KR20240041835A - 식물세포 소기관 dna의 염기 교정 - Google Patents
식물세포 소기관 dna의 염기 교정 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물세포 소기관 DNA의 염기 교정용 조성물, 특히 식물세포 소기관 DNA의 아데닌을 구아닌 및 시토신을 티민으로 교정하기 위한 조성물 및 교정방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 식물세포 소기관 DNA의 염기 교정용 조성물, 특히 식물세포 소기관 DNA의 아데닌을 구아닌 및 시토신을 티민으로 동시에 교정하기 위한 조성물 및 교정방법에 관한 것이다.
DNA 결합 단백질과 탈아미노효소가 연결된 융합단백질은 DNA 이중 가닥 절단 (DSBs)을 생성하지 않고 유전체에서 표적화된 뉴클레오타이드 치환 또는 염기 교정(base editing), 유전적 장애를 유발하는 점 돌연변이를 교정하거나 원핵세포, 인간 및 다른 진핵세포에 목적하는 단일 뉴클레오타이드 변이를 도입하도록 표적화된 방식(targeted manner)으로 단일 뉴클레오타이드 전환을 가능하게 한다.
ZFN (zinc-finger nuclease), TALEN (transcription activator-like effector nuclease), CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 시스템 및 핵산분해 효율이 없는 크리스퍼 연관 단백질 9 (Cas9) 변이체와 염기 탈아미노효소 단백질의 염기 교정 기술 등의 프로그램 (설정) 유전체 교정 도구들은 염기 서열의 변화를 통하여 식물의 유전적 연구와 작물 형질 개선에 발전되어 왔다. 그러나 이러한 도구들은 미토콘드리아와 엽록체를 포함한 식물 기관의 DNA 서열을 교정하기에는 적합하지 않은데, 그 주된 이유는 가이드 RNA를 소기관으로 전달하거나, 두 화합물을 소기관에서 동시에 발현하는 것이 어렵기 때문이다. 식물세포 소기관은 광합성 및 호흡에 필요한 여러 필수적인 유전자를 암호화하고 있다. 이러한 소기관의 유전자를 교정하는 방법이나 도구는 이러한 유전자의 기능 연구나 작물 생산성과 형질 개선에 매우 필요하다. 예를 들어, 미토콘드리아 atp6 유전자의 표적 돌연변이는 번식에 유용한 특성인 웅성불임을 유발할 수 있고, 엽록체 게놈의 16S rRNA 유전자의 특정 점 돌연변이는 항생제 내성을 유발할 수 있다.
박테리아 독소 DddAtox는 Burkholderia cenocepacia에서 유래된 박테리아 독소의 효소 기능을 맡는 부분으로, 이중 나선 DNA의 시토신을 탈아미노화 할 수 있다. 탈아미노효소의 예시로, DddAtox는 세포에 독성이 있기 때문에 숙주세포에서의 독성을 피하기 위해, DddAtox는 두 개의 비활성화된 분할체(split)로 나누어 사용하는데, 각각의 반체는 DNA에 결합할 수 있도록 고안된 DNA 결합 단백질에 연결하여 기능을 갖춘 DdCBE 쌍으로써 사용할 수 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 식물세포 소기관 DNA의 A to G 염기 교정과 C to T 염기 교정이 같이 일어날 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 DNA 결합 단백질, 시토신 탈아미노효소 또는 분리된 형태의 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 및 아데닌 탈아미노효소 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 소기관 DNA의 염기 교정용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 식물세포 소기관 DNA를 교정하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DNA 결합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 시토신 탈아미노효소 유래의 제1분할체 및 제2분할체 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 아데닌 탈아미노효소 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 식물세포 소기관 DNA의 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 소기관 DNA의 염기를 교정하는 방법을 제공한다.
식물세포 소기관 DNA의 염기 교정은 DddAtox를 이용한 시토신을 티민으로 디아미네이션 (deamination)하는 염기 교정만 존재하였다. 이번 발명으로 아데닌을 구아닌으로 염기 교정함으로 소 기관 DNA 염기 교정의 범위가 넓어졌다. A to G 염기 교정과 C to T 염기 교정이 같이 일어날 수 있다.
도 1은 Agrobacterium을 이용한 형질전환 식물 제작을 위한 DNA cloning 모식도이다.
도 2는 psaA 유전자를 타겟하는 형질전화체 식물. a, 각 식물체의 염기 교정 효율과 위치. b, 식물의 표현형. c, DNA염기교정으로 인한 아미노산 염기 서열의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 rbcL 유전자를 타겟하는 형질전화체 식물. a, 각 식물체의 염기 교정 효율과 위치. b, DNA염기교정으로 인한 아미노산 염기 서열의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 rrn16S 유전자를 타겟하는 형질전환 식물의 염기 교정 효율과 위치 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 애기 장대의 엽록체에 있는 psaA, rbcL과 rrn16S 유전자를 타겟 하는 1세대 형질전환체의 염기 교정 효율과 표현형. a, psaA #1, 2, 3의 염기 교정 효율과 위치. Adenine의 염기 교정뿐 아니라 Cytosine의 염기 교정이 동시에 일어남. b, psaA #3의 표현형으로 green, chimeric, pale green의 형질을 나타냄. c, rbcL #1, 2의 염기 교정 효율, 위치와 표현형. d, rrn16S 유전자를 타겟하는 1세대 형질전환체의 염기 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 형질전환 2세대 식물의 염기 교정 효율과 표현형. psaA #3의 형질전환 2세대의 표현형과 (a), 염기 교정 효율과 위치 (b). Spectinomycin에 저항성을 가지는 rrn16S 형질전환 2세대의 표현형 (c)과 염기 교정 효율과 위치 (d). e, 형질전환 식물에 도입된 외부 유전자의 유무를 PCR로 확인한 결과 rrn16S #9-1, 3은 외부 유전자가 없는 것을 확인하였다.
도 7은 rrn16S 형질전환 2세대 식물 중 Spectinomycin에 저항성과 민감성을 가지는 식물의 염기 교정 위치와 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 psaA #1 (a), psaA #3 chimeric (b), psaA #3 pale green (c), rrn16s #1 (d), 6 (e)과 야생형 Col-0 (f)의 엽록체 전장 유전체 분석을 통한 표적 외 염기 변이. 야생형과 비교했을 때 형질전환 식물에서 뚜렷한 표적 외 염기 변이가 관찰되지 않음.
도 9는 상추 미토콘드리아 유전자 atp6의 염기교정을 효율을 나타낸 것이다.
