KR20230075420A - Hiv 역전사효소 및 cas9 또는 이의 변이체를 이용한 프라임 에디팅 - Google Patents

Hiv 역전사효소 및 cas9 또는 이의 변이체를 이용한 프라임 에디팅 Download PDF

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KR20230075420A
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박철용
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기초과학연구원
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Abstract

본 발명은 프라임 에디터 (prime editor) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA, prime editing guide RNA)를 포함하는 프라임 에디팅을 위한 조성물 및 프라임 에디팅 방법에 관한 것이다.

Description

HIV 역전사효소 및 CAS9 또는 이의 변이체를 이용한 프라임 에디팅
본 발명은 프라임 에디터 (prime editor) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA, prime editing guide RNA)를 포함하는 프라임 에디팅을 위한 조성물 및 프라임 에디팅 방법에 관한 것이다.
유전체의 특정위치를 인지하는 가이드 DNA와 DNA의 이중나선을 자르는 Cas9 효소로 결합된 분자 복합체를 포함하는 CRISPR에 의한 유전자 에디팅 (editing)에서 보여지는 유연성과 정밀성의 한계를 극복하기 위해, 개선된 유전체 교정방법이 보고된 바 있다.
구체적으로, 니케이즈 Cas9 (H840A) 및 M-MLV 역전사 효소로 구성된 프라임 에디터 단백질 복합체를 통해 니케이즈 Cas9은 한 가닥의 DNA만 절단하도록 변형을 유도하고, 역전사효소는 하나의 RNA 주형을 복사함으로써 새로운 DNA를 생성하며, 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA)가 프라임 에디터 단백질 복합체를 표적부위로 보내어, 유전체를 교정하는 프라임 에디팅 방법이 보고된 바 있다 (Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR et al., “Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA,” Nature. 2019 Oct 21).
종래의 프라임 에디터는 니케이즈 Cas9 (H840A)에 M-MLV (Moloney murine leukaemia virus) 역전사 효소가 연결된 형태로, MMLV 기반의 역전사 효소는 긴 길이의 유전정보를 삽입하기 힘든 단점이 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 MMLV 대신 HIV RT를 사용하여 효율적인 프라임 에디팅이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 프라임 에디터 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA)를 포함하는 프라임 에디팅을 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 프라임 에디터 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA)를 이용한 프라임 에디팅 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프라임 에디터 (prime editor) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA, prime editing guide RNA)를 포함하는 프라임 에디팅을 위한 조성물로, 상기 프라임 에디터 단백질은 (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체, 및 (ii) HIV (Human Immunodeficiency Virus) 역전사 효소(reverse transcriptase: RT) 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 프라임 에디팅 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 인간세포주 (human cell line : HEK-293 GFP stable cell)에서 HIV 역전사 효소 기반 프라임 에디터 (prime editor : PE)의 교정 (editing) 효율을 표현형 (phenotype)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 인간세포주 (human cell line HEK-293 GFP stable cell)에서 HIV 역전사 효소 기반 프라임 에디터에 의해 유도된 CTT to GCC 교정 효율을 게놈 (genome) 수준에서 NGS (Next generation sequencing) 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 출원의 발명자들은 SpCas9 니케이즈 (nicakse: H840A)에 M-MLV (Moloney murine leukaemia virus) 역전사 효소가 연결된 종래의 프라임 에디터에서 MMLV 역전사 효소는 모노머 (monomer)로 작동하지만 긴 길이의 유전정보를 삽입하기 힘든 단점이 있음을 확인하였다.
이를 바탕으로 M-MLV 역전사 효소 또는 이의 변이체를 포함하여 제작된 프라임 에디터 단백질을 통해 인간세포주 (human cell line)에서 효율적인 프라임 에디팅 효과가 있음을 확인하였다 (도 1 및 도 2).
