DE112020001306T5 - Verfahren und zusammensetzungen zur editierung von nukleotidsequenzen - Google Patents

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David R. Liu
Andrew Vito Anzalone
Max Walt Shen
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Massachusetts Institute of Technology
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Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

Die vorliegende Offenbarung stellt neue Prime-Editor-Leit-RNAs für Prime Editing, Konstrukte für Prime Editing und Verfahren zu deren Verwendung bereit. Darüber hinaus stellt die vorliegende Offenbarung Zusammensetzungen und Verfahren zum Durchführen von Prime Editing eines Ziel-DNA-Moleküls (z. B. eines Genoms) bereit, das den Einbau einer Nukleotidänderung und/oder gezielte Mutagenese (z. B. Insertion oder Deletion) ermöglicht. Die Nukleotidänderung kann eine Einzelnukleotidänderung (z. B. jede Transition oder jede Transversion), eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden oder eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden beinhalten. Insbesondere stellt die Offenbarung Fusionsproteine bereit, die nukleinsäureprogrammierbare DNA-Bindungsproteine (napDNAbp) und eine Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) umfassen, die durch eine Prime-Editor-RNA (PEgRNA) zu einer spezifischen DNA-Sequenz geleitet wird. Die Prime-Editor-Leit-RNA umfasst einen Verlängerungsarm, der eine DNA-Synthesematrizensequenz bereitstellt, die für einen Einzelstrang-DNA-Flap codiert, der homolog zu einer endogenen DNA-Sequenz ist, die aber die gewünschte eine oder mehrere Nukleotidänderungen enthält und die nach Synthese durch die Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) in das Ziel-DNA-Molekül eingebaut wird.

Description

  • STAATLICHE UNTERSTÜTZUNG
  • Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den Bewilligungsnummern U01AI142756, RM1HG009490, R01EB022376 und R35GM118062, vergeben von den National Institutes of Health, entwickelt. Der Staat hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
  • VERWANDTE ANWENDUNGEN UND AUFNAHME DURCH BEZUGNAHME
  • Diese provisorische US-Anmeldung bezieht sich auf die folgenden Anmeldungen und nimmt diese durch Bezugnahme mit auf, nämlich die provisorische US-Anmeldung Nr. 62/820,813 , eingereicht am 19. März 2019 (Anwaltsakte Nr. B1195.70074US00), provisorische US-Anmeldung Nr. 62/858,958 (Anwaltsakte Nr. B1195.70074US01), eingereicht am 7. Juni 2019, provisorische US-Anmeldung Nr. 62/889,996 (Anwaltsakte Nr. B1195.70074US02), eingereicht am 21. August 2019, provisorische US-Anmeldung Nr. 62/922,654 , eingereicht am 21. August 2019 (Anwaltsakte Nr. B1195.70083US00), provisorische US-Anmeldung Nr. 62/913,553 (Anwaltsakte Nr. B1195.70074US03), eingereicht am 10. Oktober 2019, provisorische US-Anmeldung Nr. 62/973,558 (Anwaltsakte Nr. B1195.70083US01), eingereicht am 10. Oktober 2019, provisorische US-Anmeldung Nr. 62/931,195 (Anwaltsakte Nr. B1195.70074US04), eingereicht am 5. November 2019, provisorische US-Anmeldung Nr. 62/944,231 (Anwaltsakte Nr. B1195.70074US05), eingereicht am 5. Dezember 2019, provisorische US-Anmeldung Nr. 62/974,537 (Anwaltsakte Nr. B1195.70083US02), eingereicht am 5. Dezember 2019, provisorische US-Anmeldung Nr. 62/991,069 (Anwaltsakte Nr. B1195.70074US06), eingereicht am 17. März 2020, und provisorische US-Anmeldung Nr. (Seriennummer zum Zeitpunkt dieser Einreichung nicht verfügbar) (Anwaltsakte Nr. B1195.70083US03), eingereicht am 17. März 2020.
  • AUFNAHME DES SEQUENZPROTOKOLLS DURCH BEZUGNAHME
  • Gemäß 37 CFR § 1.52(e) beinhaltet diese Beschreibung ein Sequenzprotokoll, das gleichzeitig hiermit auf einer CD (2 Kopien) eingereicht wird. Gemäß 37 CFR § 1.52(e)(5) nimmt der Anmelder ausdrücklich alle Informationen und Materialien auf der CD in die Datei mit der Bezeichnung „B119570083WOOO-SEQ.txt“, die am 19. März 2020 erstellt wurde und 371,109 MB groß ist, mit auf. Durch diese Aussage wird das Sequenzprotokoll zum Teil der vorliegenden Beschreibung. Die CD enthält keine anderen Dateien.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Pathogene Einzelnukleotidmutationen tragen zu etwa 67 % aller menschlichen Krankheiten bei, für die eine genetische Komponente vorliegt7. Leider bleiben die Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit diesen genetischen Erkrankungen trotz jahrzehntelanger Gentherapieforschung äußerst begrenzt8. Eine der einfachsten Lösungen für diese therapeutische Herausforderung ist vielleicht die direkte Korrektur von Einzelnukleotidmutationen im Genom der Patienten, was die Ursache der Krankheit angehen und wahrscheinlich einen dauerhaften Nutzen bringen würde. Obwohl eine solche Strategie zuvor undenkbar war, haben die jüngsten Verbesserungen der Genom-Editierungsfähigkeiten durch das Aufkommen des CRISRP-/Cas-Systems9 diesen therapeutischen Ansatz in greifbare Nähe gerückt. Durch einfaches Design einer Leit-RNA (gRNA)-Sequenz, die ~20 Nukleotide, die zur Ziel-DNA-Sequenz komplementär sind, kann durch CRISPR-assoziierte (Cas-) Nukleasen1,2spezifisch auf nahezu jede denkbare genomische Stelle zugegriffen werden. Bis heute wurden mehrere monomere bakterielle Cas-Nuklease-Systeme identifiziert und für Genom-Editierungsanwendungen angepasst10. Diese natürliche Vielfalt von Cas-Nukleasen bietet zusammen mit einer wachsenden Sammlung gentechnisch veränderter Varianten11-14 einen fruchtbaren Boden für die Entwicklung neuer Technologien zur Genom-Editierung.
  • Während die Gendisruption mit CRISPR mittlerweile eine ausgereifte Technik ist, bleibt die Präzisionseditierung einzelner Basenpaare im menschlichen Genom eine große Herausforderung3. Homology Directed Repair (HDR) wird seit Langem in menschlichen Zellen und anderen Organismen verwendet, um DNA-Sequenzen an Stellen von Doppelstrangbrüchen (DSBs) einzufügen, zu korrigieren oder auszutauschen, wobei Spender-DNA-Reparaturmatrizen verwendet werden, welche die gewünschten Editierungen codieren15. Allerdings hat traditionelle HDR in den meisten menschlichen Zelltypen eine sehr geringe Effizienz, insbesondere in sich nicht teilenden Zellen, und konkurrierende nicht homologe Endverbindung (NHEJ) führt überwiegend zu Insertion-Deletion(Indel)-Nebenprodukten16. Andere Probleme beziehen sich auf die Erzeugung von DSBs, die zu großen chromosomalen Umlagerungen und Deletionen an Zielloci führen17 oder die p53-Achse aktivieren können, was zu Wachstumsarrest und Apoptose führt18-19.
  • Es wurden verschiedene Ansätze untersucht, um die Nachteile von HDR anzugehen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Reparatur von einzelsträngigen DNA-Brüchen (Nicks) mit Oligonukleotid-Spendern die Indel-Bildung reduziert, doch die Ausbeute an gewünschten Reparaturprodukten ist nach wie vor gering20. Andere Strategien versuchen, die Reparatur in Richtung HDR statt NHEJ zu verlagern, indem niedermolekulare und biologische Reagenzien verwendet werden21-23. Die Wirksamkeit dieser Verfahren ist jedoch zelltypabhängig, und eine Störung des normalen Zellzustands könnte zu unerwünschten und unvorhersehbaren Wirkungen führen.
  • Kürzlich haben Liu et al. Baseneditierung als eine Technologie entwickelt, die Zielnukleotide editiert, ohne DSBs zu verursachen oder sich auf HDR zu verlassen4-6,24-27. Die direkte Modifikation von DNA-Basen durch Cas-fusionierte Desaminasen ermöglicht C•G zu T•A oder A•T zu G•C, Basenpaarumwandlungen in einem kurzen Zielfenster (~5 bis 7 Basen) mit hoher Effizienz. Infolgedessen wurden Basiseditoren schnell von der wissenschaftlichen Gemeinschaft übernommen. Mehrere Faktoren können jedoch ihre Allgemeingültigkeit für die präzise Genom-Editierung einschränken.
  • Daher würde die Entwicklung programmierbarer Editoren, die in der Lage sind, jede gewünschte einzelne oder mehrfache Nukleotidänderung einzuführen, die Nukleotid-Insertionen oder -Deletionen anbringen (z. B. mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oder mehr Basenpaar-Insertionen oder -Deletionen) könnten, und/oder welche die Nukleotidsequenz an einer Zielstelle mit hoher Spezifität und Effizienz verändern oder modifizieren könnten, den Anwendungsbereich und das therapeutische Potenzial von auf CRISPR basierenden Genom-Editierungstechnologien erheblich erweitern.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung offenbart neue Zusammensetzungen (z. B. neue PEgRNA und PE-Komplexe, die diese umfassen) und Verfahren zur Verwendung von Prime Editing (PE) zur Reparatur therapeutischer Ziele, z. B. der in der ClinVar-Datenbank identifizierten Ziele, unter Verwendung von PEgRNA, die unter Verwendung eines spezialisierten, in dieser Schrift beschriebenen Algorithmus entwickelt wurde. Somit offenbart die vorliegende Anmeldung in einem Aspekt einen Algorithmus zum Vorhersagen der Sequenzen für PEgRNA im großen Maßstab, die dazu verwendet werden können, therapeutische Ziele zu reparieren (z. B. diejenigen, die in der ClinVar-Datenbank enthalten sind). Außerdem offenbart die vorliegende Anmeldung vorhergesagte Sequenzen für therapeutische PEgRNAs, die unter Verwendung des offenbarten Algorithmus entwickelt wurden und entwickelt werden können und die mit Prime Editing verwendet werden können, um therapeutische Ziele zu reparieren.
  • Der in dieser Schrift offenbarte Algorithmus und die vorhergesagten PEgRNA-Sequenzen betreffen im Allgemeinen das Prime Editing. Somit liefert diese Offenbarung auch eine Beschreibung für die verschiedenen Komponenten und Aspekte des Prime Editing, einschließlich geeigneter napDNAbp (z. B. Cas9-Nickase) und einer Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) sowie anderer geeigneter Komponenten (z. B. Linker, NLS) und PE-Fusionsproteine, die mit der in dieser Schrift offenbarten therapeutischen PEgRNA verwendet werden können.
  • Wie in dieser Schrift offenbart, ist Prime Editing ein vielseitiges und präzises Genom-Editierungsverfahren, das neue genetische Informationen direkt in eine bestimmte DNA-Stelle schreibt, indem ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein („napDNAbp“) verwendet wird, das in Verbindung mit einer Polymerase (d. h. in Form eines Fusionsproteins oder anderweitig in trans mit dem napDNAbp bereitgestellt) arbeitet, wobei das Prime-Editing-System mit einer Prime Editing(PE)-Leit-RNA (Prime Editor guide RNA - „PEgRNA“) programmiert ist, die sowohl die Zielstelle als auch die Synthesematrizen der gewünschten Editierung in Form eines Ersatz-DNA-Strangs mittels einer Verlängerung (entweder DNA oder RNA), die auf einer Leit-RNA (z. B. am 5'- oder 3'-Ende oder an einem inneren Abschnitt einer Leit-RNA) konstruiert wurde, spezifiziert. Der Ersatzstrang, der die gewünschte Editierung enthält (z. B. eine einzelne Nukleobasensubstitution) hat dieselbe Sequenz wie der endogene Strang der zu editierenden Zielstelle (mit der Ausnahme, dass er die gewünschte Editierung beinhaltet). Durch DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsmaschinerie wird der endogene Strang der Zielstelle durch den neu synthetisierten Ersatzstrang ersetzt, der die gewünschte Editierung enthält. In einigen Fällen kann Prime Editing als eine „Suchen-und-Ersetzen“-Genom-Editierungstechnologie angesehen werden, da die Prime-Editoren, wie in dieser Schrift beschrieben, nicht nur die gewünschte zu editierende Zielstelle suchen und orten, sondern zugleich auch einen Ersatzstrang codieren, der eine gewünschte Editierung enthält, die anstelle des entsprechenden endogenen DNA-Strangs der Zielstelle angebracht wird. Die Prime-Editoren der vorliegenden Offenbarung betreffen teilweise die Entdeckung, dass der Mechanismus der Target-Primed Reverse Transcription (TPRT) oder des „Prime Editing“ zur Durchführung von präziser CRISPR/Cas-basierter Genom-Editierung mit hoher Effizienz und genetischer Flexibilität (z. B. wie in verschiedenen Ausführungsformen von 1A-1F dargestellt) genutzt oder angepasst werden kann. Die TPRT wird natürlicherweise von mobilen DNA-Elementen verwendet, wie Säuger-Nicht-LTR-Retrotransposons und bakteriellen Gruppe-II-Introns28,29. Die Erfinder haben in dieser Schrift Cas-Protein-Reverse-Transkriptase-Fusionen oder verwandte Systeme verwendet, um auf eine spezifische DNA-Sequenz mit einer Leit-RNA abzuzielen, einen Einzelstrang-Nick an der Zielstelle zu erzeugen und die Nick-DNA als Primer für die reverse Transkription einer konstruierten reversen Transkriptasematrize zu verwenden, die in die Leit-RNA integriert ist. Obwohl das Konzept mit Prime-Editoren beginnt, die reverse Transkriptasen als DNA-Polymerase-Komponente verwenden, sind die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren nicht auf reverse Transkriptasen beschränkt, sondern können die Verwendung von virtuell jeder DNA-Polymerase einschließen. Obwohl sich die Anmeldung durchweg auf Prime-Editoren mit „reversen Transkriptasen“ beziehen kann, wird in dieser Schrift dargelegt, dass reverse Transkriptasen nur eine Art von DNA-Polymerase sind, die mit Prime Editing funktionieren kann. Wo immer die Beschreibung „reverse Transkriptasen“ erwähnt, sollte deshalb der Durchschnittsfachmann erkennen, dass jede geeignete DNA-Polymerase anstelle der reversen Transkriptase verwendet werden kann. Somit können die Prime-Editoren in einem Aspekt Cas9 (oder ein äquivalentes napDNAbp) umfassen, das so programmiert ist, dass es auf eine DNA-Sequenz abzielt, indem es mit einer spezialisierten Leit-RNA (d. h. PEgRNA) assoziiert wird, die eine Spacer-Sequenz enthält, die sich an einen komplementären Protospacer in der Ziel-DNA anlagert. Die spezialisierte Leit-RNA enthält auch neue genetische Informationen in Form einer Verlängerung, die einen DNA-Ersatzstrang codiert, der eine gewünschte genetische Veränderung enthält, die dazu verwendet wird, einen entsprechenden endogenen DNA-Strang an der Zielstelle zu ersetzen. Um Informationen von der PEgRNA auf die Ziel-DNA zu übertragen, beinhaltet der Mechanismus des Prime Editing das Einschneiden („Nicking“) der Zielstelle in einen Strang der DNA, um eine 3'-Hydroxylgruppe freizulegen. Die freigelegte 3'-Hydroxylgruppe kann dann verwendet werden, um die DNA-Polymerisation der die Editierung codierenden Verlängerung auf PEgRNA direkt in die Zielstelle einzuleiten. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Verlängerung - welche die Matrize für die Polymerisation des die Editierung enthaltenden Ersatzstrangs bereitstellt - aus RNA oder DNA gebildet sein. Im Falle einer RNA-Verlängerung kann die Polymerase des Prime-Editors eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (wie etwa eine reverse Transkriptase) sein. Im Falle einer DNA-Verlängerung kann die Polymerase des Prime-Editors eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein.
  • Der neu synthetisierte Strang (d. h. der Ersatz-DNA-Strang, der die gewünschte Editierung enthält), der von den in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren gebildet wird, wäre homolog zur genomischen Zielsequenz (d. h. er hätte dieselbe Sequenz) mit Ausnahme des Einschlusses einer gewünschten Nukleotidänderung (z. B. eine einzelne Nukleotidänderung, eine Deletion oder eine Insertion oder eine Kombination davon). Der neu synthetisierte (oder Ersatz-) DNA-Strang kann auch als einzelsträngiger DNA-Flap bezeichnet werden, der mit dem komplementären homologen endogenen DNA-Strang um die Hybridisierung konkurrieren würde, wodurch der entsprechende endogene Strang verdrängt würde. In bestimmten Ausführungsformen kann das System mit der Verwendung eines fehleranfälligen reversen Transkriptase-Enzyms kombiniert werden (z. B. als Fusionsprotein mit der Cas9-Domäne bereitgestellt oder der Cas9-Domäne in trans bereitgestellt). Das fehleranfällige Reverse-Transkriptase-Enzym kann während der Synthese des einzelsträngigen DNA-Flaps Änderungen einführen. Somit kann in bestimmten Ausführungsformen eine fehleranfällige reverse Transkriptase dazu verwendet werden, Nukleotidänderungen in die Ziel-DNA einzuführen. Abhängig von der fehleranfälligen reversen Transkriptase, die mit dem System verwendet wird, können die Änderungen zufällig oder nichtzufällig sein.
  • Die Auflösung des hybridisierten Zwischenprodukts (umfassend den einzelsträngigen DNA-Flap, synthetisiert durch die reverse Transkriptase, hybridisiert an den endogenen DNA-Strang) kann Entfernen des resultierenden verdrängten Flaps der endogenen DNA (z. B. mit einer 5'-End-DNA-Flap-Endonuklease, FEN1), Ligation des synthetisierten einzelsträngigen DNA-Flaps an die Ziel-DNA und Assimilation der gewünschten Nukleotidänderung infolge der zellulären DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsprozesse beinhalten. Da die DNA-Synthese mit Matrize eine Einzelnukleotid-Präzision für die Modifikation jedes Nukleotids, einschließlich Insertionen und Deletionen, bietet, ist der Anwendungsbereich dieses Ansatzes sehr breit gefasst und könnte absehbar für unzählige Anwendungen in der Grundlagenforschung und Therapie verwendet werden.
  • Algorithmus und Verfahren zum Entwickeln therapeutischer PEgRNA
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung einen neuartigen Algorithmus zum Entwickeln von therapeutischer PEgRNA, insbesondere in großem Maßstab, im Gegensatz zu einer einmaligen PEgRNA-Designübung.
  • Dementsprechend betreffen einige Aspekte ein computergestütztes Verfahren zum Bestimmen einer Sequenz einer Prime-Editor-Leit-RNA (PEgRNA). Das Verfahren beinhaltet Verwenden von mindestens einem Computerhardwareprozessor, um auf Daten zuzugreifen, die ein Eingangsallel, ein Ausgangsallel und ein Fusionsprotein angeben, das ein Nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein und eine Polymerase (z. B. eine Reverse Transkriptase) umfasst. Das Verfahren beinhaltet Bestimmen der PEgRNA-Sequenz basierend auf dem Eingangsallel, dem Ausgangsallel und dem Fusionsprotein, wobei die PEgRNA-Sequenz so gestaltet ist, dass sie mit dem Fusionsprotein assoziiert ist, um das Eingangsallel in das Ausgangsallel zu ändern, einschließlich Bestimmen eines oder mehrerer der folgenden Merkmale für die PEgRNA-Sequenz: einen Spacer, der zu einer Zielnukleotidsequenz im Eingangsallel komplementär ist (d. h. der Spacer, wie in 27 definiert); ein gRNA-Rückgrat zur Interaktion mit dem Fusionsprotein (d. h. dem gRNA-Kern, wie in 27 definiert); und eine Verlängerung (d. h. den Verlängerungsarm, wie in 27 gezeigt), umfassend eines oder mehrere von: einer DNA-Synthesematrize (wie in 27 gezeigt), die eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst, um das Eingangsallel in das Ausgangsallel zu ändern; eine Primerbindungsstelle (d. h. die Primerbindungsstelle, wie in 27 gezeigt). Die PEgRNA kann auch ein 3'-Terminationssignal umfassen, das die Transkription von einem Promotor beendet. Darüber hinaus kann die PEgRNA einen ersten Modifikator am 5'-Ende des Verlängerungsarms und einen zweiten Modifikator am 3'-Ende des Verlängerungsarms beinhalten. Solche Sequenzen (in 27 als „e1“ und „e2“ gezeigt) können Stamm-Schleifen-Sequenzen beinhalten, welche die Stabilität der PEgRNA erhöhen können.
  • In einigen Beispielen beinhaltet das Verfahren Bestimmen des Spacers und der Verlängerung sowie Bestimmen, dass sich der Spacer am 5'-Ende der PEgRNA befindet und sich die Verlängerung an einem 3'-Ende der PEgRNA -Struktur befindet.
  • In einigen Beispielen beinhaltet das Verfahren Bestimmen des Spacers und der Verlängerung sowie Bestimmen, dass sich der Spacer am 5'-Ende der PEgRNA befindet und die Verlängerung 3' zum Spacer ist.
  • In einigen Beispielen umfasst das Zugreifen auf Daten, die das Eingangsallel und das Ausgangsallel angeben, Zugreifen auf eine Datenbank, die einen Satz von Eingangsallelen und assoziierten Ausgangsallelen umfasst. Das Zugreifen auf die Datenbank kann Zugreifen auf eine ClinVar-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) beinhalten, die eine Vielzahl von Einträgen umfassst, wobei jeder Eintrag ein Eingangsallel aus dem Satz von Eingangsallelen und ein Ausgangsallel aus dem Satz von Ausgangsallelen umfasst (z. B. Wildtyp oder Allele mit der gewünschten Aktivität). Das Bestimmen der PEgRNA-Sequenz kann Bestimmen einer oder mehrerer PEgRNA-Sequenzen für jedes Eingangsallel und das zugehörige Ausgangsallel in dem Satz beinhalten.
  • In einigen Beispielen beinhaltet das Zugreifen auf Daten, die das Fusionsprotein angeben, Bestimmen des Fusionsproteins aus einer Vielzahl von Fusionsproteinen.
  • In einigen Beispielen umfasst das Fusionsprotein ein Cas9-Protein. Das Fusionsprotein kann ein Cas9-NG-Protein, Cas9-NGG, saCas9-KKH oder ein SpCas9-Protein beinhalten.
  • In einigen Beispielen beinhaltet das Ändern des Eingangsallels in das Ausgangsallel eine einzelne Nukleotidänderung, eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden, eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden oder eine Kombination davon.
  • In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren Bestimmen des Spacers, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz von zwischen 1 und 40 Nukleotiden beinhaltet. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren Bestimmen des Spacers, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz von zwischen 5 und 35 Nukleotiden beinhaltet. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren Bestimmen des Spacers, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz von zwischen 10 bis 30 Nukleotiden beinhaltet. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren Bestimmen des Spacers, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz von zwischen 15 und 25 Nukleotiden beinhaltet. In einigen Beispielen beinhaltet das Verfahren Bestimmen des Spacers, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz von etwa 20 Nukleotiden beinhaltet. Das Verfahren kann Bestimmen des Spacers basierend auf einer Position der Änderung in einer entsprechenden Protospacer-Nukleotidsequenz beinhalten. Die Änderung kann in einem Editierungsfenster angebracht werden, das zwischen etwa Protospacer-Position -15 bis Protospacer-Position +39 liegt. Die Änderung kann in einem Editierungsfenster angebracht werden, das zwischen etwa Protospacer-Position -10 bis Protospacer-Position +34 liegt. Die Änderung kann in einem Editierungsfenster angebracht werden, das zwischen etwa Protospacer-Position -5 bis Protospacer-Position +29 liegt. Die Änderung kann in einem Editierungsfenster angebracht werden, das zwischen etwa Protospacer-Position -1 bis Protospacer-Position +27 liegt.
  • In einigen Beispielen kann das Verfahren Folgendes beinhalten: Bestimmen eines Satzes anfänglicher Protospacer-Kandidaten basierend auf dem Eingangsallel und dem Fusionsprotein, wobei jeder anfängliche Protospacer-Kandidat eine PAM des Fusionsproteins in dem Eingangsallel umfasst; Bestimmen eines oder mehrerer anfänglicher Protospacer-Kandidaten aus dem Satz von anfänglichen Protospacer-Kandidaten, die jeweils eine inkompatible Nickposition umfassen; Entfernen des bestimmten einen oder der mehreren anfänglichen Protospacer-Kandidaten aus dem Satz, um einen Satz verbleibender Protospacer-Kandidaten zu erzeugen; wobei das Bestimmen der PEgRNA-Struktur Bestimmen einer Vielzahl von PEgRNA-Strukturen umfasst, wobei jede der PEgRNA-Strukturen einen anderen Spacer umfasst, der basierend auf einem entsprechenden Protospacer aus dem Satz verbleibender Protospacer-Kandidaten bestimmt wird.
  • In einigen Beispielen beinhaltet das Verfahren Bestimmen der Verlängerung und der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz), wobei die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) etwa 1 Nukleotid bis 40 Nukleotide umfasst. In einigen Beispielen beinhaltet das Verfahren Bestimmen der Verlängerung und der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz), wobei die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) etwa 3 Nukleotide bis 38 Nukleotide umfasst. In einigen Beispielen beinhaltet das Verfahren Bestimmen der Verlängerung und der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz), wobei die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) etwa 5 Nukleotide bis 36 Nukleotide umfasst. In einigen Beispielen beinhaltet das Verfahren Bestimmen der Verlängerung und der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz), wobei die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) etwa 7 Nukleotide bis 34 Nukleotide umfasst.
  • In einigen Beispielen umfasst die Bestimmung der PEgRNA Bestimmen des Spacers basierend auf dem Eingangsallel und/oder des Fusionsproteins und Bestimmen der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) basierend auf dem Spacer.
  • In einigen Beispielen codiert die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) einen einzelsträngigen DNA-Flap, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist wobei der einzelsträngige DNA-Flap die gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Der einzelsträngige DNA-Flap kann mit der endogenen DNA-Sequenz neben der Nickstelle hybridisieren, wodurch die gewünschte Nukleotidänderung angebracht wird. Der einzelsträngige DNA-Flap kann die endogene DNA-Sequenz neben der Nickstelle verdrängen. Die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap kann zur Anbringung der gewünschten Nukleotidänderung führen, wodurch ein gewünschtes Produkt gebildet wird.
  • In einigen Beispielen ist das Fusionsprotein, wenn es mit der PEgRNA komplexiert ist, in der Lage, mit einer Ziel-DNA-Sequenz zu binden. Die Ziel-DNA-Sequenz kann einen Zielstrang, an dem die Änderung auftritt, und einen komplementären Nicht-Zielstrang beinhalten.
  • In einigen Beispielen umfasst das Eingangsallel eine pathogene DNA-Mutation und das Ausgangsallel umfasst eine korrigierte DNA-Sequenz.
  • Einige Ausführungsformen betreffen ein System, das mindestens einen Prozessor und mindestens ein computerlesbares Speichermedium mit darauf codierten Anweisungen beinhaltet, die bei Ausführung den mindestens einen Prozessor dazu veranlassen, die computergestützten Verfahren zum Bestimmen der PEgRNA -Struktur durchzuführen.
  • Einige Ausführungsformen betreffen mindestens ein computerlesbares Speichermedium mit darauf codierten Anweisungen, die bei Ausführung den mindestens einen Prozessor dazu veranlassen, die computergestützten Verfahren zum Bestimmen der PEgRNA-Struktur durchzuführen.
    Einige Ausführungsformen betreffen ein Verfahren zum Base Editing unter Verwendung der PEgRNA, die gemäß den computergestützten Verfahren zur Bestimmung der PEgRNA bestimmt wurde.
  • Therapeutische PEgRNA
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung therapeutische PEgRNA bereit, die unter Verwendung des in dieser Schrift offenbarten Algorithmus entworfen wurde, wie durch 27 und 28 dargestellt.
  • Zum Beispiel ist die PEgRNA, die in der vorliegenden Offenbarung verwendet werden kann, in 27 veranschaulicht. Diese Figur stellt die Struktur einer Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich eine Primerbindungsstelle (A), eine Editiermatrize (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht abgebildet). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein. Die in 27 gezeigte PEgRNA kann durch den in dieser Schrift offenbarten Algorithmus entworfen werden.
  • In einem weiteren Beispiel stellt 28 die Struktur einer weiteren Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich eine Primerbindungsstelle (A), eine Editiermatrize (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal an dem 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht dargestellt). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein. Die in 27 gezeigte PEgRNA kann durch den in dieser Schrift offenbarten Algorithmus entworfen werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen stellt die Offenbarung therapeutische PEgRNA der SEQ ID NOs: 1-135514 und 813085-880462 bereit, die unter Verwendung des in dieser Schrift offenbarten Algorithmus gegen ClinVar-Datenbankeinträge entworfen wurde.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen sind beispielhafte PEgRNA, die gegen die ClinVar-Datenbank unter Verwendung des in dieser Schrift offenbarten Algorithmus entworfen wurde, in dem Sequenzprotokoll beinhaltet, die einen Teil dieser Beschreibung bildet. Das Sequenzprotokoll beinhaltet vollständige PEgRNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 1-135514 und 813085-880462. Jede dieser vollständigen PEgRNA besteht jeweils aus einem Spacer (SEQ ID NOs: 135515-271028 und 880463-947840) und einem Verlängerungsarm (SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218). Außerdem umfasst jede PEgRNA einen gRNA-Kern, beispielsweise wie durch SEQ ID NOs: 1361579-1361580 definiert. Die Verlängerungsarme der SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218 bestehen weiterhin jeweils aus einer Primerbindungsstelle (SEQ ID NOs: 406543-542056 und 1015219-1082596), einer Editiermatrize (SEQ ID NOs: 542057-677570 und 1082597-1149974) und einem Homologiearm (SEQ ID NOs: 677571-813084 und 1149975-1217352). Die PEgRNA kann optional eine 5'-Endmodifikatorregion und/oder eine 3'-Endmodifiziererregion umfassen. Die PEgRNA kann auch ein Reverse-Transkriptions-Terminationssignal (z. B. SEQ ID NOs: 1361560-1361566) am 3'-Ende der PEgRNA umfassen. Die Anwendung umfasst den Entwurf und die Verwendung all dieser Sequenzen.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die Prime-Editor-Leit-RNA (a) eine Leit-RNA und (b) eine RNA-Verlängerung am 5'- oder 3'-Ende der Leit-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA, wofür Beispiele in 3A-C abgebildet sind. Die RNA-Verlängerung kann (i) eine DNA-Synthesematrize, die eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst, (ii) eine Bindungsstelle für einen reversen Transkriptionsprimer und (iii) optional eine Linkersequenz umfassen. In verschiedenen Beispielen codiert die DNA-Synthesematrize einen einzelsträngigen DNA-Flap, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben der Nickstelle ist, wobei der einzelsträngige DNA-Flap die gewünschte Nukleotidänderung umfasst.
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist der RNA-Verlängerungsarm mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide oder mindestens 25 Nukleotide lang.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Prime-Editor-Leit-RNA die Nukleotidsequenz aus SEQ ID NOs: 1361548-1361581 oder eine Nukleotidsequenz mit mindestens 85 % oder mindestens 90 % oder mindestens 95 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361548-1361581.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Prime-Editor-Leit-RNA (PEgRNA) eine Variante einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NOs: 1361548-1361581, die mindestens eine Mutation im Vergleich zur Nukleotidsequenz der SEQ ID NOs: 1361548-1361581 umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst die Variante mehr als 1 (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 oder mehr) Mutation(en) im Vergleich zur Nukleotidsequenz von SEQ ID NOs: 1361548-1361581.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung eine Prime-Editor-Leit-RNA bereit, die eine Leit-RNA und mindestens eine RNA-Verlängerung (d. h. einen Verlängerungsarm gemäß 27) umfasst. Die RNA-Verlängerung befindet sich am 3'-Ende der Leit-RNA. In anderen Ausführungsformen ist die RNA-Verlängerung am 5'-Ende der Leit-RNA positioniert. In noch anderen Ausführungsformen ist die RNA-Verlängerung an einer intramolekularen Position innerhalb der Leit-RNA positioniert, wobei die intramolekulare Positionierung des verlängerten Abschnitts die Funktion des Protospacers vorzugsweise nicht stört.
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist die Prime-Editor-Leit-RNA (PEgRNA) in der Lage, an ein napDNAbp zu binden und das napDNAbp an eine Ziel-DNA-Sequenz zu lenken. Die Ziel-DNA-Sequenz kann einen Zielstrang und einen komplementären Nicht-Zielstrang umfassen, wobei die Leit-RNA mit dem Zielstrang hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der Prime-Editor-Leit-RNA umfasst die mindestens eine RNA-Verlängerung eine DNA-Synthesematrize. In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst die RNA-Verlängerung ferner eine Primerbindungsstelle für die reverse Transkription. In noch anderen Ausführungsformen umfasst die RNA-Verlängerung einen Linker oder Spacer, der die RNA-Verlängerung mit der Leit-RNA verbindet.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die RNA-Verlängerung mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens mindestens 100 Nukleotide, mindestens 150 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang sein.
  • In anderen Ausführungsformen ist die DNA-Synthesematrize (d. h. die Editiermatrize gemäß 27) mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In noch anderen Ausführungsformen ist die Sequenz der reversen Transkriptions-Primerbindungsstelle (d. h. der Primerbindungsstelle gemäß 27) mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7' beträgt Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In anderen Ausführungsformen ist der optionale Linker oder Spacer mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • Die in dieser Schrift offenbarte entworfene PEgRNA kann mit einem Prime-Editor-Fusionsprotein komplexiert werden.
  • In einem Aspekt stellt die Beschreibung ein Primer-Editor-Fusionsprotein bereit, das ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und eine reverse Transkriptase umfasst. In verschiedenen Ausführungsformen ist das Fusionsprotein der Lage, Genom-Editierung durch zielgeprimte reverse Transkription in Gegenwart einer Prime-Editor-Leit-RNA (PEgRNA) durchzuführen.
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cas9, CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2C3 und Argonaute und weist optional Nickase-Aktivität auf.
  • In anderen Ausführungsformen ist das Fusionsprotein, wenn es mit einer Prime-Editor-Leit-RNA komplexiert ist, wie in dieser Schrift beschrieben, in der Lage, an eine Ziel-DNA-Sequenz (z. B. genomische DNA) zu binden.
  • In noch anderen Ausführungsformen umfasst die Ziel-DNA-Sequenz einen Zielstrang und einen komplementären Nicht-Zielstrang.
  • In anderen Ausführungsformen bildet die Bindung des Fusionsproteins, das an die Prime-Editor-Leit-RNA komplexiert ist, eine R-Schleife. Die R-Schleife kann (i) ein RNA-DNA-Hybrid, das die Prime-Editor-Leit-RNA und den Zielstrang umfasst, und (ii) den komplementären Nicht-Zielstrang umfassen.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird der komplementäre Nicht-Zielstrang gespalten, um eine Reverse-Transkriptase-Priming-Sequenz mit einem freien 3'-Ende zu bilden.
  • In noch anderen Ausführungsformen hybridisiert der einzelsträngige DNA-Flap mit der endogenen DNA-Sequenz neben der Nickstelle, wodurch die gewünschte Nukleotidänderung angebracht wird. In noch anderen Ausführungsformen verdrängt der einzelsträngige DNA-Flap die endogene DNA-Sequenz neben der Nickstelle, die ein freies 5'-Ende hat. In einigen Ausführungsformen wird die verdrängte endogene DNA mit dem 5'-Ende von der Zelle ausgeschnitten.
  • In verschiedenen Ausführungsformen führt die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap zur Anbringung der gewünschten Nukleotidänderung, wodurch ein gewünschtes Produkt gebildet wird.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in einem Editierfenster angebracht, das zwischen etwa -4 bis + 10 der PAM-Sequenz liegt.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in einem Editierfenster angebracht, das zwischen etwa -5 bis +5 Nukleotide der Nickstelle oder zwischen etwa -10 bis + 10 der Nickstelle oder zwischen etwa -20 bis +20 der Nickstelle oder zwischen etwa -30 bis +30 der Nickstelle oder zwischen etwa -40 bis + 40 der Nickstelle oder zwischen etwa -50 bis +50 der Nickstelle oder zwischen etwa -60 bis +60 der Nickstelle oder zwischen etwa -70 bis +70 der Nickstelle oder zwischen etwa -80 bis +80 der Nickstelle oder zwischen etwa -90 bis +90 der Nickstelle oder zwischen etwa -100 bis + 100 der Nickstelle oder zwischen etwa -200 bis +200 der Nickstelle liegt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 1361421. In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % identisch mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361421-1361484 und 1361593-1361596 ist.
  • In anderen Ausführungsformen kann die reverse Transkriptase der offenbarten Fusionsproteine und/oder Zusammensetzungen eine beliebige der Aminosäuresequenzen aus SEQ ID NOs: 1361485-1361514 und 1361597-1361598 umfassen. In noch anderen Ausführungsformen kann die reverse Transkriptase eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu mindestens 80 %, 85%, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % identisch mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361485-1361514 und 1361597-1361598 ist. Diese Sequenzen können natürlich vorkommende Reverse-Transkriptase-Sequenzen sein, z. B. von einem Retrovirus oder einem Retrotransposon, oder die Sequenzen können nicht natürlich vorkommend oder manipuliert sein.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift offenbarten Fusionsproteine verschiedene strukturelle Konfigurationen umfassen. Beispielsweise können die Fusionsproteine die Struktur NH2-[napDNAbp]-[reverse transcriptase]-COOH oder NH2-[reverse transcriptase]-[napDNAbp]-COOH umfassen, wobei jede Instanz von "]-[" das Vorhandensein einer optionalen Linkersequenz anzeigt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die Linkersequenz eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NOs: 1361520-1361530, 1361585 und 1361603 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 % oder 90 % oder 95 % oder 99 % identisch mit einer der Linker-Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs: 1361520-1361530, 1361585 und 1361603 ist.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die gewünschte Nukleotidänderung, die in eine Ziel-DNA eingebaut ist, eine Einzelnukleotidänderung (z. B. eine Transition oder Transversion), eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden, eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden oder eine Kombination davon sein.
  • In bestimmten Fällen ist die Insertion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In anderen Fällen ist die Deletion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der Prime-Editor-Leit-RNAs kann die DNA-Synthesematrize (d. h. die Editiermatrize gemäß 27) einen einzelsträngigen DNA-Flap codieren, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist, wobei die Einzelstrang-DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Der einzelsträngige DNA-Flap kann eine endogene einzelsträngige DNA an der Nickstelle verdrängen. Die verdrängte endogene Einzelstrang-DNA an der Nickstelle kann ein 5'-Ende aufweisen und einen endogenen Flap bilden, der von der Zelle ausgeschnitten werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Ausschneidung des endogenen 5'-Ende-Flaps dazu beitragen, die Produktbildung voranzutreiben, da das Entfernen des endogenen 5'-Ende-Flaps die Hybridisierung des einzelsträngigen 3'-DNA-Flaps an den entsprechenden komplementären DNA-Strang und den Einbau oder die Assimilation der gewünschten Nukleotidänderung, die durch den einzelsträngigen 3'-DNA-Flap in die Ziel-DNA ausgeführt wird, fördert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der Prime-Editor-Leit-RNAs führt die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap zur Anbringung der gewünschten Nukleotidänderung, wodurch ein gewünschtes Produkt gebildet wird.
  • In noch einem anderen Aspekt der Erfindung stellt die Beschreibung Komplexe bereit, die ein dieser Schrift beschriebenes Fusionsprotein und jede vorstehend beschriebene Prime-Editor-Leit-RNA (PEgRNA) umfassen.
  • In noch anderen Aspekten der Erfindung stellt die Beschreibung einen Komplex bereit, der ein napDNAbp (z. B. Cas9) und eine Prime-Editor-Leit-RNA umfasst. Das napDNAbp kann eine Cas9-Nickase (z. B. spCas9) sein oder kann eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1361421 oder eine Aminosäuresequenz sein, die zu mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % identisch mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361421-1361484 und 1361593-1361596 ist.
  • In verschiedenen Ausführungsformen, die einen Komplex involvieren, ist die Prime-Editor-Leit-RNA in der Lage, das napDNAbp zu einer Ziel-DNA-Sequenz zu leiten. In verschiedenen Ausführungsformen kann eine reverse Transkriptase in trans bereitgestellt werden, d. h. bereitgestellt von einer anderen Quelle als der Komplex selbst. Beispielsweise könnte eine reverse Transkriptase derselben Zelle mit dem Komplex bereitgestellt werden, indem ein separater Vektor eingeführt wird, der separat für die reverse Transkriptase codiert.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die Beschreibung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit (z. B. in der Schrift beschriebene Fusionsproteine, PEgRNA aus SEQ ID NOs: 1-135,514). In einigen Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen einen oder mehrere von einem napDNAbp, einem Fusionsprotein, einer reversen Transkriptase und einer Prime-Editor-Leit-RNA. In einigen Ausführungsformen ist das in dieser Schrift beschriebene Fusionsprotein ein pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoff. In anderen Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen jede in dieser Schrift beschriebene Extend Guide RNA und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff. In noch anderen Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen jede in dieser Schrift beschriebene Extend Guide RNA in Kombination mit einem beliebigen in dieser Schrift beschriebenen Fusionsprotein und einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff. In noch weiteren Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine beliebige Polynukleotidsequenz, die einen oder mehrere von einem napDNAbp, einem Fusionsprotein, einer reversen Transkriptase und einer Prime-Editor-Leit-RNA codiert. In noch anderen Ausführungsformen können die verschiedenen in dieser Schrift offenbarten Komponenten in eine oder mehrere pharmazeutische Zusammensetzungen getrennt werden. Zum Beispiel kann eine erste pharmazeutische Zusammensetzung ein Fusionsprotein oder ein napDNAbp umfassen, eine zweite pharmazeutische Zusammensetzung kann eine reverse Transkriptase umfassen und eine dritte pharmazeutische Zusammensetzung kann eine Prime-Editor-Leit-RNA umfassen.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Kits bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Kit ein oder mehrere Polynukleotide, die eine oder mehrere Komponenten codieren, einschließlich eines Fusionsproteins, eines napDNAbp, einer reversen Transkriptase und einer Prime-Editor-Leit-RNA (z. B. eine der SEQ ID NOs: 1-135514 oder 813085-880462). Die Kits können auch Vektoren, Zellen und isolierte Präparate von Polypeptiden umfassen, einschließlich jedes in dieser Schrift offenbarten Fusionsproteins, napDNAbp oder reverser Transkriptase.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Verwendung der offenbarten PEgRNA-Materialzusammensetzungen bereit.
  • In einer Ausführungsform betreffen die Verfahren ein Verfahren zum Anbringen einer gewünschten Nukleotidänderung in einer doppelsträngigen DNA unter Verwendung der in dieser Schrift offenbarten PEgRNA. Das Verfahren umfasst zuerst Kontaktieren der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Komplex, der ein Fusionsprotein und eine Prime-Editor-Leit-RNA umfasst, wie in dieser Schrift beschrieben, wobei das Fusionsprotein ein napDNAbp und eine reverse Transkriptase umfasst, und wobei die Prime-Editor-Leit-RNA eine DNA-Synthesematrize umfasst, welche die gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Das napDNAbp nickt die doppelsträngige DNA-Sequenz auf dem Nicht-Zielstrang, wodurch eine freie einzelsträngige DNA mit einem 3'-Ende erzeugt wird. Nach dem Nicking hybridisiert das 3'-Ende der freien Einzelstrang-DNA an die DNA-Synthesematrize, wodurch die Reverse-Transkriptase-Domäne geprimt wird. Reverse Transkriptase erleichtert dann die DNA-Polymerisation vom 3'-Ende, wodurch ein einzelsträngiger DNA-Flap erzeugt wird, der die gewünschte Nukleotidänderung enthält. Der einzelsträngige DNA-Flap ersetzt dann den endogenen DNA-Strang neben der Schnittstelle, wodurch die gewünschte Nukleotidänderung in der doppelsträngigen DNA-Sequenz angebracht wird.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Einführen einer oder mehrerer Änderungen in der Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls an einem Ziellocus bereit, umfassend das Kontaktieren des DNA-Moleküls mit einem nukleinsäureprogrammierbaren DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und einer Leit-RNA, die das napDNAbp an den Ziellocus lenkt, wobei die Leit-RNA eine Reverse-Transkriptase-(RT)-Matrizensequenz umfasst, die mindestens eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Das napDNAbp freigelegt ein 3'-Ende in einem DNA-Strang an dem Ziellocus, der an die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) hybridisiert, um die reverse Transkription zu primen. Als Nächstes wird ein einzelsträngiger DNA-Flap, der die mindestens eine gewünschte Nukleotidänderung basierend auf der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) umfasst, durch reverse Transkriptase synthetisiert oder polymerisiert. Schließlich wird die mindestens eine gewünschte Nukleotidänderung in die entsprechende endogene DNA eingebaut, wodurch eine oder mehrere Änderungen in der Nukleotidsequenz des DNA-Moleküls an dem Ziellocus eingeführt werden.
  • In noch anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Einführen einer oder mehrerer Änderungen in der Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls an einem Ziellocus durch zielgeprimte reverse Transkription bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren des DNA-Moleküls an dem Ziellocus mit einem (i) Fusionsprotein, das ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und eine reverse Transkriptase umfasst, und (ii) einer Leit-RNA, die eine RT-Matrize umfasst, die eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst (z. B. eine von SEQ ID NOs: 1-135514 oder 813085-880462); wobei der Kontakt die zielgeprimte reverse Transkription der RT-Matrize erleichtert, um eine einzelsträngige DNA zu erzeugen, die die gewünschte Nukleotidänderung umfasst und die gewünschte Nukleotidänderung in das DNA-Molekül an dem Ziellocus durch einen DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsprozess einbaut.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Ersetzens des endogenen DNA-Strangs Folgendes: (i) Hybridisieren des einzelsträngigen DNA-Flaps an den endogenen DNA-Strang neben der Schnittstelle, um eine Sequenzfehlpaarung zu erzeugen; (ii) Ausschneiden des endogenen DNA-Strangs; und (iii) Reparieren der Fehlpaarung, um das gewünschte Produkt zu bilden, das die gewünschte Nukleotidänderung in beiden DNA-Strängen umfasst.
  • Die in dieser Schrift offenbarten Verfahren können Fusionsproteine umfassen, die einen napDNAbp aufweisen, der ein Nuklease-totes Cas9 (dCas9), eine Cas9-Nickase (nCas9) oder ein Nuklease-aktives Cas9 ist. In anderen Ausführungsformen werden ein napDNAbp und eine reverse Transkriptase nicht als einzelnes Fusionsprotein codiert, sondern können vielmehr in separaten Konstrukten bereitgestellt werden. Somit kann in einigen Ausführungsformen die reverse Transkriptase in trans relativ zum napDNAbp bereitgestellt werden (anstatt über ein Fusionsprotein).
  • In verschiedenen Ausführungsformen, die Verfahren beinhalten, kann das napDNAbp eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 1361421 (Cas9) umfassen. Das napDNAbp kann auch eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % identisch mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361421 ist.
  • In verschiedenen Ausführungsformen, die Verfahren beinhalten, kann die reverse Transkriptase eine beliebige der Aminosäuresequenzen aus SEQ ID NOs: 1361485- 1361514 und 1361597-1361598 umfassen. Die reverse Transkriptase kann auch eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu mindestens 80 %, 85%, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % identisch mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361485-1361514 und 1361597-1361598 ist.
  • Die Verfahren können die Verwendung einer verlängerten RNA mit einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218 oder einer Nukleotidsequenz mit mindestens 80 % oder mindestens 85 % oder mindestens 90 % oder mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu umfassen.
  • Die Verfahren können die Verwendung von Prime-Editor-Leit-RNAs umfassen, die eine RNA-Verlängerung am 3'-Ende umfassen, wobei die RNA-Verlängerung die DNA-Synthesematrize umfasst, zum Beispiel weist die in 3B gezeigte PEgRNA (mit den folgenden Komponenten wie beschrieben von 5' bis 3': Spacer; gRNA-Kern; Reverse-Transkriptions-Matrize; Primerbindungsstelle) einen Verlängerungsarm auf, der von 5' bis 3' eine Reverse-Transkriptions-Matrize und eine Primerbindungsstelle umfasst.
  • Die Verfahren können die Verwendung von Prime-Editor-Leit-RNAs umfassen, die eine RNA-Verlängerung am 5'-Ende umfassen, wobei die RNA-Verlängerung die DNA-Synthesematrize umfasst, zum Beispiel weist die in 3A gezeigte PEgRNA (mit den folgenden Komponenten wie beschrieben von 5' bis 3': Spacer; gRNA-Kern; Reverse-Transkriptions-Matrize; Primerbindungsstelle) einen Verlängerungsarm auf, der von 5' bis 3' eine Reverse-Transkriptions-Matrize, eine Primerbindungsstelle und einen Linker mit einer Länge von 5 bis 20 Nukleotiden. umfasst.
  • Die Verfahren können die Verwendung von Prime-Editor-Leit-RNAs umfassen, die eine RNA-Verlängerung an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA umfassen, wobei die RNA-Verlängerung die DNA-Synthesematrize umfasst.
  • Die Verfahren können die Verwendung von Prime-Editor-Leit-RNAs mit einer oder mehreren RNA-Verlängerungen umfassen, die mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang sind.
  • Es versteht sich, dass die vorstehenden Konzepte und die nachstehend erörterten zusätzlichen Konzepte in jeder geeigneten Kombination angeordnet werden können, da die vorliegende Offenbarung diesbezüglich nicht beschränkt ist. Ferner werden andere Vorteile und neuartige Merkmale der vorliegenden Offenbarung aus der folgenden detaillierten Beschreibung verschiedener nicht einschränkender Ausführungsformen bei Betrachtung in Verbindung mit den begleitenden Figuren ersichtlich.
  • Figurenliste
  • Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sind beinhaltet, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Offenbarung weiter zu demonstrieren, die durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung der in dieser Schrift präsentierten spezifischen Ausführungsformen besser verstanden werden können.
    • 1A.1 stellt ein Diagramm eines beispielhaften Prozesses zum Einführen einer einzelnen Nukleotidänderung, Insertion und/oder Deletion in ein DNA-Molekül (z. B. ein Genom) unter Verwendung eines Fusionsproteins, das eine reverse Transkriptase umfasst, die an ein napDNAbp- (z. B. Cas9-) Protein im Komplex mit einer Prime-Editor-Leit-RNA fusioniert ist, bereit. In dieser Ausführungsform ist die Leit-RNA am 3'-Ende verlängert, um eine DNA-Synthesematrize zu beinhalten. Das Diagramm zeigt, wie eine an eine Cas9-Nickase fusionierte Reverse Transkriptase (RT) in einem Komplex mit einer Leit-RNA (gRNA) die DNA-Zielstelle bindet und den PAM-haltigen DNA-Strang neben dem Zielnukleotid schneidet. Die RT-Matrize verwendet die genickte DNA als Primer für die DNA-Synthese aus der gRNA, die als Matrize für die Synthese eines neuen DNA-Strangs verwendet wird, der die gewünschte Editierung codiert. Der gezeigte Editierprozess kann als Target-Primed Reverse Transcription Editing (Prime Editing) bezeichnet werden. 1A.2 stellt die gleiche Darstellung wie in 1A.1 bereit, mit der Ausnahme, dass der Prime-Editor-Komplex allgemeiner dargestellt wird als [napDNAbp]-[P]:PEgRNAPEgRNA or [P]-[napDNAbp]:PEgRNAPEgRNA, wobei „P“ auf eine beliebige Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) verweist, „napDNAbp“ auf ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein (z. B. SpCas9) verweist und „PEgRNAPEgRNA“ auf eine Prime Editing Guide RNA verweist und "]-[" auf einen optionalen Linker verweist. Wie an anderer Stelle beschrieben, z. B. 3A- 3G, umfasst die PEgRNAPEgRNA einen 5'-Verlängerungsarm, der eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrize umfasst. Obwohl nicht gezeigt, wird erwogen, dass der Verlängerungsarm der PEgRNAPEgRNA (d. h. der eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrize umfasst) DNA oder RNA sein kann. Die in dieser Konfiguration in Betracht gezogene spezielle Polymerase hängt von der Natur der DNA-Synthesematrize ab. Wenn beispielsweise die DNA-Synthesematrize RNA ist, dann ist der Polymerase-Fall eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase). Wenn die DNA-Synthesematrize DNA ist, kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann die PEgRNA konstruiert oder synthetisiert werden, um eine DNA-basierte DNA-Synthesematrize einzubauen.
    • 1B.1 stellt eine schematische Darstellung eines beispielhaften Prozesses zum Einführen einer einzelnen Nukleotidänderung, Insertion und/oder Deletion in ein DNA-Molekül (z. B. ein Genom) unter Verwendung eines Fusionsproteins, das eine reverse Transkriptase umfasst, die an ein napDNAbp (z. B. Cas9) im Komplex mit einer Prime-Editor-Leit-RNA fusioniert ist, bereit. In dieser Ausführungsform ist die Leit-RNA am 5'-Ende verlängert, um eine DNA-Synthesematrize zu beinhalten. Die schematische Darstellung zeigt, wie eine an eine Cas9-Nickase fusionierte Reverse Transkriptase (RT) in einem Komplex mit einer Leit-RNA (gRNA) die DNA-Zielstelle bindet und den PAM-haltigen DNA-Strang neben dem Zielnukleotid schneidet. Die kanonische PAM-Sequenz ist 5'-NGG-3', aber verschiedene PAM-Sequenzen können mit verschiedenen Cas9-Proteinen oder äquivalenten Proteinen aus verschiedenen Organismen assoziiert sein. Außerdem kann jede gegebene Cas9-Nuklease, z. B. SpCas9, modifiziert werden, um die PAM-Spezifität des Proteins zu verändern, um alternative PAM-Sequenzen zu erkennen. Die RT-Enzym verwendet die genickte DNA als Primer für die DNA-Synthese aus der gRNA, die als Matrize für die Synthese eines neuen DNA-Strangs verwendet wird, der die gewünschte Editierung codiert. Der gezeigte Editierprozess kann als Target-Primed Reverse Transcription Editing (TPRT Editor oder Prime-Editor) bezeichnet werden. 1B.2 stellt die gleiche Darstellung wie in 1B.1 bereit, mit der Ausnahme, dass der Prime-Editor-Komplex allgemeiner dargestellt wird als [napDNAbp]-[P]:PEgRNAPEgRNA or [P]-[napDNAbp]:PEgRNAPEgRNA, wobei „P“ auf eine beliebige Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) verweist, „napDNAbp“ auf ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein (z. B. SpCas9) verweist und „PEgRNAPEgRNA“ auf eine Prime Editing Guide RNA verweist und "]-[" auf einen optionalen Linker verweist. Wie an anderer Stelle beschrieben, z. B. 3A- 3G, umfasst die PEgRNAPEgRNA einen 3'-Verlängerungsarm, der eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrize umfasst. Obwohl nicht gezeigt, wird erwogen, dass der Verlängerungsarm der PEgRNAPEgRNA (d. h. der eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrize umfasst) DNA oder RNA sein kann. Die in dieser Konfiguration in Betracht gezogene spezielle Polymerase hängt von der Natur der DNA-Synthesematrize ab. Wenn beispielsweise die DNA-Synthesematrize RNA ist, dann ist der Polymerase-Fall eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase). Wenn die DNA-Synthesematrize DNA ist, kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein.
    • 1C ist eine schematische Darstellung, das einen beispielhaften Prozess zeigt, wie der synthetisierte DNA-Einzelstrang (der die gewünschte Nukleotidänderung umfasst) so aufgelöst wird, dass die gewünschte Nukleotidänderung, Insertion und/oder Deletion in die DNA eingebaut wird. Wie gezeigt, führt nach Synthese des editierten Strangs (oder „mutagenen Strangs“) Äquilibrierung mit dem endogenen Strang, Flap-Spaltung des endogenen Strangs und Ligation zum Einbau der DNA-Editierung nach Auflösung des fehlgepaarten DNA-Duplexes durch die Wirkung endogener DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsprozesse.
    • 1D ist eine schematische Darstellung, die zeigt, dass das „Gegenstrang-Nicking“ in das Auflösungsverfahren von 1C integriert werden kann, um die Bildung des gewünschten Produkts gegenüber dem Reversionsprodukt voranzutreiben. Im Gegenstrang-Nicking wird ein zweiter napDNAbp/gRNA-Komplex (z. B. Cas9/gRNA Komplex) verwendet, um einen zweiten Nick auf dem gegenüberliegenden Strang des anfänglich genickten Strangs einzuführen. Dies induziert die endogenen zelluläre DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsprozesse, um vorzugsweise den nicht-editierten Strang zu ersetzen (d. h. den Strang, der die zweite Nickstelle enthält).
    • 1E stellt eine weitere schematische Darstellung eines beispielhaften Prozesses zum Einführen mindestens einer Nukleotidänderung (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr), Insertion und/oder Deletion in ein DNA-Molekül (z. B. ein Genom) eines Ziellocus unter Verwendung eines Nukleinsäure-programmierbaren DNA-Bindungsproteins (napDNAbp), das mit einer Prime-Editor-Leit-RNA komplexiert ist (z. B. Prime Editing), bereit. Die Prime-Editor-Leit-RNA umfasst eine Verlängerung am 3'- oder 5'-Ende der Leit-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA. In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/gRNA-Komplex das DNA-Molekül, und die gRNA leitet den napDNAbp, um an den Ziellocus zu binden. In Schritt (b) wird ein Nick in einen der DNA-Stränge (der R-Schliefenstrang oder der PAMhaltige Strang oder der Nicht-Ziel-DNA-Strang oder der Protospacer-Strang) dem Ziellocus eingeführt (z. B. durch eine Nuklease oder ein chemisches Mittel), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge dem Ziellocus erzeugt wird. In bestimmten Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Schleifenstrang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht an die Leit-RNA-Sequenz hybridisiert ist. In Schritt (c) interagiert der 3'-Ende-DNA-Strang mit dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, um die reverse Transkription zu primen. In einigen Ausführungsformen hybridisiert der 3'-Ende-DNA-Strang an eine spezifische Primerbindungsstelle auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA. In Schritt (d) wird eine reverse Transkriptase eingeführt, die einen DNA-Einzelstrang vom 3'-Ende der geprimten Stelle zum 3'-Ende der Leit-RNA synthetisiert. Dies bildet einen einzelsträngigen DNA-Flap, der die gewünschte Nukleotidänderung umfasst (z. B. eine oder mehrere Basenänderung(en), Insertion(en), Deletion(en) oder eine Kombination davon). In Schritt (e) werden napDNAbp und Leit-RNA freigesetzt. Schritte (f) und (g) betreffen die Auflösung des einzelsträngigen DNA-Flaps, sodass die gewünschte Nukleotidänderung in den Ziellocus eingebaut wird. Dieser Prozess kann zur gewünschten Produktbildung getrieben werden, indem der entsprechende 5'-endogene DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap eindringt und mit der komplementären Sequenz auf dem anderen Strang hybridisiert. Das Verfahren kann auch mit einem zweiten Strang-Nicking zur Produktbildung hin angetrieben werden, wie beispielhaft in 1D dargestellt. Dieser Prozess kann mindestens eine oder mehrere der folgenden genetischen Veränderungen einführen: Transversionen, Transitionen, Deletionen und Insertionen.
    • 1F ist eine schematische Darstellung, welche die Arten von genetischen Veränderungen darstellt, die mit den in dieser Schrift beschriebenen Target-primed Reverse Transcription Editing- (Prime-Editing-) Prozessen möglich sind. Zu den Arten von Nukleotidveränderungen, die durch Prime Editing erzielt werden können, gehören Deletionen (einschließlich kurzer und langer Deletionen), einzelne und/oder mehrfache Nukleotidänderungen und Insertionen (einschließlich kurzer und langer Insertionen).
    • 1G ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel für ein temporales Zweitstrang-Nicking zeigt, das durch einen Prime-Editor-Komplex veranschaulicht wird. Das temporale Zweitstrang-Nicking ist eine Variante des Zweitstrang-Nickings, um die Bildung des gewünschten editierten Produkts zu erleichtern. Der Begriff „temporal“ bezieht sich auf die Tatsache, dass der Zweitstrangnick am nicht-editierten Strang erst auftritt, nachdem die gewünschte Editierung in dem editierten Strang angebracht wurde. Damit werden gleichzeitige Nicks auf beiden Strängen vermieden, die zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen könnten.
    • 1H zeigt eine Variation des in dieser Schrift in Betracht gezogenen Prime Editings, welches das napDNAbp (z. B. SpCas9-Nickase) durch eine beliebige programmierbare Nukleasedomäne ersetzt, wie etwa Zinkfingernukleasen (ZFN) oder transkriptionsaktivatorähnliche Effektornukleasen (TALEN). Insofern wird erwogen, dass geeignete Nukleasen nicht notwendigerweise durch ein Nukleinsäure-Targeting-Molekül (wie etwa eine Leit-RNA) „programmiert“ werden müssen, sondern vielmehr durch Definieren der Spezifität einer DNA-bindenden Domäne programmiert werden können, wie etwa und insbesondere eine Nuklease. Genau wie beim Prime Editing mit napDNAbp-Einheiten wird bevorzugt, dass solche alternativen programmierbaren Nukleasen derarat modifiziert werden, dass nur ein Strang einer Ziel-DNA geschnitten wird. Anders ausgedrückt sollten die programmierbaren Nukleasen vorzugsweise als Nickasen fungieren. Sobald eine programmierbare Nuklease ausgewählt ist (z. B. eine ZFN oder eine TALEN), können zusätzliche Funktionalitäten in das System eingebaut werden, um ihm zu ermöglichen, gemäß einem Prime-Editing-ähnlichen Mechanismus zu arbeiten. Beispielsweise können die programmierbaren Nukleasen durch Koppeln (z. B. über einen chemischen Linker) eines RNA- oder DNA-Verlängerungsarms daran modifiziert werden, wobei der Verlängerungsarm eine Primerbindungsstelle (PBS) und eine DNA-Synthesematrize umfasst. Die programmierbare Nuklease kann auch (z. B. über einen chemischen oder Aminosäurelinker) an eine Polymerase gekoppelt werden, deren Natur davon abhängt, ob der Verlängerungsarm DNA oder RNA ist. Im Fall eines RNA-Verlängerungsarms kann die Polymerase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) sein. Im Fall eines DNA-Verlängerungsarms kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine prokaryontische Polymerase, einschließlich Pol I, Pol II oder Pol III, oder eine eukaryontische Polymerase, einschließlich Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e oder Pol z). Das System kann auch andere Funktionalitäten enthalten, die als Fusionen an die programmierbaren Nukleasen oder in trans hinzugefügt werden, um die Reaktion als Ganzes zu erleichtern (z. B. (a) eine Helikase zum Abwickeln der DNA an der Schnittstelle, um den geschnittenen Strang mit dem 3'-Ende als Primer verfügbar zu machen, (b) eine FEN1, um das Entfernen des endogenen Strangs auf dem geschnittenen Strang zu unterstützen, um die Reaktion zum Austausch des endogenen Strangs durch den synthetisierten Strang voranzutreiben, oder (c) ein nCas9:gRNA-Komplex, um ein Nick an einer zweiten Stelle am gegenüberliegenden Strang zu erzeugen, was dazu beitragen kann, die Integration der synthetisierenden Reparatur durch eine bevorzugte zelluläre Reparatur des nicht-editierten Strangs voranzutreiben). Analog zum Prime Editing mit einem napDNAbp könnte ein solcher Komplex mit einer ansonsten programmierbaren Nuklease verwendet werden, um einen neu synthetisierten DNA-Ersatzstrang mit einer interessierenden Editierung zu synthesieren und dann dauerhaft in einer DNA-Zielstelle anzubringen.
    • 11 stellt in einer Ausführungsform die anatomischen Merkmale einer Ziel-DNA dar, die durch Prime Editing editiert werden kann. Die Ziel-DNA umfasst einen „Nicht-Zielstrang“ und einen „Zielstrang“. Der Zielstrang ist der Strang, der an den Spacer einer PEgRNA eines Prime-Editor-Komplexes angelagert wird, der die PAM-Site erkennt (in diesem Fall NGG, die von den kanonischen SpCas9-basierten Prime-Editoren erkannt wird). Der Zielstrang kann auch als „Nicht-PAM-Strang“ oder „Nicht-Editierungsstrang“ bezeichnet werden. Im Gegensatz dazu kann der Nicht-Zielstrang (d. h. der Strang, der den Protospacer und die PAM-NGG-Sequenz enthält) als „PAM-Strang“ oder „Editierungsstrang“ bezeichnet werden. In verschiedenen Ausführungsformen befindet sich die Nickstelle des PE-Komplexes im Protospacer auf dem PAM-Strang (z. B. bei dem auf SpCas9 basierenden PE). Die Lage des Nicks ist charakteristisch für das jeweilige Cas9, welches den PE bildet. Bei einem auf SpCas9 basierenden PE liegt beispielsweise die Nickstelle in der Phosphodiesterbindung zwischen den Basen drei (,,-3"-Position relativ zur Position 1 der PAM-Sequenz) und vier (,,-4"-Position relativ zu Position 1 der PAM-Sequenz). Die Nickstelle im Protospacer bildet eine freie 3'-Hydroxylgruppe, die, wie in den folgenden Abbildungen zu sehen ist, mit der Primerbindungsstelle des Verlängerungsarms der PEgRNA komplexiert und das Substrat bereitstellt, um die Polymerisation eines einzelnen DNA-Codes durch die DNA-Synthesematrize des Verlängerungsarms der PEgRNA zu beginnen. Diese Polymerisationsreaktion wird durch die Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) des PE-Fusionsproteins in 5'- nach 3'-Richtung katalysiert. Die Polymerisation endet, bevor sie den gRNA-Kern erreicht (z. B. durch Einschluss eines Polymerisationsterminationssignals oder einer Sekundärstruktur, welche die Polymerisationsaktivität von PE beendet), wodurch ein einzelsträngiger DNA-Flap entsteht, der von der ursprünglichen 3'-Hydroxylgruppe des genickten PAM-Strangs verlängert wird. Die DNA-Synthesematrize codiert für eine einzelsträngige DNA, die homolog zu dem endogenen 5'-Ende-DNA-Einzelstrang ist, der unmittelbar der Nickstelle auf dem PAM-Strang folgt und die gewünschte Nukleotidänderung enthält (z. B. Einzelbasensubstitution, Insertion, Deletion, Inversion) Die Position der gewünschten Editierung kann sich an einer beliebigen Position befinden, die stromabwärts der Nickstelle auf dem PAM-Strang folgt, einschließlich Position +1, +2, +3, +4 (der Start der PAM-Stelle), +5 (Position 2 der PAM-Stelle), +6 (Position 3 der PAM-Stelle), +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, +16, +17, +18, +19, +20, +21, +22, +23, +24, +25, +26, +27, +28, +29, +30, +31, +32, +33, +34, +35, +36, +37, +38, +39, +40, +41, +42, +43, +44, +45, +46, +47, +48, +49, +50, +51, +52, +53, +54, +55, +56, +57, +58, +59, +60, +61, +62, +63, +64, +65, +66, +67, +68, +69, +70, +71, +72, +73, +74, +75, +76, +77, +78, +79, +80, +81, +82, +83, +84, +85, +86, +87, +88, +89, +90, +91, +92, +93, +94, +95, +96, +97, +98, +99, +100, +101, +102, +103, +104, +105, +106, +107, +108, +109, +110, +111, +112, +113, +114, +115, +116, +117, +118, +119, +120, + 121, +122, +123, +124, +125, +126, +127, +128, +129, +130, +131, +132, +133, +134, +135, +136, +137, +138, +139, +140, +141, +142, +143, +144, +145, +146, +147, +148, +149 oder +150 oder mehr (relativ zur stromabwärts gelegenen Position der Nickstelle). Sobald die einzelsträngige 3'-Ende-DNA (welche die interessierende Editierung enthält) die endogene einzelsträngige 5'-Ende-DNA ersetzt, führen die DNA-Reparatur- und -Replikationsprozesse zur dauerhaften Anbringung der Editierungsstelle auf dem PAM-Strang und dann zur Korrektur der Nichtübereinstimmung auf dem Nicht-PAM-Strang, der an der Editierungsstelle vorhanden sein wird. Auf diese Weise erstreckt sich die Editierung auf beide DNA-Stränge an der DNA-Zielstelle. Es versteht sich, dass die Bezugnahme auf „editierten Strang“ und „nicht-editierten“ Strang nur beabsichtigt, die DNA-Stränge abzugrenzen, die am PE-Mechanismus beteiligt sind. Der „editierte Strang“ ist der Strang, der zuerst editiert wird, indem die 5'-Ende-Einzelstrang-DNA unmittelbar stromabwärts der Nickstelle durch die synthetisierte 3'-Ende-Einzelstrang-DNA, welche die gewünschte Editierung enthält, ersetzt wird. Der „nicht-editierte“ Strang ist das Strangpaar mit dem editierten Strang, der aber selbst auch durch Reparatur und/oder Replikation editiert wird, um zum editierten Strang und insbesondere der interessierenden Editierung komplementär zu sein.
    • 1J zeigt den Mechanismus des Prime Editings und zeigt die anatomischen Merkmale der Ziel-DNA, den Prime-Editor-Komplex und die Interaktion zwischen der PEgRNA und der Ziel-DNA. Zuerst wird ein Prime-Editor, umfassend ein Fusionsprotein mit einer Polymerase (z. B. Reverse Transkriptase) und einem napDNAbp (z. B. SpCas9-Nickase, z. B. ein SpCas9 mit einer deaktivierenden Mutation in einer HNH-Nukleasedomäne (z. B. H840A) oder einer deaktivierenden Mutation in einer RuvC-Nukleasedomäne (D10A)) mit einer PEgRNA und DNA, die eine zu editierende Ziel-DNA aufweist, komplexiert. Die PEgRNA umfasst einen Spacer, einen gRNA-Kern (auch bekannt als gRNA-Gerüst oder gRNA-Rückgrat) (der an das napDNAbp bindet) und einen Verlängerungsarm. Der Verlängerungsarm kann sich am 3'-Ende, am 5'-Ende oder irgendwo innerhalb des PEgRNA-Moleküls befinden. Wie gezeigt befindet sich der Verlängerungsarm am 3'-Ende der PEgRNA. Der Verlängerungsarm umfasst in der 3'-zu-5'-Richtung eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrize (umfassend sowohl eine interessierende Editierung als auch Homologiebereiche (d. h. Homologiearme), die mit der einzelsträngigen 5'-Ende-DNA unmittelbar nach der Nickstelle auf dem PAM-Strang homolog sind. Wie gezeigt, sobald der Nick eingeführt wird, wodurch eine freie 3'-Hydroxylgruppe unmittelbar stromaufwärts der Nick-Stelle erzeugt wird, lagert sich die Region unmittelbar stromaufwärts der Nickstelle an eine komplementäre Sequenz am 3'-Ende des Verlängerungsarms, die als als „Primerbindungsstelle“ bezeichnet wird, an, wodurch eine kurze doppelsträngige Region mit einem verfügbaren 3'-Hydroxylende entsteht, die ein Substrat für die Polymerase des Prime-Editor-Komplexes bildet. Die Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) polymerisiert dann als DNA-Strang vom 3'-Hydroxyl-Ende bis zum Ende des Verlängerungsarms. Die Sequenz der einzelsträngigen DNA wird durch die DNA-Synthesematrize codiert, bei der es sich um den Abschnitt des Verlängerungsarms handelt (d. h. ohne die Primerbindungsstelle), der von der Polymerase „gelesen“ wird, um neue DNA zu synthetisieren. Diese Polymerisation verlängert effektiv die Sequenz des ursprünglichen 3'-Hydroxylendes der anfänglichen Nickstelle. Die DNA-Synthesematrize codiert einen DNA-Einzelstrang, der nicht nur die gewünschte Editierung umfasst, sondern auch Regionen, die homolog zu dem endogenen DNA-Einzelstrang unmittelbar stromabwärts der Nickstelle auf dem PAM-Strang sind. Als Nächstes verdrängt der codierte 3'-Ende-DNA-Einzelstrang (d. h. der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap) den entsprechenden homologen endogenen 5'-Ende-DNA-Einzelstrang unmittelbar stromabwärts der Nickstelle auf dem PAM-Strang und bildet ein DNA-Zwischenprodukt mit einem 5'-Ende-Einzelstrang-DNA-Flap, der von der Zelle entfernt wird (z. B. durch eine Flap-Endonuklease). Der 3'-Ende-Einzelstrang-DNA-Flap, der an das Komplement des endogenen 5'-Ende-Einzelstrang-DNA-Flaps anlagert, wird an den endogenen Strang ligiert, nachdem der 5'-DNA-Flap entfernt wurde. Die gewünschte Editierung im 3'-Ende-Einzelstrang-DNA-Flap, nunmehr angelagert und ligiert, bildet eine Fehlpaarung mit dem Komplementstrang, der einer DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsrunde unterzogen wird, wodurch die gewünschte Editierung dauerhaft auf beiden Strängen angebracht wird.
    • 2 zeigt drei zu testende Cas-Komplexe und ihre PAM-, gRNA- und DNA-Spaltungsmerkmale. Die Figur zeigt Designs für Komplexe mit SpCas9, SaCas9 und LbCas12a.
    • 3A-3C zeigen Designs für konstruierte 5'-verlängerte gRNA (3A), 3'verlängerte gRNA (3B) und eine intramolekulare Verlängerung (3C), die jeweils zum Prime Editing verwendet werden können. Die Ausführungsformen zeigen beispielhafte Anordnungen der DNA-Synthesematrize, der Primerbindungsstelle und einer optionalen Linkersequenz in den verlängerten Abschnitten der 3'-, 5'- und intramolekularen verlängerten gRNAs, sowie die Anordnung der Protospacer und Kernregionen. Der offenbarte TPRT-Prozess ist nicht auf diese Konfigurationen von Prime-Editor-Leit-RNAs beschränkt.
    • 4A-4E demonstrieren in vitro TPRT-Assays. 4A ist eine schematische Darstellung einer fluoreszenzmarkierten DNA-Substrat-gRNA-Verlängerung mit Matrize durch einen RT-Enzym-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(PAGE)-Assay der Reverse-Transkriptase-Produkte. 4B zeigt TPRT mit vorgenickten Substraten, dCas9 und 5'-verlängerten gRNAs mit unterschiedlicher Editiermatrizenlänge. 4C zeigt die RT-Reaktion mit vorgenickten DNA-Substraten in Abwesenheit von Cas9. 4D zeigt TPRT auf vollständigen dsDNA-Substraten mit Cas9 (H840A) und 5'-verlängerten gRNAs. 4E zeigt eine 3'-verlängerte gRNA-Matrize mit vorgenickten und vollständigen dsDNA-Substraten. Alle Reaktionen sind mit M-MLV RT.
    • 5 zeigt In-vitro-Validierungen unter Verwendung von 5'-verlängerten gRNAs mit Editiermatritzen unterschiedlicher Länge. Fluoreszierend markierte (Cy5) DNA-Ziele wurden als Substrate verwendet und wurden in dieser Reihe von Experimenten vorgenickt. Das in diesen Experimenten verwendete Cas9 ist katalytisch totes Cas9 (dCas9), und die verwendete RT ist Superscript III, eine im Handel erhältliche RT, die vom Moloney-Maus-Leukämie-Virus (M-MLV) abgeleitet ist. dCas9:gRNA-Komplexe wurden aus gereinigten Komponenten gebildet. Dann wurde das fluoreszenzmarkierte DNA-Substrat zusammen mit dNTPs und dem RT-Enzym zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Reaktionsprodukte durch denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Das Gelbild zeigt die Verlängerung des ursprünglichen DNA-Strangs auf Längen, die mit der Länge der reversen Transkriptionsmatrize übereinstimmen.
    • 6 zeigt In-vitro-Validierungen unter Verwendung von 5'-verlängerten gRNAs mit Editiermatrizen unterschiedlicher Länge, die den in 5 gezeigten sehr ähnlich sind. Allerdings sind die DNA-Substrate in dieser Reihe von Experimenten nicht vorgenickt. Das in diesen Experimenten verwendete Cas9 ist eine Cas9-Nickase (SpyCas9 H840A-Mutante), und die verwendete RT ist Superscript III, eine im Handel erhältliche RT, die vom Moloney-Maus-Leukämie-Virus (M-MLV) abgeleitet ist. Die Reaktionsprodukte wurden durch denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Wie im Gel gezeigt, spaltet die Nickase den DNA-Strang effizient, wenn die gRNA verwendet wird (gRNA_0, Bahn 3).
    • 7 demonstriert, dass 3'-Verlängerungen die DNA-Synthese unterstützen und die Cas9-Nickase-Aktivität nicht signifikant beeinflussen. Vorgenickte Substrate (schwarzer Pfeil) werden nahezu quantitativ in RT-Produkte umgewandelt, wenn entweder dCas9- oder Cas9-Nickase verwendet wird (Bahn 4 und 5). Bei Vollsubstraten (Bahn 3) wird eine Umwandlung von mehr als 50 % zum RT-Produkt (roter Pfeil) beobachtet. Es wurden Cas9-Nickase (SpyCas9 H840A-Mutante), katalytisch totes Cas9 (dCas9) und Superscript III, eine im Handel erhältliche RT, die vom Moloney-Maus-Leukämie-Virus (M-MLV) abgeleitet ist, verwendet.
    • 8 demonstriert Zweifarbexperimente, die verwendet wurden, um zu bestimmen, ob die RT-Reaktion bevorzugt mit der gRNA in cis (gebunden im gleichen Komplex) abläuft. Für 5'-verlängerte und 3'-verlängerte gRNAs wurden zwei separate Experimente durchgeführt. Produkte wurden durch PAGE analysiert. Produktverhältnis berechnet als (Cy3cis/Cy3trans)/(Cy5trans/Cy5cis).
    • 9A-9D demonstrieren ein Flapmodellsubstrat. 9A zeigt einen Dual-FP-Reporter für die Flap-gerichtete Mutagenese. 9B zeigt die Stopcodon-Reparatur in HEK-Zellen. 9C zeigt sequenzierte Hefeklone nach der Flap-Reparatur. 9D zeigt das Testen verschiedener Flap-Merkmale in menschlichen Zellen.
    • 10 zeigt das Prime Editing auf Plasmidsubstraten. Für die Expression in Hefe (S. cerevisiae) wurde ein dual fluoreszierendes Reporterplasmid konstruiert. Die Expression dieses Konstrukts in Hefe produziert nur GFP. Die In-vitro-TRT-Reaktion führt eine Punktmutation ein und transformiert das Eltemplasmid oder ein in-vitro-Cas9(H840A)-genicktes Plasmid in Hefe. Die Kolonien werden durch Fluoreszenzbildgebung sichtbar gemacht. Hefe-Dual-FP-Plasmid-Transformanten sind gezeigt. Die Transformation des Elternplasmids oder eines In-vitro-Cas9 (H840A)-genickten Plasmids führt zu nur grünen GFP-exprimierenden Kolonien. Die TRT-Reaktion mit 5'-verlängerten oder 3'-verlängerten gRNAs erzeugt eine Mischung aus grünen und gelben Kolonien. Letztere exprimieren sowohl GFP als auch mCherry. Bei der 3'-verlängerten gRNA werden mehr gelbe Kolonien beobachtet. Eine positive Kontrolle, die kein Stopcodon enthält, ist ebenfalls gezeigt.
    • 11 zeigt ein Prime Editing an Plasmidsubstraten ähnlich dem Experiment in 10, aber anstatt eine Punktmutation im Stopcodon anzubringen, bringt das Prime Editing eine einzelne Nukleotid-Insertion (links) oder Deletion (rechts) an, die eine Frameshift-Mutation repariert und die Synthese von Downstream-mCherry ermöglicht. Beide Experimente verwendeten 3'verlängerte gRNAs.
    • 12 zeigt Editierprodukte des Prime Editing auf Plasmidsubstraten, gekennzeichnet durch Sanger-Sequenzierung. Einzelne Kolonien aus den TRT-Transformationen wurden ausgewählt und durch Sanger-Sequenzierung analysiert. Präzise Editierungen wurden durch Sequenzieren ausgewählter Kolonien beobachtet. Grüne Kolonien enthielten Plasmide mit der ursprünglichen DNA-Sequenz, während gelbe Kolonien die genaue Mutation enthielten, die von der Prime-Editing-gRNA entworfen wurde. Es wurden keine anderen Punktmutationen oder Indels beobachtet.
    • 13 zeigt den potenziellen Anwendungsbereich der neuen Prime-Editing-Technologie und vergleicht ihn mit Deaminase-vermittelten Baseneditierungstechnologien.
    • 14 zeigt eine schematische Darstellung des Editierens in menschlichen Zellen.
    • 15 demonstriert die Verlängerung der Primerbindungsstelle in gRNA.
    • 16 zeigt verkürzte gRNAs für benachbartes Targeting.
    • 17A-17C sind Schaubilder, die den Prozentsatz % der T-zu-A-Umwandlung am Zielnukleotid nach Transfektion von Komponenten in humane embryonale Nierenzellen (HEK) anzeigen. 17A zeigt Daten, die Ergebnisse unter Verwendung einer N-terminalen Fusion von Wildtyp-MLV-Reverse-Transkriptase mit Cas9 (H840A)-Nickase (32-Aminosäure-Linker) präsentieren. 17B ist ähnlich zu 17A, jedoch für C-terminale Fusion des RT-Enzyms. 17C ist ähnlich zu 17A, doch der Linker zwischen MLV-RT und Cas9 ist 60 Aminosäuren lang statt 32 Aminosäuren.
    • 18 zeigt eine hochreine T-zu-A-Editierung an der HEK3-Stelle durch Hochdurchsatz-Amplikon-Sequenzierung. Das Ergebnis der Sequenzierungsanalyse zeigt die am häufigsten vorkommenden Genotypen von editierten Zellen.
    • 19 zeigt die Editiereffizienz am Zielnukleotid (Linker Balken jedes Balkenpaars) neben den Indel-Raten (rechter Balken jedes Balkenpaars). WT bezeichnet das Wildtyp-MLV-RT-Enzym. Die mutierten Enzyme (M1 bis M4) enthalten die rechts aufgeführten Mutationen. Die Editierraten wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von genomischen DNA-Amplikons quantifiziert.
    • 20 zeigt die Editiereffizienz des Zielnukleotids, wenn ein Einzelstrang-Nick in den komplementären DNA-Strang in der Nähe des Zielnukleotids eingeführt wird. Es wurde Nicking in verschiedenen Abständen vom Zielnukleotid getestet (orange Dreiecke). Die Editiereffizienz am Zielbasenpaar (blaue Balken) wird neben der Informationsrate (orange Balken) angezeigt. Das Beispiel „keine“ enthält keine komplementäre Strang-Nicking-Leit-RNA. Die Editierraten wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von genomischen DNA-Amplikons quantifiziert.
    • 21 demonstriert verarbeitete Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten, welche die gewünschte T-zu-A-Transversionsmutation und das allgemeine Fehlen anderer wichtiger Nebenprodukte der Genom-Editierung zeigen.
    • 22 stellt eine schematische Darstellung eines beispielhaften Prozesses zum Durchführen einer gezielten Mutagenese mit einer fehleranfälligen reversen Transkriptase an einem Ziellocus bereit, wobei ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) verwendet wird, das mit einer Prime-Editor-Leit-RNA komplexiert ist. Dieser Prozess kann als eine Ausführungsform des Prime Editings für gezielte Mutagenese bezeichnet werden. Die Prime-Editor-Leit-RNA umfasst eine Verlängerung am 3'- oder 5'-Ende der Leit-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA. In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/gRNA-Komplex das DNA-Molekül, und die gRNA leitet den napDNAbp, um an den Ziellocus zu binden, um mutagenisiert zu werden. In Schritt (b) wird ein Nick in einen der DNA-Stränge dem Ziellocus eingeführt (z. B. durch eine Nuklease oder ein chemisches Mittel), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge des Ziellocus erzeugt wird. In bestimmten Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Schleifenstrang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht an die Leit-RNA-Sequenz hybridisiert ist. In Schritt (c) interagiert der 3'-Ende-DNA-Strang mit dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, um die reverse Transkription zu primen. In einigen Ausführungsformen hybridisiert der 3'-Ende-DNA-Strang an eine spezifische Primerbindungsstelle auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA. In Schritt (d) wird eine fehleranfällige reverse Transkriptase eingeführt, die einen mutagenisierten DNA-Einzelstrang vom 3'-Ende der geprimten Stelle zum 3'-Ende der Leit-RNA synthetisiert. Exemplarische Mutationen sind mit einem Sternchen * gekennzeichnet. Dies bildet einen einzelsträngigen DNA-Flap, der die gewünschte mutagenisierte Region umfasst. In Schritt (e) werden napDNAbp und Leit-RNA freigesetzt. Die Schritte (f) und (g) betreffen die Auflösung des einzelsträngigen DNA-Flaps (die mutagenisierte Region umfassend), sodass die gewünschte mutagenisierte Region in den Ziellocus eingebaut wird. Dieser Prozess kann zur gewünschten Produktbildung getrieben werden, indem der entsprechende 5'-endogene DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap eindringt und mit der komplementären Sequenz auf dem anderen Strang hybridisiert. Das Verfahren kann auch mit Zweitstrang-Nicking zur Produktbildung getrieben werden, wie beispielhaft in 1D dargestellt. Nach endogenen DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsprozessen wird die mutagenisierte Region in beide DNA-Stränge des DNA-Locus eingebaut.
    • 23 ist eine schematische Darstellung des gRNA-Designs für die Kontraktion von Trinukleotid-Repeat-Sequenzen und die Trinukleotid-Repeat-Kontraktion mit TPRT-Genom-Editierung. Die Trinukleotid-Repeat-Expansion wird mit einer Reihe von menschlichen Erkrankungen assoziiert, einschließlich der Huntington-Krankheit, des Fragiles-X-Syndroms und der Friedreich-Ataxie. Das häufigste Trinukleotid-Repeat enthält CAG-Tripletts, obwohl auch GAA-Tripletts (Friedreich-Ataxie) und CGG-Tripletts (Fragiles-X-Syndrom) vorkommen. Die Vererbung einer Veranlagung zur Expansion oder zum Erwerb eines bereits expandierten elterlichen Allels erhöht die Wahrscheinlichkeit, die Krankheit zu bekommen. Pathogene Expansionen von Trinukleotid-Repeats könnten hypothetisch unter Verwendung von Prime Editing korrigiert werden. Eine Region stromaufwärts der Repeat-Region kann von einer RNAgeleiteten Nuklease genickt und dann verwendet werden, um die Synthese eines neuen DNA-Strangs zu primen, der eine gesunde Anzahl von Wiederholungen enthält (was von dem jeweiligen Gen und der jeweiligen Krankheit abhängt). Nach der Repeat-Sequenz wird ein kurzer Homologieabschnitt hinzugefügt, der mit der Identität der Sequenz neben dem anderen Ende des Repeats (roter Strang) übereinstimmt. Die Invasion des neu synthetisierten Strangs und der anschließende Austausch der endogenen DNA durch den neu synthetisierten Flap führt zu einem kontrahierten Repeat-Allel.
    • 24 ist eine schematische Darstellung, das eine präzise 10-Nukleotid-Deletion mit Prime Editing zeigt. Eine Leit-RNA, die auf den HEK3-Locus abzielt, wurde mit einer reversen Transkriptionsmatrize entworfen, die eine 10-Nukleotid-Deletion nach der Nickstelle codiert. Die Editiereffizienz in transfizierten HEK-Zellen wurde unter Verwendung von Amplikon-Sequenzierung ausgewertet.
    • 25 ist eine schematische Darstellung, die das gRNA-Design für Peptid-Tagging-Gene an endogenen genomischen Loci und Peptid-Tagging mit TPRT-Genom-Editierung zeigt. Die FlAsH- und ReAsH-Markierungssysteme umfassen zwei Teile: (1) eine Fluorophor-Biarsen-Sonde und (2) ein genetisch codiertes Peptid, das ein Tetracystein-Motiv enthält, beispielhaft dargestellt durch die Sequenz FLNCCPGCCMEP (SEQ ID NOs: 1361586). Wenn sie in Zellen exprimiert werden, können Proteine, die das Tetracystein-Motiv enthalten, mit Fluorophor-Arsen-Sonden fluoreszenzmarkiert werden (siehe Lit. J. Am. Chem. Soc., 2002, 124 (21), S. 6063-6076. DOI: 10.1021/ja017687n). Das „Sortagging“-System verwendet bakterielle Sortase-Enzyme, die markierte Peptidsonden kovalent an Proteine konjugieren, die geeignete Peptidsubstrate enthalten (siehe Lit. Nat. Chem. Biol. 2007 Nov; 3(11):707-8. DOI: 10.1038/nchembio.2007.31). Das FLAG-Tag (DYKDDDDK (SEQ ID NOs: 1361587)), V5-Tag (GKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NOs: 1361588)), GCN4-Tag (EELLSKNYHLENEVARLKK (SEQ ID NOs: 1361589)), HA-Tag (YPYDVPDYA (SEQ ID NOs: 1361590)) und Myc-tag (EQKLISEEDL (SEQ ID NOs: 1361591)) werden üblicherweise als Epitop-Tags für Immunoassays verwendet. Die pi-Klemme codiert für eine Peptidsequenz (FCPF (SEQ ID NOs: 1361592)), die mit einem pentafluoraromatischen Substrat markiert werden kann (Lit. Nat. Chem. 2016 Feb.; 8(2):120-8. doi: 10.1038/nchem.2413).
    • 26 zeigt den genauen Einbau eines His6-Tags und eines FLAG-Tags in genomische DNA. Eine Leit-RNA, die auf den HEK3-Locus abzielt, wurde mit einer reversen Transkriptionsmatrize entworfen, die entweder eine 18-nt-His-Tag-Insertion oder eine 24-nt-FLAG-Tag-Insertion codiert. Die Editiereffizienz in transfizierten HEK-Zellen wurde unter Verwendung von Amplikon-Sequenzierung ausgewertet. Es ist zu beachten, dass sich die vollständige 24-nt-Sequenz des FLAG-Tags außerhalb des Betrachtungsrahmens befindet (sequenzierungsbestätigte, vollständige und präzise Insertion).
    • 27 stellt die Struktur einer Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich eine Primerbindungsstelle (A), eine Editiermatrize (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht abgebildet). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein. Die PEgRNAPEgRNA könnte in bestimmten Ausführungsformen eine sekundäre RNA-Struktur umfassen, wie etwa, ohne darauf beschränkt zu sein, Haarnadeln, Haarnadelschleifen, Toeloops, RNA-bindende Protein-Rekrutierungsdomänen (z. B. das MS2-Aptamer, welches das MS2cp-Protein rekrutiert und daran bindet). Derartige Sekundärstrukturen könnten zum Beispiel innerhalb des Spacers, des gRNA-Kerns oder des Verlängerungsarms und insbesondere innerhalb der e1- und/oder e2-Modifikatorregionen liegen. Neben sekundären RNA-Strukturen könnten die PEgRNAPEgRNAs (z. B. innerhalb der e1- und/oder e2-Modifikatorregionen) ein chemischer Linker oder ein Poly(N)-Linker oder -Schwanz sein, wobei „N“ eine beliebige Nukleobase sein kann. In einigen Ausführungsformen (z. B. wie in 72(c) gezeigt) kann der chemische Linker dazu dienen, die reverse Transkription des sgRNA-Gerüsts oder -Kerns zu verhindern. Darüber hinaus könnte der Verlängerungsarm (3) in bestimmten Ausführungsformen (z. B. siehe 72(c)) aus RNA oder DNA bestehen, und/oder könnte ein oder mehrere Nukleobasen-Analoga beinhalten (z. B. die Funktionalität hinzufügen könnten, wie etwa Temperaturbeständigkeit). Weiterhin kann die Ausrichtung des Verlängerungsarms (3) in der natürlichen 5'-zu-3'-Richtung sein oder in der entgegengesetzten Ausrichtung in der 3'-zu-5'-Richtung (relativ zur Ausrichtung des PEgRNAPEgRNA-Moleküls insgesamt) synthetisiert werden. Es wird auch darauf hingewiesen, dass ein Durchschnittsfachmann in der Lage sein wird, eine geeignete DNA-Polymerase in Abhängigkeit von der Natur der Nukleinsäurematerialien des Verlängerungsarms (d. h. DNA oder RNA) zur Verwendung beim Prime Editing auszuwählen, die entweder als Fusion mit dem napDNAbp implementiert werden kann oder in trans als separate Einheit bereitgestellt wird, um den gewünschten matrizecodierten 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu synthetisieren, der die gewünschte Editierung beinhaltet. Wenn der Verlängerungsarm beispielsweise RNA ist, könnte die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase oder jede andere geeignete RNA-abhängige DNA-Polymerase sein. Wenn der Verlängerungsarm jedoch DNA ist, könnte die DNA-Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen könnte die Bereitstellung der DNA-Polymerase in trans erfolgen, z. B. durch die Verwendung einer RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (z. B. einer MS2-Haarnadel, die auf der PEgRNAPEgRNA angebracht ist (z. B. in der e1- oder e2-Region oder anderswo, und ein an die DNA-Polymerase fusioniertes MS2cp-Protein, wodurch die DNA-Polymerase an der PEgRNAPEgRNA co-lokalisiert wird). Es ist auch anzumerken, dass die Primerbindungsstelle im Allgemeinen keinen Teil der Matrize bildet, die von der DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) verwendet wird, um den resultierenden 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu codieren, der die gewünschte Editierung beinhaltet. Somit bezieht sich die Bezeichnung „DNA-Synthesematrize“ auf die Region oder den Abschnitt des Verlängerungsarms (3), der von der DNA-Polymerase als Matrize verwendet wird, um den gewünschten 3'-Einzelstrang-DNA-Flap mit der Editierung zu codieren. In einigen Ausführungsformen beinhaltet die DNA-Synthesematrize die „Editiermatrize“ und den „Homologiearm“. In anderen Ausführungsformen kann die DNA-Synthesematrize auch die e2-Region oder einen Abschnitt davon beinhalten. Wenn zum Beispiel die e2-Region eine Sekundärstruktur umfasst, welche die Beendigung der DNA-Polymeraseaktivität verursacht, dann ist es möglich, dass die DNA-Polymerasefunktion beendet wird, bevor irgendein Abschnitt der e2-Region tatsächlich in DNA codiert wird. Es ist auch möglich, dass einige oder sogar die gesamte e2-Region in DNA codiert wird. Wie viel von e2 tatsächlich als Matrize verwendet wird, hängt von deren Beschaffenheit ab und davon, ob diese Beschaffenheit die DNA-Polymerasefunktion unterbricht.
    • 28 stellt die Struktur einer anderen Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA u mfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich eine Primerbindungsstelle (A), eine Editiermatrize (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal an dem 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht dargestellt). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein. Die PEgRNAPEgRNA könnte in bestimmten Ausführungsformen sekundäre RNA-Strukturen umfassen, wie etwa, ohne darauf beschränkt zu sein, Haarnadeln, Haarnadelschleifen, Toeloops, RNA-bindende Protein-Rekrutierungsdomänen (z. B. das MS2-Aptamer, welches das MS2cp-Protein rekrutiert und daran bindet). Diese Sekundärstrukturen könnten überall im PEgRNAPEgRNA-Molekül positioniert sein. Derartige Sekundärstrukturen könnten zum Beispiel innerhalb des Spacers, des gRNA-Kerns oder des Verlängerungsarms und insbesondere innerhalb der e1 - und/oder e2-Modifikatorregionen liegen. Neben sekundären RNA-Strukturen könnten die PEgRNAPEgRNAs (z. B. innerhalb der e1- und/oder e2-Modifikatorregionen) ein chemischer Linker oder ein Poly(N)-Linker oder - Schwanz sein, wobei „N“ eine beliebige Nukleobase sein kann. In einigen Ausführungsformen (z. B. wie in 27 gezeigt) kann der chemische Linker dazu dienen, die reverse Transkription des sgRNA-Gerüsts oder -Kerns zu verhindern. Darüber hinaus könnte der Verlängerungsarm (3) in bestimmten Ausführungsformen (z. B. siehe 28) aus RNA oder DNA bestehen, und/oder könnte ein oder mehrere Nukleobasen-Analoga beinhalten (z. B. die Funktionalität hinzufügen könnten, wie etwa Temperaturbeständigkeit). Weiterhin kann die Ausrichtung des Verlängerungsarms (3) in der natürlichen 5'-zu-3'-Richtung sein oder in der entgegengesetzten Ausrichtung in der 3'-zu-5'-Richtung (relativ zur Ausrichtung des PEgRNAPEgRNA-Moleküls insgesamt) synthetisiert werden. Es wird auch darauf hingewiesen, dass ein Durchschnittsfachmann in der Lage sein wird, eine geeignete DNA-Polymerase in Abhängigkeit von der Natur der Nukleinsäurematerialien des Verlängerungsarms (d. h. DNA oder RNA) zur Verwendung beim Prime Editing auszuwählen, die entweder als Fusion mit dem napDNAbp implementiert werden kann oder in trans als separate Einheit bereitgestellt wird, um den gewünschten matrizecodierten 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu synthetisieren, der die gewünschte Editierung beinhaltet. Wenn der Verlängerungsarm beispielsweise RNA ist, könnte die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase oder jede andere geeignete RNA-abhängige DNA-Polymerase sein. Wenn der Verlängerungsarm jedoch DNA ist, könnte die DNA-Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen könnte die Bereitstellung der DNA-Polymerase in trans erfolgen, z. B. durch die Verwendung einer RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (z. B. einer MS2-Haarnadel, die auf der PEgRNAPEgRNA angebracht ist (z. B. in der e1- oder e2-Region oder anderswo, und ein an die DNA-Polymerase fusioniertes MS2cp-Protein, wodurch die DNA-Polymerase an der PEgRNAPEgRNA co-lokalisiert wird). Es ist auch anzumerken, dass die Primerbindungsstelle im Allgemeinen keinen Teil der Matrize bildet, die von der DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) verwendet wird, um den resultierenden 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu codieren, der die gewünschte Editierung beinhaltet. Somit bezieht sich die Bezeichnung „DNA-Synthesematrize“ auf die Region oder den Abschnitt des Verlängerungsarms (3), der von der DNA-Polymerase als Matrize verwendet wird, um den gewünschten 3'-Einzelstrang-DNA-Flap mit der Editierung zu codieren. In einigen Ausführungsformen beinhaltet die DNA-Synthesematrize die „Editiermatrize“ und den „Homologiearm“. In anderen Ausführungsformen kann die DNA-Synthesematrize auch die e2-Region oder einen Abschnitt davon beinhalten. Wenn zum Beispiel die e2-Region eine Sekundärstruktur umfasst, welche die Beendigung der DNA-Polymeraseaktivität verursacht, dann ist es möglich, dass die DNA-Polymerasefunktion beendet wird, bevor irgendein Abschnitt der e2-Region tatsächlich in DNA codiert wird. Es ist auch möglich, dass einige oder sogar die gesamte e2-Region in DNA codiert wird. Wie viel von e2 tatsächlich als Matrize verwendet wird, hängt von deren Beschaffenheit ab und davon, ob diese Beschaffenheit die DNA-Polymerasefunktion unterbricht.
    • 29 ist eine schematische Darstellung, welche die Interaktion einer typischen PEgRNA mit einer Zielstelle einer doppelsträngigen DNA und die gleichzeitige Produktion eines 3'einzelsträngigen DNA-Flaps zeigt, der die interessierende genetische Veränderung enthält. Die Doppelstrang-DNA wird mit dem oberen Strang (d. h. dem Zielstrang) in der 3'-zu-5'-Ausrichtung und dem unteren Strang (d. h. dem PAM-Strang oder Nicht-Zielstrang) in der 5'-zu-3'-Richtung gezeigt. Der oberste Strang umfasst das Komplement des „Protospacers“ und das Komplement der PAM-Sequenz und wird als „Zielstrang“ bezeichnet, da es sich um den Strang handelt, der von dem Spacer der PEgRNA angezielt wird und an diesen anlagert. Der komplementäre untere Strang wird als „Nicht-Zielstrang“ oder „PAM-Strang“ oder „Protospacer-Strang“ bezeichnet, da er die PAM-Sequenz (z. B. NGG) und den Protospacer enthält Obwohl nicht gezeigt, würde die abgebildete PEgRNA mit einer Cas9 oder einer äquivalenten Domäne eines Prime-Editor-Fusionsproteins komplexiert. Wie in der schematischen Darstellung gezeigt, lagert der Spacer der PEgRNA an die komplementäre Region des Protospacers auf dem Zielstrang an, die als Protospacer bezeichnet wird und sich direkt stromabwärts der PAM-Sequenz befindet und etwa 20 Nukleotide lang ist. Diese Interaktion bildet sich als DNA/RNA-Hybrid zwischen der Spacer-RNA und dem Komplement der Protospacer-DNA und induziert die Bildung einer R-Schleife in der dem Protospacer gegenüberliegenden Region. Wie an anderer Stelle in dieser Schrift gelehrt, induziert das Cas9-Protein (nicht gezeigt) dann einen Nick in dem Nicht-Zielstrang, wie gezeigt. Dies führt dann zur Bildung der 3'-ssDNA-Flap-Region unmittelbar stromaufwärts der Nickstelle, die gemäß *z* mit dem 3'-Ende der PEgRNA an der Primerbindungsstelle interagiert. Das 3'-Ende des ssDNA-Flap (d. h. die Primersequenz der reversen Transkriptase) lagert an die Primerbindungsstelle (A) auf der PEgRNA an, wodurch die reverse Transkriptase geprimt wird. Als Nächstes polymerisiert die Reverse Transkriptase (z. B. bereitgestellt in trans oder bereitgestellt cis als Fusionsprotein, angefügt an das Cas9-Konstrukt) dann einen DNA-Einzelstrang, der durch die DNA-Synthesematrize (einschließlich der Editiermatrize (B) und dem Homologiearm (C)) codiert wird. Die Polymerisation wird zum 5'-Ende des Verlängerungsarms fortgesetzt. Der polymerisierte ssDNA-Strang bildet einen ssDNA-3'-Ende-Flap, der, wie an anderer Stelle beschrieben (z. B. wie in 1E gezeigt), in die endogene DNA eindringt, wodurch der entsprechende endogene Strang verdrängt (der als 5'-DNA-Flap endogener DNA entfernt wird) und die gewünschte Nukleotideditierung (Einzelnukleotid-Basenpaar-Änderung, Deletionen, Insertionen (einschließlich ganzer Gene) durch natürlich vorkommende DNA-Reparatur-/- Replikationsrunden angebracht wird.
    • 30 hilft beim Verständnis der Offenbarung der PEgRNA des Sequenzprotokolls. Die Figuren zeigen zwei beispielhafte PEgRNA -Sequenzen (SEQ ID NO: 135529 (oben) und SEQ ID NO: 135880 (unten)) und wie die verschiedenen offenbarten Sequenzuntergruppen darauf kartieren. Für SEQ ID NO: 135529 sind die entsprechenden Sequenzen Spacer (SEQ ID NO: 271043), Verlängerungsarm (SEQ ID NO: 406557), Primerbindungsstelle (SEQ ID NO: 542071), Editiermatrize (SEQ ID NO: 677585) und der Homologiearm (SEQ ID NO: 813099). Für SEQ ID NO: 135880 sind die entsprechenden Sequenzen Spacer (SEQ ID NO: 880463), Verlängerungsarm (SEQ ID NO: 947841), Primerbindungsstelle (SEQ ID NO: 1015219), Editiermatrize (SEQ ID NO: 1082597) und der Homologiearm (SEQ ID NO: 1149975).
    • 31 ist ein Ablaufdiagramm, das ein beispielhaftes computerisiertes High-Level-Verfahren 3100 zum Bestimmen einer verlängerten gRNA-Struktur gemäß einigen Ausführungsformen der Offenbarung zeigt. In Schritt 3102 greift eine Rechenvorrichtung (z. B. die in Verbindung mit 34 beschriebene Rechenvorrichtung 3400) auf Daten zu, die ein Eingangsallel, ein Ausgangsallel und ein Fusionsprotein angeben, das ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein und eine reverse Transkriptase enthält. Während Schritt 3102 den Zugriff auf alle drei des Eingangsallels, Ausgangsallels und Fusionsproteins in einem Schritt beschreibt, dient dies der Veranschaulichung, und es versteht sich, dass auf solche Daten unter Verwendung eines oder mehrerer Schritte zugegriffen werden kann, ohne vom Geist der in dieser Schrift beschriebenen Techniken abzuweichen. Der Zugriff auf Daten kann das Empfangen von Daten, das Speichern von Daten, den Zugriff auf eine Datenbank und/oder dergleichen beinhalten.
    • 32 ist ein Ablaufdiagramm, das ein beispielhaftes computerisiertes Verfahren 3200 zum Bestimmen der Komponenten einer verlängerten gRNA-Struktur, einschließlich der Komponenten der Verlängerung, gemäß einigen Ausführungsformen zeigt. Es versteht sich, dass 32 veranschaulichend sein soll, und daher können Techniken, die verwendet werden, um die verlängerte gRNA zu bestimmen, mehr oder weniger Schritte als die in 32 gezeigten beinhalten.
    • 33 ist ein Ablaufdiagramm, das ein beispielhaftes computerisiertes Verfahren 3300 zum Bestimmen von Sätzen von verlängerten gRNA-Strukturen für jeden Mutationseintrag in einer Datenbank gemäß einigen Ausführungsformen zeigt. Bei Schritt 3302 greift die Rechenvorrichtung auf eine Datenbank zu (z. B. eine ClinVar-Datenbank, auf die unter www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ zugegriffen werden kann) die einen Satz von Mutationseinträgen beinhaltet, die jeweils ein die Mutation repräsentierendes Eingangsallel und ein die korrigierte Wildtypsequenz repräsentierendes Ausgangsallel beinhalten.
    • 34 ist eine veranschaulichende Implementierung eines Computersystems 3400, das verwendet werden kann, um jeden der Aspekte der in dieser Schrift offenbarten Techniken und Ausführungsformen auszuführen. Das Computersystem 3400 kann einen oder mehrere Prozessoren 3410 und ein oder mehrere nichtflüchtige computerlesbare Speichermedien (z. B. Speicher 3420 und ein oder mehrere nichtflüchtige Speichermedien 3430) und eine Anzeige 3440 beinhalten. Der Prozessor 3410 kann das Schreiben von Daten in und das Lesen von Daten aus dem Speicher 3420 und der nichtflüchtigen Speichervorrichtung 3430 auf jede geeignete Weise steuern, da die in dieser Schrift beschriebenen Aspekte der Erfindung in dieser Hinsicht nicht beschränkt sind.
    • 35A ist eine schematische Darstellung der PE-basierten Insertion von Sequenzen, die RNA-Motive codieren, in Verbindung mit Beispiel 3.
    • 35B ist eine Liste (nicht erschöpfend) einiger Beispielmotive, die möglicherweise eingefügt werden könnten, und ihrer Funktionen in Verbindung mit Beispiel 3.
    • 36 stellt ein Balkendiagramm zum Vergleich der Effizienz (d. h. „% der gesamten Sequenzierungslesungen mit der festgelegten Editierung oder den festgelegten Indels“) von PE2, PE2-verkürzt, PE3 und PE3-verkürzt über verschiedene Zielstellen in verschiedenen Zelllinien bereit. Die Daten zeigen, dass die Prime-Editoren, die die verkürzten RT-Varianten umfassen, etwa so effizient waren wie die Prime-Editoren, welche die nicht verkürzten RT-Proteine umfassen.
    • 37A zeigt die Nukleotidsequenz eines SpCas9-PEgRNA-Moleküls (oben), das am 3'-Ende in einem „UGU“ endet und kein Toeloop-Element enthält. Der untere Teil der Figur zeigt das gleiche SpCas9-PEgRNA-Molekül, ist jedoch weiter modifiziert, um ein Toeloop-Element zu enthalten, in das die Sequenz 5'-„GAAANNNNN“-3' unmittelbar vor dem „UUU“-3'-Ende eingefügt ist. Das „N“ kann jede Nukleobase sein.
    • 37B zeigt die Ergebnisse von Beispiel 4, das demonstriert, dass die Effizienz des Prime Editings in HEK-Zellen oder EMX-Zellen unter Verwendung von PEgRNA, die Toeloop-Elemente enthält, erhöht ist, während der Prozentsatz der Indel-Bildung weitgehend unverändert ist.
    • 38 bildet eine Ausführungsform eines Prime-Editors ab, der als zwei PE-Halbproteine bereitgestellt wird, die als ganzer Prime-Editor durch die selbstspleißende Wirkung der getrennten Inteinhälften, die sich am Ende oder Anfang jedes der Prime-Editor-Halbproteine befinden, regenerieren.
    • 39 bildet den Mechanismus der Inteinentfernung aus einer Polypeptidsequenz und die Neubildung einer Peptidbindung zwischen den N-terminalen und den C-terminalen Exteinsequenzen ab. (a) bildet den allgemeinen Mechanismus von zwei Halbproteinen ab, die jeweils die Hälfte einer Inteinsequenz enthalten, die bei Kontakt innerhalb einer Zelle zu einem voll funktionsfähigen Intein führen, das dann selbstgespleißt und ausgeschnitten wird. Der Vorgang der Exzision führt zur Bildung einer Peptidbindung zwischen der N-terminalen Proteinhälfte (oder dem „N-Extein“) und der C-terminalen Proteinhälfte (oder dem „C-Extein“), um ein ganzes, einzelnes Polypeptid zu bilden, das die N-Extein- und die C-Extein-Anteile umfasst. In verschiedenen Ausführungsformen kann das N-Extein der N-terminalen Hälfte eines getrennten Prime-Editor-Fusionsproteins entsprechen und das C-Extein kann der C-terminalen Hälfte eines getrennten Prime-Editors entsprechen. (b) zeigt eine chemische Mechanik der Intein-Exzision und der Neubildung einer Peptidbindung, welche die N-Extein-Hälfte (die rote Hälfte) und die C-Extein-Hälfte (die blaue Hälfte) verbindet. Die Exzision der getrennten Inteine (d. h. des N-Inteins und des C-Inteins in der getrennten Inteinkonfiguration) kann auch als „Trans-Spleißen“ bezeichnet werden, da es die Spleißwirkung zweier separater Komponenten beinhaltet, die in trans bereitgestellt werden.