도 2는 psaA 유전자를 타겟하는 형질전화체 식물. a, 각 식물체의 염기 교정 효율과 위치. b, 식물의 표현형. c, DNA염기교정으로 인한 아미노산 염기 서열의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 rbcL 유전자를 타겟하는 형질전화체 식물. a, 각 식물체의 염기 교정 효율과 위치. b, DNA염기교정으로 인한 아미노산 염기 서열의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 rrn16S 유전자를 타겟하는 형질전환 식물의 염기 교정 효율과 위치 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 애기 장대의 엽록체에 있는 psaA, rbcL과 rrn16S 유전자를 타겟 하는 1세대 형질전환체의 염기 교정 효율과 표현형. a, psaA #1, 2, 3의 염기 교정 효율과 위치. Adenine의 염기 교정뿐 아니라 Cytosine의 염기 교정이 동시에 일어남. b, psaA #3의 표현형으로 green, chimeric, pale green의 형질을 나타냄. c, rbcL #1, 2의 염기 교정 효율, 위치와 표현형. d, rrn16S 유전자를 타겟하는 1세대 형질전환체의 염기 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 형질전환 2세대 식물의 염기 교정 효율과 표현형. psaA #3의 형질전환 2세대의 표현형과 (a), 염기 교정 효율과 위치 (b). Spectinomycin에 저항성을 가지는 rrn16S 형질전환 2세대의 표현형 (c)과 염기 교정 효율과 위치 (d). e, 형질전환 식물에 도입된 외부 유전자의 유무를 PCR로 확인한 결과 rrn16S #9-1, 3은 외부 유전자가 없는 것을 확인하였다.
도 7은 rrn16S 형질전환 2세대 식물 중 Spectinomycin에 저항성과 민감성을 가지는 식물의 염기 교정 위치와 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 psaA #1 (a), psaA #3 chimeric (b), psaA #3 pale green (c), rrn16s #1 (d), 6 (e)과 야생형 Col-0 (f)의 엽록체 전장 유전체 분석을 통한 표적 외 염기 변이. 야생형과 비교했을 때 형질전환 식물에서 뚜렷한 표적 외 염기 변이가 관찰되지 않음.
도 9는 상추 미토콘드리아 유전자 atp6의 염기교정을 효율을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
식물세포의 소기관 DNA의 염기 교정은 DddAtox를 TALE과 결합하여 시토신을 티민으로 교정하는 방법만 존재하였다. 본 발명에 따른 기술적 과제인 DddAtox와 Adenine deaminase를 TALE에 결합하여 세포 소 기관 DNA의 염기를 교정하려 한다. 기존에는 불가능하였던 세포 소기관 DNA의 염기 교정함으로써 제초제 저항성을 가지는 식물 등 기능성 식물을 개발할 수 있다.
본 출원의 발명자들은 DNA에 결합할 수 있는 TALE 또는 ZFP 단백질에 DddAtox 시토신 탈아미노효소와 아데닌 탈아미노효소를 연결하여 A to G 염기 교정과 C to T 염기 교정이 같이 일어나는 염기 교정기 (base editor)를 제작하였다.
이를 바탕으로 일 관점에서, 본 발명은 식물세포 소기관 DNA의 염기 교정용 조성물로, DNA 결합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 시토신 탈아미노효소 또는 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 아데닌 탈아미노효소 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 식물세포 소기관 DNA의 아데닌을 구아닌으로, 시토신을 티민으로 동시에 교정하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "교정"은 "편집"과 상호 호환적으로 사용 가능하고, 특이적 게놈 표적의 선택적 결실에 의해서 핵산 서열을 변경시키는 방법을 의미한다. 이러한 특이적 게놈 표적은 염색체 영역, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "단일 염기"는 핵산 서열 내 하나, 및 오직 하나의 뉴클레오티드를 의미한다. 단일 염기 교정의 맥락에서 사용될 때, 이것은 핵산 서열 내 특이적 위치의 염기가 상이한 염기로 치환되는 것을 의미한다. 이러한 치환은 제한없이 치환 또는 변형을 포함한, 많은 기전에 의해 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "표적" 또는 "표적 부위"는 임의 조성 및/또는 길이의 사전에 확인된 핵선 서열을 의미한다. 이러한 표적 부위는 염색체 영역, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "온-타겟"은 프로그램 가능한 DNA 결합 영역 및/또는 단일 가이드 RNA 서열과 완전하게 상보성일 수 있는 특이적 게놈 표적의 하위 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "오프-타겟"은 프로그램 가능한 DNA 결합 영역 및/또는 단일 가이드 RNA 서열과 부분적으로 상보성일 수 있는 특이적 게놈 표적의 하위 서열을 의미한다.
본 발명에서 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 유래인 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 시토신 탈아미노효소가 DNA 결합 단백질에 결합되거나 상기 제1분할체 및 제2분할체가 각각 상기 DNA 결합 단백질에 결합되는 형태를 가진다.
상기 시토신 탈아미노효소는 아미노기 이탈 효소로, 시토신(C)을 우리딘(U)으로 전환시킬 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소일 수 있다. 상기 시토신 탈아미노효소로 예를 들어, APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1), AID (activation-induced deaminase)의 형태가 존재하나, 대부분의 DNA 탈아미노효소들은 단일 가닥 DNA에만 작동해서 DNA 결합 단백질에 연결하여 염기 교정하는 데에는 적합하지 않을 수 있다. 구체적으로, 상기 시토신 탈아미노효소는 상기 시토신 탈아미노효소는 이중 가닥 DNA에 작용하는 탈아미노효소 (DddA) 또는 이의 오솔로그 (orthologue)에서 유래한 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 시토신 탈아미노효소는 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소일 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소는 분할된 형태로, 상기 시토신 탈아미노효소는 분리된 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 제1분할체와 제2분할체 각각은 탈아미노효소 활성이 없는 것이다.
전장 시토신 탈아미노효소 중 tox 분할체에 해당하는 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다. 상기 시토신 탈아미노효소는 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 제1분할체와 제2분할체 각각은 탈아미노효소 활성이 없다.
(서열번호 1)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
하나의 실시예에서, 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 또는 제2분할체는 서열번호 1의 서열 중 N 말단에서 G33, G44, A54, N68, G82, N98, G108로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상까지의 서열을 포함할 수 있다. 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 또는 제2분할체는 서열번호 1의 서열 중 G34, P45, G55, N69, T83, A99, A109로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상에서 C-말단까지의 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 시토신 탈아미노효소는 서열번호 2의 제1분할체 (G1333-N) 및 서열번호 3의 제2분할체 (G1333-C)을 포함하거나, 서열번호 4의 제1분할체 (G1397-N) 및 서열번호 5의 제2분할체 (G1397-C)을 포함하거나, 서열번호 2의 제1분할체 (G1333-N) 및 서열번호 5의 제2분할체 (G1397-C)을 포함하거나, 서열번호 4의 제1분할체 (G1397-N) 및 서열번호 2의 제2분할체 (G1333-C)을 포함할 수 있다.
