CN115786355A - Tango6基因在促进细胞增殖中的应用以及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞扩增方法技术领域，具体涉及Tango6基因在促进细胞增殖中的应用以及方法。Tango6基因具有促进细胞增殖的作用，通过在各类细胞中过表达Tango6基因，可以促进细胞扩增。TANGO6蛋白(Tango6基因)作为一个全新的控制细胞增殖的因子，到目前为止还未见研究报道。通过包装敲降以及过表达Tango6基因的慢病毒，我们发现其可以调节细胞的扩增水平。我们发现了基于Tango6基因超表达的全新的促进干细胞扩增的方法，具有极大的临床应用潜力。Tango6基因作为细胞增殖的调控关键因子，可应用于相关药物筛选的实践操作中，为有效且简便地控制干细胞增殖创造条件。

Description

Tango6基因在促进细胞增殖中的应用以及方法

技术领域

本发明涉及细胞扩增方法技术领域，具体涉及Tango6基因在促进细胞增殖中的应用以及方法。

背景技术

干细胞由于其具有分化成各类细胞的潜能，已经广泛应用于骨髓移植等多种领域，可用于治疗白血病等干细胞缺陷导致的疾病。但如何在体外对各类干细胞进行扩增，以满足临床需要一直是人们关注的重点。

中国专利CN110157736B提出了一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，提供了一段可以特异性的降低山羊毛囊干细胞中CMTM3基因mRNA的表达水平的shRNA，该片段与载体pDC316-ZsGreen-shRNA连接组成干扰载体pDC316-ZsGreen-shRNA-CMTM3，将该干扰载体导入到山羊毛囊干细胞中可以降低基因CMTM3 mRNA的表达水平，从而促进毛囊干细胞增殖。但是针对于人类胚胎干细胞等其他干细胞，目前还没有非常有效的基于基因调控的促进细胞增殖且不会引起细胞癌变(无限增殖)的方法，且相关调控基因尚不明确。由于干细胞资源的稀缺，极大地限制了干细胞在临床上的应用。

发明内容

本发明意在提供Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，以解决现有技术中缺少有效地促进干细胞增殖的方法的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本方案还提供了一种促进细胞增殖的方法，包括以下依次进行的步骤：

S1：构建用于表达Tango6基因的表达载体；

S2：对表达载体进行慢病毒包被，获得病毒液；

S3：使用病毒液感染待扩增的细胞。

本技术方案的原理以及有益效果在于：

发明人首先通过正向遗传学的手段，对野生型斑马鱼进行ENU介导的诱变，获得若干突变体，发现其中的cq72突变体的造血干/祖细胞(HSPCs)数目从3.5dpf(受精后3天)开始显著减少，5dpf基本消失。发明人通过图位克隆的方法对突变基因定位，最终通过测序证实突变基因为Tango6。为了进一步验证基因功能，发明人通过CRISPR/Cas9技术构建了基因敲除突变体，证实该基因对造血干/祖细胞增殖产生影响，进而将其作为提升细胞扩增水平的候选基因。发明人再通过基因敲除和过表达实验，进而证实了该基因与细胞扩增水平的相关性。

TANGO6蛋白(Tango6基因)作为一个全新的控制细胞增殖的因子，到目前为止还未见研究报道。通过包装敲降以及过表达Tango6基因的慢病毒，我们发现其可以调节细胞的扩增水平，敲降TANGO6蛋白可抑制细胞的扩增，相应的，过表达TANGO6可促进了细胞的扩增。干细胞医疗成为研究热点，通过器官移植治疗各类干细胞缺陷导致的疾病，如白血病等。而在移植之前，如何获取足够数目的干细胞成为关注的重点。我们发现了基于Tango6基因超表达的全新的促进干细胞扩增的方法，具有极大的临床应用潜力。除了构建Tango6基因超表达的干细胞外，还可以研发针对Tango6基因抑制剂，从而促进干细胞扩增。

进一步，所述细胞为干细胞。实验结果显示，Tango6基因对促进干细胞扩增具有正向作用，所以可以用于干细胞的促增殖的操作中。

进一步，所述干细胞为胚胎干细胞或者造血干/祖细胞。实验显示，Tango6基因对多种干细胞均有较为理想的促进增殖的效果，这些干细胞包括胚胎干细胞、造血干/祖细胞。

进一步，所述细胞为神经元细胞或者白细胞。除了干细胞外，Tango6基因还可以促进其他细胞的增殖。实验结果显示，过表达Tango6后促进了细胞增殖水平，使得造血干/祖细胞(cmyb标记)数目增加，并由此导致红细胞前体(gata1标记)，淋巴细胞前体(irf4a标记)，粒细胞(lyz标记)以及巨噬细胞(mfap4标记)等下游谱系细胞数目增加。除此之外，神经元细胞中过表达Tango6后也会导致细胞数目增加，与血液细胞表型一致。