  • DEFINITIONEN
  • Antisense-Strang
  • In der Genetik ist der „Antisense“-Strang eines Segments innerhalb einer doppelsträngigen DNA der Matrizenstrang, und es wird angenommen, dass er in der 3'- bis 5'-Ausrichtung verläuft. Im Gegensatz dazu ist der „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3' verläuft und das zum Antisense-Strang der DNA oder dem Matrizenstrang, der von 3' nach 5' verläuft, komplementär ist. Im Fall eines DNA-Segments, das ein Protein codiert, ist der Sense-Strang der DNA-Strang, der die gleiche Sequenz wie die mRNA aufweist, die den Antisense-Strang während der Transkription als ihre Matrize nimmt und schließlich (normalerweise, nicht immer) der Translation in ein Protein unterzogen wird. Der Antisense-Strang ist somit für die RNA verantwortlich, die später zum Protein translatiert wird, während der Sense-Strang einen nahezu identischen Aufbau wie die mRNA besitzt. Es ist zu beachten, dass es für jedes Segment der dsDNA möglicherweise zwei Sätze von Sense und Antisense gibt, je nachdem, aus welcher Richtung man liest (da Sense und Antisense relativ zur Perspektive sind). Letztlich bestimmt das Genprodukt oder die mRNA, welcher Strang eines dsDNA-Segments als Sense oder Antisense bezeichnet wird.
  • Cas9
  • Der Begriff „Cas9“ oder „Cas9-Nuklease“ bezeichnet eine RNA-geleitete Nuklease, die eine Cas9-Domäne umfasst, oder ein Fragment davon (z. B. ein Protein, das eine aktive oder inaktive DNA-Spaltungsdomäne von Cas9 umfasst, und/oder die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9). Eine „Cas9-Domäne“, wie in dieser Schrift verwendet, ist ein Proteinfragment, das eine aktive oder inaktive Spaltungsdomäne von Cas9 und/oder die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9 umfasst. Ein „Cas9-Protein“ ist ein Cas9-Protein voller Länge. Eine Cas9-Nuklease wird auch manchmal als casn1-Nuclease oder eine CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-assoziierten Nuklease bezeichnet. CRISPR ist ein adaptives Immunsystem, das Schutz gegen mobile genetische Elemente (Viren, transponierbare Elemente und konjugative Plasmide) bietet. CRISPR-Cluster enthalten Spacer, Sequenzen, die komplementär zu vorhergehenden mobilen Elementen sind, und zielen auf eindringende Nukleinsäuren ab. CRISPR-Cluster werden transkribiert und zu CRISPR-RNA (crRNA) verarbeitet. In Typ-II-CRISPR-Systemen erfordert die korrekte Verarbeitung von prä-crRNA eine transcodierte kleine RNA (tracrRNA), endogene Ribonuklease 3 (rnc) und eine Cas9-Domäne. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease-3-unterstützte Verarbeitung von prä-crRNA. Anschließend spaltet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres dsDNA-Ziel, das zum Spacer komplementär ist. Der zur crRNA nicht komplementäre Zielstrang wird zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch 3'-5' getrimmt. In der Natur erfordert die DNA-Bindung und -Spaltung typischerweise Protein und beide RNAs. Einzelne Leit-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gNRA“) können jedoch so konstruiert werden, dass Aspekte sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies integriert werden. Siehe z. B. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Cas9 erkennt ein kurzes Motiv in den CRISPR-Repeat-Sequenzen (das PAM- oder Protospacer-benachbarte Motiv), um die Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst zu unterstützen. Cas9-Nuklease-Sequenzen und -Strukturen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. „Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes“. Ferretti et al., J.J., McShan WM, Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:4658-4663(2001); „CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III“. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); und „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity“. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), dessen gesamter Inhalt jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird. Cas9-Orthologe wurden in verschiedenen Spezies beschrieben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, in S. pyogenes und S. thermophilus. Weitere geeignete Cas9-Nukleasen und -Sequenzen werden dem Fachmann auf der Grundlage dieser Offenbarung offensichtlich sein, und solche Cas9-Nukleasen und -Sequenzen beinhalten Cas9-Sequenzen aus den Organismen und Loci, die in Chylinski, Rhun und Charpentier, „The tracrRNA and Cas9 familys of type II CRISPR-Cas immunity systems“ (2013) RNA Biology 10:5, 726-737 offenbart sind; dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einigen Ausführungsformen umfasst eine Cas9-Nuklease eine oder mehrere Mutationen, welche die DNA-Spaltungsdomäne teilweise beeinträchtigen oder inaktivieren.
  • Eine Nuklease-inaktivierte Cas9-Domäne kann austauschbar als „dCas9“-Protein (für Nuklease-„totes“ Cas9) bezeichnet werden. Verfahren zur Erzeugung einer Cas9-Domäne (oder eines Fragments davon) mit einer inaktiven DNA-Spaltungsdomäne sind bekannt (siehe z. B. Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., „Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression“ (2013) Cell. 28;152(5):1173-83, wobei der gesamte Inhalt jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird). Zum Beispiel ist bekannt, dass die DNA-Spaltungsdomäne von Cas9 zwei Subdomänen umfasst, die HNH-Nuklease-Subdomäne und die RuvC1-Subdomäne. Die HNH-Subdomäne spaltet den zur gRNA komplementären Strang, während die RuvC1-Subdomäne den nicht-komplementären Strang spaltet. Mutationen innerhalb dieser Subdomänen können die Nukleaseaktivität von Cas9 abschalten. Zum Beispiel inaktivieren die Mutationen D10A und H840A die Nukleaseaktivität von S. pyogenes-Cas9 vollständig (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). In einigen Ausführungsformen werden Proteine bereitgestellt, die Fragmente von Cas9 umfassen. Zum Beispiel umfasst ein Protein einigen Ausführungsformen eine von zwei Cas9-Domänen: (1) die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9; oder (2) die DNA-Spaltungsdomäne von Cas9. In einigen Ausführungsformen werden Proteine, die Cas9 oder Fragmente davon umfassen, als „Cas9-Varianten“ bezeichnet. Eine Cas9-Variante weist eine Homologie zu Cas9 oder einem Fragment davon auf. Zum Beispiel ist eine Cas9-Variante mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch, mindestens etwa 99,8 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 aus SEQ ID NOs: 1361421). In einigen Ausführungsformen kann die Cas9-Variante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 oder mehr Aminosäureänderungen im Vergleich zu Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 von SEQ ID NOs: 1361421) aufweisen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Cas9-Variante ein Fragment von SEQ ID NOs: X-Cas9 (z. B. eine gRNA-Bindungsdomäne oder eine DNA-Spaltungsdomäne), sodass das Fragment zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99% identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch, oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment von Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 aus SEQ ID NOs: 1361421) ist. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment zu mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 %, mindestens 50 %, mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäurelänge eines entsprechenden Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421).
  • cDNA
  • Der Begriff „cDNA“ bezeichnet einen DNA-Strang, der von einer RNA-Matrize kopiert wurde. cDNA ist komplementär zur RNA-Matrize.
  • Zirkuläre Permutante
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „zirkuläre Permutante“ ein Protein oder Polypeptid (z. B. ein Cas9), das eine zirkuläre Permutation umfasst, bei der es sich um eine Änderung der strukturellen Konfiguration des Proteins handelt, die eine Änderung der Reihenfolge der in der Aminosäuresequenz des Proteins erscheinenden Aminosäuren einschließt. Anders ausgedrückt sind zirkuläre Permutanten Proteine, die im Vergleich zu einem Wildtyp-Gegenstück veränderte N- und C-Termini aufweisen, z. B. wird die Wildtyp-C-terminale Hälfte eines Proteins die neue N-terminale Hälfte. Die zirkuläre Permutation (oder CP) ist im Wesentlichen die topologische Neuordnung der Primärsequenz eines Proteins, wobei dessen N- und C-Terminus, oft mit einem Peptidlinker, verbunden werden, während gleichzeitig seine Sequenz an einer anderen Position getrennt wird, um neue, benachbarte N- und C-Termini zu erzeugen. Das Ergebnis ist eine Proteinstruktur mit unterschiedlicher Konnektivität, die jedoch oft die gleiche insgesamt ähnliche dreidimensionale (3D-) Form aufweisen kann und möglicherweise verbesserte oder veränderte Eigenschaften aufweist, einschließlich verringerter proteolytischer Anfälligkeit, verbesserter katalytischer Aktivität, veränderter Substrat- oder Ligandenbindung und/oder verbesserter Thermostabilität. Zirkuläre permutante Proteine können in der Natur vorkommen (z. B. Concanavalin A und Lektin). Darüber hinaus kann eine zirkuläre Permutation als Ergebnis posttranslationaler Modifikationen auftreten oder unter Verwendung rekombinanter Techniken konstruiert werden.
  • Zirkulär permutiertes Cas9
  • Der Begriff „zirkulär permutiertes Cas9“ bezeichnet jedes Cas9-Protein oder eine Variante davon, das als zirkuläre Permutante auftritt, wobei seine N- und C-Termini durch Umordnung der Primärsequenz des Proteins rekonfiguriert wurden. Derartige zirkulär permutierten Cas9-Proteine („CP-Cas9“) oder Varianten davon behalten die Fähigkeit, DNA zu binden, wenn sie mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert werden. Siehe Oakes et al., „Protein Engineering of Cas9 for Enhanced Function“, Methods Enzymol, 2014, 546: 491-511 und Oakes et al., „CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification“, Cell, 10. Januar 2019, 176: 254-267, jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen. Die vorliegende Offenbarung erwägt jedes zuvor bekannte CP-Cas9 oder verwendet ein neues CP-Cas9, solange das resultierende zirkulär permutierte Protein die Fähigkeit behält, DNA zu binden, wenn es mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert wird. Beispielhafte CP-Cas9-Proteine sind SEQ ID NOs: 1361475-1361484.
  • DNA-Synthesematrize
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „DNA-Synthesematrize“ die Region oder den Abschnitt des Verlängerungsarms einer PEgRNA, die bzw. der von einer Polymerase eines Prime-Editors als Matrizenstrang verwendet wird, um einen 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu codieren, der die gewünschte Editierung enthält und der dann durch den Mechanismus des Prime Editing den entsprechenden endogenen DNA-Strang an der Zielstelle ersetzt. In verschiedenen Ausführungsformen ist die DNA-Synthesematrize in 3A (im Kontext einer PEgRNA, die einen 5'-Verlängerungsarm umfasst), 3B (im Kontext einer PEgRNA, die einen 3'-Verlängerungsarm umfasst), 3C (im Kontext eines inneren Verlängerungsarms), 3D (im Kontext eines 3'-Verlängerungsarms) und 3E (im Zusammenhang mit einem 5'-Verlängerungsarm) gezeigt. Der Verlängerungsarm, einschließlich der DNA-Synthesematrize, kann aus DNA oder RNA bestehen. Im Fall von RNA kann die Polymerase des Prime-Editors eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) sein. Im Fall von DNA kann die Polymerase des Prime-Editors eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen (z. B. wie in 3D-3E abgebildet) kann die DNA-Synthesematrize (4) die „Editiermatrize“ und den „Homologiearm“ und die gesamte oder einen Abschnitt der optionalen 5'-Ende-Modifiziererregion, e2, umfassen. Das heißt, je nach der Natur der e2-Region (z. B. ob sie eine Haarnadel-, eine Toeloop- oder Haarnadelscheifen-Sekundärstruktur beinhaltet) kann die Polymerase auch keine, einige oder die gesamte e2-Region codieren. Anders ausgedrückt, im Fall eines 3'-Verlängerungsarms kann die DNA-Synthesematrize (3) den Abschnitt des Verlängerungsarms (3) beinhalten, der sich vom 5'-Ende der Primerbindungsstelle (PBS) bis zum 3'-Ende des gRNA-Kerns erstreckt, der als Matrize für die Synthese eines DNA-Einzelstrangs durch eine Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) fungieren kann. Im Falle eines 5'-Verlängerungsarms kann die DNA-Synthesematrize (3) den Abschnitt des Verlängerungsarms (3) beinhalten, der sich vom 5'-Ende des PEgRNA-Moleküls bis zum 3'-Ende der Editiermatrize erstreckt. Vorzugsweise schließt die DNA-Synthesematrize die Primerbindungsstelle (PBS) von PEgRNAs aus, die entweder einen 3'-Verlängerungsarm oder einen 5'-Verlängerungsarm aufweisen. Bestimmte in dieser Schrift beschriebene Ausführungsformen (z. B. 71A) verweisen auf „eine RT-Matrize“, welche die Editiermatrize und den Homologiearm beinhaltet, d. h. die Sequenz des PEgRNA-Verlängerungsarms, die tatsächlich als Matrize während der DNA-Synthese verwendet wird. Der Begriff „RT-Matrize“ entspricht dem Begriff „DNA-Synthesematrize“.
  • Stromabwärts
  • Wie in dieser Schrift verwendet, sind die Begriffe „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ Relativitätsbegriffe, die die lineare Position von mindestens zwei Elementen definieren, die sich in einem Nukleinsäuremolekül (ob einzel- oder doppelsträngig) befinden, das in einer 5'-zu-3'-Richtung ausgerichtet ist. Insbesondere befindet sich ein erstes Element stromaufwärts eines zweiten Elements in einem Nukleinsäuremolekül, wobei das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 5' zum zweiten Element ist. Beispielsweise befindet sich ein SNP stromaufwärts einer Cas9-induzierten Nickstelle, wenn sich das SNP auf der 5'-Seite der Nickstelle befindet. Umgekehrt befindet sich ein erstes Element stromabwärts eines zweiten Elements in einem Nukleinsäuremolekül, wobei das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 3' zum zweiten Element ist. Beispielsweise befindet sich ein SNP stromabwärts einer Cas9-induzierten Nickstelle, wenn sich der SNP auf der 3'-Seite der Nickstelle befindet. Das Nukleinsäuremolekül kann eine DNA (doppelsträngig oder einzelsträngig), eine RNA (doppel- oder einzelsträngig) oder ein Hybrid aus DNA und RNA sein. Die Analyse ist für einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle und ein doppelsträngiges Molekül gleich, da sich die Begriffe stromaufwärts und stromabwärts nur auf einen Einzelstrang eines Nukleinsäuremoleküls beziehen, mit Ausnahme desssen, dass ausgewählt werden muss, welcher Strang des doppelsträngigen Moleküls in Betracht gezogen wird. Oft ist der Strang einer doppelsträngigen DNA, der zur Bestimmung der Positionsrelativität von mindestens zwei Elementen verwendet werden kann, der „Sense“- oder „Codierungsstrang“. In der Genetik ist der „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3' verläuft und das zum Antisense-Strang der DNA oder dem Matrizenstrang, der von 3' nach 5' verläuft, komplementär ist. So ist beispielsweise eine SNP-Nukleobase „stromabwärts“ einer Promotorsequenz in einer genomischen DNA (die doppelsträngig ist), wenn sich die SNP-Nukleobase auf der 3'-Seite des Promotors auf dem Sense- oder Codierungsstrang befindet.
  • CRISPR
  • CRISPR ist eine Familie von DNA-Sequenzen (d. h. CRISPR-Cluster) in Bakterien und Archaeen, die Schnipsel früherer Infektionen durch ein Virus darstellen, das in den Prokaryoten eingedrungen ist. Die DNA-Schnipsel werden von der prokaryotischen Zelle verwendet, um DNA von nachfolgenden Angriffen durch ähnliche Viren zu erkennen und zu zerstören und zusammen mit einem Array von CRISPR-assoziierten Proteinen (einschließlich Cas9 und Homologen davon) und CRISPR-assoziierter RNA ein prokaryotischens Immunabwehrsystem zu bilden. In der Natur werden CRISPR-Cluster transkribiert und zu CRISPR-RNA (crRNA) verarbeitet. In bestimmten CRISPR-Systemen (z. B. Typ-II-CRISPR-Systemen) erfordert die korrekte Verarbeitung von prä-crRNA eine transcodierte kleine RNA (tracrRNA), endogene Ribonuklease 3 (rnc) und ein Cas9-Protein. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease-3-unterstützte Verarbeitung von prä-crRNA. Anschließend spaltet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres dsDNA-Ziel, das zu der RNA komplementär ist. Insbesondere wird der zur crRNA nicht komplementäre Zielstrang zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch 3'-5' getrimmt. In der Natur erfordert die DNA-Bindung und -Spaltung typischerweise Protein und beide RNAs. Einzelne Leit-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gNRA“) können jedoch so konstruiert werden, dass Aspekte sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies integriert werden - die Leit-RNA. Siehe z. B. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Cas9 erkennt ein kurzes Motiv in den CRISPR-Repeat-Sequenzen (das PAM- oder Protospacer-benachbarte Motiv), um die Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst zu unterstützen. CRISPR-Biologie sowie Cas9-Nuklease-Sequenzen und -Strukturen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. „Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes“. Ferretti et al., J.J., McShan WM, Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:4658-4663(2001); „CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III“. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); und „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity“. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), dessen gesamter Inhalt jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird. Cas9-Orthologe wurden in verschiedenen Spezies beschrieben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, in S. pyogenes und S.thermophilus. Weitere geeignete Cas9-Nukleasen und -Sequenzen werden dem Fachmann auf der Grundlage dieser Offenbarung offensichtlich sein, und solche Cas9-Nukleasen und -Sequenzen beinhalten Cas9-Sequenzen aus den Organismen und Loci, die in Chylinski, Rhun und Charpentier, „The tracrRNA and Cas9 familys of type II CRISPR-Cas immunity systems“ (2013) RNA Biology 10:5, 726-737 offenbart sind; dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Der Begriff „Cas9“ oder „Cas9-Nuklease“ bezeichnet eine RNA-geleitete Nuklease, die eine Cas9-Domäne umfasst, oder ein Fragment davon (z. B. ein Protein, das eine aktive oder inaktive DNA-Spaltungsdomäne von Cas9 umfasst, und/oder die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9). Eine „Cas9-Domäne“ , wie in dieser Schrift verwendet, ist ein Proteinfragment, das eine aktive oder inaktive Spaltungsdomäne von Cas9. umfasst und/oder die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9. Ein „Cas9-Protein“ ist ein Cas9-Protein voller Länge. Eine Cas9-Nuklease wird auch manchmal als casn1-Nuclease oder eine CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-assoziierten Nuklease bezeichnet. CRISPR ist ein adaptives Immunsystem, das Schutz gegen mobile genetische Elemente (Viren, transponierbare Elemente und konjugative Plasmide) bietet. CRISPR-Cluster enthalten Spacer, Sequenzen, die komplementär zu vorhergehenden mobilen Elementen sind, und zielen auf eindringende Nukleinsäuren ab. CRISPR-Cluster werden transkribiert und zu CRISPR-RNA (crRNA) verarbeitet. In Typ-II-CRISPR-Systemen erfordert die korrekte Verarbeitung von prä-crRNA eine transcodierte kleine RNA (tracrRNA), endogene Ribonuklease 3 (rnc) und eine Cas9-Domäne. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease-3-unterstützte Verarbeitung von prä-crRNA. Anschließend spaltet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres dsDNA-Ziel, das zum Spacer komplementär ist. Der zur crRNA nicht komplementäre Zielstrang wird zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch 3'-5' getrimmt. In der Natur erfordert die DNA-Bindung und -Spaltung typischerweise Protein und beide RNAs. Einzelne Leit-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gNRA“) können jedoch so konstruiert werden, dass Aspekte sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies integriert werden. Siehe z. B. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Cas9 erkennt ein kurzes Motiv in den CRISPR-Repeat-Sequenzen (das PAM- oder Protospacer-benachbarte Motiv), um die Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst zu unterstützen. Cas9-Nuklease-Sequenzen und -Strukturen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. „Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes“. Ferretti et al., J.J., McShan WM, Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z. , Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4658-4663(2001); „CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III“. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); und „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity“. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), dessen gesamter Inhalt jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird. Cas9-Orthologe wurden in verschiedenen Spezies beschrieben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, in S. pyogenes und S. thermophilus. Weitere geeignete Cas9-Nukleasen und -Sequenzen werden dem Fachmann auf der Grundlage dieser Offenbarung offensichtlich sein, und solche Cas9-Nukleasen und Sequenzen umfassen Cas9-Sequenzen aus den Organismen und Loci, die in Chylinski, Rhun und Charpentier, „The tracrRNA and Cas9 familys“ offenbart sind von Typ-II-CRISPR-Cas-Immunitätssystemen (2013) RNA Biology 10:5, 726-737; deren gesamter Inhalt wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. In einigen Ausführungsformen umfasst eine Cas9-Nuklease eine oder mehrere Mutationen, welche die DNA-Spaltungsdomäne teilweise beeinträchtigen oder inaktivieren.
  • Eine Nuklease-inaktivierte Cas9-Domäne kann austauschbar als „dCas9“-Protein (für Nuklease-„totes“ Cas9) bezeichnet werden. Verfahren zur Erzeugung einer Cas9-Domäne (oder eines Fragments davon) mit einer inaktiven DNA-Spaltungsdomäne sind bekannt (siehe z. B. Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., „Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression“ (2013) Cell. 28;152(5):1173-83, wobei der gesamte Inhalt jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird). Zum Beispiel ist bekannt, dass die DNA-Spaltungsdomäne von Cas9 zwei Subdomänen umfasst, die HNH-Nuklease-Subdomäne und die RuvC1-Subdomäne. Die HNH-Subdomäne spaltet den zur gRNA komplementären Strang, während die RuvC1-Subdomäne den nicht-komplementären Strang spaltet. Mutationen innerhalb dieser Subdomänen können die Nukleaseaktivität von Cas9 abschalten. Zum Beispiel inaktivieren die Mutationen D10A und H840A die Nukleaseaktivität von S. pyogenes-Cas9 vollständig (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). In einigen Ausführungsformen werden Proteine bereitgestellt, die Fragmente von Cas9 umfassen. Zum Beispiel umfasst ein Protein einigen Ausführungsformen eine von zwei Cas9-Domänen: (1) die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9; oder (2) die DNA-Spaltungsdomäne von Cas9. In einigen Ausführungsformen werden Proteine, die Cas9 oder Fragmente davon umfassen, als „Cas9-Varianten“ bezeichnet. Eine Cas9-Variante weist eine Homologie zu Cas9 oder einem Fragment davon auf. Zum Beispiel ist eine Cas9-Variante mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch, mindestens etwa 99,8 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421). In einigen Ausführungsformen kann die Cas9-Variante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 oder mehr Aminosäureänderungen im Vergleich zu Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421) aufweisen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Cas9-Variante ein Fragment aus SEQ ID NO: 1361421 (z. B. eine gRNA-Bindungsdomäne oder eine DNA-Spaltungsdomäne), sodass das Fragment zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99% identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch, oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment von Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421) ist. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment zu mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 %, mindestens 50 %, mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäurelänge eines entsprechenden Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421).
  • Editiermatrize
  • Der Begriff „Editiermatrize“ bezeichnet einen Abschnitt des Verlängerungsarms, der die gewünschte Editierung im einzelsträngigen 3'-DNA-Flap codiert, der von der Polymerase synthetisiert wird, z. B. einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, RNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase). Bestimmte in dieser Schrift beschriebene Ausführungsformen (z. B. 71A) beziehen sich auf „eine RT-Matrize“, die sich sowohl auf die Editiermatrize als auch den Homologiearm zusammen bezieht, d. h. die Sequenz des PEgRNA-Verlängerungsarms, die tatsächlich als Matrize während der DNA-Synthese verwendet wird. Der Begriff „RT-Editiermatrize“ ist auch äquivalent zu dem Begriff „DNA-Synthesematrize“, wobei die RT-Editiermatrize jedoch die Verwendung eines Prime-Editors mit einer Polymerase widerspiegelt, die eine reverse Transkriptase ist, und wobei die DNA-Synthesematrize im weiteren Sinne die Verwendung eines Prime-Editors mit einer beliebigen Polymerase widerspiegelt.
  • Fehleranfällig
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „fehleranfällige“ reverse Transkriptase (oder allgemeiner jede Polymerase) eine reverse Transkriptase (oder allgemeiner jede Polymerase), die natürlich vorkommt oder von einer anderen reversen Transkriptase abgeleitet wurde (z. B. Wildtyp-M-MLV-Reverse-Transkriptase), die eine Fehlerrate aufweist, die geringer als die Fehlerrate der Wildtyp-M-MLV-Reverse-Transkriptase ist. Es heißt, dass die Fehlerrate der Wildtyp-M-MLV-Reverse-Transkriptase im Bereich von einem Fehler bei 15.000 (höher) bis 27.000 (niedriger) liegt. Eine Fehlerrate von 1 bei 15.000 entspricht einer Fehlerrate von 6,7 x 10-5. Eine Fehlerrate von 1 bei 27.000 entspricht einer Fehlerrate von 3,7 × 10-5. Siehe Boutabout et al. (2001) „DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1“, Nucleic Acids Res 29(11): 2217-2222, in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen. Für die Zwecke dieser Anmeldung bezeichnet er Begriff „fehleranfällig“ daher auf diejenigen RT, deren Fehlerrate größer als ein Fehler bei 15.000 Nukleobasen (6,7 x 10-5 oder höher) ist, z. B. 1 Fehler bei 14.000 Nukleobasen (7,14 x 10-5 oder höher), 1 Fehler bei 13.000 Nukleobasen oder weniger (7,7 × 10-5 oder höher), 1 Fehler bei 12.000 Nukleobasen oder weniger (7,7 × 10-5 oder höher), 1 Fehler bei 11.000 Nukleobasen oder weniger (9,1 × 10-5 oder höher), 1 Fehler bei 10.000 Nukleobasen oder weniger (1 × 10-4 oder 0,0001 oder höher), 1 Fehler bei 9.000 Nukleobasen oder weniger (0,00011 oder höher), 1 Fehler bei 8.000 Nukleobasen oder weniger (0.00013 oder höher) 1 Fehler bei 7.000 Nukleobasen oder weniger (0.00014 oder höher), 1 Fehler bei 6.000 Nukleobasen oder weniger (0.00016 oder höher), 1 Fehler bei 5.000 Nukleobasen oder weniger (0.0002 oder höher), 1 Fehler bei 4.000 Nukleobasen oder weniger (0.00025 oder höher), 1 Fehler bei 3.000 Nukleobasen oder weniger (0.00033 oder höher), 1 Fehler bei 2.000 Nukleobasen oder weniger (0.00050 oder höher) oder 1 Fehler bei 1.000 Nukleobasen oder weniger (0,001 oder höher) oder 1 Fehler bei 500 Nukleobasen oder weniger (0,002 oder höher) oder 1 Fehler bei 250 Nukleobasen oder weniger (0,004 oder höher).
  • Verlängerungsarm
  • Der Begriff „Verlängerungsarm“ bezeichnet eine Nukleotidsequenzkomponente einer PEgRNA, die mehrere Funktionen bereitstellt, einschließlich einer Primerbindungsstelle und einer Editiermatrize für die reverse Transkriptase. In einigen Ausführungsformen, z. B. 3D, befindet sich der Verlängerungsarm am 3'-Ende der Leit-RNA. In anderen Ausführungsformen, z. B. 3E, befindet sich der Verlängerungsarm am 5'-Ende der Leit-RNA. In einigen Ausführungsformen beinhaltet der Verlängerungsarm auch einen Homologiearm. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst der Verlängerungsarm die folgenden Komponenten in einer 5'-zu-3'-Richtung: den Homologiearm, die Editiermatrize und die Primerbindungsstelle. Da die Polymerisationsaktivität der reversen Transkriptase in 5'-zu-3'-Richtung verläuft, liegt die bevorzugte Anordnung des Homologiearms, der Editiermatrize und der Primerbindungsstelle in der 5'-zu-3'-Richtung, sodass die reverse Transkriptase, sobald sie durch eine angelagerte Primersequenz geprimt wurde, einen DNA-Einzelstrang unter Verwendung der Editiermatrize als komplementären Matrizenstrang polymerisiert. Weitere Details, wie etwa die Länge des Verlängerungsarms, sind an anderer Stelle in dieser Schrift beschrieben.
  • Der Verlängerungsarm kann auch so beschrieben werden, dass er im Allgemeinen zwei Regionen umfasst: eine Primerbindungsstelle (PBS) und eine DNA-Synthesematrize, wie beispielsweise in 3G (vorstehend) gezeigt. Die Primerbindungsstelle bindet an die Primersequenz, die aus dem endogenen DNA-Strang der Zielstelle gebildet wird, wenn er durch den Prime-Editor-Komplex genickt wird, wodurch ein 3'-Ende auf dem endogenen genickten Strang freigelegt wird.reige Wie in dieser Schrift erläutert, erzeugt die Bindung der Primersequenz an die Primerbindungsstelle am Verlängerungsarm der PEgRNA eine Duplexregion mit einem freigelegten 3'-Ende (d. h. das 3'-Ende der Primersequenz), die dann ein Substrat für eine Polymerase bereitstellt, um damit zu beginnen, einen DNA-Einzelstrang vom freigelegten 3'-Ende entlang der Länge der DNA-Synthesematrize zu polymerisieren. Die Sequenz des einzelsträngigen DNA-Produkts ist das Komplement der DNA-Synthesematrize. Die Polymerisation wird in Richtung des 5'-Endes der DNA-Synthesematrize (oder des Verlängerungsarms) fortgesetzt, bis die Polymerisation beendet ist. Somit stellt die DNA-Synthesematrize den Abschnitt des Verlängerungsarms dar, der durch ddieer Polymerase des Prime-Editor-Komplexes in ein einzelsträngiges DNA-Produkt (d. h. den 3'-einzelsträngigen DNA-Flap, der die gewünschte genetische Editierinformation enthält) codiert wird und der letztendlich den entsprechenden endogenen DNA-Strang der Zielstelle ersetzt, der sich unmittelbar stromabwärts der PE-induzierten Nickstelle befindet. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, setzt sich die Polymerisation der DNA-Synthesematrize zum 5'-Ende des Verlängerungsarms bis zu einem Terminierungsereignis fort. Die Polymerisation kann auf verschiedene Weise terminiert werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, (a) Erreichen eines 5'-Terminus der PEgRNA (z. B. im Fall des 5'-Verlängerungsarms, bei dem die DNA-Polymerase einfach aus der Matrize herausläuft), (b) Erreichen einer unpassierbaren RNA-Sekundärstruktur (z. B. Haarnadel oder Haarnadelschlaufe), oder (c) Erreichen eines Replikationsterminationssignals, z. B. einer spezifischen Nukleotidsequenz, welche die Polymerase blockiert oder hemmt, oder eines topologischen Nukleinsäuresignals, wie etwa Supercoiled DNA oder RNA. Wirksame Menge
  • Der Begriff „wirksame Menge“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet eine Menge eines biologisch aktiven Mittels, die ausreichend ist, um eine gewünschte biologische Reaktion hervorzurufen. Zum Beispiel kann sich in einigen Ausführungsformen eine wirksame Menge eines Prime-Editors auf die Menge des Editors beziehen, die ausreicht, um eine Nukleotidsequenz einer Zielstelle, z. B. ein Genom, zu editieren. In einigen Ausführungsformen kann sich eine wirksame Menge eines in dieser Schrift bereitgestellten Prime-Editors, z. B. eines Fusionsproteins, das eine Nickase-Cas9-Domäne und eine reverse Transkriptase umfasst, auf die Menge des Fusionsproteins beziehen, die ausreicht, um das Editieren einer Zielstelle zu induzieren, die durch das Fusionsprotein speziell gebunden und editiert wird. Für den Fachmann versteht es sich, dass die wirksame Menge eines Mittels, z. B. eines Fusionsproteins, einer Nuklease, eines Hybridproteins, eines Proteindimers, eines Komplexes eines Proteins (oder Proteindimers) und eines Polynukleotids oder eines Polynukleotids in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren variieren kann, wie zum Beispiel von der gewünschten biologischen Reaktion, z. B. von dem spezifischen Allel, Genom oder der spezifischen Zielstelle, das/die zu editieren ist, von der Zelle oder dem Gewebe, das angezielt wird, sowie von dem verwendeten Mittel.
  • Funktionelles Äquivalent
  • Der Begriff „funktionelles Äquivalent“ bezeichnet ein zweites Biomolekül, das der Funktion nach, aber nicht notwendigerweise der Struktur nach einem ersten Biomolekül äquivalent ist. Beispielsweise bezeichnet ein „Cas9-Äquivalent“ ein Protein, das die gleichen oder im Wesentlichen die gleichen Funktionen wie Cas9, jedoch nicht notwendigerweise die gleiche Aminosäuresequenz aufweist. Im Zusammenhang der Offenbarung bezieht sich die Beschreibung durchgehend auf „ein Protein X oder ein funktionelles Äquivalent davon“. In diesem Zusammenhang umfasst ein „funktionelles Äquivalent“ von Protein X jedes Homolog, Paralog, Fragment, jede natürlich vorkommende, konstruierte, mutierte oder synthetische Version von Protein X, die eine äquivalente Funktion trägt.
  • Fusionsprotein
  • Der Begriff „Fusionsprotein“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet ein Hybridpolypeptid, das Proteindomänen von mindestens zwei verschiedenen Proteinen umfasst. Ein Protein kann sich am aminoterminalen (N-terminalen) Abschnitt des Fusionsproteins oder am carboxyterminalen (C-terminalen) Protein befinden, wodurch ein „aminoterminales Fusionsprotein“ bzw. ein „carboxyterminales Fusionsprotein“ gebildet wird. Ein Protein kann verschiedene Domänen umfassen, zum Beispiel eine Nukleinsäure-Bindungsdomäne (z. B. die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9, welche die Bindung des Proteins an eine Zielstelle steuert) und eine Nukleinsäurespaltungsdomäne oder eine katalytische Domäne eines Nukleinsäure-Editierungsproteins. Ein weiteres Beispiel beinhaltet ein Cas9 oder ein Äquivalent davon zu einer reversen Transkriptase. Jedes der in dieser Schrift bereitgestellten Proteine kann durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können die in dieser Schrift bereitgestellten Proteine über rekombinante Proteinexpression und -reinigung hergestellt werden, was besonders für Fusionsproteine geeignet ist, die einen Peptidlinker umfassen. Verfahren zur Expression und Reinigung rekombinanter Proteine sind gut bekannt und beinhalten diejenigen, die von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)) beschrieben werden, dessen gesamter Inhalt durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird.
  • Genprodukt
  • Der Begriff „Genprodukt“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet jedes Produkt, das von einer Nukleinsäuresequenz codiert wird. Dementsprechend kann ein Genprodukt beispielsweise ein primäres Transkript, ein reifes Transkript, ein verarbeitetes Transkript oder ein Protein oder Peptid sein, das von einem Transkript codiert wird. Beispiele für Genprodukte sind dementsprechend mRNAs, rRNAs, tRNAs, Haarnadel-RNAs, microRNAs (miRNAs), shRNAs, siRNAs und Peptide und Proteine, beispielsweise Reporterproteine oder therapeutische Proteine.
  • Interessierendes Gen (Gene of Interest - GOI)
  • Der Begriff „interessierendes Gen“ oder „GOI“ bezeichnet ein Gen, das einteressierendes Biomolekül (z. B. ein Protein oder ein RNA-Molekül) codiert. Einteressierendes Protein kann ein beliebiges intrazelluläres Protein, Membranprotein oder extrazelluläres Protein beinhalten, z. B. ein Kernprotein, einen Transcriptionsfaktor, einen Kernmembrantransporter, eintrazelluläres Organellen-assoziiertes Protein, einen Membranrezeptor, ein katalytisches Protein und Enzym, ein therapeutisches Protein, ein Membranprotein, ein Membrantransportprotein, ein Signaltransduktionsprotein oder ein immunologisches Protein (z. B. ein IgG oder ein anderes Antikörperprotein) usw. Das interessierende Gen kann auch ein RNA-Molekül codieren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA), kurze nukleäre RNA (snRNA), Antisense-RNA, Leit-RNA, microRNA (miRNA), kurze interferierende RNA (siRNA) und zellfreie RNA (cfRNA).
  • Leit-RNA („gRNA“)
  • Wie in dieser Schrift verwendet, ist der Begriff „Leit-RNA“ eine besondere Art von Leitnukleinsäure, die meistens üblicherweise mit einem Cas-Protein eines CRISPR-Cas9 assoziiert ist und die mit Cas9 assoziiert, wodurch das Cas9-Protein zu einer spezifischen Sequenz in einem DNA-Molekül gelenkt wird, das Komplementarität zur Protoraumsequenz der Leit-RNA beinhaltet. Wie an anderer Stelle beschrieben, ist die PEgRNA eine Unterkategorie von Leit-RNA, die ferner einen Verlängerungsarm am 3'- oder 5'-Ende des Leiters umfasst, der es dem Molekül ermöglicht, mit den in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren verwendet zu werden. Der Begriff „Leit-RNA“ umfasst auch die äquivalenten Leitnukleinsäuremoleküle, die sich mit Cas9-Äquivalenten, Homologen, Orthologen oder Paralogen assoziieren, egal ob natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend (z. B. konstruiert oder rekombinant) und die sonst das Cas9-Äquivalent programmieren, um eine spezifische Zielnukleotidsequenz zu lokalisieren. Die Cas9-Äquivalente können andere napDNAbp von jedem Typ von CRISPR-System (z. B. Typ II, V, VI) beinhalten, einschließlich Cpf1 (ein Typ-V-CRISPR-Cas-Systeme), C2c1 (ein Typ-V-CRISPR-Cas-System), C2c2 (ein Typ-VI-CRISPR-Cas-System) und C2c3 (ein TYp-V-CRISPR-Cas-System). Weitere Cas-Äquivalente sind in Makarova et al., „C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector“, Science 2016; 353(6299) beschrieben, dessen Inhalt in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen ist. Beispielhafte Sequenzen und Strukturen von Leit-RNAs sind in dieser Schrift bereitgestellt. Außerdem sind in dieser Schrift Verfahren zum Entwerfen geeigneter Leit-RNA-Sequenzen bereitgestellt. Wie in dieser Schrift verwendet, kann die „Leit-RNA“ auch als „traditionelle Leit-RNA“ bezeichnet werden, um sie mit den modifizierten Formen von Leit-RNA, die als „Prime-Editor-Leit-RNAs“ (oder „PEgRNA“) bezeichnet werden, zu kontrastieren, welche für das Prime-Editing-Verfahren und -Zusammensetzung erfunden wurden, die in dieser Schrift offenbart sind.
  • Leit-RNAs oder PEgRNA können verschiedene Strukturelemente umfassen, die folgende beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein:
  • Spacer-Sequenz - die Sequenz in der Leit-RNA oder PEgRNA (mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 40 (z. B. etwa 10, etwa 15, etwa 20, etwa 25, etwa 30) Nukleotiden), die in der Ziel-DNA an den Protospacer bindet (wie nachstehend in dieser Schrift definiert).
  • gRNA-Kern (oder gRNA-Gerüst- oder Rückgratsequenz) - bezeichnet die Sequenz innerhalb der gRNA, die für die Bindung von napDNAbp (z. B.Cas9) verantwortlich ist, sie beinhaltet nicht die Spacer-/Targeting-Sequenz, die verwendet wird, um das napDNAbp (z. B. Cas9) zur Ziel-DNA zu leiten.
  • Verlängerungsarm - bezeichnet den verlängerten Abschnitt der Leit-RNA entweder am 5'- oder am 3'-Ende, der den Homologiearm, die Editiermatrize und die Primerbindungsstelle umfasst. Diese Komponente wird an anderer Stelle weiter definiert.
  • Homologiearm - bezeichnet einen oder mehrere Abschnitte des Verlängerungsarms, der einen Abschnitt des resultierenden Reverse-Transkriptase-codierten Einzelstrang-DNA-Flaps codiert, der durch Ersetzen des endogenen Strangs in die Ziel-DNA-Stelle integriert werden soll. Der durch den Homologiearm codierte Abschnitt des Einzelstrang-DNA-Flaps ist komplementär zum nicht-editierten Strang der Ziel-DNA-Sequenz, was die Verdrängung des endogenen Strangs und das Anlagern des einzelsträngigen DNA-Flaps an dessen Stelle erleichtert, wodurch die Editierung angebracht wird. Diese Komponente wird an anderer Stelle weiter definiert.
  • Editiermatrize - bezeichnet einen Abschnitt des Verlängerungsarms, der die gewünschte Editierung im Einzelstrang-DNA-Flap codiert, der durch reverse Transkriptase synthetisiert wird. Diese Komponente wird an anderer Stelle weiter definiert.
  • Primerbindungsstelle - bezeichnet einen Abschnitt des Verlängerungsarms, der an die Primersequenz anlagert, die aus einem Strang der Ziel-DNA nach Cas9-vermittelter Nickase-Wirkung darauf gebildet wird. Diese Komponente wird an anderer Stelle weiter definiert.
  • Transkriptionsterminator - die Leit-RNA oder PEgRNA kann eine Transkriptionsterminationssequenz am 3'-Ende des Moleküls umfassen. Typische Transkriptionsterminatorsequenzen (z. B. SEQ ID NOs: 1361560-1361565) sind etwa 70 bis etwa 125 Nukleotide lang, aber es werden kurze und längere Transkriptionsterminatorsequenzen in Betracht gezogen und es können jede im Fachgebiet bekannte verwendet werden.
  • Flap-Endonuklease (z. B. FEN1)
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Flap-Endonuklease“ ein Enzym, das die Entfernung von 5'-Einzelstrang-DNA-Flaps katalysiert. Dies sind natürlich vorkommende Enzyme, welche die Entfernung von 5'-Flaps, die während zellulärer Prozesse, einschließlich der DNA-Replikation, gebildet werden, verarbeiten. Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editing-Verfahren können endogen zugeführte Flap-Endonukleasen oder solche verwenden, die in trans bereitgestellt werden, um den 5'-Flap der endogenen DNA zu entfernen, der an der Zielstelle während des Prime Editings gebildet wird. Flap-Endonukleasen sind in der Technik bekannt und werden in Patel et al., „Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends“, Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 und Tsutakawa et al., „Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily“, Cell, 2011, 145 (2): 198-211, und Balakrishnan et al., „Flap Endonuclease 1“, Annu Rev Biochem, 2013, Vol. 82: 119-138, beschrieben (jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen). Eine beispielhafte Flap-Endonuklease ist FEN1, die durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt werden kann:
    Beschreibung Sequenz SEQ ID NO:
    FEN1 Wildtyp
    Figure DE112020001306T5_0001
    		 SEQ ID NO: 1361542
  • Fusionsprotein
  • Der Begriff „Fusionsprotein“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet ein Hybridpolypeptid, das Proteindomänen von mindestens zwei verschiedenen Proteinen umfasst. Ein Protein kann sich am aminoterminalen (N-terminalen) Abschnitt des Fusionsproteins oder am carboxyterminalen (C-terminalen) Protein befinden, wodurch ein „aminoterminales Fusionsprotein“ bzw. ein „carboxyterminales Fusionsprotein“ gebildet wird. Ein Protein kann verschiedene Domänen umfassen, zum Beispiel eine Nukleinsäure-Bindungsdomäne (z. B. die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9, welche die Bindung des Proteins an eine Zielstelle steuert) und eine Nukleinsäurespaltungsdomäne (z. B. Cas9-Nickase, napDNAbp) oder eine katalytische Domäne eines Nukleinsäure-Editierungsproteins (z. B. RT Domäne). Ein weiteres Beispiel beinhaltet ein napDNAbp (z. B. Cas9) oder ein Äquivalent davon, das an eine reverse Transkriptase fusioniert ist. Jedes der in dieser Schrift bereitgestellten Proteine kann durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können die in dieser Schrift bereitgestellten Proteine über rekombinante Proteinexpression und -reinigung hergestellt werden, was besonders für Fusionsproteine geeignet ist, die einen Peptidlinker umfassen. Verfahren zur Expression und Reinigung rekombinanter Proteine sind gut bekannt und beinhalten diejenigen, die von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)) beschrieben werden, dessen gesamter Inhalt durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird.
  • Homologiearm
  • Der Begriff Homologiearm bezeichnet einen Abschnitt des Verlängerungsarms, der eine Sequzenz des resultierenden Reverse-Transkriptase-codierten Einzelstrang-DNA-Flaps beinhaltet, der durch Ersetzen des endogenen Strangs in die Ziel-DNA-Stelle integriert werden soll. Der durch den Homologiearm codierte Abschnitt des Einzelstrang-DNA-Flaps ist komplementär zum nicht-editierten Strang der Ziel-DNA-Sequenz, was die Verdrängung des endogenen Strangs und das Anlagern des einzelsträngigen DNA-Flaps an dessen Stelle erleichtert, wodurch die Editierung angebracht wird. Diese Komponente wird an anderer Stelle weiter definiert.
  • Wirtszelle
  • Der Begriff „Wirtszelle“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet eine Zelle, die einen in dieser Schrift beschriebenen Vektor versorgen, replizieren und exprimieren kann, z. B. einen Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das ein Fusionsprotein codiert, welches ein napDNAbp oder napDNAbp-Äquivalent (z. B. Cas9 oder Äquivalent) und eine reverse Transkriptase umfasst.
  • Isoliert
  • „Isoliert“ bedeutet verändert oder aus dem natürlichen Zustand entfernt. Beispielsweise ist eine Nukleinsäure 20 oder ein Peptid, das in einem lebenden Tier natürlicherweise vorhanden ist, nicht „isoliert“, aber die gleiche Nukleinsäure oder das gleiche Peptid, die bzw. das teilweise oder vollständig von den koexistierenden Materialien ihres bzw. seines natürlichen Zustands getrennt ist, ist „isoliert“. Eine isolierte Nukleinsäure oder ein isoliertes Protein kann in im Wesentlichen gereinigter Form existieren oder kann in einer nicht-nativen Umgebung, wie beispielsweise einer Wirtszelle, existieren.
  • In einigen Ausführungsformen wird einteressierendes Gen von einer isolierten Nukleinsäure codiert. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „isoliert“ die Eigenschaft eines Materials, wie in dieser Schrift bereitgestellt, aus seiner ursprünglichen oder nativen Umgebung (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlicherweise vorkommt) entfernt zu werden. Daher ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Protein oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, sondern dasselbe Polynukleotid oder Polypeptid, das durch menschliches Eingreifen von einigen oder allen koexistierenden Materialien im natürlichen System abgetrennt wurde, ist isoliert. Ein künstliches oder konstruiertes Material, beispielsweise ein nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäurekonstrukt, wie etwa die in dieser Schrift beschriebenen Expressionskonstrukte und Vektoren, werden dementsprechend auch als isoliert bezeichnet. Ein Material muss nicht gereinigt sein, um isoliert zu sein. Dementsprechend kann ein Material Teil eines Vektors sein und/oder Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch isoliert sein, da ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil der Umgebung ist, in der das Material in der Natur vorkommt.
  • napDNAbp
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „nukleinsäureprogrammierbares DNA-bindendes Protein“ oder „napDNAbp“, wofür Cas9 ein Beispiel ist, Proteine, die RNA:DNA-Hybridisierung verwenden, um spezifische Sequenzen in einem DNA-Molekül anzuzielen und an diese zu binden. Jedes napDNAbp ist mit mindestens einer Leitnukleinsäure (z. B. Leit-RNA) assoziiert, die das napDNAbp an einer DNA-Sequenz lokalisiert, die einen zur Leitnukleinsäure komplementären DNA-Strang (d. h. einen Zielstrang) umfasst, der komplementär zu der Leitnukleinsäure oder einem Abschnitt davon ist (z. B. der Protospacer einer Leit-RNA). Anders ausgedrückt „programmiert“ die Leitnukleinsäure das napDNAbp (z. B. Cas9 oder Äquivalent), um eine komplementäre Sequenz zu lokalisieren und an sie zu binden.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, beinhaltet der Bindungsmechanismus eines napDNAbp - Leit-RNA-Komplexes im Allgemeinen den Schritt der Bildung einer R-Schleife, wobei das napDNAbp das Abwickeln eines doppelsträngigen DNA-Ziels induziert, wodurch die Stränge in der durch das napDNAbp gebundenen Region getrennt werden. Der Leit-RNA-Protospacer hybridisiert dann an den „Zielstrang“. Dadurch wird ein zum Zielstrang komplementärer „Nicht-Zielstrang“ verdrängt, der den Einzelstrangbereich der R-Schleife bildet. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das napDNAbp eine oder mehrere Nukleaseaktivitäten, die dann die DNA schneiden und verschiedene Arten von Läsionen hinterlassen. Zum Beispiel kann das napDNAbp eine Nukleaseaktivität umfassen, die den Nicht-Zielstrang an einer ersten Stelle schneidet und/oder den Zielstrang an einer zweiten Stelle schneidet. Je nach Nukleaseaktivität kann die Ziel-DNA zu einem „Doppelstrangbruch“ geschnitten werden, wobei beide Stränge durchtrennt werden. In anderen Ausführungsformen kann die Ziel-DNA nur an einer einzigen Stelle geschnitten werden, d. h. die DNA wird an einem Strang „genickt“. Beispielhafte napDNAbp mit unterschiedlichen Nukleaseaktivitäten beinhalten „Cas9-Nickase“ („nCas9“) und ein deaktiviertes Cas9 ohne Nukleaseaktivitäten („totes Cas9“ oder „dCas9“). Beispielhafte Sequenzen für diese und andere napDNAbp werden in dieser Schrift bereitgestellt.
  • Linker
  • Der Begriff „Linker“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet ein Molekül, das zwei andere Moleküle oder Einheiten verbindet. Linker sind in der Technik gut bekannt und können jede geeignete Kombination von Nukleinsäuren oder Aminosäuren umfassen, um die sachgemäße Funktion der Strukturen, die sie verbinden, zu erleichtern. Der Linker kann eine Reihe von Aminosäuren sein. Der Linker kann im Fall eines Linkers, der zwei Fusionsproteine verbindet, eine Aminosäuresequenz sein. Zum Beispiel kann ein napDNAbp (z. B. Cas9) durch eine Aminosäurelinkersequenz an eine reverse Transkriptase fusioniert werden. Der Linker kann auch eine Nukleotidsequenz sein, wenn zwei Nukleotidsequenzen miteinander verbunden werden. Im vorliegenden Fall ist beispielsweise die traditionelle Leit-RNA über eine Spacer- oder Linker-Nukleotidsequenz mit der RNA-Verlängerung einer Prime-Editor-Leit-RNA verknüpft, die eine DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) und eine Primerbindungsstelle umfassen kann. In anderen Ausführungsformen ist der Linker ein organisches Molekül, eine organische Gruppe, ein Polymer oder eine chemische Einheit. In einigen Ausführungsformen ist der Linker 5-100 Aminosäuren lang, zum Beispiel 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 oder 150-200 Aminosäuren lang. In einigen Ausführungsformen ist der Linker 5-100 Nukleotide lang, zum Beispiel 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-300, 300-500, 500-1000, 1000-2000 oder 2000-5000 Nukleotide. Längere oder kürzere Linker werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Nickase
  • Der Begriff „Nickase“ bezeichnet ein napDNAbp (z. B. Cas9), bei dem eine der beiden Nukleasedomänen inaktiviert ist. Dieses Enzym ist in der Lage, nur einen Strang einer Ziel-DNA zu spalten.
  • Kernokalisierungssequenz (nuclear localization sequence - NLS)
  • Der Begriff „Kernlokalisierungssequenz“ oder „NLS“ bezeichnet eine Aminosäuresequenz, die den Import eines Proteins in den Zellkern, beispielsweise durch Kerntransport, fördert. Kernokalisierungssequenzen sind im Stand der Technik bekannt und für den Fachmann offensichtlich. NLS-Sequenzen sind beispielsweise in Plank et al., internationale PCT-Anmeldung, PCT/ EP2000/011690 , eingereicht am 23. November 2000, veröffentlicht als WO2001/038547 am 31. Mai 2001 beschrieben, deren Inhalt in diese Schrift wegen ihrer Offenbarung beispielhafter Kernlokalisierungssequenzen durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einigen Ausführungsformen umfasst eine NLS die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ ID NO: 1361531) oder MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (SEQ ID NO: 1361533).
  • Nukleinsäuremolekül
  • Der Begriff „Nukleinsäure“, wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet ein Polymer (d. h. mehrere, mehr als ein (z. B. 2, 3, 4 usw.) Nukleotid. Das Polymer kann natürliche Nukleoside (d. h.Adenosin, Thymidin, Guanosin, Cytidin, Uridin, Desoxyadenosin, Desoxythymidin, Desoxyguanosin und Desoxycytidin), Nukleosidanaloga (z.B. 2-Aminoadenosin, 2-Thiothymidin, Inosinolo, Pyrrolo-Pyrimidin, 3-Methyladenosin, 5-Methylcytidin, C5-Bromouridin, C5-Fluorouridin, C5-Iodouridin, C5-Propynyluridin, C5-Propynylcytidin, C5-Methylcytidin, 7 Deazaadenosin, 7 Deazaguanosin, 8 Oxoadenosin, 8 Oxocyosin, 8 Oxocyosin, O(6)-Methylguanin, 4-Acetylcytidin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uridin, Dihydrouridin, Methylpseudouridin, 1-Methyladenosin, 1-Methylguanosin, N6-Methyladenosin und 2-Thiozytidin), chemisch modifizierte Basen, biologisch modifizierte Basen (z.B. methylierte Basen), interkalierte Basen, modifizierte Zucker (z. B. 2'-Fluorribose, Ribose, 2'-Desoxyribose, 2'-O-Methylcytidin, Arabinose und Hexose) oder modifizierte Phosphatgruppen (z. B. Phosphorothioate und 5' -N-Phosphoramidit-Bindungen) beinhalten.
  • Nukleobasen
  • Wie in dieser Schrift verwendet, handelt es sich bei dem in dieser Schrifft verwendete Begriff „Nukleobase“, auch bekannt als „stickstoffhaltige Base“ oder oft einfach „Base“, um stickstoffhaltige biologische Verbindungen, die Nukleoside bilden, die wiederum Bestandteile von Nukleotiden sind, wobei alle diese Monomere die grundlegenden Bausteine von Nukleinsäuren bilden. Die Fähigkeit von Nukleobasen, Basenpaare zu bilden und aufeinander zu stapeln, führt direkt zu langkettigen helikalen Strukturen wie etwa Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA).
  • Fünf Nukleobasen, Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Thymin (T) und Uracil (U), können als primär oder kanonisch bezeichnet werden. Sie fungieren als grundlegende Einheiten des genetischen Codes, wobei die Basen A, G, C und T in der DNA vorkommen, während A, G, C und U in der RNA zu finden sind. Thymin und Uracil sind identisch, abgesehen davon, dass T eine Methylgruppe enthält, die U fehlt. DNA und RNA können auch modifizierte Nukleobasen enthalten. Beispielsweise können für Adenosin- und Guanosin-Nukleobasen alternative Nukleobasen Hypoxanthin, Xanthin oder 7-Methylguanin beinhalten, die den alternativen Nukleosiden von Inosin, Xanthosin bzw. 7-Methylguanosin entsprechen. Darüber hinaus können beispielsweise Cytosin-, Thymin- oder Uridin-Nukleobasen alternative Nukleobasen 5,6-Dihydrouracil, 5-Methylcytosin oder 5-Hydroxymethylcytosin beinhalten, die den alternativen Nukleosiden von Dihydrouridin, 5-Methylcytidin bzw. 5-Hydroxymethylcytidin entsprechen. Nukleobasen können auch Nukleobasen-Analoga umfassen, von denen eine große Anzahl auf dem Fachgebiet bekannt ist. Typischerweise verleihen die analogen Nukleobasen unter anderem unterschiedliche Basenpaarungs- und Basenstapeleigenschaften. Beispiele sind universelle Basen, die mit allen vier kanonischen Basen paaren können, und Phosphat-Zucker-Rückgrat-Analoga wie etwa PNA, die die Eigenschaften der Kette beeinflussen (PNA kann sogar eine Tripelhelix bilden). Nukleinsäureanaloga werden auch „Xenonukleinsäure“ genannt und stellen eine der tragenden Säulen der Xenobiologie dar, der Gestaltung neuer Lebensformen auf Grundlage alternativer Biochemie. Künstliche Nukleinsäuren beinhalten Peptidnukleinsäure (PNA), Morpholino und gesperrte Nukleinsäure (LNA) sowie Glykolnukleinsäure (GNA) und Threosenukleinsäure (TNA). Jede davon unterscheidet sich von natürlich vorkommender DNA oder RNA durch Veränderungen am Rückgrat des Moleküls. Beispielhafte Analoga sind z. B. 2-Aminoadenosin, 2-Thiothymidin, Inosinolo, Pyrrolo-Pyrimidin, 3-Methyladenosin, 5-Methylcytidin, C5-Bromouridin, C5-Fluorouridin, C5-Iodouridin, C5-Propynyluridin, C5-Propynylcytidin, C5-Methylcytidin, 7 Deazaadenosin, 7 Deazaguanosin, 8 Oxoadenosin, 8 Oxocyosin, O(6)-Methylguanin, 4-Acetylcytidin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uridin, Dihydrouridin, Methylpseudouridin, 1-Methyladenosin, 1-Methylguanosin, N6-Methyladenosin und 2-Thiozytidin), chemisch modifizierte Basen, biologisch modifizierte Basen (z. B. methylierte Basen), interkalierte Basen, modifizierte Zucker (z. B. 2'-Fluorribose, Ribose, 2'-Desoxyribose, 2'-O-Methylcytidin, Arabinose und Hexose) oder modifizierte Phosphatgruppen (z.B. Phosphorothioate und 5' -N-Phosphoramidit-Bindungen).
  • PEgRNA
  • Wie in dieser Schrift verwendet, beziehen sich die Begriffe „Prime-Editor-Leit-RNA“ oder „PEgRNA“ oder „verlängerte Leit-RNA“ auf eine spezialisierte Form einer Leit-RNA, die modifiziert wurde, um eine oder mehrere zusätzliche Sequenzen zur Verwendung in den Prime-Editing-Verfahren, Zusammensetzungen und Systemen, die in dieser Schrift beschrieben sind, zu beinhalten. Wie in dieser Schrift beschrieben, umfasst die Prime-Editor-Leit-RNA eine oder mehrere „verlängerte Regionen“ der Nukleinsäuresequenz. Die verlängerten Regionen können einzelsträngige RNA umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus können die verlängerten Regionen am 3'-Ende einer traditionellen Leit-RNA auftreten. In anderen Anordnungen können die verlängerten Regionen am 5'-Ende einer traditionellen Leit-RNA auftreten. In noch anderen Anordnungen kann die verlängerte Region an einer intramolekularen Region statt an einem der Enden der traditionellen Leit-RNA auftreten, zum Beispiel in der gRNA-Kernregion, mit dem napDNAbp assoziiert wird und/oder bindet an dieses bindet. Die verlängerte Region umfasst eine „Reverse-Transkriptase-Matrizensequenz“, bei der es sich um ein einzelsträngiges RNA-Molekül handelt, das für eine einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) codiert, die wiederum entworfen wurde, um (a) homolog zu der zu editierenden endogenen Ziel-DNA zu sein, und (b) die mindestens eine gewünschte Nukleotidänderung (z. B. Transition, Transversion, Deletion, Insertion oder Kombination davon) umfasst, die in die endogene Ziel-DNA einzuführen oder zu integrieren ist. Die verlängerte Region kann auch andere funktionelle Sequenzelemente umfassen, wie etwa, ohne darauf beschränkt zu sein, eine „Primerbindungsstelle“ und/oder eine „Spacer- oder Linker“-Sequenz. Wie in dieser Schrift verwendet, umfasst die „Primerbindungsstelle“ eine Sequenz, die an eine einzelsträngige DNA-Sequenz mit einem 3'-Ende hybridisiert, die aus der genickten DNA der R-Schleife erzeugt wurde, und die einen Primer für die reverse Transkriptase umfasst.
  • In einigen Ausführungsformen wird die PEgRNA durch 3A dargestellt, die eine PEgRNA mit einem 5'-Verlängerungsarm, einem Spacer und einem gRNA-Kern zeigt. Die 5'-Verlängerung umfasst ferner in die 5'-zu-3'-Richtung eine Reverse-Transkriptase-Matrize, eine Primerbindungsstelle und einen Linker.
  • In einigen Ausführungsformen wird die PEgRNA durch 3B dargestellt, die eine PEgRNA mit einem 3'-Verlängerungsarm, einem Spacer und einem gRNA-Kern zeigt. Die 3'-Verlängerung umfasst ferner in 5'-zu-3'-Richtung eine Reverse-Transkriptase-Matrize, eine Primerbindungsstelle und einen Linker.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird die PEgRNA durch 27 dargestellt, die eine PEgRNA zeigt, die in 5'-zu-3'-Richtung einen Spacer (1), einen gRNA-Kern (2) und einen Verlängerungsarm (3) aufweist. Der Verlängerungsarm (3) befindet sich am 3'-Ende der PEgRNA. Der Verlängerungsarm (3) umfasst ferner in die 5' bis 3'-Richtung eine „Primerbindungsstelle“ (A), eine „Editiermatrize“ (B) und einen „Homologiearm“ (C). Der Verlängerungsarm (3) kann auch eine optionale Modifikatorregion an den 3'- und 5'-Enden umfassen, welche die gleichen Sequenzen oder unterschiedliche Sequenzen sein können. Außerdem kann das 3'-Ende der PEgRNA eine Transkriptionsterminatorsequenz umfassen. Diese Sequenzelemente der PEgRNA werden in dieser Schrift weiter beschrieben und definiert. Außerdem offenbart die Beschreibung beispielhafte PEgRNA, die gemäß den in dieser Schrift offenbarten Verfahren entworfen wurde, in dem beigefügten Sequenzprotokoll.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird die PEgRNA durch 28 dargestellt, die eine PEgRNA zeigt, die in 5'-zu-3'-Richtung einen Verlängerungsarm (3), einen Spacer (1) und einen gRNA-Kern (2) aufweist. Der Verlängerungsarm (3) befindet sich am 5'-Ende der PEgRNA. Der Verlängerungsarm (3) umfasst ferner in die 3' bis 5'-Richtung eine „Primerbindungsstelle“ (A), eine „Editiermatrize“ (B) und einen „Homologiearm“ (C). Der Verlängerungsarm (3) kann auch eine optionale Modifikatorregion an den 3'- und 5'-Enden umfassen, welche die gleichen Sequenzen oder unterschiedliche Sequenzen sein können. Die PEgRNA kann auch eine Transkriptionsterminatorsequenz am 3'-Ende umfassen. Diese Sequenzelemente der PEgRNA werden in dieser Schrift weiter beschrieben und definiert.
  • Peptid-Tag
  • Der Begriff „Peptid-Tag“ bezeichnet eine Peptidaminosäuresequenz, die genetisch an eine Proteinsequenz fusioniert ist, um den Proteinen eine oder mehrere Funktionen zu verleihen, welche die Manipulation des Proteins für verschiedene Zwecke erleichtern, wie etwa Visualisierung, Identifizierung, Lokalisierung, Reinigung, Solubilisierung, Trennung usw. Peptid-Tags können verschiedene Arten von Tags umfassen, die nach Zweck oder Funktion kategorisiert sind, darunter „Affinitäts-Tags“ (um die Proteinreinigung zu erleichtern), „Solubilisierungs-Tags“ (um die richtige Faltung von Proteinen zu unterstützen), „Chromatographie-Tags“ (um chromatographische Eigenschaften von Proteinen zu verändern), „Epitop-Tags“ (um an Antikörper mit hoher Affinität zu binden), „Fluoreszenz-Tags“ (um die Visualisierung von Proteinen in einer Zelle oder in vitro zu erleichtern).
  • PE1
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet „PE1“ einen PE-Komplex, der ein Fusionsprotein umfasst, das Cas9(H840A), und eine Wildtyp-MMLV-RT mit der folgenden Struktur umfasst: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(wt)] + eine gewünschte PEgRNA, wobei die PE-Fusion die Aminosäuresequenz von SEQ ID NOs: 1361515 aufweist, die wie folgt gezeigt ist;
    Figure DE112020001306T5_0002
    Figure DE112020001306T5_0003
    Schlüssel:
    Kernlokalisierungssequenz (NLS) Oben:
    (SEQ ID NO: 1361532), Unten: (SEQ ID NOs: 1361541)
    Cas9(H840A) (SEQ ID NO: 1361454)
    33-Aminosäure-Linker (SEQ ID NO: 1361528)
    Reverse Transkriptase von M-MLV (SEQ ID NO: 1361485).
  • PE2
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet „PE2“ einen PE-Komplex, der ein Fusionsprotein umfasst, das Cas9(H840A), und eine Wildtyp-MMLV-RT mit der folgenden Struktur umfasst: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + eine gewünschte PEgRNA, wobei die PE-Fusion die Aminosäuresequenz von SEQ ID NOs: 1361515 aufweist, die wie folgt gezeigt ist;
    Figure DE112020001306T5_0004
    Figure DE112020001306T5_0005
    Schlüssel:
    Kernlokalisierungssequenz (NLS) Oben: (SEQ ID NO: 1361532), Unten: (SEQ ID NO: 1361541)
    Cas9(H840A) (SEQ ID NO: 1361454)
    33-Aminosäure-Linker (SEQ ID NO: 1361528)
    Reverse Transkriptase von M-MLV (SEQ ID NO: 1361514).
  • PE3
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet „PE3“ PE2 plus eine Zweitstrang-Nicking-Leit-RNA, die mit dem PE2 komplexiert und einen Nick in den nicht-editierten DNA-Strang einführt, um den bevorzugten Austausch des editierten Strangs zu induzieren.
  • PE3b
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet „PE3b“ PE3, wobei jedoch die Zweitstrang-Nicking-Leit-RNA zur temporalen Kontrolle entworfen wurde, sodass der Zweitstrang-Nick erst nach der Anbringung der gewünschten Editierung eingeführt wird. Dies wird erreicht, indem eine gRNA mit einer Spacer-Sequenz entworfen wird, die nur mit dem editierten Strang übereinstimmt, aber nicht mit dem ursprünglichen Allel. Unter Verwendung dieser Strategie, die im Folgenden als PE3b bezeichnet wird, sollten Fehlpaarungen zwischen dem Protospacer und dem nicht-editierten Allel das Nicking durch die sgRNA verhindern, bis das Editierereignis auf dem PAM-Strang stattfindet.
  • PE-kurz
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet „PE-kurz“ ein PE-Konstrukt, das an eine C-terminal verkürzte reverse Transkriptase fusioniert ist und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure DE112020001306T5_0006
    Schlüssel:
    Kernlokalisierungssequenz (NLS) Oben:
    (SEQ ID NOs: 1361532), Unten: (SEQ ID NO: 1361541)
    Cas9 (H840A) (SEQ ID NO: 1361454)
    33-Aminosäure-Linker 1 (SEQ ID NO: 1361528)
    Reverse Transkriptase von M-MLV
    (SEQ ID NO: 1361597)
  • Prozentidentität
  • Die „Prozentidentität“, „Sequenzidentität“, „%-Identität“ oder „%-Sequenzidentität“ (wie sie in dieser Schrift austauschbar verwendet werden können) von Sequenzen (z. B. Nukleinsäure oder Aminosäure) bezeichnet eine quantitative Messung der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen (z. B. Nukleinsäure oder Aminosäure). Die Prozentidentität der genomischen DNA-Sequenz, der Intron- und Exon-Sequenz und der Aminosäuresequenz zwischen Menschen und anderen Spezies variiert je nach Speziestyp, wobei Schimpansen die höchste Prozentidentität mit Menschen aller Spezies in jeder Kategorie aufweisen. Die Prozentidentität kann unter Verwendung der Algorithmen von Karlin und Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modifiziert nach Karlin und Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993, bestimmt werden. Derartige Algorithmen sind in die NBLAST- und XBLAST-Programme (Version 2.0) von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 integriert. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm, Score=50, Wortlänge=3 durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu gewinnen, die zu den interessierenden Proteinmolekülen homolog sind. Wo Lücken zwischen zwei Sequenzen vorliegen, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997, beschrieben. Bei Verwendung von BLAST- und Gapped BLAST-Programmen können die Standardparameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Wird eine Prozentidentität oder ein Bereich davon festgestellt oder angegeben, (z. B.mindestens, mehr als, zwischen, usw.), sind, sofern nicht anders angegeben, die Endpunkte inklusive und der Bereich (z. B. mindestens 70 % Identität) muss alle Bereiche innerhalb des angegebenen Bereichs (z. B. mindestens 71 %, mindestens 72 %, mindestens 73 %, mindestens 74 %, mindestens 75 %, mindestens 76 %, mindestens 77%, mindestens 78%, mindestens 79%, mindestens 80 %, mindestens 81 %, mindestens 82 %, mindestens 83 %, mindestens 84 %, mindestens 85 %, mindestens 86 %, mindestens 87%, mindestens 88 %, mindestens 89%, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 95,5 %, mindestens 96 %, mindestens 96,5 %, mindestens 97 %, mindestens 97,5 %, mindestens 98 %, mindestens 98,5 %, mindetens 99 %, mindestens 99,5 %, mindestens 99,6 %, mindestens 99,7 %, mindestens 99,8 %, mindestens 99,9 % Identität) und alle Inkremente davon (z. B. Zehntelprozent (d. h. 0,1 %), Hundertstelprozent (d. h. 0,01 %), usw.) beinhalten.
  • Prime-Editor
  • Der Begriff „Prime-Editor“ bezeichnet auf die in dieser Schrift beschriebenen Fusionskonstrukte, die ein napDNAbp (z. B. Cas9-Nickase) und eine reverse Transkriptase umfassen, und ist in der Lage, Prime Editing an einer Zielnukleotidsequenz in Gegenwart einer PEgRNA (oder „verlängerten Leit-RNA“) durchzuführen. Der Begriff „Prime-Editor“ kann das Fusionsprotein oder auf das mit einer PEgRNA komplexierte Fusionsprotein bezeichnen. In einigen Ausführungsformen kann der Prime-Editor auch den Komplex bezeichnen, der ein Fusionsprotein (reverse Transkriptase, fusioniert mit einem napDNAbp), eine PEgRNA und eine reguläre Leit-RNA umfasst, die in der Lage ist, den Zweitstellen-Nicking-Schritt des nicht-editierten Strangs wie in dieser Schrift beschrieben zu steuern. In bestimmten Ausführungsformen wird die Reverse-Transkriptase-Komponente des „Prime-Editors“ in trans bereitgestellt.
  • Primerbindungsstelle
  • Der Begriff „Primerbindungsstelle“ oder „die PBS“ bezeichnet die Nukleotidsequenz, die sich auf einer PEgRNA als Bestandteil des Verlängerungsarms (typischerweise am 3'-Ende des Verlängerungsarms) befindet und zur Bindung an die Primersequenz dient das nach napDNAbp (z. B. Cas9)-Nicking der Zielsequenz durch den Prime-Editor gebildet wird. Wie an anderer Stelle beschrieben, wird, wenn die Cas9-Nickase-Komponente eines Prime-Editors einen Strang der Ziel-DNA-Sequenz schneidet, ein 3'-Ende-ssDNA-Flap gebildet, der einer Primersequenz dient, die an die Primerbindungsstelle auf der PEgRNA anlagert, um die reverse Transkription zu primen. 27 und 28 zeigen Ausführungsformen der Primerbindungsstelle, die sich an einem 3'- bzw. 5'-Verlängerungsarm befindet.
  • Protein, Peptid und Polypeptid
  • Die Begriffe „Protein“, „Peptid“ und „Polypeptid“ werden in dieser Schrift austauschbar verwendet und bezeichnen ein Polymer von Aminosäureresten, die durch Peptid-(Amid-)Bindungen miteinander verbunden sind. Die Begriffe bezeichnen ein Protein, Peptid oder Polypeptid jeder Größe, Struktur oder Funktion. Typischerweise ist ein Protein, Peptid oder Polypeptid mindestens drei Aminosäuren lang. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann ein einzelnes Protein oder eine Sammlung von Proteinen bezeichnen. Eine oder mehrere der Aminosäuren in einem Protein, Peptid oder Polypeptid können beispielsweise durch die Zugabe einer chemischen Einheit, wie etwa einer Kohlenhydratgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Famesylgruppe, einer Isofamesylgruppe, einer Fettsäuregruppe, einem Linker zur Konjugation, einer Funktionalisierung oder anderen Modifikation usw. modifiziert werden. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann auch ein einzelnes Molekül oder ein multimolekularer Komplex sein. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann nur ein Fragment eines natürlich vorkommenden Proteins oder Peptids sein. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann natürlich vorkommen, rekombinant oder synthetisch oder eine beliebige Kombination davon sein. Jedes der in dieser Schrift bereitgestellten Proteine kann durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können die in dieser Schrift bereitgestellten Proteine über rekombinante Proteinexpression und -reinigung hergestellt werden, was besonders für Fusionsproteine geeignet ist, die einen Peptidlinker umfassen. Verfahren zur Expression und Reinigung rekombinanter Proteine sind gut bekannt und beinhalten diejenigen, die von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)) beschrieben werden, dessen gesamter Inhalt durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird.
  • Funktionsfähig verknüpft
  • Der Begriff „funktionsfähig verknüpft“, wie er in dieser Schrift verwendet werden kann, bezeichnet eine funktionelle Verknüpfung zwischen einer regulatorischen Sequenz und einer heterologen Nukleinsäuresequenz (z. B. Transgen), die zur Expression der heterologen Nukleinsäuresequenz (z. B. Transgen) führt. Beispielsweise ist eine erste Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz verknüpft, wenn die erste Nukleinsäuresequenz in eine funktionelle Beziehung mit der zweiten Nukleinsäuresequenz gebracht wird. Zum Beispiel ist ein Promotor funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn der Promotor die Transkription oder Expression der codierenden Sequenz beeinflusst. Im Allgemeinen sind funktionsfähig verknüpfte Nukleinsäuresequenzen zusammenhängend und, falls notwendig zum Verbinden von zwei proteincodierenden Regionen, im gleichen Leseraster.
  • Promotor
  • Der Begriff „Promotor“ ist im Fach bekannt und bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die von der zellulären Transkriptionsmaschinerie erkannt wird und die Transkription eines stromabwärts gelegenen Gens initiieren kann. Ein Promotor kann konstitutiv aktiv sein, was bedeutet, dass der Promotor immer in einem gegebenen zellulären Kontext aktiv ist, oder bedingt aktiv, was bedeutet, dass der Promotor nur in Gegenwart einer bestimmten Bedingung aktiv ist. Beispielsweise kann ein bedingter Promotor nur in Gegenwart eines spezifischen Proteins aktiv sein, das ein mit einem regulatorischen Element im Promotor assoziiertes Protein mit der grundlegenden Transkriptionsmaschinerie verbindet, oder nur in Abwesenheit eines inhibitorischen Moleküls. Eine Unterklasse bedingt aktiver Promotoren sind induzierbare Promotoren, die für ihre Aktivität das Vorhandensein eines kleinen Molekül-„Induktors“ erfordern. Beispiele für induzierbare Promotoren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Arabinose-induzierbare Promotoren, Tet-on-Promotoren und Tamoxifen-induzierbare Promotoren. Eine Vielzahl von konstitutiven, bedingten und induzierbaren Promotoren sind dem Fachmann gut bekannt, und der Fachmann wird in der Lage sein, eine Vielzahl solcher Promotoren zu ermitteln, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, die in dieser Hinsicht nicht beschränkt ist.
  • Protospacer-Nachbarmotiv (Protospacer adiacent motif - PAM)
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Protospacer-Nachbarsequenz“ oder „PAM“ eine DNA-Sequenz mit etwa 2-6 Basenpaaren, die eine wichtige Targeting-Komponente einer Cas9-Nuklease ist. Typischerweise befindet sich die PAM-Sequenz auf jedem Strang und liegt stromabwärts in der 5'- nach 3'-Richtung der Cas9-Schnittstelle. Die kanonische PAM-Sequenz (d. h. die PAM-Sequenz, die mit der Cas9-Nuklease von Streptococcus pyogenes oder SpCas9 assoziiert ist) ist 5'-NGG-3', wobei „N“ eine beliebige Nukleobase ist, gefolgt von zwei Guanin („G“)-Nukleobasen. Verschiedene PAM-Sequenzen können mit verschiedenen Cas9-Nukleasen oder äquivalenten Proteinen aus verschiedenen Organismen assoziiert sein, zum Beispiel 5'-NG-3', wobei „N“ eine beliebige Nukleobase ist, gefolgt von einer Guanin-(„G“)-Nukleobasen oder 5'-KKH-3', wobei auf zwei Lysine („K“) ein Histidin („H“) folgt. Außerdem kann jede gegebene Cas9-Nuklease, z. B. SpCas9, modifiziert werden, um die PAM-Spezifität der Nuklease so zu ändern, dass die Nuklease eine alternative PAM-Sequenz erkennt.
  • Unter Bezugnahme auf die kanonische SpCas9-Aminosäuresequenz SEQ ID NOs: 1361421 (SpCas9-M1-QQ99ZW2-Wildtyp) kann die PAM-Sequenz beispielsweise durch Einführen einer oder mehrerer Mutationen modifiziert werden, einschließlich (a) D1135V, R1335Q und T1337R, „die VQR-Variante“, welche die PAM-Spezifität in NGAN oder NGNG ändert, (b) D1135E, R1335Q und T1337R, „die EQR-Variante“, welche die PAM-Spezifität in NGAG ändert, und (c) D1135V, G1218R, R1335E und T1337R, „die VRER-Variante“, welche die PAM-Spezifität in NGCG ändert. Darüber hinaus erkennt die D1135E-Variante des kanonischen SpCas9 noch NGG, ist jedoch im Vergleich zum Wildtyp-SpCas9-Protein selektiver.
  • Es versteht sich auch, dass Cas9-Enzyme aus verschiedenen Bakterienarten (d. h. Cas9-Orthologe) unterschiedliche PAM-Spezifitäten aufweisen können. Zum Beispiel erkennt Cas9 aus Staphylococcus aureus (SaCas9) NGRRT oder NGRRN. Außerdem erkennt Cas9 aus Neisseria meningitis (NmCas) NNNNGATT. In einem anderen Beispiel erkennt Cas9 aus Streptococcus thermophilis (StCas9) NNAGAAW. In noch einem anderen Beispiel erkennt Cas9 von Treponema denticola (TdCas) NAAAAC. Diese Beispiele sollen nicht einschränkend sein. Es versteht sich ferner, dass Nicht-SpCas9 eine Vielzahl von PAM-Sequenzen binden, was sie nützlich macht, wenn keine geeignete SpCas9-PAM-Sequenz an der gewünschten Ziel-Schnittstelle vorhanden ist. Darüber hinaus können Nicht-SpCas9 andere Eigenschaften aufweisen, die sie nützlicher als SpCas9 machen. Cas9 aus Staphylococcus aureus (SaCas9) ist beispielsweise etwa 1 Kilobase kleiner als SpCas9, sodass es in ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV) verpackt werden kann. Es kann ferner auf Shah et al., „Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity“, RNA Biology, 10(5): 891-899 Bezug genommen werden (der in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen ist).
  • Protospacer
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Protospacer“ die Sequenz (~20 bp) in DNA neben der PAM (Protospacer-Nachbarmotiv)-Sequenz, die dieselbe Sequenz wie die Spacer-Sequenz der Leit-RNA aufweist. Die Leit-RNA lagert an das Komplement der Protospacer-Sequenz auf der Ziel-DNA an (insbesondere einen Strang davon, d. h. dem „Zielstrang“ gegenüber dem „Nicht-Zielstrang“ der Zielsequenz) an. Damit Cas9 funktioniert, ist auch ein spezifisches Protospacer-Nachbarmotiv (PAM) erforderlich, das je nach Bakterienart des Cas9-Gens variiert. Die am häufigsten verwendete Cas9-Nuklease, abgeleitet von S. pyogenes, erkennt eine PAM-Sequenz von NGG, die sich direkt stromabwärts der Zielsequenz in der genomischen DNA auf dem Nicht-Zielstrang befindet. Der Fachmann wird erkennen, dass auf den „Protospacer“ in der Literatur des Standes der Technik manchmal als die ~20-ntzielspezifische Leitsequenz auf der Leit-RNA selbst Bezug genommen wird, anstatt sie als „Spacer“ zu bezeichnen. Daher kann der Begriff „Protospacer“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, in einigen Fällen austauschbar mit dem Begriff „Spacer“ verwendet werden. Der Kontext der Beschreibung, die das Auftreten von entweder „Protospacer“ oder „Spacer“ umgibt, hilft dem Leser dabei, nachzuvollziehen, ob der Begriff auf die gRNA oder das DNA-Ziel präzisiert wird. Beide Verwendungen dieser Begriffe sind akzeptabel, da der Stand der Technik beide Begriffe in jeder dieser Weisen verwendet.
  • Reverse Transkriptase
  • Der Begriff „reverse Transkriptase“ beschreibt eine Klasse von Polymerasen, die als RNAabhängige DNA-Polymerasen charakterisiert sind. Alle bekannten reversen Transkriptasen benötigen einen Primer, um ein DNA-Transkript aus einer RNA-Matrize zu synthetisieren. Historisch wurde reverse Transkriptase hauptsächlich verwendet, um mRNA in cDNA zu transkribieren, die dann zur weiteren Manipulation in einen Vektor kloniert werden kann. Die reverse Transkriptase des Vogel-Myoblastosevirus (AMV) war die erste weit verbreitete RNAabhängige DNA-Polymerase (Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1 (1977)). Das Enzym hat 5'-3'-RNA-gerichtete DNA-Polymerase-Aktivität, 5'-3'-DNA-gerichtete DNA-Polymerase-Aktivität und RNase-H-Aktivität. RNase H ist eine prozessive 5'- und 3'-Ribonuklease, die für den RNA-Strang für RNA-DNA-Hybride spezifisch ist (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). Fehler in Transkription können nicht durch reverse Transkriptase korrigiert werden, da bekannten viralen reversen Transkriptasen die zum Korrekturlesen notwendige 3'-5'-Exonukleaseaktivität fehlt (Saunders und Saunders, Microbial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm (1987)). Eine detaillierte Untersuchung der Aktivität der AMV-reversen Transkriptase und ihrer assoziierten RNase-H-Aktivität wurde von Berger et al., Biochemistry 22:2365-2372 (1983) vorgestellt. Eine weitere reverse Transkriptase, die in der Molekularbiologie ausgiebig verwendet wird, ist die reverse Transkriptase, die aus dem Moloney-Maus-Leukämievirus (M-MLV) stammt. Siehe z. B. Gerard, G. R., DNA 5:271-279 (1986) und Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258 (1985). Reverse Transkriptase aus dem M-MLV, der die RNaseH-Aktivität im Wesentlichen fehlt, wurde ebenfalls beschrieben. Siehe z. B. US-Pat. Nr. 5,244,797 . Die Erfindung zieht die Verwendung beliebiger solcher reverser Transkriptasen oder Varianten oder Mutanten davon in Betracht.
  • Außerdem zieht die Erfindung die Verwendung von fehleranfälligen reversen Transkriptasen in Betracht, d. h. die als fehleranfällige reverse Transkriptasen oder reverse Transkriptasen bezeichnet werden können, die den hochpräzisen Einbau von Nukleotiden während der Polymerisation nicht unterstützen. Während der Synthese des einzelsträngigen DNA-Flap basierend auf der RT-Matrize, die in die Leit-RNA integriert ist, kann die fehleranfällige reverse Transkriptase ein oder mehrere Nukleotide einführen, die mit der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) nicht übereinstimmen, wodurch Veränderungen der Nukleotidsequenz durch fehlerhafte Polymerisation des einzelsträngigen DNA-Flaps eingeführt werden. Diese während der Synthese des einzelsträngigen DNA-Flap eingeführten Fehler werden dann durch Hybridisierung an den entsprechenden endogenen Zielstrang, Entfernung des endogen verdrängten Strangs, Ligation und dann durch eine weitere Runde endogener DNA-Reparatur- und/oder - Replikation in das Doppelstrangmolekül integriert
  • Reverse Transkription
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „reverse Transkription“ die Fähigkeit eines Enzyms, DNA-Strang (d. h. komplementäre DNA oder cDNA) unter Verwendung von RNA als Matrize zu synthetisieren. In einigen Ausführungsformen kann die reverse Transkription „fehleranfällige reverse Transkription“ sein, was sich auf die Eigenschaften bestimmter reverser Transkriptase-Enzyme bezieht, die in ihrer DNA-Polymerisationsaktivität fehleranfällig sind.
  • Sense-Strang
  • In der Genetik ist der „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3' verläuft und das zum Antisense-Strang der DNA oder dem Matrizenstrang, der von 3' nach 5' verläuft, komplementär ist. Im Fall eines DNA-Segments, das ein Protein codiert, ist der Sense-Strang der DNA-Strang, der die gleiche Sequenz wie die mRNA aufweist, der den Antisense-Strang während der Transkription als seine Matrize nimmt und schließlich (normalerweise, nicht immer) der Translation in ein Protein unterzogen wird. Der Antisense-Strang ist somit für die RNA verantwortlich, die später zum Protein translatiert wird, während der Sense-Strang einen nahezu identischen Aufbau wie die mRNA besitzt. Es ist zu beachten, dass es für jedes Segment der dsDNA möglicherweise zwei Sätze von Sense und Antisense gibt, je nachdem, aus welcher Richtung man liest (da Sense und Antisense relativ zur Perspektive sind). Letztlich bestimmt das Genprodukt oder die mRNA, welcher Strang eines dsDNA-Segments als Sense oder Antisense bezeichnet wird.
  • Im Zusammenhang mit einer PEgRNA ist der erste Schritt die Synthese einer einzelsträngigen komplementären DNA (d. h. des 3'-ssDNA-Flap, der eingebaut wird), der in 5'zu 3'-Richtung ausgerichtet ist und vom PEgRNA-Verlängerungsarm als Matrize abgenommen wird. Ob der 3'-ssDNA-Flap als Sense- oder Antisense-Strang angesehen werden sollte, hängt von der Transkriptionsrichtung ab, da allgemein akzeptiert wird, dass beide DNA-Stränge als Matrize für die Transkription dienen können (jedoch nicht gleichzeitig). Somit dient in einigen Ausführungsformen der 3'-ssDNA-Flap (der insgesamt in 5'-zu-3'-Richtung verläuft) als Sense-Strang, da er der Codierungsstrang ist. In anderen Ausführungsformen dient der 3'-ssDNA-Flap (der insgesamt in 5'- bis 3'-Richtung verläuft) als Antisense-Strang und damit als Matrize für die Transkription.
  • Zweitstrang-Nicking
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet das Konzept die Einführung eines zweiten Nicks an einer Stelle stromabwärts des ersten Nicks (z. B. der anfänglichem Nickstelle, die das freie 3'-Ende zur Verwendung beim Priming der reversen Transkriptase auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA bereitstellt). In einigen Ausführungsformen befinden sich der erste Nick und der zweite Nick auf gegenüberliegenden Strängen. In anderen Ausführungsformen befinden sich der erste Nick und der zweite Nick auf gegenüberliegenden Strängen. In noch einer anderen Ausführungsform befindet sich der erste Nick auf dem Nicht-Zielstrang (d. h. dem Strang, der den Einzelstrangabschnitt der R-Schleife bildet), und der zweite Nick befindet sich auf dem Zielstrang. Der zweite Nick ist mindestens 5 Nukleotide stromabwärts des ersten Nicks positioniert, oder mindestens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 oder mehr Nukleotide stromabwärts des ersten Nicks. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, induziert der zweite Nick die endogenen DNA-Reparatur- und -Replikationsprozesse der Zelle zum Austausch des nicht-editierten Strangs. In einigen Ausführungsformen ist der editierte Strang der Nicht-Zielstrang und der nicht-editierte Strang ist der Zielstrang. In anderen Ausführungsformen ist der editierte Strang der Zielstrang und der nicht-editierte Strang ist der Nicht-Zielstrang.
  • Spacer-Sequenz
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Spacer-Sequenz“ in Verbindung mit einer Leit-RNA oder einer PEgRNA den Abschnitt der Leit-RNA oder PEgRNA von etwa 10 bis etwa 40 (z. B. etwa 10, etwa 15, etwa 20, etwa 25, etwa 30) Nukleotiden, der eine Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zur Protospacer-Sequenz in der Ziel-DNA-Sequenz ist. Die Spacer-Sequenz lagert an die Protospacer-Sequenz an, um eine ssRNA-/ssDNA-Hybridstruktur an der Zielstelle und eine entsprechende R-Schleifen-ssDNA-Struktur des endogenen DNA-Strangs zu bilden, die zur Protospacer-Sequenz komplementär ist.
  • Subjekt
  • Der Begriff „Subjekt“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet einen individuellen Organismus, beispielsweise ein einzelnes Säugetier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Mensch. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein nicht-menschliches Säugetier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein nicht-menschlicher Primat. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Nagetier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Schaf, eine Ziege, ein Rind, eine Katze oder ein Hund. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Wirbeltier, eine Amphibie, ein Reptil, ein Fisch, einsekt, eine Fliege oder ein Nematode. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Versuchstier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt gentechnisch verändert, z. B. ein gentechnisch verändertes nicht-menschliches Subjekt. Das Subjekt kann beiderlei Geschlechts sein und sich in einem beliebigen Entwicklungsstadium befinden.
  • Zielstelle
  • Der Begriff „Zielstelle“ bezeichnet eine Sequenz innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls, die von einem in dieser Schrift offenbarten Prime-Editor editiert wird. Die Zielstelle bezeichnet ferner die Sequenz innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls, an die ein Komplex aus Baseneditor und gRNA bindet.
  • Temporales Zweitstrang-Nicking
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „temporales Zweitstrang-Nicking“ eine Variante des Zweitstrang-Nicking, wobei die Anbringung des zweiten Nicks in dem nicht-editierten Strang erst erfolgt, nachdem die gewünschte Editierung in dem editierten Strang angebracht wurde. Damit werden gleichzeitige Nicks auf beiden Strängen vermieden, die zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen könnten. Die Zweitstrang-Nicking-Leit-RNA ist zur temporalen Kontrolle entworfen, sodass der Zweitstrang-Nick erst nach der Anbringung der gewünschten Editierung eingeführt wird. Dies wird erreicht, indem eine gRNA mit einer Spacer-Sequenz entworfen wird, die nur mit dem editierten Strang übereinstimmt, aber nicht mit dem ursprünglichen Allel. Unter Verwendung dieser Strategie, die im Folgenden als PE3b bezeichnet wird, sollten Fehlpaarungen zwischen dem Protospacer und dem nicht-editierten Allel das Nicking durch die sgRNA verhindern, bis das Editierereignis auf dem PAM-Strang stattgefunden hat.
  • tPERT
  • Siehe Definition für „Trans-Prime-Editor-RNA-Matritze (tPERT)“.
  • Temporales Zweitstrang-Nicking
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „temporales Zweitstrang-Nicking“ eine Variante des Zweitstrang-Nicking, wobei die Anbringung des zweiten Nicks in dem nicht-editierten Strang erst erfolgt, nachdem die gewünschte Editierung in dem editierten Strang angebracht wurde. Damit werden gleichzeitige Nicks auf beiden Strängen vermieden, die zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen könnten. Die Zweitstrang-Nicking-Leit-RNA ist zur temporalen Kontrolle entworfen, sodass der Zweitstrang-Nick erst nach der Anbringung der gewünschten Editierung eingeführt wird. Dies wird erreicht, indem eine gRNA mit einer Spacer-Sequenz entworfen wird, die nur mit dem editierten Strang übereinstimmt, aber nicht mit dem ursprünglichen Allel. Unter Verwendung dieser Strategie, die im Folgenden als PE3b bezeichnet wird, sollten Fehlpaarungen zwischen dem Protospacer und dem nicht-editierten Allel das Nicking durch die sgRNA verhindern, bis das Editierereignis auf dem PAM-Strang stattgefunden hat.
  • Trans-Prime Editing
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Trans-Prime Editing“ eine modifizierte Form des Prime Editings, die eine getrennte PEgRNA verwendet, d. h. wobei die PEgRNA in zwei separate Moleküle aufgetrennt wird: eine sgRNA und eine trans-Prime-Editing-RNA-Matrize (tPERT). Die sgRNA dient dazu, den Prime-Editor (oder allgemeiner die napDNAbp-Komponente des Prime-Editors) auf die gewünschte genomische Zielstelle zu lenken, während die tPERT von der Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) verwendet wird, um neue eine DNA-Sequenz in den Ziel-Locus zu schreiben, sobald die tPERT in trans durch die Interaktion von Bindungsdomänen, die sich auf dem Prime-Editor und auf der tPERT befinden, zum Prime-Editor rekrutiert wird. In einer Ausführungsform können die Bindungsdomänen RNA-Protein-Rekrutierungseinheiten beinhalten, wie etwa ein MS2-Aptamer, das auf dem tPERT lokalisiert ist, und ein MS2cp-Protein, das mit dem Prime-Editor fusioniert ist. Ein Vorteil des Trans-Prime Editings besteht darin, dass man durch die Trennung der DNA-Synthesematritze von der Leit-RNA potenziell Matritzen mit längerer Länge verwenden kann.
  • Eine Ausführungsform des Trans-Prime Editings ist in 3G und 3H. 3G zeigt links die Zusammensetzung des Trans-Prime-Editor-Komplexes („RP-PE:gRNA Komplex“), der ein napDNAbp umfasst, das jeweils mit einer Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) und einem rPERT-Rekrutierungsprotein (z. B. MS2sc) fusioniert ist und das mit einer Leit-RNA komplexiert ist. 3G zeigt ferner ein separates tPERT-Molekül, das die Verlängerungsarmmerkmale einer PEgRNA umfasst, einschließlich der DNA-Synthesematrize und der Primerbindungssequenz. Das tPERT-Molekül beinhaltet auch eine RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (die in diesem Fall eine Stammschleifenstruktur ist und beispielsweise ein MS2-Aptamer sein kann). Wie in dem in 3H beschriebenen Prozess abgebildet, bindet der RP-PE:gRNA-Komplex bindet an die Ziel-DNA-Sequenz und nickt sie. Dann rekrutiert das rekrutierende Protein (RP) eine tPERT, um an dem an die DNA-Zielstelle gebundenen Prime-Editor-Komplex zu kolokalisieren, wodurch der Primerbindungsstelle ermöglicht wird, an die Primersequenz auf dem geknickten Strang zu binden, und anschließend der Polymerase (z. B. RT) zu ermöglichen, einen DNA-Einzelstrang gegen die DNA-Synthesematrize durch bis zu 5' von der tPERT zu synthetisieren.
  • Während die tPERT in 3G und 3H so gezeigt ist, dass sie die PBS- und DNA-Synthesematrize am 5'-Ende der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne umfasst, kann die tPERT in anderen Konfigurationen mit der PBS- und DNA-Synthesematrize am 3'-Ende der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne entworfen werden. Die tPERT mit der 5'-Verlängerung hat jedoch den Vorteil, dass die Synthese des DNA-Einzelstrangs auf natürliche Weise am 5'-Ende der tPERT endet und somit nicht riskiert wird, dass ein Abschnitt der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne während der DNA-Synthesephase des Prime Editings als Matrize verwendet wird.
  • Trans-Prime-Editor-RNA-Matrize (tPERT)
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet eine „trans-Prime-Editor-RNA-Matrize (tPERT)“ eine Komponente zur Verwendung beim Trans-Prime Editing, einer modifizierten Version des Prime Editings, die durch Auftrennen der PEgRNA in zwei verschiedene Moleküle funktioniert: eine Leit-RNA und ein tPERT-Molekül. Das tPERT-Molekül ist so programmiert, dass es mit dem Prime-Editor-Komplex an einer Ziel-DNA-Stelle kolokalisiert, wodurch die Primerbindungsstelle und die DNA-Synthesematrize in trans zum Prime-Editor gebracht werden. Siehe zum Beispiel 3G für eine Ausführungsform eines Trans-Prime-Editors (tPE), der ein Zweikomponentensystem zeigt, umfassend (1) einen RP-PE:gRNA-Komplex und (2) eine tPERT, welche die Primerbindungsstelle und die DNA-Synthesematrize beinhaltet, die mit einer RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne verbunden ist, wobei die RP-Komponente (Rekrutierungsprotein) des RP-PE:gRNA-Komplexes die tPERT an eine zu editierende Zielstelle rekrutiert, wodurch die PBS- und DNA-Synthesematrize mit dem Prime-Editor in trans assoziiert wird. Anders ausgedrückt ist die tPERT so konstruiert, dass sie den Verlängerungsarm (den gesamten oder einen Teil davon) einer PEgRNA enthält, der die Primerbindungsstelle und die DNA-Synthesematrize beinhaltet.
  • Übergänge
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnen „Übergänge“ den Austausch von Purinnukleobasen (A ↔ G) oder den Austausch von Pyrimidinnukleobasen (C ↔ T). Diese Klasse von Austauschvorgängen betrifft Nukleobasen ähnlicher Form. Die in dieser Schrift offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind in der Lage, einen oder mehrere Übergänge in einem Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Die in dieser Schrift offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind auch in der Lage, sowohl Übergänge als auch Transversionen in demselben Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Diese Änderungen betreffen A ↔ G, G ↔ A, C ↔ T oder T ↔ C. Im Kontext einer doppelsträngigen DNA mit Watson-Crick-gepaarten Nukleobasen beziehen sich Transversionen auf den folgenden Basenpaaraustausch: A:T ↔ G:C, G:G ↔ A:T, C:G ↔ T:A oder T: A ↔ C:G. Die in dieser Schrift offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind in der Lage, einen oder mehrere Übergänge in einem Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Die in dieser Schrift offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind auch in der Lage, sowohl Übergänge als auch Transversionen in demselben Ziel-DNA-Molekül sowie andere Nukleotidänderungen, einschließlich Deletionen und Insertionen, zu induzieren.
  • Transversionen
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnen „Transversionen“ den Austausch von Purinnukleobasen gegen Pyrimidinnukleobasen oder umgekehrt und beinhalten somit den Austausch von Nukleobasen mit unterschiedlicher Form. Diese Änderungen betreffen T ↔ A, T ↔ G, C ↔ G, C ↔ A, A ↔ T, A ↔ C, G ↔ C und G ↔ T. Im Kontext einer doppelsträngigen DNA mit Watson-Crick-gepaarten Nukleobasen beziehen sich Transversionen auf den folgenden Basenpaaraustausch: T:A ↔ A:T, T:A ↔ G:C, CG ↔ G:C, C:G ↔ A:T, A:T ↔ T:A, A:T ↔ C:G, G:C ↔ C:G, and G:C ↔ T:A. Die in dieser Schrift offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind in der Lage, einen oder mehrere Transversionen in einem Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Die in dieser Schrift offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind auch in der Lage, sowohl Übergänge als auch Transversionen in demselben Ziel-DNA-Molekül sowie andere Nukleotidänderungen, einschließlich Deletionen und Insertionen, zu induzieren.
  • Behandlung
  • Die Begriffe „Behandlung“, „Behandlung“ und „Behandlung“ bezeichnen eine klinische Intervention, die darauf abzielt, eine Krankheit oder Erkrankung oder eines oder mehrere ihrer Symptome rückgängig zu machen, zu lindern, zu verzögern oder deren Fortschreiten zu hemmen, wie in dieser Schrift beschrieben. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnen die Begriffe „Behandlung“, „Behandlung“ und „Behandlung“ eine klinische Intervention, die darauf abzielt, eine Krankheit oder Erkrankung oder eines oder mehrere ihrer Symptome rückgängig zu machen, zu lindern, zu verzögern oder deren Fortschreiten zu hemmen, wie in dieser Schrift beschrieben. In einigen Ausführungsformen kann die Behandlung verabreicht werden, nachdem sich ein oder mehrere Symptome entwickelt haben und/oder nachdem eine Krankheit diagnostiziert wurde. In anderen Ausführungsformen kann die Behandlung in Abwesenheit von Symptomen verabreicht werden, z. B. um den Beginn eines Symptoms zu verhindern oder zu verzögern oder den Beginn oder das Fortschreiten einer Krankheit zu hemmen. Zum Beispiel kann eine anfällige Person behandelt werden, bevor die Symptome auftreten (z. B. angesichts vergangener Symptome und/oder angesichts genetischer oder anderer Anfälligkeitsfaktoren). Die Behandlung kann auch nach Abklingen der Symptome fortgesetzt werden, um beispielsweise ein Wiederauftreten zu verhindern oder zu verzögern.
  • Trinukleotid-Repeat-Erkrankungen
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet eine „Trinukleotid-Repeat-Erkrankung“ (oder alternativ „Expansions-Repeat-Erkrankung“ oder „Repeat-Expansions-Erkrankung“) eine Reihe genetischer Störungen, die durch „Trinukleotid-Repeat-Expansion“ verursacht werden, was eine Art von Mutation ist, bei der sich ein bestimmtes Trinukleotid in bestimmten Genen oder Introns wiederholt. Trinukleotid-Wiederholungen galten früher als übliche Iterationen im Genom, aber in den 1990er Jahren wurden diese Erkrankungen geklärt. Diese scheinbar „gutartigen“ DNA-Abschnitte können sich manchmal ausdehnen und Krankheiten verursachen. Erkrankungen, die durch Trinukleotid-Repeat-Expansionen verursacht werden, haben mehrere definierende Merkmale gemein. Erstens zeigen die Mutantenwiederholungen sowohl somatische als auch Keimbahninstabilität und, was noch häufiger vorkommt, dehnen sie sich bei aufeinanderfolgenden Übertragungen aus, anstatt sich zusammenzuziehen. Zweitens korrelieren ein früheres Erkrankungsalter und ein zunehmender Schweregrad des Phänotyps in nachfolgenden Generationen (Antizipation) im Allgemeinen mit einer größeren Wiederholungslänge. Schließlich kann der elterliche Ursprung des Krankheitsallels oft die Antizipation beeinflussen, wobei die Übertragung durch den Vater bei vielen dieser Erkrankungen ein größeres Risiko der Ausbreitung birgt.
  • Es wird angenommen, dass die Triplett-Expansion durch Schlupf während der DNA-Replikation verursacht wird. Aufgrund der repetitiven Natur der DNA-Sequenz in diesen Regionen können sich während der DNA-Replikation „Loop-out“-Strukturen bilden, während die komplementäre Basenpaarung zwischen dem zu synthetisierenden Elternstrang und Tochterstrang aufrechterhalten wird. Wenn die Loop-out-Struktur aus einer Sequenz auf dem Tochterstrang gebildet wird, führt dies zu einer Erhöhung der Anzahl der Wiederholungen. Wenn jedoch die Loop-out-Struktur auf dem Elternstrang gebildet wird, kommt es zu einer Abnahme der Anzahl der Wiederholungen. Es hat den Anschein, dass die Expansion dieser Wiederholungen häufiger vorkommt als die Reduktion. Im Allgemeinen ist es umso wahrscheinlicher, dass sie Krankheiten verursachen oder den Schweregrad der Krankheit erhöhen, je größer die Ausdehnung ist. Diese Eigenschaft führt zu der Eigenschaft der Antizipation, die bei Trinukleotid-Repeat-Erkrankungen beobachtet wird. Antizipation beschreibt die Tendenz, dass das Erkrankungsalter abnimmt und die Schwere der Symptome durch aufeinanderfolgende Generationen einer betroffenen Familie aufgrund der Ausdehnung dieser Wiederholungen zunimmt.
  • Trinukleotid-Repeat-Erkrankungen können solche beinhalten, bei denen die Triplett-Wiederholung in einer nicht-codierenden Region (d. h. einer nicht-codierenden Trinukleotid-Repeat-Erkrankung) oder in einer codierenden Region auftritt.
  • Das in dieser Schrift beschriebene Prime-Editor(PE)-System kann zur Behandlung von Trinukleotid-Repeat-Erkrankungen verwendet werden, die unter anderem das Fragiles-X-Syndrom (FRAXA), Fragiles-XE-MR (FRAXE), Friedrich-Ataxie (FRDA), Myotone Dystrophie (DM), Spinozerebelläre Ataxie von Typ 8 (SCA8) und spinozerebelläre Ataxie von Typ 12 (SCA12) beinhalten können.
  • Prime Editing oder „Prime Editing (PE)“
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Prime Editing“ oder „Prime Editing (PE)“ einen neuen Ansatz zur Gen-Editierung unter Verwendung von napDNAbps und spezialisierten Leit-RNAs, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben und in den Ausführungsformen von 1A-1J beispielhaft dargestellt. TPRT bezeichnet „Target-primed Reverse Transcription“, da das Ziel-DNA-Molekül in einer Ausführungsform dazu verwendet wird, die Synthese eines DNA-Strangs durch reverse Transkriptase (oder eine andere Polymerase) zu primen. In verschiedenen Ausführungsformen funktioniert das Prime Editing durch Kontaktieren eines Ziel-DNA-Moleküls (für das eine Änderung in der Nukleotidsequenz eingeführt werden soll) mit einem Nukleinsäure-programmierbaren DNA-Bindungsprotein (napDNAbp), das mit einer Prime-Editor-Leit-RNA komplexiert ist. Unter Bezugnahme auf 1E umfasst die Prime-Editor-Leit-RNA eine Verlängerung am 3'- oder 5'-Ende der Leit-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA und codiert die gewünschte Nukleotidänderung (z. B. einzelne Nukleotidänderung, Insertion oder Deletion). In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/verlängerte gRNA-Komplex das DNA-Molekül, und die verlängerte gRNA leitet den napDNAbp, um an einen Ziellocus zu binden. In Schritt (b) wird ein Nick in einen der DNA-Stränge der Zielstelle eingeführt (z. B. durch eine Nuklease oder ein chemisches Mittel), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge der Zielstelle erzeugt wird. In einigen Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Schleifenstrang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht an die Leit-RNA-Sequenz hybridisiert ist, d. h. dem „Nichtzielstrang“. Der Nick könnte jedoch in jeden der Stränge eingeführt werden. Das heißt, der Nick könnte in den „Zielstrang“ (d. h. den Strang, der mit dem Spacer der verlängerten gRNA hybridisiert ist) oder den „Nicht-Zielstrang“ (d. h. den Strang, der den einzelsträngigen Abschnitt der R-Schleife bildet und der zum Zielstrang komplementär ist) eingeführt werden. In Schritt (c) interagiert das 3'-Ende des DNA-Strangs (gebildet durch den Nick) mit dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, um die reverse Transkription zu primen (d. h. „Ziel-geprimte RT“). In einigen Ausführungsformen hybridisiert der 3'-Ende-DNA-Strang an eine spezifische Primerbindungsstelle auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, d. h. der „Reverse-Transkriptase-Priming-Sequenz“. In Schritt (d) wird eine reverse Transkriptase eingeführt, die einen DNA-Einzelstrang vom 3'-Ende der geprimten Stelle zum 3'-Ende der Prime-Editor-Leit-RNA synthetisiert. Dies bildet einen einzelsträngigen DNA-Flap, der die gewünschte Nukleotidänderung umfasst (z. B. die einzelne Basenänderung, Insertion oder Deletion oder eine Kombination davon) und der ansonsten homolog zu der endogenen DNA an oder neben der Nickstelle ist. In Schritt (e) werden napDNAbp und Leit-RNA freigesetzt. Schritte (f) und (g) betreffen die Auflösung des einzelsträngigen DNA-Flaps, sodass die gewünschte Nukleotidänderung in die Zielstelle eingebaut wird. Dieser Prozess kann zur gewünschten Produktbildung getrieben werden, indem der entsprechende 5'-endogene DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap eindringt und mit der endogenen DNA-Sequenz hypridisiert. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, lösen die endogenen DNA-Reparatur- und -Replikationsprozesse der Zellen die fehlgepaarte DNA auf, um die Nukleotidänderung(en) einzubauen, um das gewünschte veränderte Produkt zu bilden. Das Verfahren kann auch mit „Zweitstrang-Nicking“ zur Produktbildung getrieben werden, wie beispielhaft in 1D dargestellt. Dieser Prozess kann mindestens eine oder mehrere der folgenden genetischen Veränderungen einführen: Transversionen, Transitionen, Deletionen und Insertionen.
  • Der Begriff „Prime-Editor(PE)-System“ oder „Prime-Editor“ oder „PE-System“ oder „PE-Editing-System“ bezieht sich auf die Zusammensetzungen, die an dem in dieser Schrift beschriebenen Verfahren der Genom-Editierung unter Verwendung von Target-primed Reverse Transcription (TPRT) beteiligt sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, napDNAbps, reverse Transkriptasen, Fusionsproteine (z. B. napDNAbps und reverse Transkriptasen umfassend), Prime-Editor-Leit-RNAs und Komplexe, die Fusionsproteine und Prime-Editor-Leit-RNAs umfassen, sowie akzessorische Elemente, wie z. B. Zweitstrang-Nicking-Komponenten und 5'-endogene DNA-Flap-Entfernungs-Endonukleasen, um dabei zu helfen, den Prime-Editing-Prozess in Richtung der editierten Produktbildung voranzutreiben.
