JP2024505924A - 核酸送達 - Google Patents
核酸送達 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024505924A JP2024505924A JP2023546009A JP2023546009A JP2024505924A JP 2024505924 A JP2024505924 A JP 2024505924A JP 2023546009 A JP2023546009 A JP 2023546009A JP 2023546009 A JP2023546009 A JP 2023546009A JP 2024505924 A JP2024505924 A JP 2024505924A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- composition
- use according
- peptide
- nucleic acid
- mrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 213
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 212
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 212
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 title claims abstract description 128
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims abstract description 331
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 331
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 284
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 124
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 100
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 44
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 456
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 315
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 208
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 147
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 120
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 claims description 108
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 106
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 106
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 103
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 97
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 50
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 45
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 43
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 42
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 39
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 38
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims description 32
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 28
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 26
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical group NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- -1 crRNA Proteins 0.000 claims description 25
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 25
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 24
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 24
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 20
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 18
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 18
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 16
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 16
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims description 15
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 claims description 15
- DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N [(2r)-3-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 15
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 claims description 14
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 14
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 14
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 13
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 claims description 13
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 13
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 13
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical group NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 claims description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 11
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 10
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 9
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 9
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 claims description 8
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims description 8
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 8
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 8
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 claims description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 claims description 7
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 claims description 7
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 7
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004985 myeloid-derived suppressor cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 6
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 6
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(azaniumyl)propanoate;chloride Chemical compound Cl.NCC(N)C(O)=O SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 5
- IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-acetamido-5-[[amino-(methylcarbamoylamino)methylidene]amino]-n-methylpentanamide Chemical compound CNC(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(C)=O)C(=O)NC IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 4
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 3
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 3
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 201000011603 cardia cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims 11
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 108091029810 SaRNA Proteins 0.000 claims 1
- 210000002318 cardia Anatomy 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 1
- 229940078677 sarna Drugs 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 151
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 74
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 73
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 63
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 40
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 35
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 30
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 29
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 29
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 29
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 27
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 25
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 24
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 24
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 24
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 24
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 23
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 23