进一步，Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，包括提高Tango6基因在细胞中的表达水平的步骤。通过提高Tango6基因的转录水平，可以促进该细胞的增殖。

进一步，在S1中，先通过PCR扩增所述Tango6基因，获得扩增产物；再将扩增产物整合在空载体上，获得表达载体。上述过程为获得过表达载体的现有技术的常规过程，操作过程简单且能获得稳定的表达载体。

进一步，在S1中，PCR扩增的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PCR扩增的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。采用上述引物可以实现对Tango6基因的高效扩增。

进一步，Tango6基因在筛选促进干细胞增殖的药物中的应用。

进一步，所述药物用于提升Tango6基因的转录水平，或者提升Tango6蛋白的表达水平，或者提升Tango6蛋白的活性。

TANGO6蛋白(Tango6基因)作为一个全新的控制细胞增殖的因子，到目前为止还未见研究报道。通过包装敲降以及过表达Tango6基因的慢病毒，我们发现其可以调节细胞的扩增水平。因此，TANGO6蛋白(Tango6基因)为控制细胞扩增水平的关键因子(靶点)。通过对关键因子(靶点)的控制，我们可以实现对细胞增殖的调控，进而筛选出作用于该靶点的药物。在与干细胞增殖相关的药物筛选过程中，我们可以测试候选药物对于Tango6基因的表达促进或者抑制情况，进而评价药物对于干细胞增殖的作用效果。以Tango6基因作为药物靶点，我们可以研发针对Tango6基因的激动剂、提升Tango6基因的转录水平的试剂等，进而获得用于提升Tango6基因的转录水平、或者提升Tango6蛋白的表达水平、或者提升Tango6蛋白的活性的药物，为更为简便地控制干细胞增殖创造条件。

附图说明

图1为实施例1的cq72突变体和野生型斑马鱼的CHT区域原位杂交图像。

图2为实施例1的cq72突变位置的遗传和物理图谱。

图3为实施例1的三种Tango6突变体斑马鱼品系的突变位点。

图4为实施例2的慢病毒包被示意图。

图5为实施例2的通过Western blot检测敲降以及过表达TANGO6的效率的实验结果。

图6为实施例2的通过宽场显微镜拍摄H1细胞密度。

图7为实施例2的细胞密度的统计图。

图8为实施例3的coro1a-tango6表达载体结构示意图。

图9为实施例3的初步筛选cryaa-cerulean结果显微图像。

图10为实施例3的转基因斑马鱼Tango6基因检测图像。

图11为实施例3的PH3免疫荧光染色图像。

图12为实施例3的Tg(coro1a:tango6)斑马鱼和野生型斑马鱼的原位杂交图像。

图13为实施例3的huc-tango6表达载体结构示意图。

图14为实施例3的Tg(huc:tango6)斑马鱼和野生型斑马鱼头部荧光图像(绿色荧光蛋白)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：Tango6突变体斑马鱼的获取

对野生型AB系斑马鱼通过ENU介导的正向遗传筛选，获得若干突变体，其中包括cq72突变体。在该突变体中，cmyb标记的造血干/祖细胞(HSPCs)数目从3.5dpf(受精后3天)开始显著减少，5dpf基本消失(图1)。随后，我们通过图位克隆的方法对突变基因定位，发现其定位在第18号染色体上。通过高分辨率作图我们最终将cq72突变位点缩短在第18号染色体两个SNP之间200Kb的区域，该区域有四个候选基因，最终通过测序证实突变基因为Tango6(图2),在其第6个外显子中发生了G转换为T的点突变(图3)，导致翻译提前终止。将Tango6基因的点突变的突变体称为Tango6^cq72突变体。