이를 바탕으로, 본 발명은 일 관점에서 프라임 에디터 (prime editor) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA, prime editing guide RNA)를 포함하는 프라임 에디팅을 위한 조성물로, 상기 프라임 에디터 단백질은 (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체, 및 (ii) HIV (Human Immunodeficiency Virus) 역전사 효소(reverse transcriptase: RT) 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 프라임 에디팅 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 “교정”은 “편집”과 상호 호환적으로 사용 가능하고, 특이적 게놈 표적의 선택적 결실에 의해서 핵산 서열을 변경시키는 방법을 의미한다. 이러한 특이적 게놈 표적은 염색체 영역, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "표적" 또는 "표적 부위"는 임의 조성 및/또는 길이의 사전에 확인된 핵선 서열을 의미한다. 이러한 표적 부위는 염색체 영역, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "온-타겟”은 프로그램 가능한 DNA 결합 영역 및/또는 단일 가이드 RNA 서열과 완전하게 상보성일 수 있는 특이적 게놈 표적의 하위 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 “오프-타겟”은 프로그램 가능한 DNA 결합 영역 및/또는 단일 가이드 RNA 서열과 부분적으로 상보성일 수 있는 특이적 게놈 표적의 하위 서열을 의미한다.
상기 뉴클레아제는 표적 특이적으로, 예를 들어, ZNFN (zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease) 또는 Cas 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체는 Cas 단백질 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레아제 변이체는 뉴클레아제에서 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이될 수 있다. 상기 뉴클레아제 변이체는 예를 들어 Cas9의 변이체일 수 있다.
상기 Cas 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, CsMT2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 또는 Csf4의 엔도뉴클레아제, 특히 Cas9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 Cas 단백질은 Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 니케이즈를 형성할 수 있는 단백질이다. 상기 Cas 단백질은 예를 들어, 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus: Streptococcus pyogenes), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus: Staphylococcus aureus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 단순 분리된 것 또는 재조합된 것일 수 있다.
상기 표적 특이적 뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제 (예컨대, Cas9, Cpf1, 등)은 재조합 DNA에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN(Recombinant DNA; rDNA)는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대, 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 표적 특이적 뉴클레아제를 생산 (in vivo 또는 in vitro)하는 경우, 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 암호화 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
변이된 형태의 Cas 단백질을 포함할 수 있다. DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 변이 표적 특이적 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 형태 중 1종 이상일 수 있다.
니카아제 활성을 갖는 것인 경우, 염기 변환이 일어난 가닥 또는 그 반대 가닥 (예컨대, 염기 변환이 일어난 가닥의 반대 가닥)에서 nick이 도입될 수 있다 (예컨대, PAM이 위치하는 가닥의 반대가닥에서, PAM 서열의 5' 말단 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이에 해당하는 위치에 nick이 도입됨). 이와 같은 변이 (예컨대, 아미노산 치환 등)는 촉매 활성 도메인 (예컨대, Cas9의 경우 RuvC 촉매 도메인)에서 일어나는 것일 수 있다. 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9의 경우 변이는 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalytic aspartate residue; 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 등), 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863), 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 때, 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
경우에 따라서, 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 1135번째 위치의 아스파르트산 (D1135), 1335번째 위치의 아르기닌 (R1335), 및 1337번째 위치의 트레오닌 (T1337) 중 하나 이상, 예컨대 3개 모두가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 Cas9의 PAM 서열 (NGG)와 상이한 NGA (N은 A, T, G, 및 C 중에서 선택된 임의의 염기임)을 인식하도록 변이된 것일 수 있다.
예를 들어, 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열 중,
(1) D10, H840, 또는 D10 + H840;
(2) D1135, R1335, T1337, 또는 D1135 + R1335 + T1337; 또는
(3) (1)과 (2) 잔기 모두에서 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다.
상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌, 발린, 글루타민, 또는 아르기닌일 수 있다. 상기 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시예에서, 상기 프라임 에디터 단백질은 (1) (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체, 및 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체의 혼합물; 또는 (2) (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체의 말단에 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체가 결합된 융합단백질일 수 있다. 상기 뉴클레아제 또는 이의 변이체와 역전사 효소는 개별적으로 각각의 뉴클레아제 또는 이의 변이체와 역전사 효소를 포함할 수 있고, 뉴클레아제 또는 이의 변이체와 역전사 효소의 융합단백질 형태로 포함될 수 있다.