(서열번호 2) Wild-type DddAtox G1333-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGG
(서열번호 33)
GGCTCTGGTTCCTACGCCCTGGGTCCATATCAGATTAGTGCTCCCCAACTCCCCGCCTACAACGGTCAGACAGTGGGGACCTTTTACTATGTCAACGACGCCGGGGGATTGGAATCCAAGGTTTTCTCTAGCGGTGGG
(서열번호 3) Wild-type G1333-C
PTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
(서열번호 34)
CCAACACCTTATCCTAACTACGCTAACGCCGGGCACGTCGAGGGGCAGTCAGCTCTTTTTATGAGAGATAACGGCATTAGCGAAGGGCTTGTGTTCCATAATAATCCTGAGGGCACCTGTGGCTTCTGTGTAAATATGACCGAAACACTTCTGCCTGAGAACGCTAAAATGACTGTCGTACCACCCGAAGGCGCAATCCCAGTTAAACGGGGCGCAACCGGCGAAACCAAAGTATTCACCGGAAACAGCAATAGTCCAAAGTCCCCCACCAAGGGAGGTTGC
(서열번호 4) Wild-type DddAtox G1397-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
(서열번호 35)
GGTAGCTACGCACTTGGTCCTTACCAGATTAGCGCACCCCAACTCCCCGCCTATAATGGTCAAACCGTCGGGACCTTTTACTACGTAAACGATGCTGGTGGGCTGGAATCCAAAGTATTCTCCTCAGGGGGCCCTACACCCTACCCCAACTACGCCAATGCTGGTCATGTAGAAGGGCAGTCAGCACTGTTTATGCGCGATAATGGTATAAGCGAGGGGTTGGTCTTCCATAACAACCCAGAGGGTACTTGTGGCTTCTGTGTGAATATGACTGAAACCCTTCTGCCCGAAAATGCCAAGATGACTGTCGTCCCACCTGAAGGC
(서열번호 5) Wild-type DddAtox G1397-C
AIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
(서열번호 36)
GCCATACCTGTGAAGCGGGGAGCAACAGGGGAGACAAAGGTGTTCACAGGCAACTCTAACAGTCCAAAGAGCCCCACCAAAGGCGGGTGT
상기 G1333N, G1333C, G1397N 및 G1397C가 조합되어 분할 형태의 탈아미노효소로 사용될 수 있다. 구체적으로, Left-G1333-N + Right-G133-C, Left-G1397-N + Right-G1397-C, Left-G1397-N + Right-G1333-C, 또는 Left-G1333-N + Right-G1397-C의 형태로 사용될 수 있다.
상기 DNA 결합 단백질은 예를 들어, 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE (Transcription activator-like effector) 어레이 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 징크 핑커 단백질의 징크 핑거 모티프는 DNA 결합 도메인을 가지고, 핑거의 c-말단 부분은 DNA 서열을 특이적으로 인식한다. 3 ~ 6 개의 징크 핑거 모티프를 포함하는 DNA 결합 단백질이 DNA 서열을 인식한다.
하나의 실시예에서, 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 및 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 각각은 징크 핑거 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다.
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (CC configuration);
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (NC configuration);
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (CN configuration); 또는
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (NN configuration)할 수 있다.
상기 ZF-Left은 다음의 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다:
[서열번호 6]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLR.
상기 ZF-Right는 다음의 서열번호 7의 서열을 포함할 수 있다:
[서열번호 7]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQKINLQVHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDVLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRNHRTTHTKIHLR.
ZF은 DNA 타겟에 따라 서열이 달라질 수 있다. ZF은 DNA 타겟 서열에 따라 맞춤형 제작될 수 있다. ZF는 DNA 3bp를 인식하기 때문에 보통 3~6개의 ZF를 이어 붙여 9~18bp DNA를 인식하는 ZF 조합을 제작할 수 있다. 예를 들어, GNN, TNN, CNN 또는 ANN 등의 모듈이 포함된 라이브러리를 이용하여 제작할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 징크 핑거 단백질은 링커를 통해 탈아미노효소와 연결될 수 있다. 상기 링커는 2 내지 40개 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커일 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 2aa, 5aa, 10aa, 16aa, 24aa 또는 32aa 길이의 링커 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 실시예에서, 상기 링커는 다음을 포함할 수 있다:
2a.a 링커: GS
5a.a 링커: TGEKQ (서열번호 8)
10a.a 링커: SGAQGSTLDF (서열번호 9)
16a.a 링커: SGSETPGTSESATPES (서열번호 10);
24 a.a 링커: SGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTL (서열번호 45); 또는
32a.a 링커: GSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열번호 11).
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 분할 탈아미노효소와 징크 핑거 단백질이 링커를 통해 연결될 수 있고, 제1분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 N-말단에 징크 핑거 단백질이 결합하고, 제2분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 N-말단에 징크 핑거 단백질이 결합한다. 이 때, 왼쪽과 오른쪽 ZFP가 붙는 곳 사이인 스페이서에서 C에서 T로의 염기 전환이 일어날 수 있다. 왼쪽과 오른쪽 ZFP 모두 24 a.a 링커를 통해 제1분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 및 제2분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 각각과 연결되는 경우, 높은 교정 효율을 보임을 확인하였다.
상기 TAL 이펙터 (TALE)는 33개에서 34개의 반복된 아미노산 서열이 반복된 형태로 이루어져 있으며, 도메인(RVD, Repeated variant domain)이 약 9개 정도 반복된다. 도메인 하나당 한 개의 뉴클레오타이드를 인지 할 수 있으며, 12-13번째 아미노산 서열 에 따라 특이적인 DNA 서열과 결합 할 수 있다(HD->Cytosine, NI->Adenine, NG -> Thymine, NN -> Guanine). 탈이펙터(TALE)는 표적부위 내의 단일 DNA 가닥을 인식한다. 표적 부위 사이의 거리는 12-14 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-Repeat의 조합에 의해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질 도메인을 의미한다. 적어도 하나 이상의 TALE-Repeat, 구체적으로 1 내지 30개의 TALE-Repeat를 포함하나 이에 한정되지 않는다. TALE-Repeat는 TALE 도메인 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하는 부위이다.
상기 TALE 도메인에 백본 구조로 TALE의 N-말단 포함 영역 및 TALE의 C-말단 포함 영역이 포함된다.
절단 부위를 기준으로 상기 TALE 도메인이 결합하는 위치에 따라, 단일 TALE 어레이 (array) 또는 제 1 TALE 어레이 및 제 2 TALE 어레이가 각각 결합할 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체에 제 1 TALE이 결합 (left TALE)되고, 상기 시토신 탈아미노효소의 제2분할체에 제 2 TALE (right TALE)이 결합될 수 있다. 각각 N'-TALE-제1분할체-C' 및 N'-TALE-제2분할체-C' 구조를 가진다.
TALE 어레이는 타겟 DNA 서열에 따라 맞춤 제작할 수 있다. TALE 어레이는 33~35 개의 아미노산 잔기로 구성된 모듈이 반복적으로 배열되어 구성되는 데 이들은 식물 병원균 Xanthmonas에서 유래한 것으로 모듈 하나가 A, C, G, T 염기 하나씩을 각각 인식하여 DNA에 결합한다. 각각의 모듈의 염기 특이성은 12, 13번째 아미노산 잔기에 의해 결정되는데 이들을 RVD (repeat variable di-residue)라고 한다. 예를 들어 RVD가 NN인 모듈은 G를 인식하고 NI는 A, HD는 C, NG는 T를 인식한다. TALE array는 최소 14 개에서 최대 18 개 이상의 모듈로 구성되어 타겟 DNA 서열 15bp~20bp를 인식할 수 있도록 설계할 수 있다.