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 23
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 22
- 101000822869 Naja sputatrix Alpha-neurotoxin NTX-1 Proteins 0.000 description 21
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 20
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 15
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 13
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 13
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 13
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 13
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 12
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 12
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 12
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 9
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 8
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 8
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 7
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 7
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 0.000 description 6
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000006395 clathrin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 201000009338 distal myopathy Diseases 0.000 description 6
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 6
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 5
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 5
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 206010034576 Peripheral ischaemia Diseases 0.000 description 5
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000027448 caveolin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 5
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 4
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 208000013135 GNE myopathy Diseases 0.000 description 4
- 101000721712 Homo sapiens NTF2-related export protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100025055 NTF2-related export protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- LHHQTXPEHJNOCX-UHFFFAOYSA-N Rottlerin Natural products CC(=O)c1c(O)c(C)c(O)c(Oc2c(O)c3C=CC(C)(C)Cc3c(C(=O)C=Cc4ccccc4)c2O)c1O LHHQTXPEHJNOCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 4
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- DEZFNHCVIZBHBI-ZHACJKMWSA-N rottlerin Chemical compound CC(=O)C1=C(O)C(C)=C(O)C(CC=2C(=C(C(=O)\C=C\C=3C=CC=CC=3)C=3OC(C)(C)C=CC=3C=2O)O)=C1O DEZFNHCVIZBHBI-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 4
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 3
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000029402 Bulbospinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- 208000010316 Myotonia congenita Diseases 0.000 description 3
- 101000822870 Naja sputatrix Alpha-neurotoxin NTX-2 Proteins 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 description 3
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 description 3
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000034778 micropinocytosis Effects 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 3
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 0.000 description 2
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 description 2
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 1-methylguanine Chemical compound O=C1N(C)C(N)=NC2=C1N=CN2 RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminobutanoic acid Chemical group CCC(N)(N)C(O)=O BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NEZDNQCXEZDCBI-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumylethyl 2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC NEZDNQCXEZDCBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 2
- 101150110214 Cav3 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000010693 Charcot-Marie-Tooth Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000032064 Chronic Limb-Threatening Ischemia Diseases 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 201000000915 Chronic Progressive External Ophthalmoplegia Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000004117 Congenital Myasthenic Syndromes Diseases 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 208000024412 Friedreich ataxia Diseases 0.000 description 2
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032008 Glycogen storage disease due to glycogen debranching enzyme deficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010053250 Glycogen storage disease type III Diseases 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010048804 Kearns-Sayre syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000010743 Lambert-Eaton myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 208000014844 Mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy Diseases 0.000 description 2
- 206010028424 Myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 2
- SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N N(2)-methylguanine Chemical compound O=C1NC(NC)=NC2=C1N=CN2 SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N N-L-arginyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 description 2
- 206010036802 Progressive external ophthalmoplegia Diseases 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N [(6z,9z,28z,31z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl] 4-(dimethylamino)butanoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCCC(OC(=O)CCCN(C)C)CCCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N cholesteryl hemisuccinate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)CCC(O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N 0.000 description 2
- 201000011474 congenital myopathy Diseases 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 201000004543 glycogen storage disease III Diseases 0.000 description 2
- 201000009339 glycogen storage disease VII Diseases 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000034701 macropinocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 2
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXJQNQWYMAXZEV-BXXZVTAOSA-N (2r,3r,4r)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanoyl azide Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)N=[N+]=[N-] KXJQNQWYMAXZEV-BXXZVTAOSA-N 0.000 description 1
- KHWUKFBQNNLWIV-KPNWGBFJSA-N (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 KHWUKFBQNNLWIV-KPNWGBFJSA-N 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 0.000 description 1