상기 융합단백질은 프라임 에디터 단백질 중 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체가 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 상기 HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체는 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체의 C-말단에 결합한다.
경우에 따라서, HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체를 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체에 연결시, 링커를 통해 연결할 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커는 약 2-25aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 알라닌, 글리신 및/또는 세린과 같은 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 링커는 예를 들어, (AnS)m (n, m은 각각 1 내지 10), (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (AnS)m 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 (AnS)m에서 n=1, m=1, 또는 (GnS)m에서 n=4이고, m은 1 또는 2인 G4S 또는 (G4S)2일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다:
서열번호 1의 HIV RT p51;
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKQKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQCSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYAGIKVRQLCKLLRGTKALTEVVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMKGAHTNDVKQLTEAVQKIATESIVIWGKTPKFKLPIQKETWEAWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIIGAETF
서열번호 2의 HIV RT p66;
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKQKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQCSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYAGIKVRQLCKLLRGTKALTEVVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMKGAHTNDVKQLTEAVQKIATESIVIWGKTPKFKLPIQKETWEAWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIIGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTDRGRQKVVPLTDTTNQKTELQAIHLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVSQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDGLVSAGIRKVL
서열번호 3의 HIV RT p51 변이체 (p51(2)); 및
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서열번호 4의 HIV RT p66 변이체 (p66(2)).
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경우에 따라서, 상기 HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체로 위 중 어느 하나가 선택된 경우, 선택된 ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체와 상이한 HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체는 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체와 융합단백질 형태로 연결되거나, 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체와 연결되지 않고 별도로 포함될 수 있다.
구체적으로, 서열번호 1의 HIV RT p51가 선택된 경우, 서열번호 2의 HIV RT p66; 서열번호 3의 HIV RT p51 변이체; 및 서열번호 4의 HIV RT p66 변이체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
서열번호 2의 HIV RT p66가 선택된 경우, 서열번호 1의 HIV RT p51; 서열번호 3의 HIV RT p51 변이체; 및 서열번호 4의 HIV RT p66 변이체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
서열번호 3의 HIV RT p51 변이체가 선택된 경우, 서열번호 1의 HIV RT p51; 서열번호 2의 HIV RT p66; 및 서열번호 4의 HIV RT p66 변이체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
서열번호 4의 HIV RT p66 변이체가 선택된 경우, 서열번호 1의 HIV RT p51; 서열번호 2의 HIV RT p66; 및 서열번호 3의 HIV RT p51 변이체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, HIV RT p51 혹은 p66 subunit이 Cas9 H840A nickage C-term에 연결된 융합 단백질에 의해 human cell line genome 상에서 유전체 교정됨을 확인하였다.
H840A-HIV p51 융합 단백질 이외에 HIV p66을 추가로 발현될 경우 혹은 H840A-HIV p66 융합 단백질 이외에 HIV p51을 추가로 발현될 경우 유전체 교정 효율이 H840A에 연결된 두 HIV subunit 중 어느 하나만 단독으로 발현시킨 경우에 비해 크게 향상됨을 확인하였다.
또한, HIV RT p66(2)이 HIV RT p66 보다 유전체 교정 효율이 높음을 확인하였다.
상기 프라임 에디터 단백질을 코딩하는 핵산은 (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산 및 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
상기 프라임 에디팅 가이드 RNA는 교정 서열을 포함하고, 역전사 효소 주형 (template)으로 기능한다. 상기 역전사 효소(RT)는 역전사 효소 주형을 이용하여 DNA 가닥(즉, 상보적 DNA, cDNA)을 합성할 수 있는 RNA-의존적 DNA 폴리머라아제이다.
상기 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA, prime editing guide RNA) 또는 이를 코딩하는 DNA는 교정 대상 유전체에 결합하는 결합 영역 (binding site) 및 교정 서열을 포함한다.
상기 교정 서열을 포함하는 서열은 역전사 효소 주형 (template)으로 작용한다. 상기 역전사 효소 주형은 목적하는 교정 서열을 포함하고, 게놈 DNA 로커스에 상동성을 가진다. 상기 교정 서열은 이종성 (heterologous) 서열로, 게놈에서 교정하고자 하는 대상 서열을 포함한다.