  • Stromaufwärts
  • Wie in dieser Schrift verwendet, sind die Begriffe „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ Relativitätsbegriffe, die die lineare Position von mindestens zwei Elementen definieren, die sich in einem Nukleinsäuremolekül (ob einzel- oder doppelsträngig) befinden, das in einer 5'-zu-3'-Richtung ausgerichtet ist. Insbesondere befindet sich ein erstes Element stromaufwärts eines zweiten Elements in einem Nukleinsäuremolekül, wobei das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 5' zum zweiten Element ist. Beispielsweise befindet sich ein SNP stromaufwärts einer Cas9-induzierten Nickstelle, wenn sich das SNP auf der 5'-Seite der Nickstelle befindet. Umgekehrt befindet sich ein erstes Element stromabwärts eines zweiten Elements in einem Nukleinsäuremolekül, wobei das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 3' zum zweiten Element ist. Beispielsweise befindet sich ein SNP stromabwärts einer Cas9-induzierten Nickstelle, wenn sich der SNP auf der 3'-Seite der Nickstelle befindet. Das Nukleinsäuremolekül kann eine DNA (doppelsträngig oder einzelsträngig), eine RNA (doppel- oder einzelsträngig) oder ein Hybrid aus DNA und RNA sein. Die Analyse ist für einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle und ein doppelsträngiges Molekül gleich, da sich die Begriffe stromaufwärts und stromabwärts nur auf einen Einzelstrang eines Nukleinsäuremoleküls beziehen, mit Ausnahme desssen, dass ausgewählt werden muss, welcher Strang des doppelsträngigen Moleküls in Betracht gezogen wird. Oft ist der Strang einer doppelsträngigen DNA, der zur Bestimmung der Positionsrelativität von mindestens zwei Elementen verwendet werden kann, der „Sense“- oder „Codierungsstrang“. In der Genetik ist der „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3' verläuft und das zum Antisense-Strang der DNA oder dem Matrizenstrang, der von 3' nach 5' verläuft, komplementär ist. So ist beispielsweise eine SNP-Nukleobase „stromabwärts“ einer Promotorsequenz in einer genomischen DNA (die doppelsträngig ist), wenn sich die SNP-Nukleobase auf der 3'-Seite des Promotors auf dem Sense- oder Codierungsstrang befindet.
  • Variante
  • Wie in dieser Schrift verwendet, sollte der Begriff „Variante“ so verstanden werden, dass er Eigenschaften aufweist, die ein Muster aufweisen, das von dem, was in der Natur vorkommt, abweicht, z. B. ist eine Variante von Cas9 ein Cas9, das eine oder mehrere Änderungen in Aminosäureresten im Vergleich zu einer Wildtyp-Cas9-Aminosäuresequenz umfasst. Der Begriff „Variante“ umfasst homologe Proteine, die mindestens 75 % oder mindestens 80 % oder mindestens 85 % oder mindestens 90 % oder mindestens 95 % oder mindestens 99 % Identität mit einer Referenzsequenz aufweisen und die gleiche oder im Wesentlichen gleiche funktionelle Aktivität oder Aktivitäten wie die Referenzsequenz aufweisen. Der Begriff umfasst auch Mutanten, Verkürzungen oder Domänen einer Referenzsequenz, welche die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche funktionelle Aktivität oder Aktivitäten wie die Referenzsequenz aufweisen.
  • Vektor
  • Der Begriff „Vektor“, wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet eine Nukleinsäure, die modifiziert werden kann, um einteressierendes Gen zu codieren, und die in der Lage ist, in eine Wirtszelle einzutreten, innerhalb der Wirtszelle zu mutieren und zu replizieren und dann eine replizierte Form des Vektors in eine andere Wirtszelle zu übertragen. Beispielhafte geeignete Vektoren beinhalten virale Vektoren, wie etwa retrovirale Vektoren oder Bakteriophagen und filamentöse Phagen und konjugative Plasmide. Weitere geeignete Vektoren werden für den Fachmann auf Grundlage der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein.
  • Wildtyp
  • Wie in dieser Schrift verwendet, ist der Begriff „Wildtyp“ ein vom Fachmann verstandener Begriff und bezeichnet die typische Form eines Organismus, Stammes, Gens oder Merkmals, wie es in der Natur vorkommt, im Unterschied zu mutanten oder variantenreichen Formen.
  • Entfernung des 5'-endogenen DNA-Flaps
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Entfernung des 5'-endogenen DNA-Flaps“ oder „5'-Flap-Entfernung“ das Entfernen des 5'-endogenen DNA-Flaps, der sich bildet, wenn der RT-synthetisierte einzelsträngige DNA-Flap kompetitiv eindringt und an die endogene DNA hybridisiert, wobei der endogene Strang verdrängt wird. Das Entfernen dieses endogenen verdrängten Strangs kann die Reaktion zur Bildung des gewünschten Produkts vorantreiben, das die gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Die zelleigenen DNA-Reparaturenzyme können die Entfernung oder Exzision des 5'-endogenen Flaps katalysieren (z. B. eine Flap-Endonuklease wie etwa EXO1 oder FEN1). Außerdem können Wirtszellen transformiert werden, um ein oder mehrere Enzyme zu exprimieren, welche die Entfernung der 5'endogenen Flaps katalysieren, wodurch der Prozess zur Produktbildung (z. B. einer Flap-Endonuklease) vorangetrieben wird. Flap-Endonukleasen sind in der Technik bekannt und werden in Patel et al., „Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends“, Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 und Tsutakawa et al., „Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily“, Cell, 2011, 145 (2): 198-211, (jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen).
  • 5'-endogener DNA-Flap
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „5'-endogener DNA-Flap“ den DNA-Strang, der sich unmittelbar stromabwärts der PE-induzierten Nickstelle in der Ziel-DNA befindet. Das Nicking des Ziel-DNA-Strangs durch PE legt eine 3'-Hydroxylgruppe an der stromaufwärts gelegenen Seite der Nickstelle und eine 5'-Hydroxylgruppe an der stromabwärts gelegenen Seite der Nickstelle frei. Der endogene Strang, der in der 3'-Hydroxylgruppe endet, wird verwendet, um die DNA-Polymerase des Prime-Editors zu primen (wobei z. B. die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase ist). Der endogene Strang auf der stromabwärts gelegenen Seite der Nickstelle, der mit der freigelegten 5'-Hydroxylgruppe beginnt, wird als „5'-endogener DNA-Flap“ bezeichnet und schließlich entfernt und durch den neu synthetisierten Ersatzstrang (d. h. den „3'-Ersatz-DNA-Flap“), der durch die Verlängerung der PEgRNA codiert wird, ersetzt.
  • 3'-DNA-Ersatz-Flap
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „3'-Ersatz-DNA-Flap“ oder einfach „Ersatz-DNA-Flap“ den DNA-Strang, der vom Prime-Editor synthetisiert wird und der vom Verlängerungsarm der Prime-Editor-PEgRNA codiert wird. Insbesondere wird der 3'-Ersatz-DNA-Flap von der Polymerase-Matrize der PEgRNA codiert. Der 3'-Ersatz-DNA-Flap umfasst die gleiche Sequenz wie der 5'-endogene DNA-Flap, mit Ausnahme dessen, dass er auch die editierte Sequenz enthält (z. B. Einzelnukleotidänderung). Der 3'-Ersatz-DNA-Flap lagert an die Ziel-DNA an, wobei er den 5'-endogenen DNA-Flap verdrängt oder ersetzt (der beispielsweise durch eine 5'-Flap-Endonuklease, wie etwa FEN1 oder EXO1 herausgeschnitten werden kann) und wird dann gebunden, um sich mit dem 3'-Ende des 3'-Ersatz-DNA-Flaps zum freigelegten 5'-Hydroxyl-Ende der endogenen DNA zu verbinden (freigelegt nach Exzision des 5'-endogenen DNA-Flaps, wodurch sich eine Phosphodiesterbindung zurückgebildet und der 3'-Ersatz-DNA-Flap angebracht wird, um eine Heteroduplex-DNA mit einem editierten Strang und einem nicht-editierten Strang zu bilden. DNA-Reparaturprozesse lösen den Heteroduplex auf, indem sie die Informationen im editierten Strang auf den komplementären Strang kopieren und die Editierung dauerhaft in der DNA anbringen. Dieser Auflösungsprozess kann durch Nicking des nicht-editierten Strangs, d. h. durch „Zweitstrang-Nicking“, wie in dieser Schrift beschrieben, weiter zur Vollendung getrieben werden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BESTIMMTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung offenbart neue Zusammensetzungen (z. B. neue PEgRNA und PE-Komplexe, die diese umfassen) und Verfahren zur Verwendung von Prime Editing (PE) zur Reparatur therapeutischer Ziele, z. B. der in der ClinVar-Datenbank identifizierten Ziele, unter Verwendung von PEgRNA, die unter Verwendung eines spezialisierten, in dieser Schrift beschriebenen Algorithmus entwickelt wurde. Somit offenbart die vorliegende Anmeldung einen Algorithmus zum Vorhersagen der Sequenzen für PEgRNA im großen Maßstab, die dazu verwendet werden können, therapeutische Ziele zu reparieren (z. B. diejenigen, die in der ClinVar-Datenbank enthalten sind). Außerdem offenbart die vorliegende Anmeldung vorhergesagte Sequenzen für therapeutische PEgRNA, die unter Verwendung des offenbarten Algorithmus entwickelt wurden und die mit Prime Editing verwendet werden können, um therapeutische Ziele zu reparieren.
  • Der in dieser Schrift offenbarte Algorithmus und die vorhergesagten PEgRNA-Sequenzen betreffen im Allgemeinen das Prime Editing. Somit liefert diese Offenbarung auch eine Beschreibung für die verschiedenen Komponenten und Aspekte des Prime Editing, einschließlich geeigneter napDNAbp (z. B. Cas9-Nickase) und reverse Transkriptasen sowie anderer geeigneter Komponenten (z. B. Linker, NLS) und PE-Fusionsproteine, die mit der in dieser Schrift offenbarten therapeutischen PEgRNA verwendet werden können.
  • Die Einführung des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-Systems zur Genom-Editierung hat die Biowissenschaften revolutioniert1-3. Obwohl die Gendisruption mit CRISPR mittlerweile Routine ist, bleibt die präzise Anbringung einzelner Nukleotid-Editierungen eine große Herausforderung, obwohl sie für die Erforschung oder Korrektur einer großen Anzahl von krankheitsverursachenden Mutationen erforderlich ist. Homology Directed Repair (HDR) ist in der Lage, solche Editierungen zu erzielen, leidet jedoch unter geringer Effizienz (oft < 5 %), eine Anforderung für Spender-DNA-Reparaturmatrizen, sowie unter schädlichen Wirkungen bei der Bildung von doppelsträngigen DNA-Brüchen (DSB). Vor Kurzem hat das Labor von Prof. David Liu et al. Baseneditierung entwickelt, die ein effizientes Editieren einzelner Nukleotide ohne DSBs ermöglicht. Baseneditoren (BEs) kombinieren das CRISPR-System mit basenmodifizierenden Deaminaseenzymen, um jeweils Ziel-C•G oder A•T-Basenpaare in A•T oder G•C umzuwandeln4-6. Obwohl unter Forschern weltweit bereits weit verbreitet, ermöglichen aktuelle BEs nur vier der zwölf möglichen Basenpaarumwandlungen und sind nicht in der Lage, kleine Insertionen oder Deletionen zu korrigieren. Darüber hinaus ist der Targeting-Umfang der Baseneditierung durch das Editieren von Nicht-Ziel-C- oder A-Basen neben der Zielbase („Bystander-Editierung“) und durch die Anforderung, dass eine PAM-Sequenz 15 ± 2 bp von der Zielbase entfernt existieren muss, begrenzt. Die Überwindung dieser Beschränkungen würde daher die Grundlagenforschung und die therapeutischen Anwendungen der Genom-Editierung erheblich erweitern.
  • Die vorliegende Offenbarung schlägt einen neuen Ansatz zur Präzisionseditierung vor, der viele der Vorteile der Baseneditierung bietet - nämlich Vermeidung von Doppelstrangbrüchen und Spender-DNA-Reparaturmatrizen- und gleichzeitig ihre größten Beschränkungen überwindet. Der in dieser Schrift beschriebene vorgeschlagene Ansatz erreicht die direkte Anbringung von editierten DNA-Strängen an genomischen Zielstellen unter Verwendung von Target-primed Reverse Transcription (TPRT). In dem in dieser Schrift diskutierten Design wird die CRISPR-Leit-RNA (gRNA) so konstruiert, dass sie eine Reverse-Transkriptase-(RT)-Matrizensequenz trägt, die für eine einzelsträngige DNA codiert, die eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Die CRISPR-Nuklease- (Cas9-) genickte Zielstellen-DNA dient als Primer für die reverse Transkription der Matrizensequenz auf der modifizierten gRNA, was den direkten Einbau jeder gewünschten Nukleotid-Editierung ermöglicht.
  • Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung teilweise die Entdeckung, dass der Mechanismus der Target-Primed Reverse Transcription (TPRT) zur Durchführung von präziser CRISPR/Cas-basierter Genom-Editierung mit hoher Effizienz und genetischer Flexibilität (z. B. wie in verschiedenen Ausführungsformen von 1A-1G dargestellt) genutzt oder angepasst werden kann. Die Erfinder haben in dieser Schrift vorgeschlagen, napDNAbp-Polymerase-Fusionen (z. B. Cas9-Nickase, fusioniert mit einer reversen Transkriptase) zu verwenden, um eine spezifische DNA-Sequenz mit einer modifizierten Leit-RNA („eine verlängerte Leit-RNA“ oder PEgRNA) anzuzielen, um einen Einzelstrang-Nick an der Zielstelle zu erzeugen und die genickte DNA als Primer zur Synthese von DNA durch eine Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) basierend auf einer DNA-Synthesematrize, die eine Komponente der PEgRNA ist, zu verwenden Der neu synthetisierte Strang wäre homolog zu der genomischen Zielsequenz, mit Ausnahme des Einschlusses einer gewünschten Nukleotidänderung (z. B. einer einzelnen Nukleotidänderung, einer Deletion oder einer Insertion oder einer Kombination davon). Der neu synthetisierte DNA-Strang kann als einzelsträngiger DNA-Flap bezeichnet werden, der mit dem komplementären homologen endogenen DNA-Strang um die Hybridisierung konkurrieren würde, wodurch der entsprechende endogene Strang verdrängt würde. Die Auflösung dieses hybridisierten Zwischenprodukts kann die Entfernung des resultierenden verdrängten Flaps der endogenen DNA (z. B. mit einer 5'-Ende-DNA-Flap-Endonuklease, FEN1), die Ligation des synthetisierten einzelsträngigen DNA-Flaps an die Ziel-DNA und die Assimilation der gewünschten Nukleotidänderung infolge von zellulären DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsprozessen beinhalten. Da die DNA-Synthese mit Matrize Einzelnukleotidpräzision bietet, ist der Anwendungsbereich dieses Ansatzes sehr breit und könnte absehbar für unzählige Anwendungen in Grundlagenforschung und Therapie verwendet werden.
  • I. Therapeutische PEgRNAs
  • Das in dieser Schrift beschriebene Prime-Editor(PE)-System zieht die Verwendung jeder geeigneten Prime-Editor-Leit-RNA oder PEgRNA in Betracht. Die Erfinder haben entdeckt, dass der Mechanismus der Target-Primed Reverse Transcription (TPRT) für eine präzise und vielseitige Durchführung der CRISPR/Cas-basierten Genom-Editierung durch die Verwendung einer speziell konfigurierten Leit-RNA, die eine DNA-Synthesematrize umfasst, die für die gewünschte Nukleotidänderung durch eine Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) codiert, genutzt oder angepasst werden kann. In der Anwendung wird diese speziell konfigurierte Leit-RNA als „Prime-Editor-Leit-RNA“ (oder PEgRNA) bezeichnet, da die DNA-Synthesematrize als Verlängerung eines Standard- oder traditionellen Leit-RNA-Moleküls bereitgestellt werden kann. Die Anmeldung zieht jede geeignete Konfiguration oder Anordnung für die Prime-Editor-Leit-RNA in Betracht.
  • In verschiedenen Ausführungsformen stellt die Offenbarung therapeutische PEgRNA der SEQ ID NOs: 1-135514 und 813085-880462 bereit, die unter Verwendung des in dieser Schrift offenbarten Algorithmus gegen ClinVar-Datenbankeinträge entworfen wurde.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen sind beispielhafte PEgRNA, die gegen die ClinVar-Datenbank unter Verwendung des in dieser Schrift offenbarten Algorithmus entworfen wurde, in dem Sequenzprotokoll beinhaltet, die einen Teil dieser Beschreibung bildet. Das Sequenzprotokoll beinhaltet vollständige PEgRNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 1-135514 und 813085-880462. Jede dieser vollständigen PEgRNA besteht jeweils aus einem Spacer (SEQ ID NOs: 135515-271028 und 880463-947840) und einem Verlängerungsarm (SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218). Außerdem umfasst jede PEgRNA einen gRNA-Kern, beispielsweise wie durch SEQ ID NOs: 1361579-1361580 definiert. Die Verlängerungsarme der SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218 bestehen weiterhin jeweils aus einer Primerbindungsstelle (SEQ ID NOs: 406543-542056 und 1015219-1082596), einer Editiermatrize (SEQ ID NOs: 542057-677570 und 1082597-1149974) und einem Homologiearm (SEQ ID NOs: 677571-813084 und 1149975-1217352). Die PEgRNA kann optional eine 5'-Endmodifikatorregion und/oder eine 3'-Endmodifiziererregion umfassen. Die PEgRNA kann auch ein Reverse-Transkriptions-Terminationssignal (z. B. SEQ ID NOs: 1361560-1361566) am 3'-Ende von der PEgRNA umfassen. Die Anwendung umfasst den Entwurf und die Verwendung all dieser Sequenzen.
  • 3A zeigt eine Ausführungsform einer Prime-Editor-Leit-RNA (entweder als „PEgRNA“ oder als „verlängerte gRNA“ bezeichnet), die in dem in dieser Schrift offenbarten Prime-Editor(PE)-System verwendbar ist, wobei eine traditionelle Leit-RNA (der grüne Abschnitt) einen Spacer und eine gRNA-Kernregion beinhaltet, die mit dem napDNAbp bindet. In dieser Ausführungsform beinhaltet die Leit-RNA ein verlängertes RNA-Segment am 5'-Ende, d. h. eine 5'-Verlängerung. In dieser Ausführungsform beinhaltet die 5'-Verlängerung eine DNA-Synthesematrize, eine Primerbindungsstelle und eine optionale 5-20-Nukleotid-Linkersequenz. Wie in 1A gezeigt, hybridisiert die Primerbindungsstelle mit dem freien 3'-Ende, das nach der Bildung eines Nicks im Nicht-Zielstrang der R-Schleife gebildet wird, wodurch die Polymerase (z. B. Reverse Transkriptase) für die DNA-Polymerisation in der 5'-zu- 3'-Richtung geprimt wird.
  • 3B zeigt eine weitere Ausführungsform einer Prime-Editor-Leit-RNA, die in dem in dieser Schrift offenbarten Prime-Editor(PE)-System verwendbar ist, wobei eine traditionelle Leit-RNA (der grüne Abschnitt) einen ~20 nt-Spacer und einen gRNA-Kern, der mit dem napDNAbp bindet, beinhaltet. In dieser Ausführungsform beinhaltet die Leit-RNA ein verlängertes RNA-Segment am 3'-Ende, d. h. eine 3'-Verlängerung. In dieser Ausführungsform beinhaltet die 3'-Verlängerung eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle. Wie in 1B gezeigt, hybridisiert die Primerbindungsstelle mit dem freien 3'-Ende, das nach der Bildung eines Nicks im Nicht-Zielstrang der R-Schleife gebildet wird, wodurch die Polymerase für die DNA-Polymerisation in der 5'-zu- 3'-Richtung geprimt wird.
  • 3C zeigt eine weitere Ausführungsform einer verlängerten Leit-RNA, die in dem in dieser Schrift offenbarten Prime-Editor(PE)-System verwendbar ist, wobei eine traditionelle Leit-RNA (der grüne Abschnitt) einen ~20 nt-Spacer und einen gRNA-Kern, der mit dem napDNAbp bindet, beinhaltet. In dieser Ausführungsform beinhaltet die Leit-RNA ein verlängertes RNA-Segment an einer intermolekularen Position innerhalb des gRNA-Kerns, d. h. eine intramolekulare Verlängerung. In dieser Ausführungsform beinhaltet die intramolekuläre Verlängerung eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle.hybridisiert Die Primerbindungsstelle hybridisiert mit dem freien 3'-Ende, das nach der Bildung eines Nicks im Nicht-Zielstrang der R-Schleife gebildet wird, wodurch die Polymerase für die DNA-Polymerisation in der 5'-zu- 3'-Richtung geprimt wird.
  • In einer Ausführungsform ist die Position der intramolekularen RNA-Verlängerung in dem Spacer der Leit-RNA. In einer anderen Ausführungsform befindet sich die Position der intramolekularen RNA-Verlängerung im gRNA-Kern. In noch einer anderen Ausführungsform befindet sich die Position der intramolekularen RNA-Verlängerung irgendwo innerhalb des Leit-RNA-Moleküls, nur nicht innerhalb des Spacers oder an einer Position, die den Spacer beeinträchtigt.
  • In einer Ausführungsform wird die intramolekulare RNA-Verlängerung stromabwärts vom 3'-Ende des Spacers eingefügt. In einer anderen Ausführungsform wird die intramolekulare RNA-Extension mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide stromabwärts des 3'-Endes des Spacers eingefügt.
  • In anderen Ausführungsformen wird die intramolekulare RNA-Verlängerung in die gRNA eingefügt, was sich auf den Abschnitt der Leit-RNA bezieht, welcher der tracrRNA entspricht oder diese umfasst, die das Cas9-Protein oder ein Äquivalent davon (d. h. ein anderes napDNAbp) bindet und/oder damit interagiert. Vorzugsweise beeinträchtigt die Einführung der intramolekularen RNA-Extension die Interaktion zwischen dem tracrRNA-Abschnitt und dem napDNAbp nicht oder nur minimal.
  • Die Länge der RNA-Verlängerung kann jede nützliche Länge sein. In verschiedenen Ausführungsformen ist die RNA-Verlängerung mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • Die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) kann auch jede geeignete Länge haben. Zum Beispiel kann die DNA-Synthesematrize (z. B. die RT-Matrizensequenz) mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang sein.
  • In noch anderen Ausführungsformen ist die Sequenz der reversen Transkriptions-Primerbindungsstelle mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 beträgt Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang.
  • In anderen Ausführungsformen ist der optionale Linker oder Spacer mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide oder mindestens 400 Nukleotide lang.
  • Die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) codiert in einigen Ausführungsformen ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das homolog zu dem Nicht-Zielstrang (und somit komplementär zur entsprechenden Stelle des Zielstrangs) ist, jedoch eine oder mehrere Nukleotidänderungen beinhaltet. Die Nukleotidänderung kann eine oder mehrere Einzelbasen-Nukleotidänderungen, eine oder mehrere Deletionen, eine oder mehrere Insertionen und Kombinationen davon umfassen.
  • Wie in 1E abgebildet, ist das synthetisierte einzelsträngige DNA-Produkt der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) homolog zu dem Nicht-Zielstrang und enthält eine oder mehrere Nukleotidänderungen. Das einzelsträngige DNA-Produkt der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) hybridisiert im Gleichgewicht mit der komplementären Zielstrangsequenz, wodurch die homologe endogene Zielstrangsequenz verdrängt wird. Der verdrängte endogene Strang kann in einigen Ausführungsformen als eine 5'-endogene DNA-Flap-Spezies bezeichnet werden (siehe z. B. 1C). Diese 5'-endogene DNA-Flap-Spezies kann durch eine 5'-Flap-Endonuklease (z. B. FEN1) entfernt werden und das einzelsträngige DNA-Produkt, das nun mit dem endogenen Zielstrang hybridisiert ist, kann ligiert werden, wodurch eine Fehlpaarung zwischen der endogenen Sequenz und dem neu synthetisierten Strang entsteht. Die Fehlpaarung kann durch die angeborenen DNA-Reparatur- und/oder -Replikationsprozesse der Zelle aufgelöst werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen entspricht die Nukleotidsequenz der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) der Nukleotidsequenz des Nicht-Zielstrangs, der als 5'-Flap-Spezies verdrängt wird und die mit der zu editierenden Stelle überlappt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der Prime-Editor-Leit-RNAs kann die DNA-Synthesematrize einen einzelsträngigen DNA-Flap codieren, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist, wobei die Einzelstrang-DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Der einzelsträngige DNA-Flap kann eine endogene einzelsträngige DNA an der Nickstelle verdrängen. Die verdrängte endogene Einzelstrang-DNA an der Nickstelle kann ein 5'-Ende aufweisen und einen endogenen Flap bilden, der von der Zelle ausgeschnitten werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Ausschneidung des endogenen 5'-Ende-Flaps dazu beitragen, die Produktbildung voranzutreiben, da das Entfernen des endogenen 5'-Ende-Flaps die Hybridisierung des einzelsträngigen 3'-DNA-Flaps an den entsprechenden komplementären DNA-Strang und den Einbau oder die Assimilation der gewünschten Nukleotidänderung, die durch den einzelsträngigen 3'-DNA-Flap in die Ziel-DNA ausgeführt wird, fördert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der Prime-Editor-Leit-RNAs führt die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap zur Anbringung der gewünschten Nukleotidänderung, wodurch ein gewünschtes Produkt gebildet wird.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in einem Editierfenster angebracht, das zwischen etwa -5 bis +5 der Nickstelle oder zwischen etwa -10 bis +10 der Nickstelle oder zwischen etwa -20 bis +20 der Nickstelle oder zwischen etwa -30 bis +30 der Nickstelle oder zwischen etwa -40 bis + 40 der Nickstelle oder zwischen etwa -50 bis +50 der Nickstelle oder zwischen etwa -60 bis +60 der Nickstelle oder zwischen etwa -70 bis +70 der Nickstelle oder zwischen etwa -80 bis +80 der Nickstelle oder zwischen etwa -90 bis +90 der Nickstelle oder zwischen etwa -100 bis +100 der Nickstelle oder zwischen etwa -200 bis +200 der Nickstelle liegt.
  • In verschiedenen Aspekten sind die Leit-RNAs des Prime-Editors modifizierte Versionen einer Leit-RNA. Leit-RNAs können natürlich vorkommen, von einer codierenden Nukleinsäure exprimiert oder chemisch synthetisiert werden. Verfahren zum Erhalten oder anderweitigen Synthetisieren von Leit-RNAs und zum Bestimmen der geeigneten Sequenz der Leit-RNA, einschließlich des Spacers, der mit dem Zielstrang einer interessierenden genomischen Zielstelle interagiert und hybridisiert, sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen hängen die besonderen Gestaltungsaspekte einer Leit-RNA-Sequenz von der Nukleotidsequenz einer interessierenden genomischen Zielstelle (d. h. der gewünschten zu editierenden Stelle) und der Art des napDNAbp (z. B. Cas9-Protein) ab, die dem in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-System vorhanden ist, neben anderen Faktoren, wie etwa PAM-Sequenzpositionen, Prozentanteil des G/C-Inhalts in der Zielsequenz, dem Ausmaß der Mikrohomologieregionen, Sekundärstrukturen usw.
  • Im Allgemeinen ist eine Leitsequenz jede Polynukleotidsequenz, die eine ausreichende Komplementarität aufweist, mit einer Ziel-Polynukleotidsequenz, um mit der Zielsequenz zu hybridisieren und die sequenzspezifische Bindung eines napDNAbp (z. B. eines Cas9, Cas9-Homologs oder einer Cas9-Variante) an die Zielsequenz zu lenken. In einigen Ausführungsformen beträgt der Komplementaritätsgrad zwischen einer Leitsequenz und ihrer entsprechenden Zielsequenz bei optimaler Ausrichtung unter Verwendung eines geeigneten Ausrichtungsalgorithmus etwa oder mehr als etwa 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 % oder mehr. Die optimale Ausrichtung kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Algorithmus zum Ausrichten von Sequenzen bestimmt werden, wobei nicht einschränkende Beispiele den Smith-Waterman-Algorithmus, den Needleman-Wunsch-Algorithmus, Algorithmen basierend auf der Burrows-Wheeler-Transformation (z. B. dem Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Kalifornien), SOAP (erhältlich unter Seife.genomics.org.cn) und Maq (erhältlich unter maq.sourceforge.net) beinhalten. In einigen Ausführungsformen ist eine Leitsequenz etwa oder mehr als etwa 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23', 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 oder mehr Nukleotide lang.
  • In einigen Ausführungsformen ist eine Leitsequenz weniger als etwa 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 oder weniger Nukleotiden lang. Die Fähigkeit einer Leitsequenz, die sequenzspezifische Bindung eines Baseneditors an eine Zielsequenz zu lenken, kann durch jeden geeigneten Assay ausgewertet werden. Beispielsweise können die Komponenten eines Baseneditors, einschließlich der zu testenden Leitsequenz, einer Wirtszelle mit der entsprechenden Zielsequenz bereitgestellt werden, beispielsweise durch Transfektion mit Vektoren, welche die Komponenten eines in dieser Schrift offenbarten Baseneditors Codieren, gefolgt von einer Beurteilung der bevorzugten Spaltung innerhalb der Zielsequenz, wie etwa mittels Surveyor-Assay, wie in dieser Schrift beschrieben. In ähnlicher Weise kann die Spaltung einer Zielpolynukleotidsequenz in einem Reagenzglas ausgewertet werden, indem die Zielsequenz, Komponenten eines Baseneditors, einschließlich der zu testenden Leitsequenz und einer sich von der Testleitsequenz unterscheidenden Kontrollleitsequenz bereitgestellt werden und die Bindungs- oder Spaltungsrate an der Zielsequenz zwischen den Test- und Kontroll-Leitsequenz-Reaktionen verglichen wird. Andere Assays sind möglich und werden dem Fachmann in den Sinn kommen.
  • Eine Leitsequenz kann ausgewählt werden, um auf eine beliebige Zielsequenz abzuzielen. In einigen Ausführungsformen ist die Zielsequenz eine Sequenz innerhalb eines Genoms einer Zelle. Beispielhafte Zielsequenzen beinhalten diejenigen, die im Zielgenom einzigartig sind. Zum Beispiel kann für das S. pyogenes-Cas9 eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom eine Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 1361548) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 1361549) (N ist A, G, T oder C; und X kann alles sein) im Genom nur einmal vorkommt. Eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom kann eine S. pyogenes-Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 1361550) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 1361551) (N ist A, G, T oder C; und X kann alles sein) im Genom nur einmal vorkommt. Für S. thermophilus CRISPR1Cas9 kann eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom eine Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 1361552) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 1361553) (N ist A, G, T oder C; X kann alles sein; und W ist A oder T) im Genom nur einmal vorkommt. Eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom kann eine S. thermophilus-CRISPRI-Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 1361554) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 1361555) (N ist A, G, T oder C; X kann alles sein; und W ist A oder T) im Genom nur einmal vorkommt. Für das S. pyogenes-Cas9 kann eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom eine Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 1361556) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 1361557) (N ist A, G, T oder C; und X kann alles sein) im Genom nur einmal vorkommt. Eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom kann eine S. pyogenes-Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 1361558) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 1361559) (N ist A, G, T, oder C; und X kann alles sein) im Genom nur einmal vorkommt. In jeder dieser Sequenzen kann „M“ A, G, T oder C sein und muss nicht berücksichtigt werden, um eine Sequenz als einzigartig zu identifizieren.
  • In einigen Ausführungsformen wird eine Leitsequenz ausgewählt, um den Grad der Sekundärstruktur innerhalb der Leitsequenz zu reduzieren. Die Sekundärstruktur kann durch jeden geeigneten Polynukleotidfaltungsalgorithmus bestimmt werden. Einige Programme basieren auf der Berechnung der minimalen freien Gibbs-Energie. Ein Beispiel für einen solchen Algorithmus ist mFold, wie von Zuker und Stiegler beschrieben (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). Ein weiteres Beispiel für einen Faltungsalgorithmus ist die Online-Webserver-RNA-Faltung, die am Institut für Theoretische Chemie der Universität Wien entwickelt wurde und den Schwerpunktstrukturvorhersagealgorithmus verwendet (siehe z. B. A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; und PA Carr und GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62). Weitere Algorithmen finden sich in der US-Anmeldung Ser. Nr. 61/836,080 ; Broad Reference BI-2013/004A); in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Im Allgemeinen beinhaltet eine tracr-mate-Sequenz jede Sequenz, die eine ausreichende Komplementarität mit einer tracr-Sequenz aufweist, um eines oder mehrere der Folgenden zu fördern: (1) Ausschneiden einer von tracr-mate-Sequenzen flankierten Leitsequenz in einer Zelle, welche die entsprechende tracr-Sequenz enthält; und (2) Bildung eines Komplexes an einer Zielsequenz, wobei der Komplex die tracr-mate-Sequenz umfasst, die an die tracr-Sequenz hybridisiert ist. Im Allgemeinen bezieht sich der Komplementaritätsgrad auf die optimale Ausrichtung der tracr-mate-Sequenz und der tracr-Sequenz entlang der Länge der kürzeren der beiden Sequenzen. Eine optimale Ausrichtung kann durch jeden geeigneten Ausrichtungsalgorithmus bestimmt werden und kann ferner Sekundärstrukturen berücksichtigen, wie etwa Selbstkomplementarität entweder innerhalb der tracr-Sequenz oder der tracr-mate-Sequenz. In einigen Ausführungsformen ist der Komplementaritätsgrad zwischen der tracr-Sequenz und der tracr-mate-Sequenz entlang der Länge der kürzeren der beiden bei optimaler Ausrichtung etwa oder mehr als etwa 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 % oder höher. In einigen Ausführungsformen ist die tracr-Sequenz etwa oder mehr als etwa 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 oder mehr Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen sind die tracr-Sequenz und die tracr-mate-Sequenz in einem einzigen Transkript enthalten, sodass die Hybridisierung zwischen den beiden ein Transkript mit einer Sekundärstruktur, wie etwa einer Haarnadel, erzeugt. Bevorzugte schleifenbildende Sequenzen zur Verwendung in Haarnadelstrukturen sind vier Nukleotide lang und weisen höchst vorzugsweise die Sequenz GAAA auf. Es können jedoch auch längere oder kürzere Schleifensequenzen sowie alternative Sequenzen verwendet werden. Die Sequenzen beinhalten vorzugsweise ein Nukleotidtriplett (z. B. AAA) und ein zusätzliches Nukleotid (z. B. C oder G). Beispiele für Schleifenbildungssequenzen beinhalten CAAA und AAAG. In einer Ausführungsform der Erfindung weist das Transkript oder die transkribierte Polynukleotidsequenz mindestens zwei oder mehr Haarnadeln auf. In bevorzugten Ausführungsformen weist das Transkript zwei, drei, vier oder fünf Haarnadeln auf. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das Transkript höchstens fünf Haarnadeln auf. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das einzelne Transkript ferner eine Transkriptionsterminationssequenz; vorzugsweise ist dies eine polyT-Sequenz, beispielsweise sechs T-Nukleotide. Weitere nicht einschränkende Beispiele für einzelne Polynukleotide, die eine Leitsequenz, eine tracr-Mate-Sequenz und eine tracr-Sequenz umfassen, sind die folgenden (aufgelistet 5' bis 3'), wobei „N“ eine Base einer Leitsequenz darstellt, der erste Block von Kleinbuchstaben die tracr-mate-Sequenz darstellt und der zweite Block von Kleinbuchstaben die tracr-Sequenz darstellt und die letzte poly-T- Sequenz den Transkriptionsterminator darstellt: (1) NNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggc ttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 1361560); (2)
    NNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttca tgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 1361561); (3)
    NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTT (SEQ ID NO: 1361562); (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgtt atcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT (SEQ ID NO: 1361563); (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgtt atcaacttgaaaaagtgTTTTTTT (SEQ ID NO: 1361564 and (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgtt atcaTTTTTTTT (SEQ ID NO: 1361565). In einigen Ausführungsformen werden die Sequenzen (1) bis (3) in Kombination mit Cas9 aus S. thermophilus-CRISPR1 verwendet. In einigen Ausführungsformen werden die Sequenzen (4) bis (6) in Kombination mit Cas9 aus S. pyogenes verwendet. In einigen Ausführungsformen ist die tracr-Sequenz ein separates Transkript von einem Transkript, das die tracr-mate-Sequenz umfasst.
  • Für den Fachmann ist offensichtlich, dass es typischerweise notwendig ist, das Fusionsprotein zusammen mit einer Leit-RNA, z. B. einer sgRNA, zu koexprimieren, um eines der Fusionsproteine, die eine Cas9-Domäne und ein einzelsträngiges DNA-Bindungsprotein umfassen, wie in dieser Schrift offenbart auf eine Zielstelle, z. B. eine Stelle mit einer zu editierenden Punktmutation, anzuzielen. Wie an anderer Stelle in dieser Schrift ausführlicher erläutert, umfasst eine Leit-RNA typischerweise ein tracrRNA-Gerüst, das die Cas9-Bindung ermöglicht, und eine Leit-Sequenz, die dem Cas9:Nucleinsäure-Editing-Enzym/Domänen-Fusionsprotein Sequenzspezifität verleiht.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Leit-RNA eine Struktur 5'-[Leitsequenz]-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggca ccgagucggugcuuuuu-3' (SEQ ID NO: 1361566), wobei die Leitsequenz eine Sequenz umfasst, die komplementär zur Zielsequenz ist. Die Leitsequenz ist typischerweise 20 Nukleotide lang. Die Sequenzen geeigneter Leit-RNAs zum Targeting von Cas9:Nucleinsäure-Editing-Enzym/Domänen-Fusionsproteinen auf spezifische genomische Zielstellen werden dem Fachmann auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein. Solche geeigneten Leit-RNA-Sequenzen umfassen typischerweise Leitsequenzen, die zu einer Nukleinsequenz innerhalb von 50 Nukleotiden stromaufwärts oder stromabwärts des zu editierenden Zielnukleotids komplementär sind. Einige beispielhafte Leit-RNA-Sequenzen, die geeignet sind, jedes der bereitgestellten Fusionsproteine gezielt auf spezifische Zielsequenzen abzuzielen, werden in dieser Schrift bereitgestellt. Zusätzliche Leitsequenzen sind in der Technik gut bekannt und können mit den in dieser Schrift beschriebenen Baseneditoren verwendet werden.
  • In anderen Ausführungsformen kann PEgRNA diejenigen umfassen, die durch die in 27 gezeigte gezeigte Struktur abgebildet sind, die eine Leit-RNA und einen 3'-Verlängerungsarm umfasst.
  • Diese Figur stellt die Struktur einer Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich eine Primerbindungsstelle (A), eine Editiermatrize (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht abgebildet). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein.
  • In noch anderen Ausführungsformen kann PEgRNA diejenigen umfassen, die durch die in 28 gezeigte gezeigte Struktur abgebildet sind, die eine Leit-RNA und einen 5'-Verlängerungsarm umfasst.
  • Diese Figur stellt die Struktur einer Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verllängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich: eine Primerbindungsstelle (A) (SEQ ID NOs: 406543-542056 und 1015219-1082596), eine Editiermatrize (B) (SEQ ID NOs: 542057- 677570 und 1082597-1149974) und einen Homologiearm (C) (SEQ ID NOs: 677571- 813084 und 1149975-1217352). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal an dem 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht dargestellt). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein.
  • Die PEgRNA kann auch zusätzliche Designverbesserungen enthalten, die die Eigenschaften und/oder Merkmale von PEgRNA verändern können, wodurch die Effizienz des Prime Editing verbessert wird. In verschiedenen Ausführungsformen können diese Verbesserungen zu einer oder mehreren von einer Reihe verschiedener Kategorien gehören, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein: (1) Designs, um eine effiziente Expression von funktioneller PEgRNA von Nicht-Polymerase-III(Pol III)-Promotoren zu ermöglichen, was die Expression längerer PEgRNA ohne lästige Sequenzerfordernisse ermöglichen würde; (2) Verbesserungen des Kerns, des Cas9-bindenden PEgRNA -Gerüsts, was die Wirksamkeit verbessern könnte; (3) Modifikationen an der PEgRNA, um die RT-Prozessivität zu verbessern, wodurch die Insertion längerer Sequenzen an gezielten genomischen Loci ermöglicht wird; und (4) Hinzufügen von RNA-Motiven an die 5'- oder 3'-Termini der PEgRNA, was die PEgRNA - Stabilität verbessert, die RT-Prozessivität erhöht, eine Fehlfaltung der PEgRNA verhindert oder zusätzliche Faktoren rekrutiert, die für die Genom-Editierung wichtig sind.
  • In einer Ausführungsform könnte PEgRNA mit polIII-Promotoren entworfen werden, um die Expression von längerer PEgRNA mit größeren Verlängerungsarmen zu verbessern. sgRNAs werden typischerweise vom U6-snRNA-Promotor exprimiert. Dieser Promotor rekrutiert Pol III, um die assoziierte RNA zu exprimieren, und ist nützlich für die Expression von kurzen RNAs, die im Kern zurückgehalten werden. Pol III ist jedoch nicht hochprozessiv und kann keine RNAs mit einer Länge von mehr als einigen hundert Nukleotiden auf den für eine effiziente Genom-Editierung erforderlichen Niveaus exprimieren. Darüber hinaus kann Pol III an Abschnitten von U anhalten oder terminieren, was möglicherweise die Diversität der Sequenzen begrenzt, die unter Verwendung einer PEgRNA eingefügt werden könnten. Andere Promotoren, die Polymerase II (wie etwa pCMV) oder Polymerase I (wie etwa der U1-snRNA-Promotor) rekrutieren, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, längere sgRNAs zu exprimieren. Diese Promotoren werden jedoch typischerweise teilweise transkribiert, was zu einer zusätzlichen Sequenz 5' von dem Spacer in der exprimierten PEgRNA führen würde, was nachweislich auf eine ortsabhängige Weise zu einer deutlich reduzierten Cas9:sgRNA-Aktivität führt. Während Pol III-transkribierte PEgRNA einfach in einem Lauf von 6-7 U terminieren kann, würde PEgRNA, die von Pol II oder Pol I transkribiert wurde, ein anderes Terminationssignal erfordern. Häufig führen solche Signale auch zu einer Polyadenylierung, die zu einem unerwünschten Transport der PEgRNA aus dem Zellkern führen würde. In ähnlicher Weise sind RNAs, die von Pol II-Promotoren wie pCMV exprimiert werden, typischerweise 5'-begrenzt, was ebenfalls zu ihrem Kernexport führt.
  • Zuvor haben Rinn und Mitarbeiter eine Vielzahl von Expressionsplattformen für die Produktion von lang-nicht-codierenden RNA-(lncRNA)-markierten sgRNAs gescreent183. Diese Plattformen beinhalten RNAs, die von pCMV exprimiert werden und die im ENE-Element von der MALAT1-ncRNA von Menschen184, dem PAN ENE-Element von KSHV185 oder der 3'-Box von U1-snRNA186 enden. Bemerkenswerterweise bilden die MALAT1-ncRNA und PAN-ENEs Triple-Helices, die den PolyA-Schwanz schützen184, 187. Diese Konstrukte könnten auch die RNA-Stabilität erhöhen. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Expressionssysteme auch die Expression längerer PEgRNA ermöglichen.
  • Darüber hinaus wurde eine Reihe von Verfahren für die Spaltung des Abschnitts des Pol II-Promotors entwickelt, der als Teil der PEgRNA transkribiert würde, wobei entweder ein selbstspaltendes Ribozym wie etwa Hammerhead-188, Pistole-189, Beil-189, Haarnadel-190, VS-191, Twister-192 oder Twister-Sister-192 Ribozyme oder andere selbstspaltende Elemente hinzugefügt wurden, um die transkribierte Leitung zu verarbeiten, oder eine Haarnadel, die von Csy4193 erkannt wird und auch zur Verarbeitung der Leitung führt. Es wird auch vermutet, dass der Einbau mehrerer ENE-Motive zu einer verbesserten PEgRNA -Expression und -Stabilität führen könnte, wie zuvor für die KSHV-PAN-RNA und das Element185 gezeigt wurde. Es wird auch erwartet, dass die Zirkularisierung der PEgRNA in Form einer zirkulären intronischen RNA (ciRNA) ebenfalls zu einer verbesserten RNA-Expression und -Stabilität sowie zu einer Kernlokalisation führen könnte 194.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die PEgRNA verschiedene vorstehende Elemente beinhalten, wie durch die folgende Sequenz veranschaulicht.
  • Nicht einschränkendes Beispiel 1 - PEgRNA -Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und MALAT 1 ENE
    Figure DE112020001306T5_0007
  • Nicht einschränkendes Beispiel 2 - PEgRNA -Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und PAN ENE
    Figure DE112020001306T5_0008
    Figure DE112020001306T5_0009
  • Nicht einschränkendes Beispiel 3 - PEgRNA -Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3xPAN ENE
    Figure DE112020001306T5_0010
  • Nicht einschränkendes Beispiel 4 - PEgRNA -Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3'-Box
    Figure DE112020001306T5_0011
    Figure DE112020001306T5_0012
  • Nicht einschränkendes Beispiel 5 - PEgRNA -Expressionsplattform bestehend aus pU1, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3'-Box
    Figure DE112020001306T5_0013
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die PEgRNA verbessert werden, indem Verbesserungen an den Gerüst- oder Kernsequenzen eingeführt werden. Dies kann durch die Einführung bekannter
  • Der Kern, das Cas9-bindende PEgRNA-Gerüst, kann wahrscheinlich verbessert werden, um die PE-Aktivität zu erhöhen. Mehrere solcher Ansätze wurden bereits demonstriert. Zum Beispiel enthält das erste Paarungselement des Gerüsts (P1) ein GTTTT-AAAAC-Paarungselement. Es wurde gezeigt, dass solche Durchläufe von Ts zu einer Pol III-Pausierung und einer vorzeitigen Beendigung des RNA-Transkripts führen. Es wurde gezeigt, dass die rationale Mutation eines der T-A-Paare zu einem G-C-Paar in diesem Abscnitt von P1 die sgRNA-Aktivität erhöht, was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz auch für PEgRNA 195 durchführbar wäre. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass die Verlängerung der Länge von P1 die sgRNA-Faltung verbessert und zu einer verbesserten Aktivität führt195, was darauf hindeutet, dass dies ein weiterer Weg zur Verbesserung der PEgRNA-Aktivität ist. Beispiele für Verbesserungen am Kern können die Folgenden beinhalten:
  • PEgRNA mit einer 6-nt-Verlängerung zu P1
    Figure DE112020001306T5_0014
  • PEgRNA, die eine T-A-zu-G-C-Mutation innerhalb von P1 enthält
    Figure DE112020001306T5_0015
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die PEgRNA durch Einführen von Modifikationen in die Editiermatrizenregion verbessert werden. Mit zunehmender Größe der von der PEgRNA als Matrize abgenommenen Insertion ist es wahrscheinlicher, dass sie von Endonukleasen abgebaut wird, spontan hydrolysiert wird oder sich in Sekundärstrukturen faltet, die von der RT nicht revers transkribiert werden können, oder die Faltung des PEgRNA -Gerüst und die anschließende Cas9-RT-Bindung beeinträchtigt. Dementsprechend ist es wahrscheinlich, dass eine Modifikation der Matrize der PEgRNA notwendig sein könnte, um große Insertionen, wie etwa die Insertion ganzer Gene, zu beeinflussen. Einige Strategien dazu beinhalten den Einbau modifizierter Nukleotide in eine synthetische oder halbsynthetische PEgRNA, welche die RNA widerstandsfähiger gegen Abbau oder Hydrolyse machen oder die Wahrscheinlichkeit reduzieren, dass sie inhibitorische Sekundärstrukturen annimmt196. Solche Modifikationen könnten 8-Aza-7-deazaguanosin einschließen, das die RNA-Sekundärstruktur in G-reichen Sequenzen reduzieren würde; Locked-Nucleinsäuren (LNA), die den Abbau reduzieren und bestimmte Arten der RNA-Sekundärstruktur verbessern; 2'-O-Methyl-, 2'-Fluor- oder 2'-O-Methoxyethoxy-Modifikationen, welche die RNA-Stabilität erhöhen. Solche Modifikationen könnten auch an anderer Stelle in die PEgRNA aufgenommen werden, um Stabilität und Aktivität zu erhöhen. Alternativ oder zusätzlich dazu könnte die Matrize der PEgRNA so gestaltet werden, dass sie sowohl für ein gewünschtes Proteinprodukt codiert als auch die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sie einfache Sekundärstrukturen annimmt, die durch die RT entfaltet werden können. Solche einfachen Strukturen würden als thermodynamische Senke wirken, was es weniger wahrscheinlich macht, dass kompliziertere Strukturen auftreten, die eine reverse Transkription verhindern würden. Schließlich könnte man die Matrize auch in zwei separate PEgRNAs trennen. In einem solchen Design würde ein PE verwendet, um die Transkription zu initiieren und auch eine separate Matrizen-RNA über ein an Cas9 fusioniertes RNA-bindendes Protein oder ein RNA-Erkennungselement auf der PEgRNA selbst, wie etwa das MS2-Aptamer, an die Zielstelle zu rekrutieren. Die RT könnte entweder direkt an diese separate Matrizen-RNA binden oder die reverse Transkription auf der ursprünglichen PEgRNA initiieren, bevor zur zweiten Matrize gewechselt wird. Ein solcher Ansatz könnte lange Insertionen ermöglichen, indem eine Fehlfaltung der PEgRNA bei Zugabe der langen Matrize verhindert wird und auch keine Dissoziation des Cas9 vom Genom für lange Insertionen erforderlich ist, was PE-basierte lange Insertionen hemmen kann.
  • (iv) Anbringung zusätzlicher RNA-Motive an den 5' oder 3' Termini
  • In noch anderen Ausführungsformen kann die PEgRNA verbessert werden, indem zusätzliche RNA-Motive an den 5'- und 3'-Termini der PEgRNA eingeführt werden. Mehrere solcher Motive, wie etwa das PAN ENE von KSHV und das ENE von MALAT1, wurden vorstehend als mögliches Mittel diskutiert, um die Expression längerer PEgRNA von Nicht-Pol III-Promotoren zu beenden. Diese Elemente bilden RNA-Triple-Helices, die den polyA-Schwanz umhüllen, was dazu führt, dass sie im Kern zurückgehalten werden184,187. Durch die Bildung komplexer Strukturen am 3'-Terminus der PEgRNA, die das terminale Nukleotid verschließen, würden diese Strukturen jedoch wahrscheinlich auch dazu beitragen, den Exonukleasevermittelten Abbau von PEgRNA zu verhindern.
  • Andere am 3'-Terminus eingefügte Strukturelemente könnten ebenfalls die RNA-Stabilität erhöhen, jedoch ohne die Termination von Nicht-Pol III-Promotoren zu ermöglichen. Solche Motive könnten Haarnadeln oder RNA-Quadruplexe beinhalten, die den 3 ‚-Terminus 197 verdecken, oder selbstspaltende Ribozyme wie HDV, die zur Bildung eines 2‘-3'-cyclischen Phosphats am 3'-Terminus führen und möglicherweise auch die Wahrscheinlichkeit reduzieren, dass die PEgRNA durch Exonukleasen abgebaut wird 198. Das Induzieren der PEgRNA durch unvollständiges Spleißen zur Zyklisierung - um eine ciRNA zu bilden - könnte ebenfalls die Stabilität der PEgRNA erhöhen und dazu führen, dass die PEgRNA im Zellkern verbleibt194.
  • Zusätzliche RNA-Motive könnten auch die RT-Prozessivität verbessern oder die PEgRNA -Aktivität erhöhen, indem sie die RT-Bindung an den DNA-RNA-Duplex verstärken. Die Zugabe der nativen Sequenz, die von der RT in ihrem verwandten retroviralen Genom gebunden wird, könnte die RT-Aktivität erhöhen199. Dies könnte die native Primerbindungsstelle (PBS), den Polypurin-Trakt (PPT) oder Kissing Loops umfassen, die an der retroviralen Genom-Dimerisierung und der Initiation der Transkription beteiligt sind199.
  • Die Zugabe von Dimerisierungsmotiven - wie etwa Kissing Loops oder ein GNRA-Tetraloop/Tetraloop-Rezeptorpaar200 - an den 5'- und 3'-Termini der PEgRNA könnte auch zu einer effektiven Zirkularisierung der PEgRNA führen, was die Stabilität verbessert. Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass die Zugabe dieser Motive die physische Trennung des PEgRNA -Spacers und Primers ermöglichen könnte, wodurch eine Okklusion des Spacers verhindert wird, welche die PE-Aktivität behindern würde. Kurze 5'-Verlängerungen der PEgRNA, die in der Spacer-Region eine kleine Toehold-Haarnadel bilden, könnten auch günstig gegen die Anlagerungsregion der den Spacer bindenden PEgRNA konkurrieren. Schließlich könnten Kissing Loops auch verwendet werden, um andere Matrizen-RNAs an die genomische Stelle zu rekrutieren und den Austausch der RT-Aktivität von einer RNA zur anderen zu ermöglichen. Beispiele für Verbesserungen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein:
    • PEgRNA-HDV-Fusion
      Figure DE112020001306T5_0016
    • PEgRNA -MMLV-Kissing-Loop
      Figure DE112020001306T5_0017
    • PEgRNA-VS-Ribozym-Kissing-Loop
      Figure DE112020001306T5_0018
    • PEGRNA-GNRA-Tetraloop/Tetraloop-Rezeptor
      Figure DE112020001306T5_0019
    • PEgRNA- matrizenwechselnde sekundäre RNA-HDV-Fusion
      Figure DE112020001306T5_0020
  • Das PEgRNA -Gerüst könnte durch gesteuerte Evolution weiter verbessert werden, analog zur Verbesserung von SpCas9 und Baseneditoren. Die gesteuerte Evolution könnte die Erkennung von PEgRNA durch Cas9 oder weiterentwickelte Cas9-Varianten verbessern. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass verschiedene PEgRNA-Gerüstsequenzen an verschiedenen genomischen Loci optimal wären, entweder die PE-Aktivität an der fraglichen Stelle erhöhen, die Off-Target-Aktivitäten reduzieren oder beides. Schließlich würde die Evolution von PEgRNA -Gerüsten, denen andere RNA-Motive hinzugefügt wurden, mit ziemlicher Sicherheit die Aktivität der fusionierten PEgRNA im Vergleich zur nicht entwickelten Fusions-RNA verbessern. Zum Beispiel führte die Evolution allosterischer Ribozyme, die aus c-di-GMP-I-Aptameren und Hammerhead-Ribozymen zusammengesetzt sind, zu einer dramatisch verbesserten Aktivität202, was darauf hindeutet, dass die Evolution auch die Aktivität von Hammerhead-PEgRNA -Fusionen verbessern würde. Während Cas9 derzeit im Allgemeinen keine 5'-Verlängerung der sgRNA toleriert, wird die gesteuerte Evolution wahrscheinlich Mutationen erzeugen, die diese Intoleranz mildern und die Verwendung zusätzlicher RNA-Motive ermöglichen.
  • Die vorliegende Offenbarung erwägt alle derartigen Möglichkeiten, um die Wirksamkeit der in dieser Schrift offenbarten Prime-Editing-Systeme weiter zu verbessern.
  • II. Algorithmus und Verfahren zum Design therapeutischer PEgRNA
  • Wie in dieser Schrift beschrieben, entdeckten und erkannten die Erfinder, dass Prime Editing unter Verwendung von PEgRNA verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Nukleotidänderungen anzubringen, einschließlich Insertionen (jeder Länge, einschließlich ganzer Gene oder proteincodierender Regionen), Deletionen (jeder Länge) und der korrekten pathogenen Mutationen. Es gibt jedoch noch keine Techniken, um PEgRNA-Strukturen zu bestimmen und/oder vorherzusagen, einschließlich der Spezifizierung der verschiedenen Komponenten der PEgRNA, wie etwa des Spacers, des gRNA-Kerns und des Verlängerungsarms (und der in dieser Schrift beschriebenen Verlängerungskomponenten). Die Erfinder haben computergestützte Techniken zur Bestimmung von PEgRNA entwickelt, einschließlich der Bestimmung verlängerter gRNA-Strukturen. Jede verlängerte gRNA-Struktur kann basierend auf einem Eingangsallel (das z. B. eine pathogene Mutation darstellt), einem Ausgangsallel (das z. B. eine korrigierte Wildtyp-Sequenz darstellt) und einem Fusionsprotein (z. B. ein CRISPR-System für Prime Editing, einschließlich eines PAM-Motivs und der relativen Position des Prime-Editor-Nicks) bestimmt werden. Der Unterschied zwischen dem Eingangsallel und dem Ausgangsallel stellt die gewünschte Editierung dar (z. B. eine einzelne Nukleotidänderung, Insertion, Deletion und/oder dergleichen). Die bestimmten Strukturen können erzeugt und verwendet werden, um eine Baseneditierung durchzuführen, um das Eingangsallel in das Ausgangsallel zu ändern, wie in dieser Schrift weiter beschrieben.
  • 31 ist ein Ablaufdiagramm, das ein beispielhaftes computerisiertes High-Level-Verfahren 3100 zum Bestimmen einer verlängerten gRNA-Struktur gemäß einigen Ausführungsformen zeigt. In Schritt 3102 greift eine Rechenvorrichtung (z. B. die in Verbindung mit 34 beschriebene Rechenvorrichtung 3400) auf Daten zu, die ein Eingangsallel, ein Ausgangsallel und ein Fusionsprotein angeben, das ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein und eine reverse Transkriptase enthält. Während Schritt 3102 den Zugriff auf alle drei des Eingangsallels, Ausgangsallels und Fusionsproteins in einem Schritt beschreibt, dient dies der Veranschaulichung, und es versteht sich, dass auf solche Daten unter Verwendung eines oder mehrerer Schritte zugegriffen werden kann, ohne vom Geist der in dieser Schrift beschriebenen Techniken abzuweichen. Der Zugriff auf Daten kann das Empfangen von Daten, das Speichern von Daten, den Zugriff auf eine Datenbank und/oder dergleichen beinhalten.
  • Bei Schritt 3104 bestimmt die Rechenvorrichtung die verlängerte gRNA-Struktur basierend auf dem Eingangsallel, dem Ausgangsallel und dem Fusionsprotein, auf das in Schritt 3102 zugegriffen wurde. Die verlängerte gRNA-Struktur ist so konzipiert, dass sie mit dem Fusionsprotein assoziiert ist, um das Eingangsallel in das Ausgangsallel zu ändern. Das Fusionsprotein ist, wenn es mit der verlängerten gRNA komplexiert ist, in der Lage, mit einer Ziel-DNA-Sequenz zu binden, die einen Zielstrang, an dem die Änderung auftritt, und einen komplementären Nicht-Zielstrang beinhaltet. Wie in dieser Schrift beschrieben, kann das Eingangsallel eine pathogene DNA-Mutation darstellen und das Ausgangsallel kann eine korrigierte DNA-Sequenz darstellen.
  • Das Ändern des Eingangsallels in das Ausgangsallel kann eine einzelne Nukleotidänderung, eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden, eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden und/oder jede andere Änderung, die darauf abzielt, das Ausgangsallel zu erzielen, beinhalten. Insbesondere beinhalten beispielhafte Klassen von Editierungen, die durch eine einzelne PEgRNA induziert werden können, einzelne Nukleotidsubstitutionen, Insertionen von 1 nt bis zu etwa 40 nt, Deletionen von 1 nt bis zu etwa 30 nt und eine Kombination davon. Zum Beispiel kann Prime Editing Änderungen dieser Art von der Spacer-Position -3 (z. B. unmittelbar 3' des Nicks) zur Spacer-Position +27 (z. B. 30 nt 3' des Nicks im Eingangsallel) unterstützen. Es können auch andere Positionen verwendet werden. Zum Beispiel können Editierungen an der Spacer-Position -4 unter Verwendung des SpCas9-Systems mit Prime Editing durchgeführt werden (was z. B. durch gelegentliche RuvC-Spaltung zwischen den Spacer-Positionen -5 und -4 verursacht werden kann). Die Art der Änderung, die Anzahl der nt-Änderungen, und/oder die Position der Änderung kann/können konfigurierbare Parameter sein, welche die computergestützten Techniken verwenden können, um verlängerte gRNA-Strukturen zu bestimmen.
  • Wie in Verbindung mit 3A-3B und 27-28 erläutert, kann eine verlängerte gRNA verschiedene Komponenten beinhalten, wie etwa einen Spacer für die verlängerte gRNA, der zu einer Zielnukleotidsequenz im Eingangsallel komplementär ist, ein gRNA-Rückgrat zur Interaktion mit dem Fusionsprotein und eine Verlängerung. Unter weiterer Bezugnahme auf Schritt 3104 bestimmt die Rechenvorrichtung einen oder mehrere von dem Spacer, dem gRNA-Rückgrat und der Verlängerung. Während in einigen Ausführungsformen die Techniken die Bestimmung einer beliebigen Kombination des Spacers, des gRNA-Rückgrats und/oder der Verlängerung beinhalten können, sind in einigen Ausführungsformen eine oder mehrere solcher Komponenten und/oder Aspekte solcher Komponenten bekannt (z. B. vorbestimmt, vorspezifiziert, feststehend usw.) und können daher nicht als Teil von Schritt 3104 bestimmt werden.
  • Wie in dieser Schrift beschrieben, kann die gRNA-Verlängerung verschiedene Komponenten beinhalten. Beispielsweise, wie in 3A-3B und 27-28 gezeigt, kann die Verlängerung eines oder mehrere von einer RT-Matrize (die eine RT-Editiermatrize und einen Homologiearm beinhaltet), einer Primerbindungsstelle, einem RT-Terminationssignal, einer optionalen 5'-Endmodifiziererregion und einem optionalen 3'-Endmodifiziererbereich beinhalten.
  • 32 ist ein Ablaufdiagramm, das ein beispielhaftes computerisiertes Verfahren 3200 zum Bestimmen der Komponenten einer verlängerten gRNA-Struktur, einschließlich der Komponenten der Verlängerung, gemäß einigen Ausführungsformen zeigt. Es versteht sich, dass 32 veranschaulichend sein soll, und daher können Techniken, die verwendet werden, um die verlängerte gRNA zu bestimmen, mehr oder weniger Schritte als die in 32 gezeigten beinhalten.
  • Bei Schritt 3202 bestimmt die Rechenvorrichtung den Satz von Protospacern, die mit dem PAM-Motiv des ausgewählten CRISPR-Systems im Eingangsallel auf beiden Strängen kompatibel sind. In einigen Ausführungsformen bestimmt die Rechenvorrichtung einen anfänglichen Satz von Protospacern und filtert Protospacer heraus, deren zugeordnete Nick-Positionen mit dem Prime Editing des Ausgangsallels nicht kompatibel sind, um einen Satz verbleibender Protospacer-Kandidaten zu erzeugen. Zum Beispiel kann die Rechenvorrichtung feststellen, dass ein Protospacer inkompatibel ist, weil sich der Nick auf der 3'-Seite der gewünschten Editierung auf dem Strang befindet. Als weiteres Beispiel kann die Rechenvorrichtung bestimmen, dass der Abstand zwischen dem Nick und der gewünschten Editierung zu groß ist (z. B. größer als ein benutzerdefinierter Schwellenwert, z. B. 30 nt, 35 nt usw.).
  • Bei Schritt 3204 wählt die Rechenvorrichtung einen Protospacer aus dem Satz von bestimmten Protospacem aus. Bei Schritt 3206 bestimmt die Rechenvorrichtung einen Spacer und eine Editiermatrizensequenz unter Verwendung der Protospacersequenz des Eingangsallels, der Position des Nicks und der Sequenz der gewünschten Editierung. Der Spacer kann eine Nukleotidsequenz von etwa 20 Nukleotiden umfassen.
  • Bei Schritt 3208 wählt die Rechenvorrichtung einen oder mehrere Parametersätze aus, wobei jeder Parametersatz einen Wert für die Länge der Primerbindungsstelle (der z. B. in der Anzahl von nt variieren kann, beispielsweise von etwa 8 nt bis 17 nt), die Homologiearmlänge (die z. B. in der Anzahl von nt variieren kann, beispielsweise von etwa 2 nt bis 33 nt) und die gRNA-Rückgratsequenz beinhaltet. Beispielsweise kann die gRNA-Rückgratsequenz GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA AAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 1361579), GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCA CCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 1361580) und/oder andere gRNA-Rückgratsequenzen sein, wie etwa RNA-Rückgratsequenzen, die eine Wildtyp-RNA-Sekundärstruktur beibehalten.
  • Bei Schritt 3210 wählt die Rechenvorrichtung einen Satz von Parametern aus, die in Schritt 3208 bestimmt wurden. Bei Schritt 3212 bestimmt die Rechenvorrichtung einen Homologiearm, eine Primerbindungsstellensequenz und ein gRNA-Rückgrat unter Verwendung des ausgewählten Parametersatzes. Bei Schritt 3214 bildet die Rechenvorrichtung dann eine resultierende PEgRNA -Sequenz durch Verketten des Spacers, des gRNA-Rückgrats, des PEgRNA -Verlängerungsarms (der den Homologiearm und die Editiermatrize beinhaltet). Außerdem kann der Verlängerungsarm ein Terminatorsignal beinhalten, bei dem es sich um eine Sequenz handelt, welche die Termination der reversen Transkription auslöst. Solche Terminatorsequenzen können beispielsweise TTTTTTGTTTT (SEQ ID NO: 1361581) beinhalten. In einigen Ausführungsformen kann davon ausgegangen werden, dass der PEgRNA -Verlängerungsarm das Terminationssignal umfasst. In anderen Ausführungsformen kann der PEgRNA-Verlängerungsarm so in Betracht gezogen werden, dass er das Terminierungssignal ausschließt, sodass der Verlängerungsarm stattdessen am Terminierungssignal als ein außerhalb des Verlängerungsarm liegendes Element befestigt ist.
  • Das Verfahren 3200 fährt mit Schritt 3216 fort und die Rechenvorrichtung bestimmt, ob es mehr Parametersätze gibt. Falls ja, fährt das Verfahren mit Schritt 3210 fort und die Rechenvorrichtung wählt einen anderen Satz von Parametern aus. Falls nein, fährt das Verfahren mit Schritt 3218 fort und die Rechenvorrichtung bestimmt, ob es mehr Protospacer gibt. Falls ja, kehrt das Verfahren zu Schritt 3204 zurück und die Rechenvorrichtung wählt einen anderen Protospacer aus dem Satz von Protospacem aus. Falls nein, fährt das Verfahren mit Schritt 3220 fort und endet.
  • Wie in dieser Schrift beschrieben, beinhaltet die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) der Verlängerung eine gewünschte Nukleotidänderung, um das Eingangsallel in das Ausgangsallel zu ändern, und beinhaltet die RT-Editiermatrize (z. B. in Schritt 3206 bestimmt) und den Homologiearm (z. B. bei Schritt 3212 bestimmt). Wie in dieser Schrift ebenfalls beschrieben, codiert die DNA-Synthesematrize (z. B. die RT-Matrizensequenz) einen einzelsträngigen DNA-Flap, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben der Nickstelle ist. Der einzelsträngige DNA-Flap umfasst die gewünschte Nukleotidänderung (z. B. eine einzelne Nukleotidänderung, eine oder mehrere Nukleotidinsertionen, eine oder mehrere Nukleotiddeletionen und/oder dergleichen). Bei einigen Baseneditierungseinsätzen kann der einzelsträngige DNA-Flap mit der endogenen DNA-Sequenz hybridisieren, die an die Nickstelle angrenzt, um die gewünschte Nukleotidänderung anzubringen. Bei einigen Baseneditierungseinsätzen verdämgt der einzelsträngige DNA-Flap die endogene DNA-Sequenz, die an die Nickstelle angrenzt. Die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap kann zur Anbringung der gewünschten Nukleotidänderung führen, um das gewünschte Allelprodukt zu bilden. Die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) kann eine variable Anzahl von Nukleotiden aufweisen und kann von etwa 7 Nukleotiden bis 34 Nukleotiden reichen.
  • Obwohl dies in 32 nicht gezeigt ist, kann die Rechenvorrichtung dazu konfiguriert sein, andere Komponenten der verlängerten gRNA zu bestimmen. Zum Beispiel ist die Rechenvorrichtung in einigen Ausführungsformen dazu konfiguriert, ein RT-Terminationssignal neben der RT-Matrize zu bestimmen. In einigen Ausführungsformen kann die Rechenvorrichtung dazu konfiguriert sein, einen ersten Modifikator neben dem RT-Terminationssignal zu bestimmen. In einigen Ausführungsformen ist die Rechenvorrichtung dazu konfiguriert, einen zweiten Modifikator neben der Primerbindungsstelle zu bestimmen.
  • Die verlängerten gRNA-Komponenten können in unterschiedlichen Konfigurationen angeordnet sein, wie etwa diejenigen, die in 3A-3B und 27-28 gezeigt sind. Unter Bezugnahme auf beispielsweise 3A befindet sich die Verlängerung am 5'-Ende der verlängerten gRNA-Struktur, der Spacer befindet sich 3' zur Verlängerung und 5' zum gRNA-Kern. Als weiteres Beispiel befindet sich unter Bezugnahme auf 3B der Spacer an einem 5'-Ende der verlängerten gRNA-Struktur (und ist 5' zum gRNA-Kern) und die Verlängerung befindet sich an einem 3'-Ende der verlängerten gRNA-Struktur (und ist 3' zum gRNA-Kern).
  • In einigen Ausführungsformen greift die Rechenvorrichtung auf eine Datenbank zu, die einen Satz von Eingangsallelen und zugeordneten Ausgangsallelen beinhaltet. Zum Beispiel kann die Rechenvorrichtung auf eine von ClinVar bereitgestellte Datenbank zugreifen, die Hunderttausende von Mutationen enthält, von denen jede ein Allel, das eine pathogene Mutation darstellt, und ein Allel, das die korrigierte Wildtypsequenz darstellt, beinhaltet. Die Techniken können verwendet werden, um eine oder mehrere verlängerte gRNA-Strukturen für jeden Datenbankeintrag zu bestimmen. 33 ist ein Ablaufdiagramm, das ein beispielhaftes computerisiertes Verfahren 3300 zum Bestimmen von Sätzen von verlängerten gRNA-Strukturen für jeden Mutationseintrag in einer Datenbank gemäß einigen Ausführungsformen zeigt. Bei Schritt 3302 greift die Rechenvorrichtung auf eine Datenbank zu (z. B. eine ClinVar-Datenbank) die einen Satz von Mutationseinträgen beinhaltet, die jeweils ein die Mutation repräsentierendes Eingangsallel und ein die korrigierte Wildtypsequenz repräsentierendes Ausgangsallel beinhalten.
  • Bei Schritt 3304 greift die Rechenvorrichtungauf einen Satz von einem oder mehreren Fusionsproteinen zu. In einigen Ausführungsformen können die Techniken das Erzeugen von Sätzen von verlängerten gRNA-Strukturen für ein einzelnes Fusionsprotein beinhalten und/oder für eine Kombination verschiedener Fusionsproteine (z. B. für verschiedene Cas9-Proteine). Die Rechenvorrichtung kann dazu konfiguriert sein, auf Daten zuzugreifen, welche die Vielzahl von Fusionsproteinen anzeigen, und kann einen Satz verlängerter gRNA-Strukturen für jedes Fusionsprotein (z. B. ein Cas9-NG-Protein und ein SpCas9-Protein) wie in dieser Schrift beschrieben erzeugen.
  • Bei Schritt 3306 wählt die Rechenvorrichtung ein Fusionsprotein aus dem Satz von Fusionsproteinen aus. Bei Schritt 3308 wählt die Rechenvorrichtung einen Mutationseintrag aus dem Satz von Einträgen in der Datenbank aus. Die Rechenvorrichtung kann beispielsweise dazu konfiguriert, durch jeden Eintrag in der Datenbank zu iterieren und einen Satz verlängerter gRNA-Strukturen für den Eintrag zu erzeugen (z. B. einen Satz für ein bestimmtes Fusionsprotein und/oder mehrere Sätze für jedes von mehreren Fusionsproteinen). In einigen Ausführungsformen kann die Rechenvorrichtung dazu konfiguriert sein, verlängerte gRNA-Strukturen für eine Teilmenge von Einträgen in der Datenbank zu erzeugen, wie etwa eine vorkonfigurierte Menge, eine Menge von Mutationen mit höchster Signifikanz (z. B. solche mit bekannten therapeutischen Vorteilen) und/oder dergleichen. In einigen Ausführungsformen kann die Rechenvorrichtung, wenn die Datenbank Einträge enthält, die nicht mit einigen Fusionsproteinen für das Prime Editing kompatibel sind, dazu konfiguriert sein, zu bestimmen, welche Einträge in der Datenbank für das Prime Editing unter Verwendung des ausgewählten Fusionsproteins aus Schritt 3304 kompatibel sind, und in Schritt 3308 Einträge auszuwählen, die mit dem ausgewählten Fusionsprotein kompatibel sind.
  • Bei Schritt 3310 bestimmt die Rechenvorrichtung einen Satz von einer oder mehreren verlängerten gRNA-Strukturen unter Verwendung der in dieser Schrift beschriebenen Techniken. Das Verfahren geht von Schritt 3310 zu Schritt 3312 über, und die Rechenvorrichtung bestimmt, ob zusätzliche Einträge in der Datenbank vorhanden sind. Falls ja, geht die Rechenvorrichtung zurück zu Schritt 3308 und wählt einen anderen Eintrag aus. Falls nein, fährt die Rechenvorrichtung mit Schritt 3314 fort und bestimmt, ob weitere Fusionsproteine vorhanden sind. Falls ja, geht die Rechenvorrichtung zurück zu Schritt 3306 und wählt ein anderes Fusionsprotein aus. Falls nein, fährt die Rechenvorrichtung mit Schritt 3316 fort und beendet das Verfahren 3300.
  • In einigen Ausführungsformen können die Techniken PEgRNA mit gRNA-Verlängerungen entwerfen, die nicht-komplementäre Sequenzen enthalten, wie etwa nicht-komplementäre Sequenzen, die 5' vom Homologiearms, 3' von der Primerbindungsstelle oder beides sind. Zum Beispiel können nicht-komplementäre Sequenzen so entworfen werden, dass sie eine Kissing-Loop-Interaktion bilden, um als schützende Haarnadel für die RNA-Stabilität zu wirken, und/oder dergleichen.
  • In einigen Ausführungsformen kann PEgRNA unter Verwendung von Strategien entworfen werden, die unter mehreren Designkandidaten Prioritäten setzen. Zum Beispiel können die Techniken entworfen werden, um PEgRNA-Verlängerungen zu vermeiden, bei denen das 5'-nächste Nukleotid ein Cytosin ist (z. B. aufgrund der Unterbrechung der nativen Nukleotid-Protein-Interaktionen im sgRNA:Cas9-Komplex). Als weiteres Beispiel können die Techniken RNA-Sekundärstruktur-Vorhersagetools verwenden, um eine bevorzugte PBS-Länge, Flap-Länge und/oder dergleichen basierend auf anderen Parametern der verlängerten gRNA, wie etwa einem Protospacer, einer gewünschten Editierung und/oder dergleichen auszuwählen.
  • Eine beispielhafte Implementierung der in dieser Schrift beschriebenen computerisierten Techniken zur Bestimmung verlängerter gRNA-Strukturen ist wie folgt:
    Figure DE112020001306T5_0021
    Figure DE112020001306T5_0022
    Figure DE112020001306T5_0023
    Figure DE112020001306T5_0024
    Figure DE112020001306T5_0025
    Figure DE112020001306T5_0026
  • Die hiermit eingereichten beispielhaften Sequenzprotokolle wurden unter Verwendung der in dieser Schrift beschriebenen Techniken unter Verwendung der ClinVar-Datenbank für die Eingangsallele und die entsprechenden Ausgangsallele erzeugt. Die Einträge in der ClinVar-Datenbank wurden zunächst nach Keimbahnmutationen gefiltert, die als pathogen oder wahrscheinlich pathogen annotiert wurden. Für diese Beispiele wurden Cas9-NG und SpCas9 verwendet, um kompatible Mutationen zu identifizieren. Von den gefilterten Mutationen wurden etwa 72.020 einzigartige ClinVar-Mutationen als kompatibel mit dem Prime Editing mit Cas9-NG identifiziert, und etwa 63.496 einzigartige ClinVar-Mutationen wurden als kompatibel mit dem Prime Editing mit SpCas9 mit einem NGG-PAM identifiziert. Es versteht sich, dass andere und/oder zusätzliche Mutationen korrigierbar sein könnten, wenn ein Prime-Editor verwendet wird, der eine andere Cas9-Variante mit anderer PAM-Kompatibilität enthält.
  • In verschiedenen Ausführungsformen wurde der Algorithmus verwendet, um therapeutische PEgRNA der SEQ ID NOs: 1-135514 und 813085-880462 zu entwerfen, die unter Verwendung des in dieser Schrift offenbarten Algorithmus gegen ClinVar-Datenbankeinträge entworfen wurde.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen wurde der Algorithmus verwendet, um PEgRNA gegen die ClinVar-Datenbank unter Verwendung des in dieser Schrift offenbarten Algorithmus zu entwerfen, der in der Sequenzliste enthalten ist, die einen Teil dieser Beschreibung bildet. Das Sequenzprotokoll beinhaltet vollständige PEgRNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 1-135514 und 813085-880462. Jede dieser vollständigen PEgRNA besteht jeweils aus einem Spacer (SEQ ID NOs: 135515-271028 und 880463-947840) und einem Verlängerungsarm (SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218). Außerdem umfasst jede PEgRNA einen gRNA-Kern, beispielsweise wie durch SEQ ID NOs: 1361579-1361580 definiert. Die Verlängerungsarme der SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218 bestehen weiterhin jeweils aus einer Primerbindungsstelle (SEQ ID NOs: 406543-542056 und 1015219-1082596), einer Editiermatrize (SEQ ID NOs: 542057-677570 und 1082597-1149974) und einem Homologiearm (SEQ ID NOs: 677571-813084 und 1149975-1217352). Die PEgRNA kann optional eine 5'-Endmodifikatorregion und/oder eine 3'-Endmodifiziererregion umfassen. Die PEgRNA kann auch ein Reverse-Transkriptions-Terminationssignal (z. B. SEQ ID NOs: 1361560-1361566) am 3'-Ende von der PEgRNA umfassen. Die Anwendung umfasst den Entwurf und die Verwendung all dieser Sequenzen.
  • Die Mutationen wurden in vier Klassen von klinischer Signifikanz eingeteilt, wobei geringe Allelhäufigkeit, Anzahl der Einreicher, ob die Einsender in ihren Interpretationen widersprüchlich waren oder nicht und ob die Mutation von einem Expertengremium überprüft wurde, verwendet wurden. Unter den 63.496 SpCas9-kompatiblen Mutationen wurden 4.627 Mutationen auf dem signifikantesten Niveau (vier) identifiziert; 13.943 Mutationen wurden auf den Signifikanzniveaus drei oder vier identifiziert; und 44.385 Mutationen wurden auf den Signifikanzniveaus zwei, drei oder vier identifiziert.
  • Die bereitgestellten Sequenzprotokolle zählen eine einzelne PEgRNA pro eindeutiger Mutation auf, die als die PEgRNA mit dem kürzesten Abstand zwischen dem Nick und der Editierung ausgewählt wird. Die PEgRNA wurde mit einer Homologiearmlänge von 13 nt, einer Primerbindungsstellenlänge von 13 nt, einer gRNA-Nick-Position bei 17 nt und einer gRNA-Länge von 20 nt entworfen. Protospacer mit Nickstellen weiter als 20 nt von der Editierung entfernt wurden nicht berücksichtigt. Die verwendete gRNA-Rückgratsequenz war GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA AAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 1361579). Die verwendete Terminatorsequenz war TTTTTTGTTTT (SEQ ID NO: 1361581).
  • Wie in dieser Schrift beschrieben, sollen die bereitgestellten beispielhaften Sequenzprotokolle nicht einschränkend sein. Es sollte beachtet werden, dass Variationen der bereitgestellten PEgRNA -Designs in dieser Schrift beschriebene Variationen beinhalten können, einschließlich der Variation der gRNA-Rückgratsequenz, der Länge der Primerbindungsstelle, der Flap-Länge und/oder dergleichen.
  • Eine veranschaulichende Implementierung eines Computersystems 3400, das verwendet werden kann, um jeden der Aspekte der in dieser Schrift offenbarten Techniken und Ausführungsformen auszuführen, ist in 34 gezeigt. Das Computersystem 3400 kann einen oder mehrere Prozessoren 3410 und ein oder mehrere nichtflüchtige computerlesbare Speichermedien (z. B. Speicher 3420 und ein oder mehrere nichtflüchtige Speichermedien 3430) und eine Anzeige 3440 beinhalten. Der Prozessor 3410 kann das Schreiben von Daten in und das Lesen von Daten aus dem Speicher 3420 und der nichtflüchtigen Speichervorrichtung 3430 auf jede geeignete Weise steuern, da die in dieser Schrift beschriebenen Aspekte der Erfindung in dieser Hinsicht nicht beschränkt sind. Um in dieser Schrift beschriebene Funktionen und/oder Techniken auszuführen, kann der Prozessor 3410 eine oder mehrere Anweisungen ausführen, die in einem oder mehreren computerlesbaren Speichermedien (z. B. dem Speicher 3420, Speichermedien usw.) gespeichert sind, die als nichtflüchtige computerlesbare Speichermedien dienen können, die Anweisungen zur Ausführung durch den Prozessor 3410 speichern.
  • In Verbindung mit in dieser Schrift beschriebenen Techniken kann Code, der beispielsweise verwendet wird, um verlängerte gRNA-Strukturen zu bestimmen, auf einem oder mehreren computerlesbaren Speichermedien des Computersystems 3400 gespeichert werden. Der Prozessor 3410 kann jeden solchen Code ausführen, um beliebige Techniken zum Planen einer Übung bereitzustellen, wie in dieser Schrift beschrieben. Jede andere(n) in dieser Schrift beschriebene(n) Software, Programme oder Anweisungen können ebenfalls vom Computersystem 3400 gespeichert und ausgeführt werden. Es versteht sich, dass Computercode auf beliebige Aspekte der in dieser Schrift beschriebenen Verfahren und Techniken angewendet werden kann. Beispielsweise kann Computercode angewendet werden, um mit einem Betriebssystem zu interagieren, um verlängerte gRNA-Strukturen durch herkömmliche Betriebssystemprozesse zu bestimmen.
  • Die verschiedenen in dieser Schrift umrissenen Verfahren oder Prozesse können als Software codiert sein, die auf einem oder mehreren Prozessoren ausführbar ist, welche eines einer Vielzahl von Betriebssystemen oder Plattformen verwenden. Darüber hinaus kann eine solche Software unter Verwendung einer beliebigen von zahlreichen geeigneten Programmiersprachen und/oder Programmier- oder Scripting-Tools geschrieben werden und kann auch als ausführbarer Maschinensprachencode oder Zwischencode kompiliert werden, der auf einer virtuellen Maschine oder einem geeigneten Framework ausgeführt wird.
  • In dieser Hinsicht können verschiedene erfinderische Konzepte als mindestens ein nichtflüchtiges computerlesbares Speichermedium (z. B. ein Computerspeicher, eine oder mehrere Disketten, CDs, optische Platten, Magnetbänder, Flash-Speicher, Schaltungskonfigurationen in Field Programmierbare Gate-Arrays oder andere Halbleitervorrichtungen usw.) umgesetzt sein, das mit einem oder mehreren Programmen codiert sind, die bei Ausführung auf einem oder mehreren Computern oder anderen Prozessoren die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung implementieren. Das nichtflüchtige computerlesbare Medium oder die Medien können transportabel sein, sodass das darauf gespeicherte Programm oder die darauf gespeicherten Programme auf eine beliebige Computerressource geladen werden können, um verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend erörtert, zu implementieren.
  • Die Begriffe „Programm“, „Software“ und/oder „Anwendung“ werden in dieser Schrift in einem generischen Sinne verwendet, um sich auf jede Art von Computercode oder Satz von computerausführbaren Anweisungen zu beziehen, die verwendet werden können, um einen Computer oder einen anderen Prozessor dazu zu programmieren, verschiedene Aspekte von Ausführungsformen wie vorstehend erörtert zu implementieren. Außerdem versteht es sich, dass gemäß einem Aspekt ein oder mehrere Computerprogramme, die bei Ausführung Verfahren der vorliegenden Erfindung ausführen, sich nicht auf einem einzelnen Computer oder Prozessor befinden müssen, sondern modular auf verschiedene Computer oder Prozessoren verteilt sein können, um verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung implementieren.
  • Computerausführbare Anweisungen können in vielen Formen vorliegen, wie etwa als Programmmodule, die von einem oder mehreren Computern oder anderen Vorrichtungen ausgeführt werden. Im Allgemeinen beinhalten Programmmodule Routinen, Programme, Objekte, Komponenten, Datenstrukturen usw., die bestimmte Aufgaben durchführen oder bestimmte abstrakte Datentypen implementieren. Typischerweise kann die Funktionalität der Programmmodule in verschiedenen Ausführungsformen nach Wunsch kombiniert oder verteilt werden.
  • Außerdem können Datenstrukturen in jeder geeigneten Form in nichtflüchtigen computerlesbaren Speichermedien gespeichert werden. Datenstrukturen können Felder aufweisen, die mittels Position in der Datenstruktur verbunden sind. Solche Beziehungen können ebenfalls dadurch erzielt werden, dass Speicher für die Felder mit Positionen in einem nichtflüchtigen computerlesbaren Medium zugewiesen wird, die eine Beziehung zwischen den Feldern vermitteln. Jedoch kann jeder geeignete Mechanismus verwendet werden, um Beziehungen zwischen Informationen in Feldern einer Datenstruktur herzustellen, einschließlich durch die Verwendung von Zeigern, Tags oder anderen Mechanismen, die Beziehungen zwischen Datenelementen herstellen.
  • Verschiedene erfinderische Konzepte können als ein oder mehrere Verfahren umgesetzt sein, von denen Beispiele bereitgestellt wurden. Die als Teil eines Verfahrens durchgeführten Handlungen können auf jede geeignete Weise angeordnet werden. Dementsprechend können Ausführungsformen konstruiert werden, bei denen Handlungen in einer anderen als der dargestellten Reihenfolge durchgeführt werden, was das gleichzeitige Durchführen einiger Handlungen beinhalten kann, obwohl sie in veranschaulichenden Ausführungsformen als sequentielle Handlungen gezeigt sind.
  • III. Prime-Editoren zur Verwendung mit therapeutischer PEgRNA
  • Die gemäß dem in dieser Schrift offenbarten Algorithmus entworfene therapeutische PEgRNA kann verwendet werden, um Prime Editing durchzuführen, wenn es mit einem Prime-Editor komplexiert wird. Prime-Editoren umfassen ein napDNAbp, fusioniert mit einer Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) (oder einer, die in trans bereitgestellt wird), wobei die beiden Domänen optional durch Linker verbunden sind und ferner eine oder mehrere NLS umfassen können. Diese Aspekte werden wie folgt weiter beschrieben.
  • A. napDNAbp
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) umfassen.
  • In einem Aspekt kann ein napDNAbp mit mindestens einer Leitnukleinsäure (z. B. Leit-RNA oder einer PEgRNA) assoziiert oder komplexiert sein, die das napDNAbp an einer DNA-Sequenz lokalisiert, die einen DNA-Strang (d. h. einen Zielstrang) umfasst, der zu der Leitnukleinsäure oder einem Abschnitt davon komplementär ist (z. B. der Spacer einer Leit-RNA, die an den Protospacer des DNA-Ziels anlagert). Anders ausgedrückt „programmiert“ die Leitnukleinsäure das napDNAbp (z. B. Cas9 oder Äquivalent), um eine komplementäre Sequenz des Protospacers zu lokalisieren und in der DNA zu binden.
  • Jedes geeignete napDNAbp kann in den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren verwendet werden. In verschiedenen Ausführungsformen kann das napDNAbp ein beliebiges CRISPR-Cas-System der Klasse 2 sein, einschließlich eines beliebigen Typ-II-, Typ-V- oder Typ-VI-CRISPR-Cas-Enzyms. Angesichts der rasanten Entwicklung von CRISPR-Cas als Tool für die Genom-Editierung gibt es ständige Entwicklungen in der Nomenklatur, die zur Beschreibung und/oder Identifizierung von CRISPR-Cas-Enzymen, wie etwa Cas9- und Cas9-Orthologe verwendet wird. Diese Anmeldung verweist auf CRISPR-Cas-Enzyme, die alt und/oder neu sein können. Der Fachmann wird in der Lage sein, das spezifische CRISPR-Cas-Enzym, auf das in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, basierend auf der verwendeten Nomenklatur zu identifizieren, unabhängig davon, ob es sich um eine alte (d. h. „Legacy-“) oder neue Nomenklatur handelt. Die CRISPR-Cas-Nomenklatur wird in Makarova et al., „Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?“, The CRISPR Journal, Vol. 1. Nr. 5, 2018, ausführlich diskutiert, dessen gesamter Inhalt in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die besondere CRISPR-Cas-Nomenklatur, die in jedem gegebenen Fall in dieser Anmeldung verwendet wird, ist in keiner Weise einschränkend und der Fachmann wird in der Lage sein, zu identifizieren, auf welches CRISPR-Cas-Enzym Bezug genommen wird.
  • Zum Beispiel haben die folgenden Klasse-2-CRISPR-Cas-Enzyme von Typ II, Typ V und Typ VI die folgenden im Stand der Technik anerkannten alten (d. h. Legacy-) und neuen Namen. Jedes dieser Enzyme und/oder Varianten davon können mit den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren verwendet werden:
    Legacy-Nomenklatur Aktuelle Nomenklatur*
    Typ-II-CRISPR-Cas-Enzyme
    Cas9 gleich
    Typ-V-CRISPR-Cas-Enzyme
    Cpf1 Cas12a
    CasX Cas12e
    C2c1 Cas12b1
    Cas12b2 gleich
    C2c3 Cas12c
    CasY Cas12d
    C2c4 gleich
    C2c8 gleich
    C2c5 gleich
    C2c10 gleich
    C2c9 gleich
    Typ-VI-CRISPR-Cas-Enzyme
    C2c2 Cas13a
    Cas13d gleich
    C2c7 Cas13c
    C2c6 Cas13b

    * Siehe Makarova et al., The CRISPR Journal, Vol. 1, Nr. 5, 2018.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, beinhaltet der Wirkmechanismus gewisser in dieser Schrift in Betracht gezogener napDNAbp den Schritt der Bildung einer R-Schleife, wobei das napDNAbp das Abwickeln eines doppelsträngigen DNA-Ziels induziert, wodurch die Stränge in der durch das napDNAbp gebundenen Region getrennt werden. Der Leit-RNA-Spacer hybridisiert dann an den „Zielstrang“ an der Protospacer-Sequenz. Dadurch wird ein zum Zielstrang komplementärer „Nicht-Zielstrang“ verdrängt, der den Einzelstrangbereich der R-Schleife bildet. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das napDNAbp eine oder mehrere Nukleaseaktivitäten, die dann die DNA schneiden und verschiedene Arten von Läsionen hinterlassen. Zum Beispiel kann das napDNAbp eine Nukleaseaktivität umfassen, die den Nicht-Zielstrang an einer ersten Stelle schneidet und/oder den Zielstrang an einer zweiten Stelle schneidet. Je nach Nukleaseaktivität kann die Ziel-DNA zu einem „Doppelstrangbruch“ geschnitten werden, wobei beide Stränge durchtrennt werden. In anderen Ausführungsformen kann die Ziel-DNA nur an einer einzigen Stelle geschnitten werden, d. h. die DNA wird an einem Strang „genickt“. Beispielhafte napDNAbp mit unterschiedlichen Nukleaseaktivitäten beinhalten „Cas9-Nickase“ („nCas9“) und ein deaktiviertes Cas9 ohne Nukleaseaktivitäten („totes Cas9“ oder „dCas9“).
  • Die folgende Beschreibung verschiedener napDNAbps, die in Verbindung mit den gegenwärtig offenbarten Prime-Editoren verwendet werden können, soll in keiner Weise einschränkend sein. Die Prime-Editoren können das kanonische SpCas9 oder ein beliebiges orthologisches Cas9-Protein oder eine beliebige Variante des Cas9-Proteins umfassen - einschließlich jeder natürlich vorkommenden Variante, Mutante oder anderweitig konstruierten Version von Cas9 - die bekannt ist oder durch eine gesteuerte Evolution oder einen anderweitigen mutagenen Prozess hergestellt oder entwickelt werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen weisen die Cas9- oder Cas9-Varianten eine Nickase-Aktivität auf, d. h. sie spalten nur einen Strang der Ziel-DNA-Sequenz. In anderen Ausführungsformen weisen die Cas9- oder Cas9-Varianten inaktive Nukleasen auf, d. h. sind „tote“ Cas9-Proteine. Andere Varianten von Cas9-Proteinen, die verwendet werden können, sind solche mit einem kleineren Molekulargewicht als das kanonische SpCas9 (z. B. für eine einfachere Zuführung) oder mit einer modifizierten oder neu angeordneten primären Aminosäurestruktur (z. B. die zirkulären permutanten Formate).
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können auch Cas9-Äquivalente umfassen, einschließlich Cas12a (Cpf1)- und Cas12b1-Proteine, die das Ergebnis einer konvergenten Evolution sind. Die in dieser Schrift verwendeten napDNAbps (z. B. SpCas9, Cas9-Variante oder Cas9-Äquivalente) können auch verschiedene Modifikationen enthalten, die ihre PAM-Spezifitäten ändern/verbessern. Schließlich berücksichtigt die Anmeldung alle Cas9-, Cas9-Varianten oder Cas9-Äquivalente, die mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, oder mindestens 99,9 % Sequenzidentität mit einer Referenz-Cas9-Sequenz, wie etwa einer kanonischen Referenzsequenz von SpCas9 oder einem Referenz-Cas9-Äquivalent (z. B. Cas12a (Cpf1)) aufweisen.
  • Das napDNAbp kann eine CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat)-assoziierte Nuklease sein. Wie vorstehend erläuterst, ist CRISPR ein adaptives Immunsystem, das Schutz gegen mobile genetische Elemente (Viren, transponierbare Elemente und konjugative Plasmide) bietet. CRISPR-Cluster enthalten Spacer, Sequenzen, die komplementär zu vorhergehenden mobilen Elementen sind, und zielen auf eindringende Nukleinsäuren ab. CRISPR-Cluster werden transkribiert und zu CRISPR-RNA (crRNA) verarbeitet. In Typ-II-CRISPR-Systemen erfordert die korrekte Verarbeitung von prä-crRNA eine transcodierte kleine RNA (tracrRNA), endogene Ribonuklease 3 (rnc) und ein Cas9-Protein. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease-3-unterstützte Verarbeitung von prä-crRNA. Anschließend spaltet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres dsDNA-Ziel, das zum Spacer komplementär ist. Der zur crRNA nicht komplementäre Zielstrang wird zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch 3'-5' getrimmt. In der Natur erfordert die DNA-Bindung und -Spaltung typischerweise Protein und beide RNAs. Einzelne Leit-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gRNA“) können jedoch so konstruiert werden, dass Aspekte sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies integriert werden. Siehe z. B. Jinek M. et al., Science 337:816-821(2012), desseb gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • In einigen Ausführungsformen steuert das napDNAbp die Spaltung eines oder beider Stränge an der Stelle einer Zielsequenz, wie etwa innerhalb der Zielsequenz und/oder innerhalb des Komplements der Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen steuert das napDNAbp die Spaltung eines oder beider Stränge innerhalb von etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 oder mehr Basenpaare vom ersten oder letzten Nukleotid einer Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen codiert ein Vektor ein napDNAbp, das bezüglich eines entsprechenden Wildtyp-Enzyms mutiert ist, sodass dem mutierten napDNAbp die Fähigkeit fehlt, einen oder beide Stränge eines Zielpolynukleotids, das eine Zielsequenz enthält, zu spalten. Zum Beispiel wandelt eine Aspartat-zu-Alanin-Substitution (D10A) in der katalytischen RuvC-I-Domäne von Cas9 aus S. pyogenes Cas9 von einer Nuklease um, die beide Stränge in eine Nickase spaltet (spaltet einen Einzelstrang). Andere Beispiele für Mutationen, die Cas9 zu einer Nickase machen, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, H840A, N854A und N863A in Bezug auf die kanonische SpCas9-Sequenz oder auf äquivalente Aminosäurepositionen in anderen Cas9-Varianten oder Cas9-Äquivalenten.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Cas-Protein“ ein aus der Natur gewonnenes Cas-Protein voller Länge, ein rekombinantes Cas-Protein mit einer Sequenz, die sich von einem natürlich vorkommenden Cas-Protein unterscheidet, oder ein beliebiges Fragment eines Cas-Proteins, das dennoch alle oder eine signifikante Menge der erforderlichen Grundfunktionen, die für die offenbarten Verfahren benötigt werden, behält, d. h. (i) den Besitz einer programmierbaren Nukleinsäure-Bindung des Cas-Proteins an eine Ziel-DNA und (ii) die Fähigkeit, die Ziel-DNA-Sequenz an einem Strang zu nicken. Die in dieser Schrift in Betracht gezogenen Cas-Proteine umfassen CRISPR-Cas9-Proteine sowie Cas9-Äquivalente, Varianten (z. B. Cas9-Nickase (nCas9) oder Nuklease-inaktives Cas9 (dCas9)), Homologe, Orthologe oder Paraloge, ob natürlich vorkommend oder nicht-natürlich vorkommend (z. B. manipuliert oder rekombinant) und können ein Cas9-Äquivalent aus einem CRISPR-System der Klasse 2 (z. B. Typ II, V, VI) beinhalten, einschließlich Cas12a (Cpf1), Cas12e (CasX), Cas12b1 (C2c1), Cas12b2, Cas12c (C2c3), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9 Cas13a (C2c2), Cas13d, Cas13c (C2c7), Cas13b (C2c6) und Cas13b. Weitere Cas-Äquivalente sind in Makarova et al., „C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,“, Science 2016; 353(6299) und Makarova et al., „Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?“, The CRISPR Journal, Vol. 1. Nr. 5, 2018, beschrieben, deren Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die Begriffe „Cas9“ oder „Cas9-Nuklease“ oder „Cas9-Einheit“ oder „Cas9-Domäne“ umfassen jedes natürlich vorkommende Cas9 aus einem beliebigen Organismus, jedes natürlich vorkommende Cas9-Äquivalent oder funktionelles Fragment davon, jedes Cas9-Homolog, Ortholog oder Paralog aus einem beliebigen Organismus und jede Mutante oder Variante eines Cas9, ob natürlich vorkommend oder manipuliert. Der Begriff Cas9 soll nicht besonders einschränkend sein und kann als „Cas9 oder Äquivalent“ bezeichnet werden. Beispielhafte Cas9-Proteine werden in dieser Schrift weiter beschrieben und/oder sind im Stand der Technik beschrieben und werden in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen. Die vorliegende Offenbarung ist in Bezug auf das spezielle Cas9, das im Prime-Editor(PE) der Erfindung verwendet wird, unbegrenzt.
  • Wie in dieser Schrift erwähnt, sind Cas9-Nuklease-Sequenzen und -Strukturen dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. „Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes“. Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4658-4663(2001); „CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.“ Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); und „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity“. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), dessen gesamter Inhalt jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird.
  • Beispiele für Cas9- und Cas9-Äquivalente werden wie folgt bereitgestellt; diese spezifischen Beispiele sollen jedoch nicht einschränkend sein. Der Primer-Editor der vorliegenden Offenbarung kann jedes geeignete napDNAbp verwenden, einschließlich jedes geeigneten Cas9 oder Cas9-Äquivalents.
  • (i) Kanonisches Wildtyp-SpCas9
  • In einer Ausführungsform können die in dieser Schrift beschriebenen Primer-Editor-Konstrukte die „kanonische SpCas9“-Nuklease aus S. pyogenes umfassen, die als Tool für die Genomkonstruktion weit verbreitet ist und als Typ-II-Untergruppe von Enzymen der Klasse-2-CRISPR-Cas-Systeme kategorisiert ist. Dieses Cas9-Protein ist ein großes Multidomänenprotein, das zwei verschiedene Nukleasedomänen enthält. In Cas9 können Punktmutationen eingeführt werden, um eine oder beide Nukleaseaktivitäten aufzuheben, was zu einer Nickase-Cas9 (nCas9) bzw. totem Cas9 (dCas9) führt, das immer noch seine Fähigkeit behält, DNA sgRNAprogrammiert zu binden. Im Prinzip kann Cas9 oder eine Variante davon (z. B. nCas9), wenn es mit einem anderen Protein oder einer anderen Domäne fusioniert ist, dieses Protein einfach durch Co-Expression mit einer geeigneten sgRNA auf praktisch jede DNA-Sequenz richten. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet das kanonische SpCas9-Protein das Wildtyp-Protein von Streptococcus pyogenes mit der folgenden Aminosäuresequenz:
    Figure DE112020001306T5_0027
    Figure DE112020001306T5_0028
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können kanonische SpCas9 oder eine beliebige Variante davon mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit einer vorstehend bereitgestellten Wildtyp-Cas9-Sequenz beinhalten. Diese Varianten können SpCas9-Varianten beinhalten, die eine oder mehrere Mutationen enthalten, einschließlich jeder bekannten Mutation, die mit dem Eintrag der SwissProt-Zugangsnummer Q99ZW2 gemeldet wurde, einschließlich:
    SpCas9-Mutation (relativ zur Aminosäuresequenz der kanonischen SpCas9-Sequenz, SEQ ID NOs: 1361421) Funktion/Charakteristik (wie gemeldet) (siehe UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9 STRPT1) Eintrag - in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen)
    D10A Nickase-Mutante, die den Protospacer-Strang spaltet (aber keine Spaltung des Nicht-Protospacer-Strangs)
    S15A Verminderte DNA-Spaltungsaktivität
    R66A Verminderte DNA-Spaltungsaktivität
    R70A Keine DNA-Spaltung
    R74A Verminderte DNA-Spaltung
    R78A Verminderte DNA-Spaltung
    97-150 Deletion Keine Nukleaseaktivität
    R165A Verminderte DNA-Spaltung
    175-307 Deletion Etwa 50 % verminderte DNA-Spaltung
    312-409 Deletion Keine Nukleaseaktivität
    E762A Nickase
    H840A Nickase-Mutante, die den Nicht-Protospacer-Strang spaltet, aber nicht den Protospacer-Strang spaltet
    N854A Nickase
    N863A Nickase
    H982A Verminderte DNA-Spaltung
    D986A Nickase
    1099-1368 Deletion Keine Nukleaseaktivität
    R1333A Reduzierte DNA-Bindung
  • Andere Wildtyp-SpCas9-Sequenzen, die in der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, beinhalten:
    Figure DE112020001306T5_0029
    Figure DE112020001306T5_0030
    Figure DE112020001306T5_0031
    Figure DE112020001306T5_0032
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können jede der vorstehenden SpCas9-Sequenzen oder jede Variante davon mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99% Sequenzidentität dazu beinhalten.
  • (ii) Wildtyp-Cas9-Orthologe
  • In anderen Ausführungsformen kann das Cas9-Protein ein Wildtyp-Cas9-Orthologe einer anderen Bakterienart sein, die sich von dem kanonischen Cas9 aus S. pyogenes unterscheidet. Beispielsweise können die folgenden Cas9-Orthologe in Verbindung mit den in dieser Beschreibung beschriebenen Prime-Editor-Konstrukten verwendet werden. Darüber hinaus kann jede Variante von Cas9-Orthologen mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit einem der untenstehenden Orthologe auch mit den vorliegenden Prime-Editoren verwendet werden.
    Figure DE112020001306T5_0033
    Figure DE112020001306T5_0034
    Figure DE112020001306T5_0035
    Figure DE112020001306T5_0036
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können jede der vorstehenden Cas9-Ortholog-Sequenzen oder jede Variante davon mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu beinhalten.
  • Das napDNAbp kann beliebige geeignete Homologe und/oder Orthologe oder natürlich vorkommende Enzyme, wie etwa Cas9, beinhalten. Cas9-Homologe und/oder Orthologe wurden in verschiedenen Spezies beschrieben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, in S. pyogenes und S. thermophilus. Vorzugsweise ist die Cas-Einheit als Nickase konfiguriert (z. B. mutagenisiert, rekombinant hergestellt oder auf andere Weise aus der Natur gewonnen), d. h. sie ist in der Lage, nur einen Einzelstrang des Zieldoppelstrangs zu spalten. Zusätzliche geeignete Cas9-Nukleasen und -Sequenzen werden für den Fachmann auf Grundlage dieser Offenbarung ersichtlich sein, und solche Cas9-Nukleasen und -Sequenzen beinhalten Cas9-Sequenzen aus den Organismen und Loci, die in Chylinski, Rhun und Charpentier, „The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems“ (2013) RNA Biology 10:5, 726-737; offenbart sind, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einigen Ausführungsformen weist eine Cas9-Nuklease eine inaktive (z. B. eine inaktivierte) DNA-Spaltungsdomäne auf, das heißt, die Cas9 ist eine Nickase. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie von einer der Varianten von Tabelle 3 bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz Säuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie es von einem der Cas9-Orthologe in den vorstehenden Tabellen bereitgestellt wird.
  • (iii)Tote Cas9- Variante
  • In einigen Ausführungsformen können die in dieser Schriftt beschriebenen Prime-Editoren ein totes Cas9 beinhalten, z. B. totes SpCas9, das aufgrund einer oder mehrerer Mutationen keine Nukleaseaktivität aufweist, die beide Nukleasedomänen von Cas9 inaktivieren, nämlich die RuvC-Domäne (die den Nicht-Protospacer-DNA-Strang spaltet) und die HNH-Domäne (die den Protospacer-DNA-Strang spaltet). Die Nuklease-Inaktivierung kann auf eine oder mehrere Mutationen zurückzuführen sein, die zu einer oder mehreren Substitutionen und/oder Deletionen in der Aminosäuresequenz des codierten Proteins oder jeglichen Varianten davon, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu aufweisen, führen.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „dCas9“ ein Nuklease-inaktives Cas9 oder Nuklease-totes Cas9 oder ein funktionelles Fragment davon und umfasst jedes natürlich vorkommende dCas9 aus einem beliebigen Organismus, jedes natürlich vorkommende dCas9-Äquivalent oder funktionelles Fragment davon, jedes dCas9-Homolog, Ortholog oder Paralog von jedem Organismus und jede Mutante oder Variante eines dCas9, ob natürlich vorkommend oder technisch hergestellt. Der Begriff dCas9 soll nicht besonders einschränkend sein und kann als „dCas9 oder Äquivalent“ bezeichnet werden. Beispielhafte dCas9-Proteine und Verfahren zur Herstellung von dCas9-Proteinen werden in dieser Schrift weiter beschrieben und/oder sind im Stand der Technik beschrieben und werden in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen.
  • In anderen Ausführungsformen entspricht dCas9 einer Cas9-Aminosäuresequenz mit einer oder mehreren Mutationen, welche die Cas9-Nukleaseaktivität inaktivieren, oder umfasst diese ganz oder teilweise. In anderen Ausführungsformen werden Cas9-Varianten mit anderen Mutationen als D10A und H840A bereitgestellt, die zur vollständigen oder teilweisen Inaktivierung der endogenen Cas9-Nukleaseaktivität (z. B. nCas9 bzw. dCas9) führen können. Solche Mutationen umfassen beispielsweise andere Aminosäuresubstitutionen an D10 und H820 oder andere Substitutionen innerhalb der Nukleasedomänen von Cas9 (z. B. Substitutionen in der HNH-Nukleasesubdomäne und/oder der RuvC1-Subdomäne) unter Bezugnahme auf eine Wildtyp-Sequenz wie etewa Cas9 aus Streptococcus pyogenes (NCBI-Referenzsequenz: NC_017053.1 (SEQ ID NO: 1361424)). In einigen Ausführungsformen sind Varianten oder Homologe von Cas9 (z. B. Varianten von Cas9 aus Streptococcus pyogenes (NCBI-Referenzsequenz: NC_017053.1 (SEQ ID NO: 1361424)) bereitgestellt, die zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit der NCBI-Referenzsequenz: NC_017053.1 (SEQ ID NO: 1361424) sind. In einigen Ausführungsformen werden Varianten von dCas9 (z. B. Varianten der NCBI-Referenzsequenz: NC_017053.1 (SEQ ID NO: 1361424)) mit Aminosäuresequenzen bereitgestellt, die um etwa 5 Aminosäuren, um etwa 10 Aminosäuren, um etwa 15 Aminosäuren, um etwa 20 Aminosäuren, um etwa 25 Aminosäuren, um etwa 30 Aminosäuren, um etwa 40 Aminosäuren, um etwa 50 Aminosäuren, etwa 75 Aminosäuren, etwa 100 Aminosäuren oder mehr kürzer oder länger sind als NC _017053.1 (SEQ ID NO: 1361424).
  • In einer Ausführungsform kann das tote Cas9 auf der kanonischen SpCas9-Sequenz von Q99ZW2 basieren und kann die folgende Sequenz, die eine D10A- und eine H810A-Substitution (unterstrichen und fett) umfasst, oder eine Variante von SEQ ID NO: 1361444 mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu aufweisen:
    Figure DE112020001306T5_0037
    Figure DE112020001306T5_0038
  • (iv) Cas9-Nickase- Variante
  • In einer Ausführungsform umfassen die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren eine Cas9-Nickase. Der Begriff „Cas9-Nickase“ von „nCas9“ bezieht sich auf eine Variante von Cas9, die in der Lage ist, einen Einzelstrangbruch in ein doppelsträngiges DNA-Molekül-Target einzuführen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Cas9-Nickase nur eine einzige funktionierende Nukleasedomäne. Das Wildtyp-Cas9 (z. B. das kanonische SpCas9) umfasst zwei separate Nukleasedomänen, nämlich die RuvC-Domäne (die den Nicht-Protospacer-DNA-Strang spaltet) und die HNH-Domäne (die den Protospacer-DNA-Strang spaltet). In einer Ausführungsform umfasst die Cas9-Nickase eine Mutation in der RuvC-Domäne, welche die RuvC-Nukleaseaktivität inaktiviert. Beispielsweise wurden Mutationen in Aspartat (D) 10, Histidin (H) 983, Aspartat (D) 986 oder Glutamat (E) 762 als funktionslose Mutationen der RuvC-Nukleasedomäne und die Entstehung einer funktionellen Cas9-Nickase (z. B. Nishimasu et al., „Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA“, Cell 156(5), 935-949, in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen) gemeldet. Somit könnten Nickase-Mutationen in der RuvC-Domäne D10X, H983X, D986X oder E762X beinhalten, wobei X eine beliebige andere Aminosäure als die Wildtyp-Aminosäure ist. In einigen Ausführungsformen könnte die Nickase D10A, von H983A oder D986A oder E762A oder eine Kombination davon sein.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die Cas9-Nickase eine Mutation in der RuvC-Nukleasedomäne aufweisen und eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder eine Variante davon mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu aufweisen.