변이된 형태의 Cas 단백질을 포함할 수 있다. DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 변이 표적 특이적 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 형태 중 1종 이상일 수 있다.
니카아제 활성을 갖는 것인 경우, 상기 시토신 탈아미노효소에 의한 염기변환(예컨대, 시토신이 우라딘으로 변환)과 동시 또는 순서와 무관하게 순차적으로, 상기 염기 변환이 일어난 가닥 또는 그 반대 가닥 (예컨대, 염기 변환이 일어난 가닥의 반대 가닥)에서 nick이 도입될 수 있다 (예컨대, PAM이 위치하는 가닥의 반대가닥에서, PAM 서열의 5' 말단 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이에 해당하는 위치에 nick이 도입됨). 이와 같은 변이 (예컨대, 아미노산 치환 등)는 촉매 활성 도메인 (예컨대, Cas9의 경우 RuvC 촉매 도메인)에서 일어나는 것일 수 있다. 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9의 경우 변이는 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalytic aspartate residue; 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 등), 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863), 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 때, 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
경우에 따라서, 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 1135번째 위치의 아스파르트산 (D1135), 1335번째 위치의 아르기닌 (R1335), 및 1337번째 위치의 트레오닌 (T1337) 중 하나 이상, 예컨대 3개 모두가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 Cas9의 PAM 서열 (NGG)와 상이한 NGA (N은 A, T, G, 및 C 중에서 선택된 임의의 염기임)을 인식하도록 변이된 것일 수 있다.
예를 들어, 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열 중,
(1) D10, H840, 또는 D10 + H840;
(2) D1135, R1335, T1337, 또는 D1135 + R1335 + T1337; 또는
(3) (1)과 (2) 잔기 모두에서 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다.
상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌, 발린, 글루타민, 또는 아르기닌일 수 있다.
경우에 따라서, 가이드 RNA를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들어, CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
본 발명은 아데닌 탈아미노효소를 포함한다. 상기 아데닌 탈아미노효소는 예를 들어, APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1), AID (activation-induced deaminase) 및 tadA (tRNA-specific adenosine deaminase)으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 구체적으로는 tadA (tRNA-specific adenosine deaminase)일 수 있다. 상기 아데닌 탈아미노효소는 예를 들어, 대장균 TadA의 변이체로서 디옥시-아데닌 탈아미노효소 (deoxy-adenine deaminase)일 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 대장균 TadA의 변이체로서 디옥시-아데닌 탈아미노효소 (deoxy-adenine deaminase)를 사용하였고, 구체적으로 TadA8e 또는 ABE 8.0일 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소가 분할 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 징크 핑거 단백질로, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (NC configuration)한 구조에서, 아데닌 탈아미노효소는 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C 말단, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단, 징크 핑거 단백질 (ZF-Right)의 N 말단, 시토신 탈아미노효소의 제2분할체의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
아데닌 탈아미노효소는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (CC configuration); 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (CN configuration); 또는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (NN configuration)에서도 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C 말단, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단, 징크 핑거 단백질 (ZF-Right)의 N 말단, 시토신 탈아미노효소의 제2분할체의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소가 분할 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 TALE인 경우 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체에 제1 TALE 이 결합되고, 상기 시토신 탈아미노효소의 제2분할체에 제2 TALE이 결합될 수 있으며, 각각 N'-TALE-제1분할체DDDA-C' 및 N'-TALE-제2분할체DDDA-C' 구조를 가진다. 아데닌 탈아미노효소는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단 또는 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
본 발명은 1) DNA 결합 단백질 2) 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 및 3) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소를 포함하는 식물세포 소기관 DNA의 A-to-G 염기 교정용 조성물(UGI (uracil DNA-glycosylase inhibitor) 없음)로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이이고; 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 조성물이다.
상기 시토신 탈아미노효소가 분할 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 징크 핑거 단백질로, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (NC configuration)한 구조에서, 아데닌 탈아미노효소는 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C 말단, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단, 징크 핑거 단백질 (ZF-Right)의 N 말단, 시토신 탈아미노효소의 제2분할체의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
아데닌 탈아미노효소는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (CC configuration); 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (CN configuration); 또는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (NN configuration)에서도 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C 말단, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단, 징크 핑거 단백질 (ZF-Right)의 N 말단, 시토신 탈아미노효소의 제2분할체의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소가 분할 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 TALE인 경우 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체에 제1 TALE 이 결합되고, 상기 시토신 탈아미노효소의 제2분할체에 제2 TALE이 결합될 수 있으며, 각각 N'-TALE-제1분할체DDDA-C' 및 N'-TALE-제2분할체DDDA-C' 구조를 가진다. 아데닌 탈아미노효소는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단 또는 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
본 발명은 식물세포 소기관 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), 또는 TALE 어레이이고, 상기 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 식물세포 소기관 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein) 또는 TALE 어레이이고, 상기 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며, 상기 제1분할체 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는, 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 1) DNA 결합 단백질 2) 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 및 3) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소를 포함하는 식물세포 소기관 A-to-G 염기 교정용 조성물로, UGI를 포함하지 않으며, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이 이고; 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 조성물이다.
본 발명은 식물세포 소기관 A-to-G 염기 교정방법으로, DNA 결합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 아데닌 탈아미노효소 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하고, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), 또는 TALE 어레이이고, 상기 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 식물세포 소기관 A-to-G 염기 교정방법으로, DNA 결합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 아데닌 탈아미노효소 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하고, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), 또는 TALE 어레이이고, 상기 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며, 상기 제1분할체 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는, 방법에 관한 것이다.
본 발명은 식물세포 소기관 A-to-G 염기 교정방법으로, DNA 결합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 유래의 제1분할체 및 제2분할체 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 아데닌 탈아미노효소 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하고, 1) DNA 결합 단백질 2) 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 및 3) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소를 포함하는 식물세포 소기관 A-to-G 염기 교정용 조성물로, UGI를 포함하지 않으며, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이 이고; 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 방법이다.
기존에는 UGI를 포함하지 않는 TALED가 동물세포 미토콘드리아에서 C-to-T 에디팅을 일으키지 않고 A-to-G 에디팅만 일으켰다.
본 발명은 엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS)을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 엽록체 전달 단백질 (Chloroplast Transit Peptide, CTP) 또는 미토콘드리아 전달 신호 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS)이 결합하여 식물 세포 내 엽록체와 미토콘드리아에 전달된다. 엽록체와 미토콘드리아로 전달될 때 N-말단의 CTP 또는 MTS 단백질을 제외한 나머지 부분은 전-단백질 (preprotein) 형태로 엽록체와 미토콘드리아 내부로 전달된다. 엽록체와 미토콘드리아 내부로 진입 과정에서 전달 단백질 부분이 떨어져 나가게 되고 엽록체와 미토콘드리아를 타겟팅하여 특정 부분을 염기 교정할 수 있다.
상기 핵산과 관련하여, "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 전 또는 후에 가능할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다.