- HJTAZXHBEBIQQX-UHFFFAOYSA-N 1,5-bis(chloromethyl)naphthalene Chemical compound C1=CC=C2C(CCl)=CC=CC2=C1CCl HJTAZXHBEBIQQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Natural products N=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-2-hydroxyacetic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CNC(=O)NC1=O HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC1=CNC(=O)NC1=O SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVBOROZXXYRWJL-UHFFFAOYSA-N 2-[(4-oxo-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-5-yl)methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC1=CNC(=S)NC1=O SVBOROZXXYRWJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFJOIPOPUJUMI-KWXKLSQISA-N 2-[2,2-bis[(9z,12z)-octadeca-9,12-dienyl]-1,3-dioxolan-4-yl]-n,n-dimethylethanamine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCCC1(CCCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)OCC(CCN(C)C)O1 LRFJOIPOPUJUMI-KWXKLSQISA-N 0.000 description 1
- XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 2-dimethylamino-6-hydroxypurine Chemical compound N1C(N(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-4-amino-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC(=O)C1(N)NC(=O)NC=C1 GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 5-(methylaminomethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CNCC1=CNC(=O)NC1=O MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 5-[(methoxyamino)methyl]-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CONCC1=CNC(=S)NC1=O WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFGDUDUEDQSSKF-UHFFFAOYSA-N 5-butyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CCCCC1=CNC(=O)NC1=O CFGDUDUEDQSSKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AILRADAXUVEEIR-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-4-n-(2-dimethylphosphorylphenyl)-2-n-[2-methoxy-4-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidin-1-yl]phenyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound COC1=CC(N2CCC(CC2)N2CCN(C)CC2)=CC=C1NC(N=1)=NC=C(Cl)C=1NC1=CC=CC=C1P(C)(C)=O AILRADAXUVEEIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHIULBJJKFDJPR-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CCC1=CNC(=O)NC1=O RHIULBJJKFDJPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound COC1=CNC(=O)NC1=O KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCRCBPQJIOLDSS-UHFFFAOYSA-N 5-pentyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CCCCCC1=CNC(=O)NC1=O QCRCBPQJIOLDSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHEKLAXXCHLMNM-UHFFFAOYSA-N 5-propyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CCCC1=CNC(=O)NC1=O JHEKLAXXCHLMNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLUDYDNNASPOEE-UHFFFAOYSA-N 6-(aziridin-1-yl)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound C1=CNC(=O)N=C1N1CC1 PLUDYDNNASPOEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRDFPHCRHWMZJL-UHFFFAOYSA-N 6-(methylamino)-7,9-dihydropurin-8-one Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1NC(O)=N2 WRDFPHCRHWMZJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZJGCEGNCSGRBI-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-ethyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CCC1=CNC(=O)N=C1N CZJGCEGNCSGRBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHAZIWURUZYEQM-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-pentyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CCCCCC1=CNC(=O)N=C1N QHAZIWURUZYEQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJPWPQVMVIQVRH-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-propyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CCCC1=CNC(=O)N=C1N OJPWPQVMVIQVRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 7-cyclopentyl-n,n-dimethyl-2-[(5-piperazin-1-ylpyridin-2-yl)amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide Chemical compound N1=C2N(C3CCCC3)C(C(=O)N(C)C)=CC2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-2,8-diamine Chemical compound NC1=NC=C2NC(N)=NC2=N1 VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000002016 Adenosine monophosphate deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101800002011 Amphipathic peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000473391 Archosargus rhomboidalis Species 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006935 Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034808 CCAAT/enhancer-binding protein alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 101100189913 Caenorhabditis elegans pept-1 gene Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058892 Carnitine deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010050215 Carnitine palmitoyltransferase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000003904 Caveolin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000268 Caveolin 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000015374 Central core disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003728 Centronuclear myopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- BHYOQNUELFTYRT-UHFFFAOYSA-N Cholesterol sulfate Natural products C1C=C2CC(OS(O)(=O)=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 BHYOQNUELFTYRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 1
- 229930182819 D-leucine Natural products 0.000 description 1
- 125000003301 D-leucyl group Chemical group N[C@@H](C(=O)*)CC(C)C 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- HAIWUXASLYEWLM-UHFFFAOYSA-N D-manno-Heptulose Natural products OCC1OC(O)(CO)C(O)C(O)C1O HAIWUXASLYEWLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 108700043208 Dimauro disease Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000037149 Facioscapulohumeral dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000001441 Familial Periodic Paralyses Diseases 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- 208000003790 Foot Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000033777 Gallbladder neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009119 Giant Axonal Neuropathy Diseases 0.000 description 1
- LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Cys Chemical group NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 208000006562 Glycogen Storage Disease Type VII Diseases 0.000 description 1
- 208000032000 Glycogen storage disease due to muscle glycogen phosphorylase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000031926 Glycogen storage disease due to muscle phosphofructokinase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010018462 Glycogen storage disease type V Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000945515 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001032345 Homo sapiens Interferon regulatory factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101001018026 Homo sapiens Lysosomal alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000780643 Homo sapiens Protein argonaute-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102100038069 Interferon regulatory factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 206010022562 Intermittent claudication Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- HSNZZMHEPUFJNZ-UHFFFAOYSA-N L-galacto-2-Heptulose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(=O)CO HSNZZMHEPUFJNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 1