상기 결합 영역은 역전사 효소 주형의 5’ 방향 또는 3’ 방향에 임의로 위치할 수 있고, 구체적으로 결합 영역은 역전사 효소 주형의 3’ 방향에 위치할 수 있다.
상기 결합 영역은 프라임 에디터 단백질에 포함된 뉴클레아제 또는 이의 변이체 예를 들어 니케이즈에 의해 닉이 생긴 게놈 DNA 가닥에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 상기 결합 영역이 타겟 사이트 (target site)에 혼성화하여, 역전사 효소의 활성 개시점으로 작용할 타겟 사이트 수 있다.
상기 결합 영역은 타겟 사이트의 서열과 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 100%의 상동성을 가지는 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 (1) (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체, 및 (ii) HIV (Human Immunodeficiency Virus) 역전사 효소(reverse transcriptase: RT) 또는 이의 변이체를 포함하는 프라임 에디터 (prime editor) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 (2) 교정 대상 유전체에 결합하는 결합 영역 (binding site) 및 교정 서열을 포함하는 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA, prime editing guide RNA)를 포함하며, (1) 및 (2)를 전달하기 위해 단일 또는 복수의 전달 수단을 동일 또는 상이한 구성으로 조합하여 사용할 수 있다.
상기 (1)은 제1전달 수단에 포함되고, (2)는 제2전달 수단에 포함될 수 있고, 각각의 전달 시스템은 동시에 바이러스 전달수단이거나, 하나는 바이러스 전달수단이고 다른 하나는 비-바이러스 전달수단이거나, 동시에 비-바이러스 전달수단일 수 있다.
상기 핵산은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다. 상기 프라임 에디팅 가이드 RNA는 가이드 RNA의 RNA 서열 또는 이를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
상기 (1)의 프라임 에디터 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 (2)의 프라임 에디팅 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 벡터와 같은 전달 수단을 통해 제공될 수 있다. 상기 (1)을 코딩하는 DNA 서열 및 (2)를 코딩하는 DNA 서열을 동일한 벡터 상에 위치하도록 하여 하나의 벡터를 통해 동시에 전달할 수 있다. 상기 (1)의 프라임 에디터 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 (2)의 프라임 에디팅 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열을 별개의 다른 벡터상에 위치하도록 하여 전달할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 바이러스 벡터 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) 또는 Retroviral Vector (RV), 이외 기타 바이러스 벡터, 예를 들어, Simian virus 40 (SV40) ori, bovine papilloma virus (BPV) ori 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV) ori를 포함하는 에피좀 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
상기 벡터는 각각 국소주입법 (예컨대， 병변 또는 표적 부위 직접 주입), 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
경우에 따라서, (2)의 프라임 에디팅 가이드를 코딩하는 DNA 서열은 벡터를 통해 전달될 수 있다. 상기 (1)의 프라임 에디터 단백질 또는 이를 코딩하는 RNA 서열을 mRNA 형태로 전달할 수 있다. 상기 프라임 에디터 단백질 또는 mRNA는 직접 전달되거나, 캐리어를 통해 전달될 수 있다.
또한, 상기 (1)의 프라임 에디터 단백질을 코딩하는 RNA 서열 및 (2)의 프라임 에디팅 가이드 RNA 서열을 포함할 수 있다. 상기 (1)을 코딩하는 mRNA 및 (2)의 mRNA 형태로 전달할 수 있다. 상기 mRNA는 직접 전달되거나, 캐리어를 통해 전달될 수 있다.
더욱이, 상기 (1)의 프라임 에디터 단백질 및 (2) 프라임 에디팅 가이드 RNA의 mRNA가 조립된 RNP (ribonucleoprotein) 복합체를 형성하도록 하여 전달할 수 있다. 상기 RNP는 직접 전달되거나, 캐리어를 통해 전달될 수 있다.