    Figure DE112020001306T5_0039
    Figure DE112020001306T5_0040
    Figure DE112020001306T5_0041
  • In einer Ausführungsform umfasst die Cas9-Nickase eine Mutation in der HNH-Domäne, welche die HNH-Nukleaseaktivität inaktiviert. Beispielsweise wurden Mutationen in Histidin (H) 840 oder Asparagin (R) 863 als funktionslose Mutationen der HNH-Nukleasedomäne und die Entstehung einer funktionellen Cas9-Nickase (z. B. Nishimasu et al. , „Kristallstruktur vonCas9 im Komplex mit Leit- RNA und Ziel-DNA“, Cell 156(5), 935-949, die in dieser Schrift durch Bezugnahme eingeschlossen ist), gemeldet. Somit könnten Nickase-Mutationen in der HNH-Domäne H840X und R863X beinhalten, wobei X eine beliebige andere Aminosäure als die Wildtyp-Aminosäure ist. In einigen Ausführungsformen könnte die Nickase H840A oder R863A oder eine Kombination davon sein.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die Cas9-Nickase eine Mutation in der HNH-Nukleasedomäne aufweisen und eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder eine Variante davon mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu aufweisen.
    Figure DE112020001306T5_0042
    Figure DE112020001306T5_0043
  • (v) Andere Cas9-Varianten
  • Neben toten Cas9- und Cas9-Nickase-Varianten können die in dieser Schrift verwendeten Cas9-Proteine auch andere „Cas9-Varianten“ umfassen, die zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch sind, mindestens 96% identisch, mindestens 97% identisch, mindestens 98% identisch, mindestens 99% identisch, mindestens 99,5 % identisch oder mindestens 99,9% identisch mit einem beliebigen Referenz-Cas9-Protein, einschließlich jedes Wildtyp-Cas9 oder mutantes Cas9 (z. B. ein totes Cas9 oder eine Cas9-Nickase) oder Fragment-Cas9 oder zirkuläres permutantes Cas9 oder eine andere in dieser Schrift offenbarte oder im Fachgebiet bekannte Variante von Cas9. In einigen Ausführungsformen kann eine Cas9-Variante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 oder mehr Aminosäureänderungen im Vergleich zu einem Referenz-Cas9 aufweisen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Cas9-Variante ein Fragment eines Referenz-Cas9 (z. B. eine gRNA-Bindungsdomäne oder eine DNA-Spaltungsdomäne), sodass das Fragment zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99% identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch, oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment von Wildtyp-Cas9 ist. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment zu mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 %, mindestens 50 %, mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäurelänge eines entsprechenden Wildtyp-Cas9 (z. B. SEQ ID NOs: 1361421).
  • In einigen Ausführungsformen kann die Offenbarung auch Cas9-Fragmente verwenden, die ihre Funktionalität beibehalten und die Fragmente eines beliebigen in dieser Schrift offenbarten Cas9-Proteins sind. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Fragment eine Länge von mindestens 100 Aminosäuren auf. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment mindestens 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250 oder mindestens 1300 Aminosäuren lang.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren eine der wie folgt beschriebenen Cas9-Varianten oder eine Cas9-Variante davon umfassen, die zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95% identisch, mindestens etwa 96% identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99% identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit Referenz-Cas9-Varianten ist.
  • (vi) Kleine Cas9-Varianten
  • In einigen Ausführungsformen können die in dieser Schrift in Betracht gezogenen Prime-Editoren ein Cas9-Protein einschließen, das ein geringeres Molekulargewicht als die kanonische SpCas9-Sequenz hat. In einigen Ausführungsformen können die kleineren Cas9-Varianten die Zuführung an Zellen erleichtern, z. B. durch einen Expressionsvektor, Nanopartikel oder andere Zuführungsmittel. In bestimmten Ausführungsformen können die kleineren Cas9-Varianten Enzyme beinhalten, die als Typ-II-Enzyme der Klasse-2-CRISPR-Cas-Systeme kategorisiert sind. In einigen Ausführungsformen können die kleineren Cas9-Varianten Enzyme beinhalten, die als Typ-V-Enzyme der Klasse-2-CRISPR-Cas-Systeme kategorisiert sind. In anderen Ausführungsformen können die kleineren Cas9-Varianten Enzyme beinhalten, die als Typ-VI-Enzyme der Klasse-2-CRISPR-Cas-Systeme kategorisiert sind.
  • Das kanonische SpCas9-Protein ist 1368 Aminosäuren lang und weist ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 158 Kilodalton auf. Der Begriff „kleine Cas9-Variante“, wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet jede Cas9-Variante - natürlich vorkommend, konstruiert oder anderweitig - die weniger als mindestens 1300 Aminosäuren oder mindestens weniger als 1290 Aminosäuren oder weniger als 1280 Aminosäuren oder weniger als 1270 Aminosäuren oder weniger als 1260 Aminosäuren oder weniger als 1250 Aminosäuren oder weniger als 1240 Aminosäuren oder weniger als 1230 Aminosäuren oder weniger als 1220 Aminosäuren oder weniger als 1210 Aminosäuren oder weniger als 1200 Aminosäuren oder weniger als 1190 Aminosäuren oder weniger als 1180 Aminosäuren oder weniger als 1170 Aminosäuren oder weniger als 1160 Aminosäuren oder weniger als 1150 Aminosäuren oder weniger als 1140 Aminosäuren oder weniger als 1130 Aminosäuren oder weniger als 1120 Aminosäuren oder weniger als 1110 Aminosäuren oder weniger als 1100 Aminosäuren oder weniger als 1050 Aminosäuren oder weniger als 1000 Aminosäuren oder weniger als 950 Aminosäuren oder weniger als 900 Aminosäuren oder weniger als 850 Aminosäuren oder weniger als 800 Aminosäuren oder weniger als 750 Aminosäuren oder weniger als 700 Aminosäuren oder weniger als 650 Aminosäuren oder weniger als 600 Aminosäuren oder weniger als 550 Aminosäuren oder weniger als 500 Aminosäuren, aber mindestens mehr als etwa 400 Aminosäuren enthält und die erforderlichen Funktionen des Cas9-Proteins beibehält. Die Cas9-Varianten können diejenigen beinhalten, die als Typ-II-, Typ-V- oder Typ-VI-Enzyme des Klasse-2-CRISPR-Cas-Systems kategorisiert sind.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren eine der wie folgt beschriebenen kleinen Cas9-Varianten oder eine Cas9-Variante davon umfassen, die zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95% identisch, mindestens etwa 96% identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99% identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit einem kleinen Referenz-Cas9-Protein ist.
    Figure DE112020001306T5_0044
    Figure DE112020001306T5_0045
  • (vii) Cas9-Äquivalente
  • In einigen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren jedes Cas9-Äquivalent umfassen. Wie in dieser Schrift verwendet, ist der Begriff „Cas9-Äquivalent“ ein breiter Begriff, der jedes napDNAbp-Protein umfasst, das die gleiche Funktion wie Cas9 in den vorliegenden Prime-Editoren erfüllt, obwohl seine Aminosäure-Primärsequenz und/oder seine dreidimensionale Struktur möglicherweise unterschiedlich und/oder aus evolutionärer Sicht nicht verwandt ist. Während Cas9-Äquivalente also beliebige Cas9-Orthologe, Homologe, Mutanten oder Varianten beinhalten, die in dieser Schrift beschrieben oder umfasst sind und die evolutionär verwandt sind, umfassen die Cas9-Äquivalente also auch Proteine, die sich möglicherweise durch konvergente Evolutionsprozesse entwickelt haben, um die gleiche oder eine ähnliche Funktion wie Cas9 zu haben, aber die hinsichtlich der Aminosäuresequenz und/oder dreidimensionalen Struktur nicht unbedingt Ähnlichkeiten aufweisen. Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren umfassen jedes Cas9-Äquivalent, das dieselbe oder eine ähnliche Funktion wie Cas9 bereitstellen würde, obwohl das Cas9-Äquivalent auf einem Protein basieren könnte, das durch konvergente Evolution entstanden ist. Wenn sich Cas9 zum Beispiel auf ein Enzym des Typs II des CRISPR-Cas-Systems bezieht, kann sich ein Cas9-Äquivalent auf ein Enzym des Typs V oder Typ VI des CRISPR-Cas-Systems beziehen.
  • Casl2e (CasX) ist beispielsweise ein Cas9-Äquivalent, das angeblich die gleiche Funktion wie Cas9 hat, sich aber durch konvergente Evolution entwickelt hat. Somit wird das in Liu et al., „CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors“, Nature, 2019, Vol. 566: 218-223, beschreibene Casl2e(CasX)-Protein zur Verwendung mit den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren in Betracht gezogen. Darüber hinaus ist jede Variante oder Modifikation von Cas12e (CasX) denkbar und liegt im Umfang der vorliegenden Offenbarung.
  • Cas9 ist ein bakterielles Enzym, das sich in einer Vielzahl von Arten entwickelt hat. Die in dieser Schrift in Betracht gezogenen Cas9-Äquivalente können jedoch auch aus Archaeen gewonnen werden, die eine Domäne und ein Reich einzelliger prokaryontischer Mikroben darstellen, die sich von Bakterien unterscheiden.
  • In einigen Ausführungsformen können sich Cas9-Äquivalente auf Cas12e (CasX) oder Cas12d (CasY) beziehen, die beispielsweise in Burstein et al., „New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes“ Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21, beschrieben wurden, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Mittels genomaufgelöster Metagenomik wurde eine Reihe von CRISPR-Cas-Systemen identifiziert, darunter das erste beschriebene Cas9 im archaealen Lebensbereich. Dieses divergente Cas9-Protein wurde in wenig erforschten Nanoarchaea als Teil eines aktiven CRISPR-Cas-Systems gefunden. In Bakterien wurden zwei bisher unbekannte Systeme entdeckt, CRISPR-Cas 12e und CRISPR-Cas 12d, die zu den kompaktesten Systemen gehören, die bislang entdeckt wurden. In einigen Ausführungsformen bezieht sich Cas9 auf Cas12e oder eine Variante von Casl2e. In einigen Ausführungsformen bezieht sich Cas9 auf Cas12d oder eine Variante von Cas12d. Es versteht sich, dass andere RNA-geleitete DNA-Bindungsproteine als Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) verwendet werden können und im Umfang dieser Offenbarung liegen. Siehe auch Liu et al., „CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors“, Nature, 2019, Vol. 566: 218-223. Jedes dieser Cas9-Äquivalente wird in Betracht gezogen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Äquivalent eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit einem natürlich vorkommenden Cas12e (CasX)- oder Cas12d (CasY)-Protein ist. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein natürlich vorkommendes Cas12e(CasX)- oder Cas12d(CasY)-Protein. In einigen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, oder mindestens 99,5% identisch mit einer Wildtyp-Cas-Einheit oder einer beliebigen in dieser Schrift bereitgestellten Cas-Einheit.
  • In verschiedenen Ausführungsformen beinhalten die nukleinsäureprogrammierbaren DNA-bindenden Proteine ohne Einschränkung Cas9 (z. B. dCas9 und nCas9), Cas12e (CasX), Cas12d (CasY), Casl2a (Cpfl), Cas12bl (C2cl), Cas13a (C2c2), Casl2c (C2c3), Argonaute, und Cas12b1. Ein Beispiel für ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-bindendes Protein, das eine andere PAM-Spezifität als Cas9 aufweist, sind Clustered Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats von Prevotella und Francisella 1 (d. h. Cas12a (Cpfl)). Ähnlich wie Cas9 ist auch Cas12a (Cpfl) ein CRISPR-Effektor der Klasse 2, gehört jedoch zur Typ-V-Untergruppe von Enzymen und nicht zur Typ-II-Untergruppe. Es wurde gezeigt, dass Casl2a (Cpfl) eine robuste DNA-Interferenz mit Eigenschaften vermittelt, die sich von Cas9 unterscheiden. Casl2a (Cpfl) ist eine einzelne RNA-geleitete Endonuklease, der tracrRNA fehlt, und sie verwendet ein T-reiches Protospacer-Nachbarmotiv (TTN, TTTN oder YTN). Darüber hinaus spaltet Cpfl DNA über einen gestaffelten DNA-Doppelstrangbruch. Von 16 Proteinen der Cpfl-Familie haben zwei Enzyme aus Acidaminococcus und Lachnospiraceae eine effiziente Genom-Editierungsaktivität in menschlichen Zellen. Cpfl-Proteine sind im Stand der Technik bekannt und wurden bereits beschrieben, beispielsweise bei Yamano et al., „Crystal structure of Cpfl in complex with guide RNA and target DNA.“ Cell (165) 2016, p. 949-962; dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • In noch anderen Ausführungsformen kann das Cas-Protein ein beliebiges CRISPRassoziiertes Protein beinhalten, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein Cas12a, Cas12b1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (auch bekannt als Csn1 und Csx12), Cs10, Csy1, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17,Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Homologe davon oder modifizierte Versionen davon, und vorzugsweise eine Nickase-Mutation umfassend (z. B. eine Mutation entsprechend der D10A-Mutation des wilden Typ Cas9-Polypeptid von SEQ ID NOs: 1361421).
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann das napDNAbp eines der folgenden Proteine sein: ein Cas9, ein Cas12a (Cpfl), ein Cas12e (CasX), ein Cas12d (CasY), ein Cas12b1 (C2c1), ein Cas13a (C2c2), ein Cas12c (C2c3), ein GeoCas9, ein CjCas9, ein Cas12g, ein Casl2h, ein Cas12i, ein Casl3b, ein Casl3c, ein Casl3d, ein Casl4, ein Csn2, ein xCas9, ein SpCas9-NG, ein zirkulär permutiertes Cas9 oder eine Argonaut(Ago)-Domäne oder eine Variante davon.
  • Beispielhafte Cas9-äquivalente Proteinsequenzen können folgende beinhalten:
    Figure DE112020001306T5_0046
    Figure DE112020001306T5_0047
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können auch Cas12a/Cpf1(dCpf1)-Varianten umfassen, die als Leitnukleotidsequenz-programmierbare DNA-bindende Proteindomäne verwendet werden können. Das Cas12a/Cpfl-Protein hat eine RuvC-ähnliche Endonukleasedomäne, die der RuvC-Domäne von Cas9 ähnlich ist, aber keine HNH-Endonukleasedomäne hat, und der N-Terminus von Cpfl weist nicht den alpha-helikalen Erkennungslappen von Cas9 auf. Es wurde in Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015 (in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen) gezeigt, dass die RuvC-ähnliche Domäne von Cpfl für die Spaltung beider DNA-Stränge verantwortlich ist und die Inaktivierung der RuvC-ähnlichen Domäne die Cpfl-Nukleaseaktivität inaktiviert. Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editors können auch Cas12a(Cpfl)(dCpf1)-Varianten umfassen, die als eine Leitnukleotidsequenz-programmierbare DNA-bindende Proteindomäne verwendet werden können. Das 1Cas12a(Cpf1)-Protein hat eine RuvC-ähnliche Endonukleasedomäne, die der RuvC-Domäne von Cas9 ähnlich ist, aber keine HNH-Endonukleasedomäne hat, und der N-Terminus von Cas 12a (Cpfl) weist nicht den alpha-helikalen Erkennungslappen von Cas9 auf. Es wurde in Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015 (in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen) gezeigt, dass die RuvC-ähnliche Domäne von Cas12a (Cpfl) für die Spaltung beider DNA-Stränge verantwortlich ist und die Inaktivierung der RuvC-ähnlichen Domäne die Casl2a(Cpfl)-Nukleaseaktivität inaktiviert.
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein einzelner Effektor eines mikrobiellen CRISPR-Cas-Systems. Einzelne Effektoren von mikrobiellen CRISPR-Cas-Systemen beinhalten ohne Einschränkung Cas9, Cas12a (Cpfl), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2) und Cas12c (C2c3). Typischerweise werden mikrobielle CRISPR-Cas-Systeme in Systeme der Klasse 1 und Klasse 2 unterteilt. Klasse-1-Systeme haben Effektorkomplexe aus mehreren Untereinheiten, während Klasse-2-Systeme einen einzelnen Proteineffektor haben. Cas9 und Cas12a (Cpfl) sind beispielsweise Effektoren der Klasse 2. Zusätzlich zu Cas9 und Cas12a (Cpfl) wurden drei verschiedene CRISPR-Cas-Systeme der Klasse 2 (Cas12b1, Cas13a und Cas12c) von Shmakov et al., „Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems“, Mol. Cell, 5 November 2015; 60(3): 385-397, beschrieben, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Effektoren von zwei der Systeme, Cas12bl und Cas12c, enthalten RuvC-ähnliche Endonukleasedomänen, die mit Cas12a verwandt sind. Ein drittes System, Cas13a, enthält einen Effektor mit zwei prädizierten HEPN-RNase-Domänen. Die Produktion reifer CRISPR-RNA ist im Gegensatz zur Produktion von CRISPR-RNA durch Cas12b1 tracrRNA-unabhängig. Cas12b1 hängt für die DNA-Spaltung sowohl von CRISPR-RNA als auch von tracrRNA ab. Bakterielles Cas13a besitzt eine einzigartige RNase-Aktivität für die CRISPR-RNA-Reifung, die sich von seiner RNA-aktivierten einzelsträngigen RNA-Abbauaktivität unterscheidet. Diese RNase-Funktionen unterscheiden sich voneinander und vom CRISPR-RNA-Verarbeitungsverhalten von Cas12a. Siehe z. B. East-Seletsky, et al., „Two different RNase Activities of CRISPR-Casl3a enable Leit-RNA processing and RNA detection“, Nature, 13. Okt. 2016; 538(7624):270-273, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die biochemische in-vitro-Analyse von Cas13a in Leptotrichia shahii hat gezeigt, dass Cas13a von einer einzelnen CRISPR-RNA geleitet wird und so programmiert werden kann, dass sie ssRNA-Ziele mit komplementären Protospacern spaltet. Katalytische Reste in den zwei konservierten HEPN-Domänen vermitteln die Spaltung. Mutationen in den katalytischen Resten erzeugen katalytisch inaktive RNA-bindende Proteine. Siehe z. B. Abudayyeh et al., „C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector“, Science, 5. August 2016; 353(6299), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die Kristallstruktur von Alicyclobaccillus acidoterrastris-Cas12b1 (AacC2c1) wurde im Komplex mit einer chimären Einzelmolekül-Leit-RNA (sgRNA) beschrieben. Siehe z. B. Liu et al., „C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism“, Mol. Cell, 19. Januar 2017; 65(2):310-322, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die Kristallstruktur wurde auch in Alicyclobacillus acidoterrestris-C2cl beschrieben, das als ternäre Komplexe an Ziel-DNAs gebunden ist. Siehe z. B. Yang et al., „PAMdependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease“, Cell, 15. Dezember 2016; 167(7):1814-1828, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Katalytisch kompetente Konformationen von AacC2c1, sowohl mit Ziel- als auch Nicht-Ziel-DNA-Strängen, wurden unabhängig voneinander in einer einzigen katalytischen RuvC-Tasche eingefangen, wobei die C2c1-vermittelte Spaltung zu einem gestaffelten Bruch der Ziel-DNA über sieben Nukleotide führte. Strukturvergleiche zwischen ternären C2c1-Komplexen und zuvor identifizierten Cas9- und Cpfl-Gegenstücken zeigen die Vielfalt der Mechanismen, die von CRISPR-Cas9-Systemen verwendet werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann das napDNAbp ein C2c1-, ein C2c2- oder ein C2c3-Protein sein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein C2c1-Protein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein C13a-Protein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Cas12c-Protein. In einigen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit einem natürlich vorkommenden Cas12b1 (C2c1)-, Cas13a (C2c2)- oder Cas12c (C2c3)-Protein ist. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein natürlich vorkommendes Cas12bI(C2c1)-, Cas13a(C2c2)- oder Cas12c(C2c3)-Protein.
  • (viii) Zirkuläre Cas9-Permutanten
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren eine zirkuläre Permutante von Cas9 umfassen.
  • Der Begriff „zirkulär permutiertes Cas9“ oder „zirkuläre Permutante“ von Cas9 oder „CP-Cas9“) bezeichnet jedes Cas9-Protein oder eine Variante davon, das als zirkuläre permutierte Variante auftritt oder modifiziert wurde, um als zirkuläre permutierte Variante konstruiert zu werden, was bedeutet, dass der N-Terminus und der C-Terminus eines Cas9-Proteins (z. B. eines Wildtyp-Cas9-Proteins) topisch neu angeordnet wurden. Derartige zirkulär permutierten Cas9-Proteine oder Varianten davon behalten die Fähigkeit, DNA zu binden, wenn sie mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert werden. Siehe Oakes et al., „Protein Engineering of Cas9 for Enhanced Function“, Methods Enzymol, 2014, 546: 491-511 und Oakes et al., „CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification“, Cell, 10. Januar 2019, 176: 254-267, jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen. Die vorliegende Offenbarung erwägt jedes zuvor bekannte CP-Cas9 oder verwendet ein neues CP-Cas9, solange das resultierende zirkulär permutierte Protein die Fähigkeit behält, DNA zu binden, wenn es mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert wird.
  • Jedes der in dieser Schrift beschriebenen Cas9-Proteine, einschließlich jeder Variante, jedes Orthologs oder natürlich vorkommenden Cas9 oder eines Äquivalents davon, kann als zirkuläre permutante Variante rekonfiguriert werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die zirkulären Permutanten von Cas9 die folgende Struktur aufweisen:
    • N-terminus-[original C-Terminus] - [optionaler Linker]- - [ursprünglicher N-terminus]-C-terminus.
  • Als ein Beispiel betrachtet die vorliegende Offenbarung die folgenden zirkulären Permutanten des kanonischen S. pyogenes-Cas9 (1368 Aminosäuren von UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1) (Nummerierung basiert auf der Aminosäureposition in SEQ ID NOs: 1361421):
    • N-terminus-[1268-1368]-[optionaler Linker]-[1-1267]-C-terminus;
    • N-terminus-[1168-1368]-[optionaler Linker]-[1-1167]-C-terminus;
    • N-terminus-[1068-1368]-[optionaler Linker]-[1-1067]-C-terminus;
    • N-terminus-[968-1368]-[optionaler Linker]-[1-967]-C-terminus;
    • N-terminus-[868-1368]-[optionaler Linker]-[1-867]-C-terminus;
    • N-terminus-[768-1368]-[optionaler Linker]-[1-767]-C-terminus;
    • N-terminus-[668-1368]-[optionaler Linker]-[1-667]-C-terminus;
    • N-terminus-[568-1368]-[optionaler Linker]-[1-567]-C-terminus;
    • N-terminus-[468-1368]-[optionaler Linker]-[1-467]-C-terminus;
    • N-terminus-[368-1368]-[optionaler Linker]-[1-367]-C-terminus;
    • N-terminus-[268-1368]-[optionaler Linker]-[1-267]-C-terminus;
    • N-terminus-[168-1368]-[optionaler Linker]-[l-167]-C-terminus;
    • N-terminus-[68-1368]-[optionaler Linker]--[1-67]-C-terminus; oder
    • N-terminus-[10-1368]-[optionaler Linker]-[1-9]-C-terminus, oder die entsprechenden zirkulären Permutanten anderer Cas9-Proteine (einschließlich anderer Cas9-Orthologen, Varianten usw.).
  • In bestimmten Ausführungsformen hat die zirkuläre permutante Cas9 die folgende Struktur (basierend auf S. pyogenes-Cas9 (1368 Aminosäuren von UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1) (Nummerierung basiert auf der Aminosäureposition in SEQ ID NOs: 1361421):
    • N-terminus-[102-1368]-[optionaler Linker]-[1-101]-C-terminus;
    • N-terminus-[1028-1368]-[optionaler Linker]-[1-1027]-C-terminus;
    • N-terminus-[1041-1368]-[optionaler Linker]-[1-1043]-C-terminus;
    • N-terminus-[1249-1368]-[optionaler Linker]-[1-1248]-C-terminus; oder
    • N-terminus-[1300-1368]-[optionaler Linker]-[l-1299]-C-terminus, oder die entsprechenden zirkulären Permutanten anderer Cas9-Proteine (einschließlich anderer Cas9-Orthologen, Varianten usw.).
  • In noch weiteren Ausführungsformen weist die zirkuläre permutante Cas9 die folgende Struktur auf (basierend auf S. pyogenes-Cas9 (1368 Aminosäuren von UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1) (Nummerierung basiert auf der Aminosäureposition in SEQ ID NOs: 1361421):
    • N-terminus-[103-1368]-[optionalerLinker]-[1-102]-C-terminus;
    • N-terminus- [1029-1368] - [optionaler Linker] - [1-1028] -C-terminus;
    • N-terminus- [1042-1368] - [optionaler Linker] - [1-1041] -C-terminus;
    • N-terminus-[1250-1368]-[optionaler Linker]--[1-1249]-C-terminus; oder
    • N-terminus-[1301-1368]-[optionaler Linker]-[1-1300]-C-terminus, oder die entsprechenden zirkulären Permutanten anderer Cas9-Proteine (einschließlich anderer Cas9-Orthologen, Varianten usw.).
  • In einigen Ausführungsformen kann die zirkuläre Permutante durch Verbinden eines C-terminalen Fragments eines Cas9 mit einem N-terminalen Fragment eines Cas9 entweder direkt oder unter Verwendung eines Linkers, wie etwa eines Aminosäurelinkers, gebildet werden. In einigen Ausführungsformen kann das C-terminale Fragment den C-terminalen 95 % oder mehr der Aminosäuren eines Cas9 entsprechen (z. B. Aminosäuren etwa 1300-1368) oder den C-terminalen 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % oder 5 % oder mehr eines Cas9 (z. B. eine von SEQ ID NOs: 1361421-1361484 und 1361593-1361596). Der N-terminale Abschnitt kann den N-terminalen 95 % oder mehr der Aminosäuren eines Cas9 entsprechen (z. B. Aminosäuren etwa 1-1300), oder den N-terminalen 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % oder 5 % oder mehr von einem Cas9 (z. B. von SEQ ID NOs: 1361421).
  • In einigen Ausführungsformen kann die zirkuläre Permutante durch Verbinden eines C-terminalen Fragments eines Cas9 mit einem N-terminalen Fragment eines Cas9 entweder direkt oder unter Verwendung eines Linkers, wie etwa eines Aminosäurelinkers, gebildet werden. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das C-terminale Fragment, das zum N-Terminus umgeordnet wird, die C-terminalen 30 % oder weniger der Aminosäuren eines Cas9 oder entspricht diesen (z. B. Aminosäuren 1012-1368 von SEQ ID NR: 1361421). In einigen Ausführungsformen beinhaltet das C-terminale Fragment, das zum N-Terminus umgeordnet wird, die C-terminalen 30 %, 29 %, 28 %, 27 %, 26 %, 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % der Aminosäuren eines Cas9 oder entspricht diesen (z. B. des Cas9 von SEQ ID NOs: 1361421). In einigen Ausführungsformen beinhaltet das C-terminale Fragment, das zum N-Terminus umgeordnet wird, die C-terminalen Reste 410 oder weniger eines Cas9 oder entspricht diesen (z. B. des Cas9 von SEQ ID NOs: 1361421). In einigen Ausführungsformen beinhaltet der C-terminale Abschnitt, der zum N-Terminus umgeordnet ist, die C-terminalen Reste 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 oder 10 eines Cas9 oder entspricht diesen (z. B. des Cas9 von SEQ ID NOs: 1361421). In einigen Ausführungsformen beinhaltet der C-terminale Abschnitt, der zum N-Terminus umgeordnet ist, die C-terminalen 357, 341, 328, 120 oder 69 Reste eines Cas9 oder entspricht diesen (z. B. des Cas9 von SEQ ID NOs: 1361421).
  • In anderen Ausführungsformen können zirkuläre permutante Cas9-Varianten als topologische Umordnung einer Cas9-Primärstruktur basierend auf dem folgenden Verfahren definiert werden, das auf S. pyogenes-Cas9 von SEQ ID NOs: 1361421 basiert: (a) Auswählen einer zirkulären Permutanten(CP)-Stelle, die einem internen Aminosäurerest der Cas9-Primärstruktur entspricht, die das ursprüngliche Protein zwei Hälften zerlegt: eine N-terminale Region und eine C-terminale Region; (b) Modifizieren der Cas9-Proteinsequenz (z. B. durch gentechnische Techniken) durch Verschieben der ursprünglichen C-terminalen Region (welche die Aminosäure der CP-Stellen umasst), sodass sie der ursprünglichen N-terminalen Region vorangeht, wodurch ein neuer N-Terminus des Cas9-Proteins gebildet wird, das jetzt mit dem Aminosäurerest der CP-Stelle beginnt. Die CP-Stelle kann sich in einer beliebigen Domäne des Cas9-Proteins befinden, einschließlich beispielsweise der Helix-II-Domäne, der RuvCIII-Domäne oder der CTD-Domäne. Zum Beispiel kann die CP-Stelle (relativ zu S. pyogenes-Cas9 von SEQ ID NOs: 1361421) am ursprünglichen Aminosäurerest 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249 oder 1282 lokalisiert sein. Somit würde die ursprüngliche Aminosäure 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249 oder 1282, einmal an den N-Terminus versetzt, die neue N-terminale Aminosäure werden. Die Nomenklatur dieser CP-Cas9-Proteine kann als Cas9-CP181, Cas9-CP199 , Cas9-CP230, Cas9-CP270, Cas9-CP310, Cas9-CP1010, Cas9-CP1016, Cas9-CP1023, Cas9-CP1029, Cas9-CP1041, Cas9-CP1247, Cas9-CP1249 bzw. Cas9-CP1282 bezeichnet werden. Diese Beschreibung soll nicht auf die Herstellung von CP-Varianten von SEQ ID NO: 1361421 beschränkt sein, sondern kann implementiert werden, um CP-Varianten in einer beliebigen Cas9-Sequenz herzustellen, entweder an CP-Stellen, die diesen Positionen entsprechen, oder vollständig an anderen CP-Stellen. Diese Beschreibung soll die spezifischen CP-Stellen in keiner Weise einschränken. Praktisch jede CP-Stelle kann verwendet werden, um eine CP-Cas9-Variante zu bilden.
  • Beispielhafte CP-Cas9-Aminosäuresequenzen, basierend auf Cas9 von SEQ ID NOs: 1361421, werden nachstehend bereitgestellt, wo Linkersequenzen durch Unterstreichung und optionale Methionin(M)-Reste in Fettdruck angegeben sind. Es versteht sich, dass die Offenbarung CP-Cas9-Sequenzen bereitstellt, die keine Linkersequenz beinhalten oder die verschiedene Linkersequenzen beinhalten. Es sollte beachtet werden, dass CP-Cas9-Sequenzen auf anderen Cas9-Sequenzen als der von SEQ ID NO: 1361421 basieren können und alle in dieser Schrift bereitgestellten Beispiele nicht einschränkend zu verstehen sind.
    Figure DE112020001306T5_0048
    Figure DE112020001306T5_0049
    Figure DE112020001306T5_0050
  • Die zirkulären Cas9-Permutanten, die in den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editing-Konstrukten nützlich sein können. Beispielhafte C-terminale Fragmente von Cas9, basierend auf dem Cas9 von SEQ ID NO: 1361421, die zu einem N-Terminus von Cas9 umgeordnet werden können, sind unten bereitgestellt. Es sollte beachtet werden, dass solche C-terminalen Fragmente von Cas9 beispielhaft sind und nicht einschränkend gemeint sind.
    Figure DE112020001306T5_0051
    Figure DE112020001306T5_0052
  • (ix) Cas9- Varianten mit modifizierten PAM-Spezifitäten
  • Die Prime-Editoren der vorliegenden Offenbarung können auch Cas9-Varianten mit modifizierten PAM-Spezifitäten umfassen. Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Cas9-Proteine bereit, die Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die das kanonische PAM (5'-NGG-3', wobei N A, C, G oder T ist) an seinem 3'-Ende nicht umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NGG-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NNG-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NNA-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NNC-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NNT-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NGT-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NGA-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NGC-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NAA-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NAC-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NAT-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität auf einer Zielsequenz, die an seinem 3'-Ende eine 5'-NAG-3'-PAM-Sequenz umfasst.
  • Es versteht sich, dass jede der in dieser Schrift beschriebenen Aminosäuremutationen (z. B.A262T) von einem ersten Aminosäurerest (z. B.A) zu einem zweiten Aminosäurerest (z. B. T) auch Mutationen von dem ersten Aminosäurerest zu einem Aminosäurerest beinhalten kann, der dem zweiten Aminosäurerest (z. B. konserviert) ähnlich ist. Beispielsweise kann die Mutation einer Aminosäure mit einer hydrophoben Seitenkette (z. B. Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan) eine Mutation zu einer zweiten Aminosäure mit einer anderen hydrophoben Seitenkette (z. B. Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan) sein. Zum Beispiel kann eine Mutation eines Alanins zu einem Threonin (z. B. eine A262T-Mutation) auch eine Mutation von einem Alanin zu einer Aminosäure sein, die in Größe und chemischen Eigenschaften einem Threonin ähnlich ist, zum Beispiel Serin. Als weiteres Beispiel kann die Mutation einer Aminosäure mit einer positiv geladenen Seitenkette (z. B. Arginin, Histidin oder Lysin) eine Mutation zu einer zweiten Aminosäure mit einer anderen positiv geladenen Seitenkette (z. B.Arginin, Histidin oder Lysin) sein. Als weiteres Beispiel kann die Mutation einer Aminosäure mit einer polaren Seitenkette (z. B. Serin, Threonin, Asparagin oder Glutamin) eine Mutation zu einer zweiten Aminosäure mit einer anderen polaren Seitenkette (z. B. Serin, Threonin, Asparagin, oder Glutamin) sein. Zusätzliche ähnliche Aminosäurepaare beinhalten die folgenden, ohne darauf beschränkt zu sein: Phenylalanin und Tyrosin; Asparagin und Glutamin; Methionin und Cystein; Asparaginsäure und Glutaminsäure; und Arginin und Lysin. Der Fachmann wird erkennen, dass solche konservativen Aminosäuresubstitutionen wahrscheinlich geringe Auswirkungen auf die Proteinstruktur haben und wahrscheinlich gut vertragen werden, ohne die Funktion zu beeinträchtigen. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Threonin eine Aminosäuremutation zu einem Serin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Arginin eine Aminosäuremutation zu einem Lycin sein. In einigen Ausführungsformen kann jedes Amino der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Isoleucin eine Aminosäuremutation zu einem Alanin, Valin, Methionin oder Leucin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Lycin eine Aminosäuremutation zu einem Arginin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einer Asparaginsäure eine Aminosäuremutation zu einer Glutaminsäure oder Asparagin sein. In einigen Ausführungsformen kann jedes Amino der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Valin eine Aminosäuremutation zu einem Alanin, Isoleucin, Methionin oder Leucin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Glycin eine Aminosäuremutation zu einem Alanin sein. Es sollte jedoch beachtet werden, dass zusätzliche konservierte Aminosäurereste vom Fachmann erkannt werden würden und jede der Aminosäuremutationen zu anderen konservierten Aminosäureresten ebenfalls im Umfang dieser Offenbarung liegt.
  • In einigen Ausführungsformen kann die vorliegende Offenbarung jede der Cas9-Varianten verwenden, die in dieser Schrift im Abschnitt „Sequenzaprotokoll“ offenbart sind.
    Figure DE112020001306T5_0053
    Figure DE112020001306T5_0054
    Figure DE112020001306T5_0055
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Kombination von Mutationen, die Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die eine 5'-NAA-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Kombination von Mutationen in einem der in Tabelle 1 aufgelisteten Klone vorhanden. In einigen Ausführungsformen sind die Mutationskombinationen konservative Mutationen der in Tabelle 1 aufgelisteten Klone. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein die Kombination von Mutationen eines der in Tabelle X aufgeführten Cas9-Klone.
  • Tabelle X: NAA-PAM-Klone
    Mutationen von Wildtyp-SpCas9 (z. B. SEQ ID NOs: 1361421)
    D177N, K218R, D614N, D1135N, P1137S, E1219V, A1320V, A1323D, R1333K
    D177N, K218R, D614N, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, G715C, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A367T, K710E, R1114G, D1135N, P1137S, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R753G, D861N, D1135N, K1188R, E1219V, Q1221H, H1264H, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, V743I, R753G, M1021T, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, V743I, R753G, E762G, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R753G, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, S1274R, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, A589S, R753G, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264H, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R753G, E757K, G865G, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, E757K, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, K599R, M631A, R654L, K673E, V743I, R753G, N758H, E762G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, Q1256R, H1264Y, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, N869S, N1054D, R1114G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, L727I, V743I, R753G, E762G, R859S, N946D, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, N1317T, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, V1290G, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, K1151E, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, V1290G, L1318S, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, V1290G, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, F693L, V743I, R753G, E762G, N803S, N869S, L921P, Y1016D, G1077D, F1080S, R1114G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, E630K, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, Q768H, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, L1318S, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, F693L, V743I, R753G, E762G, Q768H, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, G1223S, H1264Y, L1318S, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, F693L, V743I, R753G, E762G, N803S, N869S, L921P, Y1016D, G1077D, F1801S, R1114G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, V743I, R753G, M1021T, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, M673I, N803S, N869S, G1077D, R1114G, D1135N, V1139A, D1180G, E1219V, Q1221H, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, N803S, N869S, R1114G, D1135N, E1219V, Q1221H, A1320V, R1333K
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie durch eine der Varianten von Tabelle 1 bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie von einer der Varianten von Tabelle X bereitgestellt.
  • In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine erhöhte Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die das kanonische PAM (5'-NGG-3') an seinem 3'-Ende im Vergleich zu Streptococcus pyogenes-Cas9 gemäß SEQ ID NOs: 1361421 nicht umfasst. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz mit einem 3'-Ende auf, das nicht direkt an die kanonische PAM-Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die im Vergleich mit der Aktivität von Streptococcus pyogenes-Cas9 gemäß SEQ ID NOs: 1361421 auf der gleichen Zielsequenz mindestens 5-fach erhöht ist. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die nicht direkt an die kanonische PAM-Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die mindestens 10-fach, mindestens 50-fach, mindestens 100-fach, mindestens 500-fach, mindestens 1.000-fach, mindestens 5.000-fach, mindestens 10.000-fach, mindestens 50.000-fach, mindestens 100.000-fach, mindestens 500.000-fach oder mindestens 1.000.000-fach im Vergleich zur Aktivität von Streptococcus pyogenes gemäß SEQ ID NOs: 1361421 auf der gleichen Zielsequenz erhöht ist. In einigen Ausführungsformen grenzt das 3'-Ende der Zielsequenz direkt an eine AAA-, GAA-, CAA- oder TAA-Sequenz. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Kombination von Mutationen, die Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die eine 5'-NAC-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Kombination von Mutationen in einem der in Tabelle 2 aufgelisteten Klone vorhanden. In einigen Ausführungsformen sind die Mutationskombinationen konservative Mutationen der in Tabelle 2 aufgelisteten Klone. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein die Kombination von Mutationen eines der in Tabelle X aufgeführten Cas9-Klone.
  • Tabelle Y NAC-PAM-Klone
    Mutationen von Wildtyp-SpCas9 (z. B. SEQ ID NOs: 1361421)
    T472I, R753G, K890E, D1332N, R1335Q, T1337N
    I1057S, D1135N, P1301S, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, D1332N, R1335Q, T1337N
    D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, K890E, D1332N, R1335Q, T1337N
    I1057S, D1135N, P1301S, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, D1332N, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, Q771H, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, K652T, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, K652T, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, K1156E, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, V647I, R753G, N803S, K959N, G1030R, I1055E, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, E630G, T638P, V647A, G687R, N767D, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332G, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, N1266H, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, K959N, I1057T, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, M631I, T638P, R753G, N803S, K959N, Y1036H, R1114G, D1135N, E1219V, D1251G, D1332G, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, V875I, K959N, Y1016C, R1114G, D1135N, E1219V, D1251G, D1332G, R1335Q, T1337N, I1348V
    K608R, E627K, T638P, V647I, R654L, R753G, N803S, T804A, K848N, V922A, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, R753G, N803S, V922A, K959N, K1014N, V1015A, R1114G, D1135N, K1156N, E1219V, N1252D, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, R629G, T638P, V647I, A711T, R753G, K775R, K789E, N803S, K959N, V1015A, Y1036H, R1114G, D1135N, E1219V, N1286H, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, T740A, R753G, N803S, K948E, K959N, Y1016S, R1114G, D1135N, E1219V, N1286H, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, T740A, N803S, K948E, K959N, Y1016S, R1114G, D1135N, E1219V, N1286H, D1332N, R1335Q, T1337N
    I670S, K608R, E627K, E630G, T638P, V647I, R653K, R753G, I795L, K797N, N803S, K866R, K890N, K959N, Y1016C, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, T740A, G752R, R753G, K797N, N803S, K948E, K959N, V1015A, Y1016S, R1114G, D1135N, E1219V, N1266H, D1332N, R1335Q, T1337N
    I570T, A589V, K608R, E627K, T638P, V647I, R654L, Q716R, R753G, N803S, K948E, K959N, Y1016S, R1114G, D1135N, E1207G, E1219V, N1234D, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, R629G, T638P, V647I, R654L, Q740R, R753G, N803S, K959N, N990S, T995S, V1015A, Y1036D, R1114G, D1135N, E1207G, E1219V, N1234D, N1266H, D1332N, R1335Q, T1337N
    I562F, V565D, I570T, K608R, L625S, E627K, T638P, V647I, R654I, G752R, R753G, N803S, N808D, K959N, M1021L, R1114G, D1135N, N1177S, N1234D, D1332N, R1335Q, T1337N
    I562F, I570T, K608R, E627K, T638P, V647I, R753G, E790A, N803S, K959N, V1015A, Y1036H, R1114G, D1135N, D1180E, A1184T, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    I570T, K608R, E627K, T638P, V647I, R654H, R753G, E790A, N803S, K959N, V1015A, R1114G, D1127A, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    I570T, K608R, L625S, E627K, T638P, V647I, R654I, T703P, R753G, N803S, N808D, K959N, M1021L, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    1570S, K608R, E627K, E630G, T638P, V647I, R653K, R753G, I795L, N803S, K866R, K890N, K959N, Y1016C, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    I570T, K608R, E627K, T638P, V647I, R654H, R753G, E790A, N803S, K959N, V1016A, R1114G, D1135N, E1219V, K1246E, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, R654L, K673E, R753G, E790A, N803S, K948E, K959N, R1114G, D1127G, D1135N, D1180E, E1219V, N1286H, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, L625S, E627K, T638P, V647I, R654I, I670T, R753G, N803S, N808D, K959N, M1021L, R1114G, D1135N, E1219V, N1286H, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, M631V, T638P, V647I, K710E, R753G, N803S, N808D, K948E, M1021L, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N, S1338T, H1349R
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie durch eine der Varianten von Tabelle 2 bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie von einer der Varianten von Tabelle Y bereitgestellt.
  • In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine erhöhte Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die das kanonische PAM (5'-NGG-3') an seinem 3'-Ende im Vergleich zu Streptococcus pyogenes-Cas9 gemäß SEQ ID NOs: 1361421 nicht umfasst. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz mit einem 3'-Ende auf, das nicht direkt an die kanonische PAM-Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die im Vergleich mit der Aktivität von Streptococcus pyogenes-Cas9 gemäß SEQ ID NOs: 1361421 auf der gleichen Zielsequenz mindestens 5-fach erhöht ist. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die nicht direkt an die kanonische PAM-Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die mindestens 10-fach, mindestens 50-fach, mindestens 100-fach, mindestens 500-fach, mindestens 1.000-fach, mindestens 5.000-fach, mindestens 10.000-fach, mindestens 50.000-fach, mindestens 100.000-fach, mindestens 500.000-fach oder mindestens 1.000.000-fach im Vergleich zur Aktivität von Streptococcus pyogenes gemäß SEQ ID NOs: 1361421 auf der gleichen Zielsequenz erhöht ist. In einigen Ausführungsformen grenzt das 3'-Ende der Zielsequenz direkt an eine AAC-, GAC-, CAC- oder TAC-Sequenz.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Kombination von Mutationen, die Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die eine 5'-NAT-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Kombination von Mutationen in einem der in Tabelle 3 aufgelisteten Klone vorhanden. In einigen Ausführungsformen sind die Mutationskombinationen konservative Mutationen der in Tabelle 3 aufgelisteten Klone. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein die Kombination von Mutationen eines der in Tabelle Z aufgeführten Cas9-Klone. Tabelle Z: NAT-PAM-Klone
    Mutationen von Wildtyp-SpCas9 (z. B. SEQ ID NOs: 1361421)
    K961E, H985Y, D1135N, K1191N, E1219V, Q1221H, A1320A, P1321S, R1335L
    D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    V743I, R753G, E790A, D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, A1227V, P1249S, N1286K, A1293T, P1321S, D1322G, R1335L, T1339I
    F575S, M631L, R654L, V748I, V743I, R753G, D853E, V922A, R1114G D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, A1227V, P1249S, N1286K, A1293T, P1321S, D1322G, R1335L, T1339I
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, N1286K, P1321S, D1322G, R1335L
    M631L, R654L, R753G, K797E, D853E, V922A, D1012A, R1114G D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, N1317K, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, D596Y, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, Q1256R, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, K710E, V750A, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, K649R, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, K1156E, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, I1057G, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, N1308D, P1321S, D1322G, R1335L
    M631L, R654L, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, E1150V, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1332G, R1335L
    M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, I1057V, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1332G, R1335L
    M631L, R654L, R664K, R753G, I1057V, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1332G, R1335L
  • Die vorstehende Beschreibung verschiedener napDNAbps, die in Verbindung mit den gegenwärtig offenbarten Prime-Editoren verwendet werden können, soll in keiner Weise einschränkend sein. Die Prime-Editoren können das kanonische SpCas9 oder ein beliebiges orthologisches Cas9-Protein oder eine beliebige Variante des Cas9-Proteins umfassen - einschließlich jeder natürlich vorkommenden Variante, Mutante oder anderweitig konstruierten Version von Cas9 - die bekannt ist oder durch eine gesteuerte Evolution oder einen anderweitigen mutagenen Prozess hergestellt oder entwickelt werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen weisen die Cas9- oder Cas9-Varianten eine Nickase-Aktivität auf, d. h. sie spalten nur einen Strang der Ziel-DNA-Sequenz. In anderen Ausführungsformen weisen die Cas9- oder Cas9-Varianten inaktive Nukleasen auf, d. h. sind „tote“ Cas9-Proteine. Andere Varianten von Cas9-Proteinen, die verwendet werden können, sind solche mit einem kleineren Molekulargewicht als das kanonische SpCas9 (z. B. für eine einfachere Zuführung) oder mit einer modifizierten oder neu angeordneten primären Aminosäurestruktur (z. B. die zirkulären permutanten Formate). Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können auch Cas9-Äquivalente umfassen, einschließlich Cas12a/Cpf1- und Cas12b-Proteine, die das Ergebnis einer konvergenten Evolution sind. Die in dieser Schrift verwendeten napDNAbps (z. B. SpCas9, Cas9-Variante oder Cas9-Äquivalente) können auch verschiedene Modifikationen enthalten, die ihre PAM-Spezifitäten ändern/verbessern. Schließlich berücksichtigt die Anmeldung alle Cas9-, Cas9-Varianten oder Cas9-Äquivalente, die mindestens 70 %, mindestens 15%, mindestens 80 %, mindestens 85%, mindestens 90 %, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, oder mindestens 99,9 % Sequenzidentität mit einer Referenz-Cas9-Sequenz, wie etwa einer kanonischen Referenzsequenz von SpCas9 oder einem Referenz-Cas9-Äquivalent (z. B. Cas12a/Cpf1) aufweisen.
  • Außerdem können alle verfügbaren Verfahren verwendet werden, um eine Variante oder ein mutiertes Cas9-Protein zu gewinnen oder zu konstruieren. Der Begriff „Mutation“, wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet eine Substitution eines Rests innerhalb einer Sequenz, z. B. einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, durch einen anderen Rest oder eine Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Reste innerhalb einer Sequenz. Mutationen werden in dieser Schrift typischerweise dadurch beschrieben, dass der ursprüngliche Rest identifiziert wird, gefolgt von der Position des Rests innerhalb der Sequenz und der Identität des neu substituierten Rests. Verschiedene Verfahren zur Durchführung der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuresubstitutionen (Mutationen) sind im Stand der Technik gut bekannt und werden beispielsweise von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2012)) bereitgestellt. Mutationen können eine Vielzahl von Kategorien umfassen, wie etwa Einzelbasen-Polymorphismen, Mikroduplikationsregionen, Indel und Inversionen, und sollen in keiner Weise einschränkend sein. Mutationen können „Funktionsverlust“-Mutationen umfassen, die das normale Ergebnis einer Mutation sind, die eine Proteinaktivität reduziert oder aufhebt. Die meisten Mutationen mit Funktionsverlust sind rezessiv, da bei einem Heterozygoten die zweite Chromosomenkopie eine nicht mutierte Version des Gens trägt, das für ein voll funktionsfähiges Protein codiert, dessen Vorhandensein den Effekt der Mutation kompensiert. Mutationen umfassen auch „Gain-of-Function“-Mutationen, die einem Protein oder einer Zelle eine abnormale Aktivität verleihen, die in einem normalen Zustand sonst nicht vorhanden ist. Viele Gain-of-Function-Mutationen befinden sich eher in regulatorischen Sequenzen als in codierenden Regionen und können daher eine Reihe von Konsequenzen haben. Eine Mutation kann zum Beispiel dazu führen, dass ein oder mehrere Gene in den falschen Geweben exprimiert werden und diese Gewebe Funktionen erhalten, die ihnen normalerweise fehlen. Aufgrund ihrer Natur sind Gain-of-Function-Mutationen in der Regel dominant.
  • Mutationen können mittels ortsgerichteter Mutagenese in ein Referenz-Cas9-Protein eingeführt werden. Ältere im Stand der Technik bekannte Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese beruhen auf der Subklonierung der zu mutierenden Sequenz in einen Vektor, wie etwa einen M13-Bakteriophagenvektor, der die Isolierung einer einzelsträngigen DNA-Matrize ermöglicht. Bei diesen Verfahren lagert man einen mutagenen Primer (d. h. einen Primer, der an die zu mutierende Stelle anlagern kann, aber ein oder mehrere fehlgepaarte Nukleotide an der zu mutierenden Stelle trägt) an die einzelsträngige Matrize an und polymerisiert dann das Komplement der Matrize beginnend am 3'-Ende des mutagenen Primers. Die resultierenden Duplexe werden dann in Wirtsbakterien transformiert und Plaques werden auf die gewünschte Mutation gescreent. In jüngerer Zeit hat die ortsgerichtete Mutagenese PCR-Methoden verwendet, die den Vorteil haben, dass keine einzelsträngige Matrize erforderlich ist. Darüber hinaus wurden Verfahren entwickelt, die keine Subklonierung erfordern. Bei der Durchführung einer auf PCR basierenden ortsgerichteten Mutagenese müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Erstens ist es bei diesen Verfahren wünschenswert, die Zahl der PCR-Zyklen zu reduzieren, um die Expansion unerwünschter Mutationen, die durch die Polymerase eingeführt werden, zu verhindern. Zweitens muss eine Auswahl vorgenommen werden, um die Anzahl der nicht mutierten Eltemmoleküle zu reduzieren, die in der Reaktion verbleiben. Drittens wird ein PCR-Verfahren mit verlängerter Länge bevorzugt, um die Verwendung eines einzelnen PCR-Primersatzes zu ermöglichen. Und viertens ist es wegen der nicht-matrizenabhängigen terminalen Verlängerungsaktivität einiger thermostabiler Polymerasen oft notwendig, einen Endpolierschritt in das Verfahren vor der stumpfen Ligation des PCR-erzeugten mutierten Produkts einzubauen.
  • Mutationen können auch durch gesteuerte Evolutionsprozesse, wie etwa Phagenunterstützte kontinuierlich Evolution (phage-assisted continuous evolution - PACE) oder Phagenunterstützte nicht-kontinuierliche Evolution (phage-assisted noncontinuous evolution - PANCE), eingeführt werden. Der Begriff „phagenunterstützte kontinuierliche Evolution (PACE)“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet eine kontinuierliche Evolution, die Phagen als virale Vektoren verwendet. Das allgemeine Konzept der PACE-Technologie wurde beispielsweise in der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2009/056194 , eingereicht am 8. September 2009, veröffentlicht als WO 2010/028347 am 11. März 2010; der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2011/066747 , eingereicht am 22. Dezember 2011, veröffentlicht als WO 2012/088381 am 28. Juni 2012; der US-Anmeldung, US-Patent Nr. 9,023,594 , erteilt am 5. Mai 2015, der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2015/012022 , eingereicht am 20. Januar 2015, veröffentlicht als WO 2015/134121 am 11. September 2015 und der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2016/027795 , eingereicht am 15. April 2016, veröffentlicht als WO 2016/168631 am 20. Oktober 2016, beschrieben, deren gesamter Inhalt in diese Schrift jeweils durch Bezugnahme aufgenommen ist. Fehleranfällige reverse Transkriptasen können auch durch Phagen-unterstützte nicht-kontinuierliche Evolution (PANCE) gewonnen werden, was sich in dieser Schrift auf eine nicht-kontinuierliche Evolution bezieht, die Phagen als virale Vektoren verwendet. PANCE ist eine vereinfachte Technik für die schnelle in vivo gesteuerte Evolution unter Verwendung von seriellen Glaskolben-Transfers von sich entwickelnden „Selektionsphagen“ (SP), die ein zu entwickelndes Gen von Interesse enthalten, durch frische E. coli-Wirtszellen, wodurch Gene innerhalb der Wirts-E. coli konstant gehalten werden, während sich die im SP enthaltenen Gene kontinuierlich weiterentwickeln. Serielle Glaskolben-Transfers dienten lange Zeit als allgemein zugänglicher Ansatz für die Evolution von Mikroben im Labor, und in jüngerer Zeit wurden analoge Ansätze für die Evolution von Bakteriophagen entwickelt. Das PANCE-System weist eine geringere Stringenz auf als das PACE-System.
  • Alle vorstehend genannten Literaturhinweise, die sich auf Cas9 oder Cas9-Äquivalente beziehen, werden hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen, sofern dies nicht bereits angegeben ist.
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-bindendes Protein, das keine kanonische (NGG-) PAM-Sequenz erfordert. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Argonautenprotein. Ein Beispiel für ein solches nukleinsäureprogrammierbares DNA-bindendes Protein ist ein Argonautenprotein aus Natronobacterium gregoryi (NgAgo). NgAgo ist eine ssDNA-geleitete Endonuklease. NgAgo bindet 5'-phosphorylierte ssDNA von ~24 Nukleotiden (gDNA), um sie zu ihrer Zielstelle zu leiten, und wird DNA-Doppelstrangbrüche an der gDNA-Stelle vornehmen. Im Gegensatz zu Cas9 benötigt das NgAgo-gDNA-System kein Protospacer-Nachbarmotiv (PAM). Die Verwendung eines Nuklease-inaktiven NgAgo (dNgAgo) kann die Basen, auf die abgezielt werden kann, stark erweitern. Die Charakterisierung und Verwendung von NgAgo wurde in Gao et al., Nat. Biotechnol., Juli 2016; 34(7):768-73. PubMed-PMID: 27136078; Swarts et al., Nature. 507(7491) (2014):258-61; und Swarts al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015):5120-9, beschrieben, die jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird.
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein prokaryontisches Homolog eines Argonautenproteins. Prokaryontische Homologe von Argonaute-Proteinen sind bekannt und wurden beispielsweise in Makarova K. et al., „Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements“, Biol Direct. 25. August 2009; 4:29. doi: 10.1186/1745-6150-4-29, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Marinitoga-piezophila-Argonaut(MpAgo)-Protein. Das CRISPR-assoziierte Marinitoga-piezophila-Argonaut(MpAgo)-Protein spaltet einzelsträngige Zielsequenzen unter Verwendung von 5'-phosphorylierten Guides. Die 5'-Leiter werden von allen bekannten Argonauten verwendet. Die Kristallstruktur eines MpAgo-RNA-Komplexes zeigt eine Leitstrang-Bindungsstelle, die Reste umfasst, die 5'-Phosphat-Interaktionen blockieren. Diese Daten legen die Entwicklung einer Argonauten-Unterklasse mit nichtkanonischer Spezifität für einen 5'-hydroxylierten Leitfaden nahe. Siehe z. B. Kaya et al., „A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity“, Proc Natl Acad Sci USA. 12. April 2016; 113(15):4057-62, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Es versteht sich, dass andere Argonautenproteine verwendet werden können und im Umfang dieser Offenbarung liegen.
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein einzelner Effektor eines mikrobiellen CRISPR-Cas-Systems. Einzelne Effektoren von mikrobiellen CRISPR-Cas-Systemen beinhalten ohne Einschränkung Cas9, Cpfl, C2cl, C2c2 und C2c3. Typischerweise werden mikrobielle CRISPR-Cas-Systeme in Systeme der Klasse 1 und Klasse 2 unterteilt. Klasse-1-Systeme haben Effektorkomplexe aus mehreren Untereinheiten, während Klasse-2-Systeme einen einzelnen Proteineffektor haben. Cas9 und Cpfl sind beispielsweise Effektoren der Klasse 2. Zusätzlich zu Cas9 und Cpfl wurden drei verschiedene CRISPR-Cas-Systeme der Klasse 2 (C2c1, C2c2, and C2c3) von Shmakov et al., „Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems“, Mol. Cell, November 2015; 60(3): 385-397, beschrieben, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Effektoren von zwei der Systeme, C2c1 und C2c3, enthalten RuvC-ähnliche Endonukleasedomänen, die mit Cpfl verwandt sind. Ein drittes System, C2c2, enthält einen Effektor mit zwei prädizierten HEPN-RNase-Domänen. Die Produktion reifer CRISPR-RNA ist im Gegensatz zur Produktion von CRISPR-RNA durch C2c1 tracrRNA-unabhängig. C2c1 hängt für die DNA-Spaltung sowohl von CRISPR-RNA als auch von tracrRNA ab. Bakterielles C2c2 besitzt eine einzigartige RNase-Aktivität für die CRISPR-RNA-Reifung, die sich von seiner RNA-aktivierten einzelsträngigen RNA-Abbauaktivität unterscheidet. Diese RNase-Funktionen unterscheiden sich voneinander und vom CRISPR-RNA-Verarbeitungsverhalten von Cpfl. Siehe z. B. East-Seletsky, et al., „Two different RNase Activities of CRISPR-C2c2 enable Leit-RNA processing and RNA detection“, Nature, 13. Okt. 2016; 538(7624):270-273, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die biochemische in-vitro-Analyse von C2c2 in Leptotriehia shahii hat gezeigt, dass C2c2 von einer einzelnen CRISPR-RNA geleitet wird und so programmiert werden kann, dass sie ssRNA-Ziele mit komplementären Protospacem spaltet. Katalytische Reste in den zwei konservierten HEPN-Domänen vermitteln die Spaltung. Mutationen in den katalytischen Resten erzeugen katalytisch inaktive RNA-bindende Proteine. Siehe z. B. Abudayyeh et al., „C2c2 is a singlecomponent programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector“, Science, 5. August 2016; 353(6299), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die Kristallstruktur von Alicyclobaccillus acidoterrastris-C2c1 (AacC2c1) wurde im Komplex mit einer chimären Einzelmolekül-Leit-RNA (sgRNA) beschrieben. Siehe z. B. Liu et al., „C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism“, Mol. Cell, 19. Januar 2017; 65(2):310-322, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die Kristallstruktur wurde auch in Alicyclobacillus acidoterrestris-C2cl beschrieben, das als ternäre Komplexe an Ziel-DNAs gebunden ist. Siehe z. B. Yang et al., „PAMdependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease“, Cell, 15. Dezember 2016; 167(7):1814-1828, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Katalytisch kompetente Konformationen von AacC2cl, sowohl mit Ziel- als auch Nicht-Ziel-DNA-Strängen, wurden unabhängig voneinander in einer einzigen katalytischen RuvC-Tasche eingefangen, wobei die C2c1-vermittelte Spaltung zu einem gestaffelten Bruch der Ziel-DNA über sieben Nukleotide führte. Strukturvergleiche zwischen ternären C2c1-Komplexen und zuvor identifizierten Cas9- und Cpfl-Gegenstücken zeigen die Vielfalt der Mechanismen, die von CRISPR-Cas9-Systemen verwendet werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann das napDNAbp ein C2c1-, ein C2c2- oder ein C2c3-Protein sein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein C2c1-Protein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein C2c2-Protein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein C2c3-Protein. In einigen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit einem natürlich vorkommenden Cas2c1-, C2c2- oder C2c3-Protein ist. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein natürlich vorkommendes C2c1-, C2c2- oder C2c3 -Protein.
  • Einige Aspekte der Offenbarung bieten Cas9-Domänen, die unterschiedliche PAM-Spezifitäten aufweisen. Typischerweise benötigen Cas9-Proteine, wie etwa Cas9 aus S. pyogenes (spCas9), eine kanonische NGG-PAM-Sequenz, um eine bestimmte Nukleinsäureregion zu binden. Dies kann die Fähigkeit einschränken, gewünschte Basen innerhalb eines Genoms zu editieren. In einigen Ausführungsformen müssen die in dieser Schrift bereitgestellten baseneditierenden Fusionsproteine möglicherweise an einer genauen Stelle platziert werden, zum Beispiel dort, wo eine Zielbase innerhalb einer 4-Basen-Region platziert ist (z. B. ein „Editierfenster“), die etwa 15 Basen stromaufwärts der PAM liegt. Siehe Komor, A. C., et al., „Programmable Editing of a target base in genomic DNA without double- stranged DNA cleavage“ Nature 533, 420-424 (2016), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Dementsprechend kann in einigen Ausführungsformen jedes der in dieser Schrift bereitgestellten Fusionsproteine eine Cas9-Domäne enthalten, die in der Lage ist, eine Nukleotidsequenz zu binden, die keine kanonische (z. B. NGG-) PAM-Sequenz enthält. Cas9-Domänen, die an nicht-kanonische PAM-Sequenzen binden, sind im Stand der Technik beschrieben und für den Fachmann offensichtlich. Zum Beispiel wurden Cas9-Domänen, die nicht-kanonische PAM-Sequenzen binden, in Kleinstiver, BP, et al., „Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities“ Nature 523, 481-485 (2015); und Kleinstiver, BP, et al., „Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition“ Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015) beschrieben; dessen gesamter Inhalt jeweils hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Zum Beispiel kann eine napDNAbp-Domäne mit veränderter PAM-Spezifität, wie etwa eine Domäne mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit Wildtyp Francisella novicida-Cpfl (SEQ ID NO: 1361472) (D917, E1006 und D1255 sind fett und unterstrichen) verwendet werden:
    Figure DE112020001306T5_0056
    Figure DE112020001306T5_0057
  • Eine zusätzliche napDNAbp-Domäne mit veränderter PAM-Spezifität, wie etwa eine Domäne mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit Wildtyp Geobacillus thermodenitrificans Cas9 (SEQ ID NO: 1361473) kann verwendet werden.
    Figure DE112020001306T5_0058
  • In einigen Ausführungsformen ist das nukleinsäureprogrammierbare DNA-bindende Protein (napDNAbp) ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-bindendes Protein, das keine kanonische (NGG-) PAM-Sequenz erfordert. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Argonautenprotein. Ein Beispiel für ein solches nukleinsäureprogrammierbares DNA-bindendes Protein ist ein Argonautenprotein aus Natronobacterium gregoryi (NgAgo). NgAgo ist eine ssDNA-geleitete Endonuklease. NgAgo bindet 5'-phosphorylierte ssDNA von ~24 Nukleotiden (gDNA), um sie zu ihrer Zielstelle zu leiten, und wird DNA-Doppelstrangbrüche an der gDNA-Stelle vollziehen. Im Gegensatz zu Cas9 benötigt das NgAgo-gDNA-System kein Protospacer-Nachbarmotiv (PAM). Die Verwendung eines Nuklease-inaktiven NgAgo (dNgAgo) kann die Basen, auf die abgezielt werden kann, stark erweitern. Die Charakterisierung und Verwendung von NgAgo wurde in Gao et al., Nat. Biotechnol., 34(7): 768-73 (2016), PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature, 507 (7491): 258-61 (2014); und Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015): 5120-9, bescchrieben, die jeweils durch Bezugnahme in dieser Schrift aufgenommen werden. Die Sequenz von Natronobacterium gregoryi-Argonauten ist in SEQ ID NO: 1361474 bereitgestellt.
  • Die offenbarten Fusionsproteine können eine napDNAbp-Domäne mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit Wildtyp-Natronobacterium gregoryi-Argonauten umfassen (SEQ ID NO: 1361474).
    Figure DE112020001306T5_0059
  • In einigen Ausführungsformen ist die Cas9-Domäne eine Cas9-Domäne von Staphylococcus aureus (SaCas9). In einigen Ausführungsformen ist die SaCas9-Domäne ein Nuklease-aktives SaCas9, ein Nuklease-inaktives SaCas9 (SaCas9d) oder eine SaCas9-Nickase (SaCas9n).
  • (x) Aufgeteilte napDNAbp-Domänen für die getrennte PE-Zuführung
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren Zellen als zwei oder mehr Fragmente zugeführt werden, die innerhalb der Zelle (entweder durch passiven Zusammenbau oder durch aktiven Zusammenbau, wie etwa unter Verwendung von getrennten Inteinsequenzen) zu einem rekonstituierten Prime-Editor zusammengefügt werden. In einigen Fällen kann der Selbstzusammenbau passiv sein, wodurch die zwei oder mehr Prime-Editor-Fragmente sich innerhalb der Zelle kovalent oder nicht-kovalent assoziieren, um den Prime-Editor zu rekonstituieren. In anderen Fällen kann der Selbstzusammenbau durch Dimerisierungsdomänen katalysiert werden, die auf jedem der Fragmente angebracht sind. Beispiele für Dimerisierungsdomänen sind in dieser Schrift beschrieben. In noch anderen Fällen kann der Selbstzusammenbau durch getrennte Inteinsequenzen katalysiert werden, die auf jedem der Prime-Editor-Fragmente angebracht sind.
  • Die getrennte PE-Zuführung kann vorteilhaft sein, um verschiedene Größenbeschränkungen unterschiedliche Zuführungsansätze anzugehen. Zum Beispiel können Zuführungsansätze virusbasierte Zuführungsverfahren, Messenger-RNA-basierte Zuführungsverfahren oder RNP-basierte Zuführung (ribonukleoproteinbasierte Zuführung) beinhalten. Und jedes dieser Zuführungsverfahren kann effizienter und/oder effektiver sein, indem der Prime-Editor in kleinere Teile aufgeteilt wird. Sobald sie sich in der Zelle befinden, können die kleineren Teile sich zu einem funktionalen Prime-Editor zusammenfügen. Je nach der Art der Trennung können die aufgeteilten Prime-Editor-Fragmente auf nicht-kovalente Weise oder auf kovalente Weise wieder zusammengesetzt werden, um den Prime-Editor neu zu bilden. In einer Ausführungsform kann der Prime-Editor an einer oder mehreren Trennstellen in zwei oder mehrere Fragmente getrennt werden. Die Fragmente können unverändert sein (abgesehen davon, dass sie getrennt sind). Sobald die Fragmente der Zelle zugeführt wurden (z. B. durch direkte Zuführung eines Ribonukleoproteinkomplexes oder durch Nukleinsäurezuführung, z. B. mRNA-Zuführung oder virusvektorbasierte Zuführung), können sich die Fragmente wieder kovalent oder nicht-kovalent assoziieren, um den Prime-Editor zu rekonstituieren. In einer anderen Ausführungsform kann der Prime-Editor an einer oder mehreren Trennstellen in zwei oder mehr Fragmente getrennt werden. Jedes der Fragmente kann so modifiziert werden, dass es eine Dimerisierungsdomäne umfasst, wobei jedes gebildete Fragment an eine Dimerisierungsdomäne gekoppelt ist. Sobald sie innerhalb einer Zelle zugeführt oder exprimiert sind, assoziieren und binden die Dimerisierungsdomänen der verschiedenen Fragmente aneinander, wodurch die verschiedenen Prime-Editor-Fragmente zusammengebracht werden, um einen funktionalen Prime-Editor zu bilden. In noch einer anderen Ausführungsform kann das Prime-Editor-Fragment modifiziert werden, um ein getrenntes Intein zu umfassen. Sobald sie innerhalb einer Zelle zugeführt oder exprimiert wurden, assoziieren und binden die getrennten Inteindomänen der verschiedenen Fragmente aneinander und durchlaufen dann ein Trans-Spleißen, was zur Exzision der getrennten Inteindomänen aus jedem der Fragmente und einer damit einhergehenden Bildung einer Peptidbindung zwischen den Fragmenten führt, wodurch der Prime-Editor wiederhergestellt wird.
  • In einer Ausführungsform kann der Prime-Editor unter Verwendung eines getrennten-Intein-Ansatzes zugeführt werden.
  • Die Position der Trennstelle kann zwischen einem oder mehreren Restpaaren im Prime-Editor und in beliebigen Domänen darin positioniert werden, einschließlich innerhalb der napDNAbp-Domäne, der Polymerase-Domäne (z. B. RT-Domäne), der Linkerdomäne, die sich das napDNAbp -Domäne anschließt, und der Polymerasedomäne.
  • In einer Ausführungsform, die in 66 abgeblidet ist, ist der Prime-Editor (PE) an einer Trennstelle innerhalb des napDNAbp geteilt.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist das napDNAbp ein kanonisches SpCas9-Polypeptid aus SEQ ID NO: 1361421, wie folgt:
    Figure DE112020001306T5_0060
  • In bestimmten Ausführungsformen wird das SpCas9 an einer Trennstelle in zwei Fragmente getrennt, die sich zwischen den Resten 1 und 2 oder 2 und 3 oder 3 und 4 oder 4 und 5 oder 5 und 6 oder 6 und 7 oder 7 und 8 oder 8 und 9 oder 9 und 10 oder zwischen zwei beliebigen Paaren von Resten irgendwo zwischen den Resten 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300 oder 1300-1368 des kanonischen SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421 befindet.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird ein napDNAbp an einer Trennstelle in zwei Fragmente getrennt, die sich an einem Restpaar befindet, das zwei beliebigen Restenpaaren entspricht, die sich irgendwo zwischen den Positionen 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300 oder 1300-1368 des kanonischen SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421 befinden.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird das SpCas9 an einer Trennstelle in zwei Fragmente getrennt, die sich zwischen den Resten 1 und 2 oder 2 und 3 oder 3 und 4 oder 4 und 5 oder 5 und 6 oder 6 und 7 oder 7 und 8 oder 8 und 9 oder 9 und 10 oder zwischen zwei beliebigen Paaren von Resten irgendwo zwischen den Resten 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300 oder 1300-1368 des kanonischen SpCas9 aus SEQ ID NO: 1361421 befindet.
  • In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Trennstelle an einer oder mehreren Polypeptidbindungsstellen (d. h. eine „Trennstelle oder getrenntes-Intein-Trennstelle“), wird an ein getrenntes Intein fusioniert und dann Zellen als separat codierte Fusionsproteine zugeführt. Sobald die getrenntes-Intein-Fusionsproteine (d. h. Proteinhälften) innerhalb einer Zelle exprimiert sind, werden die Proteine einem Trans-Spleißen unterzogen, um einen vollständigen oder ganzen PE zu bilden, wobei die verbundenen getrenntes-Intein-Sequenzen gleichzeitig entfernt werden.
  • Wie beispielsweise in 38 gezeigt, kann das N-terminale Extein mit einem ersten getrennten Intein (z. B. N-Intein) fusioniert werden und das C-terminale Extein kann mit einem zweiten getrennten Intein (z. B. C-Intein) fusioniert werden. Das N-terminale Extein wird mit dem C-terminalen Extein fusioniert, um ein ganzes Prime-Editor-Fusionsprotein zu bilden, das eine napDNAbp-Domäne und eine Polymerase-Domäne (z. B. RT-Domäne) umfasst, nach der Selbstassoziierung des N-Inteins und des C-Inteins innerhalb der Zelle, gefolgt von ihrer Selbstexzision und der gleichzeitigen Bildung einer Peptidbindung zwischen den N-terminalen Extein- und C-terminalen Extein-Abschnitten eines ganzen Prime-Editors (PE).
  • Um eine getrennte-PE-Zuführungsstrategie mit getrennten Inteinen zu nutzen, muss der Prime-Editor an einer oder mehreren Trennstellen geteilt werden, um mindestens zwei separate Hälften eines Prime-Editors zu schaffen, von denen jede innerhalb einer Zelle wieder zusammengefügt werden kann, wenn jede Hälfte zu einer getrenntes-Intein-Sequenz fusioniert ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird der Prime-Editor an einer einzelnen Trennstelle getrennt. In bestimmten anderen Ausführungsformen wird der Prime-Editor an zwei Trennstellen oder drei Trennstellen oder vier Trennstellen oder mehr getrennt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Prime-Editor an einer einzelnen Trennstellen getrennt, um zwei separate Hälften eines Prime-Editors zu erzeugen, von denen jede zu einer getrennten Inteinsequenz fusioniert werden kann.
  • Ein beispielhaftes getrenntes Intein ist das Ssp-DnaE-Intein, das zwei Untereinheiten umfasst, nämlich DnaE-N und DnaE-C. Die beiden verschiedenen Untereinheiten werden von separaten Genen codiert, nämlich dnaE-n und dnaE-c, welche die DnaE-N- bzw. DnaE-C-Untereinheiten codieren. DnaE ist ein natürlich vorkommendes getrenntes Intein Synechocytis sp. PCC6803 und ist in der Lage, das Trans-Spleißen von zwei separaten Proteinen zu steuern, die jeweils eine Fusion mit entweder DnaE-N oder DnaE-C umfassen.
  • Zusätzliche natürlich vorkommende oder manipulierte getrenntes-Intein-Sequenzen sind in den in dieser Schrift beschriebenen Ganzinteinsequenzen bekannt oder können aus den in dieser Schrift beschriebenen oder auf dem Fachgebiet verfügbaren Sequenzen hergestellt werden. Beispiele für getrenntes-Intein-Sequenzen finden sich in Stevens et al., „A promiscuous split intein with extended protein engineering applications“, PNAS, 2017, Vol. 114: 8538-8543; Iwai et al., „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme“, FEBS Lett, 580: 1853-1858, die jeweils in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind. Weitere getrennte Inteinsequenzen finden sich beispielsweise in WO 2013/045632 , WO 2014/055782 , WO 2016/069774 und EP2877490 , deren Inhalte jeweils in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Darüber hinaus wurde das Spleißen von Proteinen in trans in vivo und in vitro beschrieben (Shingledecker et al., Gene 207:187 (1998), Southworth et al., EMBO J. 17:918 (1998); Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans et al., J. Biol. Chem.-Nr. 275:9091 (2000); Otomo et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)) und bietet die Möglichkeit, ein Protein hinsichtlich zweier inaktiver Fragmente zu exprimieren, die anschließend einer Ligation unterzogen werden, um ein funktionelles Produkt zu bilden, z. B. wie in 38 und 39 hinsichtlich der Bildung eines vollständigen PE-Fusionsproteins aus zwei getrennt exprimierten Hälften gezeigt.
  • In verschiedenen in dieser Schrift beschriebenen Ausführungsformen können die kontinuierlichen Evolutionsverfahren (z. B. PACE) verwendet werden, um einen ersten Abschnitt eines Baseneditors zu entwickeln. Ein erster Abschnitt könnte eine einzelne Komponente oder Domäne beinhalten, z. B. eine Cas9-Domäne, eine Desaminase-Domäne oder eine UGI-Domäne. Die separat evolvierte Komponente oder Domäne kann dann an die verbleibenden Abschnitte des Baseneditors innerhalb einer Zelle fusioniert werden, indem sowohl der evolvierte Abschnitt als auch die verbleibenden nicht-evolvierten Abschnitte separat mit getrennten Intein-Polypeptiddomänen exprimiert werden. Der erste Abschnitt könnte allgemeiner jeden ersten Aminosäureteil eines Baseneditors beinhalten, der unter Verwendung eines in dieser Schrift beschriebenen kontinuierlichen Evolutionsverfahrens entwickelt werden soll. Der zweite Abschnitt würde sich in dieser Ausführungsform auf den verbleibenden Aminosäureteil des Baseneditors beziehen, der nicht unter Verwendung der in dieser Schrift beschriebenen Verfahren entwickelt wird. Der entwickelte erste Abschnitt und der zweite Abschnitt des Baseneditors könnten jeweils mit getrennten Intein-Polypeptiddomänen in einer Zelle exprimiert werden. Die natürlichen Proteinspleißmechanismen der Zelle würden den evolvierten ersten Abschnitt und den nicht-evolvierten zweiten Abschnitt wieder zusammensetzen, um einen einzelnen evolvierten Baseneditor des Fusionsproteins zu bilden. Der entwickelte erste Abschnitt kann entweder den N- oder C-terminalen Teil des einzelnen Fusionsproteins umfassen. Auf analoge Weise könnte die Verwendung eines zweiten orthogonalen trans-spleißenden Inteinpaares ermöglichen, dass der entwickelte erste Abschnitt einen internen Teil des einzelnen Fusionsproteins umfasst.
  • Somit kann jede der evolvierten und nicht evolvierten Komponenten der in dieser Schrift beschriebenen Baseneditoren mit getrennten Intein-Tags exprimiert werden, um die Bildung eines vollständigen Baseneditors zu erleichtern, der die evolvierte und nicht-evolvierte Komponente innerhalb einer Zelle umfasst.
  • Der Mechanismus des Proteinspleißprozesses wurde sehr detailliert erforscht (Chong et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 22159-22168; Xu, MQ & Perler, FB EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153) und konservierte Aminosäuren wurden an den Intein- und Extein-Spleißpunkten gefunden (Xu et al., EMBO Journal, 1994, 13 5517-522). Die in dieser Schrift beschriebenen Konstrukte enthalten eine an den 5'-Terminus des ersten Gens fusionierte Inteinsequenz (z. B. den evolvierten Abschnitt des Baseneditors). Geeignete Inteinsequenzen können aus jedem der Proteine ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie Proteinspleißelemente enthalten. Eine Datenbank mit allen bekannten Inteinen ist im World Wide Web zu finden (Perler, FB Nucleic Acids Research, 1999, 27, 346-347). Die Inteinsequenz ist am 3'-Ende mit dem 5'-Ende eines zweiten Gens fusioniert. Um dieses Gen an eine bestimmte Organelle zu lenken, kann ein Peptidsignal an die codierende Sequenz des Gens fusioniert werden. Nach dem zweiten Gen kann die Intein-Gensequenz zur Expression mehrerer Proteine in derselben Zelle beliebig oft wiederholt werden. Für Multi-Intein enthaltende Konstrukte kann es nützlich sein, Inteinelemente aus unterschiedlichen Quellen zu verwenden. Nach der Sequenz des letzten zu exprimierenden Gens muss eine Transkriptionsterminationssequenz eingefügt werden. In einer Ausführungsform ist eine modifizierte Intein-Spleißeinheit so ausgelegt, dass sie sowohl die Exzision der Exteine aus den Inteinen katalysieren als auch die Ligation der Exteine verhindern kann. Es wurde festgestellt, dass die Mutagenese der C-terminalen Exteinverbindung in der Pyrococcus-Spezies GB-D-DNA-Polymerase ein verändertes Spleißelement erzeugt, das die Spaltung von Externen und Inteinen induziert, aber die anschließende Ligation der Exteine verhindert (Xu, MQ & Perler, FB EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153). Die Mutation von Serin 538 zu entweder einem Alanin oder Glycinduzierte die Spaltung, verhinderte jedoch die Ligation. Die Mutation äquivalenter Reste in anderen Intein-Spleißeinheiten sollte auch die Extein-Ligation aufgrund der Konservierung von Aminosäuren an der C-terminalen Extein-Verbindung zum Intein verhindern. Ein bevorzugtes Intein, das keine Endonukleasedomäne enthält, ist das Mycobacterium xenopi GyrA-Protein (Telenti et al., J. Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). Andere wurden in der Natur gefunden oder wurden künstlich erzeugt, indem die Endonukleasedomänen aus Endonuklease enthaltenden Inteinen entfernt wurden (Chong et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 15587-15590). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Intein so ausgewählt, dass es aus der minimalen Anzahl von Aminosäuren besteht, die benötigt wird, um die Spleißfunktion auszuführen, wie etwa das Intein aus dem Mycobacterium xenopi GyrA-Protein (Telenti, A., et al., J. Bacteriol 1997, 179, 6378-6382). In einer alternativen Ausführungsform wird eintein ohne Endonuklease-Aktivität ausgewählt, wie das Intein aus dem Mycobacterium xenopi GyrA-Protein oder das Saccharomyces cerevisiae VMA-Intein, das modifiziert wurde, um Endonuklease-Domänen zu entfernen (Chong, 1997). Eine weitere Modifikation der Inteinspleißeinheit kann eine Veränderung der Reaktionsgeschwindigkeit der Spaltungsreaktion ermöglichen, wodurch die Proteindosierung durch einfaches Modifizieren der Gensequenz der Spleißeinheit gesteuert werden kann.
  • Inteine können auch als zwei Fragmente existieren, die durch zwei separat transkribierte und translatierte Gene codiert werden. Diese sogenannten getrennten Inteine assoziieren selbst und katalysieren die Proteinspleißaktivität in trans. Getrennte Inteine wurden in diversen Cyanobakterien und Archaeen identifiziert (Caspi et al., Mol Microbiol. 50: 1569-1577 (2003); Choi J. et al., J. Mol. Biol. 556: 1093-1106 (2006); Dassa B. et al., Biochemistry. 46:322-330 (2007.); Liu X. und Yang J., J. Biol. Chem. 275:26315-26318 (2003); Wu H.et al.
  • Proc Natl Acad Sci USA. £5:9226-9231 (1998.); und Zettler J. et al., FEBS Letters. 553:909-914 (2009)), wurden aber bisher nicht in Eukaryoten gefunden. Kürzlich ergab eine bioinformatische Analyse metagenomischer Umweltdaten 26 verschiedene Loci mit einer neuartigen genomischen Anordnung. An jedem Locus wird eine konservierte Enzymkodierregion durch ein getrenntes Intein unterbrochen, wobei ein freistehendes Endonukleasegen zwischen die Abschnitte eingefügt wird, die für Intein-Subdomänen codieren. Unter ihnen waren fünf Loci vollständig zusammengesetzt: DNA-Helikasen (gp41-1, gp41-8); Inosin-5'-monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH-1); und katalytische Untereinheiten der Ribonukleotidreduktase (NrdA-2 und NrdJ-1). Diese gebrochene Genorganisation scheint hauptsächlich in Phagen vorzukommen (Dassa et al., Nucleic Acids Research. 57:2560-2573 (2009)).
  • Die getrennte Intein-Npu-DnaE wurde dadurch charakterisiert, dass sie die höchste Rate aufwies, die für die Protein-trans-spleißende Reaktion gemeldet wurde. Darüber hinaus gilt die Npu-DnaE-Proteinspleißreaktion als robust und ertragreich in Bezug auf verschiedene Exteinsequenzen, Temperaturen von 6 bis 37 °C und das Vorhandensein von bis zu 6 M Harnstoff (Zettler J. et al., FEBS Letters. 553:909-914 (2009); Iwai I. et al., FEBS Letters 550: 1853-1858 (2006)). Als die Cysl-Ala-Mutation an der N-Domäne dieser Inteine eingeführt wurde, wurde erwartungsgemäß die anfängliche Verschiebung von N nach S-Acyl und somit das Proteinspleißen blockiert. Leider wurde auch die C-terminale Spaltungsreaktion fast vollständig gehemmt. Die Abhängigkeit der Asparagin-Zyklisierung an der C-terminalen Spleißstelle von der Acylverschiebung an der N-terminalen spaltbaren Peptidbindung scheint eine einzigartige Eigenschaft zu sein, die den natürlich getrennten DnaE-Intein-Allelen gemein ist (Zettler J. et al. FEBS Letters. 555:909-914 (2009)).
  • Der Mechanismus des Proteinspleißens besteht typischerweise aus vier Schritten [29-30]: 1) eine NS- oder NO-Acylverschiebung am N-Terminus des Inteins, welche die stromaufwärts gelegene Peptidbindung bricht und eine Esterbindung zwischen dem N-Extein und der Seitenkette der ersten Aminosäure des Inteins (Cys oder Ser) bildet; 2) eine Umesterung, die das N-Extein zum C-Terminus des Inteins verlagert, wobei eine neue Esterbindung gebildet wird, die das N-Extein mit der Seitenkette der ersten Aminosäure des C-Exteins (Cys, Ser oder Thr) verbindet; 3) Asn-Zyklisieren, welche die Peptidbindung zwischen dem Intein und dem C-Extein bricht; und 4) eine SN- oder ON-Acylverschiebung, die die Esterbindung durch eine Peptidbindung zwischen dem N-Extein und C-Extein ersetzt.
  • Protein-Trans-Spleißen, katalysiert durch getrennte Inteine, bietet eine vollständig enzymatische Methode zur Proteinligation [31]. Ein getrenntes Intein ist im Wesentlichen ein zusammenhängendes Intein (z. B. ein Mini-Intein), das in zwei Teile namens N-Intein bzw. C-Intein getrennt ist. Das N-Intein und C-Intein eines getrennten Inteins können sich nicht-kovalent zu einem aktiven Intein assoziieren und die Spleißreaktion im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie ein zusammenhängendes Intein katalysieren. Getrennten Inteine kommen in der Natur vor und werden auch in Laboren hergestellt [31-35]. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „getrenntes Intein“ jedes Intein, in dem ein oder mehrere Peptidbindungsbrüche zwischen den N-terminalen und C-terminalen Aminosäuresequenzen vorhanden sind, sodass die N-terminalen und C-terminalen Sequenzen zu separaten Molekülen werden, die nicht-kovalent zu einem Intein reassoziieren oder rekonstituieren, das für Trans-Spleißreaktionen funktionell ist. Jedes katalytisch aktive Intein oder Fragment davon kann verwendet werden, um ein getrenntes Intein zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung abzuleiten. Beispielsweise kann das getrennte Intein einem Aspekt von einem eukaryontischen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das getrennte Intein von einem bakteriellen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das getrennte Intein von einem archaealen Intein abgeleitet sein. Vorzugsweise besitzt das so abgeleitete getrennte Intein nur die Aminosäuresequenzen, die für die Katalyse von Trans-Spleißreaktionen essentiell sind.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet das „N-terminale getrennte Intein (In)“ jede Inteinsequenz, die eine N-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Spleißreaktionen funktionell ist. Ein umfasst somit auch eine Sequenz, die beim Trans-Spleißen ausgespleißt wird. Ein kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des N-terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Inteinsequenz ist. Zum Beispiel kann ein zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange solche zusätzlichen und/oder mutierte Reste das In beim Trans-Spleißen nicht funktionsunfähig machen. Vorzugsweise verbessert oder verstärkt die Einbeziehung der zusätzlichen und/oder mutierte Reste die Trans-Spleißaktivität des In.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet das „C-terminale getrennte Intein (Ic)“ jede Inteinsequenz, die eine C-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Spleißreaktionen funktionell ist. In einem Aspekt umfasst das Ic 4 bis 7 zusammenhängende Aminosäurereste, von denen mindestens 4 Aminosäuren vom letzten ß-Strang des Inteins stammen, von dem es abgeleitet wurde. Ein Ic umfasst somit ebenfalls eine Sequenz, die beim Trans-Spleißen ausgespleißt wird. Ein Ic kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des C-terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Inteinsequenz ist. Zum Beispiel kann ein Ic zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange solche zusätzlichen und/oder mutierte Reste das In beim Trans-Spleißen nicht funktionsunfähig machen. Vorzugsweise verbessert oder verstärkt die Einbeziehung der zusätzlichen und/oder mutierte Reste die Trans-Spleißaktivität des Ic.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann ein Peptid, das an ein Ic oder ein gebunden ist, eine zusätzliche chemische Einheit umfassen, einschließlich unter anderem Fluoreszenzgruppen, Biotin, Polyethylenglycol (PEG), Aminosäureanaloga, nichtnatürliche Aminosäuren, Phosphatgruppen, Glycosylgruppen, Radioisotopenmarkierungen und pharmazeutische Moleküle. In anderen Ausführungsformen kann ein mit einem Ic verknüpftes Peptid eine oder mehrere chemisch reaktive Gruppen umfassen, einschließlich unter anderem Keton, Aldehyd, Cys-Reste und Lys-Reste. Das N-Intein und C-Intein eines getrennten Inteins können nicht-kovalent assoziieren, um ein aktives Intein zu bilden und die Spleißreaktion zu katalysieren, wenn ein „Intein-spleißendes Polypeptid (ISP)“ vorhanden ist. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet ein „Intein-spleißendes Polypeptid (ISP)“ den Abschnitt der Aminosäuresequenz eines getrennten Inteins, der verbleibt, wenn das Ic, In oder beide aus dem getrennten Intein entfernt werden. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das In das ISP. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Ic das ISP. In noch einer anderen Ausführungsform ist das ISP ein separates Peptid, das weder an In noch an Ic kovalent gebunden ist.
  • Getrennte Inteine können aus zusammenhängenden Inteinen erzeugt werden, indem eine oder mehrere Trennstellen in der unstrukturierten Schleife oder eine dazwischenliegende Aminosäuresequenz zwischen den -12 konservierten Beta-Strängen, die in der Struktur von Mini-Inteins gefunden werden, erzeugt werden [25-28]. Eine gewisse Flexibilität bei der Position der Trennstelle innerhalb der Regionen zwischen den Beta-Strängen kann bestehen, vorausgesetzt, dass die Bildung der Trennung die Struktur des Inteins, insbesondere der strukturierten Beta-Stränge, nicht in einem Maße stört, das ausreicht, die Proteinspleißaktivität zu verlieren.
  • Beim Protein-Trans-Spleißen besteht ein Vorläuferprotein aus einem N-Extein-Anteil gefolgt vom N-Intein, ein anderes Vorläuferprotein besteht aus dem C-Intein gefolgt von einem C-Extein-Anteil, und eine Trans-Spleißreaktion (katalysiert durch die N- und C-Inteine zusammen) schneidet die beiden Inteinsequenzen aus und verknüpft die beiden Exteinsequenzen mit einer Peptidbindung. Protein-Trans-Spleißen als enzymatische Reaktion kann mit sehr geringen (z. B. mikromolaren) Proteinkonzentrationen arbeiten und unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden.
  • B. Programmierbare Nukleasen (nicht-napDNAbp)
  • In verschiedenen in dieser Schrift beschriebenen Ausführungsformen umfassen die Prime-Editoren ein napDNAbp, wie etwa ein Cas9-Protein. Diese Proteine sind „programmierbar“, indem sie mit einer Leit-RNA (bzw. einer PEgRNA) komplexiert werden, die das Cas9-Protein zu einer Zielstelle auf der DNA leitet, die eine zum Spacerabschnitt der gRNA (oder PEgRNA) komplementäre Sequenz besitzt und auch die erforderliche PAM-Sequenz besitzt. In bestimmten in dieser Schrift vorgestellten Ausführungsformen kann das napDNAbp jedoch durch einen anderen Typ eines programmierbaren Proteins ersetzt werden, wie etwa einer Zinkfinger-Nuklease oder einer Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektor-Nuklease (TALEN).
  • 1H zeigt eine solche Variation des in dieser Schrift in Betracht gezogenen Prime Editings, welches das napDNAbp (z. B. SpCas9-Nickase) durch eine beliebige programmierbare Nukleasedomäne ersetzt, wie etwa Zinkfingernukleasen (ZFN) oder transkriptionsaktivatorähnliche Effektornukleasen (TALEN). Insofern wird erwogen, dass geeignete Nukleasen nicht notwendigerweise durch ein Nukleinsäure-Targeting-Molekül (wie etwa eine Leit-RNA) „programmiert“ werden müssen, sondern vielmehr durch Definieren der Spezifität einer DNA-bindenden Domäne programmiert werden können, wie etwa und insbesondere eine Nuklease. Genau wie beim Prime Editing mit napDNAbp-Einheiten wird bevorzugt, dass solche alternativen programmierbaren Nukleasen derarat modifiziert werden, dass nur ein Strang einer Ziel-DNA geschnitten wird. Anders ausgedrückt sollten die programmierbaren Nukleasen vorzugsweise als Nickasen fungieren. Sobald eine programmierbare Nuklease ausgewählt ist (z. B. eine ZFN oder eine TALEN), können zusätzliche Funktionalitäten in das System eingebaut werden, um ihm zu ermöglichen, gemäß einem Prime-Editing-ähnlichen Mechanismus zu arbeiten. Beispielsweise können die programmierbaren Nukleasen durch Koppeln (z. B. über einen chemischen Linker) eines RNA- oder DNA-Verlängerungsarms daran modifiziert werden, wobei der Verlängerungsarm eine Primerbindungsstelle (PBS) und eine DNA-Synthesematrize umfasst. Die programmierbare Nuklease kann auch (z. B. über einen chemischen oder Aminosäurelinker) an eine Polymerase gekoppelt werden, deren Natur davon abhängt, ob der Verlängerungsarm DNA oder RNA ist. Im Fall eines RNA-Verlängerungsarms kann die Polymerase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) sein. Im Fall eines DNA-Verlängerungsarms kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine prokaryontische Polymerase, einschließlich Pol I, Pol II oder Pol III, oder eine eukaryontische Polymerase, einschließlich Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e oder Pol z). Das System kann auch andere Funktionalitäten enthalten, die als Fusionen an die programmierbaren Nukleasen oder in trans hinzugefügt werden, um die Reaktion als Ganzes zu erleichtern (z. B. (a) eine Helikase zum Abwickeln der DNA an der Schnittstelle, um den geschnittenen Strang mit dem 3'-Ende als Primer verfügbar zu machen, (b) eine FEN1, um das Entfernen des endogenen Strangs auf dem geschnittenen Strang zu unterstützen, um die Reaktion zum Austausch des endogenen Strangs durch den synthetisierten Strang voranzutreiben, oder (c) ein nCas9:gRNA-Komplex, um ein Nick an einer zweiten Stelle am gegenüberliegenden Strang zu erzeugen, was dazu beitragen kann, die Integration der synthetisierenden Reparatur durch eine bevorzugte zelluläre Reparatur des nicht-editierten Strangs voranzutreiben). Analog zum Prime Editing mit einem napDNAbp könnte ein solcher Komplex mit einer ansonsten programmierbaren Nuklease verwendet werden, um einen neu synthetisierten DNA-Ersatzstrang mit einer interessierenden Editierung zu synthesieren und dann dauerhaft in einer DNA-Zielstelle anzubringen.
  • Geeignete alternative programmierbare Nukleasen sind im Stand der Technik gut bekannt und können anstelle von a. verwendet werden napDNAbp:gRNA Komplex, um ein alternatives Prime-Editor-System zu konstruieren, das so programmiert werden kann, dass es selektiv eine DNA-Zielstelle bindet, und das auf die vorstehend beschriebene Weise weiter modifiziert werden kann, um eine Polymerase und einen RNA- oder DNA-Verlängerungsarm, der eine Primerbindungsstelle umfasst, gemeinsam zu lokalisieren und eine DNA-Synthesematrize für eine spezifische Nickstelle. Beispielsweise und wie in 1H dargestellt können Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) als programmierbare Nuklease in den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editing-Verfahren und Stoffzusammensetzungen verwendet werden. TALENS sind künstliche Restriktionsenzyme, die durch Fusion der TAL-Effektor-DNA-Bindungsdomäne mit einer DNA-Spaltungsdomäne erzeugt werden. Diese Reagenzien ermöglichen eine effiziente, programmierbare und spezifische DNA-Spaltung und stellen leistungsstarke Werkzeuge für die Genom-Editierung in situ dar. Transkriptionsaktivatorähnliche Effektoren (TALEs) können schnell so konstruiert werden, dass sie praktisch jede DNA-Sequenz binden. Der Begriff TALEN, wie er in dieser Schrift verwendet wird, ist breit und umfasst ein monomeres TALEN, das doppelsträngige DNA ohne Hilfe eines anderen TALEN spalten kann. Der Begriff TALEN wird auch verwendet, um sich auf ein oder beide Mitglieder eines TALEN-Paares zu beziehen, die so konstruiert sind, dass sie zusammenarbeiten, um DNA an derselben Stelle zu spalten. TALENs, die zusammenarbeiten, können als linkes TALEN und rechtes TALEN bezeichnet werden, was auf die Händigkeit der DNA verweist. Siehe US-Ser. Nr. 12/965,590 ; US-Ser. Nr. 13/426,991 ( US-Patent Nr. 8,450,471 ); US-Ser. Nr. 13/427,040 ( US-Patent Nr. 8,440,431 ); US-Ser. Nr. 13/427,137 ( US-Patent Nr. 8,440,432 ); und US-Ser. Nr. 13/738,381 , die sämtlich durch Bezugnahme vollumfänglich in diese Schrift aufgenommen sind. Außerdem werden TALENS in WO 2015/027134 , US 9,181,535 , Boch et al., „Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors“, Science, Vol. 326, S. 1509-1512 (2009), Bogdanove et al., TAL Effectors: Customizable Proteins for DNA Targeting, Science, Vol 333, S. 1843-1846 (2011), Cade et al., „Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs“, Nucleic Acids Research, Vol. 40, S. 8001-8010 (2012), und Cermak et al., „Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effectorbased constructs for DNA targeting“, Nucleic Acids Research, Vol. 39, Nr. 17, e82 (2011), Vol. 39, Nr. 17, e82 (2011) beschrieben, die jeweils in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Wie in 1H dargestellt, können Zinkfinger-Nukleasen auch als alternative programmierbare Nukleasen zur Verwendung beim Prime Editing anstelle von napDNAbps verwendet werden, wie etwa Cas9-Nickasen. Wie bei TALENS können die ZFN-Proteine so modifiziert werden, dass sie als Nickasen fungieren, d. h. das ZFN so konstruieren, dass es nur einen Strang der Ziel-DNA in einer ähnlichen Weise wie das napDNAbp spaltet, das mit den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren verwendet wird. ZFN-Proteine wurden im Stand der Technik ausführlich beschrieben, zum Beispiel in Carroll et al., „Genom Engineering with Zinc-Finger Nucleases“, Genetics, Aug. 2011, Vol. 188: 773-782; Durai et al., „Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells“, Nucleic Acids Res. 2005, Vol. 33: 5978-90; und Gaj et al., „ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering“, Trends Biotechnol. 2013, Vol. 31: 397-405, die jeweils vollumfänglich durch Bezugnahme in dieser Schrift aufgenommen ist.
  • C. Polymerasen (z. B. Reverse Transkriptase)
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfasst das in dieser Schrift offenbarte Prime-Editor(PE)-System eine Polymerase (z. B. DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) oder eine Variante davon, die als ein Fusionsprotein mit einem napDNAbp oder einer anderen programmierbaren Nuklease bereitgestellt werden kann oder in trans bereitgestellt wird.
  • Jede Polymerase kann in den in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren verwendet werden. Die Polymerasen können Wildtyp-Polymerasen, funktionelle Fragmente, Mutanten, Varianten oder verkürzte Varianten und dergleichen sein. Die Polymerasen können Wildtyp-Polymerasen aus eukaryontischen, prokaryontischen, Archael- oder viralen Organismen beinhalten, und/oder die Polymerasen können durch Gentechnik, Mutagenese, gesteuerte evolutionsbasierte Prozesse modifiziert werden. Die Polymerasen können T7-DNA-Polymerase, T5-DNA-Polymerase, T4-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment-DNA-Polymerase, DNA-Polymerase III und dergleichen beinhalten. Die Polymerasen können auch thermostabil sein und können Taq-, Tne-, Tma-, Pfu-, Tfl-, Tth-, Stoffel-Fragment-, VENT®- und DEEPVENT®-DNA-Polymerasen, KOD, Tgo, JDF3 und Mutanten, Varianten und Derivate davon beinhalten (siehe US-Patent Nr. 5,436,149 , US-Patent Nr. 4,889,818 , US-Patent Nr. 4,965,185 , US-Patent Nr. 5,079,352 , US-Patent Nr. 5,614,365 , US-Patent Nr. 5,374,553 , US-Patent Nr. 5,270,179 ; Nr. 5,047,342 ; US-Patent Nr. 5,512,462 ; WO 92/06188 ; WO 92/06200 ; WO 96/10640 ; Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M, et al., Nuc. Acids Res. 22(15):3259-3260 (1994), die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind). Für die Synthese längerer Nukleinsäuremoleküle (z. B. Nukleinsäuremoleküle mit einer Länge von mehr als etwa 3-5 Kb) können mindestens zwei DNA-Polymerasen verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen kann einer der Polymerasen im Wesentlichen eine 3'-Exonuklease-Aktivität fehlen und die andere kann eine 3'-Exonuklease-Aktivität aufweisen. Solche Paarungen können Polymerasen beinhalten, die gleich oder verschieden sind. Beispiele für DNA-Polymerasen, denen die 3'-Exonuklease-Aktivität im Wesentlichen fehlt, umfassen Taq-, Tne(exo-), Tma(exo-), Pfu(exo-), Pwo(exo-), exo-KOD- und Tth-DNA-Polymerasen sowie Mutanten, Varianten und Derivate davon.
  • Vorzugsweise ist die Polymerase, die in den in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren verwendbar ist, eine „matrizenabhängige“ Polymerase (da die Polymerasen sich auf die DNA-Synthesematrize verlassen sollen, um die Sequenz des DNA-Strangs, der während des Prime Editing synthetisiert wird, zu spezifizieren. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Matrizen-DNA-Molekül“ den Strang einer Nukleinsäure, aus dem ein komplementärer Nukleinsäurestrang durch eine DNA-Polymerase synthetisiert wird, beispielsweise in einer Primerverlängerungsreaktion der DNA-Synthesematrize einer PEgRNAPEgRNA.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, soll der Begriff „matrizenabhängige Weise“ einen Prozess bezeichnen, der die matrizenabhängige Verlängerung eines Primermoleküls beinhaltet (z. B. DNA-Synthese durch DNA-Polymerase). Der Begriff „matrizenabhängige Weise“ bezeichnet die Polynukleotidsynthese von RNA oder DNA, wobei die Sequenz des neu synthetisierten Polynukleotidstrangs durch die wohlbekannten Regeln der komplementären Basenpaarung diktiert wird (siehe zum Beispiel Watson, JD et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1987)). Der Begriff „komplementär“ bezieht sich auf das breite Konzept der Sequenzkomplementarität zwischen Regionen von zwei Polynukleotidsträngen oder zwischen zwei Nukleotiden durch Basenpaarung. Es ist bekannt, dass ein Adeninnukleotid in der Lage ist, mit einem Nukleotid, das Thymin oder Uracil ist, spezifische Wasserstoffbrückenbindungen („Basenpaarung“) zu bilden. In ähnlicher Weise ist bekannt, dass ein Cytosinnukleotid zur Basenpaarung mit einem Guaninnukleotid in der Lage ist. Insofern kann man im Fall des Prime Editing sagen, dass der DNA-Einzelstrang, der von der Polymerase des Prime-Editors gegen die DNA-Synthesematrize synthetisiert wird, als „komplementär“ zur Sequenz der DNA-Synthesematrize bezeichnet wird.
  • (i) Beispielhafte Polymerasen
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren eine Polymerase. Die Offenbarung betrachtet jede Wildtyp-Polymerase, die man aus einem natürlich vorkommenden Organismus oder Virus gewinnt oder aus einer im Handel erhältlichen oder nicht im Handel erhältlichen Quelle gewinnt. Darüber hinaus können die Polymerasen, die in den Prime-Editoren der Offenbarung verwendbar sind, jede natürlich vorkommende mutierte Polymerase, gentechnisch veränderte mutierte Polymerase oder andere varianten Polymerase beinhalten, einschließlich verkürzter Varianten, die ihre Funktion beibehalten. Die in dieser Schrift verwendbaren Polymerasen können auch so konstruiert werden, dass sie spezifische Aminosäuresubstitutionen enthalten, wie die in dieser Schrift spezifisch offenbarten. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die in den Prime-Editoren der Offenbarung verwendbaren Polymerasen matrizenbasierte Polymerasen, d. h. sie synthetisieren Nukleotidsequenzen in einer matrizenabhängigen Weise.
  • Eine Polymerase ist ein Enzym, das einen Nukleotidstrang synthetisiert und das in Verbindung mit den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor-Systemen verwendet werden kann. Die Polymerasen sind vorzugsweise „matritzenabhängige“ Polymerasen (d. h. eine Polymerase, die einen Nukleotidstrang basierend auf der Reihenfolge der Nukleotidbasen eines Matrizenstrangs synthetisiert). In bestimmten Konfigurationen können die Polymerasen auch „matritzenunabhängig“ sein (d. h. eine Polymerase, die einen Nukleotidstrang synthetisiert, ohne dass ein Matrizenstrang benötigt wird). Eine Polymerase kann ferner auch als „DNA-Polymerase“ oder „RNA-Polymerase“ kategorisiert werden. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst das Prime-Editor-System eine DNA-Polymerase. In verschiedenen Ausführungsformen kann die DNA-Polymerase eine „DNA-abhängige DNA-Polymerase“ sein (d. h. wobei das Matrizenmolekül ein DNA-Strang ist). In solchen Fällen kann das DNA-Matrizenmolekül eine PEgRNAPEgRNA sein, wobei der Verlängerungsarm einen DNA-Strang umfasst. In solchen Fällen kann die PEgRNAPEgRNA als chimäre oder hybride PEgRNAPEgRNA bezeichnet werden, die einen RNA-Abschnitt (d. h. die Leit-RNA-Komponenten, einschließlich des Spacers und des gRNA-Kerns) und einen DNA-Abschnitt (d. h. den Verlängerungsarm) umfasst. In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die DNA-Polymerase eine „RNA-abhängige DNA-Polymerase“ sein (d. h. wobei das Matrizenmolekül ein RNA-Strang ist). In solchen Fällen ist die PEgRNAPEgRNA RNA, d. h. einschließlich einer RNA-Verlängerung. Der Begriff „Polymerase“ kann sich auch auf ein Enzym beziehen, das die Polymerisation von Nukleotiden (d. h. die Polymeraseaktivität) katalysiert. Im Allgemeinen initiiert das Enzym die Synthese am 3'-Ende eines Primers, der an eine Polynukleotid-Matrizensequenz angelagert ist (z. B. wie etwa eine Primersequenz, die an die Primerbindungsstelle einer PEgRNAPEgRNA angelagert ist), und setzt sich zum 5'-Ende des Matrizenstrangs fort. Eine „DNA-Polymerase“ katalysiert die Polymerisation von Desoxynukleotiden. Wie in dieser Schrift in Bezug auf eine DNA-Polymerase verwendet, beinhaltet der Begriff DNA-Polymerase ein „funktionelles Fragment davon“. Ein „funktionelles Fragment davon“ bezieht sich auf jeden Abschnitt einer Wildtyp- oder mutierten DNA-Polymerase, der weniger als die gesamte Aminosäuresequenz der Polymerase umfasst und der die Fähigkeit behält, unter mindestens einer Reihe von Bedingungen die Polymerisation eines Polynukleotids zu katalysieren. Ein solches funktionelles Fragment kann als separate Einheit existieren oder kann ein Bestandteil eines größeren Polypeptids sein, wie etwa eines Fusionsproteins.
  • In einigen Ausführungsformen können die Polymerasen von Bakteriophagen stammen. Bakteriophagen-DNA-Polymerasen weisen im Allgemeinen keine 5'- bis 3'-Exonuklease-Aktivität auf, da diese Aktivität von einem separaten Polypeptid codiert wird. Beispiele geeigneter DNA-Polymerasen sind T4-, T7- und phi29-DNA-Polymerase. Die im Handel erhältlichen Enzyme sind: T4 (erhältlich von vielen Quellen, z. B. Epicentre) und T7 (erhältlich von vielen Quellen, z. B. Epicentre für unmodifizierte und USB für 3' bis 5' exo T7- „Sequenase“-DNA-Polymerase).
  • Bei den anderen Ausführungsformen sind die Polymerasen archaeale Polymerasen. Es gibt 2 verschiedene Klassen von DNA-Polymerasen, die in Archaeen identifiziert wurden: 1. Familie B/Pol I-Typ (Homologe von Pfu aus Pyrococcus furiosus) und 2. Pol II-Typ (Homologe von P. furiosus-DPl!DP2 2-Untereinheiten-Polymerase). Es wurde gezeigt, dass den DNA-Polymerasen aus beiden Klassen von Natur aus eine assoziierte 5'-zu-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt und sie eine 3'-zu-5'-Exonuklease-(Korrektur-) Aktivität besitzen. Geeignete DNA-Polymerasen (Pol I oder Pol II) können aus Archaeen mit optimalen Wachstumstemperaturen abgeleitet werden, die den gewünschten Assay-Temperaturen ähnlich sind.
  • Thermostabile Archaeen-DNA-Polymerasen werden aus Pyrococcus-Spezies (furiosus, Spezies GB-D, woesii, abysii, horikoshii), Thermococcus-Spezies (kodakaraensis KOD1, litoralis, Spezies 9 Grad Nord-7, Spezies JDF-3, gorgonarius), Pyrodictium occultum und Archaeoglobus fulgidus isoliert.