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 1
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 1
- 239000005536 L01XE08 - Nilotinib Substances 0.000 description 1
- 239000002145 L01XE14 - Bosutinib Substances 0.000 description 1
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 description 1
- 239000002137 L01XE24 - Ponatinib Substances 0.000 description 1
- 239000002177 L01XE27 - Ibrutinib Substances 0.000 description 1
- 102100022745 Laminin subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 201000009342 Limb-girdle muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 1
- MYZMQWHPDAYKIE-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MYZMQWHPDAYKIE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 208000009564 MELAS Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 206010068836 Metabolic myopathy Diseases 0.000 description 1
- 108700021757 Minicore Myopathy with External Ophthalmoplegia Proteins 0.000 description 1
- 206010058799 Mitochondrial encephalomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000002169 Mitochondrial myopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000001087 Miyoshi muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000009376 Miyoshi myopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036572 Myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 206010028643 Myopathy endocrine Diseases 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034965 Nemaline Myopathies Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 201000009110 Oculopharyngeal muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000008267 Peanut Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000013234 Pearson syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700010203 Phosphoglycerate Kinase 1 Deficiency Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034207 Protein argonaute-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- HAIWUXASLYEWLM-AZEWMMITSA-N Sedoheptulose Natural products OC[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@](O)(CO)O1 HAIWUXASLYEWLM-AZEWMMITSA-N 0.000 description 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101150045565 Socs1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043341 Socs3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032978 Structural Congenital Myopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000058018 Suppressor of Cytokine Signaling 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700027336 Suppressor of Cytokine Signaling 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000058015 Suppressor of Cytokine Signaling 3 Human genes 0.000 description 1
- 108700027337 Suppressor of Cytokine Signaling 3 Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035954 Thomsen and Becker disease Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 206010043540 Thromboangiitis obliterans Diseases 0.000 description 1
- 201000000509 Tibial muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000035957 Vocal cord and pharyngeal distal myopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 1
- XMIJRFQYCUBWFZ-UHFFFAOYSA-N [2-[(dimethylamino)methyl]-1-ethylcyclohexyl] benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OC1(CC)CCCCC1CN(C)C XMIJRFQYCUBWFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 1
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229960001611 alectinib Drugs 0.000 description 1
- KDGFLJKFZUIJMX-UHFFFAOYSA-N alectinib Chemical compound CCC1=CC=2C(=O)C(C3=CC=C(C=C3N3)C#N)=C3C(C)(C)C=2C=C1N(CC1)CCC1N1CCOCC1 KDGFLJKFZUIJMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-STGXQOJASA-N alpha-D-lyxopyranose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-STGXQOJASA-N 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940045988 antineoplastic drug protein kinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- GOLCXWYRSKYTSP-UHFFFAOYSA-N arsenic trioxide Inorganic materials O1[As]2O[As]1O2 GOLCXWYRSKYTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002594 arsenic trioxide Drugs 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 229960002707 bendamustine Drugs 0.000 description 1
- YTKUWDBFDASYHO-UHFFFAOYSA-N bendamustine Chemical compound ClCCN(CCCl)C1=CC=C2N(C)C(CCCC(O)=O)=NC2=C1 YTKUWDBFDASYHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960003736 bosutinib Drugs 0.000 description 1
- UBPYILGKFZZVDX-UHFFFAOYSA-N bosutinib Chemical compound C1=C(Cl)C(OC)=CC(NC=2C3=CC(OC)=C(OCCCN4CCN(C)CC4)C=C3N=CC=2C#N)=C1Cl UBPYILGKFZZVDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950004272 brigatinib Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000005233 cap myopathy Diseases 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 201000007303 central core myopathy Diseases 0.000 description 1
- 229960001602 ceritinib Drugs 0.000 description 1
- VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N ceritinib Chemical compound CC=1C=C(NC=2N=C(NC=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)C(C)C)C(Cl)=CN=2)C(OC(C)C)=CC=1C1CCNCC1 VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- BHYOQNUELFTYRT-DPAQBDIFSA-N cholesterol sulfate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 BHYOQNUELFTYRT-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000019113 chromatin silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010902 chronic myelomonocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- 201000006815 congenital muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 description 1
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960002465 dabrafenib Drugs 0.000 description 1
- BFSMGDJOXZAERB-UHFFFAOYSA-N dabrafenib Chemical compound S1C(C(C)(C)C)=NC(C=2C(=C(NS(=O)(=O)C=3C(=CC=CC=3F)F)C=CC=2)F)=C1C1=CC=NC(N)=N1 BFSMGDJOXZAERB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M didecyl(dimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 208000008570 facioscapulohumeral muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010016208 familial periodic paralysis Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 201000004534 glycogen storage disease V Diseases 0.000 description 1