RNP는 생체 내에서 통상적으로 72시간 내에 분해 되므로 계속적으로 남아 독성 및 비표적 교정을 일으킬 가능성이 낮으므로 유전자치료에 사용할 때 이점이 있다. PE를 RNP가 아닌 플라즈미드 DNA 형태로 진핵세포에 도입할 수도 있으나, 이 경우 플라즈미드 조각이 유전체에 삽입될 수 있다. 특히 식물세포 유전자 교정의 경우 RNP 방식은 DNA 방식과는 달리 GMO 규제를 받지 않을 가능성이 있다.
상기 RNP 복합체는 미세주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션 (lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 및 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 캐리어는 예를 들어, 세포 투과성 펩타이드(CPP), 나노입자, 또는 중합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. CPP는 다양한 분자 카고(나노크기 입자로부터 작은 화학 분자 및 DNA의 큰 단편까지)의 세포 흡수를 용이하게 하는 짧은 펩타이드이다. 카고는 (1) 프라임 에디터 단백질 (prime editor protein) 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 (2) 프라임 에디팅 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 상기 (1)의 프라임 에디터 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 공유 결합을 통한 화학적 결합 또는 비-공유 상호작용을 통해 조립될 수 있다. 상기 (2) 프라임 에디팅 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CPP와 복합체화되어, 축합된 양으로 하전된 입자를 형성한다.
상기 나노입자와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물은 고분자 나노입자, 금속 나노입자, 금속/무기 나노입자 또는 지질 나노입자를 통해 전달될 수 있다. 상기 고분자 나노입자는 예를 들어, 롤링 써클 증폭에 의해 합성된 DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자일 수 있다. DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자에 (1) 프라임 에디터 단백질 (prime editor protein) 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 (2) 프라임 에디팅 가이드 RNA를 로딩하고, 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위해 PEI를 코팅하였다. 이러한 복합체가 세포막에 결합하여, 내재화된 다음 엔도좀 탈출을 통해 핵으로 이동하여, (1) 및 (2)가 동시에 전달되도록 할 수 있다.
상기 금속 나노입자와 관련하여, (1) 프라임 에디터 단백질 (prime editor protein) 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 (2) 프라임 에디팅 가이드 RNA에 금입자를 연결시키고 양이온성 엔도좀 탈출 폴리머 (endosomal disruptive polymer)와 복합체를 형성하여 세포에 전달할 수 있다. 상기 양이온성 엔도좀 탈출 폴리머 (endosomal disruptive polymer)는 예를 들어, polyethylene imine, poly(arginine), poly(lysine), poly(histidine), poly-[2-{(2-aminoethyl)amino}-ethyl-aspartamide] (pAsp(DET)), poly(ethylene glycol) (PEG)와 poly(arginine)의 block co-polymer, PEG와 poly(lysine)의 block co-polymer, 또는 PEG와 poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PEG-pAsp(DET))의 block co-polymer일 수 있다.
상기 금속/무기 나노입자와 관련하여, 예를 들어 ZIF-8 (zeolitic imidazolate framework-8)를 통해 (1) 프라임 에디터 단백질 (prime editor protein) 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 (2) 프라임 에디팅 가이드 RNA를 캡슐화할 수 있으며, 음으로 하전된 RNP를 양으로 하전된 nanoscale ZIF로 캡슐화할 수 있다. 효율적 엔도좀 탈출을 통해 목적하는 타겟 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다.
음이온을 띠는(negatively charged) (1) 및 (2)를 코딩하는 DNA 또는 핵산은 양이온을 띠는(cationic) 물질들과 결합하여 나노입자 (nanoparticles)를 형성할 수 있고, 이는 세포로 수용체 매개 엔도사이토시스 (receptor-mediated endocytosis) 혹은 파고사이토시스 (phagocytosis) 등을 통해 침투할 수 있다. (1) 및 (2)의 RNP 복합체가 양이온성 중합체에 결합될 수 있다. 양이온성 중합체로 폴리알릴아민 (PAH); 폴리에틸렌이민 (PEI); 폴리(L-리신) (PLL); 폴리(L-아르기닌) (PLA); 폴리비닐아민 단일- 또는 공중합체; 폴리(비닐벤질-트리-C1-C4-알킬암모늄염); 지방족 또는 방향지방족 디할로겐화물 및 지방족 N,N,N',N'-테트라-C1-C4-알킬-알킬렌디아민의 중합체; 폴리(비닐피리딘) 또는 폴리(비닐피리디늄염); 폴리(N,N-디알릴-N,N-디-C1-C4-알킬-암모늄할로겐화물); 4차화된 디-C1-C4-알킬-아미노에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트의 단일- 또는 공중합체; 폴리쿠아드(POLYQUAD)™; 폴리아미노아미드 등이 포함될 수 있다.