为了进一步证实Tango6^cq72突变体的表型，我们利用常规的CRISPR/Cas9技术构建了Tango6^Cas9-1(第4个外显子上缺失16个碱基)以及Tango6^Cas9-2(第12个外显子上缺失5个碱基)两个突变体斑马鱼品系(图3)，这两种突变类型均导致蛋白提前终止。通过分析我们发现Tango6^Cas9-1/2两个基因敲除突变体与Tango6^cq72表型均一致，说明Tango6基因的敲除会影响造血干/祖细胞的增殖功能，发明人考虑将Tango6基因作为促进细胞增殖的候选基因之一。虽然，现有技术中有较多的基因具有促进细胞增殖的作用，但是，大部分基因的缺失或者过表达会导致细胞进入无限增殖的状态(永生状态)，即癌变，这并不符合我们临床上对干细胞的要求，所以筛选出能够适当促进细胞增殖的相关基因非常关键。例如，cMYC、kRAS、P53、PTEN、KLF6和P16等基因，他们过表达都会促进细胞增殖，但是他们均为现有技术公认的原癌基因，过表达会造成细胞癌变，不适合于我们的临床需求。

针对本实施例附图的具体解释：图1中展示了cq72突变体不同时间点cmyb的表达情况，左侧为野生型，右侧cq72为突变型，蓝色箭头指示阳性信号。图2展示了cq72突变位置的遗传和物理图谱。图3为三种Tango6突变体斑马鱼品系的突变位点。cq72突变体的第6个外显子上发生了G转换为T的点突变，Cas9-1在第4个外显子上缺失了16个碱基，Cas9-2在第12个外显子上缺失了5个碱基，这三种突变形式均导致翻译提前终止。