- 208000036243 grade 1/2 gallbladder neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 102000045921 human GAA Human genes 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960001507 ibrutinib Drugs 0.000 description 1
- XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N ibrutinib Chemical compound C1=2C(N)=NC=NC=2N([C@H]2CN(CCC2)C(=O)C=C)N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000023692 inborn mitochondrial myopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000008319 inclusion body myositis Diseases 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 208000021156 intermittent vascular claudication Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- DJLUSNAYRNFVSM-UHFFFAOYSA-N methyl 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)acetate Chemical compound COC(=O)CC1=CNC(=O)NC1=O DJLUSNAYRNFVSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetate Chemical compound COC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 201000002697 mitochondrial DNA depletion syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000012268 mitochondrial disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010924 multiminicore myopathy Diseases 0.000 description 1
- 229940087004 mustargen Drugs 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002151 myoclonic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002086 myofibrillar myopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N n-(3-methylbut-3-enyl)-2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(NCCC(C)=C)=C2NC=NC2=N1 XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZQMZXGTZAPBAK-UHFFFAOYSA-N n-(3-methylbutyl)-7h-purin-6-amine Chemical compound CC(C)CCNC1=NC=NC2=C1NC=N2 FZQMZXGTZAPBAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 229960001346 nilotinib Drugs 0.000 description 1
- HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N nilotinib Chemical compound C1=NC(C)=CN1C1=CC(NC(=O)C=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)=CC(C(F)(F)F)=C1 HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- YHIXOVNFGQWPFW-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-amine;hydrobromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[NH3+] YHIXOVNFGQWPFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940127084 other anti-cancer agent Drugs 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960004390 palbociclib Drugs 0.000 description 1
- AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N palbociclib Chemical compound N1=C2N(C3CCCC3)C(=O)C(C(=O)C)=C(C)C2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 201000010853 peanut allergy Diseases 0.000 description 1
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000030613 peripheral artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229960001131 ponatinib Drugs 0.000 description 1
- PHXJVRSECIGDHY-UHFFFAOYSA-N ponatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC(C(=C1)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C)C(C#CC=2N3N=CC=CC3=NC=2)=C1 PHXJVRSECIGDHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000001749 primary amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 239000003909 protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229950003687 ribociclib Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- HSNZZMHEPUFJNZ-SHUUEZRQSA-N sedoheptulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO HSNZZMHEPUFJNZ-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004096 skeletal muscle tissue growth Effects 0.000 description 1
- 239000008137 solubility enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 208000016505 systemic primary carnitine deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012033 transcriptional gene silencing Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960003862 vemurafenib Drugs 0.000 description 1
- GPXBXXGIAQBQNI-UHFFFAOYSA-N vemurafenib Chemical compound CCCS(=O)(=O)NC1=CC=C(F)C(C(=O)C=2C3=CC(=CN=C3NC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1F GPXBXXGIAQBQNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/641—Branched, dendritic or hypercomb peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
- A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本発明は、核酸などの治療用分子を哺乳動物細胞、並びにヒト及び動物の身体に送達することができる脂質/デンドリマー系を提供する。例えば、本発明は、リンパ系器官、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに腫瘍組織、肝臓、及び肺への核酸の有効な送達を可能にする系を提供する。DNA及びRNAの送達が、提供される。特に、本発明の系は、mRNAを送達することができる。
Description
本発明は、核酸などの治療用分子を哺乳動物細胞、並びにヒト及び動物の身体に送達することができる組成物に関する。特定の細胞型への送達、例えば、リンパ組織及び循環中の白血球への送達が示されている。特定の器官及び組織への送達も示されている。例えば、本発明は、脾臓、リンパ系器官、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに肺、腫瘍組織、心臓、骨格筋、脂肪組織、脳、肝臓、及び腎臓への核酸の有効な送達を可能にする組成物を提供する。DNA及びRNAの送達が、提供される。特に、mRNAの送達が示されている。
ヘルスケアを変えるための次世代の精密医薬品としての核酸療法の完全な可能性を実現するために、薬物送達の重要な課題に対処する必要がある。現在のウイルス及び非ウイルスベクタープラットフォームの限界は、開発を著しく妨げており、多くの療法は、オフターゲット効果、免疫系の活性化、及び大規模製造の困難に起因して、臨床転換段階で失敗している。
核酸のインビボ送達の状況において、ウイルス由来の薬剤は、最も強力なベクターであり、臨床において非常に進歩しているものもある(Sheridan et al,2011)。特に、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus、AAV)は、インビボ送達のための有効な系である(Wang et al,2019)。しかしながら、このような系の適用は、5kb未満のDNAを輸送することができるのみであり、RNA又はより大きなDNAを輸送することができないので、限定される。更に、ウイルスベクターの進歩にもかかわらず、潜在的なランダム挿入及び免疫毒性のような問題が、この種の核酸送達ベクターの使用に関連している。例えば、AAV送達は、特に高用量が肝臓以外の標的組織に必要とされる場合、高度に免疫原性であり得る。AAV送達系はまた、反復投与について制限されている。患者は、典型的には、AAV送達系に対する免疫を獲得し、反復投与が不可能となる。最後に、AAV送達系の製造は高価であり、大規模かつ適正製造規範(Good Manufacturing Practice、GMP)グレードで製造することが困難である。
ウイルス系の欠点を考慮して、インビボで細胞及び組織に核酸を送達するための非ウイルスベクターが調査されている。siRNA及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide、ASO)などのより小さな核酸の送達のために、様々な送達技術が開発されている。これらには、siRNA又はASOが抗体又はリガンドにコンジュゲートしているバイオコンジュゲートオリゴヌクレオチド送達系が含まれる(Benizri et al,2019)。しかしながら、siRNA及びASO療法は、遺伝子発現ではなく、遺伝子サイレンシング又はエクソンスキッピングのみを達成することができる。多くの疾患について、DNA又はmRNAを有する機能的遺伝子を発現することは有利である。プラスミドDNA又はmRNAなどの大きな遺伝子ペイロードの有効な送達のためにコンジュゲート系を適用することは困難である。プラスミドDNA又はmRNAは、負に荷電した大きな分子であり、負に荷電した細胞膜を容易に通過することができない。送達ビヒクルがそれらをカプセル化し、有効な送達のために電荷を中和する場合に有用である。
非ウイルス送達ビヒクルを封入するものとしての脂質ナノ粒子(lipid nanoparticle、LNP)は、例えば、COVID-19ワクチンにおけるmRNA送達に使用されている(Qui et al,2021)。ウイルスと戦うための免疫系を育てるには、比較的少数の免疫細胞及び筋肉細胞を注射部位に局所的にトランスフェクトすれば十分である。したがって、RNAベースのCOVID-19ワクチンが筋肉内投与される。しかしながら、広範な疾患は、特定の型の多くの細胞がトランスフェクトされる場合にのみ効果的に治療することができ、静脈内注射が必要となり得る。臨床で現在使用されているLNPの表面特性は、静脈内投与された場合に肝臓を標的とするのにそれらを良好に適合させる。しかしながら、現在臨床で使用されているLNPは、多くの他の組織を標的とするのにはあまり適していない。
例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(dioleoylphosphatidylethanolamine、DOPE)などの非荷電脂質及び/又は1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンクロリド(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride、DOTAP)及びN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride、DOTMA)などのカチオン性脂質を含む、様々なリポソームベースの系も同様に調査されている(Braum,2019、Ren et al,2000)。同様のリポソームが核酸送達のために臨床で使用されており、中程度の有効性を示している。