  • Polymerasen können auch von eubakteriellen Spezies stammen. Es gibt 3 Klassen von eubakteriellen DNA-Polymerasen, Pol I, II und III. Enzyme in der Pol I-DNA-Polymerase-Familie besitzen 5'-zu-3'-Exonuklease-Aktivität, und bestimmte Mitglieder zeigen auch 3'- bis 5'-Exonuklease-Aktivität. Pol II-DNA-Polymerasen haben von Natur aus keine 5'-zu-3'-Exonuklease-Aktivität, weisen jedoch 3'-zu-5'-Exonuklease-Aktivität auf. Pol III-DNA-Polymerasen stellen die wichtigste replikative DNA-Polymerase der Zelle dar und bestehen aus mehreren Untereinheiten. Der katalytischen Untereinheit von Pol III fehlt die 5'- bis 3'-Exonuklease-Aktivität, aber in einigen Fällen ist die 3'- bis 5'-Exonuklease-Aktivität im gleichen Polypeptid lokalisiert.
  • Es gibt eine Vielzahl von im Handel erhältlichen Pol I-DNA-Polymerasen, von denen einige modifiziert wurden, um die 5'-zu-3'-Exonuklease-Aktivität zu reduzieren oder zu beseitigen.
  • Geeignete thermostabile Pol I-DNA-Polymerasen können aus einer Vielzahl thermophiler Eubakterien isoliert werden, einschließlich Thermus-Arten und Thermotoga maritima, wie etwa Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth) und Thermotoga maritima (Tma UlTma).
  • Zusätzliche Eubakterien, die mit den vorstehend aufgeführten verwandt sind, sind in Thermophilic Bacteria (Kristjansson, JK, Hrsg.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1992, beschrieben.
  • Die Erfindung stellt ferner chimäre oder nicht-chimäre DNA-Polymerasen bereit, die gemäß den in US-Pat. Nr. 5,677,152 , 6,479,264 und 6,183,998 , deren Inhalt hiermit vollumfänglich durch Bezugnahme aufgenommen ist, offenbarten Verfahren chemisch modifiziert sind.
  • Weitere Archaea-DNA-Polymerasen, die mit den vorstehend aufgeführten verwandt sind, sind in der folgenden Literatur beschrieben: Archaea: A Laboratory Manual (Robb, FT and Place, AR, Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1995 und Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J. K., Hrsg.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1992.
  • (ii) B. Beispielhafte reverse Transkriptasen
  • In verschiedenen Ausführungsformen beinhaltet das in dieser Schrift offenbarte Prime-Editor(PE)-System eine reverse Transkriptase oder eine Variante davon.
  • Reverse Transkriptasen sind multifunktionale Enzyme, typischerweise mit drei enzymatischen Aktivitäten, einschließlich RNA- und DNA-abhängiger DNA-Polymerisationsaktivität und einer RNaseH-Aktivität, welche die Spaltung von RNA in RNA-DNA-Hybriden katalysiert. Einige Mutanten von reversen Transkriptasen haben die RNaseH-Einheit deaktiviert, um eine unbeabsichtigte Schädigung der mRNA zu verhindern. Diese Enzyme, die komplementäre DNA (cDNA) unter Verwendung von mRNA als Matrize synthetisieren, wurden zuerst in RNA-Viren identifiziert. Anschließend wurden reverse Transkriptasen isoliert und direkt aus Viruspartikeln, Zellen oder Geweben gereinigt. (siehe z. B. Kacian et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83; Yang et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11; Gerard et al., 1975, J. Virol. 15: 785-97; Liu et al., 1977, Arch. Virol. 55 187-200; Katoet al., 1984, J. Virol. Methods 9: 325-39; Luke et al., 1990, Biochem. 29: 1764-69 and Le Grice et al., 1991, J. Virol. 65: 7004-07, jeweils durch Bezugnahme aufgenommen). In jüngerer Zeit wurden Mutanten und Fusionsproteine auf der Suche nach verbesserten Eigenschaften wie etwa Thermostabilität, Genauigkeit und Aktivität geschaffen. Alle Wildtypen, Varianten und/oder Mutantenformen der reversen Transkriptase, die im Fachgebiet bekannt sind oder die unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden können, werden in dieser Schrift in Betracht gezogen.
  • Das Gen für die reverse Transkriptase (RT) (oder die darin enthaltene genetische Information) kann aus einer Reihe verschiedener Quellen bezogen werden. Beispielsweise kann das Gen aus eukaryontischen Zellen gewonnen werden, die mit Retrovirus infiziert sind, oder aus einer Reihe von Plasmiden, die entweder das gesamte Retrovirus-Genom oder einen Abschnitt davon enthalten. Außerdem kann Messenger-RNA-ähnliche RNA, die das RT-Gen enthält, aus Retroviren gewonnen werden. Beispiele von Quellen für RT umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, das Moloney-Maus-Leukämievirus (M-MLV oder MLVRT); das humane T-Zell-Leukämievirus Typ 1 (HTLV-1); das Rinderleukämievirus (BLV); das Rous-Sarkom-Virus (RSV); das menschliche Immunschwächevirus (HIV); Hefe, einschließlich Saccharomyces, Neurospora, Drosophila; Primaten; und Nagetiere. Siehe zum Beispiel Weiss, et al., U.S. Pat. No. 4,663,290 (1987); Gerard, G. R., DNA:271-79 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-58 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):4944-48 (1985); Roth, M. J., at al., J. Biol. Chem. 260:9326-35 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641-43 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505-16 (1986), EMBO J. 4:1267-75 (1985); und Fawcett, D. F., Cell 47:1007-15 (1986) (jeweils vollumfänglich durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen).
  • (a) Wildtyp-RTs
  • Beispielhafte Enzyme zur Verwendung mit den in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren können M-MLV-Reverse-Transkriptase und RSV-Reverse-Transkriptase beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein. Enzyme mit reverser Transkriptase-Aktivität sind im Handel erhältlich. In bestimmten Ausführungsformen wird die reverse Transkriptase in trans zu den anderen Komponenten des Prime-Editor(PE)-Systems bereitgestellt. Das heißt, die reverse Transkriptase wird als einzelne Komponente exprimiert oder anderweitig bereitgestellt, d. h. nicht als Fusionsprotein mit einem napDNAbp.
  • Ein Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass reverse Transkriptasen vom Wildtyp, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Moloney-Maus-Leukämie-Virus (M-MLV); reverse Transkriptase des humanen Immunschwächevirus (HIV) und reverse Transkriptase des aviären Sarkom-Leukose-Virus (ASLV), die reverse Transkriptase des Rous-Sarkom-Virus (RSV), reverse Transkriptase des aviären Myeloblastose-Virus (AMV), reverse Transkriptase des aviären Erythroblastose-Virus (AEV), reverse Transcriptase des Helfervirus MCAV, reverse Transkriptase des aviären Myelozytomatose-Virus MC29, reverse Transkriptase des Helfervirus-MCAV, reverse Transkriptase des aviären Retikuloendotheliose-Virus (REV-T), reverse Transkriptase des Helfervirus REV-A, reverse Transkriptase des Vogelsarkom-Virus UR2, reverse Transkriptase des Helfervirus UR2AV, reverse Transkriptase des Vogelsarkom-Virus Y73, reverse Transkriptase des Helfervirus YAV, reverse Transkriptase des Rous-assoziierten Virus (RAV) und reverse Transkriptase des Myeloblastose-assoziierten Virus (MAV) beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, in geeigneter Weise in den in dieser Schrift beschriebenen Verfahren und der in dieser Schrift beschriebenen Zusammensetzung verwendet werden können.
  • Beispielhafte Wildtyp-RT-Enzyme sind wie folgt:
    Figure DE112020001306T5_0061
    Figure DE112020001306T5_0062
    Figure DE112020001306T5_0063
    Figure DE112020001306T5_0064
  • (b) Variante RTs
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die reverse Transkriptase eine variante reverse Transkriptase sein. Wie in dieser Schrift verwendet, beinhaltet eine „variante reverse Transkriptase“ jede natürlich vorkommende oder gentechnisch hergestellte Variante, die eine oder mehrere Mutationen (einschließlich singulärer Mutationen, Inversionen, Deletionen, Insertionen und Umordnungen) relativ zu einer Referenzsequenz (z. B. einer Referenz-Wildtypsequenz) umfasst. Die RT weist von Natur aus mehrere Aktivitäten auf, einschließlich einer RNAabhängigen DNA-Polymerase-Aktivität, Ribonuklease H-Aktivität und DNA-abhängiger DNA-Polymerase-Aktivität. Zusammen ermöglichen diese Aktivitäten dem Enzym, einzelsträngige RNA in doppelsträngige cDNA umzuwandeln. In Retroviren und Retrotransposons kann diese cDNA dann in das Wirtsgenom integriert werden, von dem aus mittels Wirtszelltranskription neue RNA-Kopien hergestellt werden können. Variante RTs können eine Mutation umfassen, die eine oder mehrere dieser Aktivitäten beeinflusst (die diese Aktivitäten entweder reduziert oder erhöht oder die diese Aktivitäten insgsamt eliminiert). Darüber hinaus können RT-Varianten eine oder mehrere Mutationen umfassen, welche die RT mehr oder weniger stabil und weniger anfällig für Aggregation machen und die Reinigung und/oder Erkennung und/oder die Änderung von Eigenschaften oder Charakteristiken erleichtern.
  • Ein Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass variante reverse Transkriptasen, die von anderen reversen Transkriptasen abgeleitet sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Moloney-Maus-Leukämie-Virus (M-MLV); reverse Transkriptase des humanen Immunschwächevirus (HIV) und reverse Transkriptase des aviären Sarkom-Leukose-Virus (ASLV), die reverse Transkriptase des Rous-Sarkom-Virus (RSV), reverse Transkriptase des aviären Myeloblastose-Virus (AMV), reverse Transkriptase des aviären Erythroblastose-Virus (AEV), reverse Transcriptase des Helfervirus MCAV, reverse Transkriptase des aviären Myelozytomatose-Virus MC29, reverse Transkriptase des Helfervirus-MCAV, reverse Transkriptase des aviären Retikuloendotheliose-Virus (REV-T), reverse Transkriptase des Helfervirus REV-A, reverse Transkriptase des Vogelsarkom-Virus UR2, reverse Transkriptase des Helfervirus UR2AV, reverse Transkriptase des Vogelsarkom-Virus Y73, reverse Transkriptase des Helfervirus YAV, reverse Transkriptase des Rous-assoziierten Virus (RAV) und reverse Transkriptase des Myeloblastose-assoziierten Virus (MAV) beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, in geeigneter Weise in den in dieser Schrift beschriebenen Verfahren und der in dieser Schrift beschriebenen Zusammensetzung verwendet werden können.
  • Ein Verfahren zur Herstellung von RT-Varianten besteht in der genetischen Modifikation (z. B. durch Modifikation der DNA-Sequenz einer reversen Transkriptase eines Wildtyps). Im Stand der Technik sind eine Reihe von Verfahren bekannt, die sowohl die zufällige als auch die gezielte Mutation von DNA-Sequenzen ermöglichen (siehe beispielsweise Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology (1995) 3. Auflage, John Wiley & Söhne, Inc.). Darüber hinaus gibt es eine Reihe von im Handel erhältlichen Kits für die ortsgerichtete Mutagenese, einschließlich konventioneller und PCR-basierter Methoden. Beispiele beinhalten die QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kits (AGILENT®), das Q5®Site-Directed Mutagenesis Kit (NEW ENGLAND BIOLABS®) und das GeneArt™ Site-Directed Mutagenesis System (THERMOFISHER SCIENTIFIC®).
  • Außerdem können mutierte reverse Transkriptasen durch Insertionsmutation oder Verkürzung (N-terminale, interne oder C-terminale Insertionen oder Verkürzungen) gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren erzeugt werden. Der Begriff „Mutation“, wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet eine Substitution eines Rests innerhalb einer Sequenz, z. B. einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, durch einen anderen Rest oder eine Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Reste innerhalb einer Sequenz. Mutationen werden in dieser Schrift typischerweise dadurch beschrieben, dass der ursprüngliche Rest identifiziert wird, gefolgt von der Position des Rests innerhalb der Sequenz und der Identität des neu substituierten Rests. Verschiedene Verfahren zur Durchführung der in dieser Schrift bereitgestellten Aminosäuresubstitutionen (Mutationen) sind im Stand der Technik gut bekannt und werden beispielsweise von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2012)) bereitgestellt. Mutationen können eine Vielzahl von Kategorien umfassen, wie etwa Einzelbasen-Polymorphismen, Mikroduplikationsregionen, Indel und Inversionen, und sollen in keiner Weise einschränkend sein. Mutationen können „Funktionsverlust“-Mutationen umfassen, die das normale Ergebnis einer Mutation sind, die eine Proteinaktivität reduziert oder aufhebt. Die meisten Mutationen mit Funktionsverlust sind rezessiv, da bei einem Heterozygoten die zweite Chromosomenkopie eine nicht mutierte Version des Gens trägt, das für ein voll funktionsfähiges Protein codiert, dessen Vorhandensein den Effekt der Mutation kompensiert. Mutationen umfassen auch „Gain-of-Function“-Mutationen, die einem Protein oder einer Zelle eine abnormale Aktivität verleihen, die in einem normalen Zustand sonst nicht vorhanden ist. Viele Gain-of-Function-Mutationen befinden sich eher in regulatorischen Sequenzen als in codierenden Regionen und können daher eine Reihe von Konsequenzen haben. Eine Mutation kann zum Beispiel dazu führen, dass ein oder mehrere Gene in den falschen Geweben exprimiert werden und diese Gewebe Funktionen erhalten, die ihnen normalerweise fehlen. Aufgrund ihrer Natur sind Gain-of-Function-Mutationen in der Regel dominant.
  • Ältere im Stand der Technik bekannte Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese beruhen auf der Subklonierung der zu mutierenden Sequenz in einen Vektor, wie etwa einen M13-Bakteriophagenvektor, der die Isolierung einer einzelsträngigen DNA-Matrize ermöglicht. Bei diesen Verfahren bindet man einen mutagenen Primer (d. h. einen Primer, der an die zu mutierende Stelle anlagern kann, aber ein oder mehrere fehlgepaarte Nukleotide an der zu mutierenden Stelle trägt) an die einzelsträngige Matrize und polymerisiert dann das Komplement des Matrize beginnend am 3'-Ende des mutagenen Primers. Die resultierenden Duplexe werden dann in Wirtsbakterien transformiert und Plaques werden auf die gewünschte Mutation gescreent.
  • In jüngerer Zeit hat die ortsgerichtete Mutagenese PCR-Methoden verwendet, die den Vorteil haben, dass keine einzelsträngige Matrize erforderlich ist. Darüber hinaus wurden Verfahren entwickelt, die keine Subklonierung erfordern. Bei der Durchführung einer auf PCR basierenden ortsgerichteten Mutagenese müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Erstens ist es bei diesen Verfahren wünschenswert, die Zahl der PCR-Zyklen zu reduzieren, um die Expansion unerwünschter Mutationen, die durch die Polymerase eingeführt werden, zu verhindern. Zweitens muss eine Auswahl vorgenommen werden, um die Anzahl der nicht mutierten Eltemmoleküle zu reduzieren, die in der Reaktion verbleiben. Drittens wird ein PCR-Verfahren mit verlängerter Länge bevorzugt, um die Verwendung eines einzelnen PCR-Primersatzes zu ermöglichen. Und viertens ist es wegen der nicht-matrizenabhängigen terminalen Verlängerungsaktivität einiger thermostabiler Polymerasen oft notwendig, einen Endpolierschritt in das Verfahren vor der stumpfen Ligation des PCR-erzeugten mutierten Produkts einzubauen.
  • Verfahren der Zufallsmutagenese, die zu einer Gruppe von Mutanten führen, die eine oder mehrere zufällig angeordnete Mutationen aufweisen, existieren im Stand der Technik. Eine solche Gruppe von Mutanten kann dann nach solchen gescreent werden, welche die gewünschten Eigenschaften, beispielsweise erhöhte Stabilität, im Vergleich zu einer Wildtyp-Reversen Transkriptase aufweisen.
  • Ein Beispiel für ein Verfahren zur Zufallsmutagenese ist das sogenannte „fehleranfällige PCR-Verfahren“. Wie der Name schon sagt, amplifiziert das Verfahren eine gegebene Sequenz unter Bedingungen, in denen die DNA-Polymerase einen hochpräzisen Einbau nicht unterstützt. Obwohl die Bedingungen, die den fehleranfälligen Einbau für verschiedene DNA-Polymerasen fördern, variieren, kann der Fachmann solche Bedingungen für ein gegebenes Enzym bestimmen. Eine Schlüsselvariable für die Amplifikationstreue vieler DNA-Polymerasen ist beispielsweise die Art und Konzentration des zweiwertigen Metallions im Puffer. Die Verwendung von Manganionen und/oder einer Variation der Magnesium- oder Manganionenkonzentration kann daher angewendet werden, um die Fehlerrate der Polymerase zu beeinflussen.
  • In verschiedenen Aspekten kann die RT der Prime-Editoren eine „fehleranfällige“ Variante der reversen Transkriptase sein. Fehleranfällige reverse Transkriptasen, die im Stand der Technik bekannt und/oder verfügbar sind, können verwendet werden. Darüber hinaus kann RT unter Verwendung eines beliebigen zuvor erwähnten Mutageneseverfahrens durchgeführt werden, einschließlich gesteuerter Evolutionsprozesse, wie z. B. Phagen-unterstützte kontinuierliche Evolution (PACE) oder Phagen-unterstützte nicht-kontinuierliche Evolution (PANCE). Der Begriff „phagenunterstützte kontinuierliche Evolution (PACE)“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet eine kontinuierliche Evolution, die Phagen als virale Vektoren verwendet. Das allgemeine Konzept der PACE-Technologie wurde beispielsweise in der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2009/056194 , eingereicht am 8. September 2009, veröffentlicht als WO 2010/028347 am 11. März 2010; der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2011/066747 , eingereicht am 22. Dezember 2011, veröffentlicht als WO 2012/088381 am 28. Juni 2012; der US-Anmeldung, US-Patent Nr. 9,023,594 , erteilt am 5. Mai 2015, der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2015/012022 , eingereicht am 20. Januar 2015, veröffentlicht als WO 2015/134121 am 11. September 2015 und der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/ US2016/027795 , eingereicht am 15. April 2016, veröffentlicht als WO 2016/168631 am 20. Oktober 2016, beschrieben, deren gesamter Inhalt in diese Schrift jeweils durch Bezugnahme aufgenommen ist. Fehleranfällige reverse Transkriptasen können auch durch Phagen-unterstützte nicht-kontinuierliche Evolution (PANCE) gewonnen werden, was sich in dieser Schrift auf eine nicht-kontinuierliche Evolution bezieht, die Phagen als virale Vektoren verwendet. PANCE ist eine vereinfachte Technik für die schnelle in vivo gesteuerte Evolution unter Verwendung von seriellen Flask-Transfers von sich entwickelnden „Selektionsphagen“ (SP), die ein zu entwickelndes Gen von Interesse enthalten, durch frische E. coli-Wirtszellen, wodurch Gene innerhalb der Wirts-E. coli konstant gehalten werden, während sich die im SP enthaltenen Gene kontinuierlich weiterentwickeln. Serielle Glaskolben-Transfers dienten lange Zeit als allgemein zugänglicher Ansatz für die Evolution von Mikroben im Labor, und in jüngerer Zeit wurden analoge Ansätze für die Evolution von Bakteriophagen entwickelt. Das PANCE-System weist eine geringere Stringenz auf als das PACE-System.
  • Gene für gewünschte mutierte reverse Transkriptasen, die durch Mutagenese oder evolutionäre Prozesse erzeugt werden, können sequenziert werden, um die Stellen und Anzahl der Mutationen zu identifizieren. Für diejenigen Mutanten, die mehr als eine Mutation umfassen, kann die Wirkung einer gegebenen Mutation durch Einführung der identifizierten Mutation in das Wildtyp-Gen durch ortsgerichtete Mutagenese isoliert von den anderen Mutationen, die von der bestimmten Mutante getragen werden, ausgewertet werden. Screening-Assays der so hergestellten einzelnen Mutante ermöglichen dann die Bestimmung der Wirkung dieser Mutation allein.
  • Variante RT-Enzyme, die in dieser Schrift verwendet werden, können auch andere „RT-Varianten“ beinhalten, die zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch ist. mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit einem beliebigen Referenz-RT-Protein, einschließlich jeder Wildtyp-RT oder mutierten RT oder Fragment-RT oder einer anderen in dieser Schrift offenbarten oder in Betracht gezogenen oder im Fachgebiet bekannten Variante von RT sind.
  • In einigen Ausführungsformen kann eine RT-Variante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 oder bis zu 100 oder bis zu 200 oder bis zu 300 oder bis zu 400 oder bis zu 500 oder mehr Aminosäureänderungen im Vergleich zu einer Referenz-RT aufweisen. In einigen Ausführungsformen umfasst die RT-Variante ein Fragment einer Referenz-RT, sodass das Fragment zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens ist 96 % identisch, mindestens 97 % identisch, mindestens 98 % identisch, mindestens 99 % identisch, mindestens 99,5 % identisch oder mindestens 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment der Referenz-RT ist. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment zu mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 %, mindestens 50 %, mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäurelänge einer entsprechenden Wildtyp-RT (z. B. SEQ ID NO: 1361485).
  • In einigen Ausführungsformen kann die Offenbarung auch RT-Fragmente verwenden, die ihre Funktionalität beibehalten und die Fragmente von beliebigen in dieser Schrift offenbarten RT-Proteinen sind. In einigen Ausführungsformen weist das RT-Fragment eine Länge von mindestens 100 Aminosäuren auf. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment mindestens 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 oder bis zu 600 oder mehr Aminosäuren lang.
  • In noch anderen Ausführungsformen kann die Offenbarung auch RT-Varianten verwenden, die am N-Terminus oder am C-Terminus oder an beiden durch eine bestimmte Anzahl von Aminosäuren verkürzt sind, was zu einer verkürzten Variante führt, die immer noch eine ausreichende Polymerasefunktion beibehält. In einigen Ausführungsformen weist die RT-verkürzte Variante eine Verkürzung von mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens auf 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 21, mindestens 22, mindestens 23, mindestens 24, mindestens 25, mindestens 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 oder 250 Aminosäuren am N-terminalen Ende des Proteins auf. In anderen Ausführungsformen weist die RT-verkürzte Variante eine Verkürzung von mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens auf 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 21, mindestens 22, mindestens 23, mindestens 24, mindestens 25, mindestens 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 oder 250 Aminosäuren am N-terminalen Ende des Proteins auf. In noch anderen Ausführungsformen weist die RT-verkürzte Variante eine Verkürzung am N-terminalen und am C-terminalen Ende auf, die gleich oder unterschiedlich lang sind.
  • Zum Beispiel können die in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren eine verkürzte Version der reversen Transkriptase vom M-MLV umfassen. In dieser Ausführungsform enthält die reverse Transkriptase 4 Mutationen (D200N, T306K, W313F, T330P; wobei zu beachten ist, dass die in PE2 vorhandene L603W-Mutation aufgrund der Verkürzung nicht mehr vorhanden ist). Die DNA-Sequenz, die diesen verkürzten Editor codiert, ist 522 bp kleiner als PE2 und daher potenziell nützlich für Anwendungen, bei denen die Zuführung der DNA-Sequenz aufgrund ihrer Größe eine Herausforderung darstellt (d. h. die Zuführung von Adeno-assoziiertem Virus und Lentivirus). Diese Ausführungsform wird als MMLV-RT(verkürzt) bezeichnet und weist die folgende Aminosäuresequenz auf:
    Figure DE112020001306T5_0065
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren eine der wie folgt beschriebenen RTCas9-Varianten oder eine RT-Variante davon umfassen, die zu mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95% identisch, mindestens etwa 96% identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99% identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit Referenz-RT-Varianten ist.
  • Andere fehleranfällige reverse Transkriptasen sind in der Literatur beschrieben, von denen jede zur Verwendung in den in dieser Schrift beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen in Betracht gezogen wird. Fehleranfällige reverse Transkriptasen wurden beispielsweise in Bebenek et al., „Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase“, J. Biol Chem, 1993, Vol. 268: 10324-10334 und Sebastian-Martin et al., „Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases“, Scientific Reports, 2018, Vol. 8: 627, die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind. Darüber hinaus können reverse Transkriptasen, einschließlich fehleranfälliger reverser Transkriptasen, von einem kommerziellen Anbieter bezogen werden, einschließlich ProtoScript® (II) Reverse Transcriptase, AMV Reverse Transcriptase, WarmStart® Reverse Transcriptase und M-MuLV Reverse Transcriptase, alle von NEW ENGLAND BIOLABS® oder AMV Reverse Transcriptase XL, SMARTScribe Reverse Transcriptase, GPR ultra-pure MMLV Reverse Transcriptase, sämtlich von TAKARA BIO USA, INC. (ehemals CLONTECH).
  • In noch anderen Ausführungsformen können die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen eine DNA-Polymerase verwenden, die zu einer reversen Transkriptase weiterentwickelt wurde, wie in Effefson et al., „Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase“, Science, 24. Juni 2016, Vol. 2, No. 352: 1590-1593, beschrieben, dessen Inhalt in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • In einigen Ausführungsformen wird die reverse Transkriptase als Bestandteil eines Fusionsproteins bereitgestellt, das auch ein napDNAbp umfasst. Anders ausgedrückt wird in einigen Ausführungsformen die reverse Transkriptase als Fusionsprotein mit einem napDNAbp fusioniert.
  • Einige beispielhafte reverse Transkriptasen, die gemäß verschiedenen Ausführungsformen dieser Offenbarung mit napDNAbp-Proteinen fusioniert oder als einzelne Proteine bereitgestellt werden können, sind nachstehend bereitgestellt. Beispielhafte reverse Transkriptasen beinhalten Varianten mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit den folgenden Wildtyp-Enzymen oder Teilenzymen:
    Figure DE112020001306T5_0066
    Figure DE112020001306T5_0067
    Figure DE112020001306T5_0068
    Figure DE112020001306T5_0069
    Figure DE112020001306T5_0070
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine oder mehrere der folgenden Mutationen umfasst: P51L, S67K, E69K, L139P, T197A, D200N, H204R, F209N, E302K, E302R, T306K, F309N, W313F, T330P, L345G, L435G, N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, E607K oder D653N im Wildtyp M-MLV RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine oder mehrere der folgenden Mutationen umfasst: P51X, S67X, E69X, L139X, T197X, D200X, H204X, F209X, E302X, T306X, F309X, W313X, T330X, L345X, L435X, N454X, D524X, E562X, D583X, H594X, L603X, E607X oder D653X im Wildtyp M-MLV aus SEQ ID NO: 1361485 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine P51X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X L.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in transbereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine S67X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E69X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L139X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X P.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine T197X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X A.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D200X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine H204X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden umfasst Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X R.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine F209X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E302X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E302X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X R.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine T306X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine F309X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine W313X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X F.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine T330X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X P.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L345X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X G.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in transbereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L435X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden umfasst Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X G.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine N454X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in transbereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D524X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden umfasst Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X G.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E562X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X Q.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D583X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden umfasst Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine H594X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X Q.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L603X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden umfasst Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RTPolypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X W.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E607X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren (wobei RT entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D653X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT aus SEQ ID NO: 1361485 oder in einer entsprechenden umfasst Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In einigen Ausführungsformen ist X N.
  • Das in dieser Schrift beschriebene Prime-Editor(PE)-System betrachtet jede öffentlich verfügbare reverse Transkriptase, die in einem der folgenden US-Patente beschrieben oder offenbart ist (von denen jedes durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen ist): US-Patente Nr. 10,202,658 ; 10,189,831 ; 10,150,955 ; 9,932,567 ; 9,783,791 ; 9,580,698 ; 9,534,201 ; und 9,458,484 und jede Variante davon, die unter Verwendung bekannter Verfahren zum Anbringen von Mutationen oder bekannter Verfahren zur Entwicklung von Proteinen hergestellt werden kann. Die folgenden Literaturhinweise beschreiben reverse Transkriptasen im Stand der Technik. Jede ihrer Offenbarungen wird in dieser Schrift durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen.
  • Herzig, E., Voronin, N., Kucherenko, N. & Hizi, A. A Novel Leu92 Mutant of HIV-1 Reverse Transcriptase with a Selective Deficiency in Strand Transfer Causes a Loss of Viral Replication. J. Virol. 89, 8119-8129 (2015).
  • Mohr, G. et al. A Reverse Transcriptase-Casl Fusion Protein Contains a Cas6 Domain Required for Both CRISPR RNA Biogenesis and RNA Spacer Acquisition. Mol. Cell 72, 700-714.e8 (2018).
  • Zhao, C., Liu, F. & Pyle, A. M. An ultraprocessive, accurate reverse transcriptase encoded by a metazoan group II intron. RNA 24, 183-195 (2018).
  • Zimmerly, S. & Wu, L. An Unexplored Diversity of Reverse Transcriptases in Bacteria. Microbiol Spectr 3, MDNA3-0058-2014 (2015).
  • Ostertag, E. M. & Kazazian Jr, H. H. Biology of Mammalian L1 Retrotransposons. Annual Review of Genetics 35, 501-538 (2001).
  • Perach, M. & Hizi, A. Catalytic Features of the Recombinant Reverse Transcriptase of Bovine Leukemia Virus Expressed in Bacteria. Virology 259, 176-189 (1999).
  • Lim, D. et al. Crystal structure of the moloney murine leukemia virus RNase H domain. J. Virol. 80, 8379-8389 (2006).
  • Zhao, C. & Pyle, A. M. Crystal structures of a group II intron maturase reveal a missing link in spliceosome evolution. Nature Structural & Molecular Biology 23, 558-565 (2016).
  • Griffiths, D. J. Endogenous retroviruses in the human genome sequence. Genom Biol. 2, REVIEWS1017 (2001).
  • Baranauskas, A. et al. Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. Protein Eng Des Sel 25, 657-668 (2012).
  • Zimmerly, S., Guo, H., Perlman, P. S. & Lambowltz, A. M. Group II intron mobility occurs by target DNA-primed reverse transcription. Cell 82, 545-554 (1995).
  • Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H. & Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell 87, 905-916 (1996).
  • Berkhout, B., Jebbink, M. & Zsiros, J. Identification of an Active Reverse Transcriptase Enzyme Encoded by a Human Endogenous HERV-K Retrovirus. Journal of Virology 73, 2365-2375 (1999).
  • Kotewicz, M. L., Sampson, C. M., D'Alessio, J. M. & Gerard, G. F. Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acids Res 16, 265-277 (1988).
  • Arezi, B. & Hogrefe, H. Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer. Nucleic Acids Res 37, 473-481 (2009).
  • Blain, S. W. & Goff, S. P. Nuclease activities of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Mutants with altered substrate specificities. J. Biol. Chem 268, 23585-23592 (1993).
  • Xiong, Y. & Eickbush, T. H. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. EMBO J9, 3353-3362 (1990).
  • Herschhorn, A. & Hizi, A. Retroviral reverse transcriptases. Cell. Mol. Life Sci 67, 2717-2747 (2010).
  • Taube, R., Loya, S., Avidan, O., Perach, M. & Hizi, A. Reverse transcriptase of mouse mammary tumour virus: expression in bacteria, purification and biochemical characterization. Biochem. J. 329 (Teil 3), 579-587 (1998).
  • Liu, M. et al. Reverse Transcriptase-Mediated Tropism Switching in Bordetella Bacteriophage. Science 295, 2091-2094 (2002).
  • Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L. & Eickbush, T. H. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell 72, 595-605 (1993).
  • Nottingham, R. M. et al. RNA-seq of human reference RNA samples using a thermostable group II intron reverse transcriptase. RNA 22, 597-613 (2016).
  • Telesnitsky, A. & Goff, S. P. RNase H domain mutations affect the interaction between Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase and its primer-template. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1276-1280 (1993).
  • Halvas, E. K., Svarovskaia, E. S. & Pathak, V. K. Role of Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Deoxyribonucleoside Triphosphate-Binding Site in Retroviral Replication and In Vivo Fidelity. Journal of Virology 74, 10349-10358 (2000).
  • Nowak, E. et al. Structural analysis of monomeric retroviral reverse transcriptase in complex with an RNA/DNA hybrid. Nucleic Acids Res 41, 3874-3887 (2013).
  • Stamos, J. L., Lentzsch, A. M. & Lambowitz, A. M. Structure of a Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase with Template-Primer and Its Functional and Evolutionary Implications. Mol. Cell 68, 926- 939.e4 (2017).
  • Das, D. & Georgiadis, M. M. The Crystal Structure of the Monomeric Reverse Transcriptase from Moloney Murine Leukemia Virus. Structure 12, 819-829 (2004).
  • Avidan, O., Meer, M. E., Oz, I. & Hizi, A. The processivity and fidelity of DNA synthesis exhibited by the reverse transcriptase of bovine leukemia virus. European Journal of Biochemistry 269, 859-867 (2002).
  • Gerard, G. F. et al. The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation. Nucleic Acids Res 30, 3118-3129 (2002).
  • Monot, C. et al. The Specificity and Flexibility of L1 Reverse Transcription Priming at Imperfect T-Tracts. PLOS Genetics 9, e1003499 (2013).
  • Mohr, S. et al. Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing. RNA 19, 958-970 (2013).
  • Alle vorstehend genannten Literaturhinweise, die sich auf reverse Transkriptasen beziehen, werden hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen, sofern dies nicht bereits angegeben ist.
  • D. PE-Fusionsproteine
  • Das in dieser Schrift beschriebene Prime-Editor(PE)-System betrachtet Fusionsproteine, die ein napDNAbp und eine Polymerase umfassen (z. B. DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) und gegebenenfalls durch einen Linker verbunden sind. Die Anmeldung zieht in Betracht, jedes geeignete napDNAbp und jede Polymerase (z. B. DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie z. B. reverse Transkriptase) in einem einzigen Fusionsprotein zu kombinieren. Beispiele für napDNAbps und Polymerasen (z. B. DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) sind in dieser Schrift jeweils definiert. Da Polymerasen im Stand der Technik gut bekannt sind und die Aminosäuresequenzen leicht verfügbar sind, soll diese Offenbarung in keiner Weise auf die in dieser Schrift identifizierten spezifischen Polymerasen beschränkt sein.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Fusionsproteine jede geeignete strukturelle Konfiguration umfassen. Zum Beispiel kann das Fusionsprotein vom N-Terminus zum C-Terminus ein napDNAbp umfassen, das mit einer Polymerase (z. B. einer DNAabhängigen DNA-Polymerase oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) fusioniert ist. In anderen Ausführungsformen kann das Fusionsprotein vom N-Terminus zum C-Terminus eine Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) umfassen, die mit einem napDNAbp fusioniert ist. Die fusionierte Domäne kann gegebenenfalls durch einen Linker, z. B. eine Aminosäuresequenz, verbunden sein. In anderen Ausführungsformen können die Fusionsproteine die Struktur NH2-[napDNAbp]-[polymerase]-COOH; oder NH2-[polymerase]-[napDNAbp]-COOH umfassen, wobei jede Instanz von "]-[" das Vorhandensein einer optionalen Linkersequenz anzeigt. In Ausführungsformen, bei denen die Polymerase eine reverse Transcriptase ist, können die Fusionsproteine die Struktur NH2-[napDNAbp]-[RT]-COOH oder NH2-[RT]-[napDNAbp]-COOH umfassen, wobei jede Instanz von "]-[" das Vorhandensein einer optionalen Linkersequenz anzeigt.
  • Ein beispielhaftes Fusionsprotein ist in 14 dargestellt, die ein Fusionsprotein zeigt, das eine MLV-Reverse Transkriptase („MLV-RT“) umfasst, die über eine Linkersequenz mit einem Nickase-Cas9 („Cas9(H840A)“) fusioniert ist. Dieses Beispiel soll den Umfang von Fusionsproteinen, die für das in dieser Schrift beschriebene Prime-Editor(PE)-System verwendet werden können, nicht einschränken.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann das Prime-Editor-Fusionsprotein die folgende Aminosäuresequenz aufweisen (in dieser Schrift als „PE1“ bezeichnet), die eine Cas9-Variante beinhaltet, die eine H840A-Mutation (d. h. eine Cas9-Nickase) und eine Wildtyp-M-MLV-RT umfasst, sowie eine N-terminale NLS-Sequenz (19 Aminosäuren) und einen Aminosäurelinker (32 Aminosäuren), der den C-Terminus der Cas9-Nickase-Domäne mit dem N-Terminus der RT-Domäne verbindet. Das PE1-Fusionsprotein hat die folgende Struktur: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(wt)]. Die Aminosäuresequenz von PE1 und dessen einzelnen Komponenten ist wie folgt:
    Figure DE112020001306T5_0071
    Figure DE112020001306T5_0072
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann das Prime-Editor-Fusionsprotein die folgende Aminosäuresequenz aufweisen (in dieser Schrift als „PE2“ bezeichnet), die eine Cas9-Variante beinhaltet, die eine H840A-Mutation (d. h. eine Cas9-Nickase) und eine M-MLV-RT mit Mutationen D200N, T330P, L603W, T306K und W313F umfasst, sowie eine N-terminale NLS-Sequenz (19 Aminosäuren) und einen Aminosäurelinker (33 Aminosäuren), der den C-Terminus der Cas9-Nickase-Domäne mit dem N-Terminus der RT-Domäne verbindet. Das PE2-Fusionsprotein hat die folgende Struktur: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]. Die Aminosäuresequenz von PE2 ist wie folgt:
    Figure DE112020001306T5_0073
    Figure DE112020001306T5_0074
  • In noch anderen Ausführungsformen kann das Prime-Editor-Fusionsprotein die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen:
    Figure DE112020001306T5_0075
    Figure DE112020001306T5_0076
    Figure DE112020001306T5_0077
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift in Betracht gezogenen Prime-Editor-Fusionsproteine auch beliebige Varianten der oben offenbarten Sequenzen umfassen, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch ist. mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit PE1, PE2 oder einer der oben angegebenen Prime-Editor-
  • In einigen Ausführungsformen können Linker verwendet werden, um beliebige der Peptide oder Peptiddomänen oder -einheiten der Erfindung zu verknüpfen (z. B. ein napDNAbp, das mit einer reversen Transkriptase verbunden oder fusioniert ist).
  • In anderen Ausführungsformen können die Prime-Editor-Fusionsproteine auf SaCas9- oder SpCas9-Nickasen mit veränderten PAM-Spezifitäten basieren, wie etwa die folgenden beispielhaften Sequenzen:
    Figure DE112020001306T5_0078
    Figure DE112020001306T5_0079
    Figure DE112020001306T5_0080
  • In noch anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift in Betracht gezogenen Prime-Editor-Fusionsproteine eine Cas9-Nickase (z. B. Cas9 (H840A)) umfassen, die mit einer verkürzten Version der M-MLV-reversen Transkriptase fusioniert ist. In dieser Ausführungsform enthält die reverse Transkriptase auch 4 Mutationen (D200N, T306K, W313F, T330P; wobei zu beachten ist, dass die in PE2 vorhandene L603W-Mutation aufgrund der Verkürzung nicht mehr vorhanden ist). Die DNA-Sequenz, die diesen verkürzten Editor codiert, ist 522 bp kleiner als PE2 und daher potenziell nützlich für Anwendungen, bei denen die Zuführung der DNA-Sequenz aufgrund ihrer Größe eine Herausforderung darstellt (d. h. die Zuführung von Adeno-assoziiertem Virus und Lentivirus). Diese Ausführungsform wird als Cas9(H840A)-MMLV-RT(verkürzt) oder „PE2-kurz“ oder „PE2-verkürzt“ bezeichnet und weist die folgende Aminosäuresequenz auf:
    Figure DE112020001306T5_0081
    Figure DE112020001306T5_0082
  • Siehe 36, die ein Balkendiagramm zum Vergleich der Effizienz (d. h. „% der gesamten Sequenzierungslesungen mit der festgelegten Editierung oder den festgelegten Indels“) von PE2, PE2-verkürzt, PE3 und PE3-verkürzt über verschiedene Zielstellen in verschiedenen Zelllinien bereitstellt. Die Daten zeigen, dass die Prime-Editoren, die die verkürzten RT-Varianten umfassen, etwa so effizient waren wie die Prime-Editoren, welche die nicht verkürzten RT-Proteine umfassen.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift in Betracht gezogenen Prime-Editor-Fusionsproteine auch beliebige Varianten der oben offenbarten Sequenzen umfassen, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch ist. mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit PE1, PE2 oder einer der oben angegebenen Prime-Editor-
  • In bestimmten Ausführungsformen können Linker verwendet werden, um beliebige der Peptide oderPeptiddomänen oder -einheiten der Erfindung zu verknüpfen (z. B. ein napDNAbp, das mit einer reversen Transkriptase verbunden oder fusioniert ist).
  • E. Linker und andere Fusionsproteindomänen
  • Die PE-Fusionsproteine können neben dem napDNAbp (z. B. Cas9-Domäne) und der Polymerase-Domäne (z. B. RT-Domäne) verschiedene andere Domänen umfassen. Wenn beispielsweise das napDNAbp ein Cas9 ist und die Polymerase eine RT ist, können die PE-Fusionsproteine einen oder mehrere Linker umfassen, welche die Cas9-Domäne mit der RT-Domäne verbinden. Die Linker können auch andere funktionelle Domänen, wie etwa Kernlokalisierungssequenzen (NLS) oder eine FEN1 (oder eine andere Flap-Endonuklease) mit den PE-Fusionsproteinen oder einer Domäne davon verbinden.
  • (i) Linker
  • Wie vorstehend definiert, bezeichnet der Begriff „Linker“, wie in dieser Schrift verwendet, eine chemische Gruppe oder ein Molekül, das zwei Moleküle oder Einheiten verbindet, z. B. eine Bindungsdomäne und eine Spaltungsdomäne einer Nuklease. In einigen Ausführungsformen verbindet ein Linker eine gRNA-Bindungsdomäne einer RNA-programmierbaren Nuklease und die katalytische Domäne einer Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase). In einigen Ausführungsformen verbindet sich ein Linker mit dCas9 und reverser Transkriptase. Typischerweise ist der Linker zwischen zwei Gruppen, Molekülen oder anderen Einheiten positioniert oder wird von diesen flankiert und ist mit jeder über eine kovalente Bindung verbunden, wodurch die beiden verbunden werden. In einigen Ausführungsformen ist der Linker eine Aminosäure oder eine Vielzahl von Aminosäuren (z. B. ein Peptid oder Protein). In einigen Ausführungsformen ist der Linker ein organisches Molekül, eine organische Gruppe, ein Polymer oder eine chemische Einheit. In einigen Ausführungsformen ist der Linker 5-100 Aminosäuren lang, zum Beispiel 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 oder 150-200 Aminosäuren lang. Längere oder kürzere Linker werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Der Linker kann so simpel wie eine kovalente Bindung sein, oder er kann ein polymerer Linker mit vielen Atomen Länge sein. In einigen Ausführungsformen ist der Linker ein Polypeptid oder basiert auf Aminosäuren. In anderen Ausführungsformen ist der Linker nicht peptidähnlich. In einigen Ausführungsformen ist der Linker eine kovalente Bindung (z. B. eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, Disulfid-Bindung, Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung usw.). In einigen Ausführungsformen ist der Linker eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung einer Amidbindung. In einigen Ausführungsformen ist der Linker ein zyklischer oder azyklischer, substituierter oder unsubstituierter, verzweigter oder unverzweigter aliphatischer oder heteroaliphatischer Linker. In einigen Ausführungsformen ist der Linker polymer (z. B. Polyethylen, Polyethylenglycol, Polyamid, Polyester usw.). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker ein Monomer, Dimer oder Polymer von Aminoalkansäure. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker eine Aminoalkansäure (z. B. Glycin, Ethansäure, Alanin, Beta-Alanin, 3-Aminopropansäure, 4-Aminobutansäure, 5-Pentansäure usw.). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker ein Monomer, Dimer oder Polymer von Aminoalkansäure (Ahx) In einigen Ausführungsformen basiert der Linker auf einer carbocyclischen Einheit (z. B. Cyclopentan, Cyclohexan). In anderen Ausführungsformen umfasst der Linker eine Polyethylenglykol-Einheit (PEG). In anderen Ausführungsformen umfasst der Linker Aminosäuren. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker ein Peptid. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker eine Aryl- oder Heteroaryleinheit. In einigen Ausführungsformen basiert der Linker auf einem Phenylring. Der Linker kann funktionalisierte Einheiten beinhalten, um die Anheftung eines Nukleophils (z. B. Thiol, Amino) von dem Peptid an den Linker zu erleichtern. Jedes Elektrophil kann als Teil des Linkers verwendet werden. Beispielhafte Elektrophile beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, aktivierte Ester, aktivierte Amide, Michael-Akzeptoren, Alkylhalogenide, Arylhalogenide, Acylhalogenide und Isothiocyanate.
  • In einigen anderen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz (GGGGS)n (SEQ ID NO: 1361520), (G)n (SEQ ID NO: 1361521), (EAAAK)n (SEQ ID NO: 1361522), (GGS)n (SEQ ID NO: 1361523), (SGGS)n (SEQ ID NO: 1361524), (XP)n (SEQ ID NO: 1361525) oder eine beliebige Kombination davon, wobei n unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 und 30 ist, und wobei X eine beliebige Aminosäure ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz (GGS)n (SEQ ID NO: 1361526), wobei n 1, 3 oder 7 ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 1361527). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (SEQ ID NO: 1361528). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 1361529). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGS (SEQ ID NO: 1361530).
  • Insbesondere können die folgenden Linker in verschiedenen Ausführungsformen verwendet werden, um Prime-Editor-Domänen miteinander zu verbinden:
 GGS;
 GGSGGS (SEQ ID NO: 1361523);
 GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 1361523);
 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (SEQ ID NO: 1361528);
 SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 1361527);
 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGG
 SSGGS (SEQ ID NO: 1361585).
  • (ii) Kernokalisierungssequenz (NLS)
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die PE-Fusionsproteine eine oder mehrere Kernlokalisierungssequenzen (NLS) umfassen, die dabei helfen, die Translokation eines Proteins in den Zellkern zu fördern. Solche Sequenzen sind in der Technik gut bekannt und können die folgenden Beispiele beinhalten:
    Beschreibung Sequenz SEQ ID NO:
    NLS von LTag-SV40 PKKRKKV SEQ ID NO: 1361531
    NLS MKRTADGSEFESPKKKRKV SEQ ID NO: 1361532
    NLS MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRETYLC SEQ ID NO: 1361533
    NLS von Nukleoplasm in AVKRPAATKKAGQAKKKKLD SEQ ID NO: 1361534
    NLS von EGL-13 MSRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN SEQ ID NO: 1361535
    NLS von c-MYC PAAKRVKLD SEQ ID NO: 1361536
    NLS von TUS-Protein KLKIKRPVK SEQ ID NO: 1361537
    NLS von LTag-Polyoma VSRKRPRP SEQ ID NO: 1361538
    NLS des Hepatitis-D-Virus-Antigens EGAPPAKRAR SEQ ID NO: 1361539
    NLS von murinem p53 PPQPKKKPLDGE SEQ ID NO: 1361540
    SGGSKRTADGSEFEPKKKRKV SEQ ID NO: 1361541
  • Die vorstehenden NLS-Beispiele sind nicht einschränkend. Die PE-Fusionsproteine können jede bekannte NLS-Sequenz umfassen, einschließlich jeder der in Cokol et al., „Finding nuclear localization signals“, EMBO Rep., 2000, 1(5): 411-415 und Freitas et al., „Mechanisms and Signals for the Nuclear Import of Proteins“, Current Genomics, 2009, 10(8): 550-7, beschrieben, die in dieser Schrift jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Prime-Editoren und Konstrukte, welche die in dieser Schrift offenbarten Prime-Editoren codieren, ferner ein oder mehrere, vorzugsweise mindestens zwei Kernlokalisierungssignale. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Prime-Editoren mindestens zwei NLSs. In Ausführungsformen mit mindestens zwei NLSs können die NLSs die gleichen NLSs sein oder sie können unterschiedliche NLSs sein. Außerdem können die NLSs als Teil eines Fusionsproteins mit den verbleibenden Abschnitten der Prime-Editoren exprimiert werden. In einigen Ausführungsformen sind eine oder mehrere der NLSs zweiteilige NLSs („bpNLS“). In bestimmten Ausführungsformen umfassen die offenbarten Fusionsproteine zwei zweiteilige NLSs. In einigen Ausführungsformen umfassen die offenbarten Fusionsproteine mehr als zwei zweiteilige NLSs.
  • Der Ort der NLS-Fusion kann sich am N-Terminus, am C-Terminus oder innerhalb einer Sequenz eines Prime-Editors (z. B. eingefügt zwischen der codierten napDNAbp-Komponente (z. B. Cas9) und einer Polymerasedomäne (z Transkriptase-Domäne) befinden.
  • Die NLSs können jede im Stand der Technik bekannte NLS-Sequenz sein. Die NLSs können auch alle zukünftig entdeckten NLSs zur Kernlokalisierung sein. Die NLSs können auch jede natürlich vorkommende NLS oder jede nicht natürlich vorkommende NLS sein (z. B. eine NLS mit einer oder mehreren gewünschten Mutationen).
  • Der Begriff „Kernlokalisierungssequenz“ oder „NLS“ (Nuclear Localization Sequence) bezeichnet eine Aminosäuresequenz, die den Import eines Proteins in den Zellkern, beispielsweise durch Kerntransport, fördert. Kemokalisierungssequenzen sind im Stand der Technik bekannt und für den Fachmann offensichtlich. NLS-Sequenzen sind beispielsweise in Plank et al., internationale PCT-Anmeldung, PCT/ EP2000/011690 , eingereicht am 23. November 2000, veröffentlicht als WO2001/038547 am 31. Mai 2001 beschrieben, deren Inhalt in diese Schrift wegen durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einigen Ausführungsformen umfasst eine NLS die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ ID NO: 1361531), MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (SEQ ID NO: 1361533), KRTADGSEFESPKKKRKV (SEQ ID NO: 1361659) oder KRTADGSEFEPKKKRKV (SEQ ID NO: 1361660). In anderen Ausführungsformen umfasst die NLS die Aminosäuresequenzen NLSKRPAAIKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 1361661), PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 1361536), RQRRNELKRSF (SEQ ID NO: 1361662), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 1361663)
  • In einem Aspekt der Offenbarung kann ein Prime-Editor mit einem oder mehreren Kernlokalisierungssignalen (NLS) modifiziert werden, vorzugsweise mit mindestens zwei NLSs. In bestimmten Ausführungsformen werden die Prime-Editoren mit zwei oder mehr NLSs modifiziert. Die Offenbarung erwägt die Verwendung jedes zum Zeitpunkt der Offenbarung im Stand der Technik bekannten Kernlokalisierungssignals oder jedes Kernlokalisierungssignals, das nach dem Zeitpunkt der vorliegenden Anmeldung im Stand der Technik identifiziert oder anderweitig verfügbar gemacht wird. Ein repräsentatives Kernlokalisierungssignal ist eine Peptidsequenz, die das Protein zum Kern der Zelle lenkt, in der die Sequenz exprimiert wird. Ein Kernlokalisierungssignal ist überwiegend basisch, kann fast überall in der Aminosäuresequenz eines Proteins positioniert werden, besteht im Allgemeinen aus einer kurzen Sequenz von vier Aminosäuren (Autieri & Agrawal, (1998) J. Biol. Chem. 273: 14731-37, in diese Schrift durch Bezugnahme eingeschlossen) bis acht Aminosäuren und ist typischerweise reich an Lysin- und Argininresten (Magin et al., (2000) Virology 274: 11-16, in diese Schrift durch Bezugnahme eingeschlossen). Kernlokalisierungssignale umfassen oft Prolinreste. Eine Vielzahl von Kernlokalisierungssignalen wurde identifiziert und verwendet, um den Transport biologischer Moleküle vom Zytoplasma zum Zellkern zu bewirken. Siehe z. B. Tinland et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7442-46; Moede et al., (1999) FEBSLett. 461:229-34, durch Bezugnahme aufgenommen. Es wird derzeit angenommen, dass die Translokation Kemporenproteine umfasst.
  • Die meisten NLSs können in drei allgemeine Gruppen eingeteilt werden: (i) ein monopartites NLS, beispielhaft dargestellt durch das SV40-Large-T-Antigen-NLS (PKKKRKV (SEQ ID NO: 1361531)); (ii) ein zweiteiliges Motiv, das aus zwei basischen Domänen besteht, die durch eine variable Anzahl von Spacer-Aminosäuren getrennt sind und durch das Xenopus-Nukleoplasmin-NLS (KRXXXXXXXXXXKKKL (SEQ ID NO: 1361664) veranschaulicht wird); und (iii) nicht-kanonische Sequenzen wie M9 des hnRNP-Al-Proteins, des Influenzavirus-Nukleoproteins-NLS und des Hefe-Gal4-Proteins-NLS (Dingwall und Laskey 1991).
  • Kernlokalisierungssignale erscheinen an verschiedenen Stellen in den Aminosäuresequenzen von Proteinen. NLSs wurden am N-Terminus, am C-Terminus und in der zentralen Region von Proteinen identifiziert. Somit stellt die Offenbarung Prime-Editoren bereit, die mit einem oder mehreren NLSs am C-Terminus, dem N-Terminus sowie in der internen Region des Prime-Editors modifiziert werden können. Die Reste einer längeren Sequenz, die nicht als Komponenten-NLS-Reste fungieren, sollten so ausgewählt werden, dass sie das Kernlokalisierungssignal selbst nicht stören, beispielsweise tonisch oder sterisch. Obwohl der Zusammensetzung einer NLS-umfassenden Sequenz keine strengen Grenzen gesetzt sind, kann eine solche Sequenz daher in der Praxis hinsichtlich ihrer Länge und Zusammensetzung funktionell eingeschränkt sein.
  • Die vorliegende Offenbarung erwägt jedes geeignete Mittel, um einen Prime-Editor so zu modifizieren, dass er ein oder mehrere NLSs enthält. In einem Aspekt können die Prime-Editoren so konstruiert werden, dass sie ein Prime-Editor-Protein exprimieren, das an seinem N-Terminus oder seinem C-Terminus (oder beiden) mit einer oder mehreren NLSs translational fusioniert ist, d. h. um ein Prime-Editor-NLS-Fusionskonstrukt zu bilden. In anderen Ausführungsformen kann die für den Prime-Editor codierende Nukleotidsequenz genetisch modifiziert werden, um einen Leserahmen einzubauen, der eine oder mehrere NLSs in einer internen Region des codierten Prime-Editors codiert. Außerdem können die NLSs verschiedene Aminosäure-Linker oder Spacer-Regionen umfassen, die beispielsweise zwischen dem Prime-Editor und der N-terminal, C-terminal oder intern angehängten NLS-Aminosäuresequenz und in der zentralen Region von Proteinen codiert werden. Somit stellt die vorliegende Offenbarung auch Nukleotidkonstrukte, Vektoren und Wirtszellen zum Exprimieren von Fusionsproteinen bereit, die einen Prime-Editor und ein oder mehrere NLSs umfassen.
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können auch Kernlokalisierungssignale umfassen, die über einen oder mehrere Linker mit einem Prime-Editor verknüpft sind, z. B. ein Polymer-, Aminosäure-, Nukleinsäure-, Polysaccharid-, chemisches oder Nukleinsäure-Linkerelement. Die Linker innerhalb des in Betracht gezogenen Umfangs der Offenbarung sollen keine Beschränkungen aufweisen und können jede geeignete Art von Molekül sein (z. B. Polymer, Aminosäure, Polysaccharid, Nukleinsäure, Lipid oder eine beliebige synthetische chemische Linkerdomäne) und mit den Prime-Editor durch eine beliebige geeignete Strategie verbunden sein, welche die Bildung einer Bindung (z. B. kovalente Bindung, Wasserstoffbrückenbindung) zwischen dem Prime-Editor und dem einen oder den mehreren NLSs bewirkt.
  • (iii) Flap-Endonukleasen (z. B. FEN1)
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die PE-Fusionsproteine eine oder mehrere Flap-Endonukleasen (z. B. FEN1) umfassen, was sich auf ein Enzym bezieht, das die Entfernung von 5'-Einzelstrang-DNA-Flaps katalysiert. Dies sind natürlich vorkommende Enzyme, welche die Entfernung von 5'-Flaps, die während zellulärer Prozesse, einschließlich der DNA-Replikation, gebildet werden, verarbeiten. Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editing-Verfahren können endogen zugeführte Flap-Endonukleasen oder solche verwenden, die in trans bereitgestellt werden, um den 5'-Flap der endogenen DNA zu entfernen, der an der Zielstelle während des Prime Editings gebildet wird. Flap-Endonukleasen sind in der Technik bekannt und werden in Patel et al., „Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends“ , Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 und Tsutakawa et al., „Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily“, Cell, 2011, 145 (2): 198-211, beschrieben (jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen). Eine beispielhafte Flap-Endonuklease ist FEN1, die durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt werden kann:
    Figure DE112020001306T5_0083
  • Die Flap-Endonukleasen können auch jede beliebige FEN1-Variante, -Mutante oder ein anderes Flap-Endonuklease-Ortholog, -Homolog oder -Variante beinhalten. Nicht einschränkende Beispiele sind wie folgt:
    Figure DE112020001306T5_0084
    Figure DE112020001306T5_0085
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift in Betracht gezogenen Prime-Editor-Fusionsproteine auch beliebige Varianten der oben offenbarten Sequenzen umfassen, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch ist. mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit einer der oben angegebenen Prime-Editor-Fusionssequenzen.
  • Andere Endonukleasen, die durch die vorliegenden Verfahren verwendet werden können, um die Entfernung des 5'-Ende-Einzelstrang-DNA-Flaps zu erleichtern, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein: (1) Trex 2, (2) Exol-Endonuklease (z. B. Keijzers et al., Biosci Rep 2015, 35(3): e00206)
    Trex 2
    3'-Drei-Prime-Reparatur-Exonuklease 2 (TREX2) - Mensch
    Zugangsnr. NM_080701
    Figure DE112020001306T5_0086

    3'-Drei-Prime-Reparatur-Exonuklease 2 (TREX2) - Maus
    Zugangsnr. NM_011907
    Figure DE112020001306T5_0087

    3'-Drei-Prime-Reparatur-Exonuklease 2 (TREX2) - Ratte
    Zugangsnr. NM_001107580
    Figure DE112020001306T5_0088
  • ExoI
  • Humane Exonuklease 1 (EXO1) ist an vielen verschiedenen DNA-Stoffwechselprozessen beteiligt, einschließlich DNA-Fehlpaarungs-Reparatur (MMR), mikrovermittelte Endverbindung, homologe Rekombination (HR) und Replikation. Humanes EXO1 gehört zu einer Familie eukaryontischer Nukleasen, Rad2/XPG, die auch FEN1 und GEN1 beinhalten. Die Rad2/XPG-Familie ist in der Nukleasedomäne durch Spezies vom Phagen bis zum Menschen konserviert. Das EXO1-Genprodukt weist sowohl 5'-Exonuklease- als auch 5'-Flap-Aktivität auf. Darüber hinaus enthält EXO1 eine intrinsische 5'-RNase H-Aktivität. Humanes EXO1 hat eine hohe Affinität zur Verarbeitung von doppelsträngiger DNA (dsDNA), Nicks, Lücken, Pseudo-Y-Strukturen und kann Holliday-Junctions mithilfe seiner inhärenten Flap-Aktivität auflösen. Humanes EXO1 ist an MMR beteiligt und enthält konservierte Bindungsdomänen, die direkt mit MLH1 und MSH2 interagieren. Die nukleolytische Aktivität von EXO1 wird positiv durch PCNA, MutSα (MSH2/MSH6 Komplex), 14-3-3, MRN und 9-1-1-Komplex stimuliert.
  • Exonuklease 1 (EXO1) Zugangsnr. NM 003686 (Homo sapiens Exonuklease 1 (EXO1), Transkriptvariante 3) - Isoform A
    Figure DE112020001306T5_0089
    Figure DE112020001306T5_0090
  • Exonuklease 1 (EXO1) Zugangsnummer NM_006027 (Homo sapiens Exonuklease 1 (EXO1), Transkriptvariante 3) - Isoform B
    Figure DE112020001306T5_0091
  • Exonuklease 1 (EXO1) Zugangsnummer NM_001319224 (Homo sapiens Exonuklease 1 (EXO1), Transkriptvariante 4) - Isoform C
    Figure DE112020001306T5_0092
  • (iv)Inteine und getrennte Inteine
  • Es versteht sich, dass es in einigen Ausführungsformen (z. B. Zuführung eines Prime-Editors in vivo unter Verwendung von AAV-Partikeln) vorteilhaft sein kann, ein Polypeptid (z. B. eine Desaminase oder ein napDNAbp) oder ein Fusionsprotein (z. B. einen Prime-Editor) in eine N-terminale Hälfte und eine C-terminale Hälfte zu trennen, sie zuzuführen und es dann ihrer Kolokalisierung zu ermöglichen, das vollständige Protein (oder gegebenenfalls das Fusionsprotein) innerhalb der Zelle neu zu bilden. Separate Hälften eines Proteins oder Fusionsproteins können jeweils einen getrenntes-Intein-Tag umfassen, um die Neubildung des vollständigen Proteins oder Fusionsproteins durch den Mechanismus des Protein-Trans-Spleißens zu erleichtern.
  • Protein-Trans-Spleißen, katalysiert durch getrennte Inteine, bietet eine vollständig enzymatische Methode zur Proteinligation. Ein getrenntes Intein ist im Wesentlichen ein zusammenhängendes Intein (z. B. ein Mini-Intein), das in zwei Teile namens N-Intein bzw. C-Intein getrennt ist. Das N-Intein und C-Intein eines getrennten Inteins können sich nicht-kovalent zu einem aktiven Intein assoziieren und die Spleißreaktion im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie ein zusammenhängendes Intein katalysieren. Getrennten Inteine kommen in der Natur vor und werden auch in Laboren hergestellt. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „getrenntes Intein“ jedes Intein, in dem ein oder mehrere Peptidbindungsbrüche zwischen den N-terminalen und C-terminalen Aminosäuresequenzen vorhanden sind, sodass die N-terminalen und C-terminalen Sequenzen zu separaten Molekülen werden, die nicht-kovalent zu einem Intein reassoziieren oder rekonstituieren, das für Trans-Spleißreaktionen funktionell ist. Jedes katalytisch aktive Intein oder Fragment davon kann verwendet werden, um ein getrenntes Intein zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung abzuleiten. Beispielsweise kann das getrennte Intein einem Aspekt von einem eukaryontischen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das getrennte Intein von einem bakteriellen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das getrennte Intein von einem archaealen Intein abgeleitet sein. Vorzugsweise besitzt das so abgeleitete getrennte Intein nur die Aminosäuresequenzen, die für die Katalyse von Trans-Spleißreaktionen essentiell sind.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet das „N-terminale getrennte Intein (In)“ jede Inteinsequenz, die eine N-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Spleißreaktionen funktionell ist. Ein umfasst somit auch eine Sequenz, die beim Trans-Spleißen ausgespleißt wird. Ein kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des N-terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Inteinsequenz ist. Zum Beispiel kann ein zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange solche zusätzlichen und/oder mutierte Reste das In beim Trans-Spleißen nicht funktionsunfähig machen. Vorzugsweise verbessert oder verstärkt die Einbeziehung der zusätzlichen und/oder mutierte Reste die Trans-Spleißaktivität des In.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet das „C-terminale getrennte Intein (Ic)“ jede Inteinsequenz, die eine C-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Spleißreaktionen funktionell ist. In einem Aspekt umfasst das Ic 4 bis 7 zusammenhängende Aminosäurereste, von denen mindestens 4 Aminosäuren vom letzten β-Strang des Inteins stammen, von dem es abgeleitet wurde. Ein Ic umfasst somit ebenfalls eine Sequenz, die beim Trans-Spleißen ausgespleißt wird. Ein Ic kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des C-terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Inteinsequenz ist. Zum Beispiel kann ein Ic zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange solche zusätzlichen und/oder mutierte Reste das In beim Trans-Spleißen nicht funktionsunfähig machen. Vorzugsweise verbessert oder verstärkt die Einbeziehung der zusätzlichen und/oder mutierte Reste die Trans-Spleißaktivität des Ic.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann ein Peptid, das an ein Ic oder ein gebunden ist, eine zusätzliche chemische Einheit umfassen, einschließlich unter anderem Fluoreszenzgruppen, Biotin, Polyethylenglycol (PEG), Aminosäureanaloga, nichtnatürliche Aminosäuren, Phosphatgruppen, Glycosylgruppen, Radioisotopenmarkierungen und pharmazeutische Moleküle. In anderen Ausführungsformen kann ein mit einem Ic verknüpftes Peptid eine oder mehrere chemisch reaktive Gruppen umfassen, einschließlich unter anderem Keton, Aldehyd, Cys-Reste und Lys-Reste. Das N-Intein und C-Intein eines getrennten Inteins können nicht-kovalent assoziieren, um ein aktives Intein zu bilden und die Spleißreaktion zu katalysieren, wenn ein „Intein-spleißendes Polypeptid (ISP)“ vorhanden ist. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet ein „Intein-spleißendes Polypeptid (ISP)“ den Abschnitt der Aminosäuresequenz eines getrennten Inteins, der verbleibt, wenn das Ic, In oder beide aus dem getrennten Intein entfernt werden. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das In das ISP. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Ic das ISP. In noch einer anderen Ausführungsform ist das ISP ein separates Peptid, das weder an In noch an Ic kovalent gebunden ist.
  • Getrennte Inteine können aus zusammenhängenden Inteinen erzeugt werden, indem eine oder mehrere Trennstellen in der unstrukturierten Schleife oder eine dazwischenliegende Aminosäuresequenz zwischen den -12 konservierten Beta-Strängen, die in der Struktur von Mini-Inteins gefunden werden, konstruiert werden. Eine gewisse Flexibilität bei der Position der Trennstelle innerhalb der Regionen zwischen den Beta-Strängen kann bestehen, vorausgesetzt, dass die Bildung der Trennung die Struktur des Inteins, insbesondere der strukturierten Beta-Stränge, nicht in einem Maße stört, das ausreicht, die Proteinspleißaktivität zu verlieren.
  • Beim Protein-Trans-Spleißen besteht ein Vorläuferprotein aus einem N-Extein-Anteil gefolgt vom N-Intein, ein anderes Vorläuferprotein besteht aus dem C-Intein gefolgt von einem C-Extein-Anteil, und eine Trans-Spleißreaktion (katalysiert durch die N- und C-Inteine zusammen) schneidet die beiden Inteinsequenzen aus und verknüpft die beiden Exteinsequenzen mit einer Peptidbindung. Protein-Trans-Spleißen als enzymatische Reaktion kann mit sehr geringen (z. B. mikromolaren) Proteinkonzentrationen arbeiten und unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden.
  • Beispielhafte Sequenzen sind wie folgt:
    • NAME SEQUENZ VON LIGANDABHÄNGIGEM INTEIN
    • 2-4 INTEIN:
      Figure DE112020001306T5_0093
    • 3-2 INTEIN
      Figure DE112020001306T5_0094
    • 30R3-1 INTEIN
      Figure DE112020001306T5_0095
    • 30R3-2 INTEIN
      Figure DE112020001306T5_0096
      Figure DE112020001306T5_0097
    • 30R3-3 INTEIN
      Figure DE112020001306T5_0098
    • 37R3-1 INTEIN
      Figure DE112020001306T5_0099
    • 37R3-2 INTEIN
      Figure DE112020001306T5_0100
    • 37R3-3 INTEIN
      Figure DE112020001306T5_0101
  • Obwohl Inteine am häufigsten als zusammenhängende Domäne vorkommen, existieren einige in einer natürlich gespaltenen Form. In diesem Fall werden die beiden Fragmente als separate Polypeptide exprimiert und müssen vor dem Spleißen, dem sogenannten Protein-Trans-Spleißen, assoziieren.
  • Ein beispielhaftes getrenntes Intein ist das Ssp-DnaE-Intein, das zwei Untereinheiten umfasst, nämlich DnaE-N und DnaE-C. Die beiden verschiedenen Untereinheiten werden von separaten Genen codiert, nämlich dnaE-n und dnaE-c, welche die DnaE-N- bzw. DnaE-C-Untereinheiten codieren. DnaE ist ein natürlich vorkommendes getrenntes Intein Synechocytis sp. PCC6803 und ist in der Lage, das Trans-Spleißen von zwei separaten Proteinen zu steuern, die jeweils eine Fusion mit entweder DnaE-N oder DnaE-C umfassen.
  • Zusätzliche natürlich vorkommende oder manipulierte getrenntes-Intein-Sequenzen sind in den in dieser Schrift beschriebenen Ganzinteinsequenzen bekannt oder können aus den in dieser Schrift beschriebenen oder auf dem Fachgebiet verfügbaren Sequenzen hergestellt werden. Beispiele für getrenntes-Intein-Sequenzen finden sich in Stevens et al., „A promiscuous split intein with extended protein engineering applications“, PNAS, 2017, Vol. 114: 8538-8543; Iwai et al., „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme“, FEBS Lett, 580: 1853-1858, die jeweils in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind. Weitere getrennte Inteinsequenzen finden sich beispielsweise in WO 2013/045632 , WO 2014/055782 , WO 2016/069774 , und EP2877490 , deren Inhalte jeweils in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Darüber hinaus wurde das Spleißen von Proteinen in trans in vivo und in vitro beschrieben (Shingledecker et al., Gene 207:187 (1998), Southworth et al., EMBO J. 17:918 (1998); Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans et al., J. Biol. Chem.-Nr. 275:9091 (2000); Otomo et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)) und bietet die Möglichkeit, ein Protein hinsichtlich zweier inaktiver Fragmente zu exprimieren, die anschließend einer Ligation unterzogen werden, um ein funktionelles Produkt zu bilden, z. B. wie in 66 und 67 hinsichtlich der Bildung eines vollständigen PE-Fusionsproteins aus zwei getrennt exprimierten Hälften gezeigt.
  • (v) RNA-Protein-Rekrutierungssystem
  • In verschiedenen Ausführungsformen können zwei separate Proteindomänen (z. B. eine Cas9-Domäne und eine Polymerasedomäne) miteinander kolokalisiert werden, um einen funktionellen Komplex (ähnlich der Funktion eines Fusionsproteins, das die zwei separaten Proteindomänen umfasst) zu bilden, indem ein „RNA-Protein-Rekrutierungssystem“ verwendet wird, wie eetwa die „MS2-Tagging-Technik“. Solche Systeme markieren im Allgemeinen eine Proteindomäne mit einer „RNA-Protein-Interaktionsdomäne“ (auch bekannt als „RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne“) und die andere mit einem „RNA-bindenden Protein“, das spezifisch die RNA-Protein-Interaktionsdomäne, z. B. eine spezifische Haarnadelstruktur, erkennt und daran bindet. Diese Arten von Systemen können genutzt werden, um die Domänen eines Prime-Editors zu kolokalisieren, sowie um zusätzliche Funktionen für einen Prime-Editor, wie etwa eine UGI-Domäne, zu rekrutieren. In einem Beispiel basiert die MS2-Tagging-Technik auf der natürlichen Interaktion des MS2-Bakteriophagen-Hüllproteins („MCP“ oder „MS2cp“) mit einer im Genom des Phagen vorhandenen Stammschleifen- oder Haarnadelstruktur, d. h. der „MS2- Haarnadel“. Im Fall der MS2-Haarnadel wird sie vom MS2-Bakteriophagen-Hüllprotein (MCP) erkannt und gebunden. Somit kann in einem beispielhaften Szenario eine Desaminase-MS2-Fusion eine Cas9-MCP-Fusion rekrutieren.
  • Ein Überblick über andere modulare RNA-Protein-Interaktionsdomänen ist im Stand der Technik beispielsweise in Johansson et al., „RNA recognition by the MS2 phage coat protein“, Sem Virol. 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al., „Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies“, Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al., „Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering“, Nat. Biotechnol., 2013, Vol. 31: 833-838; und Zalatan et al., „Engineering Complex Synthetic Transcriptional Programs with CRISPR RNA Scaffolds“, Cell, 2015, Vol. 160: 339-350, beschrieben, die jeweils durch Bezugnahme vollumfänglich in diese Schrift aufgenommen sind. Andere Systeme beinhalten die PP7-Haarnadel, die spezifisch das PCP-Protein rekrutiert, und die „com“-Haarnadel, die spezifisch das Com-Protein rekrutiert. Siehe Zalatan et al.
  • Die Nukleotidsequenz der MS2-Haarnadel (oder äquivalent als das „MS2-Aptamer“ bezeichnet) ist: GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC (SEQ ID NOs: 1361679).
  • Die Aminosäuresequenz des MCP oder MS2cp ist:
    Figure DE112020001306T5_0102
  • (vi) UGI-Domäne
  • In anderen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren eine oder mehrere Uracil-Glycosylase-Inhibitor-Domänen umfassen. Der Begriff „Uracil-Glycosylase-Inhibitor (UGI)“ oder „UGI-Domäne“, wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet ein Protein, das in der Lage ist, ein Uracil-DNA-Glycosylase-Basenexzision-Reparaturenzym zu hemmen. In einigen Ausführungsformen umfasst eine UGI-Domäne einen Wildtyp-UGI oder einen UGI, wie in SEQ ID NOs: 1361681 dargelegt. In einigen Ausführungsformen beinhalten die in dieser Schrift bereitgestellten UGI-Proteine Fragmente von UGI und Proteine, die zu einem UGI oder einem UGI-Fragment homolog sind. Beispielsweise umfasst in einigen Ausführungsformen eine UGI-Domäne ein Fragment der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NOs: 1361681 dargelegt ist. In einigen Ausführungsformen umfasst ein UGI-Fragment eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75%, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, oder mindestens 99,5 % der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NOs: 1361681 dargelegt, umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst ein UGI eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NOs: 1361681 dargelegten Aminosäuresequenz homolog ist, oder eine Aminosäuresequenz, die zu einem Fragment der in SEQ ID NOs: 1361681 dargelegten Aminosäuresequenz homolog ist. In einigen Ausführungsformen werden Proteine, die UGI oder Fragmente von UGI oder Homologe von UGI oder UGI-Fragmenten umfassen, als „UGI-Varianten“ bezeichnet. Eine UGI-Variante teilt Homologie mit UGI oder einem Fragment davon. Zum Beispiel ist eine UGI-Variante zu mindestens 70 % identisch, mindestens 75 % identisch, mindestens 80 % identisch, mindestens 85 % identisch, mindestens 90 % identisch, mindestens 95 % identisch, mindestens 96 % identisch, mindestens 97 % identisch, mindestens 98 % identisch, mindestens 99 % identisch, mindestens 99,5 % identisch oder mindestens 99,9 % identisch mit einem Wildtyp-UGI oder einem UGI, wie in SEQ ID NOs: 1361681 dargelegt. In einigen Ausführungsformen umfasst die UGI-Variante ein Fragment von UGI, so dass das Fragment mindestens 70 % identisch, mindestens 80 % identisch, mindestens 90 % identisch, mindestens 95 % identisch, mindestens 96 % identisch, mindestens ist 97% identisch, mindestens 98% identisch, mindestens 99% identisch, mindestens 99,5 % identisch oder mindestens 99,9% mit dem entsprechenden Fragment von Wildtyp-UGI oder einem UGI, wie in SEQ ID NOs: 1361681 dargelegt. In einigen Ausführungsformen umfasst der UGI die folgende Aminosäuresequenz:
    • Uracil-DNA-Glykosylase-Inhibitor:
    • >sp|P14739|UNGI_BPPB2
      Figure DE112020001306T5_0103
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren können mehr als eine UGI-Domäne umfassen, die durch einen oder mehrere Linker, wie in dieser Schrift beschrieben, getrennt sein kann.
  • (vii) Zusätzliche PE-Elemente
  • In bestimmten Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren einen Inhibitor der Basenreparatur umfassen. Der Begriff „Inhibitor der Basenreparatur“ oder „IBR“ bezeichnet ein Protein, das in der Lage ist, die Aktivität eines Nukleinsäure-Reparaturenzyms zu hemmen, beispielsweise eines Basenexzisions-Reparaturenzyms. In einigen Ausführungsformen ist der IBR einhibitor der OGG-Basenexzisionsreparatur. In einigen Ausführungsformen ist der IBR einhibitor der Basenexzisionsreparatur („iBER“). Beispielhafte Inhibitoren der Basenexzisionsreparatur beinhalten Inhibitoren von APE1, Endo III, Endo IV, Endo V, Endo VIII, Fpg, hOGG1, hNEIL1, T7 Endol, T4PDG, UDG, hSMUG1 und hAAG. In einigen Ausführungsformen ist der IBR einhibitor von Endo V oder hAAG. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein iBER, der eine katalytisch inaktive Glykosylase oder eine katalytisch inaktive Dioxygenase oder ein kleines Molekül oder ein Peptid-Inhibitor einer Oxidase oder Varianten davon sein kann. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein iBER, der ein TDG-Inhibitor, MBD4-Inhibitor oder einhibitor eines AlkBH-Enzyms sein kann. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein iBER, der ein katalytisch inaktives TDG oder katalytisch inaktives MBD4 umfasst. Ein beispielhaftes katalytisch inaktives TDG ist eine N140A-Mutante aus SEQ ID NOs: 3872 (menschliches TDG).
  • Einige beispielhafte Glykosylasen werden nachstehend bereitgestellt. Die katalytisch inaktivierten Varianten jeder dieser Glycosylasedomänen sind iBERs, die an die napDNAbp- oder Polymerasedomäne der in dieser Offenbarung bereitgestellten Prime-Editoren fusioniert werden können.
    • OGG (menschlich)
      Figure DE112020001306T5_0104
    • MPG (menschlich)
      Figure DE112020001306T5_0105
    • MBD4 (menschlich)
      Figure DE112020001306T5_0106
      Figure DE112020001306T5_0107
    • TDG (menschlich)
      Figure DE112020001306T5_0108
  • In einigen Ausführungsformen können die in dieser Schrift beschriebenen Fusionsproteine eine oder mehrere heterologe Proteindomänen umfassen (z. B. etwa oder mehr als etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Domänen zusätzlich zu den Komponenten des Prime-Editors). Ein Fusionsprotein kann eine beliebige zusätzliche Proteinsequenz und gegebenenfalls eine Linkersequenz zwischen zwei beliebigen Domänen umfassen. Andere beispielhafte Merkmale, die vorhanden sein können, sind Lokalisierungssequenzen, wie etwa zytoplasmatische Lokalisierungssequenzen, Exportsequenzen, wie etwa Kernexportsequenzen oder andere Lokalisierungssequenzen, sowie Sequenzmarkierungen, die für die Solubilisierung, Reinigung oder den Nachweis der Fusionsproteine nützlich sind.
  • Beispiele für Proteindomänen, die mit einem Prime-Editor oder einer Komponente davon (z. B. der napDNAbp-Domäne, der Polymerase-Domäne oder der NLS-Domäne) fusioniert werden können, beinhalten ohne Einschränkung Epitop-Tags und Reportergensequenzen. Nicht einschränkende Beispiele von Epitop-Tags beinhalten Histidin(His)-Tags, V5-Tags, FLAG-Tags, Influenza-Hämagglutinin (HA)-Tags, Myc-Tags, VSV-G-Tags und Thioredoxin (Trx)-Tags. Beispiele für Reportergene beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Glutathion-5-Transferase (GST), Meerrettichperoxidase (HRP), Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Beta-Galactosidase, Beta-Glucuronidase, Luciferase, grünfluoreszierendes Protein (GFP), HcRed, DsRed, cyanfluoreszierendes Protein (CFP), gelbfluoreszierendes Protein (YFP) und autofluoreszierende Proteine einschließlich blaufluoreszierendes Protein (BFP). Ein Prime-Editor kann mit einer Gensequenz fusioniert werden, die ein Protein oder ein Fragment eines Proteins codiert, das DNA-Moleküle bindet oder andere zelluläre Moleküle bindet, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Maltose-bindendes Protein (MBP), S-Tag, Lex A DNA Bindungsdomänen-(DBD)-Fusionen, GAL4-DNA-Bindungsdomänen-Fusionen und HerpesSimplex-Virus-(HSV)-BP16-Proteinfusionen. Zusätzliche Domänen, die Teil eines Prime-Editors sein können, sind in der US-Patentveröffentlichung Nr. 2011/0059502 , veröffentlicht am 10. März 2011 und in diese Schrift durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen.
  • In einem Aspekt der Offenbarung kann ein Reportergen, das Glutathion-5-Transferase (GST), Meerrettichperoxidase (HRP), Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) beta-Galactosidase, beta-Glucuronidase, Luciferase, grünfluoreszierendes Protein (GFP), HcRed, DsRed, cyanfluoreszierendes Protein (CFP), gelbfluoreszierendes Protein (YFP) und autofluoreszierende Proteine, einschließlich blaufluoreszierendes Protein (BFP), beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, in eine Zelle eingeführt werden, um ein Genprodukt zu codieren, das als Marker dient, mit dem die Änderung oder Modifikation der Expression des Genprodukts gemessen wird. In bestimmten Ausführungsformen der Offenbarung ist das Genprodukt Luciferase. In einer weiteren Ausführungsform der Offenbarung wird die Expression des Genprodukts verringert.
  • Geeignete in dieser Schrift bereitgestellte Protein-Tags beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotin-Carboxylase-Trägerprotein (BCCP)-Tags, myc-Tags, Calmodulin-Tags, FLAG-Tags, Hämagglutinin (HA)-Tags, Polyhistidin-Tags, auch als Histidin-Tags oder His-Tags bezeichnet, Maltose-bindendes Protein (MBP)-Tags, Nus-Tags, Glutathion-S-Transferase (GST)-Tags, grünfluoreszierende Protein(GFP)-Tags, Thioredoxin-Tags, S-Tags, Softags (z. B. Softag 1, Softag 3), Strep-Tags, Biotin-Ligase-Tags, FlAsH-Tags, V5-Tags und SBP-Tags. Weitere geeignete Sequenzen werden dem Fachmann offensichtlich sein. In einigen Ausführungsformen umfasst das Fusionsprotein ein oder mehrere His-Tags.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung kann die Aktivität des Prime-Editing-Systems durch Anpassen der Verweilzeit, der Menge und/oder der Aktivität der exprimierten Komponenten des PE-Systems zeitlich reguliert werden. Beispielsweise kann, wie in dieser Schrift beschrieben, das PE mit einer Proteindomäne fusioniert sein, welche die intrazelluläre Halbwertszeit des PE modifizieren kann. In bestimmten Ausführungsformen, die zwei oder mehr Vektoren beinhalten (z. B. ein Vektorsystem, in dem die in dieser Schrift beschriebenen Komponenten auf zwei oder mehr separaten Vektoren codiert sind) kann die Aktivität des PE-Systems durch Steuern des Timings, mit dem die Vektoren zugeführt werden, zeitlich reguliert werden. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen ein Vektor, der das Nukleasesystem codiert, das PE vor dem Vektor, der die Matrize codiert, zuführen. In anderen Ausführungsformen kann der die PEgRNA codierende Vektor den Leiter vor dem das PE-System codierenden Vektor zuführen. In einigen Ausführungsformen werden die Vektoren, die das PE-System codieren, und die PEgRNA gleichzeitig zugeführt. In bestimmten Ausführungsformen führen die gleichzeitig zugeführten Vektoren zeitlich z. B. das PE, die PEgRNA und/oder Zweitstrang-Leit-RNA-Komponenten zu. In weiteren Ausführungsformen kann die von der codierenden Sequenz auf den Vektoren transkribierte RNA (wie etwa das Nuklease-Transkript) ferner mindestens ein Element umfassen, das in der Lage ist, die intrazelluläre Halbwertszeit der RNA zu modifizieren und/oder die Translationssteuerung zu modulieren. In einigen Ausführungsformen kann die Halbwertszeit der RNA erhöht werden. In einigen Ausführungsformen kann die Halbwertszeit der RNA gesenkt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Element in der Lage sein, die Stabilität der RNA zu erhöhen. In einigen Ausführungsformen kann das Element in der Lage sein, die Stabilität der RNA zu senken. In einigen Ausführungsformen kann sich das Element innerhalb der 3'-UTR der RNA befinden. In einigen Ausführungsformen kann das Element ein Polyadenylierungssignal (PA) beinhalten. In einigen Ausführungsformen kann das Element eine Obergrenze umfassen, z. B. ein stromaufwärts gelegenes mRNA- oder PEgRNA-Ende. In einigen Ausführungsformen kann die RNA kein PA umfassen, sodass sie nach der Transkription einem schnelleren Abbau in der Zelle unterliegt. In einigen Ausführungsformen kann das Element mindestens ein AU-reiches Element beinhalten (ARE). Die AREs können durch ARE-Bindungsproteine (ARE-BPs) auf eine Weise gebunden werden, die vom Gewebetyp, Zelltyp, Zeitpunkt, zellulärer Lokalisation und Umgebung abhängt. In einigen Ausführungsformen kann das destabilisierende Element den RNA-Zerfall fördern, die RNA-Stabilität beeinflussen oder die Translation aktivieren. In einigen Ausführungsformen kann das ARE eine Länge von 50 bis 150 Nukleotiden aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann das ARE mindestens eine Kopie der Sequenz AUUUA umfassen. In einigen Ausführungsformen kann mindestens ein ARE der 3'-UTR der RNA hinzugefügt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Element ein Waldmurmeltier-Hepatitisvirus (WHP) sein.
  • Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE), das eine Tertiärstruktur erzeugt, um die Expression aus dem Transkript zu verstärken. In weiteren Ausführungsformen ist das Element eine modifizierte und/oder verkürzte WPRE-Sequenz, welche die Expression aus dem Transkript verstärken kann, wie beispielsweise in Zufferey et al., J. Virol, 73(4): 2886-92 (1999) und Flajolet et al., J. Virol, 72(7): 6175-80 (1998) beschrieben. In einigen Ausführungsformen kann das WPRE oder ein Äquivalent zur 3'-UTR der RNA hinzugefügt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Element aus anderen RNA-Sequenzmotiven ausgewählt sein, die entweder in schnell oder langsam zerfallenden Transkripten angereichert sind.
  • In einigen Ausführungsformen kann der Vektor, der den PE oder die PEgRNA codiert, durch Spaltung einer auf dem Vektor vorhandenen Zielsequenz durch das PE-System selbstzerstört werden. Die Spaltung kann die fortgesetzte Transkription eines PE oder einer PEgRNA aus dem Vektor verhindern. Obwohl die Transkription auf dem linearisierten Vektor eine gewisse Zeit lang stattfinden kann, haben die exprimierten Transkripte oder Proteine, die einem intrazellulären Abbau unterliegen, weniger Zeit, um Off-Target-Effekte zu erzeugen, ohne dass die Expression der codierenden Vektoren kontinuierlich zugeführt wird.
  • F. PE-Komplexe
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die in dieser Schrift offenbarten Prime-Editor-Fusionsproteine mit einer in dieser Schrift offenbarten PEgRNA komplexiert werden. Somit werden in dieser Schrift weiterhin Komplexe bereitgestellt, umfassend (i) eines der in dieser Schrift bereitgestellten PE-Fusionsproteine und (ii) eine PEgRNA (z. B. eine therapeutische PEgRNA des Sequenzprotokolls), die an napDNAbp (z. B. Cas9-Domäne) des PE-Fusionsprotein gebunden ist. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, können die PE-Fusionsproteine auf programmierbare Weise an eine gewünschte Zielstelle gerichtet werden, indem eine geeignete PEgRNA entworfen wird, um das PE-Fusionsprotein spezifisch und effizient an eine gewünschte genomische Zielstelle zu lenken, um die gewünschte Mutation oder anderweitige genetische Modifikation anzubringen. In einigen Fällen kann jedoch die Eignung einer Zielstelle für Prime Editing vom Vorhandensein eines geeignet positionierten PAM abhängen. Die breitere PAM-Kompatibilität der in dieser Schrift bereitgestellten Cas9-Domänen hat das Potenzial, den Targeting-Umfang von Baseneditoren auf diejenigen Zielstellen zu erweitern, die nicht innerhalb von etwa 15 Nukleotiden einer kanonischen 5'-NGG-3'-PAM-Sequenz liegen. Ein Durchschnittsfachmann wird in der Lage sein, basierend auf dieser Offenbarung und Kenntnissen auf dem Gebiet eine geeignete PEgRNA-Sequenz zu entwerfen, um auf eine gewünschte genomische Sequenz abzuzielen.
  • In einigen Ausführungsformen ist PE1 mit einer PEgRNA komplexiert und weist die folgende Zusammensetzung auf: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(wt)]. Die Struktur wird wie folgt dargestellt:
    Figure DE112020001306T5_0109
    Figure DE112020001306T5_0110
  • In einigen Ausführungsformen wird PE2 mit einer PEgRNA komplexiert. Dieser Komplex kann als „PE3“ bezeichnet werden und weist die folgende Struktur auf: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + PEgRNA. PE3 weist die folgende Struktur auf:
    Figure DE112020001306T5_0111
    Figure DE112020001306T5_0112
  • In einigen Ausführungsformen ist die PEgRNA etwa 15-100 Nukleotide lang und umfasst eine Sequenz von mindestens 10 zusammenhängenden Nukleotiden, die zu einer Zielsequenz komplementär ist. In einigen Ausführungsformen ist die Leit-RNA 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen umfasst die Leit-RNA eine Sequenz von 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 zusammenhängenden Nukleotide, die zu einer Zielsequenz komplementär sind. In einigen Ausführungsformen ist die Zielsequenz eine DNA-Sequenz. In einigen Ausführungsformen befindet sich die Zielsequenz im Genom eines Organismus. In einigen Ausführungsformen ist der Organismus ein Prokaryont. In einigen Ausführungsformen ist der Prokaryont ein Bakterium. In einigen Ausführungsformen ist das Bakterium E. coli. In einigen Ausführungsformen ist der Organismus ein Eukaryot. In einigen Ausführungsformen ist der Organismus eine Pflanze oder ein Pilz. In einigen Ausführungsformen ist der Organismus ein Wirbeltier. In einigen Ausführungsformen ist das Wirbeltier ein Säugetier. In einigen Ausführungsformen ist das Säugetier ein Mensch. In einigen Ausführungsformen ist der Organismus eine Zelle. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle eine menschliche Zelle. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle eine HEK293T- oder U20S-Zelle.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Zielsequenz eine Sequenz, die mit einer Krankheit oder Erkrankung assoziiert ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zielsequenz eine Punktmutation, die mit einer Krankheit oder Erkrankung assoziiert ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zielsequenz eine T→C-Punktmutation. In einigen Ausführungsformen desaminiert der Komplex die Ziel-C-Punktmutation, wobei die Desaminierung zu einer Sequenz führt, die nicht mit einer Krankheit oder Erkrankung assoziiert ist. In einigen Ausführungsformen ist die Ziel-C-Punktmutation in dem DNA-Strang vorhanden, der nicht komplementär zur Leit-RNA ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zielsequenz eine T→A-Punktmutation. In einigen Ausführungsformen desaminiert der Komplex die Ziel-A-Punktmutation, wobei die Desaminierung zu einer Sequenz führt, die nicht mit einer Krankheit oder Erkrankung assoziiert ist. In einigen Ausführungsformen ist die Ziel-A-Punktmutation in dem DNA-Strang vorhanden, der nicht komplementär zur Leit-RNA ist.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst der PE-Komplex ferner eine Leit-RNA zum Durchführen von Zweitstrang-Nicking, was sich auf die Einführung eines zweiten Nicks an einer Stelle stromabwärts des ersten Nicks auf dem nicht-editierten Strang bezieht (d. hfreies 3'-Ende zur Verwendung beim Priming der reversen Transkriptase auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA). In einigen Ausführungsformen befinden sich der erste Nick und der zweite Nick auf gegenüberliegenden Strängen. In anderen Ausführungsformen befinden sich der erste Nick und der zweite Nick auf gegenüberliegenden Strängen. In noch einer anderen Ausführungsform befindet sich der erste Nick auf dem Nicht-Zielstrang (d. h. dem Strang, der den Einzelstrangabschnitt der R-Schleife bildet), und der zweite Nick befindet sich auf dem Zielstrang. Der zweite Nick ist mindestens 5 Nukleotide stromabwärts des ersten Nicks positioniert, oder mindestens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 oder mehr Nukleotide stromabwärts des ersten Nicks. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, induziert der zweite Nick die endogenen DNA-Reparatur- und -Replikationsprozesse der Zelle zum Ersatz des nicht-editierten Strangs, anstatt den gewünschten editierten Strang zu ersetzen. In einigen Ausführungsformen ist der editierte Strang der Nicht-Zielstrang und der nicht-editierte Strang ist der Zielstrang. In anderen Ausführungsformen ist der editierte Strang der Zielstrang und der nicht-editierte Strang ist der Nicht-Zielstang.
  • Der Zweitstrang-Nick kann unter Verwendung einer zweiten Leit-RNA angebracht werden, die mit dem PE-Fusionsprotein an einer zweiten, aber nahegelegenen Protospacer-Sequenz komplexiert und einen Nick anbringt.
  • In einigen Ausführungsformen kann das Einfügen des zweiten Strangnicks nach der Anbringung der gewünschten Editierung erfolgen. Dieses Konzept bezeichnet „temporales Zweitstrang-Nicking“. Damit werden gleichzeitige Nicks auf beiden Strängen vermieden, die zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen könnten. Das zeitliche Nicking des zweiten Strangs könnte auf verschiedene Weise eingeführt werden, einschließlich der Einführung der zweiten Leit-RNA, nachdem die gewünschte Editierung vorgenommen wurde.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Offenbarung den „PE3b“ -Komplex bereit, der sich auf den PE3-Komplex plus die Leit-RNA für das Nicking des zweiten Strangs bezieht. Dieser Komplex weist die folgende Struktur auf: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + PEgRNA + Zweitstrang-Nicking-Leit-RNA. PE3b weist die folgende Struktur auf:
    Figure DE112020001306T5_0113
  • Die PE-Komplexe können den Zellen als intakte Fusionskomplexe zugeführt werden. Die PE-Komplexe können den Zellen auch unter Verwendung eines oder mehrerer Expressionsvektoren (z. B. Lentivirus-Vektoren oder Adeno-assoziierten Virus-Vektoren) zugeführt werden. Zum Beispiel könnte die Zuführung des gewünschten PE-Komplexes einen einzigen Expressionsvektor umfassen, der das PE-Fusionsprotein und die PEgRNA und die optionale Zweitstrang-Leit-RNA von demselben oder unterschiedlichen Promotoren codiert. In einem anderen Beispiel könnte die Zuführung des gewünschten PE-Komplexes zwei oder mehr Expressionsvektoren umfassen, die das PE-Fusionsprotein codieren, einen ersten Expressionsvektor und die PEgRNA und/oder die optionale Zweitstrang-Leit-RNA aus einem zweiten Expressionsvektor.
  • Die PEgRNA, die als Teil dieses Komplexes beinhaltet sein kann, beinhaltet jede der therapeutischen PEgRNAs ein, die in dem Sequenzprotokoll beinhaltet sind, z B. die gesamten PEgRNA-Sequenzen aus SEQ ID NOs: 1-135514 oder 813085-880462.
  • IV. PE-Verfahren und Behandlungen
  • In einem anderen Aspekt stellt die Patentschrift Verfahren zum Editieren einer Ziel-DNA-Sequenz mit einem „Prime-Editor“ bereit. Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „Prime Editing“ einen neuen Ansatz zur Gen-Editierung unter Verwendung von napDNAbps, Polymerasen und spezialisierten Leit-RNAs, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben und in den Ausführungsformen von 1A-1H beispielhaft dargestellt. Prime Editing kann auch als „Target-primed Reverse Transcription“ (TPRT) beschrieben werden, da das Ziel-DNA-Molekül dazu verwendet wird, die Synthese eines DNA-Strangs durch eine Polymerase (z. B. reverse Transcriptase) zu primen. Die Verwendung des Begriffs „reverse Transkription“ im Namen „Target-primed Reverse Transcription“ soll das Prime Editing nicht auf die Verwendung von reversen Transkriptasen beschränken, vielmehr können TPRT oder Prime-Editoren jede beliebige Polymerase umfassen (z. B. DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase). In verschiedenen Ausführungsformen funktioniert das Prime Editing durch Kontaktieren eines Ziel-DNA-Moleküls (für das eine Änderung in der Nukleotidsequenz eingeführt werden soll) mit einem Nukleinsäure-programmierbaren DNA-Bindungsprotein (napDNAbp), das mit einer Prime-Editor-Leit-RNA komplexiert ist. Unter Bezugnahme auf 1E umfasst die Prime-Editor-Leit-RNA eine Verlängerung am 3'- oder 5'-Ende der Leit-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA und codiert die gewünschte Nukleotidänderung (z. B. einzelne Nukleotidänderung, Insertion oder Deletion). In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/verlängerte gRNA-Komplex das DNA-Molekül, und die verlängerte gRNA leitet den napDNAbp, um an einen Ziellocus zu binden. In Schritt (b) wird ein Nick in einen der DNA-Stränge der Zielstelle eingeführt (z. B. durch eine Nuklease oder ein chemisches Mittel), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge der Zielstelle erzeugt wird. In einigen Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Schleifenstrang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht an die Leit-RNA-Sequenz hybridisiert ist, d. h. dem „Nichtzielstrang“. Der Nick könnte jedoch in jeden der Stränge eingeführt werden. Das heißt, der Nick könnte in den R-Schleifen-„Zielstrang“ (d. h. den Strang, der mit dem Protospacer der verlängerten gRNA hybridisiert ist) oder den „Nicht-Zielstrang“ (d. h. den Strang, der den einzelsträngigen Abschnitt der R-Schleife bildet und der zum Zielstrang komplementär ist) eingeführt werden. In Schritt (c) interagiert das 3'-Ende des DNA-Strangs (gebildet durch den Nick) mit dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, um die reverse Transkription zu primen (d. h. „Ziel-geprimte RT“). In einigen Ausführungsformen hybridisiert der 3'-Ende-DNA-Strang an eine spezifische Primerbindungsstelle auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, d. h. der „Reverse-Transkriptase-Priming-Sequenz“. In Schritt (d) wird eine reverse Transkriptase eingeführt, die einen DNA-Einzelstrang vom 3'-Ende der geprimten Stelle zum 3'-Ende der Prime-Editor-Leit-RNA synthetisiert. Dies bildet einen einzelsträngigen DNA-Flap, der die gewünschte Nukleotidänderung umfasst (z. B. die einzelne Basenänderung, Insertion oder Deletion oder eine Kombination davon) und der ansonsten homolog zu der endogenen DNA an oder neben der Nickstelle ist. In Schritt (e) werden napDNAbp und Leit-RNA freigesetzt. Schritte (f) und (g) betreffen die Auflösung des einzelsträngigen DNA-Flaps, sodass die gewünschte Nukleotidänderung in die Zielstelle eingebaut wird. Dieser Prozess kann zur gewünschten Produktbildung getrieben werden, indem der entsprechende 5'-endogene DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap eindringt und mit der endogenen DNA-Sequenz hypridisiert. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, lösen die endogenen DNA-Reparatur- und -Replikationsprozesse der Zellen die fehlgepaarte DNA auf, um die Nukleotidänderung(en) einzubauen, um das gewünschte veränderte Produkt zu bilden. Das Verfahren kann auch mit einem zweitem Strang-Nicking zur Produktbildung hin angetrieben werden, wie beispielhaft in 1D dargestellt. Dieser Prozess kann mindestens eine oder mehrere der folgenden genetischen Veränderungen einführen: Transversionen, Transitionen, Deletionen und Insertionen.
  • Der Begriff „Prime-Editor(PE)-System“ oder „Prime-Editor“ bezeichnet die Zusammensetzungen, die an dem in dieser Schrift beschriebenen Verfahren der Genom-Editierung unter Verwendung von Target-Primed Reverse Transcription (TPRT) beteiligt sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, napDNAbps, reverse Transkriptasen, Fusionsproteine (z. B. napDNAbps und reverse Transkriptasen umfassend), Prime-Editor-Leit-RNAs und Komplexe, die Fusionsproteine und Prime-Editor-Leit-RNAs umfassen, sowie akzessorische Elemente, wie z. B. Zweitstrang-Nicking-Komponenten und 5'-endogene DNA-Flap-Entfernungs-Endonukleasen, um dabei zu helfen, den Prime-Editing-Prozess in Richtung der editierten Produktbildung voranzutreiben.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann das Prime-Editor(PE)-System die Verwendung einer fehleranfälligen reversen Transkriptase zum Durchführen einer gezielten Mutagenese umfassen, d. h. um nur einen wohldefinierten DNA-Abschnitt in einem Genom oder ein anderes DNA-Element in einer Zelle zu mutieren. 22 stellt eine schematische Darstellung eines beispielhaften Prozesses zum Einführen und Durchführen einer gezielten Mutagenese mit einer fehleranfälligen reversen Transkriptase an einem Ziellocus bereit, wobei ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) verwendet wird, das mit einer Prime-Editor-Leit-RNA komplexiert ist. Dieser Prozess kann als eine Ausführungsform des Prime Editings für gezielte Mutagenese bezeichnet werden. Die Prime-Editor-Leit-RNA umfasst eine Verlängerung am 3'- oder 5'-Ende der Leit-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA. In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/gRNA-Komplex das DNA-Molekül, und die gRNA leitet den napDNAbp, um an die Zielstelle zu binden, um mutagenisiert zu werden. In Schritt (b) wird ein Nick in einen der DNA-Stränge der Zielstelle eingeführt (z. B. durch eine Nuklease oder ein chemisches Mittel), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge der Zielstelle erzeugt wird. In bestimmten Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Schleifenstrang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht an die Leit-RNA-Sequenz hybridisiert ist. In Schritt (c) interagiert der 3'-Ende-DNA-Strang mit dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, um die reverse Transkription zu primen. In einigen Ausführungsformen hybridisiert der 3'-Ende-DNA-Strang an eine spezifische Primerbindungsstelle auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA. In Schritt (d) wird eine reverse Transkriptase eingeführt, die einen DNA-Einzelstrang vom 3'-Ende der geprimten Stelle zum 3'-Ende der Leit-RNA synthetisiert. Exemplarische Mutationen sind mit einem Sternchen * gekennzeichnet. Dies bildet einen einzelsträngigen DNA-Flap, der die gewünschte mutagenisierte Region umfasst. In Schritt (e) werden napDNAbp und Leit-RNA freigesetzt. Die Schritte (f) und (g) betreffen die Auflösung des einzelsträngigen DNA-Flaps (die mutagenisierte Region umfassend), sodass die gewünschte mutagenisierte Region in den Ziellocus eingebaut wird. Dieser Prozess kann zur gewünschten Produktbildung getrieben werden, indem der entsprechende 5'-endogene DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap eindringt und mit der komplementären Sequenz auf dem anderen Strang hybridisiert. Das Verfahren kann auch mit Zweitstrang-Nicking in Richtung Produktbildung vorangetrieben werden, wie beispielhaft in 1D dargestellt. Nach endogener DNA-Reparatur und/oder Replikationsprozessen wird die mutagenisierte Region in beide DNA-Stränge des DNA-Locus eingebaut.