상기 융합단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현 벡터를 사용할 수 있으며, 백터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 구체적으로 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노부속 바이러스(Adeno-associated virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용되도록 즉, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게-연결되도록 숙주세포를 기반을 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주세포 내로 도입되는 경우 숙주세포에서) 조절 요소에 연결됨을 의미한다.
재조합 발현 벡터는 T7 promoter를 포함하여 메신저 RNA 합성에 적합한 형태를 포함할 수 있으며, 이는 기내에서 mRNA 합성을 할 수 있도록, 즉, T7 polymerase에 의해 메신저 RNA가 합성될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
"조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 기타 발현 조정 요소(예를 들어, 전사 종결 신호 예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)을 포함할 수 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주세포에서 뉴클레오티드 서열의 유도 또는 항상 발현을 지시하는 요소 및 특정 숙주세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 요소(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 요망되는 관심 조직 예컨대, 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 기관(예를 들어, 간, 췌장), 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 지시할 수 있다. 조절 요소는 또한 조직 또는 세포-유형 특이적일 수 있거나 아닐 수 있는 세포-주기 의존성 또는 발달 단계-의존적 방식과 같은 일시적-의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있다.
경우에 따라서 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터, 하나 이상의 pol II 프로모터, 하나 이상의 pol I 프로모터, 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 비제한적으로 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예는 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)(예를 들어, Boshart et al(1985) Cell 41:521-530), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
"조절 요소"에는 인핸서 예를 들어, WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서 R-U5' 세그먼트; SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2 및 3 사이의 인트론 서열 등이 포함될 수 있다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 벡터는 숙주세포 내로 도입되어 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 전사물, 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다(예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 이의 돌연변이체, 이의 융합 단백질 등). 유익한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 유형의 세포를 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
상기 벡터는 각각 국소주입법 (예컨대， 병변 또는 표적 부위 직접 주입), 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
상기 핵산은 리보핵산, 예를 들어 메신저 리보핵산 mRNA 형태로 주입하여 세포의 유전자 염기 교정, 예를 들어 동물세포 또는 식물세포에 제한없이 유전자 염기 교정이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산은 mRNA 형태일 수 있고, mRNA 형태로 전달하는 경우 DNA를 이용한 벡터 형태로 전달하는 것에 비해, mRNA로의 전사 과정이 불필요하여 유전자 교정 개시가 빠를 수 있다. 일시적 단백질 발현 (transient protein expression) 가능성이 높다.
본 출원의 발명자들은 식물세포 소기관 유전자 교정을 위해 시토신 염기 교정기 (cytosine base editor)를 리보핵산, 예를 들어 메신저 리보핵산 형태로 식물 세포에 주입하였을 때 플라스미드로 전달하는 것에 비해 비표적 효과가 감소함을 확인하였다. 식물세포 소기관 유전자 교정에 있어 시토신 염기 교정기를 mRNA 형태로 식물세포에 형질전환 하였을 때, 플라스미드에 비해 비표적 효과에서 장점이 있음을 최초로 입증하였다.
상기 mRNA는 직접 전달되거나, 캐리어를 통해 전달될 수 있다. 경우에 따라서, 핵산절단효소 및/또는 절단인자의 mRNA를 화학변형 (chemical modification) 하거나, 합성 자기-복제 RNA (synthetic self-replicative RNA) 형태로 직접 전달할 수 있다.
세포로 mRNA를 전달하는 방법 또는 생체 내에서 mRNA를 인간, 동물과 같은 유기체의 세포로 전달하는 방법을 포함하여, 시험관 내 또는 생체 내에서 mRNA 분자를 세포로 전달할 수 있는 방법을 고려할 수 있다. 예를 들어, 지질(예를 들어, 리포좀, 마이셀 등)을 포함하거나, 나노파티클 또는 나노튜브를 포함하거나, 양이온성 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌이민 또는 PEI)을 포함하거나, 양이온성 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌이민 또는 PEI)을 포함하여, mRNA 분자를 세포로 전달할 수 있다. 경우에 따라서, mRNA를 세포로 전달하기 위해서 유전자 총 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템과 같은 볼리스틱 방법(bolistics method)을 사용할 수 있다.
상기 캐리어는 예를 들어, 세포 투과성 펩타이드(CPP), 나노입자, 또는 중합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 CPP는 다양한 분자 카고(나노크기 입자로부터 작은 화학 분자 및 DNA의 큰 단편까지)의 세포 흡수를 용이하게 하는 짧은 펩타이드이다.
상기 나노입자와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물은 고분자 나노입자, 금속 나노입자, 금속/무기 나노입자 또는 지질 나노입자를 통해 전달될 수 있다. 상기 고분자 나노입자는 예를 들어, 롤링 써클 증폭에 의해 합성된 DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자일 수 있다. DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자에 mRNA를 로딩하고, 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위해 PEI를 코팅할 수 있다. 이러한 복합체가 세포막에 결합하여, 내재화된 다음 엔도좀 탈출을 통해 핵으로 이동하여, 전달되도록 할 수 있다.
상기 금속 나노입자와 관련하여, 금입자를 연결시키고 양이온성 엔도좀 탈출 폴리머 (endosomal disruptive polymer)와 복합체를 형성하여 세포에 전달할 수 있다. 상기 양이온성 엔도좀 탈출 폴리머 (endosomal disruptive polymer)는 예를 들어, polyethylene imine, poly(arginine), poly(lysine), poly(histidine), poly-[2-{(2-aminoethyl)amino}-ethyl-aspartamide] (pAsp(DET)), poly(ethylene glycol) (PEG)와 poly(arginine)의 block co-polymer, PEG와 poly(lysine)의 block co-polymer, 또는 PEG와 poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PEG-pAsp(DET))의 block co-polymer일 수 있다.
상기 금속/무기 나노입자와 관련하여, 예를 들어 ZIF-8 (zeolitic imidazolate framework-8)를 통해 mRNA를 캡슐화할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 mRNA는 음이온을 띠고(negatively charged), 양이온을 띠는(cationic) 물질들과 결합하여 나노입자 (nanoparticles)를 형성할 수 있고, 이는 세포로 수용체 매개 엔도사이토시스 (receptor-mediated endocytosis) 혹은 파고사이토시스 (phagocytosis) 등을 통해 침투할 수 있다.
양이온성 중합체로 폴리알릴아민 (PAH); 폴리에틸렌이민 (PEI); 폴리(L-리신) (PLL); 폴리(L-아르기닌) (PLA); 폴리비닐아민 단일- 또는 공중합체; 폴리(비닐벤질-트리-C1-C4-알킬암모늄염); 지방족 또는 방향지방족 디할로겐화물 및 지방족 N,N,N',N'-테트라-C1-C4-알킬-알킬렌디아민의 중합체; 폴리(비닐피리딘) 또는 폴리(비닐피리디늄염); 폴리(N,N-디알릴-N,N-디-C1-C4-알킬-암모늄할로겐화물); 4차화된 디-C1-C4-알킬-아미노에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트의 단일- 또는 공중합체; 폴리쿠아드(POLYQUAD)™; 폴리아미노아미드 등이 포함될 수 있다.