양이온성 지질로 양이온성 리포솜 제제를 포함할 수 있다. 리포솜의 지질 이중층은 캡슐화된 핵산을 분해로부터 보호하며, 핵산에 결합할 수 있는 항체에 의한 특이적 중화를 방지할 수 있다. 엔도좀 성숙 동안 엔도좀 멤브레인과 리포좀이 융합되어, 양이온성 지질-핵산절단효소의 효율적인 엔도좀 탈출이 가능하다. 양이온성 지질로 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (PAMAM) 성화 수지상체, 리포펙틴 (DOTMA와 DOPE의 조합), 리포펙타제, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® (예컨대 리포펙타민® 2000, 리포펙타민® 3000, 리포펙타민® RNAiMAX, 리포펙타민® LTX), 세인트-레드(SAINT-RED) (시노볼룩스 세라퓨틱스(Synvolux Therapeutics)사, 네덜란드 그로닝겐 소재), DOPE, 시토펙틴 (길레드 사이언시즈(Gilead Sciences) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재), 및 유펙틴 (JBL사, 캘리포니아 산 루이스 오비스포 소재)가 포함될 수 있다. 대표적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드; 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)으로부터 제조될 수 있다.
지질 나노입자와 관련하여, 캐리어로 리포좀을 이용하여 전달할 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소낭 구조이다. 리포좀 제형은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린 또는 모노시알로강글리오사이드 등을 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 혈장 내 불안정성을 해소하기 위하여, 지질막에 콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 추가할 수 있다. 콜레스테롤의 첨가는 캡슐화된 생활성 화합물의 혈장 내로의 신속한 방출을 감소시키거나 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 프라임 에디팅 방법에 관한 것이다.
상기 세포는 진핵 세포 (예컨대, 효모 등의 균류， 진핵 동물 및 /또는 진핵 식물 유래 세포 (예컨대, 배아세포， 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등)， 진핵 동물 (예컨대， 인간, 원숭이 둥의 영장류 개， 돼지， 소， 양， 염소, 마우스，래트 등)， 또는 진핵 식물 (예컨대, 녹조류 등의 조류，옥수수, 콩，밀， 벼 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
GFP 유전자의 CTT (65, 66번째 아미노산 부위를 코딩하는 염기서열) 서열을 GCC로 교정 (editing)하여 GFP 표현형을 BFP 표현형으로 변환하기 위해 여러 가지 버전의 HIV 역전사 효소 기반 프라임 에디터 (prime editor)를 GFP 안정화 세포 (stable cell)에 발현시킨 후 해당 형광 시그널 (signal)을 FACS 장비로 분석하였다.
제작된 프라임 에디터는 다음과 같다:
* Mock: 유전자를 발현시키지 않은 original HEK293-gfp stable cell
* PE only: 기존의 H840A-MMLV RT 융합 단백질만 발현된 것 (pegRNA 없이)
* HIVPE-66 only: H840A-HIV RT p66 융합 단백질만 발현된 것 (pegRNA 없이)
* HIVPE-66(2) only: H840A-HIV RT p66(2) 융합 단백질만 발현된 것 (pegRNA 없이)
* PE+peg: 기존의 H840A-MMLV RT 융합 단백질과 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-51+peg: H840A-HIV RT p51 융합 단백질과 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-66+peg: H840A-HIV RT p66 융합 단백질과 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-51(2)+peg: H840A-HIV RT p51(2) 융합 단백질과 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-66(2)+peg: H840A-HIV RT p66(2) 융합 단백질과 pegRNA를 발현 시킨 것
* PE+Cont.Vec+peg: 기존의 H840A-MMLV RT 융합 단백질, Control Vector와 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-51+66+peg: H840A-HIV RT p51 융합 단백질, HIV p66(융합 단백질 아님)와 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-66+51+peg: H840A-HIV RT p66 융합 단백질, HIV p51(융합 단백질 아님)와 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-51(2)+66(2)+peg: H840A-HIV RT p51(2) 융합 단백질, HIV p66(2)(융합 단백질 아님)와 pegRNA를 발현 시킨 것
* HIVPE-66(2)+51(2)+peg: H840A-HIV RT p66(2) 융합 단백질, HIV p51(2)(융합 단백질 아님)와 pegRNA를 발현 시킨 것.