实施例2：利用Tango6基因促进人胚胎干细胞增殖

Tango6基因的序列为SEQ ID NO.1(5’→3’)：

ATGGCGGCCCGACAGGCCGTGGGCAGCGGGGCTCAGGAGACATGCGGTCTGGATCGGATTTTGGAGGCATTGAAGCTGCTGCTGAGCCCGGGAGGCTCGGGCTCAAGTTCACTACAGGTCACAAAACATGATGTCTTGTTGGCTACTTTAAAATCTAACCTGTCTGCTTTGGAGGACAAGTTTCTGAAGGATCCTCAGTGGAAGAATCTGAAACTCCTAAGAGATGAAATTGCTGATAAGGCAGAATGGCCACAAAACTCTGTGGATGTCACTTGGAGTTTTACCTCTCAAACCTTGTTGTTGCTTTTGTGCTTGAAGGAAACCATGATCCGCCTTGCAGCTAATTTCAATCCAGGTAAACCCAACCCTAGGACTCCGGAAGTTGCTCCTGCCCTGAGCCCCGATGCACTTAGTATCTCACAACAGAAGACTGTCCAGTTCGTTTTGCAGTTTGTAGTTACCTTGGGTATCTGCCCCTATCTCATGCCTGGTGTTGGAGTCCCTTTGAGATATAGAACTGAATTTGGTGCCGTCGTTCAAGACGTGGTGTGTTTTGATGCTGCCCCCGATGCAACTCGAAGACTGTACACCAGCTGCAAGGCCCTTCTGAATGTTGCTCAGCACACATCTCTGGGGAGCTTGATCTTCTGCCACCACTTTGGGGATATCGCAGCAGGTCTGTGCCAACTGGGATTCTGCCCAACCAAAAGAAAACTGCTAACACCTGCAGAAGAGGTTCTAACTGAAGAGGAGAGAACCCTATCCAGGGGGGCCTTGAGAGACATGCTGGATCAAGTCTATCAGCCCTTAGCAGTCCGGGAACTGCTTATCCTCCAGGGAGGACCACCCCAGTCCTGCACAGATGTGAAGACACAGATGAGGTGTCGGGCCCCAGCTTGGCTTCGGCGTCTATGTGGACAGCTGCTCTCTGAAAGGTTAATGAGACCTAATGGTGTTCAGGCAGTAGTCCGGGGCATTTTGGAAGGAGCAGGTGCGGGAGCAGCTGGTGGAAGTGATGCTGAGGTGACGGCTGCTGACTGGAAGAAGTGTGACCTGATCGCAAAGATTTTGGCCTCTTGTCCCCAGCAGTCTCTTTCACCAGAGAATTACTACAGGGACATCTGCCCCCAGGTTCTGGATTTATTTCACTTTCAAGATAAATTGACAGCACGACAATTTCAGAGAGTTGCCACCACTACCTTTATAACTTTGTCAAGAGAACGCCCACATTTGGCAGCAAAGTATTTGCTCCAGCCAGTGTTAGCTCCTCTTCATCGATGTTTGAATACAGCAGAGCTTTCAGAGAGTGACATGGTACCAGGAACTATTTTGGTGACAGAAGAAGAACTTAGTAGATGCATTGAGGATGTGTTTAAGGTGTACGTGGTTGGGAATGAACCTTTAACAGTTTTGATGGATTCCCTGCTTCCAGTCCTGGGAGTGCTTTTTCTTCTCTACTGTTTTACTAAGCAGAGTGTGTCTCACATAAGGTCACTTTGCCAAGAAATCTTATTATGGATTCTGGGGAAGCTGGAAAGGAAGAAGGCAATTGCCAGCCTGAAAGGATTTGCAGGGTTGGACAAAGCTGTGCCCTCTCTCCATTCTCTGTGTCAGTTTAGAGTTGCCACTCAAGGTGGCATTATGATTACCATCAAAGAGGCCATTAGTGATGAAGATGAAGATGAAGCCCTGTACCAGAAGGTATCCTCTGAGCAGGGCCGGGTGGAGCATCTCGGGGACTTGCTGTCCCACTGCCAGGAATGCGGTTTGGCAGGAGACTTCTTCATCTTCTGTTTGAAAGAGTTGACTCATGTGGCCTCGGAAAATGAAACAGAGTTAAAAACTGAGCCCTTCTCCAGCAAGAGCCTCTTGGAATTAGAGCAACATCAGACTCTTCTTGTGGAAGGCCAAGAGCGGAAGCTGCTTGTCCTGCAGCTGATGGCTGTTCTGTGCGAGAGAATGTCTGAGCAGATATTCACAAACGTCACTCAGGTGGTGGACTTTGTAGCAGCAACATTGCAGAGAGCCTGTGCAAGCCTGGCCCATCAGGCAGAGAGCACCGTGGAATCACAGACGCTGAGCATGTCCATGGGGCTGGTGGCTGTCATGCTAGGAGGAGCTGTTCAGTTGAAGTCAAGTGATTTTGCTGTTCTGAAGCAGTTGTTGCCTCTGTTGGAGAAGGTATCCAACACATACCCTGATCCGGTCATCCAAGAACTCGCTGTTGATCTCCGCATCACCATCTCTACCCATGGAGCCTTTGCCACTGAGGCCGTCAGCATGGCTGCCCAAAGTACACTGAACAGAAAAGATCTGGAAGGGAAAATAGAAGAGCAGCAACAAACCAGTCATGAAAGACCCACTGATGTAGCTCATAGCCACCTTGAACAACAGCAGAGCCATGAGACAGCCCCCCAGACAGGCCTGCAGTCAAATGCTCCAATCATTCCTCAAGGAGTCAATGAGCCCAGCACTACTACAAGTCAGAAATCTGGAAGCGTAACCACAGAACAGCTCCAAGAGGTTCTTTTGTCAGCTTATGACCCTCAAATTCCAACACGGGCTGCTGCCCTGCGTACTCTTTCCCACTGGATAGAGCAGAGAGAAGCAAAAGCCCTTGAGATGCAAGAGAAGCTTCTCAAGATATTCTTGGAAAACTTGGAACATGAAGACACTTTTGTATATCTATCTGCAATTCAGGGGGTTGCCCTGCTGTCAGACGTCTATCCTGAGAAAATCTTGCCGGACTTGTTGGCTCAATATGACAGCAGCAAAGACAAGCACACACCAGAGACCAGAATGAAAGTCGGGGAAGTCCTTATGCGAATCGTCAGGGCATTAGGAGACATGGTCTCAAAGTACCGAGAACCTTTGATCCATACCTTCCTGAGGGGAGTGAGAGATCCTGATGGTGCTCACAGGGCCAGCAGCTTGGCCAACCTTGGGGAGCTGTGCCAGAGGCTGGACTTTCTGCTGGGCTCCGTGGTCCATGAGGTAACAGCTTGCCTGATTGCTGTGGCCAAAACAGATGGTGAAGTTCAAGTACGCAGAGCTGCCATACATGTGGTTGTGCTGCTGCTTCGGGGACTCAGCCAGAAAGCTACTGAGGTGCTGAGCGCCGTCCTCAAGGATCTCTACCACCTGCTGAAGCACGTAGTGTGTCTGGAGCCCGATGACGTGGCCAAGCTCCATGCCCAGTTGGCCCTAGAAGAGCTGGATGACATCATGAAAAACTTCCTGTTCCCTCCACAGAAGCTGGAGAAGAAGATCATGGTCCTGCCGTAG。