脂質ベースのベクターへのペプチドの付加が調査されている。ペプチド/脂質ハイブリッド系では、ペプチド及び脂質が核酸と会合して、細胞によって内在化され得るナノ粒子を形成する。ペプチド要素は、直鎖状(Kwok et al,2016)であってもよく、ペプチドデンドリマー(Kwok et al,2013)などの分岐状であってもよい。しかしながら、ペプチド/脂質ハイブリッド系に対するこの以前の研究は、インビボ条件とは実質的に異なる無血清インビトロ条件において、二本鎖プラスミドDNA(plasmid DNA、pDNA)及び短鎖干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)に対してのみ実施された。この系がインビボでの核酸送達のために使用され得るかどうかは明らかではなかった。ペプチドデンドリマー/脂質ナノ粒子を使用する短い一本鎖オリゴヌクレオチドの送達のみが、インビボで報告されており(Saher et al,2018、Saher et al,2019)、ASO単独と比較して、ASO肝臓送達における20~30%の低い増加が観察されている。このデータから、ペプチドデンドリマー系は、mRNAなどの更に大きな核酸をインビボで組織に送達することができない可能性があると結論付けることができる。mRNAなどの長い核酸の送達は、ペプチドデンドリマー/脂質ハイブリッド系を用いて以前にインビボで実証されたことがない。
本発明は、上記の考慮事項に鑑みてなされたものである。
核酸療法の開発は、効率的な核酸送達に依存する。本発明者らは、ペプチドデンドリマーを使用して、核酸送達のためのフレームワークを開発した。これらのデンドリマーは、デンドリマー分子内で分岐単位として作用する「分岐残基」の間に1、2、3、又は4個のアミノ酸残基を示す分岐ペプチドである。本発明は、驚くべきことに、より大きな核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ASOよりも大きい)を送達するのに有効である。ASOなどの一部のより小さな核酸は、ベクター系がなくても細胞に容易に取り込まれるが、本発明の組成物は、mRNAなどのより大きな核酸の効果的な送達を可能にする。これは、ウイルス送達ベクターを必要とすることなく、CRISPR媒介性遺伝子編集及び関連技術などの分野を臨床応用に開放する。
肝臓をバイパスする臨床mRNA又はCRISPRカセット(すなわち、sgRNA及びCas9 mRNA)送達系が依然として欠如しているので、組織特異的mRNA送達系を特異的に開発することは、著しい進歩を意味する。本発明は、細胞中のCRISPRカセット及びmRNAを様々な組織、特に肺及び免疫細胞に富む組織(脾臓、リンパ節、及び骨髄を含む)に効果的に送達することができる。これにより、肝外組織に対するmRNA及びCRISPR療法の開発が可能になる。免疫細胞、更には、単球、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞を含む骨髄細胞にmRNAを送達することができることにより、この技術は、全てのがん型(固形腫瘍、及び骨髄異形成症候群(Myelodysplastic Syndrome、MDS)及び慢性骨髄単球性白血病(Chronic Myelomonocytic Leukemia、CMML)などの血液がん、自己免疫疾患(例えば、リウマチ性関節炎、クローン病、ブドウ膜炎、炎症性大腸炎)、並びにゴーシェ病などの他の免疫細胞関連障害を含む、を治療するために開発されることが可能になる。本発明はまた、mRNAが肺及び/又は免疫細胞に送達されることを可能にし、肺関連疾患(例えば、嚢胞性線維症及び慢性閉塞性肺疾患)の治療を可能にする。
本発明者らはまた、それらのデンドリマーベースの系が驚くほど汎用性であることを見出した。DNA及びRNA分子は、ある範囲の第1世代、第2世代、及び第3世代デンドリマーを使用して送達することができる。一例では、脂質と会合したG1,2,3-KLデンドリマー(「第3世代」デンドリマー)などのデンドリマーに基づくベクター系は、Lipofectamine 2000などのいくつかの主要な市販試薬と比較して、DNAの細胞トランスフェクションを6~10倍改善することができる。別の例では、脂質と会合したG1,2-RL,3-LRデンドリマー(「第3世代」デンドリマー)などのデンドリマーに基づくベクター系は、Lipofectamine 2000などのいくつかの主要な市販試薬と比較して、mRNAなどの細胞トランスフェクション核酸を10倍改善することができる。更に、特定の器官及び組織を標的とすることができる。以下により詳細に記載されるように、本発明者らは、デンドリマーベースの系が、驚くほど頑強かつ汎用性であり、血清の存在下、インビトロで高い活性を示し、インビボで予想外の組織標的化特性を示すことを見出した。DNA及びRNAの効果的な送達を、以下で考察する。
本発明者らは、DNA送達のために、G1,2,3-KL及びG1,2,3-RL(「第3世代」デンドリマー)並びにある程度までG1,2-KL、G1,2-RL(両方とも「第2世代」デンドリマー)が、血清の存在下でHeLa及びNeuro2A細胞をトランスフェクトすることができることを見出した。(血清成分は、アルブミンなどの成分がカチオン性製剤に干渉し得るので、インビボDNA送達、特に全身送達に関する課題を示す)。この予想外の発見により、本発明者らは、細胞侵入の根底にある機構を調査し、このベクター系の能力をインビボで評価するに至った。驚くべきことに、G1,2,3-RLベースのベクターは、全身送達後の特定の組織への機能的核酸の有効な送達を媒介することが見出された。肝臓及び骨格筋は、高度に標的となる。エンドサイトーシス経路分析により、G1,2,3-RL DNA複合体がクラスリン、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、及びマクロピノサイトーシスの両方を介してDNAを送達することが示される。
本発明者らは、mRNA送達のために、第1又は第2世代デンドリマー(例えば、RHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL、2-LR)が、細胞を効果的にトランスフェクトし得、第3世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介し得ることを見出した(血清を含む完全成長培地条件下でのHeLa細胞のトランスフェクションの有効性を示す図28Aを参照されたい)。これは、RNA送達のためのハイブリッド系の特定の汎用性を示す。
本発明において使用されるデンドリマーは、第1、第2、又は第3世代ペプチドデンドリマーであり、これは、そのペプチドデンドリマーが、リジンなどの「分岐」残基間に散在するペプチドモチーフ(典型的にはジペプチドモチーフである)の最大3つの「層」を有することを意味する。第1世代デンドリマーは、N末端からC末端への配向で示され、Lysを分岐単位とする以下の構造を有する。
(N末端-Pep1)2-Lys-(コア)-(C末端)
(N末端-Pep1)2-Lys-(コア)-(C末端)
第2世代デンドリマーは、N末端からC末端への配向で示され、Lysを分岐単位とする以下の構造を有する。
(N末端-Pep2)4-Lys2-(Pep1)2-Lys-(コア)-(C末端)
(N末端-Pep2)4-Lys2-(Pep1)2-Lys-(コア)-(C末端)
第3世代デンドリマーは、N末端からC末端への配向で示され、Lysを分岐単位とする以下の構造を有する。
(N末端-Pep3)8-Lys4-(Pep2)4-Lys2-(Pep1)2-Lys-(コア)-(C末端)
(N末端-Pep3)8-Lys4-(Pep2)4-Lys2-(Pep1)2-Lys-(コア)-(C末端)
第3世代デンドリマーは、図31において図式的に表される(左側にN末端及び右側にC末端を有する)。
丸は、コア配列を表す。各三角は、リジンなどの分岐残基を表す。各長方形は、ペプチドモチーフを表す。第3世代デンドリマーの第1の層には2つのペプチドモチーフがあり、第2の層には4つのペプチドモチーフがあり、第3の層には8つのペプチドモチーフがある。N末端及びC末端は、本明細書で考察されるように、更なる化学モチーフで誘導体化されてもよい。例えば、誘導体化されていない実施形態では、C末端はカルボン酸であるが、他の実施形態では、デンドリマーを合成するために使用される化学経路の結果として、C末端は、例えば、一級アミド基であるCONH2を(COOHの代わりに)含むように誘導体化される。標的化部分(例えば、抗体、ペプチド基、糖基、及び/又は脂質鎖)などの機能的に重要な誘導体化も想定され、これらの部分は、N末端及び/若しくはC末端に、又はデンドリマーに沿った他の位置に結合することができる。
本明細書に記載されているように、デンドリマーは、第1、第2、又は第3世代であり得る。これは、構造的に次のように定義することができる。第1世代デンドリマーは、コアペプチド配列と、第1の分岐残基と、2つの第1のペプチドモチーフと、を含む。2つの第1のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。第2世代デンドリマーは、2つの第2の分岐残基(例えば、リジン)及び4つの第2のペプチドモチーフを更に含み、第2の分岐残基のうちの一方は、第1のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の第2の分岐残基は、他方の第1のペプチドモチーフと共有結合し、各第2の分岐残基は、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合する。4つの第2のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。第3世代デンドリマーは、4つの第3の分岐残基(例えば、リジン)及び8つの第3のペプチドモチーフを更に含み、各第2のペプチドモチーフは、各第3の分岐残基が1つの第2のペプチドモチーフと共有結合するように、第3の分岐残基のうちの1つとそれぞれ共有結合し、各第3の分岐残基は、2つの第3のペプチドモチーフと共有結合する。8つの第3のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、存在する場合、(1)塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、リジン(K)又はアルギニン(R)又はヒスチジン(H)、(2)酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)、(3)非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、ベータ-アラニン(B)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、アミノヘキサン酸(X)、及びシステイン(C)、並びに(4)非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、スレオニン(T)、及びチロシン(Y)を含み得る。
好ましいデンドリマーを以下の表2に示す。特定の例を特に説明する。例えば、各ペプチドモチーフがArg-Leu(RL)ジペプチドであるデンドリマーでは、この構造は、G1-RL、G1,2-RL、及びG1,2,3-RLと表すことができる。各ペプチドモチーフがLys-Leu(KL)ジペプチドであるデンドリマーでは、この構造は、G1-KL、G1,2-KL、及びG1,2,3-KLと表される。各ペプチドモチーフがLeu-Arg(LR)ジペプチドであるデンドリマーでは、この構造は、G1-LR、G1,2-LR、及びG1,2,3-LRと表される。
(「G1」、「G2」、及び「G3」は、それぞれ、第1、第2、及び第3の層の「世代1」、「世代2」、及び「世代3」ペプチドモチーフを指す。各アミノ酸残基は、L-アミノ酸又はD-アミノ酸であり得る。D-アミノ酸は、一文字コードの小文字を使用して示され得る。あるいは、各アミノ酸がD-アイソフォームであるデンドリマーは、デンドリマーの短縮形表記の前に「D-」を先行させて書くことができる。)
したがって、第1の態様では、本発明は、医薬における使用のための組成物であって、第1、第2、又は第3世代ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む、組成物を提供する。組成物は、核酸及び脂質を更に含む。ペプチドデンドリマーは、少なくとも、コアペプチド配列と、第1の分岐残基と、2つの第1のペプチドモチーフと、を含む。分岐残基は、リジン、2,4-ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であってもよい。核酸は、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも100ヌクレオチドの核酸を含む。
第2の態様では、本発明は、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む組成物であって、ペプチドデンドリマーが、少なくとも、コアペプチド配列と、第1の分岐残基と、2つの第1のペプチドモチーフと、を含む、組成物を提供する。分岐残基は、リジン、2,4-ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であってもよい。核酸は、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも100ヌクレオチドの一本鎖核酸を含む。
第3の態様では、本発明は、核酸の送達を必要とする対象の細胞内へ核酸を送達する方法であって、薬学的有効量の組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。組成物は、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含み、ペプチドデンドリマーは、少なくとも、コアペプチド配列と、第1の分岐残基と、2つの第1のペプチドモチーフと、を含む。分岐残基は、リジン、2,4-ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であってもよい。核酸は、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも100ヌクレオチドの核酸を含む。核酸は、一本鎖であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸は、RNAである。例えば、RNAは、mRNA、ssRNA、dsRNA、sgRNA、crRNA、tracrRNA、lncRNA、siRNA、saRNA、及び/又は自己増幅RNAから選択され得る。好ましくは、RNAは、mRNAである。
