-6-G的插入位点标记为靶向位点5。至此我们获得5个成功插入eGFP编码片段的基因组位点，以“宿主细胞-内源蛋白-靶向位点n”为格式记录形成可插入位点表单，如表4所示。
表4：
| 序 号 | 基因组DNA序列及理论插入位点 | |
| CHO-Txnip-靶向位点1 | SEQ NO：41↕TTGGGG | ACCGTTTCGAGAAGTTG↕TTGGGG |
| CHO-Txnip-靶向位点2 | SEQ NO：42↕GTTGGG | CACCGTTTCGAGAAGTT↕GTTGGG |
| CHO-Txnip-靶向位点3 | SEQ NO：43↕CTCAGG | CCAGCAGGGTCGAAGCT↕CTCAGG |
| CHO-Txnip-靶向位点4 | SEQ NO：44↕TGCTGG | TCCTGGGCTCATCCGGC↕TGCTGG |
| CHO-Txnip-靶向位点5 | SEQ NO：45↕CGGAGG | AGCGGGTTCCAGATAAA↕CGGAGG |
考察细胞克隆10-6-G（靶向插入位点5）在一个培养周期内eGFP的表达情况也体现出外源蛋白在非强启动式的内源基因表达盒中的表达特征，如图5所示。
在本实施例中，我们选择“CHO-Txnip-靶向位点5”作为计划的插入位点，采用Cre/loxp系统在外源基因序列的loxP511和loxP之间进行目标蛋白（C端截短的猪瘟病毒E2蛋白）编码序列与eGFP编码序列的置换，得到目标外源基因序列，如SEQ NO：46所示。
紧接着，我们采用CRISPR/Cas9系统以及前述处插入方式形成将这一目标外源基因序列插入至“CHO-Txnip-靶向位点5”位点中，获得目标蛋白。
经过检测，置换重组的CHO细胞克隆可表达C端截短的猪瘟病毒E2蛋白，经高密度悬浮培养其表达效率明显高于传统的重组表达模式，在一个批式悬浮培养周期内C端截短的猪瘟病毒E2蛋白表达量随培养时间延长逐步增高（蛋白表达经western blot检测如图6所示），在培养第6天，其表达量可达到41ug/ml，是现有技术中目标蛋白的生成量12ug/ml的3倍以上。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 非强启动式的外源基因表达法及其在具有毒性的目标蛋白表达中的应用
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 23
<212> DNA
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<210> 19
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<212> DNA
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<400> 19
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caccgtgtcc acgcgcccct gcggccgcgc ggattggtcg gaggcctggt aaacaagggc 120
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ttccggagag tgaactcttc atctgctgtg aagggctctt acgagttttc tctcccgcct 1920
ccgttt 1926
<210> 20
<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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<210> 21
<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
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<210> 22
<211> 1926
<212> DNA
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<400> 22
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<210> 23
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<400> 23
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<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
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<400> 26
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gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 480
tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 540
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cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac 1620
cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat atggccacaa ccatggtccg 1680
tttatctgga acccgctgaa cccaatcatg gtgatgttca agaagatcaa gtcttttgag 1740
gtggtcttca acgaccccga gaaggtgtac ggcagcgggg agaaggtggc cggccgggtg 1800
atagtggaag tgtgtgaagt tactcggatc aaagccgtca ggatcctggc ttgcggagtg 1860
gccaaggtcc tgtggatgca agggtctcag cagtgcaaac agaccttgga ctacctgcgt 1920
tatgaa 1926
<210> 34
<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctcatctcgt gggtttcctg ggctcatccg gctgctggag caaagagaca gccgccgctg 60
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agaagttgtt ggggttttgt taaagggctc ctttagcttt tcgtttgggt tttttcaagc 180
cctgtctgcc ttccggagag tgaactcttc atctgctgtg aagggctctt acgagttttc 240
tctcccgcct gctagcataa cttcgtatag tatacattat acgaagttat gccgccacca 300
tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 360
gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 420
gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 480
tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 540
agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 600
tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 660
tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 720
agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg 780
gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 840
accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 900
acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 960
tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaaa 1020
taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatgtcgacg gtaccgcggg cccgggatcg 1080
atccgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc 1140
cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg 1200
gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc 1260
aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga 1320
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cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat atggccacaa ccatggccgt 1680
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tagtggaagt gtgtgaagtt actcggatca aagccgtcag gatcctggct tgcggagtgg 1860
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atgaag 1926
<210> 35
<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atctcgtggg tttcctgggc tcatccggct gctggagcaa agagacagcc gccgctgctt 60
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<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatgtcgacg gtaccgcggg cccgggatcg 1080
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ctcagattac ttcgcagaac atcatcatca tcatcattaa ataacttcgt atagcataca 1140
ttatacgaag ttat 1154
Claims (7)
1.非强启动式的外源基因表达法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1：选择宿主细胞，并根据宿主细胞中不同内源蛋白的表达时间，选择满足目标外源蛋白表达时间要求的内源蛋白，并根据GenBank确定该内源蛋白基因的表达盒序列；
S2：选择用于定点插入的基因编辑系统；
S3：在内源蛋白基因的表达盒序列中按照以下规则选择均满足条件的位点作为定点插入点，a.位于该内源蛋白基因的转录起始位点上游，b.位于该内源蛋白基因的启动子下游，c.满足定点插入基因编辑系统的识别操作要求；
S4：根据插入位点，设计合成包含插入位点上游同源序列、loxP511序列、eGFP编码序列、loxP序列、IRES2序列、插入位点下游同源序列的荧光标记外源基因序列；
S5：利用S2中选择的基因编辑系统将S4中获得的外源基因序列插入至S3筛选获得的插入点中；
S6：经PCR特异性扩增片段并测序验证，获得在不同插入位点处整合插入外源基因序列的重组细胞克隆；
S7：考察不同插入位点定点整合插入的重组细胞中eGFP的转录水平，选择eGFP转录水平与S1中所选内源基因转录水平变化基本一致的插入位点，分别标记为靶向位点1、靶向位点2、…… 靶向位点n；
S8：以“ 宿主细胞-内源蛋白-靶向位点n”为格式记录形成可插入位点表单；
S9：采用Cre/loxp系统在外源基因序列的loxP511和loxP之间进行目标蛋白编码序列与eGFP编码序列的置换，得到目标外源基因序列；
S10：将S9中的目标外源基因序列按照S5的方式插入S8中某一或者某几个“ 宿主细胞-内源蛋白-靶向位点n”插入位点中，获得目标蛋白；
利用宿主自身基因的启动子以及相关转录起始或翻译起始调控序列实现外源基因的转录、表达；所述外源蛋白编码序列中不含有启动子。
2.根据权利要求1所述的非强启动式的外源基因表达法，其特征在于：所述的宿主细胞为CHO细胞。
3.根据权利要求2所述的非强启动式的外源基因表达法，其特征在于：内源蛋白为硫氧还蛋白互作蛋白。
4.根据权利要求3所述的非强启动式的外源基因表达法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9系统作为定点插入的基因编辑系统。
5.根据权利要求4所述的非强启动式的外源基因表达法，其特征在于：CRISPR/Cas9系统定点插入外源基因的步骤包括3个转染操作载体：1）根据插入位点的上下游序列构建的含有上下游同源序列以及插入序列的同源重组载体，2）构建可识别插入位点的sgRNA载体，3）含有完整Cas9表达盒的载体。
6.根据权利要求1所述的非强启动式的外源基因表达法，其特征在于：通过荧光报告基因的转录水平变化来考察eGFP的转录水平。
7.权利要求1-6任一项所述的非强启动式的外源基因表达法在具有毒性的目标蛋白表达中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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Citations (3)
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| AU5840198A (en) * | 1992-12-03 | 1998-06-04 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination |
| CN1255166A (zh) * | 1997-03-14 | 2000-05-31 | 艾德药品公司 | 将基因整合至哺乳动物细胞特定位点的方法及所用载体 |
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-
2018
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Patent Citations (3)
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|---|
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Also Published As
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