  • In anderen Ausführungsformen kann PEgRNA in den in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editing-Systemen verwendet werden, um eine genetische Veränderung in einer Ziel-DNA-Sequenz anzubringen. Ein beispielhafter derartiger Prozess ist in 29 abgebildet. Die Figuren zeigen eine schematische Darstellung der Interaktion einer typischen PEgRNA mit einer Zielstelle einer doppelsträngigen DNA. Die Doppelstrang-DNA ist mit dem oberen Strang in der 3'- bis 5'-Ausrichtung und dem unteren Strang in der 5'- bis 3'-Richtung gezeigt. Der obere Strang besteht aus dem „Protospacer“ und der PAM-Sequenz und wird als „Zielstrang“ bezeichnet. Der komplementäre untere Strang wird als „Nicht-Zielstrang“ bezeichnet. Obwohl nicht gezeigt, würde die abgebildete PEgRNA mit einem Cas9 oder einem Äquivalent komplexiert. Wie in der schematischen Darstellung gezeigt, lagert der Spacer der PEgRNA an die komplementäre Region auf dem Zielstrang an, die als Protospacer bezeichnet wird und sich direkt stromabwärts der PAM-Sequenz befindet und etwa 20 Nukleotide lang ist. Diese Interaktion bildet sich als DNA/RNA-Hybrid zwischen der Spacer-RNA und der Protospacer-DNA und induziert die Bildung einer R-Schleife in der dem Protospacer gegenüberliegenden Region. Wie an anderer Stelle in dieser Schrift gelehrt, induziert das Cas9-Protein (nicht gezeigt) dann einen Nick in dem Nicht-Zielstrang, wie gezeigt. Dies führt dann zur Bildung der 3'-ssDNA-Flap-Region, die gemäß *z* mit dem 3'-Ende der PEgRNA an der Primerbindungsstelle interagiert. Das 3'-Ende des ssDNA-Flap (d. h. die Primersequenz der reversen Transkriptase) lagert an die Primerbindungsstelle (A) auf der PEgRNA an, wodurch die reverse Transkriptase geprimt wird. Als Nächstes polymerisiert die Reverse Transkriptase (z. B. bereitgestellt in trans oder bereitgestellt cis als Fusionsprotein, angefügt an das Cas9-Konstrukt) dann einen DNA-Einzelstrang, der durch die Editiermatrize (B) und den Homologiearm (C) codiert wird. Die Polymerisation wird zum 5'-Ende des Verlängerungsarms fortgesetzt. Der polymerisierte ssDNA-Strang bildet einen ssDNA-3'-Ende-Flap, der, wie an anderer Stelle beschrieben (z. B. wie in 1E gezeigt), in die endogene DNA eindringt, wodurch der entsprechende endogene Strang verdrängt (der als 5'-DNA-Flap endogener DNA entfernt wird) und die gewünschte Nukleotideditierung (Einzelnukleotid-Basenpaar-Änderung, Deletionen, Insertionen (einschließlich ganzer Gene) durch natürlich vorkommende DNA-Reparatur/Replikationsrunden angebracht wird.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Behandlung eines Subjekts bereit, bei dem eine Krankheit diagnostiziert wurde, die mit einer Punktmutation verbunden ist oder durch diese verursacht wird, die durch das in dieser Schrift bereitgestellte Prime-Editor(PE)-System korrigiert werden kann. Zum Beispiel wird in einigen Ausführungsformen ein Verfahren bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-Systems an ein Subjekt mit einer solchen Krankheit, z. B. einem Krebs, der mit einer Punktmutation wie vorstehend beschrieben verbunden ist, umfasst das die Punktmutation korrigiert oder eine deaktivierende Mutation in ein krankheitsassoziiertes Gen einführt, wie durch homologiegerichtete Reparatur in Gegenwart eines Spender-DNA-Moleküls, das die gewünschte genetische Veränderung umfasst, vermittelt wird. In einigen Ausführungsformen wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-Systems an ein Subjekt mit einer solchen Krankheit umfasst, z. B. einem mit einer Punktmutation assoziiertem Krebs, das die Punktmutation korrigiert oder eine deaktivierende Mutation in ein krankheitsassoziiertes Gen einführt. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine proliferative Krankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine genetische Krankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine neoplastische Krankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine Stoffwechselkrankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine lysosomale Speicherkrankheit. Andere Krankheiten, die durch Korrigieren einer Punktmutation oder Einführen einer deaktivierenden Mutation in ein krankheitsassoziiertes Gen behandelt werden können, sind dem Fachmann bekannt und die Offenbarung ist diesbezüglich nicht beschränkt.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Behandlung zusätzlicher Krankheiten oder Erkrankungen bereit, z. B. Krankheiten oder Erkrankungen, die mit einer Punktmutation, die durch TPRT-vermittelte Gen-Editierung korrigiert werden kann, assoziiert sind oder davon verursacht werden. Einige dieser Krankheiten werden in dieser Schrift beschrieben, und zusätzliche geeignete Krankheiten, die mit den in dieser Schrift bereitgestellten Strategien und Fusionsproteinen behandelt werden können, werden dem Fachmann auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein. Beispielhafte geeignete Krankheiten und Erkrankungen sind nachstehend aufgeführt. Es versteht sich, dass die Nummerierung der spezifischen Positionen oder Reste in den jeweiligen Sequenzen von dem jeweiligen verwendeten Protein und Numerierungsschema abhängt. Die Nummerierung kann unterschiedlich sein, z. B. bei Vorläufern eines reifen Proteins und dem reifen Protein selbst, und Sequenzunterschiede von Spezies zu Spezies können die Nummerierung beeinflussen. Der Fachmann wird in der Lage sein, den jeweiligen Rest in jedem homologen Protein und in der jeweiligen codierenden Nukleinsäure durch in der Technik wohlbekannte Verfahren zu identifizieren, z. B. durch Sequenzausrichtung und Bestimmung homologer Reste. Beispielhafte geeignete Krankheiten und Störungen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein: 2-Methyl-3-hydroxybutterazidurie; 3 Beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase-Mangel; 3-Methylglutaconazidurie; 3-Oxo-5-Alpha-Steroid-Delta-4-Dehydrogenase-Mangel; 46,XY-Geschlechtsumkehr, Typ 1, 3 und 5; 5-Oxoprolinase-Mangel; 6-Pyruvoy-Tetrahydropterin-Synthase-Mangel; Aarskog-Syndrom; Aase-Syndrom; Achondrogenese Typ 2; Achromatopsie 2 und 7; Erworbenes langes QT-Syndrom; Akrokallosales Syndrom, Schinzel-Typ; Akrokapitofemorale Dysplasie; Akrodysostose 2, mit oder ohne Hormonresistenz; Akroerythrokeratodermie; Akromikrische Dysplasie; Acth-unabhängige makronoduläre Nebennierenhyperplasie 2; Aktiviertes PI3K-Delta-Syndrom; akute intermittierende Porphyrie; Mangel der Acyl-CoA-Dehydrogenase-Familie, Mitglied 9; Adams-Oliver-Syndrom 5 und 6; Adenin-Phosphoribosyltransferase-Mangel; Adenylatkinase-Mangel; hämolytische Anämie aufgrund eines Adenylosuccinat-Lyase-Mangels; jugendliche Nephronophthise; Nieren-Hepatische-Pankreas-Dysplasie; Meckel-Syndrom Typ 7; Adrenoleukodystrophie; Epidermolysis bullosa der Epidermolyse bei Erwachsenen; Epidermolysis bullosa, junktionale localisata-Variante; neuronale Ceroid-Lipofuszinose bei Erwachsenen; neuronale Ceroid-Lipofuszinose bei Erwachsenen; Ataxie mit okulomotorischer Apraxie bei Erwachsenen; ADULT-Syndrom; Afibrinogenämie und angeborene Afibrinogenämie; autosomal-rezessive Agammaglobulinämie 2; Altersbedingte Makuladegeneration 3, 6, 11 und 12; Aicardi-Goutieres-SyndromE 1, 4 und 5; Chilbain-Lupus 1; Alagille-Syndrome 1 und 2; Alexander-Krankheit; Alkaptonurie; Allan-Hemdon-Dudley-Syndrom; angeborene Alopecia universalis; Alpers-Enzephalopathie; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; autosomal-dominante, autosomal-rezessive und X-chromosomal-rezessive Alport-Syndrome; familiäre Alzheimer-Krankheit 3 mit spastischer Paraparese und Apraxie; Alzheimer-Krankheit, Typen 1, 3 und 4; IIA1 Amelogenesis imperfecta, Hypokalzifizierungstyp und Hyporeifungstyp; Aminoacylase-1-Mangel; infantiles Amish-Epilepsie-Syndrom; amyloidogene Transthyretin-Amyloidose; Amyloid-Kardiomyopathie, Transthyretin-bezogen; Kardiomyopathie; Amyotrophe Lateralsklerose Typ 1, 6, 15 (mit oder ohne frontotemporaler Demenz), 22 (mit oder ohne frontotemporaler Demenz) und 10; Frontotemporale Demenz mit TDP43-Einschlüssen, TARDBP-bezogen; Andermann-Syndrom; Andersen-Tawil-Syndrom; angeborenes langes QT-Syndrom; Anämie, nichtsphärozytär hämolytisch, aufgrund von G6PD-Mangel; Angelman-Syndrom; schwere neonatale Enzephalopathie mit Mikrozephalie; Anfälligkeit für Autismus, X-chromosomal 3; Angiopathie, erblich, mit Nephropathie, Aneurysmen und Muskelkrämpfen; Angiotensin-i-konvertierendes Enzym, gutartiger Serumanstieg; Aniridie, zerebelläre Ataxie und geistige Behinderung; Anonychie; Antithrombin-III-Mangel; Antley-Bixler-Syndrom mit Genitalanomalien und gestörter Steroidogenese; familiäres thorokales Aortenaneurysma 4, 6 und 9; Thoraxaortenaneurysmen und Aortendissektionen; multisystemisches Funktionsstörungssyndrom der glatten Muskulatur; Moyamoya-Krankheit 5; aplastische Anämie; scheinbarer Mineralocorticoid-Überschuss; Arginase-Mangel; Argininosuccinat-Lyase-Mangel; Aromatasemangel; arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie Typ 5, 8 und 10; primäre familiäre hypertrophe Kardiomyopathie; Arthrogryposis multiplex congenita, distal, X-chromosomal; Arthrogrypose-Nierenfunktionsstörung-Cholestase-Syndrom; Arthrogrypose, Nierenfunktionsstörung und Cholestase 2; Asparagin-Synthetase-Mangel; Anomalie der neuronalen Migration; Ataxie mit Vitamin-E-Mangel; Ataxie, sensorisch, autosomal-dominant; Ataxie-Teleangiektasie-Syndrom; hereditäres krebsprädisponierendes Syndrom; Atransferrinämie; familiäres Vorhofflimmern 11, 12, 13 und 16; Vorhofseptumdefekte 2, 4 und 7 (mit oder ohne atrioventrikuläre Überleitungsdefekte); Vorhofstillstand 2; atrioventrikulärer Septumdefekt 4; Atrophia bulborum hereditaria; ATR-X-Syndrom; aurikulokondyläres Syndrom 2; Autoimmunerkrankung, Multisystem, infantiler Beginn; autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom, Typ 1a; autosomal-dominante hypohidrotische ektodermale Dysplasie; autosomal-dominante progressive externe Ophthalmoplegie mit mitochondrialen DNA-Deletionen 1 und 3; autosomal-dominante Torsionsdystonie 4; autosomal-rezessive zentronukleäre Myopathie; autosomal-rezessive kongenitale Ichthyose 1, 2, 3, 4A und 4B; autosomal-rezessive Cutis laxa Typ IA und 1B; autosomal-rezessives hypohidrotisches ektodermales Dysplasie-Syndrom; ektodermale Dysplasie 11b; hypohidrotisch/Haar-/Zahntyp, autosomal-rezessiv; autosomal-rezessive hypophosphatämische Knochenerkrankung; Axenfeld-Rieger-Syndrom Typ 3; Bainbridge-Ropers-Syndrom; Bannayan-Riley-Ruvalcaba-Syndrom; PTEN-Hamartom-Tumorsyndrom; Baraitser-Winter-Syndrome 1 und 2; Barakat-Syndrom; Bardet-Biedl-Syndrome 1, 11, 16 und 19; Bare-Lymphozyten-Syndrom Typ 2, Komplementierungsgruppe E; Bartter-Syndrom vorgeburtlicher Typ 2; Bartter-Syndrom Typ 3, 3 mit Hypokalziurie und 4; Basalganglienverkalkung, idiopathisch, 4; Monilethrix; gutartige familiäre Hämaturie; gutartige familiäre neonatale Anfälle 1 und 2; gutartige familiäre neonatale Krampfanfälle 1 und/oder Myokymie; Krampfanfälle, frühkindliche epileptische Enzephalopathie 7; gutartige familiäre neonatal-infantile Anfälle; gutartige erbliche Chorea; gutartige scapuloperoneale Muskeldystrophie mit Kardiomyopathie; Bernard-Soulier-Syndrom, Typen A1 und A2 (autosomal-dominant); Bestrophinopathie, autosomal-rezessiv; Beta-Thalassämie; Bethlem-Myopathie und Bethlem -Myopathie 2; Bietti kristalline komeoretinale Dystrophie; Gallensäuresynthesedefekt, angeboren, 2; Biotinidase-Mangel; Birk-Barel-mentales Retardations-Dysmorphismus-Syndrom; Blepharophimose, Ptosis und Epikanthus inversus; Bloom-Syndrom; Borjeson-Forssman-Lehmann-Syndrom; Boucher-Neuhauser-Syndrom; Brachydaktylie-Typen A1 und A2; Brachydaktylie mit Bluthochdruck; Erkrankung der kleinen Gefäße des Gehirns mit Blutung; Mangel an verzweigtkettiger Ketosäure-Dehydrogenase-Kinase; Branchiootische Syndrome 2 und 3; Brustkrebs, früh einsetzend; Brust-Eierstock-Krebs, familiär 1, 2 und 4; sprödes Hornhautsyndrom 2; Brody-Myopathie; Bronchiektasen mit oder ohne erhöhtem Schweißchlorid 3; Brown-Vialetto-Van-Laere-Syndrom und Brown-Vialetto-Van-Laere-Syndrom 2; Brugada-Syndrom; Brugada-Syndrom 1; Kammerflimmern; paroxysmales familiäres Kammerflimmern; Brugada-Syndrom und Brugada-Syndrom 4; Langes-QT-Syndrom; plötzlicher Herztod; Bull's Eye-Makuladystrophie; Stargardt-Krankheit 4; Zapfen-Stäbchen-Dystrophie 12; bullöse ichthyosiforme Erythrodermie; Burn-Mckeown-Syndrom; Candidiasis, familiär, 2, 5, 6 und 8; Kohlenhydratmangel-Glykoprotein-Syndrom Typ I und II; Carboanhydrase-VA-Mangel, dadurch bedingte Hyperammonämie; Dickdarmkarzinom; Herzrythmusstörung; Langes-QT-Syndrom, LQT1-Subtyp; tödliche infantile Kardioenzephalomyopathie aufgrund eines Cytochrom-c-Oxidase-Mangels; cardiofaciokutanes Syndrom; Kardiomyopathie; Danon-Krankheit; hypertrophe Kardiomyopathie; linksventrikuläre Nichtkompaktationskardiomyopathie; Kamevalssyndrom; Camey-Komplex, Typ 1; Carnitin-Acylcarnitin-Translokase-Mangel; Carnitinpalmitoyltransferasemangel I, II, II (später Beginn) und II (infantil); Katarakt 1, 4, autosomal-dominant, autosomal-dominant, multiple Typen, mit Mikrokornea, koppockartig, juvenil, mit Mikrokornea und Glukosurie, und nukleärer diffuser, nicht fortschreitender Katarakt; katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie; kaudales Regressionssyndrom; Cd8-Mangel, familiär; Zentralkernerkrankung; zentromerische Instabilität der Chromosomen 1,9 und 16 und Immunschwäche; Kleinhirn-Ataxie infantil mit progressiver externer Ophthalmoplegien und Kleinhirn-Ataxie, geistiger Retardierung und Dysgleichgewichtssyndrom 2; zerebrale Amyloid-Angiopathie, APP-bezogen; zerebrale autosomal-dominante und rezessive Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukenzephalopathie; zerebrale kavernöse Fehlbildungen 2; zerebrookulofazioskelettales Syndrom 2; zerebro-oculo-facio-skelettales Syndrom; zerebroretinale Mikroangiopathie mit Verkalkungen und Zysten; Ceroid-Lipofuszinose-Neuronen 2, 6, 7 und 10; Ch\xc3 \xa9diak-Higashi-Syndrom, Chediak-Higashi-Syndrom, Erwachsenentyp; Charcot-Marie-Tooth-Krankheitstypen 1B, 2B2, 2C, 2F, 21, 2U (axonal), 1C (demyelinisierend), dominant intermediär C, rezessiv intermediär A, 2A2, 4C, 4D, 4H, IF, IVF und X; skapuloperoneale spinale Muskelatrophie; distale spinale Muskelatrophie, angeboren, nicht fortschreitend; spinale Muskelatrophie, distal, autosomal-rezessiv, 5; CHARGE-Verbindung; Hypophosphatasie im Kindesalter; Hypophosphatasie bei Erwachsenen; Cholezystitis; progressive familiäre intrahepatische Cholestase 3; intrahepatische Cholestase der Schwangerschaft 3; Cholesterinspeicherkrankheit; Mangel an Cholesterinmonooxygenase (Seitenkettenspaltung); Chondrodysplasie Blomstrand-Typ; Chondrodysplasia punctata 1, X-chromosomal rezessiv und 2 x-chromosomal dominant; CHOPS-Syndrom; chronische Granulomatose, autosomal-rezessiv Cytochrom b-positiv, Typ 1 und 2; Chudley-McCullough-Syndrom; Ziliardyskinesie, primär, 7, 11, 15, 20 und 22; Citrullinämie Typ I; Citrullinämie Typ I und II; Cleidokraniale Dysostose; C-ähnliches Syndrom; Cockayne-Syndrom Typ A, ; Coenzym Q10-Mangel, primär 1, 4 und 7; Coffin Siris/geistige Behinderung; Coffm-Lowry-Syndrom; Cohen-Syndrom; kälteinduziertes Schwitzsyndrom 1; COLE-SCHREINER-SYNDROM 2; kombinierte zelluläre und humorale Immundefekte mit Granulomen; kombinierte d-2- und 1-2-Hydroxyglutarazidurie; kombinierte Malon- und Methylmalonazidurie; kombinierte oxidative Phosphorylierungsmängel 1, 3, 4, 12, 15 und 25; kombinierter partieller und vollständiger 17-alpha-Hydroxylase/17,20-Lyase-Mangel; häufige variable Immunschwäche 9; teilweiser Mangel an Komplement-Komponente 4, aufgrund dysfunktionalen cl-Inhibitors; Komplementfaktor-B-Mangel; Kegelmonochromatismus; Zapfen-Stäbchen-Dystrophie 2 und 6; Zapfen-Stäbchen-Dystrophie amelogenesis imperfecta; angeborene Nebennierenhyperplasie und angeborene Nebennierenhypoplasie, X-chromosomal; angeborene amegakaryocytische Thrombozytopenie; Angeborene Aniridie; angeborene zentrale Hypoventilation; Hirschsprung-Krankheit 3; angeborene kontrakturale Arachnodaktylie; angeborene Kontrakturen der Gliedmaßen und des Gesichts, Hypotonie und Entwicklungsverzögerung; angeborene Glykosylierungsstörung der Typen 1B, 1D, 1G, 1H, 1J, 1K, 1N, 1P, 2C, 2J, 2K, IIm; angeborene dyserythropoetische Anämie, Typ I und II; angeborene ektodermale Dysplasie des Gesichts; angeborene erythropoetische Porphyrie; angeborene generalisierte Lipodystrophie Typ 2; angeborene Herzfehler, mehrere Typen, 2; angeborene Herzfehler; unterbrochener Aortenbogen; angeborenes lipomatöses Wachstum, Gefäßfehlbildungen und epidermale Nävi; nicht-kleinzelliger Lungenkrebs; Neoplasma des Eierstocks; Herzleitungsstörung, unspezifisch; Angeborene mikrovillöse Atrophie; Angeborene Muskeldystrophie; angeborene Muskeldystrophie aufgrund eines partiellen LAMA2-Mangels; angeborene Muskeldystrophie-Dystroglycanopathie mit Hirn- und Augenanomalien, Typen A2, A7, A8, A11 und A14; angeborene Muskeldystrophie-Dystroglycanopathie mit geistiger Behinderung, Typen B2, B3, B5 und B15; angeborene Muskeldystrophie-Dystroglycanopathie ohne geistige Behinderung, Typ B5; angeborenes Muskelhypertrophie-zerebrales Syndrom; angeborenes myasthenisches Syndrom, auf Acetazolamid ansprechend; angeborene Myopathie mit Fasertyp-Disproportion; angeborenes okuläres Kolobom; Angeborene stationäre Nachtblindheit, Typ 1A, 1B, 1C, 1E, 1F und 2A; Koproporphyrie; Cornea plana 2; Hornhautdystrophie, Fuchs-Endothel, 4; Hornhaut-Endotheldystrophie Typ 2; Hornhautzerbrechlichkeit Keratoglobus, blaue Sklerae und Gelenkhypermobilität; Cornelia-de-Lange-Syndrome 1 und 5; koronare Herzkrankheit, autosomal-dominant 2; koronare Herzerkrankung; Hyperalphalipoproteinämie 2; kortikale Dysplasie, komplex, mit anderen Hirnfehlbildungen 5 und 6; kortikale Fehlbildungen, Hinterkopf; Mangel an Kortikosteroidbindendem Globulin; Corticosteron-Methyloxidase-Typ-2-Mangel; Costello-Syndrom; Cowden-Syndrom 1; Coxa plana; kraniodiaphysäre Dysplasie, autosomal-dominant; Kraniosynostose 1 und 4; Kraniosynostose und Zahnanomalien; Kreatinmangel, X-chromosomal; Crouzon-Syndrom; Kryptophthalmus-Syndrom; Kryptorchismus, einseitig oder beidseitig; Cushing-Symphalangismus; kutanes malignes Melanom 1; Cutis laxa mit Osteodystrophie und mit schweren Lungen-, Magen-Darm- und Harnwegsanomalien; vorübergehende neonatale und atypische nephropathische Zyanose; Mukoviszidose; Cystinurie; Cytochrom-c-Oxidase-I-Mangel; Cytochrom-c-Oxidase-Mangel; D-2-Hydroxyglutarazidurie 2; Darier-Krankheit, segmental; Taubheit mit labyrinthischer Aplasie Mikrotie und Mikrodontie (LAMM); Taubheit, autosomal-dominant 3a, 4, 12, 13, 15, autosomal-dominant nicht-syndromal sensorineural 17, 20 und 65; Taubheit, autosomal-rezessiv 1A, 2, 3, 6, 8, 9, 12, 15, 16, 18b, 22, 28, 31, 44, 49, 63, 77, 86 und 89; Taubheit, Cochlea, mit Myopie und intellektueller Beeinträchtigung, ohne vestibuläre Beteiligung, autosomal-dominant, X-chromosomal 2; Mangel an 2-Methylbutyryl-CoA-Dehydrogenase; Mangel an 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase; Mangel an Alpha-Mannosidase; Mangel an aromatischer L-Aminosäure-Decarboxylase; Mangel an Bisphosphoglycerat-Mutase; Mangel an Butyryl-CoA-Dehydrogenase; Mangel an Ferroxidase; Mangel an Galaktokinase; Mangel an Guanidinoacetat-Methyltransferase; Mangel an Hyaluronoglucosaminidase; Mangel an Ribose-5-Phosphat-Isomerase; Mangel an Steroid-11-beta-Monooxygenase; Mangel an UDP-Glucose-Hexose-1-Phosphat-Uridylyltransferase; Mangel an Xanthinoxidase; Dejerine-Sottas-Krankheit; Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Typen ID und IVF; Dejerine-Sottas-Syndrom, autosomal-dominant; Mangel an dendritischen Zellen, Monozyten, B-Lymphozyten und natürlichen Killer-Lymphozyten; Desbuquois-Dysplasie 2; Desbuquois-Syndrom; DFNA 2 Nicht-syndromaler Hörverlust; Diabetes mellitus und Insipidus mit Optikusatrophie und Taubheit; Diabetes mellitus Typ 2 und insulinabhängig 20; Diamond-Blackfan-Anämie 1, 5, 8 und 10; Durchfall 3 (sekretorisches Natrium, angeboren, syndromal) und 5 (mit Tufting-Enteropathie, angeboren); Dicarbonsäureaminoazidurie; diffuse palmoplantare Keratodermie, Bottnischer Typ; digitorenozerebrales Syndrom; Dihydropteridin-Reduktase-Mangel; dilatative Kardiomyopathie 1A, 1AA, 1C, 1G, 1BB, 1DD, 1FF, 1HH, 1I, 1KK, 1N, 1S, 1Y und 3B; linksventrikuläre Nichtverdichtung 3; gestörte Steroidogenese aufgrund eines Cytochrom-p450-Oxidoreduktase-Mangels; distale Arthrogrypose Typ 2B; distale hereditäre motorische Neuronopathie Typ 2B; distale Myopathie Markesbery-Griggs-Typ; distale spinale Muskelatrophie, X-chromosomal 3; Distichiasis-Lymphödem-Syndrom; dominante dystrophische Epidermolysis bullosa mit fehlender Haut; dominante erbliche Optikusatrophie; Donnai-Barrow-Syndrom; Dopamin-Beta-Hydroxylase-Mangel; Dopaminrezeptor d2, reduzierte Hirndichte; Dowling-Degos-Krankheit 4; Doyne-Waben-Netzhautdystrophie; Malattia leventenine; Duane-Syndrom Typ 2; Dubin-Johnson-Syndrom; Duchenne-Muskeldystrophie; Becker-Muskeldystrophie; Dysfibrinogenämie; Dyskeratosis congenita autosomal-dominant und autosomal-dominant, 3; Dyskeratosis congenita, autosomal-rezessiv, 1, 3, 4 und 5; Dyskeratosis congenita X-chromosomal; Dyskinesie, familiär, mit Gesichtsmyokymie; Dysplasminogenämie; Dystonie 2 (Torsion, autosomal-rezessiv), 3 (Torsion, X-chromosomal), 5 (Dopa-responsiver Typ), 10, 12, 16, 25, 26 (Myoklonisch); gutartige familiäre infantile Anfälle 2; frühkindliche epileptische Enzephalopathie 2, 4, 7, 9, 10, 11, 13 und 14; atypisches Rett-Syndrom; frühe T-Zell-Vorläufer akute lymphoblastische Leukämie; ektodermale Dysplasie Hautfragilitätssyndrom; ektodermales Dysplasie-Syndaktylie-Syndrom 1; Ectopia lentis, isoliert autosomal-rezessiv und dominant; Ektrodaktylie, ektodermale Dysplasie und Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten-Syndrom 3; Ehlers-Danlos-Syndrom Typ 7 (autosomal-rezessiv), klassischer Typ, Typ 2 (Progeroid), Hydroxylysin-defizient, Typ 4, Typ-4-Variante und aufgrund von Tenascin-X-Mangel; angeborene Muskeldystrophie vom Eichsfeld-Typ; endokrine Zerebroosteodysplasie; verstärktes S-Kegel-Syndrom; vergrößertes vestibuläres Aquäduktsyndrom; Enterokinase-Mangel; Epidermodysplasie verruciformis; Epidermolysa bullosa simplex und Gliedergürtel-Muskeldystrophie, Simplex mit fleckiger Pigmentierung, Simplex mit Pylorusatresie, Simplex, autosomal-rezessiv und mit Pylorusatresie; epidermolytische palmoplantare Keratodermie; familiäre Fieberkrämpfe 8; Epilepsie, Abwesenheit im Kindesalter 2, 12 (idiopathisch generalisiert, Anfälligkeit für) 5 (nächtlicher Frontallappen), nächtlicher Frontallappen Typ 1, partiell, mit variablen Herden, progressive myoklonische 3 und X-chromosomal, mit variablen Lernbehinderungen und Verhaltensstörungen; epileptische Enzephalopathie, im Kindesalter beginnend, frühkindlich, 1, 19, 23, 25, 30 und 32; multiple epiphysäre Dysplasie mit Myopie und konduktiver Taubheit; episodische Ataxie Typ 2; episodisches Schmerzsyndrom, familiär, 3; Epstein-Syndrom; Fechtner-Syndrom; erythropoetische Protoporphyrie; Östrogenresistenz; Exsudative Vitreoretinopathie 6; Morbus Fabry und Morbus Fabry, Herzvariante; Mangel an Faktor H, VII, X, v und Faktor viii, kombinierter Mangel an einer Untereinheit 2, xiii; familiäre adenomatöse Polyposis 1 und 3; familiäre Amyloidnephropathie mit Urtikaria und Taubheit; familiäre kalte Urtikaria; familiäre Aplasie des Vermis; familiärer gutartiger Pemphigus; familiärer Brustkrebs; Brustkrebs, Anfälligkeit für; Osteosarkom; Bauchspeicheldrüsenkrebs 3; familiäre Kardiomyopathie; familiäres autoinflammatorisches Erkältungssyndrom 2; familiärer Darmkrebs; familiäre exsudative Vitreoretinopathie, X-chromosomal; familiäre hemiplegische Migräne Typ 1 und 2; familiäre Hypercholesterinämie; familiäre hypertrophe Kardiomyopathie 1, 2, 3, 4, 7, 10, 23 und 24; familiäre Hypokaliämie-Hypomagnesiämie; familiäre hypoplastische, glomerulozystische Niere; familiäre infantile Myasthenie; familiäre juvenile Gicht; familiäres Mittelmeerfieber und familiäres Mittelmeerfieber, autosomal dominant; familiäre Porenzephalie; familiäre Porphyria cutanea tarda; familiäre pulmonale kapillare Hämangiomatose; familiäre renale Glukosurie; familiäre renale Hypourikämie; familiäre restriktive Kardiomyopathie 1; familiäre Hyperlipoproteinämie Typ 1 und 3; Fanconi-Anämie, Komplementierungsgruppe E, I, N und O; Fanconi-Bickel-Syndrom; Favismus, Anfälligkeit für; Fieberkrämpfe, familiär, 11; Feingold-Syndrom 1; fötaler Hämoglobin-Quantitativer Trait Locus 1; FG-Syndrom und FG-Syndrom 4; Fibrose der extraokularen Muskulatur, angeboren, 1, 2, 3a (mit oder ohne extraokulare Beteiligung), 3b; Fischaugenkrankheit; Fleck-Hornhautdystrophie; Floating-Harbor-Syndrom; Fokale Epilepsie mit Sprachstörung mit oder ohne geistige Behinderung; Fokale segmentale Glomerulosklerose 5; Defekte des Vorderhirns; Frank-Ter-Haar-Syndrom; Borrone Di Rocco Crovato-Syndrom; Frasier-Syndrom; Wilms-Tumor 1; Freeman-Sheldon-Syndrom; Frontometaphysäre Dysplasie 1 und 3; frontotemporale Demenz; frontotemporale Demenz und/oder amyotrophe Lateralsklerose 3 und 4; frontotemporale Demenz Chromosom 3-verknüpft und frontotemporale Demenz Ubiquitin-positiv; Fructose-Biphosphatase-Mangel; Fuhrmann-Syndrom; Gamma-Aminobuttersäure-Transaminase-Mangel; Gamstorp-Wohlfart-Syndrom; Gaucher-Krankheit Typ 1 und subakute neuronopathische; Blicklähmung, familiär horizontal, mit fortschreitender Skoliose; Generalisierte dominante dystrophische Epidermolysis bullosa; Generalisierte Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus 3, Typ 1, Typ 2; epileptische Enzephalopathie vom Lennox-Gastaut-Typ; Riesen-Axonale Neuropathie; Glanzmann-Thrombasthenie; Glaukom 1, offener Winkel, e, F und G; Glaukom 3, primär angeboren, d; angeborenes Glaukom und angeborenes Glaukom, Kolobom; Glaukom, primärer Offenwinkel, juveniler Beginn; Gliomanfälligkeit 1; Glukosetransporter-Typ-1-Mangelsyndrom; Glucose-6-Phosphat-Transportdefekt; GLUT1-Mangelsyndrom 2; Epilepsie, idiopathisch generalisiert, Anfälligkeit für, 12; Glutamat-Formiminotransferase-Mangel; Glutarazidämie IIA und IIB; Glutarazidurie, Typ 1; Gluthathion-Synthetase-Mangel; Glykogenspeicherkrankheit 0 (Muskel), II (adulte Form), IXa2, IXc, Typ 1A; Typ II, Typ IV, IV (kombiniert hepatisch und myopathisch), Typ V und Typ VI; Goldmann-Favre-Syndrom; Gordon-Syndrom; Gorlin-Syndrom; Holoprosenzephalie-Sequenz; Holoprosenzephalie 7; Granulomatöse Erkrankung, chronisch, X-chromosomal, Variante; Granulosazelltumor des Eierstocks; Syndrom der grauen Blutplättchen; Griscelli-Syndrom Typ 3; Hornhautdystrophie Groenouw Typ I; Wachstum und geistige Behinderung, mandibulofaziale Dysostose, Mikrozephalie und Gaumenspalte; Wachstumshormonmangel mit Hypophysenanomalien; Wachstumshormonunempfindlichkeit mit Immunschwäche; GTP-Cyclohydrolase-I-Mangel; Hajdu-Cheney-Syndrom; Hand-Fuß-Uterus-Syndrom; Schwerhörig; Hämangiom, kapillares infantiles; hämatologisches Neoplasma; Hämochromatose Typ 1, 2B und 3; Mikrovaskuläre Komplikationen von Diabetes 7; Transferrin-Serumspiegel Quantitativer Trait Locus 2; Hämoglobin-H-Krankheit, nichtdeletional; Hämolytische Anämie, nicht-sphärozytär, aufgrund von Glucosephosphat-Isomerase-Mangel; Hämophagozytische Lymphohistiozytose, familiär, 2; Hämophagozytische Lymphohistiozytose, familiär, 3; Heparin-Cofaktor-II-Mangel; hereditäre Acrodermatitis enteropathica; hereditäres Brust- und Eierstockkrebssyndrom; Ataxie-telangiektasie-ähnliche Störung; hereditärer diffuser Magenkrebs; hereditäre diffuse Leukenzephalopathie mit Sphäroiden; Mangelkrankheit hereditärer Faktoren II, IX, VIII; hereditäre hämorrhagische Teleangiektasie Typ 2; hereditäre Schmerzunempfindlichkeit bei Anhidrose; hereditäres Lymphödem Typ I; hereditäre motorische und sensorische Neuropathie mit Optikusatrophie; hereditäre Myopathie mit frühem Atemversagen; hereditäre neuralgische Amyotrophie; hereditäre nichtpolypöse kolorektale Neoplasien; Lynch-Syndrom I und II; hereditäre Pankreatitis; Pankreatitis, chronisch, Anfälligkeit für; hereditäre sensorische und autonome Neuropathie Typ IIB und IIA; hereditäre sideroblastische Anämie; Hermansky-Pudlak-Syndrom 1, 3, 4 und 6; Heterotaxie, viszeral, 2, 4 und 6, autosomal; Heterotaxie, viszeral, X-gebunden; Heterotopie; histiozytäre medulläre Retikulose; Histiozytose-Lymphadenopathie plus Syndrom; Holocarboxylase-Synthetase-Mangel; Holoprosenzephalie 2, 3,7 und 9; Holt-Oram-Syndrom; Homocysteinämie aufgrund von MTHFR-Mangel, CBS-Mangel und Homocystinurie, auf Pyridoxin ansprechend; Homocystinurie-Megaloblastische Anämie aufgrund eines Defekts im Cobalamin-Stoffwechsel, cblE-Komplementationstyp; Howel-Evans-Syndrom; Hurler-Syndrom; Hutchinson-Gilford-Syndrom; Hydrozephalus; Hyperammonämie, Typ III; Hypercholesterinämie und Hypercholesterinämie, autosomal-rezessiv; Hyperekplexia 2 und Hyperekplexia erblich; Hyperferritinämie-Katarakt-Syndrom; Hyperglycinurie; Hyperimmunglobulin D mit periodischem Fieber; Mevalon-Azidurie; Hyperimmunglobulin-E-Syndrom; Hyperinsulinämische Hypoglykämie familiär 3, 4 und 5; Hyperinsulinismus-Hyperammonämie-Syndrom; Hyperlysinämie; Hypermanganesämie mit Dystonie, Polyzythämie und Zirrhose; Hyperornithinämie-Hyperammonämie-Homocitrullinurie-Syndrom; Hyperparathyreoidismus 1 und 2; Hyperparathyreoidismus, Neugeborene schwer; Hyperphenylalaninämie, bh4-defizient, a, aufgrund eines partiellen Pts-Mangels, BH4-defizient, D und nicht-pku; Hyperphosphatasie mit geistigem Retardationssyndrom 2, 3 und 4; hypertrichotische Osteochondrodysplasie; Hypobetalipoproteinämie, familiär, assoziiert mit Apob32; Hypokalzämie, autosomal-dominant 1; hypokalziurie Hyperkalzämie, familiär, Typ 1 und 3; Hypochondrogenese; hypochrome mikrozytäre Anämie mit Eisenüberladung; Hypoglykämie mit Mangel an Glykogensynthetase in der Leber; hypogonadotroper Hypogonadismus 11 mit oder ohne Anosmie; hypohidrotische ektodermale Dysplasie mit Immunschwäche; hypohidrotische X-chromosomale ektodermale Dysplasie; hypokaliämische periodische Paralyse 1 und 2; Hypomagnesiämie 1, Darm; Hypomagnesiämie, Krampfanfälle und geistige Behinderung; hypomyelinisierende Leukodystrophie 7; hypoplastisches Linksherzsyndrom; Atrioventrikulärer Septumdefekt und gemeinsamer atrioventrikulärer Übergang; Hypospadie 1 und 2, X-chromosomal; Hypothyreose, angeboren, nicht kropfig, 1; Hypotrichose 8 und 12; Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom; I Blutgruppensystem; Ichthyosis bullosa von Siemens; Ichthyosis exfoliativa; Ichthyose-Frühgeborenen-Syndrom; Idiopathische Basalganglienverkalkung 5; idiopathische fibrosierende Alveolitis, chronische Form; Dyskeratosis congenita, autosomal-dominant, 2 und 5; idiopathische Hyperkalzämie des Säuglingsalters; Immundysfunktion mit T-Zell-Inaktivierung aufgrund eines Calciumeintrittsdefekts 2; Immunschwäche 15, 16, 19, 30, 31C, 38, 40, 8, aufgrund eines Defekts in cd3-zeta, mit Hyper-IgM Typ 1 und 2 und X-chromosomal, mit Magnesiumdefekt, Epstein-Barr-Virusinfektion und Neoplasie ; Immunschwäche-zentromerische Instabilität-Gesichtsanomalien-Syndrom 2; Einschlusskörpermyopathie 2 und 3; Nonaka-Myopathie; infantile Krämpfe und paroxysmale Choreoathetose, familiär; infantile kortikale Hyperostose; infantile GM1-Gangliosidose; infantile Hypophosphatasie; infantile Nephronophthise; infantiler Nystagmus, X-chromosomal; infantile Parkinsonismus-Dystonie; Unfruchtbarkeit im Zusammenhang mit mehrschwänzigen Spermatozoen und übermäßiger DNA; Insulinresistenz; insulinresistenter Diabetes mellitus und Acanthosis nigricans; insulinabhängiges sekretorisches Durchfallsyndrom von Diabetes mellitus; interstitielle Nephritis, karyomegalie; intrauterine Wachstumsverzögerung, metaphysäre Dysplasie, Nebennierenhypoplasie congenita und Genitalanomalien; Iodtyrosyl-Kupplungsdefekt; IRAK4-Mangel; Iridogoniodysgenesis dominanter Typ und Typ 1; Eisenansammlung im Gehirn; ischiopatellare Dysplasie; Inselzellhyperplasie; Isolierter 17,20-Lyase-Mangel; isolierter Lutropinmangel; Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase-Mangel; Jankovic Rivera-Syndrom; Jervell- und Lange-Nielsen-Syndrom 2; Joubert-Syndrom 1, 6, 7, 9/15 (digenic), 14, 16 und 17 und Orofaciodigital-Syndrom xiv; Junktionale Epidermolysis bullosa gravis von Herlitz; Juvenile GM>1< Gangliosidose; Juveniles Polyposis-Syndrom; juvenile Polyposis /hereditäres hämorrhagisches Teleangiektasie-Syndrom; juvenile Retinoschisis; Kabuki-Make-up-Syndrom; Kallmann-Syndrom 1, 2 und 6; verzögerte Pubertät; Kanzaki-Krankheit; Karak-Syndrom; Kartagener-Syndrom; Kenny-Caffey-Syndrom Typ 2; Keppen-Lubinsky-Syndrom; Keratokonus 1; Keratose follicularis; Keratosis palmoplantaris striata 1; Kindler-Syndrom; L-2-Hydroxyglutarazidurie; Larsen-Syndrom, dominanter Typ; Gitter-Hornhautdystrophie Typ III; Leber-Amaurose; Zellweger-Syndrom; Peroxisom-Biogenese-Störungen; Zellweger-Syndrom-Spektrum; Leber angeborene Amaurose 11, 12, 13, 16, 4, 7 und 9; Leber-Optik-Atrophie; Aminoglykosid-induzierte Taubheit; Taubheit, nicht-syndromale sensorineurale, mitochondriale; Linksventrikuläre Nichtverdichtung 5; Fehlbildungen der Links-Rechts-Achse; Leigh-Krankheit; Mitochondrialer kurzkettiger Enoyl-CoA-Hydratase-1-Mangel; Leigh-Syndrom aufgrund eines Mangels an mitochondrialem Komplex I; Leiner-Krankheit; Leri Weill Dyschondrosteose; letales kongenitales Kontraktursyndrom 6; Leukozytenadhäsionsmangel Typ I und III; Leukodystrophie, hypomyelinisierend, 11 und 6; Leukenzephalopathie mit Ataxie, mit Beteiligung des Hirnstamms und des Rückenmarks und Laktaterhöhung, mit verschwindender weißer Substanz und fortschreitend, mit Ovarialversagen; Leukonychia totalis; Lewy-Körper-Demenz; Lichtenstein-Knorr-Syndrom; Li-Fraumeni-Syndrom 1; Lig4-Syndrom; Gliedergürtel-Muskeldystrophie, Typ 1B, 2A, 2B, 2D, C1, C5, C9, C14; angeborene Muskeldystrophie-Dystroglycanopathie mit Hirn- und Augenanomalien, Typ A14 und B14; Lipasemangel kombiniert; Lipidproteinose; Lipodystrophie, familiär partiell, Typ 2 und 3; Lissenzephalie 1, 2 (X-chromosomal), 3, 6 (mit Mikrozephalie), X-chromosomal; subkortikale laminare Heterotopie, X-chromosomal; Leberversagen akut infantil; Loeys-Dietz-Syndrom 1, 2, 3; Long-QT-Syndrom 1, 2, 2/9, 2/5, (digenisch), 3, 5 und 5, erworben, Anfälligkeit für; Lungenkrebs; Lymphödem, erblich, id; Lymphödem, primär, mit Myelodysplasie; Lymphoproliferatives Syndrom 1, 1 (X-chromosomal) und 2; Mangel an lysosomaler saurer Lipase; Makrozephalie, Makrosomie, Gesichtsdysmorphismus-Syndrom; Makuladystrophie, Vitelliform, im Erwachsenenalter beginnend; Anfälligkeit für maligne Hyperthermie Typ 1; Malignes Lymphom, Non-Hodgkin; malignes Melanom; bösartiger Tumor der Prostata; mandibuloakrale Dysostose; Mandibuloakrale Dysplasie mit Lipodystrophie Typ A oder B, atypisch; Mandibulofaziale Dysostose, Treacher-Collins-Typ, autosomal-rezessiv; Mangel an Mannose-bindendem Protein; Ahomsirup-Urinkrankheit Typ 1A und Typ 3; Marden Walker-ähnliches Syndrom; Marfan-Syndrom; Marinesco- Syndrom; Martsolf-Syndrom; Altersdiabetes bei jungen Menschen, Typ 1, Typ 2, Typ 11, Typ 3 und Typ 9; May-Hegglin-Anomalie; MYH9-bezogene Störungen; Sebastian-Syndrom; McCune-Albright-Syndrom; somatotropes Adenom; Geschlechtsstrang-Stromatumor; Cushing-Syndrom; McKusick-Kaufman-Syndrom; McLeod-Neuroakanthozytose-Syndrom; Meckel-Gruber-Syndrom; Dehydrogenase-Mangel an mittelkettigem Acyl-Coenzym A; Medulloblastom; Megalenzephale Leukenzephalopathie mit subkortikalen Zysten 1 und 2a; Megalenzephalie cutis marmorata teleangiectatica angeboren; PIK3CA-bezogenes Überwuchsspektrum; Megalenzephalie-Polymikrogyrie-Polydaktylie-Hydrozephalus-Syndrom 2; Megaloblastäre Anämie, auf Thiamin ansprechend, mit Diabetes mellitus und sensorineuraler Taubheit; Meier-Gorlin-Syndrome 1 und 4; Melnick-Nadel-Syndrom; Meningeom; Geistige Retardierung, X-chromosomal, 3, 21, 30 und 72; geistige Retardierung und Mikrozephalie mit pontiner und zerebellärer Hypoplasie; geistige Retardierung X-chromosomal Syndrom 5; geistige Behinderung, vorderer Oberkiefervorsprung und Strabismus; geistige Retardierung, autosomal-dominant 12, 13, 15, 24, 3, 30, 4, 5, 6 und 9; Geistige Retardierung, autosomal-rezessiv 15, 44, 46 und 5; geistige Behinderung, stereotype Bewegungen, Epilepsie und/oder zerebrale Fehlbildungen; geistige Retardierung, syndromal, Claes-Jensen-Typ, X-chromosomal; geistige Retardierung, X-chromosomal, unspezifisch, syndromal, Hedera-Typ und syndromal, Wu-Typ; angeborene Muskeldystrophie mit Merosinmangel; Metachromatische Leukodystrophie juveniler, spätinfantiler und erwachsener Typ; Metachromatische Leukodystrophie; Metatrophe Dysplasie; Methämoglobinämie Typ I und 2; Methionin-Adenosyltransferase-Mangel, autosomal-dominant; Methylmalonazidämie mit Homocystinurie, ; Methylmalonazidurie vom Typ cblB; Methylmalonazidurie aufgrund von Methylmalonyl-CoA-Mutase-Mangel; METHYLMALON-ACIDURIE, mut(0)-TYP; Mikrozephaler osteodysplastischer primordialer Zwergwuchs Typ 2; Mikrozephalie mit oder ohne Chorioretinopathie, Lymphödem oder geistiger Behinderung; Mikrozephalie, Hiatushemie und nephrotisches Syndrom; Mikrozephalie; Hypoplasie des Corpus callosum; spastische Paraplegie 50, autosomal-rezessiv; globale Entwicklungsverzögerung; ZNS-Hypomyelinisierung; Gehirnschwund; Mikrozephalie, normale Intelligenz und Immunschwäche; Mikrozephaliekapilläres Fehlbildungssyndrom; Mikrozytäre Anämie; Mikrophthalmie-Syndrom 5, 7 und 9; Mikrophthalmie, isoliert 3, 5, 6, 8 und mit Kolobom 6; Mikrosphärophakie; Migräne, familiärer Basilar; Miller-Syndrom; Minicore-Myopathie mit externer Ophthalmoplegie; Myopathie, angeboren mit Kernen; Mitchell-Riley-Syndrom; mitochondrialer 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Synthase-Mangel; Mangel an mitochondrialem Komplex I, II, III, III (Kerntyp 2, 4 oder 8); Mitochondriales DNA-Depletion-Syndrom 11, 12 (kardiomyopathischer Typ), 2, 4B (MNGIE-Typ), 8B (MNGIE-Typ); Mitochondriales DNA-Depletionssyndrom 3 und 7, hepato-zerebrale Typen und 13 (enzephalomyopathischer Typ); Mangel an mitochondrialen Phosphatträgern und Pyruvatträgern; Mitochondrialer trifunktionaler Proteinmangel; Mangel an langkettiger 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase; Miyoshi-Muskeldystrophie 1; Myopathie, distal, mit anteriorem Tibiabeginn; Mohr-Tranebjaerg-Syndrom; Mangel an Molybdän-Kofaktor, Komplementierungsgruppe A; Mowat-Wilson-Syndrom; Mukolipidose III Gamma; Mukopolysaccharidose Typ VI, Typ VI (schwer) und Typ VII; Mucopolysaccharidose, MPS-I-H/S, MPS-II, MPS-III-A, MPS-III-B, MPS-III-C, MPS-IV-A, MPS-IV-B; Retinitis pigmentosa 73; Gangliosidose GM1 Typl (mit Herzbeteiligung) 3; Multizentrische Osteolyse-Nephropathie; Multizentrische Osteolyse, Nodulose und Arthropathie; Mehrere angeborene Anomalien; Vorhofseptumdefekt 2; Multiple angeborene Anomalien-Hypotonie-Krampf-Syndrom 3; multiple Haut- und Schleimhautvenenfehlbildungen; multiple endokrine Neoplasie, Typ 1 und 4; multiple epiphysäre Dysplasie 5 oder Dominant; Mehrere gastrointestinale Atresien; Multiples Pterygium-Syndrom Escobar-Typ; Multipler Sulfatase-Mangel; Multiple Synostosen-Syndrom 3; Muskel-AMP-Guaninoxidase-Mangel; Muskel-Augen-Hirn-Krankheit; Muskeldystrophie, angeboren, megakonialer Typ; Myasthenia, familiäre infantile, 1; Myasthenisches Syndrom, kongenital, 11, verbunden mit Acetylcholinrezeptormangel; Myasthenisches Syndrom, kongenital, 17, 2A (langsamer Kanal), 4B (schneller Kanal) und ohne tubuläre Aggregate; Myeloperoxidase-Mangel; MYH-assoziierte Polyposis; Endometriumkarzinom; Myokardinfarkt 1; Myoklonische Dystonie; Myoklonisch-Atonische Epilepsie; Myoklonus mit Epilepsie mit ausgefransten roten Fasern; Myofibrilläre Myopathie 1 und ZASP-bezogen; Myoglobinurie, akut rezidivierend, autosomal-rezessiv; myoneurales gastrointestinales Enzephalopathie-Syndrom; Kleinhirn-Ataxie infantil mit progressiver externer Ophthalmoplegie; Mitochondriales DNA-Depletion-Syndrom 4B, MNGIE-Typ; Myopathie, zentronukleär, 1, angeboren, mit Überschuss an Muskelspindeln, distal, 1, Laktatazidose und sideroblastische Anämie 1, mitochondrial progressiv mit angeborenem Katarakt, Hörverlust und Entwicklungsverzögerung und tubulärem Aggregat, 2; Kurzsichtigkeit 6; Myosklerose, autosomal-rezessiv; angeborene Myotonie; angeborene Myotonie, autosomal-dominante und rezessive Formen; Nagel-Patella-Syndrom; Nance-Horan-Syndrom; Nanophthalmus 2; Navajo-Neurohepatopathie; Nemalin-Myopathie 3 und 9; neonatale Hypotonie; Beschränkter Intellekt; Anfälle; verzögerte Sprach- und Sprachentwicklung; geistige Behinderung, autosomal-dominant 31; neonatale intrahepatische Cholestase durch Citrinmangel; Nephrogener Diabetes insipidus, Nephrogener Diabetes insipidus, X-chromosomal; Nephrolithiasis/Osteoporose, hypophosphatämisch, 2; Nephronophthise 13, 15 und 4; Unfruchtbarkeit; Kleinhirn-okulo-renales Syndrom (Nephronophthise, okulomotorische Apraxie und Kleinhirnanomalien); Nephrotisches Syndrom, Typ 3, Typ 5, mit oder ohne Augenanomalien, Typ 7 und Typ 9; Nestor-Guillermo-Progerie-Syndrom; Neu-Laxova-Syndrom 1; Neurodegeneration mit Eisenansammlung im Gehirn 4 und 6; Neuroferritinopathie; Neurofibromatose, Typ 1 und Typ 2; Neurofibrosarkom; Neurohypophysärer Diabetes insipidus; Neuropathie, hereditäre sensorische, Typ IC; Transportdefekt für neutrale 1 Aminosäure; Neutrale Lipidspeicherkrankheit mit Myopathie; Neutrophiles Immunschwächesyndrom; Nicolaides-Baraitser-Syndrom; Niemann-Pick-Krankheit Typ C1, C2, Typ A und Typ C1, adulte Form; nicht-ketotische Hyperglyzinämie; Noonan-Syndrom 1 und 4, LEOPARD-Syndrom 1; Noonan-Syndrom-ähnliche Erkrankung mit oder ohne juvenile myelomonozytäre Leukämie; Normokalämische periodische Lähmung, kaliumempfindlich; Norum-Krankheit; Epilepsie, Hörverlust und Syndrom der geistigen Behinderung; Geistige Retardierung, X-Linked 102 und Syndrom 13; Fettleibigkeit; Augenalbinismus, Typ I; Okulokutaner Albinismus Typ 1B, Typ 3 und Typ 4; Oculodentodigitale Dysplasie; Odontohypophosphatasie; Odontotrichomeles Syndrom; Oguchi-Krankheit; Oligodontie-Kolorektalkrebs-Syndrom; Opitz G/BBB-Syndrom; Optikusatrophie 9; Oral-Gesichts-Digital-Syndrom; Ornithin-Aminotransferase-Mangel; Orofaziale Spalte 11 und 7, Lippen-/Gaumenspalte-ektodermales Dysplasie-Syndrom; Orstavik-Lindemann-Solberg-Syndrom; Arthrose mit leichter Chondrodysplasie; Osteochondritis dissecans; Osteogenesis imperfecta Typ 12, Typ 5, Typ 7, Typ 8, Typ I, Typ III, mit normalen Skleren, dominante Form, rezessiv perinatal letal; Osteopathia striata mit Hirnsklerose; Osteopetrose autosomal-dominant Typ 1 und 2, rezessiv 4, rezessiv 1, rezessiv 6; Osteoporose mit Pseudogliom; Oto-palato-digitales Syndrom, Typ I und II; Ovarialdysgenesie 1; Ovarioleukodystrophie; Pachyonychia congenita 4 und Typ 2; Paget-Knochenkrankheit, familiär; Pallister-Hall-Syndrom; Palmoplantare Keratodermie, nicht-pidermolytisch, fokal oder diffus; Pankreas-Agenesie und angeborene Herzfehler; Papillon-Lefevre-Syndrom; Paragangliome 3; Paramyotonia congenita von Eulenburg; Nebenschilddrüsenkarzinom; Parkinson-Krankheit 14, 15, 19 (juvenil beginnend), 2, 20 (früh beginnend), 6, (autosomal-rezessiv, früh einsetzend, und 9; partieller Albinismus; partieller Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Mangel; gemusterte Dystrophie des retinalen Pigmentepithels ; PC-K6a; Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit; Pendred-Syndrom; Periphere demyelinisierende Neuropathie, zentrale Dysmyelinisierung; Morbus Hirschsprung; Permanenter neonataler Diabetes mellitus; Diabetes mellitus, permanenter Neugeborenen mit neurologischen Merkmalen; Neugeborener insulinabhängiger Diabetes mellitus; Altersdiabetes von junge, Typ 2; Peroxisom-Biogenesestörung 14B, 2A, 4A, 5B, 6A, 7A und 7B; Perrault-Syndrom 4; Perry-Syndrom; Persistierende hyperinsulinämische Hypoglykämie im Säuglingsalter; familiärer Hyperinsulinismus; Phänotypen; Phenylketonurie; Phäochromozytom; Hereditäres Paragangliom .-Phäochromozytom Syndrome; Paragangliome 1; Karzinoider Darmtumor; Cowden-Syndrom 3; Phosphoglycerat-Dehydrogenase-Mangel; Phosphoglycerat-Kinase 1 de fizienz; Lichtempfindliche Trichothiodystrophie; Phytansäurespeicherkrankheit; Pick-Krankheit; Pierson-Syndrom; pigmentäre Netzhautdystrophie; Pigmentierte noduläre Nebennierenrindenerkrankung, primär, 1; Pilomatrixom; Pitt-Hopkins-Syndrom; Hypophysenabhängiger Hypercortisolismus; Hypophysenhormonmangel, kombiniert 1, 2, 3 und 4; Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-Typ-1-Mangel; Plasminogenmangel, Typ I; Blutungsstörung vom Thrombozytentyp 15 und 8; Poikilodermie, erbliche Fibrose mit Sehnenkontrakturen, Myopathie und Lungenfibrose; Polyzystische Nierenerkrankung 2, adulter Typ und infantiler Typ; Polyzystische lipomembranöse Osteodysplasie mit sklerosierender Leukenzephalopathie; Polyglucosan-Körper-Myopathie 1 mit oder ohne Immunschwäche; Polymikrogyrie, asymmetrisch, bilateral frontoparietal; Polyneuropathie, Hörverlust, Ataxie, Retinitis pigmentosa und Katarakt; Pontozerebelläre Hypoplasie Typ 4; Popliteal-Pterygium-Syndrom; Porenzephalie 2; Porokeratose 8, disseminierter oberflächlicher aktinischer Typ; Porphobilinogen-Synthase-Mangel; Porphyria cutanea tarda; Ataxie der hinteren Säule mit Retinitis pigmentosa; Posteriorer Polarkatarakt Typ 2; Prader-Willi-ähnliches Syndrom; vorzeitiges Ovarialversagen 4, 5, 7 und 9; Primäre autosomal-rezessive Mikrozephalie 10, 2, 3 und 5; Primäre Ziliardyskinesie 24; Primäre dilatative Kardiomyopathie; Linksventrikuläre Nichtverdichtung 6; 4, linksventrikuläre Nichtverdichtung 10; paroxysmales Vorhofflimmern; Primäre Hyperoxalurie, Typ I, Typ und Typ III; Primäre hypertrophe Osteoarthropathie, autosomal-rezessiv 2; Primäre Hypomagnesiämie; Primäres Offenwinkelglaukom juveniler Beginn 1; Primäre pulmonale Hypertonie; Primel-Syndrom; Progressiver familiärer Herzblock Typ 1B; Progressive familiäre intrahepatische Cholestase 2 und 3; Progressive intrahepatische Cholestase; Progressive Myoklonus-Epilepsie mit Ataxie; Progressive pseudorheumatoide Dysplasie; Progressive sklerosierende Poliodystrophie; Prolidase-Mangel; Prolin-Dehydrogenase-Mangel; Schizophrenie 4; Properdin-Mangel, X-chromosomal; Propionische Wissenschaft; Proproteinkonvertase 1/3-Mangel; Prostatakrebs, erblich, 2; Protan-Defekt; Proteinurie; Finnisches angeborenes nephrotisches Syndrom; Proteus-Syndrom; Brust-Adenokarzinom; Pseudoachondroplastisches spondyloepiphysäres Dysplasie-Syndrom; Pseudohypoaldosteronismus Typ 1 autosomal dominant und rezessiv und Typ 2; Pseudohypoparathyreoidismus Typ 1A, Pseudopseudohypoparathyreoidismus; Pseudoneonatale Adrenoleukodystrophie; Pseudoprimärer Hyperaldosteronismus; Pseudoxanthoma elasticum; generalisierte arterielle Verkalkung des Säuglingsalters 2; Pseudoxanthoma elasticum-ähnliche Erkrankung mit multiplem Gerinnungsfaktormangel; Psoriasis-Anfälligkeit 2; PTEN-Hamartom-Tumorsyndrom; Pulmonale arterielle Hypertonie im Zusammenhang mit hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie; Lungenfibrose und/oder Knochenmarkversagen, Telomerbezogen, 1 und 3; Pulmonale Hypertonie, primär, 1 mit hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie; Purin-Nukleosid-Phosphorylase-Mangel; Pyruvat-Carboxylase-Mangel; Pyruvatdehydrogenase E1-alpha-Mangel; Pyruvatkinase-Mangel der roten Blutkörperchen; Raine-Syndrom; Rasopathie; Rezessive dystrophische Epidermolysis bullosa; Nagelstörung, nicht-syndromal angeboren, 8; Reifenstein-Syndrom; Nierenadysplasie; Nieren-Carnitin-Transportdefekt; Nieren-Kolobom-Syndrom; Nierendysplasie; Nierendysplasie, retinale Pigmentdystrophie, zerebelläre Ataxie und Skelettdysplasie; Nierentubuläre Azidose, distal, autosomal-rezessiv, mit spät einsetzendem sensorineuralem Hörverlust oder mit hämolytischer Anämie; Nierentubuläre Azidose, proximal, mit Augenanomalien und geistiger Behinderung; Netzhautzapfendystrophie 3B; Retinitis pigmentosa; Retinitis pigmentosa 10, 11, 12, 14, 15, 17 und 19; Retinitis pigmentosa 2, 20, 25, 35, 36, 38, 39, 4, 40, 43, 45, 48, 66, 7, 70, 72; Retinoblastom; Rett-Störung; Rhabdoides Tumorprädispositionssyndrom 2; Rhegmatogene Netzhautablösung, autosomal-dominant; Rhizomelische Chondrodysplasie punctata Typ 2 und Typ 3; Roberts-SC-Phokomelie-Syndrom; Robinow-Sorauf-Syndrom; Robinow-Syndrom, autosomal-rezessiv, autosomal-rezessiv, mit Brachy-Syn-Polydaktylie; Rothmund-Thomson-Syndrom; Rapadilino-Syndrom; RRM2B-bedingte mitochondriale Erkrankung; Rubinstein-Taybi-Syndrom; Salla-Krankheit; Sandhoff-Krankheit, erwachsene und infantile Typen; Sarkoidose, früh einsetzend; Blau-Syndrom; Schindler-Krankheit, Typ 1; Schizenzephalie; Schizophrenie 15; Schneckenbecken-Dysplasie; Schwannomatose 2; Schwartz-Jampel-Syndrom Typ 1; Sklerocomea, autosomal-rezessiv; Sklerosteose; Sekundäre Hypothyreose; Segawa-Syndrom, autosomal-rezessiv; Senior-Loken-Syndrom 4 und 5; sensorische ataktische Neuropathie, Dysarthrie und Ophthalmoparese; Sepiapterin-Reduktase-Mangel; SeSAME-Syndrom; Schwere kombinierte Immunschwäche aufgrund eines ADA-Mangels mit Mikrozephalie, Wachstumsverzögerung und Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung, atypisch, autosomal-rezessiv, T-Zell-negativ, B-Zell-positiv, NK-Zell-negativ oder NK-positiv; schwere angeborene Neutropenie; Schwere angeborene Neutropenie 3, autosomal-rezessiv oder dominant; schwere angeborene Neutropenie 6, autosomal-rezessiv; schwere myoklonische Epilepsie im Säuglingsalter; generalisierte Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus Typ 1 und 2; schwere X-chromosomale myotubuläre Myopathie; Kurzes QT-Syndrom 3; Kleinwuchs mit unspezifischen Skelettanomalien; Kleinwuchs, Gehörgangsatresie, Unterkieferhypoplasie, Skelettanomalien; Kleinwuchs, Onychodysplasie, Gesichtsdysmorphie und Hypotrichose; ursprünglicher Zwergwuchs; Kurzrippen-Thoraxdysplasie 11 oder 3 mit oder ohne Polydaktylie; Sialidose Typ I und II; Silberspastisches Paraplegie-Syndrom; verlangsamte Nervenleitgeschwindigkeit, autosomal-dominant; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; Snyder-Robinson-Syndrom; somatotropes Adenom; Prolaktinom; familiäre, Hypophysenadenom-Veranlagung; Sotos-Syndrom 1 oder 2; Spastische Ataxie 5, autosomal-rezessiv, Charlevoix-Saguenay-Typ, 1,10 oder 11, autosomal-rezessiv; Amyotrophe Lateralsklerose Typ 5; Spastische Paraplegie 15, 2, 3, 35, 39, 4, autosomal-dominant, 55, autosomal-rezessiv und 5A; Gallensäuresynthesedefekt, angeboren, 3; Spermatogenes Versagen 11, 3 und 8; Sphärozytose Typ 4 und 5; Sphäroid-Körper-Myopathie; Spinale Muskelatrophie, untere Extremität überwiegend 2, autosomal-dominant; Spinale Muskelatrophie, Typ II; Spinozerebelläre Ataxie 14, 21, 35, 40 und 6; Spinozerebelläre Ataxie autosomal-rezessiv 1 und 16; Milzhypoplasie; Spondylokarpotarsales Synostose-Syndrom; Spondylocheirodysplasie, Ehlers-Danlos-Syndromähnlich, mit Immundysregulation, Aggrecan-Typ, mit angeborenen Gelenkluxationen, kurzer Gliedmaßen-Hand-Typ, Sedaghatian-Typ, mit Zapfen-Stäbchen-Dystrophie und Kozlowski-Typ; Parastremmatischer Zwergwuchs; Stargardt-Krankheit 1; Kegel-Stäbchen-Dystrophie 3; Stickler-Syndrom Typ 1; Kniest-Dysplasie; Stickler-Syndrom, Typ 1 (nicht-syndromales Auge) und 4; Stich-assoziierte Vaskulopathie, infantiler Beginn; Stormorken-Syndrom; Sturge-Weber-Syndrom, kapillare Fehlbildungen, angeboren, 1; Succinyl-CoA-Acetoacetat-Transferase-Mangel; Saccharase-Isomaltase-Mangel; Plötzlichen Kindstod; Sulfitoxidase-Mangel, isoliert; supravalvare Aortenstenose; Dysfunktion des Tensidstoffwechsels, pulmonal, 2 und 3; Symphalangismus, proximal, 1b; Syndaktylie Typ Cenani Lenz; Syndaktylie Typ 3; Syndromische X-chromosomale geistige Behinderung 16; Talipes Equinovarus; Tangier-Krankheit; TARP-Syndrom; Tay-Sachs-Krankheit, B1-Variante, Gm2-Gangliosidose (Erwachsene), Gm2-Gangliosidose (Erwachsenenbeginn); Temtamy-Syndrom; Tenorio-Syndrom; Terminale knöcherne Dysplasie; Testosteron-17-beta-Dehydrogenase-Mangel; Tetraamelie, autosomal-rezessiv; Fallot-Tetralogie; Hypoplastisches Linksherzsyndrom 2; Truncus arteriosus; Fehlbildung des Herzens und der großen Gefäße; Ventrikelseptumdefekt 1; Thiel-Behnke-Hornhautdystrophie; Thoraxaortenaneurysmen und Aortendissektionen; Marfanoider Habitus; Drei-M-Syndrom 2; Thrombozytopenie, Thrombozytendysfunktion, Hämolyse und unausgewogene Globinsynthese; Thrombozytopenie, X-chromosomal; Thrombophilie, erblich, aufgrund von Protein-C-Mangel, autosomal-dominant und rezessiv; Schilddrüsen-Agenesie; Schilddrüsenkrebs, follikulär; Schilddrüsenhormonstoffwechsel, abnormal; Schilddrüsenhormonresistenz, generalisiert, autosomal-dominant; Thyreotoxische periodische Paralyse und Thyreotoxische periodische Paralyse 2; Thyrotropin-Releasing-Hormon-Resistenz, generalisiert; Timothy-Syndrom; TNF-Rezeptor-assoziiertes periodisches Fiebersyndrom (TRAPS); Zahnagenesie, selektiv, 3 und 4; Torsades de pointes; Townes-Brocksbranchiootorenal-ähnliches Syndrom; Vorübergehende bullöse Dermolyse des Neugeborenen; Treacher-Collins-Syndrom 1; Trichomegalie mit geistiger Behinderung, Zwergwuchs und Pigmentdegeneration der Netzhaut; Trichorhinophalangeale Dysplasie Typ I; Trichorhinophalangeales Syndrom Typ 3; Trimethylaminurie; Syndrom der tuberösen Sklerose; Lymphangiomyomatose; Tuberöse Sklerose 1 und 2; Tyrosinase-negativer okulokutaner Albinismus; Tyrosinase-positiver okulokutaner Albinismus; Tyrosinämie Typ I; UDP-Glucose-4-Epimerase-Mangel; Ullrich angeborene Muskeldystrophie; Fehlen von Ulna und Fibula bei schwerem Gliedmaßenmangel; Upshaw-Schulman-Syndrom; Urocanathydratase-Mangel; Usher-Syndrom, Typ 1, 1B, 1D, 1G, 2A, 2C und 2D; Retinitis pigmentosa 39; UV-sensitives Syndrom; Van-der-Woude-Syndrom; Van-Maldergem-Syndrom 2; Hennekam-Lymphangiektasie-Lymphödem-Syndrom 2; Variegate-Porphyrie; Ventrikulomegalie mit zystischer Nierenerkrankung; Verheij-Syndrom; Mangel an sehr langkettiger Acyl-CoA-Dehydrogenase; vesikoureteraler Reflux 8; Viszerale Heterotaxie 5, autosomal; Viszerale Myopathie; Vitamin-D-abhängige Rachitis, Typ 1 und 2; Vitelliforme Dystrophie; von Willebrand-Krankheit Typ 2M und Typ 3; Waardenburg-Syndrom Typ 1, 4C und 2E (mit neurologischer Beteiligung); Klein-Waardenberg-Syndrom; angeborene Muskeldystrophie Walker-Warburg; Warburg-Mikrosyndrom 2 und 4; Warzen, Hypogammaglobulinämie, Infektionen und Myelokathexis; Weaver-Syndrom; Weill-Marchesani-Syndrom 1 und 3; Weill-Marchesani-ähnliches Syndrom; Weißenbacher-Zweymüller-Syndrom; Werdnig-Hoffmann-Krankheit; Charcot-Marie-Tooth-Krankheit; Werner-Syndrom; WFS1-bezogene Störungen; Wiedemann-Steiner-Syndrom; Wilson-Krankheit; Wolfram-ähnliches Syndrom, autosomal-dominant; Wert-Krankheit; Van-Buchem-Krankheit Typ 2; Xeroderma pigmentosum, Komplementierungsgruppe b, Gruppe D, Gruppe E und Gruppe G; X-chromosomale Agammaglobulinämie; X-chromosomale hereditäre motorische und sensorische Neuropathie; X-chromosomale Ichthyose mit Steryl-Sulfatase-Mangel; X-chromosomale periventrikuläre Heterotopie; Oto-palato-digitales Syndrom, Typ I; X-chromosomal schwere kombinierte Immunschwäche; Zimmermann-Laband-Syndrom und Zimmermann-Laband-Syndrom 2; und Zonulärer pulverförmiger Katarakt 3.
  • In einem besonderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung TPRT-basierte Verfahren zur Behandlung eines Patienten bereit, bei dem eine Expansions-Repeat-Erkrankung (auch bekannt als Repeat-Expansions-Erkrankung oder Trinukleotid-Repeat-Erkrankung) diagnostiziert wurde. Expansions-Repeat-Erkrankungen treten auf, wenn Mikrosatelliten-Wiederholungen über eine Schwellenlänge hinaus expandieren. Derzeit wird angenommen, dass mindestens 30 genetische Krankheiten durch Repeat-Expansionen verursacht werden. Das wissenschaftliche Verständnis dieser vielfältigen Gruppe von Erkrankungen kam in den frühen 1990er Jahren mit der Entdeckung ans Licht, dass Trinukleotid-Repeats mehreren wichtigen Erbkrankheiten zugrunde liegen, darunter Fragiles-X-Syndrom, Spinobulbäre Muskelatrophie Typ Kennedy, Myotone Dystrophie und Huntington-Krankheit (Nelson et al. „The unstable repeats - three evolving faces of neurological disease“, Neuron, 6. März 2013, Vol. 77; 825-843, die in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind), sowie Haw-River-Syndrom, Jacobsen-Syndrom, Dentatorubro-Pallidoluysische Atrophie (DRPLA), Machado-Joseph-Krankheit, Synpolydaktylie (SPD II), Hand-Fuß-Genitalsyndrom (HFGS), Kleidokraniale Dysplasie (CCD), Holoprosenzephalie-Erkrankung (HPE), angeborenes zentrales Hypventilationssyndrom (CCHS), ARX-nicht-syndromale X-chromosomale mentale Retardierung (XLMR) und okulopharyngeale Muskeldystrophie (OPMD) (siehe Es wurde festgestellt, dass die wiederholte Instabilität von Mikrosatelliten ein Kennzeichen dieser Bedingungen ist, ebenso wie die Antizipation - das Phänomen, bei dem mit jeder nachfolgenden Generation eine Repeat-Expansion auftreten kann, was zu einem schwereren Phänotyp und einem früheren Erkrankungsalter bei den Nachkommen führt. Es wird angenommen, dass Repeat-Expansionen über verschiedene Mechanismen Krankheiten verursachen. Expansionen können nämlich die zelluläre Funktion auf der Ebene des Gens, des mRNA-Transkripts und/oder des codierten Proteins beeinträchtigen. Unter einigen Bedingungen wirken Mutationen über einen Mechanismus des Funktionsverlusts, indem sie Gene, die Repeats enhalten, ausschalten. Unter anderen Bedingungen resultieren die Erkrankungen aus Gain-of-Function-Mechanismen, wobei entweder das mRNA-Transkript oder das Protein neue, abweichende Funktionen übernimmt.
  • In einer Ausführungsform ist ein Verfahren zur Behandlung einer Trinukleotid-Repeat-Erkrankung in 23 abgebildet. Im Allgemeinen beinhaltet der Ansatz die Verwendung von TPRT-Genom-Editierung in Kombination mit einer verlängerten gRNA, die eine Region umfasst, die eine gewünschte und gesunde Ersatz-Trinukleotid-Repeat-Sequenz codiert, die die endogene kranke Trinukleotid-Repeat-Sequenz durch den Mechanismus des Prime-Editing-Prozesses ersetzen soll. Eine schematische Darstellung des gRNA-Designs für die Kontraktion von Trinukleotid-Repeat-Sequenzen und die Trinukleotid-Repeat-Kontraktion mit TPRT-Genom-Editierung ist in 23 gezeigt.
  • Die Trinukleotid-Repeat-Expansion wird mit einer Reihe von menschlichen Erkrankungen assoziiert, einschließlich der Huntington-Krankheit, des Fragiles-X-Syndroms und der Friedreich-Ataxie. Das häufigste Trinukleotid-Repeat enthält CAG-Tripletts, obwohl auch GAA-Tripletts (Friedreich-Ataxie) und CGG-Tripletts (Fragiles-X-Syndrom) vorkommen. Die Vererbung einer Veranlagung zur Expansion oder zum Erwerb eines bereits expandierten elterlichen Allels erhöht die Wahrscheinlichkeit, die Krankheit zu bekommen. Pathogene Expansionen von Trinukleotid-Repeats könnten hypothetisch unter Verwendung von Prime Editing korrigiert werden.
  • Eine Region stromaufwärts der Repeat-Region kann von einer RNA-geleiteten Nuklease genickt und dann verwendet werden, um die Synthese eines neuen DNA-Strangs zu primen, der eine gesunde Anzahl von Wiederholungen enthält (was von dem jeweiligen Gen und der jeweiligen Krankheit abhängt), gemäß dem allgemeinen in 1E und 22 umrissenem Mechanismus. Nach der Repeat-Sequenz wird ein kurzer Homologieabschnitt hinzugefügt, der mit der Identität der Sequenz neben dem anderen Ende des Repeats (roter Strang) übereinstimmt. Die Invasion des neu synthetisierten Strangs durch das TPRT-System und der anschließende Austausch der endogenen DNA durch den neu synthetisierten Flap führt zu einem kontrahierten Wiederholungsallel. Der Begriff „kontrahiert“ bezeichnet eine Verkürzung der Länge der Nukleotid-Repeat-Region, was zu einer Reparatur der Trinukleotid-Repeat-Region führt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die gewünschte Nukleotidänderung eine einzelne Nukleotidsubstitution (z. B. Transition oder eine Transversionsänderung), eine Deletion oder eine Insertion sein. Beispielsweise kann die gewünschte Nukleotidänderung (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C-Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C-Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A-zu-C-Substitution sein.
  • In anderen Ausführungsformen kann die gewünschte Nukleoidänderung (1) ein G:C-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T:A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T.Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar umwandeln.
  • In noch anderen Ausführungsformen führt das Verfahren eine gewünschte Nukleotidänderung ein, bei der es sich um eine Insertion handelt. In bestimmten Fällen ist die Insertion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In anderen Ausführungsformen führt das Verfahren eine gewünschte Nukleotidänderung ein, bei der es sich um eine Deletion handelt. In anderen Fällen ist die Deletion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In verschiedenen Ausführungsformen korrigiert die gewünschte Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen. Das krankheitsassoziierte Gen kann mit einer monogenetischen Störung assoziiert sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase(ADA)-Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie; Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirupkrankheit; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose-Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylkeoturie; schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellenanämie; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; und Tay-Sachs-Krankheit. In anderen Ausführungsformen kann das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Erkrankung assoziiert sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit; hoher Blutdruck; Alzheimerkrankheit; Arthritis; Diabetes; Krebs; und Fettleibigkeit.
  • Die Zielnukleotidsequenz kann eine Zielsequenz (z. B. eine Punktmutation) umfassen, die mit einer Krankheit, Erkrankung oder einem Leiden assoziert ist. Die Zielsequenz kann eine T zu C (oder A zu G)-Punktmutation umfassen, die mit einer Krankheit, Erkrankung oder einem Leiden assoziiert ist, wobei die Desaminierung der mutierten C-Base zu einer durch eine Fehlpaarungsreparatur vermittelten Korrektur einer Sequenz führt, die mit einer Krankheit, Erkrankung oder einem Leiden assoziiert ist. Die Zielsequenz kann eine G zu A (oder C zu T)-Punktmutation umfassen, die mit einer Krankheit, Erkrankung oder einem Leiden assoziiert ist, wobei die Desaminierung der mutierten A-Base zu einer durch eine Fehlpaarungsreparatur vermittelten Korrektur einer Sequenz führt, die nicht mit einer Krankheit, Erkrankung oder einem Leiden assoziiert ist. Die Zielsequenz kann ein Protein codieren, wobei sich die Punktmutation in einem Codon befindet und zu einer Änderung der Aminosäure führt, die durch das mutierte Codon im Vergleich zu einem Wildtyp-Codon codiert wird. Die Zielsequenz kann sich auch an einer Spleißstelle befinden, und die Punktmutation führt zu einer Änderung des Spleißens eines mRNA-Transkripts im Vergleich zu einem Wildtyp-Transkript. Außerdem kann sich das Ziel an einer nicht-codierenden Sequenz eines Gens befinden, wie etwa einem Promotor, und die Punktmutation führt zu einer erhöhten oder verringerten Expression des Gens.
  • Somit führt in einigen Aspekten die Desaminierung einer Mutante C zu einer Änderung der Aminosäure, die durch das mutierte Codon codiert wird, was in einigen Fällen zur Expression einer Wildtyp-Aminosäure führen kann. In anderen Aspekten führt die Desaminierung einer Mutante A zu einer Änderung der Aminosäure, die durch das mutierte Codon codiert wird, was in einigen Fällen zur Expression einer Wildtyp-Aminosäure führen kann.
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Verfahren, die das Kontaktieren einer Zelle mit einer Zusammensetzung oder einem rAAV-Partikel beinhalten, können in vitro, ex vivo oder in vivo erfolgen. In bestimmten Ausführungsformen erfolgt der Schritt des Kontaktierens in einem Subjekt. In bestimmten Ausführungsformen wurde bei dem Subjekt eine Krankheit, Erkrankung oder ein Leiden diagnostiziert.
  • In einigen Ausführungsformen beinhalten die in dieser Schrift offenbarten Verfahren das Kontaktieren einer Säugetierzelle mit einer Zusammensetzung oder einem rAAV-Partikel. In bestimmten Ausführungsformen beinhalten die Verfahren das Kontaktieren einer Netzhautzelle, Kortikaliszelle oder Kleinhimzelle.
  • Das getrennte Cas9-Protein oder der getrennte Prime-Editor, das bzw. der unter Verwendung der in dieser Schrift beschriebenen Verfahren zugeführt wird, weist vorzugsweise eine vergleichbare Aktivität im Vergleich zum ursprünglichen Cas9-Protein oder Prime-Editor auf (d. h. ein ungeteiltes Protein, das einer Zelle zugeführt oder in einer Zelle als Ganzes exprimiert wird). Zum Beispiel behält das getrennte Cas9-Protein oder der getrennte Prime-Editor mindestens 50 % (z. B. 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 %) der Aktivität des ursprünglichen Cas9-Proteins oder des Prime-Editors bei. In einigen Ausführungsformen ist das getrennte Cas9-Protein oder der getrennte Prime-Editor aktiver (z. B. 2-fach, 5-fach, 10-fach, 100-fach, 1000-fach oder mehr) als das ursprüngliche Cas9-Protein oder der ursprüngliche Prime-Editor.
  • Die in dieser Schrift beschriebenen Zusammensetzungen können einem Patienten, der dies benötigt, in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Behandlung von verabreicht werden und/oder eine Krankheit oder Erkrankung zu verhindern, an der das Subjekt leidet. Jede Krankheit oder Erkrankung, die mit CRISPR/Cas9-basierter Genom-Editierungstechnologie behandelt werden und/oder verhindert kann, kann mit dem in dieser Schrift beschriebenen getrennten Cas9-Protein oder getrennten Prime-Editor behandelt werden. Es versteht sich, dass, wenn die Nukleotidsequenzen, die das getrennte Cas9-Protein oder den Prime-Editor codieren, eine gRNA nicht weiter codieren, ein separater Nukleinsäurevektor, der die gRNA codiert, zusammen mit den in dieser Schrift beschriebenen Zusammensetzungen verabreicht werden kann.
  • Beispielhafte geeignete Krankheiten, Erkrankungen oder Leiden beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, die Krankheit oder Erkrankung, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Mukoviszidose, Phenylketonurie, epidermolytische Hyperkeratose (EHK), chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Charcot-Marie-Toot-Krankheit Typ 4J, Neuroblastom (NB), von Willebrand-Krankheit (vWD), angeborene Myotonie, hereditäre renale Amyloidose, dilatative Kardiomyopathie, hereditäres Lymphödem, familiäre Alzheimerkrankheit, Prionenerkrankung, chronisches infantiles neurologisches kutanes Gelenksyndrom (CINCA), angeborene Taubheit, Niemann-Pick-Krankheit Typ C (NPC) und Desmin-bedingte Myopathie (DRM). In bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei der Krankheit oder dem Leiden um die Niemann-Pick-Krankheit Typ C (NPC).
  • In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit, Erkrankung oder das Leiden mit einer Punktmutation in einem NPC-Gen, einem DNMTI-Gen, einem PCSK9-Gen oder einem TMC1-Gen assoziiert. In bestimmten Ausführungsformen ist die Punktmutation eine T3182C-Mutation in NPC, die zu einer I1061T-Aminosäuresubstitution führt.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist die Punktmutation eine A545G-Mutation in TMC1, die zu einer Y182C-Aminosäuresubstitution führt. TMC1 codiert für ein Protein, das mechanosensitive Ionenkanäle in sensorischen Haarzellen des Innenohrs bildet und für eine normale Hörfunktion benötigt wird. Die Aminosäuresubstitution Y182C ist mit angeborener Taubheit assoziiert.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit, Erkrankung oder das Leiden mit einer Punktmutation assoziiert, die ein Stopcodon erzeugt, beispielsweise ein vorzeitiges Stopcodon innerhalb der codierenden Region eines Gens.
  • Weitere beispielhafte Krankheiten, Erkrankungen und Leiden umfassen Mukoviszidose (siehe z. B. Schwank et al., Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013; 13: 653-658; und Wu et. al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013; 13: 659-662, wobei keiner von beiden ein Deaminasefusionsprotein zum Korrigieren des Gendefekts verwendet); Phenylketonuria - z. B. Mutation von Phenylalanin zu Serin an Position 835 (Maus) oder 240 (Mensch) oder ein homologer Rest im Phenylalanine-Hydroxylase-Gene (T>C Mutation) - siehe z. B. McDonald et al., Genomics. 1997; 39:402-405; Bernard-Soulier-Syndrom (BSS) - z. B. Mutation von Phenylalanin zu Serin an Position 55 oder einem homologen Rest oder Cystein zu Arginin an Rest 24 oder einem homologen Rest im Thrombozytenmembran-Glykoprotein IX (T>C-Mutation) - siehe z. B. Noris et al., British Journal of Haematology. 1997; 97: 312-320, and Ali et al., Hematol. 2014; 93: 381-384; epidermolytische Hyperkeratosis (EHK) - z. B. Leucin-zu-Prolin-Mutation an Position 160 oder 161 (wenn das Initiator-Methionin gezählt wird) oder ein homologer Rest in Keratin 1 (T>C-Mutation) - siehe z. B. Chipev et al., Cell. 1992; 70: 821-828, siehe auch Zugangsnummer P04264 in der UNIPROT-Datenbank unter www.uniprot.org; Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) - z. B. Leucin-zu-Prolin-Mutation an Position 54 oder 55 (wenn das Initiator-Methionin gezählt wird) oder ein homologer Rest in der verarbeiteten Form von a1-Antitrypsin oder Rest 78 in der nicht verarbeiteten Form oder ein homologer Rest (T>C-Mutation) - siehe z. B. Poller et al., Genomics. 1993; 17: 740-743, siehe auch Zugangsnummer P01011 in der UNIPROT-Datenbank; Charcot-Marie-Toot-Krankheit Typ 4J - z. B. Isoleucin-zu-Threonin-Mutation an Position 41 oder ein homologer Rest in 4 (T>C-Mutation) - siehe z. B. Lenk et al., PLoS Genetics. 2011; 7: e1002104; Neuroblastom (NB) - z. B., Leucin-zu-Prolin-Mutation an Position 197 oder ein homologer Rest in Caspase-9 (T>C-Mutation) - siehe z. B. Kundu et al., 3 Biotech. 2013, 3:225-234; von Willebrand-Krankheit (vWD) - z. B. Cystein-Arginin-Mutation an Position 509 oder ein homologer Rest in der prozessierten Form des von-Willebrand-Faktors oder an Position 1272 oder ein homologer Rest in der unverarbeiteten Form des von-Willebrand-Faktors (T>C-Mutation) - siehe z. B. Lavergne et al., Br. J. Hämatol. 1992, siehe auch Zugangsnummer P04275 in der UNIPROT-Datenbank; 82: 66-72; Angeborene Myotonie - z. B. Mutation von Cystein zu Arginin an Position 277 oder ein homologer Rest im Muskelchloridkanal-Gen CLCN1 (T>C Mutation) - siehe z. B. Weinberger et al., The J. ofPhysiology. 2012; 590: 3449-3464; hereditäre renale Amyloidose - z. B. Stopcodonzu-Arginin-Mutation an Position 78 oder ein homologer Rest in der verarbeiteten Form von Apolipoprotein All oder an Position 101 oder ein homologer Rest in der nicht verarbeiteten Form (T>C Mutation) - siehe z. B. Yazaki et al., Kidney Int. 2003; 64: 11-16; dilatative Kardiomyopathie (DCM) - z. B. Tryptophan-zu-Arginin-Mutation an Position 148 oder ein homologer Rest im FOXD4-Gen (T>C Mutation), siehe z. B. Minoretti et. al., Int. J. of Mol. Med.2007; 19: 369-372; hereditäres Lymphödem - z. B. Histidin-Arginin-Mutation an Position 1035 oder ein homologer Rest in der VEGFR3-Tyrosinkinase (A>G Mutation), siehe z. B. Irrthum et al. , Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 295-301; familiäre Alzheimerkrankheit - z. B. Isoleucin-zu-Valin-Mutation an Position 143 oder ein homologer Rest in Presenilin1 (A>G Mutation), siehe z. B. Gallo et. al., J. Alzheimer's Disease. 2011; 25: 425-431; Prionenerkrankung - z. B. Methioninzu-Valin-Mutation an Position 129 oder ein homologer Rest im Prionprotein (A>G Mutation) - siehe z. B. Lewis et. al., J. of General Virology. 2006; 87: 2443-2449; Chronisches infantiles neurologisches kutanes Gelenksyndrom (CINCA) - z. B. Tyrosin-Cystein-Mutation an Position 570 oder ein homologer Rest in Cryopyrin (A>G Mutation) - siehe z. B. Fujisawa et. al. Blood. 2007; 109: 2903-2911; und Desmin-bedingte Myopathie (DRM) - z. B. Arginin-zu-Glycin-Mutation an Position 120 oder ein homologer Rest in aβ-Kristallin (A>G Mutation) - siehe z. B. Kumar et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 24137-24141. Der gesamte Inhalt aller Literaturhinweise und Datenbankeinträge wird in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen.
  • V. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Andere Aspekte der vorliegenden Offenbarung betreffen pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine der verschiedenen Komponenten des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-Systems umfassen (z. B. einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, die napDNAbps, reverse Transkriptasen, Fusionsproteine (z. B. napDNAbps und Reverse Transkriptasen umfassend), Prime-Editor-Leit-RNAs, Zweitstrang-Nicking-Leit-RNAs und Komplexe bestehend aus Fusionsproteinen und Prime-Editor-Leit-RNAs, sowie akzessorische Elemente, wie etwa Zweitstrang-Nicking-Komponenten und 5'-endogene DNA-Flap-Entfernung/Endonukleasen zur Unterstützung des Prime-Editing-Proyesses hin zur editierten Produktbildung). Solche Zusammensetzungen können PE1, PE2, PE3 oder PE3b beinhalten.
  • Der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung“, wie er in dieser Schrift verwendet wird, bezeichnet eine Zusammensetzung, die zur pharmazeutischen Verwendung formuliert ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger. In einigen Ausführungsformen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzliche Mittel (z. B. zur spezifischen Zuführung, Erhöhung der Halbwertszeit oder andere therapeutische Verbindungen).
  • Wie in dieser Schrift verwendet, bezeichnet der Begriff „pharmazeutisch annehmbarer Träger“ ein pharmazeutisch akzeptables Material, eine Zusammensetzung oder ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel, wie etwa ein flüssiger oder fester Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, ein Hilfsstoff, ein Herstellungshilfsmittel (z. B. Schmiermittel, Talkum-, Magnesium-, Calcium- oder Zinkstearat oder Sterinsäure) oder lösungsmittelverkapselndes Material, das am Tragen oder Transportieren der Verbindung von einer Stelle (z. B. der Zuführungsstelle) des Körpers zu einer anderen Stelle (z. B. Organ, Gewebe oder Körperteil) beteiligt ist. Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger ist „akzeptabel“ in dem Sinne, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und das Gewebe des Subjekts nicht schädigt (z. B. physiologisch kompatibel, steril, physiologischer pH-Wert usw.). Einige Beispiele für Materialien, die als pharmazeutisch annehmbare Träger dienen können, beinhalten: (1) Zucker, wie etwa Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, wie etwa Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Zellulose und deren Derivate, wie etwa Natriumcarboxymethylzellulose, Methylzellulose, Ethylzellulose, mikrokristalline Zellulose und Zelluloseacetat; (4) pulverisierter Traganth; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Schmiermittel, wie etwa Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk; (8) Hilfsstoffe, wie etwa Kakaobutter und Zäpfchenwachse; (9) Öle, wie etwa Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojabohnenöl; (10) Glykole, wie Propylenglykol; (11) Polyole, wie etwa Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglycol (PEG); (12) Ester, wie etwa Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) pH-gepufferte Lösungen; (21) Polyester, Polycarbonate und/oder Polyanhydride; (22) Füllstoffe wie etwa Polypeptide und Aminosäuren (23) Serumkomponente wie etwa Serumalbumin, HDL und LDL; (22) C2-C12-Alkohole, wie etwa Ethanol; und (23) andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden. Benetzungsmittel, Farbstoffe, Trennmittel, Beschichtungsmittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe, Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidantien können ebenfalls in der Formulierung enthalten sein.
  • Die Begriffe wie „Hilfsstoff“, „Träger“, „pharmazeutisch verträglicher Träger“ oder dergleichen werden in dieser Schrift austauschbar verwendet.
  • In einigen Ausführungsformen wird die pharmazeutische Zusammensetzung zur Zuführung an ein Subjekt formuliert, z. B. zur Gen-Editierung. Geeignete Verabreichungswege der in dieser Schrift beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung beinhalten ohne Einschränkung: topische, subkutane, transdermale, intradermale, intraläsionale, intraartikuläre, intraperitoneale, intravesikale, transmukosale, gingivale, intradentale, intracochleare, transtympanale, intraorganische, epidurale, intrathekale, intramuskuläre, intravenöse, intravaskuläre, intraossäre, periokuläre, intratumorale, intrazerebrale und intrazerebroventrikuläre Verabreichung.
  • In einigen Ausführungsformen wird die in dieser Schrift beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung lokal an eine erkrankte Stelle (z. B. eine Tumorstelle) verabreicht. In einigen Ausführungsformen wird die in dieser Schrift beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung einem Patienten durch Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Zäpfchens oder mittels eines Implantats verabreicht, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht porösen oder gelatineartigen Material, einschließlich einer Membran, wie etwa einer sialastischen Membran, oder einer Faser besteht.
  • In anderen Ausführungsformen wird die in dieser Schrift beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung in einem kontrollierten Freisetzungssystem zugeführt. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (siehe z. B. Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). In einer anderen Ausführungsform können Polymermaterialien verwendet werden. (Siehe z. B. Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball Hrsg., Wiley, New York, 1984); Ranger und Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Siehe auch Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Andere kontrollierte Freigabesysteme werden beispielsweise in Langer erörtert.
  • In einigen Ausführungsformen wird die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Routineverfahren als Zusammensetzung formuliert, die zur intravenösen oder subkutanen Verabreichung an ein Subjekt, z. B. einen Menschen, angepasst ist. In einigen Ausführungsformen sind pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Injektion Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Falls erforderlich, kann das Arzneimittel auch einen solubilisierendes Mittel und ein Lokalanästhetikum wie etwa Lignocain enthalten, um Schmerzen an der Injektionsstelle zu lindern. Im Allgemeinen werden die Inhaltsstoffe entweder separat oder zusammengemischt in Einheitsdosierungsform bereitgestellt, zum Beispiel als trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie etwa einer Ampulle oder einem Beutel, die bzw. der die Wirkstoffmenge anzeigt. Wenn das Arzneimittel durch Infusion verabreicht werden soll, kann es mit einer Infusionsflasche abgegeben werden, die steriles Wasser oder Kochsalzlösung pharmazeutischer Qualität enthält. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser zur Injektion oder Kochsalzlösung bereitgestellt werden, sodass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden können.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur systemischen Verabreichung kann eine Flüssigkeit sein, z. B. eine sterile Kochsalzlösung, Ringer-Laktat- oder Hanks-Lösung. Außerdem kann die pharmazeutische Zusammensetzung in fester Form vorliegen und unmittelbar vor der Verwendung wieder aufgelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einem Lipidpartikel oder Vesikel enthalten sein, wie etwa einem Liposom oder Mikrokristall, das auch für die parenterale Verabreichung geeignet ist. Die Partikel können jede geeignete Struktur aufweisen, wie etwa unilamellar oder plurilamellar, solange Zusammensetzungen darin enthalten sind. Verbindungen können in „stabilisierten Plasmid-Lipid-Partikeln“ (SPLP) eingeschlossen werden, die das fusogene Lipid-Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) enthalten, niedrige Konzentrationen (5 bis 10 mol%) von kationischem Lipid und stabilisiert durch eine Polyethylenglycol(PEG)-Beschichtung (Zhang YP et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47). Positiv geladene Lipide wie etwa N-[1-(2,3-dioleoyloxi)propyl]-N,N,N-trimethyl-amoniummethylsulfat, oder „DOTAP“ sind für solche Partikel und Vesikel besonders bevorzugt. Die Herstellung solcher Lipidpartikel ist gut bekannt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,880,635 ; 4.906.477 ; 4.911.928 ; 4.917.951 ; 4.920.016 ; und 4.921.757 ; jeweils in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Die in dieser Schrift beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung kann beispielsweise als Einheitsdosis verabreicht oder verpackt werden. Der Begriff „Einheitsdosis“, wenn er in Bezug auf eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, bezeichnet physisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosis für den Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die berechnet wird, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder Vehikel, zu erzeugen.
  • Weiterhin kann die pharmazeutische Zusammensetzung als pharmazeutischer Kit bereitgestellt werden, umfassend (a) einen Behälter, der eine Verbindung der Erfindung in lyophilisierter Form enthält, und (b) einen zweiten Behälter, der ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel (z. B. steriles Wasser) zur Injektion enthält. Das pharmazeutisch verträgliche Verdünnungsmittel kann zur Rekonstitution oder Verdünnung der lyophilisierten Verbindung der Erfindung verwendet werden. Optional mit einem oder mehreren solchen Behältern verbunden kann eine Mitteilung in der Form sein, die von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, welche die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Produkten regelt, wobei die Mitteilung die Genehmigung der Herstellungs-, Verwendungs- oder Verkaufsstelle für die menschliche Verabreichung widerspiegelt.
  • In einem anderen Aspekt ist ein Herstellungsartikel enthalten, der Materialien enthält, die zur Behandlung der oben beschriebenen Krankheiten nützlich sind. In einigen Ausführungsformen umfasst der Herstellungsartikel einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter beinhalten beispielsweise Flaschen, Fläschchen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus einer Vielzahl von Materialien wie etwa Glas oder Kunststoff ausgebildet sein. In einigen Ausführungsformen enthält der Behälter eine Zusammensetzung, die zur Behandlung einer in dieser Schrift beschriebenen Krankheit wirksam ist und eine sterile Zugangsöffnung aufweisen kann. Zum Beispiel kann der Behälter ein Beutel mit intravenöser Lösung oder ein Fläschchen mit einem Stöpsel sein, der mit einer Injektionsnadel durchstechbar ist. Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist eine erfindungsgemäße Verbindung. In einigen Ausführungsformen zeigt das sich auf dem Behälter befindliche oder damit verbundene Etikett an, dass die Zusammensetzung zur Behandlung der jeweiligen Krankheit verwendet wird. Der Herstellungsartikel kann ferner einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch verträglichen Puffer umfasst, wie etwa eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, eine Ringer-Lösung oder Dextroselösung. Er kann ferner andere Materialien beinhalten, die aus kommerzieller Sicht und vom Standpunkt des Benutzers wünschenswert sind, einschließlich anderer Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
  • VI. Verfahren zur viralen Zuführung
  • In einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren bereit, die das Zuführen eines oder mehrerer Polynukleotiden, wie etwa eines oder mehrerer Vektoren, die wie in dieser Schrift beschrieben eine oder mehrere Komponenten des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-Systems codieren, eines oder mehrerer Transkripte davon und/oder eines oder mehrerer davon transkribierten Proteine an eine Wirtszelle umfassen. In einigen Aspekten stellt die Erfindung ferner Zellen, die durch solche Verfahren hergestellt werden, und Organismen (wie etwa Tiere, Pflanzen oder Pilze), die solche Zellen umfassen oder daraus hergestellt werden, bereit. In einigen Ausführungsformen wird ein dieser Schrift beschriebener Baseneditor in Kombination mit (und optional komplexiert mit) einer Leitsequenz einer Zelle zugeführt. Herkömmliche Gentransferverfahren auf viraler und nicht-viraler Basis können dazu verwendet werden, Nukleinsäuren in Säugetierzellen oder Zielgewebe einzuführen. Solche Verfahren können dazu verwendet werden, Nukleinsäuren, die Komponenten eines Baseneditors codieren, an Zellen in einer Kultur oder in einem Wirtsorganismus zu verabreichen. Nicht-virale Vektorzuführungssysteme beinhalten DNA-Plasmide, RNA (z. B. ein Transkript eines in dieser Schrift beschriebenen Vektors), nackte Nukleinsäure und Nukleinsäure, die mit einem Zuführungsvehikel, wie etwa einem Liposom, komplexiert ist. Virale Vektorzuführungssysteme beinhalten DNA- und RNA-Viren, die nach Zuführung zu der Zelle entweder episomale oder integrierte Genome aufweisen. Für einen Überblick über Gentherapieverfahren siehe Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler und Bihm (Hrsg.) (1995); und Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
  • Verfahren der nicht-viralen Zuführung von Nukleinsäuren beinhalten Lipofektion, Nukleofektion, Mikroinjektion, Biolistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder lipide Nukleinsäurekonjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und Wirkstoff-verstärkte Aufnahme von DNA. Die Lipofektion ist z. B. in US-Pat. Nr. 5,049,386 , 4,946,787 ; und 4,897,355 ) beschrieben, und Lipofektionsreagenzien werden im Handel verkauft (z. B. Transfectam™ und Lipofectin™). Kationische und neutrale Lipide, die für eine effiziente Lipofektion von Polynukleotiden mit Rezeptorerkennung geeignet sind, beinhalten die von Feigner, WO 91/17424 ; WO 91/16024 . Die Zuführung kann an Zellen (z. B. in vitro- oder ex vivo-Verabreichung) oder Zielgewebe (z. B. in vivo- Verabreichung) erfolgen.
  • Die Vorbereitung von lipiden Nukleinsäurekomplexen, einschließlich zielgerichteter Liposome, wie etwa Immunlipidkomplexe, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); US-Patent Nr. 4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 und 4,946,787 ).
  • Die Verwendung von auf RNA- oder DNA-Viren basierenden Systemen zur Zuführung von Nukleinsäuren nutzt hochentwickelte Prozesse, um ein Virus auf spezifische Zellen im Körper zu richten und die virale Nutzlast zum Zellkern zu transportieren. Virale Vektoren können Patienten direkt verabreicht werden (in vivo) oder sie können verwendet werden, um Zellen in vitro zu behandeln, und die modifizierten Zellen können gegebenenfalls Patienten verabreicht werden (ex vivo). Herkömmliche virale Systeme könnten retrovirale, lentivirale, adenovirale, adenoassoziierte und Herpes-simplex-Virusvektoren für den Gentransfer beinhalten. Die Integration in das Wirtsgenom ist mit den Retrovirus-, Lentivirus- und Adeno-assoziierten Virus-Gentransferverfahren möglich, was oft zu einer Langzeitexpression des eingefügten Transgens führt. Darüber hinaus wurden in vielen verschiedenen Zelltypen und Zielgeweben hohe Transduktionseffizienzen beobachtet.
  • Der Tropismus eines Virus kann durch den Einbau fremder Hüllproteine verändert werden, wodurch die potenzielle Zielpopulation von Zielzellen erweitert wird. Lentivirale Vektoren sind retrovirale Vektoren, die sich nicht teilende Zellen transduzieren oder infizieren können und typischerweise hohe Virustiter produzieren. Die Auswahl eines retroviralen Gentransfersystems würde daher vom Zielgewebe abhängen. Retrovirale Vektoren bestehen aus cis-wirkenden langen terminalen Wiederholungen mit einer Verpackungskapazität von bis zu 6-10 kb Fremdsequenz. Die minimalen cis-wirkenden LTRs reichen für die Replikation und Verpackung der Vektoren aus, die dann verwendet werden, um das therapeutische Gen in die Zielzelle zu integrieren, um eine permanente Transgenexpression bereitzustellen. Weit verbreitete retrovirale Vektoren beinhalten solche, die auf dem Maus-Leukämievirus (MuLV), dem Gibbonaffen-Leukämievirus (GaLV), dem Simian-Immuno-Defizienzvirus (SIV), dem humanen Immunschwächevirus (HIV) und Kombinationen davon basieren (siehe z. B. Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/ US94/05700 ). Bei Anwendungen, bei denen eine vorübergehende Expression bevorzugt wird, können auf Adenovirus basierende Systeme verwendet werden. Vektoren auf Adenovirusbasis sind in vielen Zelltypen zu einer sehr hohen Transduktionseffizienz fähig und erfordern keine Zellteilung. Mit solchen Vektoren ließen sich bereits hohe Titer- und Expressionsniveaus erzielen. Dieser Vektor kann in einem relativ einfachen System in großen Mengen hergestellt werden. Vektoren des Adeno-assoziierten Virus („AAV“) können auch zur Transduktion von Zellen mit Zielnukleinsäuren verwendet werden können, z. Bin der in vitro-Produktion von Nukleinsäuren und Peptiden und für in vivo- und ex vivo-Gentherapieverfahren (siehe z. B. West et al., Virology 160:38-47 (1987); US-Pat. Nr. 4,797,368 ; WO 93/24641 ; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Die Konstruktion rekombinanter AAV-Vektoren wird in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich US-Pat. Nr. 5,173,414 ; Tratschit et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); und Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
  • Verpackungszellen werden typischerweise verwendet, um Viruspartikel zu bilden, die eine Wirtszelle infizieren können. Solche Zellen beinhalten 293-Zellen, die Adenovirus verpacken, und ψ2-Zellen oder PA317-Zellen, die Retrovirus verpacken. Virale Vektoren, die in der Gentherapie verwendet werden, werden normalerweise durch die Herstellung einer Zelllinie erzeugt, die einen Nukleinsäurevektor in ein virales Partikel verpackt. Die Vektoren enthalten typischerweise die minimalen viralen Sequenzen, die für die Verpackung und die anschließende Integration in einen Wirt erforderlich sind, wobei andere virale Sequenzen durch eine Expressionskassette für das/die zu exprimierende(n) Polynukleotid(e) ersetzt werden. Die fehlenden viralen Funktionen werden typischerweise in trans durch die Verpackungszelllinie bereitgestellt. Beispielsweise besitzen in der Gentherapie verwendete AAV-Vektoren typischerweise nur ITR-Sequenzen aus dem AAV-Genom, die für die Verpackung und Integration in das Wirtsgenom benötigt werden. Virale DNA wird in eine Zelllinie verpackt, die ein Helferplasmid enthält, das die anderen AAV-Gene, und zwar rep und cap, codiert, dem jedoch ITR-Sequenzen fehlen. Die Zelllinie kann auch mit Adenovirus als Helfer infiziert werden. Das Helfervirus fördert die Replikation des AAV-Vektors und die Expression von AAV-Genen aus dem Helferplasmid. Das Helferplasmid wird aufgrund fehlender ITR-Sequenzen nicht in signifikanten Mengen verpackt. Die Kontamination mit Adenovirus kann z. B. durch Hitzebehandlung reduziert werden, auf die Adenovirus empfindlicher reagiert als AAV. Dem Fachmann sind zusätzliche Verfahren zur Zuführung von Nukleinsäuren an Zellen bekannt. Siehe zum Beispiel US20030087817 , in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen.
  • VII. Kits, Vektoren, Zellen und Zuführung
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung stellen Kits bereit, die ein Nukleidsäurekonstrukt umfassen, das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche die verschiedenen Komponenten des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-Systems codiert (z. B. einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, die napDNAbps, reverse Transkriptasen, Fusionsproteine (z. B. napDNAbps und Reverse Transkriptasen umfassend), Prime-Editor-Leit-RNAs und Komplexe bestehend aus Fusionsproteinen und Prime-Editor-Leit-RNAs, sowie akzessorische Elemente, wie etwa Zweitstrang-Nicking-Komponenten und 5'-endogene DNA-Flap-Entfernung/Endonukleasen zur Unterstützung des Prime-Editing-Prozesses hin zur editierten Produktbildung). In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleotidsequenz einen heterologen Promotor, der die Expression der Prime-Editor(PE)-Systemkomponenten steuert.
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung stellen Kits bereit, die ein oder mehrere Nukleidsäurekonstrukte umfassen, welche die verschiedenen Komponenten des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-Systems codieren, z. B. eine Nukleotidsequenz umfassend, die Komponenten des Prime-Editor(PE)-Systems codiert, die zum Modifizieren einer Ziel-DNA-Sequenz fähig sind. In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleotidsequenz einen heterologen Promotor, der die Expression der Prime-Editor(PE)-Systemkomponenten steuert.
  • Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Kits bereit, die ein Nukleinsäurekonstrukt umfassen, das (a) eine Nukleotidsequenz, die einen napDNAbp (z. B. eine Cas9-Domäne) codiert, die mit einer reversen Transkriptase fusioniert ist, und (b) einen heterologen Promotor, der die Expression der Sequenz aus (a) antreibt, umfasst.
  • Kits
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung können zu Kits zusammengestellt werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit Nukleinsäurevektoren für die Expression der in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren. In anderen Ausführungsformen umfasst das Kit ferner geeignete Leitnukleotidsequenzen (z. B. PEgRNAs und Second-Site-gRNAs) oder Nukleinsäurevektoren für die Expression solcher Leitnukleotidsequenzen, um das Cas9-Protein oder den Prime-Editor auf die gewünschte Zielsequenz zu lenken.
  • Das in dieser Schrift beschriebene Kit kann einen oder mehrere Behälter enthalten, die Komponenten zum Durchführen der in dieser Schrift beschriebenen Verfahren und optional Gebrauchsanweisungen enthalten. Jedes der in dieser Schrift beschriebenen Kits kann ferner Komponenten umfassen, die zur Durchführung der Assayverfahren benötigt werden. Jede Komponente der Kits kann gegebenenfalls in flüssiger Form (z. B. in Lösung) oder in fester Form (z. B. als Trockenpulver) bereitgestellt werden. In bestimmten Fällen können einige der Komponenten rekonstituierbar oder anderweitig verarbeitbar sein (z. B. zu einer aktiven Form), beispielsweise durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels oder anderen Spezies (z. B. Wasser), die mit dem Kit bereitgestellt werden können oder nicht.
  • In einigen Ausführungsformen können die Kits optional Anweisungen und/oder Werbung für die Verwendung der bereitgestellten Komponenten beinhalten. Wie in dieser Schrift verwendet, kann „Anweisungen“ eine Anweisungs- und/oder verkaufsfördernde Komponente definieren und umfasst in der Regel schriftliche Anweisungen auf oder im Zusammenhang mit der Verpackung der Offenbarung. Anweisungen können auch alle mündlichen oder elektronischen Anweisungen beinhalten, die in irgendeiner Weise bereitgestellt werden, sodass ein Benutzer klar erkennt, dass die Anweisungen mit dem Kit im Zusammenhang stehen sollen, beispielsweise audiovisuell (z. B. Videoband, DVD usw.), Internet- und/oder webbasierte Mitteilungen usw. Die schriftlichen Anweisungen können in einer Form vorliegen, die von einer staatlichen Behörde zur Regulierung der Herstellung, Verwendung oder des Verkaufs von Arzneimitteln oder biologischen Produkten vorgeschrieben wird, die auch die Genehmigung der Behörde für die Herstellung, den Gebrauch oder Verkauf zur Tierverabreichung widerspiegeln kann. Wie in dieser Schrift verwendet, beinhaltet „verkaufsfördernd“ alle Verfahren der Geschäftstätigkeit, einschließlich Verfahren zur Bildung, Krankenhaus- und sonstiger klinisch-praktischer Ausbildung, für wissenschaftliche Untersuchungen, Arzneimittelforschung oder -entwicklung, akademische Forschung, Aktivitäten der Pharmabranche einschließlich des Arzneimittelverkaufs und jeglicher Werbung oder anderer verkaufsfördernder Aktivitäten, einschließlich schriftlicher, mündlicherund elektronische Kommunikation jeglicher Form im Zusammenhang mit der Offenbarung. Darüber hinaus können die Kits je nach der spezifischen Anwendung andere Komponenten beinhalten, wie in dieser Schrift beschrieben.
  • Die Kits können eine oder mehrere der in dieser Schrift beschriebenen Komponenten in einem oder mehreren Behältern enthalten. Die Komponenten können steril zubereitet, in einer Spritze verpackt und gekühlt verschickt werden. Alternativ können sie zur Lagerung in einem Fläschchen oder einem anderen Behälter untergebracht werden. Ein zweiter Behälter kann andere steril zubereitete Komponenten aufweisen. Alternativ dazu können die Kits die Wirkstoffe vorgemischt und in einem Fläschchen, einem Röhrchen oder einem anderen Behälter versandt enthalten.
  • Die Kits können eine Vielzahl von Formen aufweisen, z. B. Blisterbeutel, Schrumpfbeutel, vakuumversiegelbare Beutel, versiegelbare thermogeformte Schalen oder eine ähnliche Beutel- oder Schalenform, wobei das Zubehör lose im Beutel, einer oder mehrere Tuben, Behälter, einer Schachtel oder einer Tüte verpackt ist. Die Kits können sterilisiert werden, nachdem die Zubehörteile hinzugefügt wurden, wodurch die einzelnen Zubehörteile im Behälter ausgepackt werden können. Die Kits können unter Verwendung beliebiger geeigneter Sterilisationstechniken sterilisiert werden, wie etwa Strahlungssterilisation, Hitzesterilisation oder andere im Stand der Technik bekannte Sterilisationsverfahren. Die Kits können je nach Anwendung auch andere Komponenten beinhalten, zum Beispiel Behälter, Zellmedien, Salze, Puffer, Reagenzien, Spritzen, Nadeln, ein Gewebe, wie etwa Gaze, zum Auftragen oder Entfernen eines Desinfektionsmittels, Einmalhandschuhe, einen Träger für die Mittel vor der Verabreichung usw. Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Kits bereit, die ein Nukleinsäurekonstrukt umfassen, das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche die verschiedenen Komponenten des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editing-Systems codiert (z. B. einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, die napDNAbps, reverse Transkriptasen, Polymerasen, Fusionsproteine (z. B. umfassend napDNAbps und reverse Transkriptasen (oder allgemeiner Polymerasen), verlängerte Leit-RNAs und Komplexe, die Fusionsproteine und verlängerte Leit-RNAs umfassen, sowie akzessorische Elemente, wie etwa Zweitstrang-Nicking-Komponenten (z. B. Zweitstrang-Nicking-gRNA) und 5'-endogene DNA-Flap-Entfernungsendonukleasen, die dabei helfen, den Prime-Editing-Prozess in Richtung der editierten Produktbildung anzutreiben). In einigen Ausführungsformen umfassen die Nukleotidsequenz(en) einen heterologen Promotor (oder mehr als einen einzelnen Promotor), der die Expression der Komponenten des Prime-Editing-Systems antreibt.
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung stellen Kits bereit, die ein oder mehrere Nukleidsäurekonstrukte umfassen, welche die verschiedenen Komponenten des in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editor(PE)-Systems codieren, z. B. eine Nukleotidsequenz umfassend, die Komponenten des Prime-Editor-Systems codiert, die zum Modifizieren einer Ziel-DNA-Sequenz fähig sind. In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleotidsequenz einen heterologen Promotor, der die Expression der Prime-Editing-Systemkomponenten antreibt.
  • Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Kits bereit, die ein Nukleinsäurekonstrukt umfassen, das (a) eine Nukleotidsequenz, die einen napDNAbp (z. B. eine Cas9-Domäne) codiert, die mit einer reversen Transkriptase fusioniert ist, und (b) einen heterologen Promotor, der die Expression der Sequenz aus (a) antreibt, umfasst.
  • Zellen
  • Zellen, die eine der in dieser Schrift beschriebenen Zusammensetzungen enthalten können, beinhalten prokaryontische Zellen und eukaryontische Zellen. Die in dieser Schrift beschriebenen Verfahren werden verwendet, um ein Cas9-Protein oder einen Prime-Editor einer eukaryontische Zelle (z. B. einer Säugetierzelle, wie etwa einer menschlichen Zelle) zuzuführen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle in vitro (z. B. eine kultivierte Zelle). In einigen Ausführungsformen ist die Zelle in vivo (z. B. in einem Subjekt wie etwa einem menschlichen Subjekt). In einigen Ausführungsformen ist die Zelle ex vivo (z. B. von einem Subjekt isoliert und kann demselben oder einem anderen Subjekt zurückverabreicht werden).
  • Säugetierzellen der vorliegenden Offenbarung beinhalten menschliche Zellen, Primatenzellen (z. B. Vero-Zellen), Rattenzellen (z. B. GH3-Zellen, OC23-Zellen) oder Mauszellen (z. B. MC3T3-Zellen). Es gibt eine Vielfalt menschlicher Zelllinien, einschließlich, ohne Einschränkung, menschliche embryonale Nierenzellen (HEK), HeLa-Zellen, Krebszellen aus den 60 Krebszelllinien des National Cancer Institute (NCI60), DU145- (Prostatakrebs-) Zellen, Lncap- (Prostatakrebs-) Zellen, MCF-7- (Brustkrebs-) Zellen, MDA-MB-438- (Brustkrebs-) Zellen, PC3- (Prostatakrebs-) Zellen, T47D- (Brustkrebs-) Zellen, THP-1- (akute myeloische Leukämie-) Zellen, U87- (Glioblastom-) Zellen, menschliche SHSY5Y-Neuroblastom-Zellen (aus einem Myelom geklont) und Saos-2- (Knochenkrebs-) Zellen. In einigen Ausführungsformen werden rAAV-Vektoren humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) zugeführt (z. B. HEK 293 oder HEK 293T-Zellen). In einigen Ausführungsformen werden rAAV-Vektoren Stammzellen (z. B. menschlichen Stammzellen) wie beispielsweise pluripotenten Stammzellen (z. B. menschlichen pluripotenten Stammzellen, einschließlich menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs)) zugeführt. Eine Stammzelle bezeichnet eine Zelle mit der Fähigkeit, sich in Kultur für unbestimmte Zeit zu teilen und spezialisierte Zellen hervorzubringen. Eine pluripotente Stammzelle bezeichnet eine Art von Stammzelle, die in der Lage ist, sich in alle Gewebe eines Organismus zu differenzieren, aber nicht allein der Lage ist, die vollständige Entwicklung des Organismus aufrechtzuerhalten. Eine vom Menschen induzierte pluripotente Stammzelle bezeichnet eine somatische (z. B. reife oder erwachsene) Zelle, die in einen embryonalen Stammzell-ähnlichen Zustand umprogrammiert wurde, indem sie gezwungen wurde, Gene und Faktoren zu exprimieren, die für die Aufrechterhaltung der definierenden Eigenschaften embryonaler Stammzellen wichtig sind (z B. Takahashi und Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006, in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen). Humane induzierte pluripotente Stammzellzellen exprimieren Stammzellmarker und sind in der Lage, für alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm, Mesoderm) charakteristische Zellen zu erzeugen.