いくつかの実施形態では、核酸は、DNAである。例えば、DNAは、ssDNA、dsDNA、プラスミド、及び/又はcDNAを含んでもよい。
疑義を避けるために、組成物は、2つ以上の核酸(例えば、2つ以上のタイプのRNA分子)を含んでもよい。同様に、組成物は、2つ以上の脂質を含んでもよい。組成物は、2つ以上のペプチドデンドリマーを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、RNA核酸及びDNA核酸を含む。RNA核酸及びDNA核酸は、単一核酸分子の一部であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸は、修飾核酸を含む。例示的な核酸修飾が、本明細書に記載される。
好ましくは、核酸は、導入遺伝子をコードし、標的細胞において導入遺伝子を発現することができる。導入遺伝子は、タンパク質又はペプチドであってもよい。更に又はあるいは、核酸は、内因性遺伝子の発現又は活性を調節することができる。調節は、遺伝子の発現及び/若しくは遺伝子の更なるコピーの外因性発現の増加であり得るか、又は調節は、遺伝子の発現の減少であり得る。
いくつかの実施形態では、調節された内因性遺伝子は、タンパク質又はペプチドを発現する遺伝子である。
いくつかの実施形態では、タンパク質又はペプチドは、抗原、ホルモン、受容体、キメラ抗原受容体、転写因子、及び/又はサイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、腫瘍抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ワクチンとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、核酸は、自己増幅RNAを含むか又はコードする。
いくつかの実施形態では、使用は、対象における遺伝性障害の治療を含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、対象において非機能的であるか、下方制御されているか、不活性であるか、又は損なわれている遺伝子の機能的バージョンを発現する。
いくつかの実施形態では、核酸は、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系の1つ以上の成分をコードする、かつ/又は含む。例えば、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系は、CRISPR/Cas系であってもよい。核酸は、Casタンパク質若しくはペプチドをコードしてもよく、かつ/又はsgRNA、crRNA、及び/若しくはtracrRNAを含む。核酸は、Casタンパク質又はペプチドをコードするmRNA、及びsgRNAを含むRNA配列を含んでもよい。組成物は、Casタンパク質又はペプチドをコードするmRNA、及びsgRNAを含む別のRNAを(別々の分子として)含み得る。いくつかの実施形態では、sgRNA、crRNA、tracrRNA、及びCasタンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上が、存在する場合、単一核酸の一部である。いくつかの実施形態では、sgRNA、crRNA、tracrRNA、及びCasタンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上が、存在する場合、2つ以上の核酸上に存在する。
いくつかの実施形態では、組成物は、脾臓、リンパ組織、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに肺、腫瘍組織、心臓、骨格筋、脂肪組織、脳、肝臓、及び腎臓を標的とする。
いくつかの実施形態では、組成物は、脾臓、リンパ組織、肺、及び/又は骨を標的とする。これらの実施形態では、核酸は、RNA、例えば、mRNAであってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸は、白血球、例えば、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、若しくは単球;リンパ節組織細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、筋細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、幹細胞、及び/又は腫瘍細胞である細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、組成物は、核酸が免疫細胞に送達されるように、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、核酸は、標的細胞において免疫分子又は転写因子を発現する。免疫分子は、T細胞受容体、キメラ抗原受容体、サイトカイン、デコイ受容体、抗体、共刺激受容体、共刺激リガンド、チェックポイント阻害剤、免疫コンジュゲート、又は腫瘍抗原であってもよい。
いくつかの実施形態では、細胞は、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、単球、骨髄由来サプレッサ細胞(myeloid derived suppressor cell、MDSC)、腫瘍関連マクロファージ、又は腫瘍関連好中球である。
いくつかの実施形態では、核酸は、RNA、例えば、mRNAである。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象におけるがんを治療する方法における使用のためのものである。がんは、血液がん、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、若しくは骨髄異形成症候群;又は肺がん、噴門がん、肉腫、若しくは肝臓がんであってもよい。治療はまた、抗がん剤の投与を含んでもよい。がんは、非小細胞肺がん、進行性黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胆管がん(Bile duct cancer)(胆管がん(Cholangiocarcinoma))、胆のうがん、神経内分泌腫瘍、肝細胞がん、結腸直腸がん、膵臓がん、及び固形腫瘍であってもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、肺疾患を治療する方法における使用のためのものである。例えば、組成物は、慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease、COPD)又は嚢胞性線維症(cystic fibrosis、CF)の治療における使用のためのものであってもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象における自己免疫疾患を治療する方法における使用のためのものである。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象におけるポンペ病、筋肉消耗性疾患、ミオパチー、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における使用のためのものである。これらの実施形態では、核酸は、DNAであってもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象における糖尿病性四肢虚血などの四肢虚血のための治療における使用のためのものであり、導入遺伝子が、肝細胞増殖因子(hepatocyte growth factor、HGF)、血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、VEGF)及び/又は線維芽細胞増殖因子(Fibroblast growth factor、FGF)である。
いくつかの実施形態では、2つの第1のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、2つの第2の分岐残基(例えば、リジン)及び4つの第2のペプチドモチーフを更に含み、第2の分岐残基のうちの一方は、第1のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の第2の分岐残基は、他方の第1のペプチドモチーフと共有結合し、各第2の分岐残基は、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合する。
いくつかの実施形態では、4つの第2のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、4つの第3の分岐残基(例えば、リジン)及び8つの第3のペプチドモチーフを更に含み、各第2のペプチドモチーフは、各第3の分岐残基が1つの第2のペプチドモチーフと共有結合するように、第3の分岐残基のうちの1つとそれぞれ共有結合し、各第3の分岐残基は、2つの第3のペプチドモチーフと共有結合する。
いくつかの実施形態では、8つの第3のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。
各ペプチドモチーフは、独立して、天然に存在するL-若しくはD-アミノ酸及び/又は天然に存在しないL-若しくはD-アミノ酸、例えば、ベータ-アラニン(B)又はアミノヘキサン酸(X)を含む。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフは、塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、コア配列は、ヒスチジンなどのイオン化可能な基を有するアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフは、非極性側鎖を有するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフは、酸性側鎖を有するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフは、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフ(存在する場合)は、a)アルギニン(R)若しくはリジン(K);及び/又はb)ロイシン(L)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、若しくはイソロイシン(I)を含む。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフは、ロイシン(L)及び/又はアルギニン(R)残基を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、表2に記載される構造を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、組織及び/又は細胞標的化モチーフを更に含む。組織又は細胞標的化モチーフは、筋標的化モチーフ、例えば、GAASSLNIA(配列番号1)、インテグリン標的化モチーフ、例えば、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)、又は化学修飾、例えば、マンノース糖鎖付加を含む化学修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、細胞透過性ペプチドを更に含む。細胞透過性ペプチドは、TAT由来配列を含んでもよい。細胞透過性ペプチドは、ペプチド配列XRXRRBRRXRRBRXB(配列番号2)(式中、Xは6-アミノヘキサン酸であり、Bはベータ-アラニンである)を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、アルキル鎖、アルケニル鎖、抗体若しくはその断片、糖、及び/又は脂肪酸を更に含む。アルキル鎖又はアルケニル鎖は、例えば、ペプチドデンドリマーのC末端で、コアペプチド配列にコンジュゲートしていてもよい。あるいは、アルキル鎖又はアルケニル鎖は、ペプチドデンドリマーのN末端にコンジュゲートしていてもよい。
いくつかの実施形態では、アルキル鎖又はアルケニル鎖は、約5個の炭素~約50個の炭素、好ましくは約12個~約30個の炭素を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ペプチドデンドリマーのC末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む。他の実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ペプチドデンドリマーのN末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む。
いくつかの実施形態では、組成物の脂質は、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、及び/又はイオン化可能な脂質を含む。
いくつかの実施形態では、組成物の脂質は、飽和脂肪酸を含む。更に又はあるいは、組成物の脂質は、不飽和脂肪酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質は、1、2、3、4、5、又は6個の脂肪酸鎖を含む。好ましくは、脂質は、2、3、4、又は6個の脂肪酸鎖を含む。
いくつかの実施形態では、脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及び/又はN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及びジオレオイルホスファチジルグリセロール(dioleoylphosphatidylglycerol、DOPG)を含む。
いくつかの実施形態では、N/P比は、約0.01:1~100:1である。例えば、N/P比は、約0.05:1~50:1又は約0.1:1~30:1であってもよい。0.2:1~25:1及び0.5:1~20:1などのより狭い範囲も想定される。
いくつかの実施形態では、N/P比は、1:1~50:1である。いくつかの実施形態では、対象への投与後に、肝臓よりも脾臓及び/又はリンパ節において、より高い割合の組成物が観察される。
いくつかの実施形態では、N/P比は、0.01:1~1:1である。いくつかの実施形態では、対象への投与後に、肝臓よりも肺、脾臓、及び/又はリンパ節において、より高い割合の組成物が観察される。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質は、正に荷電した粒子を形成する。
他の実施形態では、ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質は、負に荷電した粒子又は中性電荷を有する粒子を形成する。