양이온성 지질로 양이온성 리포솜 제제를 포함할 수 있다. 리포솜의 지질 이중층은 캡슐화된 핵산을 분해로부터 보호하며, 핵산에 결합할 수 있는 항체에 의한 특이적 중화를 방지할 수 있다. 엔도좀 성숙 동안 엔도좀 멤브레인과 리포좀이 융합되어, 양이온성 지질-핵산절단효소의 효율적인 엔도좀 탈출이 가능하다. 양이온성 지질로 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (PAMAM) 성화 수지상체, 리포펙틴 (DOTMA와 DOPE의 조합), 리포펙타제, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® (예컨대 리포펙타민® 2000, 리포펙타민® 3000, 리포펙타민® RNAiMAX, 리포펙타민® LTX), 세인트-레드(SAINT-RED) (시노볼룩스 세라퓨틱스(Synvolux Therapeutics)사, 네덜란드 그로닝겐 소재), DOPE, 시토펙틴 (길레드 사이언시즈(Gilead Sciences) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재), 및 유펙틴 (JBL사, 캘리포니아 산 루이스 오비스포 소재)가 포함될 수 있다. 대표적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드; 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)으로부터 제조될 수 있다.
지질 나노입자와 관련하여, 캐리어로 리포좀을 이용하여 전달할 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소낭 구조이다. 리포좀 제형은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린 또는 모노시알로강글리오사이드 등을 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 혈장 내 불안정성을 해소하기 위하여, 지질막에 콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 추가할 수 있다. 콜레스테롤의 첨가는 캡슐화된 생활성 화합물의 혈장 내로의 신속한 방출을 감소시키거나 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다.
상기 조성물은 다음을 통해 식물세포에 전달될 수 있다:
Gene gun을 이용한 주입 (Bombardment);
PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection).
본 발명에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다.
상기 핵산은 다음을 통해 식물세포에 전달될 수 있다:
Agrobacterium, 예를 들어 Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogene 등을 이용한 형질전환
- binary vector,
- Viral vector: Geminivirus, tobacco rattle virus (TRV), tomato mosaic virus (ToMV), foxtail mosaic virus (FoMV), barley yellow striate mosaic virus (BYSMV), Sonchus yellow net rhabdovirus (SYNV) 등;
바이러스를 이용한 형질감염;
주입 (Bombardment, Gene gun);
PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection).
상기 바이러스는 예를 들어, viral vector: Geminivirus, tobacco rattle virus (TRV), tomato mosaic virus (ToMV), foxtail mosaic virus (FoMV), barley yellow striate mosaic virus (BYSMV), Sonchus yellow net rhabdovirus (SYNV) 등을 예로 들 수 있다.
상기 벡터는 각각 국소주입법 (예컨대， 병변 또는 표적 부위 직접 주입), 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 세포내로 전달될 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 소기관 DNA의 염기를 교정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 방법에 의해 GTTGAAAGC 서열을 포함하는 엽록체 psbA 유전자의 염기가 교정된, 아트라진 (Atrazine) 제초제 저항성 식물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 방법에 의해 CGTCATCCTCA 서열을 포함하는 16s rRNA의 염기가 교정된 스펙티노마이신 (Spectinomycine) 저항성 식물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 방법에 의해 atp6 유전자의 염기가 교정된 식물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 방법에 의해 ATG를 포함하는 psaA 유전자의 염기가 교정된 알비노 표현형을 가지는 식물에 관한 것이다.
엽록체 DNA 중 psbA의 295번재 아미노산인 페닐알라닌 (Phenylalanine)을 세린 (Serine)으로 염기교정함으로 제초제 중 하나인 아트라진 (Atrazine)에 저항성을 가지는 식물을 개발할 수 있다. 엽록체의 psbA뿐 아니라 16s rRNA, psaA의 염기 교정을 통해 스펙티노마이신 (Spectinomycine) 저항성 식물, 알비노 형태의 식물을 개발할 수 있다.
광합성에 관여하는 rbcL (Rubisco large subunit) 유전자의 염기 교정이 가능 함으로 광합성 효율을 조절하여 식물의 생산량 증대 또는 이산화탄소 흡수의 효율이 높은 식물체 제작을 기대 할 수 있다.
본 발명은 상기 방법에 의해 엽록체 루비스코 (rubisco: ribulose bisphosphate carboxylase) 코딩 유전자의 염기가 교정된 식물에 관한 것이다. 광합성에 관여하는 루비스코 라지 유닛 (rubisco Large unit)의 염기 교정이 가능 함으로 광합성 효율을 조절하여 식물의 생산량 증대를 기대할 수 있다.
엽록체의 염기서열은 식물 간 상동관계 (homology)가 높아, 본 발명에 사용한 양상추 (Lactuca sativa cv. Cheongchima) 뿐만 아니라 벼, 밀, 감자, 토마토 등의 식물도 아트라진 (Atrazine)에 저항성을 가지는 식물을 개발할 수 있다.
상추 원형질체 (Lettuce protoplast)에 플라스미드를 전달하여 7일 후 미토콘드리아 DNA의 atp6 유전자 내 타겟에서 아데닌 염기 교정되었음을 확인하였다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
아그로박테리움 (agrobacterium)을 이용한 형질전환 식물 제작을 위한 DNA 클로닝 (cloning) 모식도를 도 1에 나타내었다. 염기서열이 반복되는 TALE 쌍을 하나의 벡터에 클로닝하기 위해 Aat II, Pme I site의 위치가 다른 벡터에 RPS5A promoter-PTP-3xFlag-Left TALE-1397N와 RPS5A promoter-PTP-3xFlag-Right TALE-1397C-ABE8.0을 각각 클로닝 하였다. 두개의 플라스미드 (plasmid)를 각각 Aat II, Pme I으로 digestion 후 Left TALE이 있는 플라스미드에 RPS5A promoter-PTP-3xFlag-Right TALE-1397C-ABE8.0-35S terminator를 ligation하여 하나의 플라스미드에 모두 클로닝 하였다. 위의 도 1은 모식도 일 뿐이고, Left TALE에 1397C-ABE8.0을, Right TALE에 1397N을 클로닝 할 수 있다.
아그로박테리움을 이용한 형질 전환을 통해, 애기 장대의 엽록체에 있는 psaA, rbcL과 rrn16S 유전자를 타겟하는 1세대 형질전환체를 각각 20개, 6개, 그리고 37개의 식물체를 확보하였다. psaA유전자를 타겟하는 형질전화체 식물. a, 각 식물체의 염기 교정 효율과 위치. b, 식물의 표현형. c, DNA염기교정으로 인한 아미노산 염기 서열의 변화를 도 2에 나타내었다. 도 2의 a에 따르면 염기서열 표시 중 C-12, C-11, C2 (표기는 G2로 되어 있음)이 교정되는 것을 확인할 수 있다.
rbcL 유전자를 타겟하는 형질전화체 식물. a, 각 식물체의 염기 교정 효율과 위치. b, DNA염기교정으로 인한 아미노산 염기 서열의 변화를 도 3에 나타내었다.
rrn16S 유전자를 타겟하는 형질전환 식물의 염기 교정 효율과 위치를 도 4에 나타내었다.