对人胚胎干细胞H1细胞系的Tango6基因进行敲除以及过表达操作，具体过程如下：

1.Tango6基因过表达的人胚胎干细胞的构建

(1)表达载体构建

通过DNA聚合酶链式反应扩增Tango6基因使用到的引物序列为：

F1-Tango6：5’-CCCTCGAGATGGCGGCCCGACAGGCCGT-3’，SEQ ID NO.2；

R1-Tango6：5’-CGGAATTCCTACGGCAGGACCATGATCTTCT-3’，SEQ ID NO.3。

扩增Tango6基因的PCR体系见表1，PCR程序见表2。

表1：Hieff DNA聚合酶PCR反应体系(50μL)

表2：Hieff DNA聚合酶PCR反应程序

通过现有技术常规的琼脂糖电泳以及切胶回收的手段，获得纯化富集后的Tango6基因扩增产物，并送第三方公司测序确认回收产物为目的序列。

通过酶切连接的方式，将Tango6基因扩增产物连接到空载体pLVX-puro上。使用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ分别酶切Tango6基因扩增产物和空载体。酶切体系(表3)为100μL，酶切温度和时间为37℃，过夜酶切。连接体系(表4)为20μL，连接温度和时间为常温4h。

表3：双酶切体系(100μL)

组份	体积
		10×Reaction Buffer(根据NEB推荐选择)	10μL
Enzyme 1(XhoⅠ，NEB)	1.5μL
		Enzyme 2(EcoRⅠ，NEB)	1.5μL
Template(Tango6基因扩增产物或者空载体)	4-6μg
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 100μL

表4：连接反应体系(promega)(20μL)

组分	体积
		2×Ligation Buffer	2μL
目的片段	3μL
		质粒载体	1μL
T<sub>4</sub> DNA连接酶	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	补齐至20μL

(2)病毒包装(慢病毒包被示意图参见图4)

利用293T细胞进行病毒包装。接种293T细胞至DMEM培养基中,细胞用10cm细胞培养皿培养，等细胞密度达到70-80％进行转染,转染前将培养基换为无血清DMEM。配制转染混合体系，如表5所示。将表5中的转染混合体系750μL滴加到293T细胞的培养板中。培养48以及72h后，收集上清获得病毒液。

表5：转染混合体系

(3)病毒感染

将人胚胎干细胞培养至密度为30％左右，在人胚胎干细胞中加入上一步获得的病毒液，通过现有技术的常规手段使用病毒液对人胚胎干细胞进行转染，转染72h后，获得过表达Tango6基因的人胚胎干细胞(H1细胞)。

2.Tango6基因敲除的人胚胎干细胞的构建

shRNA中的用于敲降TANGO6的小干扰RNA的DNA序列为：

5’-CCGAGAACCTTTGATCCAT-3’，SEQ ID NO.4。

委托北京擎科生物公司，将SEQ ID NO.4整合到空载pLKO.1-puro上，合成用于敲降的shRNA的质粒。

病毒包装以及感染干细胞的过程同前述过表达模型。

获得Tango6基因敲除以及Tango6基因过表达的人胚胎干细胞后(转染72h后)，通过western blot观察目的蛋白的表达情况，实验结果详见图5。在图5中，NC-shRNA代表转染对照shRNA的H1细胞(Tango6基因表达未被抑制)；TANGO6-shRNA代表转染有shRNA的H1细胞；PLVX-empty代表转染不含tango6表达序列的H1细胞；PLVX-tango6代表转染有Tango6基因的H1细胞。western blot实验结果说明Tango6基因敲除以及Tango6基因过表达均分别降低了Tango6蛋白表达量以及提升了Tango6蛋白表达量。转染后72h观察小孔中细胞密度情况，以及对细胞密度进行统计，实验结果参见图6(比例尺100μm)和图7。TANGO6蛋白(Tango6基因)作为一个全新的控制细胞增殖的因子，到目前为止还未见研究报道。通过包装敲降以及过表达Tango6基因的慢病毒，我们发现其可以调节人类胚胎干细胞(H1)的扩增水平，敲降TANGO6蛋白抑制了H1细胞的扩增，相应的，过表达TANGO6促进了H1细胞的扩增。目前，干细胞医疗成为研究热点，通过器官移植治疗各类干细胞缺陷导致的疾病，如白血病等。而在移植之前，如何获取足够数目的干细胞成为关注的重点。我们发现了基于Tango6基因过表达的全新的促进人类胚胎干细胞扩增的方法，具有极大的临床应用潜力。除了构建Tango6基因过表达的干细胞外，还可以研发针对Tango6基因的激动剂、提升Tango6基因的转录水平的试剂，从而促进干细胞扩增。Tango6基因可以作为药物作用靶点，用于调控干细胞增殖水平。在与干细胞增殖相关的药物筛选过程中，我们可以将Tango6基因作为筛选靶点，测试候选药物对于Tango6基因的表达促进或者抑制情况，进而评价药物对于干细胞增殖的作用效果。