서열번호 1의 HIV RT p51;
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서열번호 2의 HIV RT p66;
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서열번호 3의 HIV RT p51 변이체 (p51(2)); 및
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서열번호 4의 HIV RT p66 변이체 (p66(2)).
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQKVVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSESELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKVL
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면, (a) pegRNA가 없는 음성대조군(negative control) 실험군에서는 BFP 양성 (positive) 세포가 0% (빨간색 부분)로 확인되었다. (b) pegRNA가 있는 상황에서 MMLV 기반 PE (PE+peg실험군)를 발현시켰을 때 39.9%의 BFP 양성 세포가 확인되었다. HIV RT p51 혹은 p66을 사용하는 PE를 pegRNA와 같이 발현시켰을 때는 3.2%-15.1%의 BFP 양성 세포가 확인되었고, p51 보다는 p66 서브유닛 (subunit)을 사용할 때 더 높은 BFP 양성 세포가 확인되었다. (c) p51과 p66을 동시에 발현시킨 경우에는 각각을 발현시킨 경우 (b번) 보다 더 높은 BFP 양성 세포가 (22.4-29.5%) 확인되었다.
인간세포주 (Human cell line : HEK-293 GFP stable cell)에서 HIV RT기반 PE에 의해 유도된 CTT to GCC editing 효율을 게놈 (genome) 수준에서 NGS (Next generation sequencing) 분석을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 따르면, HIV RT p51을 사용하는 PE를 pegRNA와 같이 발현시켰을 때는 3.96-9.92%의 GCC 교정 효율을 보였고, p66 서브유닛 (subunit)을 사용하는 PE를 pegRNA와 같이 발현시켰을 때는 16.68-21.30%의 GCC 교정 효율을 보였다. HIV 두 서브유닛 (subunit)이 같이 발현되는 경우, GCC 교정 효율은 29.49-34.01%로 확인되었다. 이러한 결과는 앞서 보여준 BFP 양성세포 (표현형 phenotype 결과) 수준과 매치 (match)되는 패턴을 보였다.
이상으로 본 발명의내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (12)

  1. 프라임 에디터 (prime editor) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 프라임 에디팅 가이드 RNA (pegRNA, prime editing guide RNA)를 포함하는 프라임 에디팅을 위한 조성물로,
    상기 프라임 에디터 단백질은 (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체, 및 (ii) HIV (Human Immunodeficiency Virus) 역전사 효소(reverse transcriptase: RT) 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라임 에디터 단백질 중 (1) (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체, 및 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체는 개별로 포함; 또는
    (2) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체의 말단에 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체가 결합된 융합단백질인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프라임 에디터 단백질을 코딩하는 핵산은 (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산 및 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, (i) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산 또는 (ii) HIV RT 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산은 프라임 에디팅 가이드 RNA와 동일 또는 상이한 벡터에 삽입된 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 프라임 에디터 단백질을 코딩하는 핵산 및 프라임 에디팅 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 모두 또는 별개로 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 프라임 에디터 단백질 및 프라임 에디팅 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 Cas9인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제 변이체는 Cas9의 D10, E762, H839, H840, N854, N863 및 D986로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 알라닌인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물:
    서열번호 1의 HIV RT p51;
    서열번호 2의 HIV RT p66;
    서열번호 3의 HIV RT p51 변이체; 및
    서열번호 4의 HIV RT p66 변이체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (ii) HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체와 상이한 HIV 역전사 효소 또는 이의 변이체를 추가로 포함하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 프라임 에디팅 방법.
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