  • Zusätzliche nicht einschränkende Beispiele für Zelllinien, die gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, umfassen 293-T, 293-T, 3T3, 4T1, 721, 9L, A-549, A172, A20, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, ALC, B16, B35, BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR293, BxPC3, C2C12, C3H-10T1/2, C6, C6/36, Cal-27, CGR8, CHO, CML T1, CMT, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, E14Tg2a, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, Hepalclc7, High- Five-Zellen, HL-60, HMEC, HT-29, HUVEC, J558L-Zellen, Jurkat, JY-Zellen, K562-Zellen, KCL22, KG1, Ku812, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1, 2, 3....48, MC-38, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, MDCKII, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0.2R, MRC5, MTD-1A, MyEnd, NALM-1, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NW-145, OPCN/OPCT Peer, PNT-1A/PNT 2, PTK2, Raji, RBL-Zellen, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, S2, Saos-2-Zellen, Sf21, Sf9, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T-47D, T2, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49, X63, YAC-1 und YAR-Zellen.
  • Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Zellen bereit, die eines der in dieser Schrift offenbarten Konstrukte umfassen. In einigen Ausführungsformen wird eine Wirtszelle vorübergehend oder nicht vorübergehend mit einem oder mehreren in dieser Schrift beschriebenen Vektoren transfiziert. In einigen Ausführungsformen wird eine Zelle so transfiziert, wie sie in einem Subjekt natürlicherweise vorkommt. In einigen Ausführungsformen wird eine transfizierte Zelle einem Subjekt entnommen. In einigen Ausführungsformen stammt die Zelle von Zellen, die einem Subjekt entnommen wurden, wie etwa einer Zelllinie. Im Stand der Technik sind viele verschiedene Zelllinien für die Gewebekultur bekannt. Beispiele für Zelllinien beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein: C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panel, PC- 3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI- 231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 Affennierenepithel, BALB/3T3 Mausembryofibroblasten, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 humane fötale Fibroblasten; 10.1 Mausfibroblasten, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1-Zellen, BEAS-2B, bEnd. 3, BHK-21, BR 293. BxPC3. C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY Zellen, K562 Zellen, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma- Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK 11, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN/OPCT Zelllinien, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2-Zellen, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1-Zelllinie, U373, U87, U937, VCaP, Vero-Zellen, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR und transgene Sorten davon.
  • Zelllinien sind aus einer Vielfalt von Quellen erhältlich, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. die American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Virginia)). In einigen Ausführungsformen wird eine mit einem oder mehreren in dieser Schrift beschriebenen Vektoren transfizierte Zelle verwendet, um eine neue Zelllinie zu etablieren, die eine oder mehrere von Vektoren abgeleitete Sequenzen umfasst. In einigen Ausführungsformen wird eine Zelle, die mit den Komponenten eines CRISPR-Systems, wie in dieser Schrift beschrieben, transient transfiziert (wie etwa durch transiente Transfektion eines oder mehrerer Vektoren oder Transfektion mit RNA) und durch die Aktivität eines CRISPR-Komplexes modifiziert wurde, verwendet, um eine neue Zelllinie zu etablieren, die Zellen umfasst, welche die Modifikation enthalten, denen jedoch jede andere exogene Sequenz fehlt. In einigen Ausführungsformen werden Zellen, die vorübergehend oder nicht vorübergehend mit einem oder mehreren in dieser Schrift beschriebenen Vektoren transfiziert wurden, oder von solchen Zellen abgeleitete Zelllinien zur Bewertung einer oder mehrerer Testverbindungen verwendet.
  • Vektoren
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung betreffen die Verwendung rekombinanter Virusvektoren (z. B. adenoassoziierte Virusvektoren, Adenovirusvektoren oder Herpes-simplex-Virusvektoren) für die Zuführung der in dieser Schrift beschriebenen Prime-Editoren oder Komponenten davon, z. B. des getrennten Cas9-Proteins oder eines getrennten Nukleobase-Prime-Editors, in eine Zelle. Im Fall eines Ansatzes mit getrenntem PE werden der N-terminale Abschnitt eines PE-Fusionsproteins und der C-terminale Abschnitt einer PE-Fusion durch separate rekombinante Virusvektoren (z. B. Adeno-assoziierte Virusvektoren, Adenovirusvektoren oder Herpes-simplex-Virusvektoren) derselben Zelle zugeführt, da das Cas9-Protein oder die Prime-Editoren in voller Länge die Verpackungsgrenze verschiedener Virusvektoren, z. B. rAAV (~4.9 KB), überschreiten.
  • Somit betrachtet die Offenbarung in einer Ausführungsform Vektoren, die in der Lage sind, getrennte Prime-Editor-Fusionsproteine oder getrennte Komponenten davon zuzuführen. In einigen Ausführungsformen wird eine Zusammensetzung zum Zuführen des getrennten Cas9-Proteins oder des getrennten Prime-Editors in eine Zelle (z. B. eine Säugetierzelle, eine menschliche Zelle) bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung Folgendes: (i) ein erstes rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus (rAAV)-Partikel, das eine erste Nukleotidsequenz umfasst, die einen N-terminalen Abschnitt eines Cas9-Proteins oder eines Prime-Editors codiert, der an seinem C-Terminus mit einem Intein-N fusioniert ist; und (ii) ein zweites rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus (rAAV)-Partikel, das eine zweite Nukleotidsequenz umfasst, die eintein-C codiert, das mit dem N-Terminus eines C-terminalen Abschnitts des Cas9-Proteins oder Prime-Editors fusioniert ist. Die rAAV-Partikel der vorliegenden Offenbarung umfassen einen rAAV-Vektor (d. h. ein rekombinantes Genom des rAAV), der in die viralen Kapsidproteine eingekapselt ist.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst der rAAV-Vektor Folgendes: (1) eine heterologe Nukleinsäureregion, welche die erste oder zweite Nukleotidsequenz umfasst, die den N-terminalen Abschnitt oder C-terminalen Abschnitt eines getrennten Cas9-Proteins oder eines getrennten Prime-Editors in irgendeiner Form wie in dieser Schrift beschrieben codiert, (2) eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, die eine Sequenz umfassen, welche die Expression der heterologen Nukleinsäureregion erleichtert (z. B. einen Promotor), und (3) eine oder mehrere Nukleinsäureregionen, die eine Sequenz umfassen, welche die Integration der heterologen Nukleinsäureregion (gegebenenfalls mit der einen oder mehreren Nukleinsäureregionen, die eine Sequenz umfassen, welche die Expression erleichtert) in das Genom einer Zelle erleichtert. In einigen Ausführungsformen umfassen virale Sequenzen, welche die Integration erleichtern, Inverted Terminal Repeat (ITR)-Sequenzen. In einigen Ausführungsformen wird die erste oder zweite Nukleotidsequenz, die den N-terminalen Abschnitt oder C-terminalen Abschnitt eines getrennten Cas9-Proteins oder eines getrennten Prime-Editors codiert, auf jeder Seite von einer ITR-Sequenz flankiert. In einigen Ausführungsformen umfasst der Nukleinsäurevektor ferner eine Region, die ein wie in dieser Schrift beschriebenes AAV-Rep-Protein codiert, das entweder innerhalb der von ITRs flankierten Region enthalten ist oder außerhalb der Region liegt. Die ITR-Sequenzen können von jedem AAV-Serotyp abgeleitet sein (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10) oder können von mehr als einem Serotyp abgeleitet sein. In einigen Ausführungsformen werden die ITR-Sequenzen von AAV2 oder AAV6 abgeleitet.
  • Somit umfassen die in dieser Schrift offenbarten rAAV-Partikel in einigen Ausführungsformen mindestens ein rAAV2-Partikel, rAAV6-Partikel, rAAV8-Partikel, rPHP.B-Partikel, rPHP.eB-Partikel oder rAAV9-Partikel oder eine Variante davon. In bestimmten Ausführungsformen sind die offenbarten rAAV-Partikel rPHP.B-Partikel, rPHP.eB-Partikel, rAAV9-Partikel.
  • ITR-Sequenzen und Plasmide, die ITR-Sequenzen enthalten, sind in der Technik bekannt und im Handel erhältlich (siehe z. B. Produkte und Dienstleistungen, die von Vector Biolabs, Philadelphia, PA; Cellbiolabs, San Diego, CA; Agilent Technologies, Santa Clara, CA; Cambridge, MA erhältlich sind; und Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byme BJ. Proc Natl Acad Sei USA. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; und Curtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 © Humana Press Inc. 2003. Kapitel 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen und Richard Jude Samulski; US-Pat. Nr. 5,139,941 und 5,962,313 , die alle in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind).
  • In einigen Ausführungsformen umfasst der rAAV-Vektor der vorliegenden Offenbarung ein oder mehrere regulatorische Elemente zur Kontrolle der Expression der heterologen Nukleinsäureregion (z. B. Promotoren, Transkriptionsterminatoren, und/oder andere Regulierungselemente). In einigen Ausführungsformen ist der erste und/oder die zweite Nukleotidsequenz funktionsfähig mit einem oder mehreren (z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr) Transkriptionsterminatoren verbunden. Nicht einschränkende Beispiele für Transkriptionsterminatoren, die gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, beinhalten Transkriptionsterminatoren des Rinder-Wachstumshormon-Gens (bGH), des menschlichen Wachstumshormon-Gens (hGH), SV40, CW3, Φ oder Kombinationen davon. Die Effizienz mehrerer Transkriptionsterminatoren wurde getestet, um ihre jeweiligen Wirkungen auf das Expressionsniveau des getrennten Cas9-Proteins oder des getrennten Prime-Editors zu bestimmen. In einigen Ausführungsformen ist der in der vorliegenden Offenbarung verwendete Transkriptionsterminator ein bGH-Transkriptionsterminator. In einigen Ausführungsformen umfasst der rAAV-Vektor ferner ein posttranskriptionales regulatorisches Element des Waldmurmeltier-Hepatitisvirus (WPRE). In bestimmten Ausführungsformen ist das WPRE eine verkürzte WPRE-Sequenz, wie etwa „W3“. In einigen Ausführungsformen wird das WPRE 5' von dem Transkriptionsterminator eingefügt. Solche Sequenzen erzeugen, wenn sie transkribiert werden, eine Tertiärstruktur, welche die Expression insbesondere von viralen Vektoren verstärkt.
  • In einigen Ausführungsformen können die in dieser Schrift verwendeten Vektoren die PE-Fusionsproteine oder beliebige ihrer Komponenten (z. B. napDNAbp, Linker oder Polymerasen) codieren. Darüber hinaus können die in dieser Schrift verwendeten Vektoren die PEgRNAs und/oder die akzessorische gRNA für das Zweitstrang-Nicking codieren. Die Vektoren können in der Lage sein, die Expression einer oder mehrerer codierender Sequenzen in einer Zelle anzutreiben. In einigen Ausführungsformen kann die Zelle eine prokaryontische Zelle sein, wie beispielsweise eine Bakterienzelle. In einigen Ausführungsformen kann die Zelle eine eukaryontische Zelle sein, wie beispielsweise eine Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugetierzelle. In einigen Ausführungsformen kann die eukaryontische Zelle eine Säugetierzelle sein. In einigen Ausführungsformen kann die eukaryontische Zelle eine Nagetierzelle sein. In einigen Ausführungsformen kann die eukaryontische Zelle eine menschliche Zelle sein. Geeignete Promotoren, um die Expression in verschiedenen Zelltypen anzutreiben, sind im Fachgebiet bekannt. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor vom Wildtyp sein. In anderen Ausführungsformen kann der Promotor für eine effizientere oder wirksamere Expression modifiziert werden. In noch anderen Ausführungsformen kann der Promotor verkürzt sein, jedoch seine Funktion beibehalten. Zum Beispiel kann der Promotor eine normale Größe oder eine reduzierte Größe aufweisen, die zum richtigen Verpacken des Vektors in ein Virus geeignet ist.
  • In einigen Ausführungsformen können die Promotoren, die in den Prime-Editor-Vektoren verwendet werden können, konstitutiv, induzierbar oder gewebespezifisch sein. In einigen Ausführungsformen können die Promotoren konstitutive Promotoren sein. Nicht einschränkende beispielhafte konstitutive Promotoren beinhalten die folgenden: Cytomegalovirus Immediate Early Promotor (CMV), Simian Virus(SV40)-Promotor, Adenovirus Major Late (MLP)-Promotor, Rous Sarcoma Virus (RSV)-Promotor, Maus-Mammatumorvirus(MMTV)-Promotor, Phosphoglyceratkinase(PGK)-Promotor, Elongationsfaktor-alpha(EFla)-Promotor, Ubiquitin-Promotoren, Aktin-Promotoren, Tubulin-Promotoren, Immunglobulin-Promotoren, ein funktionelles Fragment davon oder eine Kombination von jedem der vorhergehenden. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein CMV-Promotor sein. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein verkürzter CMV-Promotor sein. In anderen Ausführungsformen kann der Promotor ein EF1a-Promotor sein. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor einduzierbarer Promotor sein. Nicht einschränkende beispielhafte induzierbare Promotoren beinhalten solche, die durch Hitzeschock, Licht, Chemikalien, Peptide, Metalle, Steroide, Antibiotika oder Alkohol induzierbar sind. In einigen Ausführungsformen kann der induzierbare Promotor einer sein, der ein niedriges basales (nicht induziertes) Expressionsniveau hat, wie z. B. der Tet-On®-Promotor (Clontech). In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein gewebespezifischer Promotor sein. In einigen Ausführungsformen wird der gewebespezifische Promotor ausschließlich oder überwiegend in Lebergewebe exprimiert. Nicht einschränkende beispielhafte gewebespezifische Promotoren beinhalten den B29-Promotor, CD14-Promotor, CD43-Promotor, CD45-Promotor, CD68-Promotor, Desmin-Promotor, Elastase-1-Promotor, Endoglin-Promotor, Fibronectin-Promotor, Flt-1-Promotor, GFAP-Promotor, GPIIb-Promotor, ICAM-2-Promotor, INF-ß-Promotor, Mb-Promotor, Nphs1-Promotor, OG-2-Promotor, SP-B-Promotor, SYN1-Promotor und den WASP-Promotor.
  • In einigen Ausführungsformen können die Prime-Editor-Vektoren (z. B. einschließlich jeglicher Vektoren, die das Prime-Editor-Fusionsprotein und/oder die PEgRNAs und/oder die akzessorischen Zweitstrang-Nicking-gRNAs codieren) induzierbare Promotoren umfassen, um die Expression erst zu starten, nachdem er einer Zielzelle zugeführt wurde. Nicht einschränkende beispielhafte induzierbare Promotoren beinhalten solche, die durch Hitzeschock, Licht, Chemikalien, Peptide, Metalle, Steroide, Antibiotika oder Alkohol induzierbar sind. In einigen Ausführungsformen kann der induzierbare Promotor einer sein, der ein niedriges basales (nicht induziertes) Expressionsniveau hat, wie z. B. der Tet-On®-Promotor (Clontech).
  • In zusätzlichen Ausführungsformen können die Prime-Editor-Vektoren (z. B. einschließlich jeglicher Vektoren, die das Prime-Editor-Fusionsprotein und/oder die PEgRNAs und/oder die akzessorischen Zweitstrang-Nicking-gRNAs codieren) gewebespezifische Promotoren umfassen, um die Expression erst zu starten, nachdem er einem spezifischen Gewebe zugeführt wurde. Nicht einschränkende beispielhafte gewebespezifische Promotoren beinhalten den B29-Promotor, CD14-Promotor, CD43-Promotor, CD45-Promotor, CD68-Promotor, Desmin-Promotor, Elastase-1-Promotor, Endoglin-Promotor, Fibronectin-Promotor, Flt-1-Promotor, GFAP-Promotor, GPIIb-Promotor, ICAM-2-Promotor, INF-ß-Promotor, Mb-Promotor, Nphs1-Promotor, OG-2-Promotor, SP-B-Promotor, SYN1-Promotor und den WASP-Promotor.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, welche die PEgRNA codiert (oder jegliche Leit-RNAs, die in Verbindung mit Prime Editing verwendet werden) funktionsfähig mit mindestens einer transkriptionalen oder translationalen Kontrollsequenz verbunden sein. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, welche die Leit-RNA codiert, funktionsfähig mit mindestens einem Promotor verbunden sein. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor von RNA-Polymerase III (Pol III) erkannt werden. Nicht einschränkende Beispiele für Pol III-Promotoren beinhalten U6-, HI- und tRNA-Promotoren. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, welche die Leit-RNA codiert, funktionsfähig mit einem Maus- oder menschlichen U6-Promotor verbunden sein. In anderen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, welche die Leit-RNA codiert, funktionsfähig mit einem Maus- oder menschlichen HI-Promotor verbunden sein. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, welche die Leit-RNA codiert, funktionsfähig mit einem Maus- oder menschlichen tRNA-Promotor verbunden sein. In Ausführungsformen mit mehr als einer Leit-RNA können die zum Antreiben der Expression verwendeten Promotoren gleich oder verschieden sein. In einigen Ausführungsformen können das Nukleotid, das die crRNA der Leit-RNA codiert, und das Nukleotid, das die tracr-RNA der Leit-RNA codiert, auf demselben Vektor bereitgestellt werden. In einigen Ausführungsformen können das Nukleotid, das die crRNA codiert, und das Nukleotid, das die tracr-RNA codiert, von demselben Promotor angetrieben werden. In einigen Ausführungsformen können die crRNA und tracr-RNA in ein einzelnes Transkript transkribiert werden. Zum Beispiel können die crRNA und tracr-RNA aus dem einzelnen Transkript verarbeitet werden, um eine Doppelmolekül-Leit-RNA zu bilden. Alternativ können die crRNA und tracr-RNA in eine Einzelmolekül-Leit-RNA transkribiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, welche die Leit-RNA codiert, auf demselben Vektor lokalisiert sein, der die Nukleotidsequenz umfasst, die das PE-Fusionsprotein codiert. In einigen Ausführungsformen kann die Expression der Leit-RNA und des PE-Fusionsproteins durch ihre entsprechenden Promotoren angetrieben werden. In einigen Ausführungsformen kann die Expression der Leit-RNA durch denselben Promotor angetrieben werden, der die Expression des PE-Fusionsproteins antreibt. In einigen Ausführungsformen können die Leit-RNA und das PE-Fusionsprotein-Transkript in einem einzigen Transkript enthalten sein. Beispielsweise kann sich die Leit-RNA innerhalb einer untranslatierten Region (UTR) des Cas9-Proteintranskripts befinden. In einigen Ausführungsformen kann sich die Leit-RNA innerhalb der 5'-UTR des PE-Fusionsprotein-Transkripts befinden. In anderen Ausführungsformen kann sich die Leit-RNA innerhalb der 3'-UTR des PE-Fusionsprotein-Transkripts befinden. In einigen Ausführungsformen kann die intrazelluläre Halbwertszeit des PE-Fusionsprotein-Transkripts reduziert werden, indem die Leit-RNA in seiner 3'-UTR enthalten ist und dadurch die Länge seines 3'-UTR verkürzt wird. In zusätzlichen Ausführungsformen kann sich die Leit-RNA innerhalb eines Introns des PE-Fusionsprotein-Transkripts befinden. In einigen Ausführungsformen können geeignete Spleißstellen an dem Intron hinzugefügt werden, in dem sich die Leit-RNA befindet, sodass die Leit-RNA sachgemäß aus dem Transkript gespleißt wird. In einigen Ausführungsformen kann die Expression des Cas9-Proteins und der Leit-RNA in unmittelbarer Nähe auf demselben Vektor eine effizientere Bildung des CRISPR-Komplexes erleichtern.
  • Das Prime-Editor-Vektorsystem kann einen Vektor oder zwei Vektoren oder drei Vektoren oder vier Vektoren oder fünf Vektoren oder mehr umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Vektorsystem einen einzigen Vektor umfassen, der sowohl das PE-Fusionsprotein als auch PEgRNA codiert. In anderen Ausführungsformen kann das Vektorsystem zwei Vektoren umfassen, wobei ein Vektor das PE-Fusionsprotein codiert und der andere die PEgRNA codiert. In zusätzlichen Ausführungsformen kann das Vektorsystem drei Vektoren umfassen, wobei der dritte Vektor die Nicking-gRNA des zweiten Strangs codiert, die in den in dieser Schrift beschriebenen Verfahren verwendet wird.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung, die das rAAV-Partikel (in jeder in dieser Schrift in Betracht gezogenen Form) umfasst, ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger. In einigen Ausführungsformen wird die Zusammensetzung in geeigneten pharmazeutischen Vehikeln zur Verabreichung an Menschen oder Tiere formuliert.
  • Einige Beispiele für Materialien, die als pharmazeutisch annehmbare Träger dienen können, beinhalten: (1) Zucker, wie etwa Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, wie etwa Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Zellulose und deren Derivate, wie etwa Natriumcarboxymethylzellulose, Methylzellulose, Ethylzellulose, mikrokristalline Zellulose und Zelluloseacetat; (4) pulverisierter Traganth; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Schmiermittel, wie etwa Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk; (8) Hilfsstoffe, wie etwa Kakaobutter und Zäpfchenwachse; (9) Öle, wie etwa Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojabohnenöl; (10) Glykole, wie Propylenglykol; (11) Polyole, wie etwa Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglycol (PEG); (12) Ester, wie etwa Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) pH-gepufferte Lösungen; (21) Polyester, Polycarbonate und/oder Polyanhydride; (22) Füllstoffe wie etwa Polypeptide und Aminosäuren (23) Serumkomponente wie etwa Serumalbumin, HDL und LDL; (22) C2-C12-Alkohole, wie etwa Ethanol; und (23) andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden. Benetzungsmittel, Farbstoffe, Trennmittel, Beschichtungsmittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe, Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidantien können ebenfalls in der Formulierung enthalten sein. Die Begriffe wie „Hilfsstoff“, „Träger“, „pharmazeutisch verträglicher Träger“ oder dergleichen werden in dieser Schrift austauschbar verwendet.
  • Verfahren zur Zuführung
  • In einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren bereit, die das Zuführen eines oder mehrerer Polynukleotiden, wie etwa eines oder mehrerer Vektoren wie in dieser Schrift beschrieben, eines oder mehrerer Transkripte davon und/oder eines oder mehrerer davon transkribierten Proteine an eine Wirtszelle umfassen. In einigen Aspekten stellt die Erfindung ferner Zellen, die durch solche Verfahren hergestellt werden, und Organismen (wie etwa Tiere, Pflanzen oder Pilze), die solche Zellen umfassen oder daraus hergestellt werden, bereit. In einigen Ausführungsformen wird ein dieser Schrift beschriebener Baseneditor in Kombination mit (und optional komplexiert mit) einer Leitsequenz einer Zelle zugeführt.
  • Beispielhafte Zuführungsstrategien werden in dieser Schrift an anderer Stelle beschrieben, die vektorbasierte Strategien, die Zuführung von PE-Ribonukleoproteinkomplexen und die Zuführung von PE durch mRNA-Verfahren umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das bereitgestellte Zuführungsverfahren Nukleofektion, Mikroinjektion, Biolistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder lipide Nukleinsäurekonjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und Wirkstoff-verstärkte Aufnahme von DNA.
  • Beispielhafte Verfahren der Zuführung von Nukleinsäuren beinhalten Lipofektion, Nukleofektion, Elektroporation, stabile Genomintegration (z. B. Piggybac), Mikroinjektion, Biolistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder lipide Nukleinsäurekonjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und Wirkstoff-verstärkte Aufnahme von DNA. Die Lipofektion ist z. B. in US-Pat. Nr. 5,049,386 , 4,946,787 ; und 4,897,355 beschrieben, und Lipofektionsreagenzien werden im Handel verkauft (z. B. Transfectam™, Lipofectin™ und SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit™ (Lonza)). Kationische und neutrale Lipide, die für eine effiziente Lipofektion von Polynukleotiden mit Rezeptorerkennung geeignet sind, beinhalten die von Feigner, WO 91/17424 ; WO 91/16024 . Die Zuführung kann an Zellen (z. B. in vitro- oder ex vivo- Verabreichung) oder Zielgewebe (z. B. in vivo- Verabreichung) erfolgen. Die Zuführung kann durch die Verwendung von RNP-Komplexen erreicht werden.
  • Die Vorbereitung von lipiden Nukleinsäurekomplexen, einschließlich zielgerichteter Liposome, wie etwa Immunlipidkomplexe, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); US-Patent Nr. 4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 und 4,946,787 ).
  • In anderen Ausführungsformen ist das in dieser Schrift bereitgestellte Verfahren für Zuführung und Vektor ein RNP-Komplex. Die RNP-Zuführung von Fusionsproteinen erhöht die DNA-Spezifität der Baseneditierung deutlich. Die RNP-Zuführung von Fusionsproteinen führt zur Entkopplung der DNA-Editierung auf und außerhalb des Ziels. Die RNP-Zuführung entfernt die Off-Target-Editierung an nicht-repetitiven Stellen, während die On-Target-Editierung vergleichbar mit der Plasmidzuführung beibehalten und die Off-Target-DNA-Editierung sogar an der stark repetitiven VEGFA-Stelle 2 stark reduziert wird. Siehe Rees, HA et al., Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery, Nat. Commun. 8, 15790 (2017), US-Patent Nr. 9,526,784 , erteilt am 27. Dezember 2016, und US-Patent Nr. 9,737,604 , erteilt am 22. August 2017, die jeweils durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen sind.
  • Dem Fachmann sind zusätzliche Verfahren zur Zuführung von Nukleinsäuren an Zellen bekannt. Siehe zum Beispiel US2003/0087817 , in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Andere Aspekte der vorliegenden Offenbarung stellen Verfahren zur Zuführung der Prime-Editor-Konstrukte in eine Zelle bereit, um einen vollständigen und funktionalen Prime-Editor innerhalb einer Zelle zu bilden. Zum Beispiel wird in einigen Ausführungsformen eine Zelle mit einer in dieser Schrift beschriebenen Zusammensetzung in Kontakt gebracht (z. B. Zusammensetzungen, die Nukleotidsequenzen umfassen, die das getrennte Cas9 oder den getrennten Prime-Editor codieren, oder AAV-Partikel, die Nukleinsäurevektoren enthalten, die solche Nukleotidsequenzen umfassen). In einigen Ausführungsformen führt das Kontaktieren zur Zuführung solcher Nukleotidsequenzen in eine Zelle, wobei der N-terminale Abschnitt des Cas9-Proteins oder des Prime-Editors und der C-terminale Abschnitt des Cas9-Proteins oder des Prime-Editors in der Zelle exprimiert werden und verbunden werden, um ein vollständiges Cas9-Protein oder einen vollständigen Prime-Editor zu bilden.
  • Es versteht sich, dass jedes rAAV-Partikel, Nukleinsäuremolekül oder jede in dieser Schrift bereitgestellte Zusammensetzung auf jede geeignete Weise, entweder stabil oder vorübergehend, in die Zelle eingeführt werden kann. In einigen Ausführungsformen können die offenbarten Proteine in die Zelle transfiziert werden. In einigen Ausführungsformen kann die Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül transduziert oder transfiziert werden. Zum Beispiel kann eine Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül, das ein getrenntes Protein codiert, oder einem rAAV-Partikel, das ein virales Genom enthält, das ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle codiert, transduziert (z. B. mit einem Virus, das ein getrenntes Protein codiert) oder transfiziert (z. B. mit einem Plasmid, das ein getrenntes Protein codiert) werden. Eine solche Transduktion kann eine stabile oder vorübergehende Transduktion sein. In einigen Ausführungsformen können Zellen, die ein getrenntes Protein exprimieren oder ein getrenntes Protein enthalten, mit einer oder mehreren Leit-RNA-Sequenzen transduziert oder transfiziert werden, beispielsweise bei Zuführung eines getrennten Cas9-Proteins (z. B. nCas9). In einigen Ausführungsformen kann ein Plasmid, das ein getrenntes Protein exprimiert, in Zellen durch Elektroporation, transiente (z. B. Lipofektion) und stabile Genomintegration (z. B. Piggybac) und virale Transduktion oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren eingeführt werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfassen die in dieser Schrift bereitgestellten Zusammensetzungen ein Lipid und/oder Polymer. In bestimmten Ausführungsformen ist das Lipid und/oder Polymer kationisch. Die Herstellung solcher Lipidpartikel ist gut bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4,880,635 ; 4.906.477 ; 4.911.928 ; 4.917.951 ; 4.920.016 ; 4.921.757 ; und 9,737,604 , die jeweils in diese Schrift durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Die Leit-RNA-Sequenz kann 15-100 Nukleotide lang sein und eine Sequenz von mindestens 10, mindestens 15 oder mindestens 20 zusammenhängenden Nukleotiden umfassen, die zu einer Ziel-Nukleotidsequenz komplementär ist. Die Leit-RNA kann eine Sequenz von 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 zusammenhängenden Nukleotiden umfassen, die zu einer Zielsequenz komplementär sind. Die Leit-RNA kann 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotide lang sein.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Zielnukleotidsequenz eine DNA-Sequenz in einem Genom, z. B. einem eukaryontischen Genom. In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Zielnukleotidsequenz in einem Säuger- (z. B. einem menschlichen) Genom.
  • Die Zusammensetzungen dieser Offenbarung können beispielsweise als Einheitsdosis verabreicht oder verpackt werden. Der Begriff „Einheitsdosis“, wenn er in Bezug auf eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, bezeichnet physisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosis für den Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die berechnet wird, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. einem Träger oder Vehikel, zu erzeugen.
  • Die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung beinhaltet das Verzögern der Entwicklung oder des Fortschreitens der Krankheit oder das Verringern der Schwere der Krankheit. Die Behandlung der Krankheit erfordert nicht unbedingt heilende Ergebnisse.
  • Wie darin verwendet, bedeutet „Verzögern“ der Entwicklung einer Krankheit, das Fortschreiten der Krankheit aufzuschieben, zu behindern, zu verlangsamen, zu verzögern, zu stabilisieren und/oder hinauszuzögern. Diese Verzögerung kann je nach Krankheitsgeschichte und/oder der behandelten Person unterschiedlich lang sein. Ein Verfahren, das die Entwicklung einer Krankheit „verzögert“ oder lindert oder den Ausbruch der Krankheit verzögert, ist ein Verfahren, das die Wahrscheinlichkeit verringert, in einem bestimmten Zeitrahmen ein oder mehrere Symptome der Krankheit zu entwickeln und/oder reduziert das Ausmaß der Symptome in einem bestimmten Zeitrahmen im Vergleich zur Nichtanwendung des Verfahrens. Solche Vergleiche basieren typischerweise auf klinischen Studien, bei denen eine ausreichende Anzahl von Probanden eingesetzt wird, um ein statistisch signifikantes Ergebnis zu erzielen.
  • „Entwicklung“ oder „Fortschreiten“ einer Krankheit bezeichnet erste Manifestationen und/oder nachfolgenden Krankheitsverlauf. Die Entwicklung der Krankheit kann unter Verwendung klinischer Standardtechniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind, nachgewiesen und beurteilt werden. Entwicklung bezieht sich jedoch auch auf ein Fortschreiten, das möglicherweise nicht nachweisbar ist. Im Sinne dieser Offenbarung bezieht sich Entwicklung oder Fortschreiten auf den biologischen Verlauf der Symptome. „Entwicklung“ beinhaltet das Auftreten, das Wiederauftreten und den Beginn.
  • Wie in dieser Schrift verwendet, beinhaltet „Beginn“ oder „Auftreten“ einer Krankheit den anfänglichen Beginn und/oder Wiederauftreten. Herkömmliche Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Medizin bekannt sind, können verwendet werden, um dem Patienten das isolierte Polypeptid oder die pharmazeutische Zusammensetzung je nach der Art der zu behandelnden Krankheit oder dem Herd der Krankheit zu verabreichen.
  • Ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann auf der Grundlage der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Offenbarung in vollem Umfang nutzen kann. Die folgenden spezifischen Ausführungsformen sind daher lediglich veranschaulichend und in keiner Weise einschränkend für den Rest der Offenbarung zu verstehen. Alle in dieser Schrift zitierten Veröffentlichungen werden durch Bezugnahme für die in dieser Schrift genannten Zwecke oder Gegenstände aufgenommen.
  • SEQUENZEN
  • Diese Anmeldung beschreibt durchgehend eine Vielzahl von Aminosäure- und Nukleotidsequenzen, die verschiedene Aspekte der vorliegenden Offenbarung betreffen, einschließlich beispielhafter Cas9-Sequenzen, Reverse-Transkriptase-Sequenzen, Fusionsproteinsequenzen, Linker, Leit-RNAs und andere Sequenzen. Außerdem beschreibt Beispiel 2 (und andere Stellen in dieser Schrift) einen Prozess und einen Algorithmus zum Entwerfen von und/oder Bestimmen der Sequenz von Tausenden von beispielhaften Prime-Editor-Leit-RNAs (PEgRNA) zum Reparieren beispielhafter Sequenzen aus der ClinVar-Datenbank.
  • Diese Anmeldung wird mit einem Sequenzprotokoll eingereicht. Das Sequenzprotokoll der PEgRNA beinhaltet eine Beschreibung der einzelnen PEgRNA, die gemäß Beispiel 2 bestimmt wurden. Insgesamt bestimmt Beispiel 2 die Sequenz von 133515 beispielhaften PEgRNA -vollständigen Sequenzen. Jede dieser Sequenzen ist in dem Sequenzprotokoll präsentiert/beinhaltet und als SEQ ID NOs: 1-135514 und 813085-880462 identifiziert. Darüber hinaus bestehen die PEgRNA, wie an anderer Stelle beschrieben, jeweils aus einem Spacer (SEQ ID NOs: 135515-271028 und 880463-947840) und einem Verlängerungsarm (SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218). Außerdem umfasst jede PEgRNA einen gRNA-Kern, beispielsweise wie durch SEQ ID NOs: 1361579-1361580 definiert. Die Verlängerungsarme der SEQ ID NOs: 271029-406542 und 947841-1015218 bestehen weiterhin jeweils aus einer Primerbindungsstelle (SEQ ID NOs: 406543-542056 und 1015219-1082596), einer Editiermatrize (SEQ ID NOs: 542057-677570 und 1082597-1149974) und einem Homologiearm (SEQ ID NOs: 677571-813084 und 1149975-1217352). Die PEgRNA kann optional eine 5'-Endmodifikatorregion und/oder eine 3'-Endmodifiziererregion umfassen. Die PEgRNA kann auch ein Reverse-Transkriptions-Terminationssignal (z. B. SEQ ID NOs: 1361560-1361566) am 3'-Ende der PEgRNA umfassen.
  • Für jede Volllängen-PEgRNA -Sequenz, die im Sequenzprotokoll (SEQ ID NOs: 1-135514) bereitgestellt wird, beinhaltet das Sequenzprotokoll einen Satz von fünf (5) entsprechenden Teilsequenzen: nämlich (1) Spacer, (2) Verlängerungsarm, (3) Primerbindungsstelle, (4) Editiermatrize und (5) Homologiearm. Der Satz von Teilsequenzen für jede gegebene PEgRNA -Sequenz in voller Länge kann durch die folgende mathematische Operation bestimmt werden.
  • Bestimmung des Satzes von Teilsequenzen für jede PEgRNA
  • Für jede PEgRNA -Sequenz (z. B. SEQ ID NO: 1) im Sequenzprotokoll bilden die folgenden Sequenzen im Sequenzprotokoll einen Satz entsprechender Teilsequenzen:
  • Für SEQ ID NOs: 1-813084 sind (1) Spacer, (2) Verlängerungsarm, (3) Primerbindungsstelle, (4) Editiermatrize und (5) Homologiearm wie folgt verknüpft:
  • Spacer: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Spacer-Sequenz als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 135514 hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist der Spacer, welcher der PEgRNA von SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 135515.
  • Verlängerungsarm: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird der entsprechende Verlängerungsarm als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), der dem Faktor 271028 (135514 X 2) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist der Verlängerungsarm, welcher der PEgRNA von SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 271029.
  • Primerbindungsstelle: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Primerbindungsstelle als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 406542 (135514 X 3) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Primerbindungsstelle, die der PEgRNA von SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 406542.
  • Editiermatrize: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Editiermatritze als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 542056 (135514 X 4) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Editiermatrize, die der PEgRNA von SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 542057.
  • Verlängerungsarm: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird der entsprechende Verlängerungsarm als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 677570 (135514 X 5) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Editiermatrize, die der PEgRNA von SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 677571.
  • Beispiele für andere PEgRNA-Sequenzsätze (d. h. umfassend jede gegebene PEgRNA aus den Sequenzen 1-813084, von denen jede gegen SpCas9 (NG) (SEQ ID NO: 1361594) oder SpCas9 (NGG) (SEQ ID NO: 1361593) entworfen wurde, und der entsprechende Spacer, Extensionsarm, Primerbindungsstelle, Editiermatrize und Homologiearm) sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
    Gruppe A vollständige PEgRNA Spacer Verlängerungsarm Primerbindungsstelle Editiermatrize Homologiearm
    SEQ ID NOs: 1 135.5 15 271.029 406.543 542.057 677.571
    SEQ ID NOs: 2 135.5 16 271.030 406.544 542.058 677.572
    SEQ ID NOs: 3 135.5 17 271.031 406.545 542.059 677.573
    SEQ ID NOs: 4 135.5 18 271.032 406.546 542.060 677.574
    SEQ ID NOs: 5 135.5 19 271.033 406.547 542.061 677.575
    SEQ ID NOs: 6 135.5 20 271.034 406.548 542.062 677.576
    ...
    SEQ ID NOs: 135.509 271.023 406.537 542.051 677.565 813.079
    SEQ ID NOs: 135.510 271.024 406.538 542.052 677.566 813.080
    SEQ ID NOs: 135.511 271.025 406.539 542.053 677.567 813.081
    SEQ ID NOs: 135.512 271.026 406.540 542.054 677.568 813.082
    SEQ ID NOs: 135.513 271.027 406.541 542.055 677.569 813.083
    SEQ ID NOs: 135.514 271.028 406.542 542.056 677.570 813.084
  • Unter Bezugnahme auf die Spalte „vollständige PEgRNA“-Sequenz wurden die folgenden Sequenzen gegen SpCas9 (NG) entworfen: SEQ ID NOs: 1-5647, 11805-16732, 22103-25050, 28363-29187, 30093-32319, 35189-36933, 38922-39997, 41226-42469, 43878-44208, 44586-46456, 48645-49697, 50844-52070, 53532-54670, 55949-57576, 59335-60913, 62672-64332, 66233-67299, 68520-69273, 70195-72171, 74385-74390, 74398-77256, 80717-81275, 81899-81962, 82033-82033, 82036-82044, 82057-82063, 82072 - 82075, 82080-82084, 82090-82092, 82096-82100, 82106-82110, 82117-82122, 82129 - 82405, 82715 -84431, 86323-86687, 87092-87715, 88417-88800, 89256-89791, 90405 - 92752, 95411 - 98661, 102329-103777, 105393-107009, 108826-109348, 109932-110356, 110863-111265, 111744-112224, 112822-113854, 115060-115952, 116995-117667, 118418-118426, 118436-119980, 121698-121921, 122175-122445, 122774-124123, 125657-126486, 127395-127872, 128428-128931, 129509-130164, 130892-131784, 132784-134059.
  • Unter Bezugnahme auf die Spalte „vollständige PEgRNA“-Sequenz wurden die folgenden Sequenzen gegen SpCas9 (NGG) entworfen: SEQ ID NOs: 5648-11804, 16733-22102, 25051-28362, 29188-30092, 32320-35188, 36934-38921, 39998-41225, 42470-43877, 44209-44585, 46457-8644, 49698-50843, 52071-53531, 54671-55948, 57577-59334, 60914-62671, 64333-66232, 67300-68519, 69274-70194, 72172-74384, 74391-74397, 77257-80716, 81276-81898, 81963-82032, 82034-82035, 82045-82056, 82064-82071, 82076-82079, 82085-82089, 82093-82095, 82101-82105, 82111-82116, 82123-82128, 82406-82714, 84432-86322, 86688-87091, 87716-88416, 88801-89255, 89792-90404, 92753-95410, 98662-102328, 103778-105392, 107010-108825, 109349-109931, 110357-110862, 111266-111743, 112225-112821, 113855-115059, 115953-116994, 117668-118417, 118427-118435, 119981-121697, 121922-122174, 122446-122773, 124124-125656, 126487-127394, 127873-128427, 128932-129508, 130165-130891, 131785-132783, 134060-135514.
  • Für SEQ ID NOs: 813085-1217352 sind (1) Spacer, (2) Verlängerungsarm, (3) Primerbindungsstelle, (4) Editiermatrize und (5) Homologiearm wie folgt verknüpft:
  • Spacer: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Spacer-Sequenz als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „813085“ für SEQ ID NO: 813085), die dem Faktor 67378 hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist der Spacer, welcher der PEgRNA aus SEQ ID NO: 813085 entspricht, SEQ ID NO: 880463.
  • Verlängerungsarm: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird der entsprechende Verlängerungsarm als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „813085“ für SEQ ID NO: 813085), die dem Faktor 134756 (67378 X 2) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist der Verlängerungsarm, welcher der PEgRNA aus SEQ ID NO: 813085 entspricht, SEQ ID NO: 947841.
  • Primerbindungsstelle: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Primerbindungsstelle als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „813085“ für SEQ ID NO: 813085), die dem Faktor 202134 (67378 X 3) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Primerbindungsstelle, die der PEgRNA aus SEQ ID NO: 813085 entspricht, SEQ ID NO: 1015219.
  • Editiermatrize: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Editiermatritze als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „813085“ für SEQ ID NO: 813085), die dem Faktor 269512 (67378 X 4) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Editiermatrize, die der PEgRNA aus SEQ ID NOs: 813085 entspricht, SEQ ID NO: 1082597.
  • Verlängerungsarm: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird der entsprechende Verlängerungsarm als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „813085“ für SEQ ID NO: 813085), die dem Faktor 336890 (67378 X 5) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Editiermatrize, die der PEgRNA aus SEQ ID NO: 813085 entspricht, SEQ ID NO: 1149975.
  • Die Gesamtzahl der in dem Sequenzprotokoll bereitgestellten Sequenzen beträgt 1217352. Es gibt insgesamt 202892 PEgRNA-vollständige Sequenzen (die jeweils mindestens einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfassen). Es gibt dieselbe Anzahl von (1) Spacern, (2) Verlängerungsarmen, (3) Primerbindungsstellen, (4) Editiermatrizen und (5) Homologiearmen, wobei jeweils Sätze wie vorstehend definiert sind.
  • Beispiele für andere PEgRNA-Sequenzsätze (d. h. die eine beliebige gegebene PEgRNA aus den Sequenzen 813085-1217352 und den entsprechenden Spacer, Verlängerungsarm, Primerbindungsstelle, Editiermatrize und Homologiearm umfassen) sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
    Gruppe B vollständige PEgRNA Space r Verlängerun gsarm Primerbindung sstelle Editierma trize Homologi earm
    SEQ ID NOs: 813.085 880.4 63 947.841 1.015.219 1.082.597 1.149.975
    SEQ ID NOs: 813.086 880.4 64 947.842 1.015.220 1.082.598 1.149.976
    SEQ ID NOs: 813.087 880.4 65 947.843 1.015.221 1.082.599 1.149.977
    SEQ ID NOs: 813.088 880.4 66 947.844 1.015.222 1.082.600 1.149.978
    SEQ ID NOs: 813.089 880.4 67 947.845 1.015.223 1.082.601 1.149.979
    SEQ ID NOs: 813.090 880.4 68 947.846 1.015.224 1.082.602 1.149.980
    ...
    SEQ ID NOs: 880.457 947.835 1.015.213 1.082.591 1.149.969 1.217.347
    SEQ ID NOs: 880.458 947.836 1.015.214 1.082.592 1.149.970 1.217.348
    SEQ ID NOs: 880.459 947.837 1.015.215 1.082.593 1.149.971 1.217.349
    SEQ ID NOs: 880.460 947.838 1.015.216 1.082.594 1.149.972 1.217.350
    SEQ ID NOs: 880.461 947.839 1.015.217 1.082.595 1.149.973 1.217.351
    SEQ ID NOs: 880.462 947.840 1.015.218 1.082.596 1.149.974 1.217.352
  • Jede der Sequenzen von SEQ ID NOs: 813.085-1.217.352 wurde gegen SaCas9-KKH (SEQ ID NO: 1361596) entworfen.
  • Das hiermit eingereichte Sequenzprotokoll soll Teil der vorliegenden Patentschrift in der ursprünglich eingereichten Fassung sein und bildet einen Teil derselben.
  • Eine Zusammenfassung des Inhalts des Sequenprotokolls (d. h. Inventars) ist wie folgt in Tabelle XY:
    SEQ ID NOs:* Molekülbeschreibung Klassifizierung
    1-135514 PEgRNA - vollständige Sequenz PEgRNA oder Bestandteil davon
    135515-271028 Spacer "
    271029-406542 Verlängerungsarm "
    406543-542056 Primerbindungsstelle "
    542057-677570 Editiermatrize "
    677571-813084 Homologiearm "
    813085- 880462 PEgRNA - vollständige Sequenz "
    880463- 947840 Spacer "
    947841- 1015218 Verlängerungsarm "
    1015219- 1082596 Primerbindungsstelle "
    1082597- 1149974 Editiermatrize "
    1149975- 1217352 Homologiearm "
    1217353-1289387 Krankheitsvarianten (Eingabe) - Variante + Kontextsequenz Priorisierte krankheitsbezogene Variante aus der ClinVar-Datenbank**, einschließlich 200 bp stromaufwärts und stromabwärts der Krankheitsvariante***
    1289388-1361420 Gesunde Allele (Ausgabe) - gesundes Allel + Kontextsequenz Entsprechendes gesundes Allel, einschließlich 200 bp stromaufwärts und stromabwärts des gesunden Allels***
    1361421-1361428 Wildtyp-kanonische SpCas9 napDNAbp/ Cas9
    1361429-1361442 Wildtyp-Cas9-Orthologe napDNAbp/ Cas9
    1361443-1361444 Tote Cas9-Variante napDNAbp/ Cas9
    1361445-1361456 und 1361593-1361596 Sonstige Cas9-Varianten napDNAbp/ Cas9
    1361457-1361462 Kleine Cas9-Varianten napDNAbp/ Cas9
    1361463-1361471 Cas9-Äquivalente napDNAbp/ Cas9
    1361472-1361474 Cas9 mit verlängertem PAM napDNAbp/ Cas9
    1361475-1361484 Cas9-zirkuläre Permutante napDNAbp/ Cas9
    1361485-1361496 Reverse Transkriptasen vom Wildtyp RTs
    1361497-1361514 und 1361597-1361598 Variante reverse Transkriptasen RTs
    1361515-1361519 und 1361602 PE-Fusionsproteine PE-Fusion
    1361520-1361530, 1361585 und 1361603 Linker Linker
    1361531-1361541 und 1361659-1361664 Kernokalisierungssequenz NLS
    1361542-1361547 Flap-Endonukleasen (FEN1/GEN1/ERCC5 usw.) Flap-Endonukleasen
    1361548-1361559 Zielstellen und Zielsequenzen PEgRNA
    1361560-1361565 Transkriptionsterminatoren PEgRNA
    1361566-1361578 Sonstige PEgRNA PEgRNA
    1361579-1361581 algorithmenbasiertes Design von PEgRNA PEgRNA
    1361582-1361584 PE-Komplexe PE-Komplexe
    1361586-1361592 TAG-Sequenzen TAG
    1361665-1361667 TREX
    1361668-1361670 EXO1
    1361671-1361678 INTEIN
    1361679-1361680 Haarnadel
    1361681 uracil
    1361682-1361685 IBR
    1361604-1361658 Sequenzen, die nur in den Figuren vorkommen FIG SEQ
  • PAM-Erkennungsseiten
  • Für jede der PEgRNA kann das Cas9 damit assoziierte PAM-Erkennungsstellen aufweisen. In einigen Ausführungsformen ist die PAM-Erkennungsstelle NGG. In einigen Ausführungsformen ist die PAM-Erkennungsstelle NG. In einigen Ausführungsformen ist die PAM-Erkennungsstelle KKH. Die folgende Tabelle veranschaulicht die assoziierte PAM-Stelle, die durch die PEgRNA der Offenbarung angezielt wird: Tabelle: XX: PAM-Assoziationen
    NG NGG KKH
    SEQ ID NOs: 1 - 5467 5648 - 11804 813085 - 1217352
    SEQ ID NOs: 11805 - 16732 16733 - 22102
    SEQ ID NOs: 22103 - 25050 25051 - 28362
    SEQ ID NOs: 28363 - 29187 29188 - 30092
    SEQ ID NOs: 30093 - 32319 32320 - 35188
    SEQ ID NOs: 35189 - 36933 36934 - 38921
    SEQ ID NOs: 38922 - 39997 39998 - 41225
    SEQ ID NOs: 41226 - 42469 42470 - 43877
    SEQ ID NOs: 43878 - 44208 44209 - 44585
    SEQ ID NOs: 44586 - 46456 46457 - 48644
    SEQ ID NOs: 48645 - 49697 49698 - 50843
    SEQ ID NOs: 50844 - 52070 52071 - 53531
    SEQ ID NOs: 53532 - 54670 54671 - 55948
    SEQ ID NOs: 55949 - 57576 57577 - 59334
    SEQ ID NOs: 59335 - 60913 60914 - 62671
    SEQ ID NOs: 62672 - 64332 64333 - 66232
    SEQ ID NOs: 66233 - 67299 67300 - 68519
    SEQ ID NOs: 68520 - 69273 69274 - 70194
    SEQ ID NOs: 70195 - 72171 72172 - 74384
    SEQ ID NOs: 74385 - 74390 74391 - 74397
    SEQ ID NOs: 74398 - 77256 77257 - 80716
    SEQ ID NOs: 80717 - 81275 81276 - 81898
    SEQ ID NOs: 81899 - 81962 81963 - 82032
    SEQ ID NOs: 82033 - 82033 82034 - 82035
    SEQ ID NOs: 82036 - 82044 82045 - 82056
    SEQ ID NOs: 82057 - 82063 82064 - 82071
    SEQ ID NOs: 82072 - 82075 82076 - 82079
    SEQ ID NOs: 82080 - 82084 82085 - 82089
    SEQ ID NOs: 82090 - 82092 82093 - 82095
    SEQ ID NOs: 82096 - 82100 82101 - 82105
    SEQ ID NOs: 82106 - 82110 82111 - 82116
    SEQ ID NOs: 82117 - 82122 82123 - 82128
    SEQ ID NOs: 82129 - 82405 82406 - 82714
    SEQ ID NOs: 82715 - 84431 84432 - 86322
    SEQ ID NOs: 86323 - 86687 86688 - 87091
    SEQ ID NOs: 87092 - 87715 87716 - 88416
    SEQ ID NOs: 88417 - 88800 88801 - 89255
    SEQ ID NOs: 89256 - 89791 89792 - 90404
    SEQ ID NOs: 90405 - 92752 92753 - 95410
    SEQ ID NOs: 95411 - 98661 98662 - 102328
    SEQ ID NOs: 102329 - 103777 103778 - 105392
    SEQ ID NOs: 105393 - 107009 107010 - 108825
    SEQ ID NOs: 108826 - 109348 109349 - 109931
    SEQ ID NOs: 109932 - 110356 110357 - 110862
    SEQ ID NOs: 110863 - 111265 111266 - 111743
    SEQ ID NOs: 111744 - 112224 112225 - 112821
    SEQ ID NOs: 112822 - 113854 113855 - 115059
    SEQ ID NOs: 115060 - 115952 115953 - 116994
    SEQ ID NOs: 116995 - 117667 117668 - 118417
    SEQ ID NOs: 118418 - 118426 118427 - 118435
    SEQ ID NOs: 118436 - 119980 119981 - 121697
    SEQ ID NOs: 121698 - 121921 121922 - 122174
    SEQ ID NOs: 122175 - 122445 122446 - 122773
    SEQ ID NOs: 122774 - 124123 124124 - 125656
    SEQ ID NOs: 125657 - 126486 126487 - 127394
    SEQ ID NOs: 127395 - 127872 127873 - 128427
    SEQ ID NOs: 128428 - 128931 128932 - 129508
    SEQ ID NOs: 129509 - 130164 130165 - 130891
    SEQ ID NOs: 130892 - 131784 131785 - 132783
    SEQ ID NOs: 132784 - 134059 134060 - 135514
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1. PRIME EDITING (PE) ZUR ANBRINGUNG PRÄZISER NUKLEOTIDÄNDERUNGEN IM GENOM
  • Ziel ist die Entwicklung einer transformativen Genom-Editierungstechnologie zur präzisen und allgemeinen Anbringung einzelner Nukleotidänderungen in Säugetiergenomen. Diese Technologie würde es Forschern erlauben, die Auswirkungen einzelner Nukleotidvariationen in praktisch jedem Säugetiergen zu untersuchen und möglicherweise therapeutische Interventionen zur Korrektur pathogener Punktmutationen bei menschlichen Patienten zu ermöglichen.
  • Die Einführung des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-Systems zur Genom-Editierung hat die Biowissenschaften revolutioniert1-3. Obwohl die Gendisruption mit CRISPR mittlerweile Routine ist, bleibt die präzise Anbringung einzelner Nukleotid-Editierungen eine große Herausforderung, obwohl sie für die Erforschung oder Korrektur einer großen Anzahl von krankheitsverursachenden Mutationen erforderlich ist. Homology Directed Repair (HDR) ist in der Lage, solche Editierungen zu erzielen, leidet jedoch unter geringer Effizienz (oft < 5 %), eine Anforderung für Spender-DNA-Reparaturmatrizen, sowie unter schädlichen Wirkungen bei der Bildung von doppelsträngigen DNA-Brüchen (DSB). Vor Kurzem hat das Liu-Labor Baseneditierung entwickelt, die ein effizientes Editieren einzelner Nukleotide ohne DSBs ermöglicht. Baseneditoren (BEs) kombinieren das CRISPR-System mit basenmodifizierenden Deaminaseenzymen, um jeweils Ziel-C•G oder A•T-Basenpaare zu A•T oder G•C umzuwandeln4-6. Obwohl unter Forschern weltweit bereits weit verbreitet (> 5.000 Liu-Labor-BE-Konstrukte, vertrieben von Addgene), ermöglichen aktuelle BEs nur vier der zwölf möglichen Basenpaarumwandlungen und sind nicht in der Lage, kleine Insertionen oder Deletionen zu korrigieren. Darüber hinaus ist der Targeting-Umfang der Baseneditierung durch das Editieren von Nicht-Ziel-C- oder A-Basen neben der Zielbase („Bystander-Editierung“) und durch die Anforderung, dass eine PAM-Sequenz 15 ± 2 bp von der Zielbase entfernt existieren muss, begrenzt. Die Überwindung dieser Einschränkungen würde daher die Grundlagenforschung und die therapeutischen Anwendungen der Genom-Editierung erheblich erweitern.
  • Vorliegend wird ein neuen Ansatz zur Präzisionseditierung vorgeschlagen, der viele der Vorteile der Baseneditierung bietet - nämlich Vermeidung von Doppelstrangbrüchen und Spender-DNA-Reparaturmatrizen- und gleichzeitig ihre größten Beschränkungen überwindet. Um dieses ehrgeizige Ziel zu erreichen, sollen editierte DNA-Stränge mittels Target-primed Reverse Transcription (TPRT) direkt an genomischen Zielstellen angebracht werden. In dem in dieser Schrift erörterten Design wird die CRISPR-Leit-RNA (gRNA) so konstruiert, dass sie eine Matrize trägt, welche die mutagene DNA-Strangsynthese codiert, um durch ein assoziiertes Enzym der reversen Transkriptase (RT) ausgeführt zu werden. Die CRISPR-Nuklease- (Cas9-) genickte Zielstellen-DNA dient als Primer für die reverse Transkription der Matrizensequenz, was den direkten Einbau jeder gewünschten Nukleotid-Editierung ermöglicht.
  • Experiment 1
  • Einrichten einer reversen Transkription mutagener DNA-Stränge mit Leit-RNA-Matrize. Frühere Studien haben gezeigt, dass Cas9 nach der DNA-Spaltung, aber vor der Komplexdissoziation den Nicht-Ziel-DNA-Strang freisetzt, um einen freien 3'-Terminus freizulegen. Es wird vermutet, dass dieser DNA-Strang einer Verlängerung durch Polymerase-Enzyme zugänglich ist und dass gRNAs durch Verlängerung ihres 5'- oder 3'-Terminus konstruiert werden können, um als Matrizen für die eine DNA-Synthese zu dienen. In vorläufigen In-vitro-Studien wurde festgestellt, dass geknickte DNA-Stränge innerhalb von Cas9:gRNA-gebundenen Komplexen in der Tat die reverse Transkription unter Verwendung der gebundenen gRNA als Matrize (RT-Enzym in trans) primen können. Als Nächstes werden verschiedene gRNA-Linker, Primerbindungsstellen und Editiermatrizen untersucht, um optimale Designregeln in vitro zu bestimmen. Anschließend werden verschiedene RT-Enzyme, die in trans oder als Fusionen mit Cas9 wirken, in vitro ausgewertet. Schließlich werden konstruierte gRNA-Designs identifiziert, die eine effiziente Bindungs- und Schneideaktivität in Zellen beibehalten. Die erfolgreiche Demonstration dieses Ziels wird eine Grundlage zur Durchführung der mutagenen Strangsynthese in Zellen bilden.
  • Experiment 2
  • Einrichten von Prime Editing in menschlichen Zellen. Basierend auf DNA-Verarbeitungs- und Reparaturmechanismen wird die Hypothese aufgestellt, dass mutagene DNA-Stränge (einzelsträngige Flaps) verwendet werden können, um eine spezifische und effiziente Editierung von Zielnukleotiden zu steuern. In ermutigenden Vorstudien wurde die Durchführbarkeit dieser Strategie nachgewiesen, indem die Editierung mit Modellplasmidsubstraten, die mutagene Flaps enthalten, demonstriert wurde. Gleichzeitig mit Experiment 1 werden die Reparaturergebnisse durch systematisches Variieren der Länge des mutagenen Flaps, der Sequenzzusammensetzung, der Zielnukleotididentität und des 3'-Terminus weiter ausgewertet. Kleine 1- bis 3-Nukleotid-Insertionen und -Deletionen werden ebenfalls getestet. Parallel dazu und aufbauend auf Experiment 1 werden Cas9-RT-Architekturen ausgewertet, darunter Fusionsproteine und nicht-kovalente Rekrutierungsstrategien. Cas9-RT-Architekturen und verlängerte gRNAs werden auf zelluläres Editieren an mehreren Zielstellen im menschlichen Genom getestet und dann für hohe Effizienz optimiert. Im Erfolgsfall würde dieses Ziel sofort eine TPRT-Genome-Editierung für grundlagenwissenschaftliche Anwendungen etablieren.
  • Experiment 3
  • Erzielen einer ortsspezifischen Editierung von pathogenen Mutationen in kultivierten menschlichen Zellen. Die potenzielle Allgemeingültigkeit dieser Technologie könnte die Editierung von Transversionsmutationen und Indels ermöglichen, die derzeit nicht durch BEs korrigierbar sind. Geleitet von den Ergebnissen aus Experiment 1 und Experiment 2 werden pathogene Transversionsmutationen in kultivierten menschlichen Zellen angezielt, einschließlich der Gründermutation der Sichelzellenanämie in Beta-Globin (erfordert eine A•T zu T•A-Transversion zur Korrektur) und der häufigsten Mutation des Morbus Wilson in ATP7B (erfordert eine G•C zu T•A-Transversion zur Korrektur). Die Korrektur kleiner Insertions- und Deletionsmutationen wird ebenfalls untersucht, einschließlich der 3-Nukleotid-ΔF508-Deletion in CFTR, die Mukoviszidose verursacht. Im Erfolgsfall würde dies den Grundstein für die Entwicklung leistungsfähiger therapeutischer Ansätze legen, die diese wichtigen menschlichen Krankheiten in Angriff nehmen.
  • Ansatz
  • Ziel ist die Entwicklung einer Genom-Editierungsstrategie, die Punktmutationen direkt an gezielten Genomstellen anbringt. In der Technologieentwicklungsphase werden sich die Bemühungen auf das Protein- und RNA-Engineering konzentrieren, um die TPRT-Funktionalität in die CRISPR/Cas System zu integrieren. In-vitro-Assays werden verwendet, um die Funktion jedes Schrittes der TPRT von Grund auf sorgfältig zu untersuchen (Experiment 1). Der zweite Schwerpunktbereich wird die Ergebnisse der Editierung in Säugetierzellen unter Verwendung einer Kombination von Modellsubstraten und technisch hergestellten CRISPR/Cas-Systemen (Experiment 2) bewerten. Schließlich wird die Anwendungsphase die Technologie nutzen, um Mutationen zu korrigieren, die mit anderen Verfahren der Genom-Editierung nicht zugänglich waren (Experiment 3).
  • Das allgemeine Editierdesign ist in 1A-1B gezeigt. Cas9-Nickasen enthalten inaktivierende Mutationen an der HNH-Nukleasedomäne (Spy Cas9 H840A oder N863A), welche die DNA-Spaltung auf den PAM-haltigen Strang (Nicht-Zielstrang) beschränken. Leit-RNAs (gRNAs) werden so konstruiert, dass sie eine Matrize für die reverse Transkription enthalten. Gezeigt ist eine 5'-Verlängerung der gRNA, aber auch 3'-Verlängerungen können implementiert werden. Die Cas9-Nickase ist entweder über den C-Terminus oder N-Terminus mit einem Reverse-Transkriptase-(RT)-Enzym fusioniert. Der gRNA:Cas9-RT-Komplex zielt auf die interessierende DNA-Region ab und bildet eine R-Schleife, nachdem der Nicht-Zielstrang verdrängt wurde. Cas9 schneidet den Nicht-Ziel-DNA-Strang. Die Freisetzung des eingenickten Strangs legt einen freien 3'-OH-Terminus frei, der dazu in der Lage ist, die reverse Transkription unter Verwendung der verlängerten gRNA als Matrize zu primen. Diese DNA-Synthesereaktion wird durch das fusionierte RT-Enzym durchgeführt. Die gRNA-Matrize codiert eine DNA-Sequenz, die homolog zum ursprünglichen DNA-Duplex ist, mit Ausnahme des Nukleotids, das für die Editierung bestimmt ist. Das Produkt der reversen Transkription ist ein einzelsträngiger DNA-Flap, der die gewünschte Editierung codiert. Dieser Flap, der einen freien 3'-Terminus enthält, kann mit dem benachbarten DNA-Strang äquilibrieren, was zu einer 5'-Flap-Spezies führt. Es wird vermutet, dass die letztere Spezies als effizientes Substrat für FEN1 (Flap-Endonuklease 1) dient, ein Enzym, das auf natürliche Weise 5'-Flaps aus Okazaki-Fragmenten während der DNA-Synthese des diskontinuierlichen Strangs ausschneidet und 5'-Flaps nach der Strangverdrängungssynthese entfernt, die während der Long-Patch-Basenexzisionsreparatur auftritt. Die Ligation der genickten DNA erzeugt ein fehlgepaartes Basenpaar. Dieses Zwischenprodukt könnte entweder einer Reversion zum ursprünglichen Basenpaar oder einer Umwandlung in das gewünschte editierte Basenpaar über Fehlpaarungsreparaturprozesse (mismatch repair - MMR) unterzogen werden. Alternativ dazu könnte eine semikonservative DNA-Replikation zu je einer Kopie der Reversion und der Editierung führen.
  • 1. Einrichten einer reversen Transkription mutagener DNA-Stränge mit Leit-RNA-Matrize. Stand der Technik und Begründung
  • In der vorgeschlagenen Genomeditierungsstrategie fungiert der Cas9-genickte Nicht-Ziel-DNA-Strang (PAM-haltiger Strang, der die R-Schleife bildet) als Primer für die DNA-Synthese. Basierend auf mehreren biochemischen und strukturellen Daten wird die Hypothese aufgestellt, dass dies möglich ist. Nuklease-Schutz-Experimente32, kristallographische Studien33 und Baseneditierfenster4,24 haben ein hohes Maß an Flexibilität und Unordnung für die Nicht-Zielstrang-Nukleotide -20 bis -10 innerhalb der sogenannten R-Schleife des Cas9-gebundenen Komplexes gezeigt (Nummerierung zeigt den Abstand 5' vom ersten PAM-Nukleotid an). Darüber hinaus kann der PAM-distale Abschnitt des gespaltenen Nicht-Zielstrangs von fest gebundenen ternären Komplexen verdrängt werden, wenn komplementäre ssDNA in trans hinzugefügt wird20. Diese Studien belegen, dass der Nicht-Zielstrang hochflexibel ist, für Enzyme zugänglich ist und dass nach dem Nicking der 3'-Terminus des PAM-distalen Fragments vor der Cas9-Dissoziation freigesetzt wird. Darüber hinaus wird die Hypothese aufgestellt, dass gRNAs auf Matrizen-DNA-Synthese verlängert werden können. Frühere Studien haben gezeigt, dass gRNAs für SpCas9, SaCas9 und LbCas12a (früher Cpf1) gRNA-Verlängerungen mit RNA-Aptameren34, Ligand-induzierbaren selbstspaltenden Ribozymen35 und langen nicht-codierenden RNAs36 tolerieren. Diese Literatur schafft Präzedenzfälle für zwei Hauptmerkmale, die ausgenutzt werden. Bei der Bewertung dieser Strategie werden mehrere CRISPR-Cas-Systeme in Verbindung mit 5'- und 3'-verlängerten gRNA-Designs unter Verwendung einer Kombination von in vitro- und zellulären Assays ausgewertet (2A-2C).
  • Designs für konstruierte gRNAs für das Prime Editing sind in 3A- 3B gezeigt. Die DNA-Synthese verläuft von 5' nach 3' und kopiert somit die RNA-Matrize in die Richtung 3' nach 5'. Das Design für die 5'-Verlängerung enthält eine Linker-Region, eine Primerbindungsstelle, an der sich der eingenickte DNA-Strang anlagert, und eine Matrize zur DNA-Synthese durch reverse Transkription. Die 3'-verlängerte gRNA enthält eine Primerbindungsstelle und eine Reverse-Transkriptions-Matrize. In einigen Fällen ist die 3'-RNA-Haarnadel des gRNA-Kerns so modifiziert, dass sie der DNA-Zielsequenz entspricht, da In-vitro-Experimente gezeigt haben, dass reverse Transkription ~3 Nukleotide in den gRNA-Kern für die 3'-verlängerten gRNA-Konstrukte verlängert (die Modifikation der Haarnadelsequenz scheint gut toleriert zu werden, solange kompensatorische Änderungen vorgenommen werden, welche die Haarnadel-RNA-Struktur erhalten). Die DNA-Synthese verläuft 5' bis 3', wobei Nukleotide an das 3'-OH des wachsenden DNA-Strangs angefügt werden.
  • Vorläufige Ergebnisse
  • Cas9-genickte DNA primt die reverse Transkription von gRNA-Matrizen. Um die Zugänglichkeit des genickten Nicht-Ziel-DNA-Strangs zu bewerten, wurden biochemische In-vitro-Assays unter Verwendung der Cas9-Nuklease aus S. pyogenes (SpCas9) und Cy5-fluoreszenzmarkierten Duplex-DNA-Substraten (51 Basenpaare) durchgeführt. Zuerst wurde eine Reihe von gRNAs, die 5'-Verlängerungen mit unterschiedlichen Editiermatrizenlängen enthielten, durch In vitro-Transkription hergestellt (Gesamtdesign in 2B gezeigt). Elektrophoretische Mobility-Shift-Assays (EMSA) mit Nuklease-totem Cas9 (dCas9) zeigten, dass 5'-verlängerte gRNAs die Zielbindungsaffinität beibehalten (Daten nicht gezeigt). Als Nächstes wurde die TPRT-Aktivität auf vorgenickten Cy5-markierten Duplex-DNA-Substraten unter Verwendung von dCas9, 5'-verlängerten gRNAs und der reversen Transkriptase des Molony-Mäuse-Leukämievirus (M-MLV) (Superscript III) getestet. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Produkte durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ausgewertet und unter Verwendung von Cy5-Fluoreszenz abgebildet (4A). Jede 5'-verlängerte gRNA-Variante führte zu einer signifikanten Produktbildung, wobei die beobachteten DNA-Produktgrößen mit der Länge der Verlängerungsmatrize übereinstimmten (4B). Wichtig ist, dass in Abwesenheit von dCas9 die vorgenickten Substrate auf die volle Länge von 51 bp des DNA-Substrats verlängert wurden, was stark darauf hindeutet, dass der komplementäre DNA-Strang und nicht die gRNA als Matrize für die DNA-Synthese verwendet wurde, als dCas9 nicht vorhanden war (4C). Bemerkenswert ist, dass das System so konzipiert wurde, dass der neu synthetisierte DNA-Strang das Produkt widerspiegelt, das für die Editierung der Zielstelle erforderlich wäre (ein homologer Strang mit einer einzigen Nukleotidänderung). Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Cas9:gRNA-Bindung das 3'-Ende des genickten Nicht-Ziel-Strangs freilegt, und dass der Nicht-Ziel-Strang für die reverse Transkription zugänglich ist.
  • Als Nächstes wurden nicht-genickte dsDNA-Substrate unter Verwendung der Cas9(H840A)-Mutante ausgewertet, die den Nicht-Ziel-DNA-Strang nickt. Um Cas9(H840A)-Nickase-Aktivität mit 5'-verlängerten gRNAs zu testen, wurden zunächst In vitro-Spaltungsassays wie zuvor beschrieben37 durchgeführt. Obwohl das Nicking im Vergleich zur Standard-gRNA beeinträchtigt war, wurden nennenswerte Spaltprodukte gebildet (4D). Wichtig ist, dass auch RT-Produkte beobachtet wurden, wenn TPRT-Reaktionen mit 5'-verlängerten gRNAs und Cas9 (H840A) durchgeführt wurden, wenn auch in geringeren Ausbeuten, die sich wahrscheinlich durch die verringerte Nicking-Aktivität erklären lassen (4D). Dieses Ergebnis zeigt, dass 5'-verlängerte gRNA:Cas9(H840A)-Komplexe DNA nicken und eine Matrize für die reverse Transkription bilden können.
  • Schließlich wurden 3'-gRNA-Verlängerungen auf Cas9(H840A)-Nicking und TPRT untersucht. Im Vergleich zu 5'-verlängerten gRNAs wurde die DNA-Spaltung durch 3'-verlängerte gRNAs verglichen mit der Standard-gRNA in keinem nachweisbaren Ausmaß beeinträchtigt. Bedeutsamerweise unterstützten 3'-verlängerte gRNA-Matrizen auch eine effiziente reverse Transkription sowohl mit vorgenickten als auch intakten Duplex-DNA-Substraten, wenn M-MLV-RT in trans bereitgestellt wurde (4E). Überraschenderweise wurde nur ein einziges Produkt für 3'-verlängerte Matrizen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die reverse Transkription an einer bestimmten Stelle entlang des gRNA-Gerüsts endet. Homopolymer-Tailing des Produkts mit terminaler Transferase gefolgt von Klenow-Verlängerung und Sanger-Sequenzierung zeigte, dass die vollständige gRNA-Editiermatrize zusätzlich zu den terminalen 3 Nukleotiden des gRNA-Kerns kopiert wurde. In Zukunft wird der Flap-Terminus durch Modifikation der terminalen gRNA-Sequenz umprogrammiert38,39. Dieses Ergebnis zeigt, dass 3'-verlängerte gRNAs als effiziente Nuklease-Targeting-Leiter dienen und eine Matrize für die reverse Transkription bilden können.
  • Cas9-TPRT verwendet genickte DNA und gRNA in cis. Zweifarbexperimente wurden verwendet, um zu bestimmen, ob die RT-Reaktion bevorzugt mit der gRNA in cis (gebunden im gleichen Komplex) abläuft (siehe 8). Für 5'-verlängerte und 3'-verlängerte gRNAs wurden zwei separate Experimente durchgeführt. Für ein gegebenes Experiment wurden ternäre Komplexe von dCas9, gRNA und DNA-Substrat in separaten Röhrchen gebildet. In einem Röhrchen codiert die gRNA ein langes RT-Produkt und das DNA-Substrat ist mit Cy3 (rot) markiert; im anderen codiert die gRNA ein kurzes RT-Produkt und das DNA-Substrat ist mit Cy5 (blau) markiert. Nach kurzen Inkubationen wurden die Komplexe gemischt und dann mit RT-Enzym und dNTPs behandelt. Die Produkte wurden durch Harnstoff-denaturierende PAGE getrennt und durch Fluoreszenz in den Cy3- und Cy5-Kanälen sichtbar gemacht. Es wurde festgestellt, dass sich Reaktionsprodukte bevorzugt unter Verwendung der gRNA-Matrize bilden, die mit dem DNA-Substrat vorkomplexiert wurde, was darauf hindeutet, dass die RT-Reaktion wahrscheinlich in cis ablaufen kann. Dieses Ergebnis belegt, dass ein einzelner Cas9:gRNA-Komplex auf eine DNA-Stelle abzielen und die reverse Transkription eines mutagenen DNA-Strangs zur Matrize machen kann.
  • (viii) Testen von TPRT mit anderen Cas-Systemen
  • Ähnliche Experimente wie die in den vorherigen Abschnitten vorgestellten werden unter Verwendung anderer Cas-Systeme durchgeführt, einschließlich Cas9 aus S. aureus und Cas12a aus L. bacterium (siehe 2A-2C). Wenn TRPT auch für diese Cas-Varianten demonstriert werden kann, würden der potenzielle Editierumfang und die Wahrscheinlichkeit des Gesamterfolgs in Zellen steigen.
  • (ix) Testen von TPRT mit RT-Cas9-Fusionsproteinen
  • Eine Reihe von im Handel erhältlichen oder reinigbaren RT-Enzymen wird zunächst in trans auf TPRT-Aktivität untersucht. Neben der bereits getesteten RT von M-MLV werden die RT von Avian Myeloblastosis Virus (AMV), dem Geobacillus stearothermophilus-Gruppe II-Intron (GsI-IIC)41,42 und dem Eubacterium rectale-Gruppe II-Intron (Eu.re .I2)43,44 ausgewertet. Bezeichnenderweise führen die beiden letztgenannten RTs TPRT in ihrem natürlichen biologischen Kontext durch. Gegebenenfalls werden RNAse-inaktivierende Mutationen und andere potenziell vorteilhafte RT-Enzymmodifikationen getestet. Sobald funktionelle RTs identifiziert sind, wenn sie in trans bereitgestellt werden, wird jede als Fusionsprotein zu Cas9-Varianten ausgewertet. Sowohl die N-Terminus- als auch die C-Terminus-Fusionsausrichtungen werden zusammen mit verschiedenen Linkerlängen und Architekturen getestet. Kinetische Zeitverlaufsexperimente werden verwendet, um zu bestimmen, ob TPRT unter Verwendung des RT-Enzyms in cis erfolgen kann. Wenn eine RT-Cas9-Fusionsarchitektur konstruiert werden kann, die eine effiziente TPRT-Chemie ermöglicht, wird dies die Wahrscheinlichkeit einer funktionellen Editierung im Kontext einer Zelle erheblich erhöhen.
  • (x) Cas9-Targeting mit konstruierten gRNAs in Zellen
  • In den vorherigen Unterzielen entwickelte Kandidaten-gRNAs werden in humanen Zellkulturexperimenten (HEK293) ausgewertet, um die Wirksamkeit des Cas9-Targetings zu bestätigen. Unter Verwendung etablierter Informations-Bildungsassays unter Verwendung von Wildtyp-SpCas945 werden manipulierte gRNAs Seite an Seite mit Standard-gRNAs über 5 oder mehr Stellen im menschlichen Genom verglichen. Die Effizienz der Genom-Editierung wird durch die Amplikon-Sequenzierung im Multiplex unter Verwendung der im Labor untergebrachten Illumina MiSeq-Plattform charakterisiert. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse aus diesem und den vorherigen Abschnitten Erkenntnisse liefern, die in nachfolgende Iterationen des Design-Build-Test-Zyklus einfließen können, in dem gRNAs sowohl zur Matrizenbildung für reverse Transkription als auch zum effizienten Cas9-Targeting in Zellen optimiert werden können.
  • Ergebnisse von in vitro-Validierungen sind in 5-7 gezeigt. In-vitro-Experimente zeigten, dass der genickte Nicht-Ziel-DNA-Strang flexibel und zum Priming der DNA-Synthese verfügbar ist und dass die gRNA-Verlängerung als Matrize für die reverse Transkription dienen kann (siehe 5). Dieser Satz von Experimenten verwendete 5'-verlängerte gRNAs (entworfen wie in den 3A-3B gezeigt) mit Editiermatrizen unterschiedlicher Länge (links aufgelistet). Fluoreszierend markierte (Cy5) DNA-Ziele wurden als Substrate verwendet und wurden in dieser Reihe von Experimenten vorgenickt. Das in diesen Experimenten verwendete Cas9 ist katalytisch totes Cas9 (dCas9), kann also keine DNA schneiden, aber dennoch effizient binden. Superscript III, eine im Handel erhältliche RT, die vom Moloney-Maus-Leukämievirus (M-MLV) abgeleitet ist, wurde in trans zugeführt. Zuerst wurden dCas9:gRNA-Komplexe aus gereinigten Komponenten gebildet. Dann wurde das fluoreszenzmarkierte DNA-Substrat zusammen mit dNTPs und dem RT-Enzym zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Reaktionsprodukte durch denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Das Gelbild zeigt die Verlängerung des ursprünglichen DNA-Strangs auf Längen, die mit der Länge der reversen Transkriptionsmatrize übereinstimmen. Bemerkenswert ist, dass Reaktionen, die in Abwesenheit von dCas9 durchgeführt wurden, unabhängig von der verwendeten gRNA DNA-Produkte mit einer Länge von 51 Nukleotiden produzierten. Dieses Produkt entspricht der Verwendung des komplementären DNA-Strangs als Matrize für die DNA-Synthese und nicht der RNA (Daten nicht gezeigt). Somit ist die Cas9-Bindung erforderlich, um die DNA-Synthese an die RNA-Matrize zu lenken. Dieser Satz von In-vitro-Experimenten ähnelt stark den in 5 gezeigten, mit der Ausnahme, dass das DNA-Substrat nicht vorgenickt ist und eine Cas9-Nickase (SpyCas9 H840A-Mutante) verwendet wird. Wie im Gel gezeigt, spaltet die Nickase den DNA-Strang effizient, wenn die gRNA verwendet wird (gRNA_0, Bahn 3). Es werden mehrere Spaltungsprodukte beobachtet, die mit früheren biochemischen Studien von SpyCas9 übereinstimmen. Die 5'-Verlängerung beeinträchtigt die Nicking-Aktivität (Bahnen 4-8), jedoch wird immer noch etwas RT-Produkt beobachtet. 7 zeigt, dass 3'-Verlängerungen die DNA-Synthese unterstützen und die Cas9-Nickase-Aktivität nicht signifikant beeinflussen. Vorgenickte Substrate (schwarzer Pfeil) werden nahezu quantitativ in RT-Produkte umgewandelt, wenn entweder dCas9- oder Cas9-Nickase verwendet wird (Bahnen 4 und 5). Bei Vollsubstraten (Bahn 3) wird eine Umwandlung von mehr als 50 % zum RT-Produkt (roter Pfeil) beobachtet. Zur Bestimmung der Länge und Sequenz des RT-Produkts wurde der Produktbereich aus dem Gel ausgeschnitten, extrahiert und sequenziert. Dies ergab, dass RT 3 Nukleotide in die 3'-terminale Haarnadel verlängerte. Nachfolgende Experimente demonstrierten, dass diese drei Nukleotide geändert werden konnten, um den Ziel-DNA-Sequenzen zu entsprechen, solange komplementäre Änderungen vorgenommen wurden, welche die Haarnadel-RNA-Struktur aufrechterhalten.
  • (xi) Mögliche Schwierigkeiten und Alternativen
  • (1) RT funktioniert nicht als Fusion: Molecular Crowding und/oder ungünstige Geometrien könnten die Polymerase-Extension durch Cas9-fusionierte RT-Enzyme behindern. Zunächst kann die Linker-Optimierung getestet werden. Es werden zirkulär permutierte Varianten von Cas9 untersucht, welche die räumliche Beziehung zwischen DNA-Primer, gRNA und RT-Enzym neu ausrichten könnten. Nicht-kovalente RT-Rekrutierungsstrategien, wie in Experiment 2 beschrieben, können getestet werden. (2) Verringerte Cas-Targeting-Effizienz durch verlängerte gRNA-Varianten: Dies ist höchstwahrscheinlich ein Problem bei 5'-verlängerten gRNAs. Basierend auf Strukturdaten24 können Cas9-Mutanten entworfen und gescreent werden, um Varianten mit größerer Toleranz gegenüber einer gRNA-Verlängerung zu identifizieren. Darüber hinaus könnten gRNA-Bibliotheken in Zellen auf Linker gescreent werden, welche die Targeting-Aktivität verbessern.
  • Bedeutung
  • Diese vorläufigen Ergebnisse belegen, dass Cas9-Nickasen und verlängerte gRNAs die Ziel-geprimte reverse Transkription auf gebundenen DNA-Zielen unter Verwendung einer in trans bereitgestellten reversen Transkriptase initiieren können. Wichtig ist, dass die Cas9-Bindung für die Produktbildung von entscheidender Bedeutung ist. Obwohl dies möglicherweise keine absolute Voraussetzung für die Genom-Editierung in Zellen ist, würde eine Weiterentwicklung des Systems, das die RT-Enzymfunktion in cis beinhaltet, die Erfolgswahrscheinlichkeit bei zellbasierten Anwendungen erheblich erhöhen. Die Verwirklichung der verbleibenden Aspekte dieses Ziels würde eine molekulare Grundlage für die Durchführung einer präzisen Genom-Editierung im Kontext des menschlichen Genoms schaffen.
  • 2. Einrichten von Prime Editing in menschlichen Zellen.
  • Stand der Technik und Begründung
  • In der vorgeschlagenen Strategie wird ein konstruierter RT-Cas9:gRNA-Komplex mutagene 3'-DNA-Flaps an genomischen Zielstellen einführen. Es wird angenommen, dass mutagene 3'-Flaps, die eine einzelne Fehlpaarung enthalten, von der DNA-Reparaturmaschinerie durch energetisch zugängliche Äquilibrierung mit benachbarten 5'-Flaps eingebaut werden, die vorzugsweise entfernt würden (1B). Die DNA-Replikations- und Reparaturmaschinerie trifft bei der Verarbeitung von Okazaki-Fragmenten46 und während der Long-Patch-Basenexzisionsreparatur (LP-BER)47 auf 5' ssDNA-Flap. 5'-Flaps sind die bevorzugten Substrate für die weit verbreitete Flap-Endonuklease FEN1, die durch den homotrimeren Gleitklemmenkomplex PCNA48 an DNA-Reparaturstellen rekrutiert wird. PCNA dient auch als Gerüst für die gleichzeitige Rekrutierung anderer Reparaturfaktoren, einschließlich der DNA-Ligase Lig149. Als „Werkzeuggürtel“ beschleunigt PCNA die serielle Flapspaltung und -ligation, die für die Verarbeitung der Millionen von Okazaki-Fragmenten, die bei jeder Zellteilung erzeugt werden, unerlässlich ist50,51. Aufgrund der Ähnlichkeit mit diesen natürlichen DNA-Zwischenprodukten wird angenommen, dass mutagene Stränge durch Äquilibrierung mit 5'-Flaps, gefolgt von koordinierter 5'-Flaps-Exzision und -Ligation, eingebaut werden. Die Mismatch-Reparatur (MMR) sollte dann an jedem Strang mit gleicher Wahrscheinlichkeit auftreten, was zu einem Editieren oder einer Reversion führt (1B). Alternativ dazu könnte die DNA-Replikation zuerst erfolgen und direkt zum Einbau der Editierung in den neu synthetisierten Tochterstrang führen. Während die höchste erwartete Ausbeute dieses Prozesses bei 50 % liegt, könnten mehrere Versuche zur Editierung des Substrats die Reaktion aufgrund der Irreversibilität der Editierreperatur zum Abschluss führen.
  • Vorläufiges Ergebnis
  • DNA-Flaps induzieren ortsspezifische Mutagenese in Plasmidmodellsubstraten in Hefe- und HEK-Zellen. Um die vorgeschlagene Editierungsstrategie zu testen, wurden Studien mit Modellplasmidsubstraten initiiert, die mutagene 3'-Flaps enthielten, die dem Produkt von TPRT ähneln. Es wurde ein dualer fluoreszierender Proteinreporter geschaffen, der ein Stopcodon zwischen GFP und mCherry codiert. Mutagene Flaps codieren eine Korrektur des Stopcodons (9A), was die mCherry-Synthese ermöglicht. Somit kann die Mutageneseeffizienz durch GFP:mCherry-Verhältnisse quantifiziert werden. Plasmidsubstrate wurden in vitro hergestellt und in Hefe- (S. cerevisiae) oder humane Zellen (HEK293) eingeführt. In beiden Systemen wurde eine Hochfrequenz-Mutagenese beobachtet (9B) und isolierte Hefekolonien enthielten entweder die umgekehrte Base, die mutierte Base oder eine Mischung beider Produkte (9C). Der Nachweis des letzteren legt nahe, dass die Plasmidreplikation in diesen Fällen vor der MMR stattfand, und legt ferner nahe, dass die Flap-Exzision und -Ligation der MMR vorausgehen. Dieses Ergebnis belegt die Machbarkeit der DNA-Editierung unter Verwendung von mutagenen 3'-Strängen.
  • (i) Systematische Studien mit Modell-Flap-Substraten
  • Basierend auf den oben beschriebenen vorläufigen Ergebnissen wird ein breiteres Spektrum von Flap-Substraten in HEK-Zellen ausgewertet, um Prinzipien für effizienter Editieren abzuleiten. 3'-ssDNA-Flaps werden systematisch variiert, um den Einfluss von Fehlpaarungen, die Lage des mutagenen Nukleotids entlang des Flaps und die Identität des terminalen Nukleotids zu bestimmen (9D). Einzelnukleotid-Insertionen und -Deletionen werden ebenfalls getestet. Die Amplikon-Sequenzierung wird verwendet, um die Editierpräzision zu analysieren. Diese Ergebnisse werden dazu beitragen, das Design von gRNA-Reverse-Transkriptions-Matrizen zu informieren.
  • In-vitro-TPRT auf Plasmidsubstraten führt zu effizienten Editierergebnissen. In Experiment 1 entwickelte TPRT-Reaktionen wurden dazu verwendet, Mutagenese innerhalb eines Plasmidsubstrats zu induzieren. Die Reaktion wurde auf zirkulären DNA-Plasmid-Substraten durchgeführt (siehe 10). Dies schließt die Möglichkeit der DNA-Strangdissoziation als Mechanismus für die RT-Verlängerung in den vorherigen in-vitro-Experimenten aus. Es ermöglichte auch das Testen der DNA-Reparatur von Flap-Substraten in Zellen. Für die Expression in Hefe (S. cerevisiae) wurde ein dual fluoreszierendes Reporterplasmid konstruiert. Dieses Plasmid codiert für GFP (grün fluoreszierendes Protein) und mCherry (rot fluoreszierendes Protein) mit einem dazwischenliegenden Stopcodon (TGA). Die Expression dieses Konstrukts in Hefe produziert nur GFP. Das Plasmid wurde als Substrat für in-vitro-TRT verwendet [Cas9(H840A) Nickase, konstruierte gRNA, MLV-RT-Enzym, dNTPS]. Die gRNA-Verlängerung codiert für eine Mutation des Stopcodons. Der Flap-Strang wird zur Reparatur des Stopcodons verwendet und soll ein Plasmid erzeugen, das sowohl GFP als auch mCherry als Fusionsprotein exprimiert. Hefe-Dual-FP-Plasmid-Transformanten sind in 10 gezeigt. Die Transformation des Elternplasmids oder eines In-vitro-Cas9 (H840A)-genickten Plasmids führt zu nur grünen GFP-exprimierenden Kolonien. Eine TRT-Reaktion mit 5'-verlängerten oder 3'-verlängerten gRNAs erzeugt eine Mischung aus grünen und gelben Kolonien. Letztere exprimieren sowohl GFP als auch mCherry. Bei der 3'-verlängerten gRNA werden mehr gelbe Kolonien beobachtet. Eine positive Kontrolle, die kein Stopcodon enthält, ist ebenfalls gezeigt.
  • Dieses Ergebnis belegt, dass lange doppelsträngige Substrate TPRT durchlaufen können und dass TPRT-Produkte in eukaryontischen Zellen Editieren induzieren.
  • Ein weiteres Experiment, das dem vorherigen Prime-Editing-Experiment ähnlich ist, wurde durchgeführt, aber anstatt eine Punktmutation im Stop-Codon anzubringen, bringt das Prime Editing eine einzige Nukleotid-Insertion (links) oder Deletion (rechts) an, die eine Frameshift-Mutation repariert und die Synthese stomabwärts von mCherry ermöglicht (siehe 11). Beide Experimente verwendeten 3'-verlängerte gRNAs. Einzelne Kolonien aus den TRT-Transformationen wurden ausgewählt und durch Sanger-Sequenzierung analysiert (siehe 12) Grüne Kolonien enthielten Plasmide mit der ursprünglichen DNA-Sequenz, während gelbe Kolonien die genaue Mutation enthielten, die von der Prime-Editing-gRNA entworfen wurde. Es wurden keine anderen Punktmutationen oder Indels beobachtet.
  • (ii) Einrichten von Prime Editing in HEK-Zellen mit RT-Cas9-Architekturen
  • Die optimierten Konstrukte aus früheren Zielen werden für die Säugetierexpression und - Editierung an Zielstellen im menschlichen Genom angepasst. Es werden mehrere RT-Enzyme und Fusionsarchitekturen getestet, zusätzlich zum benachbarten Targeting mit sekundären gRNAs (verkürzt, um Nicking zu verhindern). Die nicht-kovalente RT-Rekrutierung wird auch unter Verwendung des Sun-Tag-Systems52 und des MS2-Aptamer-Systems53 ausgewertet. Indel-Bildungsassays werden verwendet, um die Targeting-Effizienz mit Standard-gRNAs und RT-Cas9-Fusionen (wie vorstehend) auszuwerten. Dann werden für jede genomische Stelle verlängerte gRNAs und RT-Cas9-Paare auf Einzelnukleotid-Editierung untersucht. Die Bearbeitungsergebnisse werden mit MiSeq ausgewertet.
  • Anfängliche Experimente in HEK-Zellen wurden unter Verwendung von Cas9-RT-Fusionen durchgeführt. Das Editieren durch innerhalb von Zellen exprimierte Komponenten erfordert eine Cas9(H840A)-Nickase, eine reverse Transkriptase (als Fusion exprimiert oder in trans bereitgestellt) und eine gentechnisch veränderte gRNA mit einer 3'-Verlängerung (siehe 14). Vorläufige Studien zeigten, dass die Länge der Primerbindungsstelle innerhalb der gRNA-Verlängerung wichtig war, um die Effizienz des Editierens in menschlichen Zellen zu erhöhen (siehe 15).
  • (iii) Optimieren von Prime-Editing-Parametern in HEK-Zellen
  • Nach Identifizierung von Cas9-RT-Architekturen, die eine erstklassige Editierung in Zellen durchführen können, werden die Komponenten und das Design optimiert, um eine hocheffiziente Editierung zu erreichen. Der Ort und die Nukleotididentität der codierten Punktmutation sowie die Gesamtlänge des neu synthetisierten DNA-Strangs werden variiert, um den Umfang der Editierung und mögliche Einschränkungen zu bewerten. Kurze Insertions- und Deletionsmutationen werden ebenfalls ausgewertet. Proteinexpressionskonstrukte werden codonoptimiert. Im Erfolgsfall würde dies ein effizientes Prime Editing in Säugetierzellen etablieren.
  • Vorläufiges Ergebnis. Für den Fall, dass eine intramolekulare reverse Transkription durch das fusionierte RT-Enzym nicht möglich war, wurden zusätzliche gRNAs entworfen, um das RT-Enzym auf eine höhere lokale Konzentration am Editierlocus zu bringen. Diese Hilfsleiter sind am 5'-Ende (14-15 nt Spacer) verkürzt, was zuvor gezeigt wurde, um Cas9-Schneiden zu verhindern, aber die Bindung beizubehalten (siehe 16). Der HEK3-Locus wurde ausgewählt, um diese Strategie zu untersuchen.
  • (iv) Mögliche Schwierigkeiten und Alternativen
  • 1) gRNA-Abbau in Zellen: Werden verlängerte gRNA-Termini in Zellen verkürzt, könnten stabilisierende Sekundärstrukturen eingebaut oder synthetische gRNAs mit stabilisierenden Modifikationen getestet werden. (2) Keine beobachtete Editierung in menschlichen Zellen: zusätzliche Strategien werden untersucht, einschließlich sekundäres Lenken von RT-Cas9-Fusionen auf benachbarte genomische Stellen54. Darüber hinaus könnten potenzielle Strategien der gesteuerten Evolution in E. coli oder S. cerevisiae erforscht werden.
  • Bedeutung
  • Wenn in experimentellen Zelllinien Prime Editing eingerichtet werden könnte, hätte dies unmittelbare Auswirkungen auf die biomedizinische Grundlagenforschung, indem es die schnelle Erzeugung und Charakterisierung einer Vielzahl von Punktmutationen in menschlichen Genen ermöglicht. Die Allgemeingültigkeit des Verfahrens und sein orthogonales Editierfenster in Bezug auf Basiseditoren würden einen Ansatz zum Anbringen vieler derzeit unzugänglicher Mutationen bereitstellen. Wenn Prime Editing außerdem für hohe Effizienz und Produktreinheit optimiert werden könnte, wäre seine potenzielle Anwendbarkeit auf die Korrektur von Krankheitsmutationen in anderen menschlichen Zelltypen signifikant.
  • 3. Erzielen einer ortsspezifischen Editierung von pathogenen Mutationen in kultivierten menschlichen Zellen.
  • Stand der Technik und Begründung.
  • Eine große Anzahl pathogener Mutationen kann aufgrund von PAM-Beschränkungen oder der Notwendigkeit einer Transversions- oder Indel-Mutationskorrektur von den aktuellen Basiseditoren nicht korrigiert werden. Beim Prime Editing sind theoretisch alle Übergänge und Transversionen möglich, ebenso kleine Insertionen und Deletionen. Darüber hinaus unterscheidet sich in Bezug auf das PAM das Prime-Editing-Fenster (voraussichtlich -3 bis +4) von dem der Basiseditoren (-18 bis -12) (13). Mendelsche Leiden, die derzeit von den Baseneditoren nicht korrigierbar sind, beinhalten: (1) die Sichelzellkrankheit Glu6Val-Gründermutation in Hämoglobin Beta (erfordert A•T zu T•A-Transversion); (2) die häufigste Variante der Wilson-Krankheit His1069G1n in ATP7B (erfordert G•C zu T•A-Transversion); und (3) die ΔPhe508-Mutation in CFTR, die zystische Fibrose verursacht (erfordert 3-Nukleotid-Insertion). Jedes dieser Ziele enthält ein entsprechend positioniertes PAM für SpCas9-Targeting und Prime Editing.
  • Vorläufige Ergebnisse.
  • (i) Ein Editieren von T zu A in HEK3-Zellen lässt sich durch aktuelle Baseneditierung nicht erzielen, ist jedoch durch das TRPT-Editieren (siehe FIG. 17A-17C) erzielbar.
  • 17A zeigt ein Schaubild, das den Prozentsatz % der T-zu-A-Umwandlung am Zielnukleotid nach Transfektion von Komponenten in humane embryonale Nierenzellen (HEK) anzeigt. Diese Daten präsentieren die Ergebnisse unter Verwendung einer N-terminalen Fusion von Wildtyp-MLV-Reverse-Transkriptase mit Cas9 (H840A)-Nickase (32-Aminosäure-Linker). Die Editiereffizienz wurde dramatisch verbessert, wenn die Länge der Primerbindungsstelle von 7 Nukleotiden auf 11 oder 12 Nukleotide verlängert wurde. Außerdem verbessert der Hilfsleiter A, der direkt stromaufwärts des Editierlocus positioniert ist (siehe 16), die Editieraktivität signifikant, insbesondere für Primerbindungsstellen mit kürzerer Länge. Die Editiereffizienz wurde durch Amplikon-Sequenzierung unter Verwendung der Illumina MiSeq-Plattform quantifiziert. 17B zeigt ebenfalls den Prozentsatz % der T-zu-A-Umwandlung am Zielnukleotid nach Transfektion von Komponenten in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK), aber diese Daten präsentieren Ergebnisse unter Verwendung einer C-terminalen Fusion des RT-Enzyms. Hier hat der Hilfsleiter A nicht so viel Wirkung und die Editiereffizienz ist insgesamt höher. 17C zeigt Daten, die Ergebnisse unter Verwendung einer N-terminalen Fusion von Wildtyp-MLV-Reverse-Transkriptase mit Cas9(H840A)-Nickase ähnlich der in 17A verwenden; jedoch ist der Linker zwischen MLV-RT und Cas9 60 Aminosäuren statt 32 Aminosäuren lang.
  • (ii) Die Ergebnisse der T-zu-A-Editierung an der HEK3-Stelle durch TRPT-Editierung zeigen eine hohe Reinheit.
  • 18 zeigt die Ausgabe der Sequenzierungsanalyse durch Hochdurchsatz-Amplikon-Sequenzierung. Die Ausgabe zeigt die am häufigsten vorkommenden Genotypen editierter Zellen. Bemerkenswert ist, dass keine wichtigen Indel-Produkte gewonnen werden und die gewünschte Punktmutation (T zu A) ohne Bystander-Editierungen sauber angebracht wird. Die erste Sequenz zeigt den Referenzgenotyp. Die beiden oberen Produkte sind der Ausgangsgenotyp, der einen endogenen Polymorphismus (G oder A) enthält. Die unteren beiden Produkte repräsentieren die korrekt editierten Genotypen.
  • (iii)MLV-RT-Mutanten verbessern die Editierung.
  • Mutante reverse Transkriptasen, beschrieben in Baranauskas et al (doi: 10.1093/protein/gzs034), wurden als C-terminale Fusionen mit der Cas9(H840A)-Nickase für die Zielnukleotid-Editierung in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) getestet. Das Cas9-RT-Editor-Plasmid wurde mit einem Plasmid co-transfiziert, das eine 3'-Prime-Editor-Leit-RNA codiert, welche die Matrize für die reverse Transkription bildet. Die Editiereffizienz am Zielnukleotid (blaue Balken) ist neben den Indel-Raten (orange Balken) in 19 gezeigt. WT bezeichnet das Wildtyp-MLV-RT-Enzym. Die mutierten Enzyme (M1 bis M4) enthalten die rechts aufgeführten Mutationen. Die Editierraten wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von genomischen DNA-Amplikons quantifiziert.
  • (iv) Komplementäres Strangnicken mit einer zweiten gRNA verbessert das Editieren.izen
  • Dieses Experiment wertet die Editiereffizienz des Zielnukleotids aus, wenn ein Einzelstrangbruch in den komplementären DNA-Strang in der Nähe des Zielnukleotids eingeführt wird, mit der Hypothese, dass dies die Fehlpaarungsreparatur so lenken würde, dass vorzugsweise das ursprüngliche Nukleotid entfernt und das Basenpaar in die gewünschte Editierung umgewandelt wird. Das Cas9(H840A)-RT-Editing-Konstrukt wurde mit zwei Leit-RNAcodierenden Plasmiden co-transfiziert, von denen eines der Reverse-Transkriptions-Reaktion als Matrizen dient, während das andere auf den komplementären DNA-Strang zum Nicking abzielt. Es wurde Nicking in verschiedenen Abständen vom Zielnukleotid getestet (orange Dreiecke) (siehe 20). Die Editiereffizienz am Zielbasenpaar (blaue Balken) wird neben der Informationsrate (orange Balken) angezeigt. Das Beispiel „keine“ enthält keine komplementäre Strang-Nicking-Leit-RNA. Die Editierraten wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von genomischen DNA-Amplikons quantifiziert.
  • 21 zeigt verarbeitete Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten, welche die gewünschte T-zu-A-Transversionsmutation und das allgemeine Fehlen anderer wichtiger Nebenprodukte der Genom-Editierung zeigen.
  • Anwendungsbereich. Der potenzielle Anwendungsbereich der neuen Prime-Editing-Technologie ist in 13 gezeigt und wird mit Deaminase-vermittelten Baseneditierungstechnologien verglichen. Zuvor entwickelte Basiseditoren zielen auf eine Region ∼15 ± 2 bp stromaufwärts der PAM ab. Durch die Umwandlung von Ziel-C- oder A-Nukleotiden in T bzw. G ermöglichen zuvor entwickelte Baseneditoren alle Übergangsmutationen (A:T in G:C-Umwandlungen). Bisher entwickelte Basiseditoren sind jedoch nicht in der Lage, Transversionsmutationen (A zu T, A zu C, G zu T, G zu C, T zu A, T zu G, C zu A, C zu G) anzubringen. Darüber hinaus können, wenn im Editierfenster mehrere Zielnukleotide vorhanden sind, zusätzliche unerwünschte Editierungen resultieren.
  • Die neue Prime-Editing-Technologie könnte theoretisch jede Nukleotid- und Basenpaarumwandlung und möglicherweise auch kleine Insertions- und Deletionseditierungen anbringen. In Bezug auf das PAM beginnen die Prime-Editing-Fenster an der Stelle des DNA-Nickings (3 Basen stromaufwärts des PAM) und enden an einer noch unbestimmten Position stromabwärts des PAM. Bemerkenswert ist, dass sich dieses Editierfenster von dem der Deaminase-Baseneditoren unterscheidet. Da das TPRT-System das Editieren unter Verwendung von DNA-Polymerase-Enzymen durchführt, hat es potenziell alle ihre Vorteile, einschließlich Allgemeingültigkeit, Präzision und Zuverlässigkeit.
  • (v) Korrektur pathogener Mutationen in von Patienten stammenden Zelllinien.
  • Zelllinien mit den entsprechenden Mutationen (Sichelzellkrankheit: CD34+ hämatopoetische Stammzellen; Morbus Wilson: kultivierte Fibroblasten; Mukoviszidose: kultivierte Bronchialepithelien) werden von ATCC, der Coriell Biobank oder von mit Harvard/Broad verbundenen Laboren bezogen. Die Editiereffizienz wird durch Hochdurchsatz-Sequenzierung ausgewertet, und die Wirksamkeit des korrigierten Genotyps wird mit phänotypischen Assays (Hämoglobin-HPLC, ATP7B-Immunfärbung und CFTR-Membranpotenzial-Assays) getestet.
  • (vi) Charakterisierung von Off-Target-Editing-Aktivität.
  • Mögliches Off-Target-Editing wird mit etablierten Verfahren wie etwa GUIDE-seq55 und CIRCLE-seq56 unter Verwendung von Ziel-gRNAs gepaart mit Wildtyp-Cas9 gescreent. Wenn potenzielle Off-Targets identifiziert werden, werden diese Loci in TPRT-editierten Zellen sondiert, um tatsächliche Off-Target-Editing-Ereignisse zu identifizieren.
  • (vii) Potenzielle Schwierigkeiten und Alternativen.
  • (1) Geringe Editiereffizienz: Prime-Editoren benötigen möglicherweise eine Optimierung für jedes Ziel. In diesem Fall können gRNA-Bibliotheken getestet werden, um die am besten funktionierenden Varianten für spezifische Anwendungen zu identifizieren. RT-Cas-Fusionsexpression und Kernlokalisation können optimiert werden. Die liposomale RNP-Zuführung könnte verwendet werden, um Off-Target-Editing einzuschränken.
  • (viii) Anstehende Experimente.
  • Die Optimierung von gRNA-Designs kann durch eine weitere Untersuchung der Länge der Primerbindungsstelle und Verlängerung der Editiermatrize erreicht werden. Der Testumfang und die Allgemeingültigkeit beinhalten verschiedene Nukleotidumwandlungen, kleine Insertionen und Deletionen sowie verschiedene Editierpositionen in Bezug auf PAM und mehrere Stellen im menschlichen Genom. Die Optimierung der RT-Komponente beinhaltet die Untersuchung von Mutationen in der MLV-RT, um die Aktivität (Inaktivierung von Rnase H, Erhöhung der Primer-Matrize-Bindungsaffinität, Anpassungen der Prozessivität) und neue RT-Enzyme (Gruppe II-Intro-RTs, andere retrovirale RTs) zu erhöhen.
  • Bedeutung.
  • Unzählige genetische Störungen resultieren aus einzelnen Nukleotidänderungen in individuellen Genen. Die Entwicklung der in dieser Schrift beschriebenen Genom-Editierungstechnologie und deren Anwendung in krankheitsrelevanten Zelltypen würde eine Grundlage für Translation in der Klinik schaffen. Bei einigen Krankheiten, wie etwa der Sichelzellanämie, repräsentiert eine einzige Punktmutation den dominanten Genotyp in der gesamten Bevölkerung. Bei vielen anderen genetischen Störungen wird jedoch in der gesamten Patientenpopulation eine große Heterogenität verschiedener Punktmutationen innerhalb eines einzigen Gens beobachtet, die jeweils zu einem ähnlichen Krankheitsphänotyp führt. Daher könnte diese Technologie als allgemeines Verfahren zur Genom-Editierung, das theoretisch auf eine große Anzahl solcher Mutationen abzielen könnte, vielen dieser Patienten und ihren Familien einen enormen potenziellen Nutzen bieten. Wenn ein Prinzipnachweis für diese Anwendungen in Zellen erbracht werden könnte, wäre dies die Grundlage für Studien an Tiermodellen für Krankheiten.
  • Vorteile
  • Präzision: Die gewünschte Editierung wird in Nukleinsäuresequenz gerichtet codiert. Allgemeingültigkeit: Theoretisch könnte jede Basenpaarumwandlung möglich sein, einschließlich Transversionseditierungen sowie kleine Insertionen oder Deletionen. In Bezug auf die Sequenz des benachbarten Protospacer-Motivs (PAM) von Cas9 liegt ein anderes Editierfenster vor als das von Baseneditoren. Dieses Verfahren erzielt viele der Editierfähigkeiten der Homology-Directed Repair (HDR), jedoch ohne die Haupteinschränkungen von HDR (ineffizient bei den meisten Zelltypen und wird normalerweise von einem Überschuss an unerwünschten Nebenprodukten wie Indels begleitet). Es verursacht auch keine doppelsträngigen DNA-Brüche (DSBs, also wenige Indels, Translokationen, große Deletionen, p53-Aktivierung usw.
  • BEISPIEL 2. EIN VERFAHREN ZUM ENTWERFEN THERAPEUTISCHER PRIME-EDITOR-LEIT-RNAS (PEGRNA) UND POTENZIELLE ZIELE UND PEGRNA ZUR KORREKTUR VON PATHOGENEN MENSCHLICHEN GENVARIANTEN MIT PRIME EDITING
  • Einführung
  • Prime Editing ist ein transformatives Werkzeug für Genom-Editierung. Unter seinen vielen möglichen Anwendungen stellt Prime Editing eine neuartige Strategie zur Korrektur pathogener Mutationen mit potenziellem therapeutischem Nutzen dar. Clinvar ist eine öffentlich zugängliche Datenbank mit gemeldeten menschlichen Mutationen, die möglicherweise mit einer Krankheit assoziiert sind.
  • Dieses Beispiel demonstriert das Design eines Computerprogramms/Algorithmus, der mit einem einfachen Verfahren PEgRNA Sequenzen bestimmt und auf 436.042 einzigartige Clinvar-Mutationen anwendet. Dieses Beispiel beschreibt zuerst die PEgRNA -Struktur und funktionelle Elemente und beschreibt dann das Designverfahren, einschließlich Definitionen, stellt die folgenden Beiträge zur Beschreibung des Computerprogramms/Algorithmus bereit, der ein einfaches Verfahren verwendet, um potenziell heilende PEgRNA zu entwerfen, sowie eine Diskussion über Variationen des PEgRNA- Designs.
  • Außerdem stellt dieses Beispiel das mit dieser Schrift eingereichte Sequenzprotokoll bereit, das beispielhafte PEgRNA -Sequenzen zum Korrigieren potenziell pathogener Mutationen von Clinvar umfasst. Eine Beschreibung des Sequenzprotokolls ist vorstehend bereitgestellt.
  • PEgRNA -Struktur
  • 27 und 28 stellen schematische Darstellungen von zwei möglichen Konfigurationen von PEgRNA bereit, die gemäß diesem Beispiel entworfen werden können.
  • Diese 27 stellt die Struktur einer Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich eine Primerbindungsstelle (A), eine Editiermatrize (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht abgebildet). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein.