实施例3：Tango6基因过表达促进细胞增殖的深入研究

在白细胞(coro1a启动子，白细胞的标志物)中特异性过表达tango6的转基因斑马鱼，具体构建过程可以详见发明人在先申请的专利(专利号：cn2022103751223；特异性胸腺淋巴细胞损伤以及再生模型及其构建方法)，现将过程描述如下：

将coro1a启动子和tango6基因序列使用现有技术的常规手段整合到空载体上，获得表达载体，载体结构示意图参见图8(coro1a启动子序列可参见发明人在先专利“2022103751223特异性胸腺淋巴细胞损伤以及再生模型及其构建方法”，SEQ ID NO.6，表达载体构建过程以及转基因斑马鱼制备过程也参见上述专利)。然后将表达载体(40ng/μL)和转座酶(100ng/μL，Tol2 transposase mRNA)按照1：1体积比例混合后注射入斑马鱼单细胞受精卵(AB系斑马鱼，注射量1nL)，从而通过转座酶的作用将质粒载体随机整合入斑马鱼基因组中。受精后3天，将有荧光表达的受精卵挑选出来(荧光图片参见图9)，于标准温度28.5℃下培养至性成熟(F0代；founder)。将F0代与野生型斑马鱼交配，获得荧光后代个体为F1代。继续将F1代培养至性成熟，与野生型斑马鱼交配，获得荧光F2代。自此，稳定遗传的斑马鱼Tg(coro1a:tango6)品系。观测斑马鱼Tg(coro1a:tango6)品系3dpf时，tango6基因的表达情况，发现其表达量在转基因品系中上调(图10)。通过PH3(磷酸化的组蛋白3，细胞增殖标记物)免疫荧光染色(图11)，发现过表达Tango6后促进了细胞增殖水平，使得造血干/祖细胞(cmyb标记)数目增加，并由此导致红细胞前体(gata1标记)，淋巴细胞前体(irf4a标记)，粒细胞(lyz标记)以及巨噬细胞(mfap4标记)等下游谱系细胞数目增加(图12)。

采用同样的方式构建斑马鱼Tg(huc:tango6)品系，其中huc基因启动子(SEQ IDNO.5)为神经元特异性启动子，构建的表达载体示意图详见图13。发现神经细胞中过表达Tango6后也会导致细胞数目增加，与血液细胞表型一致(图14)。由于表达载体中带有GFP标记，所以在斑马鱼的神经元中，可检测绿色荧光，可见Tg(huc:tango6)品系荧光信号更强，说明神经元的增殖速度加快。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，其特征在于，所述细胞为干细胞。

3.根据权利要求2所述的Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞或者造血干/祖细胞。

4.根据权利要求1所述的Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，其特征在于，所述细胞为神经元细胞或者血细胞。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的Tango6基因在促进细胞增殖中的应用，其特征在于，包括提高Tango6基因在细胞中的表达水平的步骤。

6.一种促进细胞增殖的方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：

S1：构建用于表达Tango6基因的表达载体；

S2：对表达载体进行慢病毒包被，获得病毒液；

S3：使用病毒液感染待扩增的细胞。

7.根据权利要求6所述的一种促进细胞增殖的方法，其特征在于：在S1中，先通过PCR扩增所述Tango6基因，获得扩增产物；再将扩增产物整合在空载体上，获得表达载体。

8.根据权利要求7所述的一种促进细胞增殖的方法，其特征在于：在S1中，PCR扩增的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PCR扩增的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

9.Tango6基因在筛选促进干细胞增殖的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的Tango6基因在筛选促进干细胞增殖的药物中的应用，其特征在于：所述药物用于提升Tango6基因的转录水平，或者提升Tango6蛋白的表达水平，或者提升Tango6蛋白的活性。

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