애기 장대의 엽록체에 있는 psaA, rbcL과 rrn16S 유전자를 타겟 하는 1세대 형질전환체의 염기 교정 효율과 표현형. a, psaA #1, 2, 3의 염기 교정 효율과 위치를 나타내었다. 아데닌의 염기 교정뿐 아니라 시토신의 염기 교정이 동시에 일어난다. b, psaA #3의 표현형으로 green, chimeric, pale green의 형질을 나타낼 수 있다. c, rbcL #1, 2의 염기 교정 효율, 위치와 표현형. d, rrn16S 유전자를 타겟 하는 1세대 형질전환체의 염기 교정 효율을 도 5에 나타내었다.
도 4의 C-2, 도 5의 a, d도 각각 C2, C-2가 교정되는 것을 확인할 수 있다.
도 6에 따르면, 형질전환 2세대 식물의 염기 교정 효율과 표현형을 나타내었다. psaA #3의 형질전환 2세대의 표현형과 (a), 염기 교정 효율과 위치 (b). Spectinomycin에 저항성을 가지는 rrn16S 형질전환 2세대의 표현형 (c)과 염기 교정 효율과 위치 (d). e, 형질전환 식물에 도입된 외부 유전자의 유무를 PCR로 확인한 결과 rrn16S #9-1, 3은 외부 유전자가 없는 것을 확인하였다.
도 6은 엽록체 염기 교정이 다음 세대로 전달되는 것을 확인한 것이고, b의 경우 A to G, C to T 염기 교정이 다음 세대로 같이 전달되는 것을 확인한 것이다.
이를 토대로 식물에서는 동물에서와 다르게 A to G 염기 교정과 C to T 염기 교정이 같이 일어나는 것을 확인하였다.
rrn16S 형질전환 2세대 식물 중 스펙티노마이신 (Spectinomycin)에 저항성과 민감성을 가지는 식물의 염기 교정 위치와 효율을 도 7에 나타내었다.
도 8에 따르면, psaA #1 (a), psaA #3 chimeric (b), psaA #3 pale green (c), rrn16s #1 (d), 6 (e)과 야생형 Col-0 (f) 의 엽록체 전장 유전체 분석을 통한 표적 외 염기 변이. 야생형과 비교했을 때 형질전환 식물에서 뚜렷한 표적 외 염기 변이가 관찰되지 않았다.
도 9에 따르면 상추 미토콘드리아 유전자 atp6의 염기교정을 효율을 나타내었다. 상추 원형질체 (Lettuce protoplast)에 PcUBi promoter-MTS-3xFlag-Left TALE-1397N-Pea3A terminator, PcUBi promoter-MTS-3xFlag-Right TALE-1397C-ABE8.0-Pea3A terminator과 PcUBi promoter-MTS-3xFlag-Left TALE-1397C-ABE8.0-Pea3A terminator, PcUBi promoter-MTS-3xFlag-Right TALE-1397N-Pea3A terminator을 각각 15ug 씩 총 30ug을 전달하여 7일 후 아데닌 염기 교정 효율을 측정하였고, A6 0.99%, A9 1.12%의 염기 교정 효율을 나타내었다.
실시예 중 사용된 각 구성에 대한 서열은 다음과 같다.
CTS (or PTP: 서열번호 16)
MDSQLVLSLKLNPSFTPLSPLFPFTPCSSFSPSLRFSSCYSRRLYSPVTVYAAK
MTS (서열번호 17)
MFKQASRLLSRSVAAASSKSVTTRAFSTELPSTLDS
NTD (TALE N-term 서열번호 18)
DLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLN
CTD (TALE C-term 서열번호 19)
LTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLG
AD (ABE8.0 또는 TadA8e: 서열번호 20)
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
Linker 1 (TALE array ?? Linker 1-DddAtox)
GS
Linker 2 (DddAtox-Linker 2-AD)
SGSETPGTSESATPES
DddAtox 1397N (서열번호 21)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
DddAtox 1397C (서열번호 22)
GSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
psbA Left TALE repeat (서열번호 23)
LTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHG
psbA Right TALE repeat (서열번호 24)
LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
rrn16S Left TALE repeat (서열번호 25)
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rrn16S Right TALE repeat (서열번호 26)
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psaA Left TALE repeat (서열번호 27)
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psaA Right TALE repeat (서열번호 28)
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rbc L Left TALE repeat (서열번호 29)
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rbc L Right TALE repeat (서열번호 30)
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atp6 Left TALE repeat (서열번호 31)
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atp6 Right TALE repeat (서열번호 32)
LTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHG
RPS5A promoter (서열번호 41)
CTCAACTTTTGATTCGCTATTTGCAGTGCACCTGTGGCGTTCATCACATCTTTTGTGACACTGTTTGCACTGGTCATTGCTATTACAAAGGACCTTCCTGATGTTGAAGGAGATCGAAAGTAAGTAACTGCACGCATAACCATTTTCTTTCCGCTCTTTGGCTCAATCCATTTGACAGTCAAAGACAATGTTTAACCAGCTCCGTTTGATATATTGTCTTTATGTGTTTGTTCAAGCATGTTTAGTTAATCATGCCTTTGATTGATCTTGAATAGGTTCCAAATATCAACCCTGGCAACAAAACTTGGAGTGAGAAACATTGCATTCCTCGGTTCTGGACTTCTGCTAGTAAATTATGTTTCAGCCATATCACTAGCTTTCTACATGCCTCAGGTGAATTCATCTATTTCCGTCTTAACTATTTCGGTTAATTAAAGCACGAACACCATTACTGCATGTAGAAGCTTGATAAACTATCGCCACCAATTTATTTTTGTTGCGATATTGTTACTTTCCTCAGTATGCAGCTTTGAAAAGACCAACCCTCTTATCCTTTAACAATGAACAGGTTTTTAGAGGTAGCTTGATGATTCCTGCACATGTGATCTTGGCTTCAGGCTTAATTTTCCAGGTAAAGCATTATGAGATACTCTTATATCTCTTACATACTTTTGAGATAATGCACAAGAACTTCATAACTATATGCTTTAGTTTCTGCATTTGACACTGCCAAATTCATTAATCTCTAATATCTTTGTTGTTGATCTTTGGTAGACATGGGTACTAGAAAAAGCAAACTACACCAAGGTAAAATACTTTTGTACAAACATAAACTCGTTATCACGGAACATCAATGGAGTGTATATCTAACGGAGTGTAGAAACATTTGATTATTGCAGGAAGCTATCTCAGGATATTATCGGTTTATATGGAATCTCTTCTACGCAGAGTATCTGTTATTCCCCTTCCTCTAGCTTTCAATTTCATGGTGAGGATATGCAGTTTTCTTTGTATATCATTCTTCTTCTTCTTTGTAGCTTGGAGTCAAAATCGGTTCCTTCATGTACATACATCAAGGATATGTCCTTCTGAATTTTTATATCTTGCAATAAAAATGCTTGTACCAATTGAAACACCAGCTTTTTGAGTTCTATGATCACTGACTTGGTTCTAACCAAAAAAAAAAAAATGTTTAATTTACATATCTAAAAGTAGGTTTAGGGAAACCTAAACAGTAAAATATTTGTATATTATTCGAATTTCACTCATCATAAAAACTTAAATTGCACCATAAAATTTTGTTTTACTATTAATGATGTAATTTGTGTAACTTAAGATAAAAATAATATTCCGTAAGTTAACCGGCTAAAACCACGTATAAACCAGGGAACCTGTTAAACCGGTTCTTTACTGGATAAAGAAATGAAAGCCCATGTAGACAGCTCCATTAGAGCCCAAACCCTAAATTTCTCATCTATATAAAAGGAGTGACATTAGGGTTTTTGTTCGTCCTCTTAAAGCTTCTCGTTTTCTCTGCCGTCTCTCTCATTCGCGCGACGCAAACGATCTTCAGGTGATCTTCTTTCTCCAAATCCTCTCTCATAACTCTGATTTCGTACTTGTGTATTTGAGCTCACGCTCTGTTTCTCTCACCACAGCC