  • Diese 28 stellt die Struktur einer Ausführungsform einer in dieser Schrift in Betracht gezogenen PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik entworfen werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponentenelemente, die in 5'- bis 3'-Richtung angeordnet sind, nämlich einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann weiter in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden, nämlich eine Primerbindungsstelle (A), eine Editiermatrize (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'-Endmodifiziererregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifiziererregion (e2) umfassen. Weiterhin kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal an dem 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht dargestellt). Diese strukturellen Elemente werden in dieser Schrift weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA soll nicht einschränkend sein und umfasst Variationen in Bezug auf die Anordnung der Elemente. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen jeder der anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, an den 3'- und 5'-Enden angeordnet zu sein.
  • Die Strukturelemente der PEgRNA lassen sich wie folgt beschreiben:
  • Spacer: Der Abschnitt der gRNA, typischerweise 20-nt lang, der komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz im Genom ist. Der Spacer ist komplementär zum Protospacer in der DNA. Der Spacer kann auf verschiedene nicht einschränkende Weise modifiziert werden. Zum Beispiel kann der Spacer modifiziert werden, um ein 5'-G hinzuzufügen, um einen 21-nt-Spacer zu bilden, wenn das 5'-nächste Nukleotid kein G ist. Diese Modifikation verbessert die Transkription von einem U6-Promotor.
  • gRNA-Kern oder „gRNA-Rückgrat“: Der Abschnitt der gRNA befindet sich im Allgemeinen auf der 3'-Seite des Spacers und beinhaltet mehrere Haarnadeln, die mit dem Cas9-Protein interagieren. Beispielhafte gRNA-Kerne können zum Beispiel folgende beinhalten:
  • gRNA-Rückgrat-Sequenz 1:
    •  GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATC
 AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (86 nt) (SEQ ID NOs: 1361579).
  • gRNA-Rückgrat-Sequenz 2:
    •  GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAA
 AGTGGCACCGAGTCGGTGC (76 nt) (SEQ ID NOs: 1361580).
  • Die in dieser Schrift in Betracht gezogene PEgRNA kann andere gRNA-Kernsequenzen verwenden, welche die gleiche oder eine ähnliche Kapazität der gRNA aufrechterhalten, an Cas9 zu binden.
  • Verlängerungsarm: Die in dieser Schrift in Betracht gezogene PEgRNA umfasst einen Verlängerungsarm, der verschiedene funktionelle Elemente umfasst, einschließlich der Primerbindungsstelle, der Editiermatrize und des Homologiearms. Der Verlängerungsarm kann am 3'-Ende des gRNA-Kerns positioniert werden. In anderen Ausführungsformen kann der Verlängerungsarm am 5'-Ende des Spacers positioniert sein. Der Verlängerungsarm ist fast komplementär zum Kontext der genomischen Sequenz, wobei die gewünschte Editierung den nicht komplementären Abschnitt darstellt. Die Sequenz des Verlängerungsarms kann variiert werden, um die folgenden Variationen einzuschließen: Variationen in der Länge der Primerbindungsstelle (siehe nachstehend); Variationen in der Länge der codierten Bereiche.
  • Primerbindungsstelle: Die Primerbindungsstelle befindet sich am 3'-Ende des PEgRNA -Verlängerungsarms und ist komplementär zum ssDNA-Flap, der durch den Spacer nach dem Casvermittelten Nick verdrängt wird. Der ssDNA:RNA-Hybrid dient als Primer für die reverse Transkription des Rests der PEgRNA -Verlängerung in der 5'- zu 3'-Polymerisationsrichtung. Für SpCas9 ist der RuvC-Nick zwischen den Protospacer-Positionen -4 und -3 positioniert, wobei -1 das 3'-nächste Nukleotid und -20 das 5'-nächste Nukleotid eines 20-nt-Spacers ist. Eine Primerbindungsstelle der Länge X ist als die X-Nukleotide konzipiert, beginnend 3' von Spacer-Position -4 bis und einschließlich Spacer-Position -4. Übliche Variationen beinhalten unterschiedliche Längen, die von etwa 8 nt bis etwa 20 nt reichen (z. B. zwischen 8 und 17 nt).
  • Editiermatrize: Die Editiermatrize befindet sich neben dem 5'-Ende der Primerbindungsstelle und codiert die gewünschte editierte Sequenz (z. B. einzelne Nukleotidänderung, Deletion oder Insertion).
  • Homologiearm: Der Homologiearm befindet sich am 5'-Ende der Editiermatrize und ist komplementär zum nativen genomischen Kontext.
  • Reverse Transkriptionsmatrize oder die Region, die den ssDNA-Flap codiert, der in die endogene DNA eingebaut wird: Die PEgRNA -Verlängerung schließt die Primerbindungsstelle aus (da die Primerbindungsstelle nicht zu einer Matrize für die ssDNA-Polymerisation durch reverse Transkriptase wird). Die Reverse-Transkriptase-Matrize enthält die Editiermatrize und den Homologiearm. Nach dem Entbinden des Spacers vom Protospacer bindet die Reverse-Transkriptase-Primer-ssDNA-Sequenz erneut an ihren nativen genomischen Kontext, wobei die Reverse-Transkriptase-Matrize als 3'-ssDNA-Flap zurückbleibt. Übliche Variationen beinhalten: Flaplänge kann variieren, z. B. von 7 nt bis 34 nt (aber ein breiter Bereich von Flaplängen wird in Betracht gezogen, wie in dieser Schrift beschrieben); die Position der Editierung innerhalb des Flaps kann variieren. Erfolgreiches Editieren wurde mit einer Homologiearmlänge von nur 2 nt beobachtet. Editierungen werden normalerweise, müssen aber nicht, so nah wie möglich am Nick positioniert.
  • Transkriptionsterminatorsequenz: Eine Sequenz am 3'-Ende der PEgRNA, welche die Transkription während der Erzeugung der PEgRNA beendet, z. B. wenn sie von einem U6-Promotor oder einem anderen Promotor exprimiert wird. Eine beispielhafte Terminatorsequenz ist TTTTTTGTTTT (SEQ ID NO: 1361581).
  • Zusätzliche Variationen des PEgRNA-Designs sind möglich und werden in dieser Schrift in Erwägung gezogen. Zum Beispiel ist es denkbar, dass PEgRNA mit PEgRNA-Verlängerungsarmen entworfen werden kann, die nicht-komplementäre Sequenzen 5' vom Homologiearm oder 3' von der Primerbindungsstelle oder beides enthalten, um zum Beispiel eine Kissing-Loop-Interaction zu bilden oder als schützende Haarnadel für die RNA-Stabilität zu dienen. Diese Sequenzen sind in 27 und 28 an den Sequenzelementen e1 und e2 dargestellt und werden als „optionale 3'- oder 5'-Endmodifikatorregionen“ bezeichnet. Darüber hinaus ist es denkbar, dass PEgRNA mithilfe von Strategien und Verfahren entworfen werden kann, die zwischen mehreren Designkandidaten priorisieren. Beispiele hierfür sind die Vermeidung von PEgRNA -Verlängerungen, bei denen das 5'-nächste Nukleotid ein Cytosin ist, da die nativen Nukleotid-Protein-Interaktionen in dem sgRNA:Cas9-Komplex unterbricht, oder Verwenden von RNA-Sekundärstruktur-Vorhersagewerkzeugen, um eine bevorzugte PBS-Länge und Flap-Länge bei gegebenem Spacer und gewünschter Editierung auszuwählen.
  • PEgRNA -Designalgorithmus
  • Bei einem Eingangsallel, einem Ausgangsallel und einem CRISPR-System für das Prime Editing (wichtig ist das PAM-Motiv und die relative Position des Nicks des Prime-Editors) entwirft der Algorithmus eine PEgRNA oder eine Liste von PEgRNA, die in der Lage sind, das Eingangsallel zum Ausgangsallel zu editieren. Der Sequenzunterschied zwischen den Ausgangs- und Eingangsallelen wird als gewünschte Editierung bezeichnet. Eine Ausführungsform davon kann Eingangsallel sein, das eine pathogene Mutation repräsentiert, und ein Ausgangsallel, das die korrigierte Wildtyp-Sequenz repräsentiert.
  • Die Klassen von Editierungen, die durch eine einzelne PEgRNA induziert werden können, beinhalten einzelne Nukleotidsubstitutionen, Insertionen von 1 nt bis zu etwa 40 nt, Deletionen von 1 nt bis zu etwa 30 nt und eine Kombination oder Mischung all der vorstehend genannten. Prime Editing unterstützt bekanntermaßen Editierungen dieser Art in erster Linie von der Spacer-Position -3 (unmittelbar 3' vom Nick) bis zur Spacer-Position +27 (30 nt 3' vom Nick im Eingangsallel). Jede dieser angegebenen Zahlen stellt einen Parameter des Algorithmus dar, der sich im Laufe der Zeit ändern kann, wenn das Wissen über das Prime Editing zunimmt. Abgesehen davon wurden Editierungen an Protospacer-Position -4 unter Verwendung des SpCas9-Systems mit Prime Editing beobachtet, die wahrscheinlich durch gelegentliche RuvC-Spaltung zwischen Protospacer-Positionen -5 und -4 verursacht werden.
  • Der Algorithmus zählt alle Spacer auf, die mit dem PAM-Motiv des ausgewählten CRISPR-Systems im Eingangsallel auf beiden Strängen kompatibel sind, und filtert dann Protospacer, deren zugehörige Nick-Positionen mit dem Prime Editing nicht kompatibel sind, auf das Ausgangsallel, entweder weil der Nick auf der 3'-Seite der gewünschten Editierung auf diesem Strang liegt oder weil der Abstand zwischen dem Nick und der gewünschten Editierung zu groß ist (größer als ein benutzerdefinierter Schwellenwert, zum Beispiel 30 nt).
  • Für jeden Spacer konstruiert der Algorithmus eine Spacer- und Editiermatrizensequenz unter Verwendung der Sequenz des Eingangsallels, der Position des Nicks und der Sequenz der gewünschten Editierung. Der Algorithmus wählt dann einen oder mehrere Werte für die Länge der Primerbindungsstelle aus, die von 8 nt bis 17 nt variieren kann; für die Homologiearmlänge, die von 2 nt bis 33 nt variieren kann; und für die gRNA-Rückgratsequenz, die GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATC AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 1361579) oder GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAA AGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 1361580) oder eine andere gRNA-Rückgratssequenz sein kann, die eine Wildtyp-RNA-Sekundärstruktur beibehält. Für jede ausgewählte Parameterkombination konstruiert der Algorithmus einen Homologiearm, eine Primerbindungsstellensequenz und ein gRNA-Rückgrat unter Verwendung der gegebenen Parameter. Der Algorithmus bildet dann eine PEgRNA-Sequenz, indem er den Protospacer, das gRNA-Rückgrat, die PEgRNA-Verlängerung und die Terminatorsequenz verkettet.
  • Nach grundlegender Filterung nach Keimbahnmutationen, die als pathogen oder wahrscheinlich pathogen annotiert wurden, wurden 72.020 einzigartige Clinvar-Mutationen identifiziert, die mit Prime Editing mit Cas9-NG kompatibel sind, und 63.496 einzigartige Clinvar-Mutationen, die mit PrimeEditing mit SpCas9 mit einem NGG-PAM kompatibel sind. Es ist zu beachten, dass zusätzliche Mutationen korrigierbar wären, wenn man einen Prime-Editor verwendet, der eine andere Cas9-Variante mit anderer PAM-Kompatibilität enthält.
  • Diese Mutationen wurden in vier Klassen von klinischer Signifikanz eingeteilt, wobei geringe Allelhäufigkeit, Anzahl der Einreicher, ob die Einsender in ihren Interpretationen widersprüchlich waren oder nicht und ob die Mutation von einem Expertengremium überprüft wurde, verwendet wurden.
  • Unter den 63.496 SpCas9-kompatiblen Mutationen werden:
    • • 4.627 Mutationen auf dem signifikantesten Niveau identifiziert (vier)
    • • 13.943 Mutationen auf den Signifikanzniveaus drei oder vier identifiziert
    • • 44.385 Mutationen auf den Signifikanzniveaus zwei, drei oder vier identifiziert.
  • Die bereitgestellten Sequenzprotokolle zählen eine einzelne PEgRNA pro eindeutiger Mutation auf, die als die PEgRNA mit dem kürzesten Abstand zwischen dem Nick und der Editierung ausgewählt wird. Die PEgRNA wurde mit einer Homologiearmlänge von 13 und einer Primerbindungsstellenlänge von 13 entworfen. Protospacer mit Nickstellen weiter als 20 nt von der Editierung entfernt wurden nicht berücksichtigt. Die verwendete gRNA-Rückgratsequenz war GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATC AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 1361579). Die verwendete Terminatorsequenz war TTTTTTGTTTT (SEQ ID NO: 1361581).
  • Das Sequenzprotokoll der PEgRNA beinhaltet eine Beschreibung der einzelnen PEgRNA, die gemäß Beispiel 2 bestimmt wurden. Insgesamt bestimmt Beispiel 2 die Sequenz von 133515 beispielhaften PEgRNA-vollständigen Sequenzen. Jede dieser Sequenzen ist in dem Sequenzprotokoll präsentiert/beinhaltet und als SEQ ID NOs: 1-135514 identifiziert. Darüber hinaus bestehen die PEgRNA, wie an anderer Stelle beschrieben, jeweils aus einem Spacer (SEQ ID NOs: 135515-271028) und einem Verlängerungsarm (SEQ ID NOs: 271029-406542). Außerdem umfasst jede PEgRNA einen gRNA-Kern, beispielsweise wie durch SEQ ID NOs: 1361579-1361580 definiert. Die Verlängerungsarme der SEQ ID NOs: 271029-406542 bestehen weiterhin jeweils aus einer Primerbindungsstelle (SEQ ID NOs: 406543-542056), einer Editiermatrize (SEQ ID NOs: 542057-677570) und einem Homologiearm (SEQ ID NOs: 677571-813084). Die PEgRNA kann optional eine 5'-Endmodifikatorregion umfassen (SEQ ID NOs: EE-EE) und/oder eine 3'-Endmodifikatorregion (SEQ ID NOs: FF-FF). Die PEgRNA kann auch ein Reverse-Transkriptions-Terminationssignal (z. B. SEQ ID NOs: 1361560-1361565) am 3'-Ende von der PEgRNA umfassen.
  • Für jede Volllängen-PEgRNA-Sequenz, die im Sequenzprotokoll (SEQ ID NOs: 1-135514) bereitgestellt wird, beinhaltet das Sequenzprotokoll einen Satz von fünf (5) entsprechenden Teilsequenzen: nämlich (1) Spacer, (2) Verlängerungsarm, (3) Primerbindungsstelle, (4) Editiermatrize und (5) Homologiearm. Der Satz von Teilsequenzen für jede gegebene PEgRNA-Sequenz in voller Länge kann durch die folgende mathematische Operation bestimmt werden.
  • Für jede PEgRNA-Sequenz (z. B. SEQ ID NOs: 1) im Sequenzprotokoll bilden die folgenden Sequenzen im Sequenzprotokoll einen Satz entsprechender Teilsequenzen: (1) Spacer, (2) Verlängerungsarm, (3) Primer Bindungsstelle, (4) Editiermatrize und (5) Homologiearm wie folgt:
  • Spacer: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Spacer-Sequenz als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 135514 hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist der Spacer, welcher der PEgRNA aus SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 135515.
  • Verlängerungsarm: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird der entsprechende Verlängerungsarm als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), der dem Faktor 271028 (135514 X 2). Zum Beispiel ist der Verlängerungsarm, welcher der PEgRNA aus SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 271029.
  • Primerbindungsstelle: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Primerbindungsstelle als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 406542 (135514 X 3) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Primerbindungsstelle, die der PEgRNA aus SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 406542.
  • Editiermatrize: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird die entsprechende Editiermatritze als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B.Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 542056 (135514 X 4) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Editiermatrize, die der PEgRNA aus SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 542057.
  • Verlängerungsarm: Für jede gegebene PEgRNA-Sequenz wird der entsprechende Verlängerungsarm als die Ziffer des PEgRNA-Sequenzidentifikators identifiziert (z. B. Ziffer „1“ für SEQ ID NO: 1), die dem Faktor 677570 (135514 X 5) hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist die Editiermatrize, die der PEgRNA aus SEQ ID NO: 1 entspricht, SEQ ID NO: 677571.
  • Die Gesamtzahl der in dem Sequenzprotokoll bereitgestellten Sequenzen beträgt 813084. Es gibt insgesamt 135514 PEgRNA- vollständige Sequenzen (die jeweils mindestens einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfassen). Es gibt dieselbe Anzahl von (1) Spacern, (2) Verlängerungsarmen, (3) Primerbindungsstellen, (4) Editiermatrizen und (5) Homologiearmen, wobei jeweils Sätze wie vorstehend definiert sind.
  • Beispiele für andere PEgRNA-Sequenzsätze (d. h. die eine beliebige gegebene PEgRNA und den entsprechenden Spacer, Verlängerungsarm, Primerbindungsstelle, Editiermatrize und Homologiearm umfassen) sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
    vollständige PEgRNA Spac er Verlängerun gsarm Primerbindung sstelle Editierma trize Homologi earm
    SEQ ID NOs: 1 135.5 15 271.029 406.543 542.057 677.571
    SEQ ID NOs: 2 135.5 16 271.030 406.544 542.058 677.572
    SEQ ID NOs: 3 135.5 17 271.031 406.545 542.059 677.573
    SEQ ID NOs: 4 135.5 18 271.032 406.546 542.060 677.574
    SEQ ID NOs: 5 135.5 19 271.033 406.547 542.061 677.575
    SEQ ID NOs: 6 135.5 20 271.034 406.548 542.062 677.576
    ...
    SEQ ID NOs: 135.509 271.023 406.537 542.051 677.565 813.079
    SEQ ID NOs: 135.510 271.024 406.538 542.052 677.566 813.080
    SEQ ID NOs: 135.511 271.025 406.539 542.053 677.567 813.081
    SEQ ID NOs: 135.512 271.026 406.540 542.054 677.568 813.082
    SEQ ID NOs: 135.513 271.027 406.541 542.055 677.569 813.083
    SEQ ID NOs: 135.514 271.028 406.542 542.056 677.570 813.084
  • Variationen der bereitgestellten PEgRNA-Designs beinhalten alle zuvor erörterten Variationen, einschließlich der Variation der gRNA-Rückgratsequenz, der Länge der Primerbindungsstelle, der Flap-Länge usw.
  • Literaturhinweise (für Beispiel 2)
    • Landrum, M. J., Lee, J. M., Riley, G. R., Jang, W., Rubinstein, W. S., Church, D. M., & Maglott, D. R. (2014). ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic acids research, 42(Database issue), D980-D985. doi:10.1093/nar/gkt1113
    • Stenson, P. D., Mort, M., Ball, E. V., Evans, K., Hayden, M., Heywood, S., ... Cooper, D. N. (2017). The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human genetics, 136(6), 665-677. doi:10.1007/s00439-017-1779-6
    • Nishimasu, H., Ran, F. A., Hsu, P. D., Konermann, S., Shehata, S. I., Dohmae, N., ... Nureki, O. (2014). Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 156(5), 935-949. doi:10.1016/j.cell.2014.02.001
    • Lorenz, R., Bernhart, S. H., Höner Zu Siederdissen, C., Tafer, H., Flamm, C., Stadler, P. F., & Hofacker, I. L. (2011). ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for molecular biology : AMB, 6, 26. doi:10.1186/1748-7188-6-26
  • BEISPIEL 3. DESIGN UND KONSTRUKTION VON PEGRNA FÜR PRIME EDITING
  • Kurzdarstellung
  • in dieser Schrift ist eine Reihe von PEgRNA-Designs und -Strategien beschrieben, welche die Effizienz des Prime Editing (PE) verbessern können.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Prime Editing (PE) ist eine Genom-Editiierungstechnologie, die definierte DNA-Sequenzen innerhalb eines gezielten genetischen Locus ersetzen, einfügen oder entfernen kann, indem Informationen verwendet werden, die in einer Prime-Editor-Leit-RNA (PEgRNA) codiert sind. Prime-Editoren (PEs) bestehen aus einem sequenzprogrammierbaren DNA-bindenden Protein mit Nukleaseaktivität (Cas9), das mit einem Reverse-Transkriptase-(RT)-Enzym fusioniert ist. PEs bilden Komplexe mit PEgRNA, welche die Informationen zum Anzielen spezifischer DNA-Loci innerhalb ihrer Spacer-Sequenzen sowie Informationen zur Spezifizierung der gewünschten Editierung in einer konstruierten Verlängerung enthalten, die in ein StandardsgRNA-Gerüst eingebaut ist. PE:PEgRNA-Komplexe binden und spalten den programmierten Ziel-DNA-Locus, wodurch die Hybridisierung des DNA-Strangs mit der konstruierten Primer-Bindungssequenz (PBS) der PEgRNA ermöglicht wird. Die Reverse-Transkriptase-Domäne kopiert dann die editierungscodierenden Informationen innerhalb des RT-Matrizenabschnitts der PEgRNA, wobei die genickte genomische DNA als Primer für die DNA-Polymerisation verwendet wird. Nachfolgende DNA-Reparaturprozesse integrieren den neu synthetisierten, editierten DNA-Strang in den genomischen Locus. Während die Vielseitigkeit von Prime Editing als Forschungswerkzeug und potenzielles Therapeutikum vielversprechend ist, bestehen aufgrund des für die Editierung erforderlichen mehrstufigen Prozesses mehrere Einschränkungen in Bezug auf Effizienz und Umfang. Beispielsweise können ungünstige RNA-Strukturen, die sich innerhalb der PEgRNA bilden, das Kopieren von DNA-Editierungen von der PEgRNA auf den genomischen Locus hemmen. Ein möglicher Weg zur Verbesserung der PE-Technologie ist die Neugestaltung und Konstruktion der kritischen PEgRNA -Komponente. Verbesserungen des Designs dieser PEgRNA sind wahrscheinlich für eine verbesserte PE-Effizienz notwendig und ermöglichen den Einbau längerer eingefügter Sequenzen in das Genom.
  • Beschreibung
  • In dieser Schrift ist eine Reihe von PEgRNA -Designs beschrieben, welche die Wirksamkeit des PE verbessern sollen. Diese Designs nutzen eine Reihe von zuvor veröffentlichten Ansätzen zur Verbesserung der sgRNA-Wirksamkeit und/oder Stabilität sowie eine Reihe neuartiger Strategien. Diese Verbesserungen können zu einer oder mehreren von einer Reihe verschiedener Kategorien gehören: i) Designs, um eine effiziente Expression von funktioneller PEgRNA von Nicht-Polymerase-III(Pol III)-Promotoren zu ermöglichen, was die Expression längerer PEgRNA ohne lästige Sequenzerfordernisse ermöglichen würde; ii) Verbesserungen des Kerns, des Cas9-bindenden PEgRNA-Gerüsts, was die Wirksamkeit verbessern könnte; iii) Modifikationen an der PEgRNA, um die RT-Prozessivität zu verbessern, wodurch die Insertion längerer Sequenzen an gezielten genomischen Loci ermöglicht wird; und iv) Hinzufügen von RNA-Motiven an die 5'- oder 3'-Termini der PEgRNA, was die PEgRNA-Stabilität verbessert, die RT-Prozessivität erhöht, eine Fehlfaltung der PEgRNA verhindert oder zusätzliche Faktoren rekrutiert, die für die Genom-Editierung wichtig sind. In dieser Schrift sind eine Reihe potenzieller PEgRNA -Designs dieser Art für jede Kategorie beschrieben. Mehrere dieser Designs wurden zuvor zur Verbesserung der sgRNA-Aktivität mit Cas9 beschrieben und sind als solche angegeben. Ebenfalls in dieser Schrift beschrieben ist eine Plattform für die Evolution von PEgRNA für vorgegebene Sequenzziele, die das Verfeinern des PEgRNA-Gerüsts ermöglichen und die PE-Aktivität erhöhen würde (v). Bemerkenswerterweise könnten diese Designs auch leicht angewendet werden, um eine PEgRNA zu verbessern, die durch jedes Cas9 oder einer weiterentwickelten Variante davon erkannt wird.
  • (i) Expression von PEgRNA von nicht-Pol III-Promotoren
  • sgRNAs werden typischerweise vom U6-snRNA-Promotor exprimiert. Dieser Promotor rekrutiert Pol III, um die assoziierte RNA zu exprimieren, und ist nützlich für die Expression von kurzen RNAs, die im Kern zurückgehalten werden. Pol III ist jedoch nicht hochprozessiv und kann keine RNAs mit einer Länge von mehr als einigen hundert Nukleotiden auf den für eine effiziente Genom-Editierung erforderlichen Niveaus exprimieren183. Darüber hinaus kann Pol III an Abschnitten von U anhalten oder terminieren, was möglicherweise die Diversität der Sequenzen begrenzt, die unter Verwendung einer PEgRNA eingefügt werden könnten. Andere Promotoren, die Polymerase II (wie etwa pCMV) oder Polymerase I (wie etwa der U1-snRNA-Promotor) rekrutieren, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, längere sgRNAs zu exprimieren.183 Diese Promotoren werden jedoch typischerweise teilweise transkribiert, was zu einer zusätzlichen Sequenz 5' von dem Spacer in der exprimierten PEgRNA führen würde, was nachweislich auf eine stellenabhängige Weise zu einer deutlich reduzierten Cas9:sgRNA-Aktivität führt. Während Pol III-transkribierte PEgRNA einfach in einem Lauf von 6-7 U terminieren kann, würde PEgRNA, die von Pol II oder Pol I transkribiert wurde, ein anderes Terminationssignal erfordern. Häufig führen solche Signale auch zu einer Polyadenylierung, die zu einem unerwünschten Transport der PEgRNA aus dem Zellkern führen würde. In ähnlicher Weise sind RNAs, die von Pol II-Promotoren wie pCMV exprimiert werden, typischerweise 5'-begrenzt, was ebenfalls zu ihrem Kernexport führt.
  • Zuvor haben Rinn und Mitarbeiter eine Vielzahl von Expressionsplattformen für die Produktion von lang-nicht-codierenden RNA-(lncRNA)-markierten sgRNAs gescreent183. Diese Plattformen beinhalten RNAs, die von pCMV exprimiert werden und die im ENE-Element von der MALAT1-ncRNA von Menschen184, dem PAN ENE-Element von KSHV185 oder der 3'-Box von U1-snRNA186 enden. Bemerkenswerterweise bilden die MALAT1-ncRNA und PAN-ENEs Triple-Helices, die den PolyA-Schwanz schützen184, 187. Es wird erwartet, dass diese Konstrukte zusätzlich zur Ermöglichung der Expression von RNAs auch die RNA-Stabilität erhöhen könnten (siehe Abschnitt iv). Die Verwendung des Promotors von der U1-snRNA zur Ermöglichung der Expression dieser längeren sgRNAs183 wurde ebenfalls untersucht. Es wird erwartet, dass diese Expressionssysteme auch die Expression längerer PEgRNA ermöglichen. Darüber hinaus wurde eine Reihe von Verfahren für die Spaltung des Abschnitts des Pol II-Promotors entwickelt, der als Teil der PEgRNA transkribiert würde, wobei entweder ein selbstspaltendes Ribozym wie etwa Hammerhead-188, Pistole-189, Beil-189, Haarnadel-190, VS-191, Twister-192 oder Twister-Sister-192 Ribozyme oder andere selbstspaltende Elemente hinzugefügt wurden, um die transkribierte Leitung zu verarbeiten, oder eine Haarnadel, die von Csy4193 erkannt wird und auch zur Verarbeitung der Leitung führt. Es wird auch vermutet, dass der Einbau mehrerer ENE-Motive zu einer verbesserten PEgRNA -Expression und -Stabilität führen könnte, wie zuvor für die KSHV-PAN-RNA und das Element demonstriert185. Es wird auch erwartet, dass die Zirkularisierung der PEgRNA in Form einer zirkulären intronischen RNA (ciRNA) ebenfalls zu einer verbesserten RNA-Expression und -Stabilität sowie zu einer Kernlokalisation führen könnte194.
  • Sequenzen:
  • PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und MALAT1 ENE
    Figure DE112020001306T5_0114
  • PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und PAN ENE
    Figure DE112020001306T5_0115
  • PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3xPAN ENE
    Figure DE112020001306T5_0116
    Figure DE112020001306T5_0117
  • PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3'-Box
    Figure DE112020001306T5_0118
  • PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pU1, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3'-Box
    Figure DE112020001306T5_0119
    Figure DE112020001306T5_0120
  • (ii) Verbesserungen des PEgRNA-Gerüsts
  • Der Kern, das Cas9-bindende PEgRNA-Gerüst, kann wahrscheinlich verbessert werden, um die PE-Aktivität zu erhöhen. Mehrere solcher Ansätze wurden bereits demonstriert. Zum Beispiel enthält das erste Paarungselement des Gerüsts (P1) ein GTTTT-AAAAC-Paarungselement. Es wurde gezeigt, dass solche Durchläufe von Ts zu einer Pol III-Pausierung und einer vorzeitigen Beendigung des RNA-Transkripts führen. Es wurde gezeigt, dass die rationale Mutation eines der T-A-Paare zu einem G-C-Paar in diesem Abscnitt von P1 die sgRNA-Aktivität erhöht, was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz auch für PEgRNA 195 durchführbar wäre. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass die Verlängerung der Länge von P1 die sgRNA-Faltung verbessert und zu einer verbesserten Aktivität führt195, was darauf hindeutet, dass dies ein weiterer Weg zur Verbesserung der PEgRNA-Aktivität ist. Schließlich ist es wahrscheinlich, dass auch das Verfeinern des PEgRNA-Gerüsts durch gesteuerte Evolution von PEgRNA auf einem bestimmten DNA-Ziel zu einer verbesserten Aktivität führen würde. Dies wird in Abschnitt (v) beschrieben.
  • Sequenzen:
  • PEgRNA mit einer 6-nt-Verlängerung zu P1
    Figure DE112020001306T5_0121
  • PEgRNA, die eine T-A-zu-G-C-Mutation innerhalb von P1 enthält
    Figure DE112020001306T5_0122
  • (iii) Verbesserung der RT-Prozessivität durch Modifikationen der Matrizenregion der PEgRNA
  • Mit zunehmender Größe der von der PEgRNA als Matrize abgenommenen Insertion ist es wahrscheinlicher, dass sie von Endonukleasen abgebaut wird, spontan hydrolysiert wird oder sich in Sekundärstrukturen faltet, die von der RT nicht revers transkribiert werden können, oder die Faltung des PEgRNA-Gerüst und die anschließende Cas9-RT-Bindung beeinträchtigt. Dementsprechend ist es wahrscheinlich, dass eine Modifikation der Matrize der PEgRNA notwendig sein könnte, um große Insertionen, wie etwa die Insertion ganzer Gene, zu beeinflussen. Einige Strategien dazu beinhalten den Einbau modifizierter Nukleotide in eine synthetische oder halbsynthetische PEgRNA, welche die RNA widerstandsfähiger gegen Abbau oder Hydrolyse machen oder die Wahrscheinlichkeit reduzieren, dass sie inhibitorische Sekundärstrukturen annimmt196. Solche Modifikationen könnten 8-Aza-7-deazaguanosin einschließen, das die RNA-Sekundärstruktur in G-reichen Sequenzen reduzieren würde; Locked-Nucleinsäuren (LNA), die den Abbau reduzieren und bestimmte Arten der RNA-Sekundärstruktur verbessern; 2'-O-Methyl-, 2'-Fluor- oder 2'-O-Methoxyethoxy-Modifikationen, welche die RNA-Stabilität erhöhen. Solche Modifikationen könnten auch an anderer Stelle in die PEgRNA aufgenommen werden, um Stabilität und Aktivität zu erhöhen. Alternativ oder zusätzlich dazu könnte die Matrize der PEgRNA so gestaltet werden, dass sie sowohl für ein gewünschtes Proteinprodukt codiert als auch die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sie einfache Sekundärstrukturen annimmt, die durch die RT entfaltet werden können. Solche einfachen Strukturen würden als thermodynamische Senke wirken, was es weniger wahrscheinlich macht, dass kompliziertere Strukturen auftreten, die eine reverse Transkription verhindern würden. Schließlich könnte man sich auch vorstellen, die Matrize in zwei separate PEgRNAs trennen. In einem solchen Design würde ein PE verwendet, um die Transkription zu initiieren und auch eine separate Matrizen-RNA über ein an Cas9 fusioniertes RNA-bindendes Protein oder ein RNA-Erkennungselement auf der PEgRNA selbst, wie etwa das MS2-Aptamer, an die Zielstelle zu rekrutieren. Die RT könnte entweder direkt an diese separate Matrizen-RNA binden oder die reverse Transkription auf der ursprünglichen PEgRNA initiieren, bevor zur zweiten Matrize gewechselt wird. Ein solcher Ansatz könnte lange Insertionen ermöglichen, indem eine Fehlfaltung der PEgRNA bei Zugabe der langen Matrize verhindert wird und auch keine Dissoziation des Cas9 vom Genom für lange Insertionen erforderlich ist, was PEbasierte lange Insertionen hemmen kann.
  • (iv) Anbringung zusätzlicher RNA-Motive an den 5' oder 3' Termini
  • PEgRNA -Designs könnten auch durch die Anbringung zusätzlicher Motive an beiden Enden des RNA-Terminus verbessert werden. Mehrere solcher Motive, wie etwa das PAN ENE von KSHV und das ENE von MALAT1, wurden vorstehend in Teil (i)184,185 als mögliches Mittel erörtert, um die Expression längerer PEgRNA von Nicht-Pol III-Promotoren zu beenden. Diese Elemente bilden RNA-Triple-Helices, die den polyA-Schwanz umhüllen, was dazu führt, dass sie im Kern zurückgehalten werden184,187. Durch die Bildung komplexer Strukturen am 3'-Terminus der PEgRNA, die das terminale Nukleotid verschließen, würden diese Strukturen jedoch wahrscheinlich auch dazu beitragen, den Exonuklease-vermittelten Abbau von PEgRNA zu verhindern. Andere am 3'-Terminus eingefügte Strukturelemente könnten ebenfalls die RNA-Stabilität erhöhen, jedoch ohne die Termination von Nicht-Pol III-Promotoren zu ermöglichen. Solche Motive könnten Haarnadeln oder RNA-Quadruplexe beinhalten, die den 3'-Terminus197 verdecken, oder selbstspaltende Ribozyme wie HDV, die zur Bildung eines 2'-3'-cyclischen Phosphats am 3'-Terminus führen und möglicherweise auch die Wahrscheinlichkeit reduzieren, dass die PEgRNA durch Exonukleasen abgebaut wird198. Das Induzieren der PEgRNA durch unvollständiges Spleißen zur Zyklisierung - um eine ciRNA zu bilden - könnte ebenfalls die Stabilität der PEgRNA erhöhen und dazu führen, dass die PEgRNA im Zellkern verbleibt194.
  • Zusätzliche RNA-Motive könnten auch die RT-Prozessivität verbessern oder die PEgRNA -Aktivität erhöhen, indem sie die RT-Bindung an den DNA-RNA-Duplex verstärken. Die Zugabe der nativen Sequenz, die von der RT in ihrem verwandten retroviralen Genom gebunden wird, könnte die RT-Aktivität erhöhen199. Dies könnte die native Primerbindungsstelle (PBS), den Polypurin-Trakt (PPT) oder Kissing Loops umfassen, die an der retroviralen Genom-Dimerisierung und der Initiation der Transkription beteiligt sind199. Die Zugabe von Dimerisierungsmotiven - wie etwa Kissing Loops oder ein GNRA- Tetraloop/Tetraloop-Rezeptorpaar200 - an den 5'- und 3'-Termini der PEgRNA könnte auch zu einer effektiven Zirkularisierung der PEgRNA führen, was die Stabilität verbessert. Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass die Zugabe dieser Motive die physische Trennung des PEgRNA -Spacers und Primers ermöglichen könnte, wodurch eine Okklusion des Spacers verhindert wird, welche die PE-Aktivität behindern würde. Kurze 5'-Verlängerungen der PEgRNA, die in der Spacer-Region eine kleine Toehold-Haarnadel bilden, könnten auch günstig gegen die Anlagerungsregion der den Spacer bindenden PEgRNA konkurrieren. Schließlich könnten Kissing Loops auch verwendet werden, um andere Matrizen-RNAs an die genomische Stelle zu rekrutieren und den Austausch der RT-Aktivität von einer RNA zur anderen zu ermöglichen (Abschnitt iii).
  • Sequenzen
  • PEgRNA-HDV-Fusion
    Figure DE112020001306T5_0123
    Figure DE112020001306T5_0124
  • PEgRNA -MMLV-Kissing-Loop
    Figure DE112020001306T5_0125
  • PEgRNA-VS-Ribozym-Kissing-Loop
    Figure DE112020001306T5_0126
  • PEGRNA-GNRA-Tetraloop/Tetraloop-Rezeptor
    Figure DE112020001306T5_0127
  • PEgRNA- matrizenwechselnde sekundäre RNA-HDV-Fusion
    Figure DE112020001306T5_0128
  • (v) Evolution von PEgRNA
  • Es ist wahrscheinlich, dass das PEgRNA -Gerüst durch gesteuerte Evolution weiter verbessert werden kann, analog zur Verbesserung von SpCas9 und Baseneditoren201. Die gesteuerte Evolution könnte die Erkennung von PEgRNA durch Cas9 oder weiterentwickelte Cas9-Varianten verbessern. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass verschiedene PEgRNA-Gerüstsequenzen an verschiedenen genomischen Loci optimal wären, entweder die PE-Aktivität an der fraglichen Stelle erhöhen, die Off-Target-Aktivitäten reduzieren oder beides. Schließlich würde die Evolution von PEgRNA -Gerüsten, denen andere RNA-Motive hinzugefügt wurden, mit ziemlicher Sicherheit die Aktivität der fusionierten PEgRNA im Vergleich zur nicht entwickelten Fusions-RNA verbessern. Zum Beispiel führte die Evolution allosterischer Ribozyme, die aus c-di-GMP-I-Aptameren und Hammerhead-Ribozymen zusammengesetzt sind, zu einer dramatisch verbesserten Aktivität202, was darauf hindeutet, dass die Evolution auch die Aktivität von Hammerhead-PEgRNA-Fusionen verbessern würde. Während Cas9 derzeit im Allgemeinen keine 5'-Verlängerung der sgRNA toleriert, wird die gesteuerte Evolution wahrscheinlich Mutationen erzeugen, die diese Intoleranz mildern und die Verwendung zusätzlicher RNA-Motive ermöglichen.
  • Konkurrierende Ansätze
  • Wie in dieser Schrift beschrieben, wurde eine Reihe dieser Ansätze bereits für die Verwendung mit Cas9:sgRNA-Komplexe beschrieben, aber es wurden keine Designs zur Verbesserung der PEgRNA-Aktivität gemeldet. Andere Strategien zur Anbringung programmierbarer Mutationen im Genom beinhalten Baseneditierung, Homology-Directed Recombination (HDR), präzises Mikrohomologie-vermitteltes End-Joining (MMEJ) oder Transposase-vermitteltes Editieren. Alle diese Ansätze weisen allerdings erhebliche Nachteile im Vergleich zu PEs auf. Gegenwärtige Baseneditoren können, obwohl sie effizienter als bestehende PEs sind, nur bestimmte Klassen von genomischen Mutationen anbringen und können zu zusätzlichen, unerwünschten Nukleotidumwandlungen an der interessierenden Stelle führen. HDR ist nur in einer sehr kleinen Minderheit von Zelltypen möglich und führt zu vergleichsweise hohen Raten an zufälligen Insertions- und Deletionsmutationen (Indels). Präzises MMEJ kann zu einer vorhersagbaren Reparatur von Doppelstrangbrüchen führen, ist jedoch weitgehend auf die Anbringung von Deletionen beschränkt, ist sehr ortsabhängig und kann auch vergleichsweise hohe Raten an unerwünschten Indels aufweisen. Transposase-vermitteltes Editieren funktioniert bisher nur bei Bakterien. Daher stellen Verbesserungen des PE möglicherweise den besten Weg zur therapeutischen Korrektur einer breiten Palette genomischer Mutationen dar.
  • BEISPIEL 4. EINBAU VON 3'-TOELOOP IN DIE PRIMERBINDUNGSSTELLE (PBS) VERBESSERT DIE PEgRNA-AKTIVITÄT
  • Um die PE-Aktivität weiter zu verbessern, zogen die Erfinder in Betracht, eine Toeloop-Sequenz am 3'-Ende einer PEgRNA mit einem 3'-Verlängerungsarm hinzuzufügen. 37A stellt ein Beispiel für eine generische SpCas9-PEgRNA mit einem 3'-Verlängerungsarm (oberes Molekül) bereit. Der 3'-Verlängerungsarm wiederum umfasst eine RT-Matrize (welche die gewünschte Editierung beinhaltet) und eine Primerbindungsstelle (PBS) am 3'-Ende des Moleküls. Das Molekül endet mit einer Poly(U)-Sequenz, die drei U-Nukleobasen umfasst (d. h. 5'-UUU-3').
  • Im Gegensatz dazu zeigt der untere Teil von 37A das gleiche PEgRNA-Molekül wie der obere Teil von 37A, wobei jedoch eine 9-Nukleobasen-Sequenz von 5'-GAAANNNNN-3' zwischen dem 3'-Ende der Primerbindungsstelle und dem 5'-Ende der terminalen Poly(U)-Sequenz eingefügt wurde. Diese Struktur faltet sich um 180° um sich selbst zurück, um eine „Toeloop“-RNA-Struktur zu bilden, wobei die Sequenzen von 5'-NNNNN-3' der 9-Nukleobasen-Insertion mit einer komplementären Sequenz in der Primerbindungsstelle hybridisieren, und wobei der 5'-GAAA-3'-Abschnitt die 180°-Drehung bildet. Die Merkmale der Toeloop-Sequenz, die in 37A abgebildet ist, soll den Umfang möglicher Toeloops, die an dessen Stelle verwendet werden könnten, nicht einengen oder einschränken. Außerdem hängt die Sequenz des Toeloops von der komplementären Sequenz der Primerbindungsstelle ab. Im Wesentlichen kann die Toeloop-Sequenz jedoch in verschiedenen Ausführungsformen einen ersten Sequenzabschnitt aufweisen, der eine 180°-Drehung bildet, und einen zweiten Sequenzabschnitt, der eine Sequenz aufweist, die zu einem Abschnitt der Primerbindungsstelle komplementär ist.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Toeloop-Sequenz PEgRNA die Verwendung von PEgRNAs mit zunehmend längeren Primerbindungsstellen ermöglicht, als dies sonst möglich wäre. Längere PBS-Sequenzen wiederum sollen die PE-Aktivität verbessern. PEgRNA Genauer gesagt besteht die wahrscheinliche Funktion des Toeloops darin, die Interaktion der PBS mit dem Spacer zu verhindern oder zumindest zu minimieren. Eine stabile Haarnadelbildung zwischen PBS und Spacer kann zu einer inaktiven PEgRNA führen. Ohne Toeloop kann diese Interaktion eine Beschränkung der Länge des PBS erfordern. Das Blockieren oder Minimieren der Interaktion zwischen Spacer und PBS unter Verwendung eines 3'-Ende-Toeloop kann zu einer Verbesserung der PE-Aktivität führen.
  • 37B zeigt die Ergebnisse von Beispiel 4, das demonstriert, dass die Effizienz des Prime Editings in HEK-Zellen oder EMX-Zellen unter Verwendung von PEgRNA, die Toeloop-Elemente enthält, erhöht ist, während der Prozentsatz der Indel-Bildung weitgehend unverändert ist.
  • AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die folgenden Ausführungsformen liegen im Umfang der vorliegenden Offenbarung. Darüber hinaus umfasst die Offenbarung alle Variationen, Kombinationen und Permutationen dieser Ausführungsformen, in denen eine oder mehrere Beschränkungen, Elemente, Klauseln und beschreibende Begriffe aus einer oder mehreren der in diesem Abschnitt aufgelisteten Ausführungsformen in eine andere aufgelistete Ausführungsform eingeführt werden. Zum Beispiel kann jede aufgelistete Ausführungsform, die von einer anderen Ausführungsform abhängt, modifiziert werden, um eine oder mehrere Einschränkungen einzuschließen, die in jeder anderen in diesem Abschnitt aufgelisteten Ausführungsform gefunden werden, die von derselben Basisausführungsform abhängt. Wenn Elemente als Listen präsentiert werden, z. B. im Markush-Gruppenformat, wird jede Untergruppe der Elemente ebenfalls offenbart, und alle Elemente können aus der Gruppe entfernt werden. Es versteht sich, dass im Allgemeinen, wenn die Offenbarung oder Aspekte der Offenbarung als bestimmte Elemente umfassend und/oder Merkmale bezeichnet wird/werden, bestehen oder bestehen im Wesentlichen bestimmte Ausführungsformen der Erfindung oder Aspekte der Erfindung aus solchen Elementen und/oder Merkmalen. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die Begriffe „umfassend“ und „enthaltend“ offen sein sollen und die Aufnahme zusätzlicher Elemente oder Schritte gestatten. Wenn Bereiche angegeben sind, sind Endpunkte beinhaltet. Darüber hinaus können Werte, die als Bereiche ausgedrückt werden, jeden spezifischen Wert oder Teilbereich innerhalb der angegebenen Bereiche in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung annehmen, sofern nicht anders angegeben oder aus dem Kontext und dem Verständnis eines Durchschnittsfachmanns ersichtlich ist, und zwar bis zum Zehntel der Einheit der unteren Grenze des Bereichs, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt.
    1. 1. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei die Leit-RNA eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514 oder eine Sequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1-135514 umfasst.
    2. 2. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Identitätssequenz mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 umfasst.
    3. 3. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 271029-406542, oder einen Verlängerungsarm mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 271029-406542 aufweist.
    4. 4. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm (i) eine Primerbindungsstelle, (ii) eine Editiermatrize und (iii) einen Homologiearm umfasst.
    5. 5. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Primerbindungsstelle mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 406543-542056, oder eine Primerbindungsstelle mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 406543-542056 ist.
    6. 6. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Editiermatrize umfasst, die eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 542057-677570, oder eine Editiermatrize mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 90 % mit einer der SEQ ID NOs: 542057-677570 sequenzidentisch ist.
    7. 7. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm einen Homologiearm mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 677571-813084, oder einen Homologiearm mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 90 % mit einer der SEQ ID NOs: 677571-813084 identisch ist.
    8. 8. Leit-RNA, Folgendes umfassend:
      • (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und
      • (ii) einen Verlängerungsarm, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 271029-406542, oder einen Verlängerungsarm mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NOs: 271029-406542.
    9. 9. Leit-RNA, Folgendes umfassend:
      • (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und
      • (ii) eine Primerbindungsstelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 406543-542056, oder eine Primerbindungsstelle mit einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 406543-542056 ist.
    10. 10. Leit-RNA, Folgendes umfassend:
      • (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und
      • (ii) eine Editiermatrize mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 542057-677570, oder eine Editiermatrize mit einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 542057-677570 ist.
    11. 11. Leit-RNA, Folgendes umfassend:
      • (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und
      • (ii) einen Homologiearm mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 677571-813084, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 677571-813084 ist.
    12. 12. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-11, ferner umfassend ein Terminationssignal von SEQ ID NO: 813086 oder ein Terminationssignal mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813086.
    13. 13. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-12, ferner umfassend eine 5'-Ende-Modifikatorregion, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    14. 14. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-13, ferner umfassend eine 3'-Ende-Modifikatorregion umfasst, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    15. 15. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-14, ferner umfassend einen gRNA-Kern, der SEQ ID NOs: 813085 umfasst, oder einen gRNA-Kern, der mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813085 aufweist.
    16. 16. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-15, wobei die Leit-RNA in der Lage ist, an ein napDNAbp zu binden, das zum Prime Editing geeignet ist, und das napDNAbp an eine Ziel-DNA-Sequenz zu lenken.
    17. 17. Leit-RNA nach Ausführungsform 16, wobei die Zielnukleinsäuresequenz einen Zielstrang (oder PAM-Strang) und einen komplementären Nicht-Zielstrang (oder Nicht-PAM-Strang) umfasst, wobei der Spacer der Leit-RNA mit dem komplementären Nicht-Zielstrang (Nicht-PAM-Strang) hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
    18. 18. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-17, wobei die Primerbindungsstelle zwischen etwa 8 und etwa 20 Nukleotide lang ist.
    19. 19. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-18, wobei die Primerbindungsstelle 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Nukleotide lang ist.
    20. 20. Leit-RNA nach einer der vorstehenden Ausführungsformen, wobei die Primerbindungsstelle mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide oder mindestens 20 Nukleotide lang ist.
    21. 21. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-19, wobei der Homologiearm zu einem Strang der Ziel-DNA komplementär ist.
    22. 22. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-10, wobei der Verlängerungsarm zwischen etwa 7 und etwa 500 Nukleotide lang ist.
    23. 23. Leit-RNA nach einer der vorstehenden Ausführungsformen, wobei der Verlängerungsarm mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    24. 24. Leit-RNA nach einer der vorstehenden Ausführungsformen, wobei die Editiermatrize mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    25. 25. Leit-RNA nach einer der vorstehenden Ausführungsformen, wobei der Homologiearm mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide oder mindestens 30 Nukleotide lang ist.
    26. 26. Leit-RNA nach einer der vorstehenden Ausführungsformen, wobei die Editiermatrize und der Homologiearm durch eine reverse Transkriptase als Matrizensequenz für die Synthese eines entsprechenden einzelsträngigen DNA-Flap mit einem 3'-Ende verwendet werden können, wobei der DNA-Flap komplementär zu einem Strang der endogenen Ziel-DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist, und wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine Nukleotidänderung umfasst, die durch die Editiermatrize codiert wird.
    27. 27. Leit-RNA nach Ausführungsform 25, wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine endogene einzelsträngige DNA mit einem 5'-Ende in der Ziel-DNA-Sequenz, die genickt wurde, verdrängt.
    28. 28. Leit-RNA nach Ausführungsform 26, wobei die endogene Einzelstrang-DNA mit dem freien 5'-Ende von der Zelle ausgeschnitten wird.
    29. 29. Leit-RNA nach Ausführungsform 27, wobei die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap zur Anbringung der Nukleotidänderung führt, wodurch ein gewünschtes Produkt gebildet wird.
    30. 30. Leit-RNA nach Ausführungsform 28, wobei die gewünschte Nukleotidänderung eine Insertion ist.
    31. 31. Leit-RNA nach einer der vorstehenden Ausführungsformen 29, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    32. 32. Leit-RNA nach Ausführungsform 29, wobei die Insertion eine Sequenz ist, die ein Polypeptid codiert.
    33. 33. Prime-Editing-Komplex, umfassend ein napDNAbp, eine reverse Transkriptase und eine beliebige der Leit-RNAs nach Ausführungsformen 1-32.
    34. 34. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 32, wobei das napDNAbp und die reverse Transkriptase als Fusionsprotein gebildet sind.
    35. 35. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 32, wobei das napDNAbp ein Cas9 ist.
    36. 36. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 34, wobei das Cas9 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cas9-Nickasen oder Varianten davon.
    37. 37. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 34, wobei das Cas9 eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514.
    38. 38. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 33, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514 besteht.
    39. 39. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 33, wobei das Fusionsprotein einen Linker umfasst, der das napDNAbp und die reverse Transkriptase verbindet.
    40. 40. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 38, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514.
    41. 41. Ein oder mehrere Polynukleotide, die den Prime-Editing-Komplex nach einer der Ausführungsformen 32-39 codieren.
    42. 42. Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Ausführungsform 41 und einen oder mehrere Promotoren, welche die Expression der Leit-RNA und des Fusionsproteins des Prime-Editing-Komplexes antreiben.
    43. 43. Zelle, die den Vektor nach Ausführungsform 41 umfasst.
    44. 44. Zelle, die einen Prime-Editing-Komplex nach einer der Ausführungsformen 32-39 umfasst.
    45. 45. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (i) eine Leit-RNA einer der Ausführungsformen 1-31, einen Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsformen 32-39, ein Polynukleotid nach Ausführungsform 40 oder einen Vektor nach Ausführungsform 41; und (ii) einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff.
    46. 46. Verfahren zum Anbringen einer Nukleotidänderung in einer Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Nukleinsäuresequenz mit einem Komplex, umfassend ein Fusionsprotein und eine Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-31 oder einer der Ausführungsformen 83-85, wobei die Fusionsprotein ein napDNAbp und eine Polymerase umfasst, und wobei die Leit-RNA einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, der eine Editiermatrize umfasst, die eine Nukleotidänderung codiert; dadurch
      • (i) Nicken der doppelsträngigen DNA-Sequenz auf dem Zielstrang (oder dem PAM-Strang) und Erzeugen einer freien einzelsträngigen DNA mit einem 3'-Ende;
      • (ii) Hybridisieren des 3'-Endes der freien Einzelstrang-DNA mit der Leit-RNA an der Primerbindungsstelle, wodurch die Polymerase geprimt wird;
      • (iii) Polymerisieren eines DNA-Strangs vom 3'-Ende aus, wodurch ein Einzelstrang-DNA-Flap erzeugt wird, der die Nukleotidänderung umfasst; und
      • (iv) Ersetzen des endogenen DNA-Strangs unmittelbar stromabwärts der Schnittstelle auf dem Zielstrang (oder PAM-Strang) durch den Einzelstrang-DNA-Flap, wodurch die gewünschte Nukleotidänderung in die doppelsträngige DNA-Sequenz eingebaut wird.
    47. 47. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei die Nukleotidänderung eine einzelne Nukleotidsubstitution, eine Deletion, eine Insertion oder eine Kombination davon ist.
    48. 48. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei die einzelne Nukleotidsubstitution eine Transition oder eine Transversion ist.
    49. 49. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei die Nukleotidänderung (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C-Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C-Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A-zu-C-Substitution ist.
    50. 50. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei die Nukleoidänderung (1) ein G:C-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T:A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T.Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar umwandelt.
    51. 51. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion oder Deletion von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden ist.
    52. 52. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion einer Polypeptid-codierenden Sequenz ist.
    53. 53. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei die Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen korrigiert.
    54. 54. Verfahren nach Ausführungsform 46, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer monogenetischen Störung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase(ADA)-Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie; Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirupkrankheit; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose-Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylkeoturie; schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellenanämie; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; und Tay-Sachs-Krankheit.
    55. 55. Verfahren nach Ausführungsformen 46, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Erkrankung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit; hoher Blutdruck; Alzheimerkrankheit; Arthritis; Diabetes; Krebs; und Fettleibigkeit.
    56. 56. Computergestütztes Verfahren zum Bestimmen einer Prime-Editor-Leit-RNA(PEgRNA)-Struktur, wobei das Verfahren die Verwendung von mindestens einem Computerhardwareprozessor umfasst, um Folgendes durchzuführen:
      • Zugreifen auf Daten, die Folgendes angeben:
        • ein Eingangsallel;
        • ein Ausgangsallel; und
        • ein Fusionsprotein, umfassend ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-bindendes Protein und eine Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase); und
      • Bestimmen der PEgRNA-Struktur basierend auf dem Eingangsallel, dem Ausgangsallel und dem Fusionsprotein, wobei die PEgRNA-Struktur so gestaltet ist, dass sie mit dem Fusionsprotein assoziiert ist, um das Eingangsallel in das Ausgangsallel zu ändern, umfassend das Bestimmen für die PEgRNA-Struktur von einer oder mehreren der folgenden Funktionen:
        • einen Spacer, der komplementär zu einer Zielnukleotidsequenz im Eingangsallel ist;
        • ein gRNA-Rückgrat zur Interaktion mit dem Fusionsprotein; und
        • eine Verlängerung, die eines oder mehrere der Folgenden umfasst:
          • eine DNA-Synthesematrizensequenz, die eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst, um das Eingangsallel in das Ausgangsallel zu ändern;
          • eine Primerbindungsstelle;
          • optional ein Terminationssignal neben der DNA-Synthesematrize;
          • optional einen ersten Modifikator neben dem Terminationssignal; und
          • optional einen zweiten Modifikator neben der Primerbindungsstelle.
    57. 57. Verfahren nach Ausführungsform 56, ferner umfassend Bestimmen des Spacers und der Verlängerung und Bestimmen, dass der Spacer am 5'-Ende der PEgRNA-Struktur liegt und die Verlängerung am 3'-Ende der PEgRNA-Struktur liegt.
    58. 58. Verfahren nach Ausführungsform 56, ferner umfassend Bestimmen des Spacers und der Verlängerung, wobei der Spacer am 5'-Ende der PEgRNA-Struktur liegt und die Verlängerung 3' zum Spacer ist.
    59. 59. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Zugreifen auf Daten, die das Eingangsallel und das Ausgangsallel angeben, Zugreifen auf eine Datenbank, umfassend einen Satz von Eingangsallelen und assoziierten Ausgangsallelen, umfasst.
    60. 60. Verfahren nach Ausführungsform 59, wobei das Zugreifen auf die Datenbank Zugreifen auf eine ClinVar-Datenbank umfasst, die eine Vielzahl von Einträgen umfasst, wobei jeder Eintrag ein Eingangsallel aus dem Satz von Eingangsallelen und ein Ausgangsallel aus dem Satz von Ausgangsallelen umfasst.
    61. 61. Verfahren nach Ausführungsform 59, wobei das Bestimmen der PEgRNA-Struktur Bestimmen einer oder mehrerer PEgRNA-Strukturen für jedes Eingangsallel und das zugehörige Ausgangsallel in dem Satz umfasst.
    62. 62. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Zugreifen auf Daten, die das Fusionsprotein angeben, Bestimmen des Fusionsproteins aus einer Vielzahl von Fusionsproteinen umfasst.
    63. 63. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Fusionsprotein ein Cas9-Protein umfasst.
    64. 64. Verfahren nach Ausführungsform 63, wobei das Fusionsprotein ein Cas9-NG-Protein oder ein SpCas9-Protein umfasst.
    65. 65. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Ändern des Eingangsallels in das Ausgangsallel eine einzelne Nukleotidänderung, eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden, eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden oder eine Kombination davon umfasst.
    66. 66. Verfahren nach Ausführungsform 56, ferner umfassend Bestimmen des Spacers, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz von etwa 20 Nukleotiden umfasst.
    67. 67. Verfahren nach Ausführungsform 66, ferner umfassend Bestimmen des Spacers basierend auf der Position der Änderung in einer entsprechenden Protospacer-Nukleotidsequenz.
    68. 68. Verfahren nach Ausführungsform 67, wobei die Änderung in einem Editierfenster angebracht wird, das zwischen etwa Protospacer-Position -3 bis Protospacer-Position +27 liegt.
    69. 69. Verfahren der Ausführungsform 67, ferner umfassend:
      • Bestimmen eines Satzes von anfänglichen Protospacer-Kandidaten basierend auf dem Eingangsallel und dem Fusionsprotein, wobei jeder anfängliche Protospacer-Kandidat ein PAM des Fusionsproteins in dem Eingangsallel umfasst;
      • Bestimmen eines oder mehrerer anfänglicher Protospacer-Kandidaten aus dem Satz anfänglicher Protospacer-Kandidaten, wobei jeder eine inkompatible Nickposition umfasst;
      • Entfernen des bestimmten einen oder mehreren anfänglichen Protospacer-Kandidaten aus dem Satz, um einen Satz verbleibender Protospacer-Kandidaten zu erzeugen; und
      • wobei das Bestimmen der PEgRNA-Struktur Bestimmen einer Vielzahl von PEgRNA-Strukturen umfasst, wobei jede der PEgRNA -Strukturen einen anderen Spacer umfasst, der basierend auf einem entsprechenden Protospacer aus dem Satz verbleibender Protospacer-Kandidaten bestimmt wird.
    70. 70. Verfahren nach Ausführungsform 55, ferner umfassend Bestimmen der Verlängerung und der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz), wobei die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) etwa 7 Nukleotide bis etwa 34 Nukleotide umfasst.
    71. 71. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Bestimmen der PEgRNA umfasst:
      • Bestimmen des Spacers basierend auf dem Eingangsallel und/oder dem Fusionsprotein; und
      • Bestimmen der DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) basierend auf dem Spacer.
    72. 72. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei die DNA-Synthesematrize (z. B. RT-Matrizensequenz) einen einzelsträngigen DNA-Flap codiert, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist, wobei der einzelsträngige DNA-Flap die gewünschte Nukleotidänderung umfasst.
    73. 73. Verfahren nach Ausführungsform 72, wobei der einzelsträngige DNA-Flap in der Lage ist, mit der endogenen DNA-Sequenz neben der Nickstelle zu hybridisieren, wodurch die gewünschte Nukleotidänderung angebracht wird.
    74. 74. Verfahren nach Ausführungsform 72, wobei der einzelsträngige DNA-Flap in der Lage ist, die endogene DNA-Sequenz neben der Nickstelle zu verdrängen.
    75. 75. Verfahren nach Ausführungsform 72, wobei die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap zur Anbringung der gewünschten Nukleotidänderung führt, wodurch ein gewünschtes Produkt gebildet wird.
    76. 76. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Fusionsprotein, wenn es mit der PEgRNA komplexiert ist, in der Lage ist, mit einer Ziel-DNA-Sequenz zu binden.
    77. 77. Verfahren nach Ausführungsform 76, wobei die Ziel-DNA-Sequenz einen Zielstrang, in dem die Änderung auftritt, und einen komplementären Nicht-Zielstrang umfasst.
    78. 78. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Eingangsallel eine pathogene DNA-Mutation umfasst und das Ausgangsallel eine korrigierte DNA-Sequenz umfasst.
    79. 79. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Eingangsallel eines der Krankheitsallele von SEQ ID NOs: 1217353-1289387 ist.
    80. 80. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei das Ausgangsallel eines der gesunden Allele von SEQ ID NOs: 1289388-1361420 ist.
    81. 81. System, umfassend:
      • mindestens einen Prozessor; und
      • mindestens ein computerlesbares Speichermedium mit darauf codierten Anweisungen, die bei Ausführung den mindestens einen Prozessor dazu veranlassen, das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 56-81 durchzuführen.
    82. 82. mindestens ein computerlesbares Speichermedium mit darauf codierten Anweisungen, die bei Ausführung mindestens einen Prozessor dazu veranlassen, das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 56-81 durchzuführen.
    83. 83. Verfahren zur Baseneditierung unter Verwendung der PEgRNA-Struktur, die gemäß dem Verfahren nach einer der Ausführungsformen 56-81 bestimmt wurde.
    84. 84. PEgRNA, bestimmt gemäß dem Verfahren nach einer der Ausführungsformen 56-81.
    85. 85. Leit-RNA zur Verwendung beim Prime Editing, um ein Krankheitsallel an einer Ziel-DNA-Sequenz zu korrigieren, um ein gesundes Allel zu bilden, wobei der Leiter einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, wobei der Spacer in der Lage ist, mit einer ~20 Nukleotidregion innerhalb von SEQ ID NOs: 1217353- 1289387 oder dem Komplementstrang davon zu binden.
    86. 86. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle umfasst, die wirksam ist, um ein Prime Editing durchzuführen.
    87. 87. Leit-RNA nach Ausführungsform 85, wobei die Editierstelle in einer der Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 1217353-1289387 an Position 201 in der 5' bis 3'-Ausrichtung beginnt.
    88. 88. Leit-RNA zum Prime Editing, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrize umfasst.
    89. 89. Leit-RNA nach Ausführungsform 88, wobei die Primerbindungsstelle eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 406543-542056 (Primerbindungsstelle) oder eine Nukleotidsequenz aufweist, die mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NOs: 406543-542056 aufweist.
    90. 90. Leit-RNA nach Ausführungsform 88, wobei die DNA-Synthesematrize eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NOs: 542057-677570 (Editiermatrize) oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NOs: 542057-677570 aufweist.
    91. 91. Leit-RNA nach Ausführungsform 88, wobei die DNA-Synthesematrize eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NOs: 677571-813084 (Homologiearm) oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NOs: 677571-813084 aufweist.
    92. 92. Leit-RNA nach Ausführungsform 88, wobei die DNA-Synthesematrize eine Editiermatrize und einen Homologiearm umfasst, wobei die Editiermatrize eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NOs: 542057-677570 umfasst und der Homologiearm eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NOs: 677571-813084 umfasst.
    93. 93. Die Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-92 umfasst ferner ein Terminationssignal aus SEQ ID NO: 813086 oder ein Terminationssignal mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813086.
    94. 94. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-93 ferner umfassend eine 5'-Ende-Modifikatorregion, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    95. 95. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-94, ferner umfassend eine 3'-Ende-Modifikatorregion, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    96. 96. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-95, ferner umfassend einen gRNA-Kern, der SEQ ID NO: 813085 umfasst, oder einen gRNA-Kern, der mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813085 aufweist.
    97. 97. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-96, wobei die Leit-RNA in der Lage ist, an ein napDNAbp zu binden, das zum Prime Editing geeignet ist, und das napDNAbp an eine Ziel-DNA-Sequenz zu lenken.
    98. 98. Leit-RNA nach Ausführungsform 97, wobei die Zielnukleinsäuresequenz einen Zielstrang (oder PAM-Strang) und einen komplementären Nicht-Zielstrang (oder Nicht-PAM-Strang oder Nicht-Editierstrang) umfasst, wobei der Spacer der Leit-RNA mit dem komplementären Nicht-PAM hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
    99. 99. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-98, wobei die Primerbindungsstelle zwischen etwa 8 und etwa 20 Nukleotide lang ist.
    100. 100. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-99, wobei die Primerbindungsstelle 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Nukleotide lang ist.
    101. 101. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-100, wobei der Verlängerungsarm mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    102. 102. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-101, wobei die Primerbindungsstelle mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide oder mindestens 20 Nukleotide lang ist.
    103. 103. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-102, wobei die DNA-Synthesematrize mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    104. 104. Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 86-103, wobei die DNA-Synthesematrize von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) als Matrize für die Synthese eines entsprechenden einzelsträngigen DNA-Flap mit einem 3' Ende verwendet werden kann, wobei der DNA-Flap komplementär zu einem Strang der endogenen Ziel-DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist und wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst, die von der DNA-Synthesematrize codiert wird.
    105. 105. Leit-RNA nach Ausführungsform 104, wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine endogene einzelsträngige DNA mit einem 5'-Ende in der Ziel-DNA-Sequenz, die genickt wurde, verdrängt.
    106. 106. Leit-RNA nach Ausführungsform 105, wobei die endogene Einzelstrang-DNA mit dem freien 5'-Ende von der Zelle ausgeschnitten wird.
    107. 107. Leit-RNA nach Ausführungsform 105, wobei die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap zur Anbringung der Nukleotidänderung führt, wodurch ein editiertes DNA-Produkt gebildet wird.
    108. 108. Leit-RNA nach Ausführungsform 107, wobei die gewünschte Nukleotidänderung eine Insertion ist.
    109. 109. Leit-RNA nach Ausführungsform 108, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    110. 110. Leit-RNA nach Ausführungsform 108, wobei die Insertion eine Sequenz ist, die ein Polypeptid codiert.
    111. 111. Prime-Editing-Komplex, umfassend ein napDNAbp, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und eine beliebige der Leit-RNA nach Ausführungsformen 86-110.
    112. 112. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 111, wobei das napDNAbp und die RNA-abhängige DNA-Polymerase als Fusionsprotein gebildet werden.
    113. 113. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 111, wobei das napDNAbp ein Cas9 ist.
    114. 114. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 113, wobei das Cas9 eine Cas9-Nickase oder eine Variante davon ist.
    115. 115. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 113, wobei das Cas9 eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514.
    116. 116. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 112, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514 besteht.
    117. 117. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 112, wobei das Fusionsprotein einen Linker umfasst, der den napDNAbp und die RNA-abhängige DNA-Polymerase verbindet.
    118. 118. Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsform 117, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514.
    119. 119. Ein oder mehrere Polynukleotide, die den Prime-Editing-Komplex nach einer der Ausführungsformen 111-118 codieren.
    120. 120. Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Ausführungsform 119 und einen oder mehrere Promotoren, welche die Expression der Leit-RNA und des Fusionsproteins des Prime-Editing-Komplexes antreiben.
    121. 121. Zelle, die den Vektor nach Ausführungsform 120 umfasst.
    122. 122. Zelle, die einen Prime-Editing-Komplex nach einer der Ausführungsformen 111-118 umfasst.
    123. 123. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (i) eine Leit-RNA einer der Ausführungsformen 84-110, einen Prime-Editing-Komplex nach Ausführungsformen 111-118, ein Polynukleotid nach Ausführungsform 119 oder einen Vektor nach Ausführungsform 120; und (ii) einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff.
    124. 124. Verfahren zum Anbringen einer Nukleotidänderung in einer Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Nukleinsäuresequenz mit einem Komplex, umfassend ein Fusionsprotein und eine Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 109-116, wobei das Fusionsprotein ein napDNAbp und eine RNA-abhängige DNA-Polymerase umfasst, wobei die Leit-RNA einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, der eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle umfasst, wobei die DNA-Synthesematrize eine Nukleotidänderung codiert und wobei der Spacer in der Lage ist, an den Nicht-PAM-Strang proximal zu einem verfügbaren PAM und Protospacer anzulagern, dadurch
      • (i) Nicken der doppelsträngigen DNA-Sequenz auf dem PAM-Strang, dadurch Erzeugen einer freien einzelsträngigen DNA mit einem 3'-Ende;
      • (ii) Hybridisieren des 3'-Endes der freien Einzelstrang-DNA mit der Leit-RNA an der Primerbindungsstelle, wodurch die RNA-abhängige DNA-Polymerase geprimt wird;
      • (iii) Polymerisieren eines DNA-Strangs vom 3'-Ende der DNA aus, der von der DNA-Synthesematrize codiert wird, wodurch ein Einzelstrang-DNA-Flap erzeugt wird, der vom 3'-Ende der DNA verlängert wird, wobei der Flap die Nukleotidänderung umfasst;
      • (iv) Ersetzen des endogenen DNA-Strangs unmittelbar stromabwärts der Schnittstelle auf dem PAM-Strang durch den Einzelstrang-DNA-Flap, wodurch die Nukleotidänderung in die doppelsträngige DNA-Sequenz eingebaut wird.
    125. 125. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei, wenn Schritt (v) innerhalb einer Zelle abgeschlossen ist, die Zelle den nicht-editierten Strang durch zelluläre DNA-Reparatur und/oder - Replikation repariert.
    126. 126. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei die Nukleotidänderung eine einzelne Nukleotidsubstitution, eine Deletion, eine Insertion oder eine Kombination davon ist.
    127. 127. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei die einzelne Nukleotidsubstitution eine Transition oder eine Transversion ist.
    128. 128. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei die einzelne Nukleotidsubstitution (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C-Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C-Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A-zu-C-Substitution ist.
    129. 129. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei die einzelne Nukleotidsubstitution (1) ein G:C-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T:A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T.Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar umwandelt.
    130. 130. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion oder Deletion von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden ist.
    131. 131. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion einer Polypeptid-codierenden Sequenz ist.
    132. 132. Verfahren nach Ausführungsform 124, wobei die Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen korrigiert.
    133. 133. Verfahren nach Ausführungsform 132, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer monogenetischen Störung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase(ADA)-Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie; Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirupkrankheit; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose-Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylkeoturie; schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellenanämie; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; und Tay-Sachs-Krankheit.
    134. 134. Verfahren nach Ausführungsformen 132, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Erkrankung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit; hoher Blutdruck; Alzheimerkrankheit; Arthritis; Diabetes; Krebs; und Fettleibigkeit.
    135. 135. Leit-RNA zur Verwendung beim Prime Editing, um die Nukleotidsequenz eines Ziel-DNA-Moleküls mit einer Insertion, Deletion, Inversion, Substitution oder Kombination davon zu verändern, um ein entsprechendes editiertes DNA-Molekül herzustellen, wobei:
      • (i) die Leit-RNA in der Lage ist, einen Komplex mit einem Fusionsprotein zu bilden, das ein napDNAbp und eine Domäne umfasst, die eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst;
      • (ii) die Leit-RNA (a) einen Spacer, der sich proximal zu dem verfügbaren PAM und Protospacer am PAM-Strang auf dem Ziel-DNA-Molekül an den Nicht-PAM-Strang anlagern kann, und (b) einen gRNA-Kern umfasst;
      • (iii) die Leit-RNA ferner einen Verlängerungsarm am 5'- oder 3'-Ende der Leit-RNA umfasst;
      • (iv) der Verlängerungsarm (a) eine Primerbindungsstelle und (b) eine DNA-Synthesematrize umfasst, wobei die DNA-Synthesematrize für einen Einzelstrang-DNA-Flap codiert, der eine Editierung enthält, die anstelle des endogenen Strangs unmittelbar stromabwärts der Schnittstelle am PAM-Strang zu integrieren ist;
      • (v) das Ziel-DNA-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1217353-1289387; und
      • (vi) das entsprechende editierte DNA-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1289388-1361420.
    136. 136. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das Ziel-DNA-Molekül eine Clinvar-Variantensequenz ist.
    137. 137. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das napDNAbp Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Casl3a, Cas12c oder Argonaute oder eine Variante von Cas9, Cas12e, Casl2d, Cas12a, Cas12b1, Casl3a, Casl2c oder Argonaute ist.
    138. 138. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die napDNAbp-Domäne Nickase-Aktivität umfasst.
    139. 139. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das napDNAbp ein Cas9 oder eine Variante davon ist.
    140. 140. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das napDNAbp ein Nuklease-aktives Cas9, ein Nuklease-inaktives Cas9 (dCas9) oder eine Cas9-Nickase (nCas9) ist.
    141. 141. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das napDNAbp Cas9-Nickase (nCas9) ist.
    142. 142. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das napDNAbp die Aminosäure umfasst.
    143. 143. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das napDNAbp SpCas9-Wildtyp oder eine Variante davon einer der Aminosäuresequenzen 1361421- 1361428 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NOs: 1361421-1361428 ist.
    144. 144. Leit-RNA nach Anspruch 135, wobei die napDNAbp SpCas9-Wildtyp oder eine Variante davon einer der Aminosäuresequenzen 1361421-1361428 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361421-1361428 ist.
    145. 145. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das napDNAbp eine der Aminosäuresequenzen 1361421-1361484 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NOs: 1361421-1361484 ist.
    146. 146. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die Domäne, die eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst, eine reverse Transkriptase ist.
    147. 147. Leit-RNA nach Ausführungsform 146, wobei die reverse Transkriptase eine natürlich vorkommende reverse Transkriptase vom Wildtyp mit einer Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361485-1361496 oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ ID NOs: 1361485-1361496 ist.
    148. 148. Leit-RNA nach Ausführungsform 146, wobei die reverse Transkriptase eine variante reverse Transkriptase mit einer Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361497-1361514 oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ ID NOs: 1361497-1361514 ist.
    149. 149. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361515-1361519 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361515-1361519 umfasst.
    150. 150. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NOs: 1361515 (PE1) oder 1361516 (PE2) oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361515 oder 1361516 umfasst.
    151. 151. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die verfügbare PAM-Sequenz eine Funktion des in Schritt (i) verwendeten napDNAbp ist.
    152. 152. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die verfügbare PAM-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) 5'-NGG-3' (die kanonische PAM-Sequenz), (b) 5'-NNG-3', (c) 5'-NNA-3', (d) 5'-NNC-3', (e) 5'-NNT-3', (f) 5'-NGT-3', (g) 5'-NGA- 3', (h) 5'-NGC-3', (i) 5'-NAA-3', (j) 5'-NAC-3', (k) 5'-NAG-3' und (1) 5'-NAT-3', dessen Auswahl abhängig von der Wahl des napDNAbp ist.
    153. 153. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die Editierstelle in einer der Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 1217353-1289387 von Schritt (v) an Position 201 in der 5' bis 3'-Ausrichtung beginnt.
    154. 154. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die Nukleotidänderung eine Nukleotidsubstitution, eine Deletion, eine Insertion oder eine Kombination davon ist.
    155. 155. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die Nukleotidsubstitution eine Transition oder eine Transversion ist.
    156. 156. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die einzelne Nukleotidsubstitution (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C-Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C-Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A-zu-C-Substitution ist.
    157. 157. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die einzelne Nukleotidsubstitution (1) ein G:C-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T:A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T.Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar umwandelt.
    158. 158. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die gewünschte Nukleotidänderung eine Insertion oder Deletion von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden ist.
    159. 159. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion einer Polypeptid-codierenden Sequenz ist.
    160. 160. Leit-RNA nach Ausführungsform 135, wobei die Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen korrigiert.
    161. 161. Leit-RNA nach Ausführungsform 160, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer monogenetischen Störung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase(ADA)-Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie; Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirupkrankheit; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose-Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylkeoturie; schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellenanämie; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; und Tay-Sachs-Krankheit.
    162. 162. Leit-RNA nach Ausführungsformen 160, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Erkrankung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit; hoher Blutdruck; Alzheimerkrankheit; Arthritis; Diabetes; Krebs; und Fettleibigkeit.
    163. 163. Verfahren zum Anbringen einer Nukleotidänderung in einer Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Nukleinsäuresequenz mit einem Komplex, der ein Fusionsprotein und eine Leit-RNA nach einer der Ausführungsformen 1-32 oder 135-162 umfasst.
    164. 164. Verfahren nach Ausführungsform 163, wobei das Fusionsprotein ein napDNAbp und eine RNA-abhängige DNA-Polymerase umfasst.
    165. 165. Verfahren nach Ausführungsform 163, wobei die Leit-RNA einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, der eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle umfasst.
    166. 166. Verfahren nach Ausführungsform 165, wobei die DNA-Synthesematrize eine Nukleotidänderung codiert.
    167. 167. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 163-166, wobei die Leit-RNA in der Lage ist, an ein napDNAbp zu binden, das zum Prime Editing geeignet ist, und das napDNAbp an eine Ziel-DNA-Sequenz zu lenken.
    168. 168. Verfahren nach Ausführungsform 167, wobei die Zielnukleinsäuresequenz einen Zielstrang (oder PAM-Strang) und einen komplementären Nicht-Zielstrang (oder Nicht-PAM-Strang oder Nicht-Editierstrang) umfasst, wobei der Spacer der Leit-RNA mit dem komplementären Nicht-PAM hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
    169. 169. Verfahren nach Ausführungsform 165, wobei die Primerbindungsstelle zwischen etwa 8 und etwa 20 Nukleotiden lang ist.
    170. 170. Verfahren nach Ausführungsform 165, wobei die Primerbindungsstelle 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Nukleotide lang ist.
    171. 171. Verfahren nach Ausführungsformen 165, wobei der Verlängerungsarm mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    172. 172. Verfahren nach Ausführungsform 165, wobei die Primerbindungsstelle mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide oder mindestens 20 Nukleotide lang ist.
    173. 173. Verfahren nach Ausführungsform 165, wobei die DNA-Synthesematrize mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    174. 174. Verfahren nach Ausführungsform 165, wobei die DNA-Synthesematrize von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) als Matrize für die Synthese eines entsprechenden einzelsträngigen DNA-Flap mit einem 3' Ende verwendet werden kann, wobei der DNA-Flap komplementär zu einem Strang der endogenen Ziel-DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist und wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst, die von der DNA-Synthesematrize codiert wird.
    175. 175. Verfahren nach Ausführungsform 174, wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine endogene einzelsträngige DNA mit einem 5'-Ende in der Ziel-DNA-Sequenz, die genickt wurde, verdrängt.
    176. 176. Verfahren nach Ausführungsform 175, wobei die endogene Einzelstrang-DNA mit dem freien 5'-Ende von der Zelle ausgeschnitten wird.
    177. 177. Verfahren nach Ausführungsform 175, wobei die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flap zur Anbringung der Nukleotidänderung führt, wodurch ein editiertes DNA-Produkt gebildet wird.
    178. 178. Verfahren nach Ausführungsform 177, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion ist.
    179. 179. Verfahren nach Ausführungsform 178, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    180. 180. Verfahren nach Ausführungsform 178, wobei die Insertion eine Sequenz ist, die ein Polypeptid codiert.
  • LITERATURHINWEISE
  • Die folgenden Literaturhinweise sind jeweils vollumfänglich durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen.
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  • ÄQUIVALENTE UND UMFANG
  • In den Ansprüchen können Artikel wie „ein“, „eine“ und „der/die/das“ ein oder mehrere bedeuten, sofern nicht anders angegeben oder aus dem Kontext anderweitig ersichtlich. Ansprüche oder Beschreibungen, die „oder“ zwischen einem oder mehreren Mitgliedern einer Gruppe enthalten, gelten als erfüllt, wenn eines, mehrere oder alle Gruppenmitglieder in einem bestimmten Produkt oder Verfahren vorhanden, darin eingesetzt oder anderweitig relevant für ein bestimmtes Produkt oder Verfahren sind, sofern nicht gegenteilig angegeben oder anderweitig aus dem Kontext ersichtlich. Die Erfindung schließt Ausführungsformen ein, in denen genau ein Mitglied der Gruppe in einem gegebenen Produkt oder Verfahren vorhanden ist, darin eingesetzt wird oder anderweitig für dieses relevant ist. Die Erfindung schließt Ausführungsformen ein, in denen mehr als ein Mitglied oder alle Mitglieder der Gruppe in einem gegebenen Produkt oder Verfahren vorhanden ist, darin eingesetzt wird oder anderweitig für dieses relevant ist.
  • Darüber hinaus umfasst die Erfindung alle Variationen, Kombinationen und Permutationen, in denen eine oder mehrere Beschränkungen, Elemente, Klauseln und beschreibende Begriffe aus einer oder mehreren der in diesem Abschnitt aufgelisteten Ansprüche in eine andere aufgelistete Anspruch eingeführt werden. Beispielsweise kann jeder Anspruch, der von einem anderen Anspruch abhängig ist, modifiziert werden, um eine oder mehrere Einschränkungen einzuschließen, die in jedem anderen Anspruch gefunden werden, der von demselben Basisanspruch abhängig ist. Wenn Elemente als Listen präsentiert werden, z. B. im Markush-Gruppenformat, wird jede Untergruppe der Elemente ebenfalls offenbart, und alle Elemente können aus der Gruppe entfernt werden. Es versteht sich, dass im Allgemeinen, wenn die Erfindung oder Aspekte der Erfindung als bestimmte Elemente umfassend und/oder Merkmale bezeichnet wird/werden, bestehen oder bestehen im Wesentlichen bestimmte Ausführungsformen der Erfindung oder Aspekte der Erfindung aus solchen Elementen und/oder Merkmalen. Der Einfachheit halber wurden diese Ausführungsformen in dieser Schrift nicht spezifisch in haec verba dargelegt. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die Begriffe „umfassend“ und „enthaltend“ offen sein sollen und die Aufnahme zusätzlicher Elemente oder Schritte gestatten. Wenn Bereiche angegeben sind, sind Endpunkte beinhaltet. Darüber hinaus können Werte, die als Bereiche ausgedrückt werden, jeden spezifischen Wert oder Teilbereich innerhalb der angegebenen Bereiche in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung annehmen, sofern nicht anders angegeben oder aus dem Kontext und dem Verständnis eines Durchschnittsfachmanns ersichtlich ist, und zwar bis zum Zehntel der Einheit der unteren Grenze des Bereichs, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt.
  • Diese Anmeldung bezieht sich auf verschiedene erteilte Patente, veröffentlichte Patentanmeldungen, Zeitschriftenartikel und andere Veröffentlichungen, die sämtlich durch Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen sind. Falls ein Konflikt zwischen einem der aufgenommenen Literaturhinweise und der vorliegenden Patentschrift besteht, hat die Patentschrift Vorrang. Außerdem kann jede bestimmte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die in den Stand der Technik fällt, ausdrücklich von einem oder mehreren der Ansprüche ausgenommen werden. Da solche Ausführungsformen dem Fachmann als bekannt gelten, können sie auch dann ausgeschlossen werden, wenn der Ausschluss in dieser Schrift nicht ausdrücklich dargelegt wird. Jede bestimmte Ausführungsform der Erfindung kann aus einem beliebigen Grund von jedem Anspruch ausgeschlossen werden, unabhängig davon, ob es sich um den Stand der Technik handelt oder nicht.
  • Der Fachmann wird viele Äquivalente für die spezifischen in dieser Schrift beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen erkennen oder in der Lage sein, diese unter Verwendung lediglich von Routineversuchen zu ermitteln. Der Umfang der in dieser Schrift beschriebenen vorliegenden Ausführungsformen soll nicht auf die vorstehende Beschreibung beschränkt sein, sondern wird vielmehr in den beigefügten Ansprüchen dargelegt. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen an dieser Beschreibung vorgenommen werden können, ohne vom Geist oder Umfang der vorliegenden Erfindung, wie in den folgenden Ansprüchen definiert, abzuweichen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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    • US 9737604 B [0653, 0657]

    Claims (151)

    1. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei die Leit-RNA eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514 oder eine Sequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1-135514 umfasst.
    2. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Spacer eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Identitätssequenz mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 umfasst.
    3. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 271029-406542, oder einen Verlängerungsarm mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 271029-406542 aufweist.
    4. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm (i) eine Primerbindungsstelle, (ii) eine Editiermatrize und (iii) einen Homologiearm umfasst.
    5. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Primerbindungsstelle mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 406543-542056, oder eine Primerbindungsstelle mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 406543-542056 ist.
    6. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Editiermatrize umfasst, die eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 542057-677570, oder eine Editiermatrize mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 90 % mit einer der SEQ ID NOs: 542057-677570 sequenzidentisch ist.
    7. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm einen Homologiearm mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 677571-813084, oder einen Homologiearm mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 90 % mit einer der SEQ ID NOs: 677571-813084 identisch ist.
    8. Leit-RNA, Folgendes umfassend: (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und (ii) einen Verlängerungsarm, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 271029-406542, oder einen Verlängerungsarm mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NOs: 271029-406542.
    9. Leit-RNA, Folgendes umfassend: (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und (ii) eine Primerbindungsstelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 406543-542056, oder eine Primerbindungsstelle mit einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 406543-542056 ist.
    10. Leit-RNA, Folgendes umfassend: (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und (ii) eine Editiermatrize mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 542057-677570, oder eine Editiermatrize mit einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 542057-677570 ist.
    11. Leit-RNA, Folgendes umfassend: (i) einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 135515-271028, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 135515-271028 und (ii) einen Homologiearm mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 677571-813084, oder einen Spacer mit einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90 % identisch mit einer der SEQ ID NOs: 677571-813084 ist.
    12. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend ein Terminationssignal aus SEQ ID NO: 813086 oder ein Terminationssignal mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813086.
    13. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend eine 5'-Ende-Modifikatorregion, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    14. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend eine 3'-Ende-Modifikatorregion, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    15. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend einen gRNA-Kern, der SEQ ID NO: 813085 umfasst, oder einen gRNA-Kern, der mindestens 90% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813085 aufweist.
    16. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Leit-RNA in der Lage ist, an ein napDNAbp zu binden, das zum Prime Editing geeignet ist, und das napDNAbp zu einer Ziel-DNA-Sequenz zu lenken.
    17. Leit-RNA nach Anspruch 16, wobei die Zielnukleinsäuresequenz einen Zielstrang (oder PAM-Strang) und einen komplementären Nicht-Zielstrang (oder Nicht-PAM-Strang) umfasst, wobei der Spacer der Leit-RNA mit dem komplementären Nicht-Zielstrang (Nicht-PAM-Strang) hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
    18. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Primerbindungsstelle zwischen etwa 8 und etwa 20 Nukleotide lang ist.
    19. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Primerbindungsstelle 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Nukleotide lang ist.
    20. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Primerbindungsstelle mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide oder mindestens 20 Nukleotide lang ist.
    21. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Homologiearm zu einem Strang der Ziel-DNA komplementär ist.
    22. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Verlängerungsarm zwischen etwa 7 und etwa 500 Nukleotide lang ist.
    23. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Verlängerungsarm mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    24. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Editiermatrize mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    25. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Homologiearm mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide oder mindestens 30 Nukleotide lang ist.
    26. Leit-RNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Editiermatrize und der Homologiearm durch eine reverse Transkriptase als Matrizensequenz für die Synthese eines entsprechenden Einzelstrang-DNA-Flaps mit einem 3'-Ende verwendet werden können, wobei der DNA-Flap komplementär zu einem Strang der endogenen Ziel-DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist und wobei der Einzelstrang-DNA-Flap eine Nukleotidänderung umfasst, die durch die Editiermatrize codiert wird.
    27. Leit-RNA nach Anspruch 26, wobei der Einzelstrang-DNA-Flap eine endogene Einzelstrang-DNA mit einem 5'-Ende in der Ziel-DNA-Sequenz, die genickt wurde, verdrängt.
    28. Leit-RNA nach Anspruch 27, wobei die endogene Einzelstrang-DNA mit dem freien 5'-Ende durch die Zelle ausgeschnitten wird.
    29. Leit-RNA nach Anspruch 27, wobei die zelluläre Reparatur des Einzelstrang-DNA-Flaps zum Einbau der Nukleotidänderung führt, wodurch ein gewünschtes Produkt gebildet wird.
    30. Leit-RNA nach Anspruch 29, wobei die gewünschte Nukleotidänderung eine Insertion ist.
    31. Leit-RNA nach Anspruch 30, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    32. Leit-RNA nach Anspruch 30, wobei die Insertion eine Sequenz ist, die für ein Polypeptid codiert.
    33. Prime-Editing-Komplex, umfassend ein napDNAbp, eine reverse Transkriptase und eine beliebige der Leit-RNAs nach den Ansprüchen 1-32.
    34. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 33, wobei das napDNAbp und die reverse Transkriptase als ein Fusionsprotein gebildet sind.
    35. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 33, wobei das napDNAbp ein Cas9 ist.
    36. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 35, wobei das Cas9 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cas9-Nickasen oder Varianten davon.
    37. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 35, wobei das Cas9 eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 1-135514.
    38. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 34, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514.
    39. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 34, wobei das Fusionsprotein einen Linker umfasst, der das napDNAbp und die reverse Transkriptase verbindet.
    40. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 39, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-135514.
    41. Ein oder mehrere Polynukleotide, die für den Prime-Editing-Komplex nach einem der Ansprüche 33-40 codieren.
    42. Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 41 und einen oder mehrere Promotoren, welche die Expression der Leit-RNA und des Fusionsproteins des Prime-Editing-Komplexes antreiben.
    43. Zelle, die den Vektor nach Anspruch 42 umfasst.
    44. Zelle, die einen Prime-Editing-Komplex nach einem der Ansprüche 33-40 umfasst.
    45. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (i) eine Leit-RNA nach einem der Ansprüche 1-32, einen Prime-Editing-Komplex nach den Ansprüchen 33-40, ein Polynukleotid nach Anspruch 41 oder einen Vektor nach Anspruch 42; und (ii) einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff.
    46. Verfahren zum Einbauen einer Nukleotidänderung in eine Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Nukleinsäuresequenz mit einem Komplex, umfassend ein Fusionsprotein und eine Leit-RNA nach einem der Ansprüche 1-32 oder einem der Ansprüche 56-81, wobei das Fusionsprotein ein napDNAbp und eine Polymerase umfasst und wobei die Leit-RNA einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, der eine Editiermatrize umfasst, die eine Nukleotidänderung codiert; dadurch (i) Nicken der doppelsträngigen DNA-Sequenz auf dem Zielstrang (oder dem PAM-Strang) und Erzeugen einer freien einzelsträngigen DNA mit einem 3'-Ende; (ii) Hybridisieren des 3'-Endes der freien Einzelstrang-DNA mit der Leit-RNA an der Primerbindungsstelle, wodurch die Polymerase geprimt wird; (iii) Polymerisieren eines DNA-Strangs vom 3'-Ende aus, wodurch ein Einzelstrang-DNA-Flap erzeugt wird, der die Nukleotidänderung umfasst; und (iv) Ersetzen des endogenen DNA-Strangs unmittelbar stromabwärts der Schnittstelle auf dem Zielstrang (oder PAM-Strang) durch den Einzelstrang-DNA-Flap, wodurch die gewünschte Nukleotidänderung in die doppelsträngige DNA-Sequenz eingebaut wird.
    47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Nukleotidänderung eine Substitution, eine Deletion, eine Insertion eines einzelnen Nukleotids oder eine Kombination davon ist.
    48. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Substitution eines einzelnen Nukleotids eine Transition oder eine Transversion ist.
    49. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Nukleotidänderung (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C-Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C-Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A-Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A-zu-C-Substitution ist.
    50. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Nukleotidänderung (1) ein G:C-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T:A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar umwandelt.
    51. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion oder Deletion von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden ist.
    52. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion einer Polypeptid-codierenden Sequenz ist.
    53. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen korrigiert.
    54. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer monogenetischen Störung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase(ADA)-Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie;Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirupkrankheit; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylketonurie; schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellenanämie; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; und Tay-Sachs-Krankheit.
    55. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Erkrankung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit; hoher Blutdruck; neurologische Krankheit; Autoimmunerkrankung, Arthritis; Diabetes; Krebs; und Fettleibigkeit.
    56. Leit-RNA zur Verwendung beim Prime Editing, um ein Krankheitsallel an einer Editierstelle in einer Ziel-DNA-Sequenz zu korrigieren, um ein gesundes Allel zu bilden, wobei der Leiter einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, wobei der Spacer in der Lage ist, an eine Region mit etwa 20 Nukleotiden innerhalb der SEQ ID NOs: 1217353-1289387 oder dem Komplementstrang davon zu binden.
    57. Leit-RNA, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle umfasst, die wirksam ist, um ein Prime Editing durchzuführen.
    58. Leit-RNA nach Anspruch 56, wobei die Editierstelle in einer der Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 1217353-1289387 an Position 201 in der 5'-nach-3'-Richtung beginnt.
    59. Leit-RNA zum Prime Editing, umfassend einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm, wobei der Verlängerungsarm eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrize umfasst.
    60. Leit-RNA nach Anspruch 59, wobei die Primerbindungsstelle eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 406543-542056 (Primerbindungsstelle) oder eine Nukleotidsequenz aufweist, die mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 406543-542056 aufweist.
    61. Leit-RNA nach Anspruch 59, wobei die DNA-Synthesematrize eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NOs: 542057-677570 (Editiermatrize) oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 542057-677570 aufweist.
    62. Leit-RNA nach Anspruch 59, wobei die DNA-Synthesematrize eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NOs: 677571-813084 (Homologiearm) oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 677571-813084 aufweist.
    63. Leit-RNA nach Anspruch 59, wobei die DNA-Synthesematrize eine Editiermatrize und einen Homologiearm umfasst, wobei die Editiermatrize eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NOs: 542057-677570 umfasst und der Homologiearm eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NOs: 677571-813084 umfasst.
    64. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-63, ferner umfassend ein Terminationssignal der SEQ ID NO: 813086 oder ein Terminationssignal mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813086.
    65. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-64, ferner umfassend eine 5'-Ende-Modifikatorregion, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    66. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-65, ferner umfassend eine 3'-Ende-Modifikatorregion, die eine Haarnadelsequenz, eine Stammschleifensequenz oder eine Toeloop-Sequenz umfasst.
    67. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-66, ferner umfassend einen gRNA-Kern, der die SEQ ID NO: 813085 umfasst, oder einen gRNA-Kern, der mindestens 90% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 813085 aufweist.
    68. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-67, wobei die Leit-RNA in der Lage ist, an ein napDNAbp zu binden, das zum Prime Editing geeignet ist, und das napDNAbp an eine Ziel-DNA-Sequenz zu lenken.
    69. Leit-RNA nach Anspruch 68, wobei die Zielnukleinsäuresequenz einen Zielstrang (oder PAM-Strang oder Editierstrang) und einen komplementären Nicht-Zielstrang (oder Nicht-PAM-Strang oder Nicht-Editierstrang) umfasst, wobei der Spacer der Leit-RNA mit dem komplementären Nicht-PAM hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
    70. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-69, wobei die Primerbindungsstelle zwischen etwa 8 und etwa 20 Nukleotide lang ist.
    71. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-70, wobei die Primerbindungsstelle 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Nukleotide lang ist.
    72. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-71, wobei der Verlängerungsarm mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    73. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-72, wobei die Primerbindungsstelle mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide oder mindestens 20 Nukleotide lang ist
    74. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-73, wobei die DNA-Synthesematrize mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    75. Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-74, wobei die DNA-Synthesematrize von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) als Matrize für die Synthese eines entsprechenden Einzelstrang-DNA-Flaps mit einem 3'-Ende verwendet werden kann, wobei der Einzelstrang-DNA-Flap komplementär zu einem Strang der endogenen Ziel-DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist und wobei der Einzelstrang-DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst, die durch die DNA-Synthesematrize codiert wird.
    76. Leit-RNA nach Anspruch 75, wobei der Einzelstrang-DNA-Flap eine endogene einzelsträngige DNA mit einem 5'-Ende in der Ziel-DNA-Sequenz, die genickt wurde, verdrängt.
    77. Leit-RNA nach Anspruch 76, wobei die endogene Einzelstrang-DNA mit dem freien 5'-Ende durch die Zelle ausgeschnitten wird.
    78. Leit-RNA nach Anspruch 77, wobei die zelluläre Reparatur des Einzelstrang-DNA-Flaps zum Einbau der Nukleotidänderung führt, wodurch ein editiertes DNA-Produkt gebildet wird.
    79. Leit-RNA nach Anspruch 78, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion ist.
    80. Leit-RNA nach Anspruch 79, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    81. Leit-RNA nach Anspruch 79, wobei die Insertion eine Sequenz ist, die für ein Polypeptid codiert.
    82. Prime-Editing-Komplex, umfassend ein napDNAbp, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und eine beliebige der Leit-RNA nach den Ansprüchen 56-81.
    83. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 82, wobei das napDNAbp und die RNA-abhängige DNA-Polymerase als ein Fusionsprotein gebildet werden.
    84. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 82, wobei das napDNAbp ein Cas9 ist.
    85. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 84, wobei das Cas9 eine Cas9-Nickase oder eine Variante davon ist.
    86. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 84, wobei das Cas9 eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 1-135514.
    87. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 83, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 1-135514.
    88. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 83, wobei das Fusionsprotein einen Linker umfasst, der das napDNAbp und die RNA-abhängige DNA-Polymerase verbindet.
    89. Prime-Editing-Komplex nach Anspruch 88, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 1-135514.
    90. Ein oder mehrere Polynukleotide, die für den Prime-Editing-Komplex nach einem der Ansprüche 82-89 codieren.
    91. Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 90 und einen oder mehrere Promotoren, welche die Expression der Leit-RNA und des Fusionsproteins des Prime-Editing-Komplexes antreiben.
    92. Zelle, die den Vektor nach Anspruch 91 umfasst.
    93. Zelle, die einen Prime-Editing-Komplex nach einem der Ansprüche 82-89 umfasst.
    94. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (i) eine Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-81, einen Prime-Editing-Komplex nach den Ansprüchen 82-89, ein Polynukleotid nach Anspruch 90 oder einen Vektor nach Anspruch 91; und (ii) einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff.
    95. Verfahren zum Einbauen einer Nukleotidänderung in eine Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Nukleinsäuresequenz mit einem Komplex, umfassend ein Fusionsprotein und eine Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-81, wobei das Fusionsprotein ein napDNAbp und eine RNA-abhängige DNA-Polymerase umfasst, wobei die Leit-RNA einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, der eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle umfasst, wobei die DNA-Synthesematrize eine Nukleotidänderung codiert und wobei der Spacer in der Lage ist, sich an den Nicht-PAM-Strang proximal zu einem verfügbaren PAM und Protospacer anzulagern; dadurch (i) Nicken der doppelsträngigen DNA-Sequenz auf dem PAM-Strang, dadurch Erzeugen einer freien einzelsträngigen DNA mit einem 3'-Ende; (ii) Hybridisieren des 3'-Endes der freien Einzelstrang-DNA mit der Leit-RNA an der Primerbindungsstelle, wodurch die RNA-abhängige DNA-Polymerase geprimt wird; (iii) Polymerisieren eines DNA-Strangs vom 3'-Ende der DNA aus, der von der DNA-Synthesematrize codiert wird, wodurch ein Einzelstrang-DNA-Flap erzeugt wird, der vom 3'-Ende der DNA verlängert wird, wobei der Flap die Nukleotidänderung umfasst; (iv) Ersetzen des endogenen DNA-Strangs unmittelbar stromabwärts der Schnittstelle auf dem PAM-Strang durch den Einzelstrang-DNA-Flap, wodurch die Nukleotidänderung in die doppelsträngige DNA-Sequenz eingebaut wird.
    96. Verfahren nach Anspruch 95, wobei, wenn Schritt (v) innerhalb einer Zelle abgeschlossen ist, die Zelle den nichteditierten Strang durch zelluläre DNA-Reparatur und/oder - Replikation repariert.
    97. Verfahren nach Anspruch 95, wobei die Nukleotidänderung eine Substitution, eine Deletion, eine Insertion eines einzelnen Nukleotids oder eine Kombination davon ist.
    98. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Substitution eines einzelnen Nukleotids eine Transition oder eine Transversion ist.
    99. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Substitution eines einzelnen Nukleotids (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C-Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C-Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A-Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A-zu-C-Substitution ist.
    100. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Substitution eines einzelnen Nukleotids (1) ein G:C-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T:A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar umwandelt.
    101. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion oder Deletion von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden ist.
    102. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion einer Polypeptid-codierenden Sequenz ist.
    103. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen korrigiert.
    104. Verfahren nach Anspruch 103, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer monogenetischen Störung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase(ADA)-Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie; Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirupkrankheit; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylketonurie; schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellenanämie; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; und Tay-Sachs-Krankheit.
    105. Verfahren nach Anspruch 103, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Erkrankung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit; hoher Blutdruck; Alzheimer-Krankheit; Arthritis; Diabetes; Krebs; und Fettleibigkeit.
    106. Leit-RNA zur Verwendung beim Prime Editing, um die Nukleotidsequenz eines Ziel-DNA-Moleküls mit einer Insertion, Deletion, Inversion, Substitution oder Kombination davon zu verändern, um ein entsprechendes editiertes DNA-Molekül herzustellen, wobei: (i) die Leit-RNA in der Lage ist, einen Komplex mit einem Fusionsprotein zu bilden, das ein napDNAbp und eine Domäne umfasst, die eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; (ii) die Leit-RNA (a) einen Spacer, der sich proximal zu dem verfügbaren PAM und Protospacer am PAM-Strang auf dem Ziel-DNA-Molekül an den Nicht-PAM-Strang anlagern kann, und (b) einen gRNA-Kern umfasst; (iii) die Leit-RNA ferner einen Verlängerungsarm am 5'- oder 3'-Ende der Leit-RNA umfasst; (iv) der Verlängerungsarm (a) eine Primerbindungsstelle und (b) eine DNA-Synthesematrize umfasst, wobei die DNA-Synthesematrize für einen Einzelstrang-DNA-Flap codiert, der eine Editierung enthält, die anstelle des endogenen Strangs unmittelbar stromabwärts der Schnittstelle am PAM-Strang zu integrieren ist; (v) das Ziel-DNA-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1217353-1289387; und (vi) das entsprechende editierte DNA-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1289388-1361420.
    107. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das Ziel-DNA-Molekül eine Clinvar-Variantensequenz ist.
    108. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das napDNAbp Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Casl3a, Casl2c oder Argonaute oder eine Variante von Cas9, Casl2e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c oder Argonaute ist.
    109. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die napDNAbp-Domäne Nickase-Aktivität umfasst.
    110. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das napDNAbp ein Cas9 oder eine Variante davon ist.
    111. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das napDNAbp ein Nuklease-aktives Cas9, ein Nuklease-inaktives Cas9 (dCas9) oder eine Cas9-Nickase (nCas9) ist.
    112. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das napDNAbp Cas9-Nickase (nCas9) ist.
    113. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das napDNAbp die Aminosäure umfasst.
    114. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das napDNAbp SpCas9-Wildtyp oder eine Variante davon mit einer der Aminosäuresequenzen 1361421-1361428 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361421-1361428 ist.
    115. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das napDNAbp ein SpCas9-Ortholog einer der Aminosäuresequenzen 1361429-1361442 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361429-1361442 ist.
    116. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die napDNAbp eine Variante davon mit einer der Aminosäuresequenzen 1361421-1361484 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361421-1361484 ist.
    117. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Domäne, die eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst, eine reverse Transkriptase ist.
    118. Leit-RNA nach Anspruch 117, wobei die reverse Transkriptase eine natürlich vorkommende reverse Transkriptase vom Wildtyp mit einer Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361485-1361496 oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361485-1361496 ist.
    119. Leit-RNA nach Anspruch 117, wobei die reverse Transkriptase eine variante reverse Transkriptase mit einer Aminosäuresequenz einer der SEQ IDNOs: 1361497-1361514 oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361497-1361514 ist.
    120. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 1361515-1361519 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361515-1361519 umfasst.
    121. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei das Fusionsprotein eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1361515 (PE1) oder 1361516 (PE2) oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 1361515 oder 1361516 umfasst.
    122. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die verfügbare PAM-Sequenz eine Funktion des in Schritt (i) verwendeten napDNAbp ist.
    123. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die verfügbare PAM-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) 5'-NGG-3' (die kanonische PAM-Sequenz), (b) 5'-NNG-3', (c) 5'-NNA-3', (d) 5'-NNC-3', (e) 5'-NNT-3', (f) 5'-NGT-3', (g) 5'-NGA-3', (h) 5'-NGC-3', (i) 5'-NAA-3', (j) 5'-NAC-3', (k) 5'-NAG-3' und (1) 5'-NAT-3', deren Auswahl abhängig von der Wahl des napDNAbp ist.
    124. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Editierstelle in einer der Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 1217353-1289387 von Schritt (v) an Position 201 in der 5'-nach-3'-Richtung beginnt.
    125. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Nukleotidänderung eine Substitution, eine Deletion, eine Insertion eines Nukleotids oder eine Kombination davon ist.
    126. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Nukleotidsubstitution eine Transition oder eine Transversion ist.
    127. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Substitution eines einzelnen Nukleotids (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C-Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C-Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A-Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A-zu-C-Substitution ist.
    128. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Substitution eines einzelnen Nukleotids (1) ein G:C-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T:A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar umwandelt.
    129. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die gewünschte Nukleotidänderung eine Insertion oder Deletion von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotiden ist.
    130. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion einer Polypeptid-codierenden Sequenz ist.
    131. Leit-RNA nach Anspruch 106, wobei die Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen korrigiert.
    132. Leit-RNA nach Anspruch 131, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer monogenetischen Störung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase(ADA)-Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie; Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirupkrankheit; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylketonurie; schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellenanämie; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; und Tay-Sachs-Krankheit.
    133. Leit-RNA nach Anspruch 131, wobei das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Erkrankung assoziiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit; hoher Blutdruck; Alzheimer-Krankheit; Arthritis; Diabetes; Krebs; und Fettleibigkeit.
    134. Verfahren zum Einbauen einer Nukleotidänderung in eine Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Nukleinsäuresequenz mit einem Komplex, der ein Fusionsprotein und eine Leit-RNA nach einem der Ansprüche 56-81 umfasst.
    135. Verfahren nach Anspruch 134, wobei das Fusionsprotein ein napDNAbp und eine RNA-abhängige DNA-Polymerase umfasst.
    136. Verfahren nach Anspruch 134, wobei die Leit-RNA einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm umfasst, der eine DNA-Synthesematrize und eine Primerbindungsstelle umfasst.
    137. Verfahren nach Anspruch 136, wobei die DNA-Synthesematrize für eine Nukleotidänderung codiert.
    138. Verfahren nach einem der Ansprüche 134-137, wobei die Leit-RNA in der Lage ist, an ein napDNAbp zu binden, das zum Prime Editing geeignet ist, und das napDNAbp an eine Ziel-DNA-Sequenz zu lenken.
    139. Verfahren nach Anspruch 138, wobei die Zielnukleinsäuresequenz einen Zielstrang (oder PAM-Strang oder Editierstrang) und einen komplementären Nicht-Zielstrang (oder Nicht-PAM-Strang oder Nicht-Editierstrang) umfasst, wobei der Spacer der Leit-RNA mit dem komplementären Nicht-PAM hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
    140. Verfahren nach Anspruch 136, wobei die Primerbindungsstelle zwischen etwa 8 und etwa 20 Nukleotiden lang ist.
    141. Verfahren nach Ausführungsform 136, wobei die Primerbindungsstelle 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Nukleotide lang ist.
    142. Verfahren nach Anspruch 136, wobei der Verlängerungsarm mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    143. Verfahren nach Anspruch 136, wobei die Primerbindungsstelle mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide oder mindestens 20 Nukleotide lang ist.
    144. Verfahren nach Anspruch 136, wobei die DNA-Synthesematrize mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    145. Verfahren nach Anspruch 136, wobei die DNA-Synthesematrize von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. reversen Transkriptase) als Matrize für die Synthese eines entsprechenden Einzelstrang-DNA-Flaps mit einem 3'-Ende verwendet werden kann, wobei der DNA-Flap komplementär zu einem Strang der endogenen Ziel-DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist und wobei der Einzelstrang-DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst, die durch die DNA-Synthesematrize codiert wird.
    146. Verfahren nach Anspruch 145, wobei der Einzelstrang-DNA-Flap eine endogene einzelsträngige DNA mit einem 5'-Ende in der Ziel-DNA-Sequenz, die genickt wurde, verdrängt.
    147. Verfahren nach Anspruch 146, wobei die endogene Einzelstrang-DNA mit dem freien 5'-Ende durch die Zelle ausgeschnitten wird.
    148. Verfahren nach Anspruch 145, wobei die zelluläre Reparatur des Einzelstrang-DNA-Flaps zum Einbau der Nukleotidänderung führt, wodurch ein editiertes DNA-Produkt gebildet wird.
    149. Verfahren nach Anspruch 148, wobei die Nukleotidänderung eine Insertion ist.
    150. Verfahren nach Anspruch 149, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide lang ist.
    151. Verfahren nach Anspruch 149, wobei die Insertion eine Sequenz ist, die für ein Polypeptid codiert.
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