35S terminator (서열번호 42)
CGGCCATGCTAGAGTCCGCAAAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATTTTTCTCCAGAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTGACCT
PcUbi promoter (서열번호 43)
CTAGCAACGATTGTACAATTGCTTCTTTAAAAAAGGAAGAAAGAAAGAAAGAAAAGAATCAACATCAGCGTTAACAAACGGCCCCGTTACGGCCCAAACGGTCATATAGAGTAACGGCGTTAAGCGTTGAAAGACTCCTATCGAAATACGTAACCGCAAACGTGTCATAGTCAGATCCCCTCTTCCTTCACCGCCTCAAACACAAAAATAATCTTCTACAGCCTATATATACAACCCCCCCTTCTATCTCTCCTTTCTCACAATTCATCATCTTTCTTTCTCTACCCCCAATTTTAAGAAATCCTCTCTTCTCCTCTTCATTTTCAAGGTAAATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTTATTCCTTGTTTTAATTAGGTATGTATTATTGCTAGTTTGTTAATCTGCTTATCTTATGTATGCCTTATGTGAATATCTTTATCTTGTTCATCTCATCCGTTTAGAAGCTATAAATTTGTTGATTTGACTGTGTATCTACACGTGGTTATGTTTATATCTAATCAGATATGAATTTCTTCATATTGTTGCGTTTGTGTGTACCAATCCGAAATCGTTGATTTTTTTCATTTAATCGTGTAGCTAATTGTACGTATACATATGGATCTACGTATCAATTGTTCATCTGTTTGTGTTTGTATGTATACAGATCTGAAAACATCACTTCTCTCATCTGATTGTGTTGTTACATACATAGATATAGATCTGTTATATCATTTTTTTTATTAATTGTGTATATATATATGTGCATAGATCTGGATTACATGATTGTGATTATTTACATGATTTTGTTATTTACGTATGTATATATGTAGATCTGGACTTTTTGGAGTTGTTGACTTGATTGTATTTGTGTGTGTATATGTGTGTTCTGATCTTGATATGTTATGTATGTGCAGC
Pea3A terminator (서열번호 44)
CAGGCCTCCCAGCTTTCGTCCGTATCATCGGTTTCGACAACGTTCGTCAAGTTCAATGCATCAGTTTCATTGCCCACACACCAGAATCCTACTAAGTTTGAGTATTATGGCATTGGAAAAGCTGTTTTCTTCTATCATTTGTTCTGCTTGTAATTTACTGTGTTCTTTCAGTTTTTGTTTTCGGACATCAAAATGCAAATGGATGGATAAGAGTTAATAAATGATATGGTCCTTTTGTTCATTCTCAAATTATTATTATCTGTTGTTTTTACTTTAATGGGTTGAATTTAAGTAAGAAAGGAACTAACAGTGTGATATTAAGGTGCAATGTTAGACATATAAAACAGTCTTTCACCTCTCTTTGGTTATGTCTTGAATTGGTTTGTTTCTTCACTTATCTGTGTAATCAAGTTTACTATGAGTCTATGATCAAGTAATTATGCAATCAAGTTAAGTACAGTATAGGCTT
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (18)
- 다음을 포함하는 식물세포 소기관 DNA의 염기 교정용 조성물로,
DNA 결합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 시토신 탈아미노효소 유래의 제1분할체 및 제2분할체 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
아데닌 탈아미노효소 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하고,
상기 제1분할체 및 제2분할체는 각각 상기 DNA 결합 단백질에 결합되며,
상기 식물세포 소기관 DNA의 아데닌을 구아닌으로, 시토신을 티민으로 동시에 교정하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 제1분할체와 제2분할체 각각은 시토신 탈아미노효소 활성이 없는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서 상기 시토신 탈아미노효소는 이중 가닥 DNA에 작용하는 탈아미노효소 (DddA) 또는 이의 오솔로그 (orthologue)에서 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 제1분할체는 서열번호 1의 서열 중 N 말단에서 G33, G44, A54, N68, G82, N98, G108로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상까지의 서열을 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 제2분할체는 서열번호 1의 서열 중 G34, P45, G55, N69, T83, A99, A109로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상에서 C-말단까지의 서열을 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 ZF 단백질 (zinc-finger protein), 또는 TALE 어레이 (transcription activator-like effector array)인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 2 내지 40개 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 링커는 다음을 포함하는 조성물:
2a.a 링커: GS
5a.a 링커: TGEKQ
10a.a 링커: SGAQGSTLDF
16a.a 링커: SGSETPGTSESATPES;
24 a.a 링커: SGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTL; 또는
32a.a 링커: GSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS. - 제1항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질이고, 상기 제1분할체 및 제2분할체 각각은 상기 징크 핑거 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되어 있는 형태인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 TALE array이고 단일 TALE 어레이 (array)가 분할체의 일 말단에 결합 또는 제 1 TALE 어레이 및 제 2 TALE 어레이가 제1분할체 및 제2분할체에 결합된 형태인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아데닌 탈아미노효소는 DNA 결합 단백질 또는 시토신 탈아미노효소의 N 또는 C 말단에 결합된 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아데닌 탈아미노효소는 TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소인 조성물.
- 제1항에 있어서, 엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, UGI(uracil DNA-glycosylase inhibitor)를 포함하지 않는 조성물.
- 제1항에 있어서, 다음을 통해 식물세포에 전달되는 것을 특징으로 하는 조성물:
진건 (Gene gun)을 이용한 주입 (Bombardment);
PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection). - 제1항에 있어서, 상기 핵산은 다음을 통해 식물세포에 전달되는 것을 특징으로 하는 조성물:
Agrobacterium tumefaciens 또는 Agrobacterium rhizogene의 아그로박테리움을 이용한 형질전환;
바이러스 형질감염;
진건 (Gene gun)을 이용한 주입 (Bombardment);
PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection). - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 소기관 DNA의 염기 교정방법.
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