いくつかの実施形態では、標的組織又は標的細胞への核酸の送達は、脂質ベースの核酸送達系を使用した同じ組織又は細胞型への同じ核酸の送達と比較して、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、75%、85%、90%、95%、100%増加する。標的細胞又は標的組織は、本明細書で定義される細胞型又は臓器/組織である。例えば、標的組織は、脾臓、リンパ系器官、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに肺、腫瘍組織、心臓、骨格筋、脂肪組織、脳、肝臓、及び腎臓であってもよい。脂質ベースの核酸送達系は、DOTMA/DOPEであってもよい。
組成物は、対象に静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、皮内、又は腹腔内に投与することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、液体内に含まれる。他の実施形態では、組成物は、乾燥組成物、例えば、乾燥粉末として提供される。乾燥組成物は、凍結乾燥及び/又はフリーズドライ技術を使用して調製され得る。
特定の実施形態では、第3世代ペプチドデンドリマーは、第1のリジン残基及び2つの第1のペプチドモチーフと、2つの第2のリジン残基及び4つの第2のペプチドモチーフと、4つの第3のリジン残基及び8つの第3のペプチドモチーフと、第1のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含み、
(i)第1のリジン残基は、2つの第1のペプチドモチーフと共有結合し、2つの第1のペプチドモチーフは、それぞれ2つの第2のリジン残基と共有結合し、
(ii)各第2のリジン残基は、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合し、各第2のペプチドモチーフは、それぞれ、第3のリジン残基のうちの1つと共有結合し、
(iii)各第3のリジン残基は、第3のペプチドモチーフのうちの2つと共有結合し、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフは、独立して、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフである。第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、アルギニン(R)若しくはリジン(K);及び/又はb)ロイシン(L)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、若しくはイソロイシン(I)を含んでもよい。(「共有結合した」という用語は、いかなる介在原子も持たない、記載された部分間の直接共有結合を意味する。したがって、モノ-、ジ-、トリ-、又はテトラ-ペプチドモチーフのみが、第1のリジン残基と各第2のリジン残基との間に存在し、モノ-、ジ-、トリ-、又はテトラ-ペプチドモチーフのみが、各第2のリジン残基と各第3のリジン残基との間に存在する)。
(i)第1のリジン残基は、2つの第1のペプチドモチーフと共有結合し、2つの第1のペプチドモチーフは、それぞれ2つの第2のリジン残基と共有結合し、
(ii)各第2のリジン残基は、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合し、各第2のペプチドモチーフは、それぞれ、第3のリジン残基のうちの1つと共有結合し、
(iii)各第3のリジン残基は、第3のペプチドモチーフのうちの2つと共有結合し、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフは、独立して、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフである。第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、アルギニン(R)若しくはリジン(K);及び/又はb)ロイシン(L)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、若しくはイソロイシン(I)を含んでもよい。(「共有結合した」という用語は、いかなる介在原子も持たない、記載された部分間の直接共有結合を意味する。したがって、モノ-、ジ-、トリ-、又はテトラ-ペプチドモチーフのみが、第1のリジン残基と各第2のリジン残基との間に存在し、モノ-、ジ-、トリ-、又はテトラ-ペプチドモチーフのみが、各第2のリジン残基と各第3のリジン残基との間に存在する)。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、存在する場合、(1)塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、リジン(K)又はアルギニン(R)又はヒスチジン(H)、(2)酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)、(3)非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、ベータ-アラニン(B)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、アミノヘキサン酸(X)、及びシステイン(C)、並びに(4)非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、スレオニン(T)、及びチロシン(Y)を含み得る。
好ましくは、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも1つは、アルギニン(R)を含む。第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも2つは、アルギニン(R)を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの全てが、アルギニン(R)を含む。
好ましくは、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも1つは、ロイシン(L)を含む。第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも2つは、ロイシン(L)を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの全てが、ロイシン(L)を含む。
いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、ジペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、トリペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、テトラペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々は、独立して、モノ-、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフである。好ましくは、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも1つは、ロイシン(L)及びアルギニン(R)の両方を含むジペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも2つは、ロイシン(L)及びアルギニン(R)の両方を含むジペプチドモチーフである。特に好ましい実施形態では、各ペプチドモチーフは、ロイシン(L)及びアルギニン(R)の両方を含むジペプチドモチーフである。各アミノ酸残基は、独立して、L-アイソフォーム又はD-アイソフォームから選択される。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、表2に列挙されるペプチドデンドリマーのうちのいずれか1つから選択される。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1,2,3-RLであり、(RL)8(KRL)4(KRL)2K-コアを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1-LR,G2,3-RLであり、(RL)8(KRL)4(KLR)2K-コアを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1,2,3-rlであり、(rl)8(krl)4(krl)2k-コア(式中、「r」はD-アルギニンであり、TはD-ロイシンであり、「k」はD-リジンである)を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1,2-RL,G3-LRであり、(LR)8(KRL)4(KRL)2K-コアを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1,2-LR,G3-RLであり、(RL)8(KLR)4(KLR)2K-コアを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1,2,3-LRであり、(LR)8(KLR)4(KLR)2K-コアを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、RHCG1-Rであり、(R)2KRHC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、RHCG1,2-Rであり、(R)4(KR)2KRHC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、RHCG1-LRであり、(LR)2KRHC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、RHCG1-RL,2-LRであり、(LR)4(KRL)2KRHC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1,2-RL,3-LRであり、(LR)8(KRL)4(KRL)2KGSC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、RHCG1-RLRであり、(RLR)2KRHC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、RHCG1,2-RLRであり、(RLR)4(KRLR)2KRHC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1-LRLRであり、(LRLR)2KGSC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、RHCG1,2-RL,3-LRであり、(LR)8(KRL)4(KRL)2KRHC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、G1,2,3-RLであり、(RL)s(KRL)4(KRL)2KGSC-NH2を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、NTX1であり、(LR)8(KRL)4(KRL)2KGSCGAASSLNIAXRXRRBRRXRRBRXB-NH2(式中、X=6-アミノヘキサン酸及びB=ベータ-アラニン)を含む。
(「G1」は、第1の層の「世代1」ペプチドモチーフを指す。「G2」は、第2の層の「世代2」ペプチドモチーフを指す。「G3」は、第3の層の「世代3」ペプチドモチーフを指す。)
したがって、本発明は、医薬における使用のための、本明細書に記載される核酸と、脂質と、デンドリマーと、を含む、組成物を提供する。デンドリマーは、第1世代デンドリマー、又は第2世代デンドリマー、又は第3世代デンドリマーであってもよい。好ましくは、核酸の量(骨格中の1-荷電リン酸基の数Pによって測定される)に対するペプチドの量(ペプチド上の1+荷電窒素原子の数Nによって測定される)であるN/P比は、0.05:1より大きく、例えば、0.1:1より大きい。(用語N/P比は、「N/P」、「N:P」、又は「NP」)と表すことができる。)いくつかの実施形態では、N/P比は、0.15:1、又は約0.15:1、又は少なくとも0.15:1である。いくつかの実施形態では、N/P比は、0.16:1、又は約0.16:1、又は少なくとも0.16:1である。いくつかの実施形態では、N/P比は、少なくとも1:1以上、例えば、約2:1以上、約2.5:1以上、約3:1以上、約4:1以上、約5:1以上、約10:1、又は最大20:1である。いくつかの実施形態では、N/P比は、約5:1、約8:1、約10:1、又は約20:1である。いくつかの実施形態では、N/P比は、約2:1~約20:1、又は約2.5:1~約10:1の範囲内である。
組成物の脂質成分は、DOTMA、DOPE、DOPC、及び/又はDOPGを含んでもよい。
脂質成分の量は、組成物中の核酸の量に対する重量:重量比(「w/w」又は「w:w」)で表すことができ、1:50~50:1の範囲内であり得る。より好ましくは、脂質の量(重量)は、核酸の量(重量)に対して1:1~50:1、又は2:1~20:1である。脂質:核酸比は、少なくとも2:1であり得る。最も好ましくは、脂質:核酸の重量:重量比は、約10:1である。これらの比は、総脂質の重量を指す。本明細書に記載されるように、組成物は、2つ以上の脂質成分、例えば、2つ、3つ、又は4つの脂質の混合物を含む脂質を含んでもよい。脂質成分の重量は、これらの脂質成分の合計(合わせた)重量である。好ましくは、各脂質成分は、ほぼ等しい割合で混合される。
関連して、本発明は、本明細書に記載される核酸、脂質、及び第1、第2、又は第3世代デンドリマー、並びに薬学的に許容される賦形剤、を含む、薬学的組成物を提供する。
本発明の組成物の一部を形成する核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide、ASO)であってもよい。好ましくは、ASOは、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも25ヌクレオチド長、少なくとも30ヌクレオチド長、少なくとも35ヌクレオチド長であるか、又は本明細書の他の箇所に開示される核酸に関連して特定される長さ、例えば、少なくとも40ヌクレオチド長を有する。
本発明の組成物の一部を形成する核酸は、mRNA分子であってもよい。本発明の組成物の一部を形成する核酸は、lncRNA分子であってもよい。本発明の組成物の一部を形成する核酸は、CRISPR配列を含んでもよい。本発明の組成物の一部を形成する核酸は、二本鎖領域を含んでもよい。核酸は、siRNA分子であってもよい。核酸は、小活性化RNA(small activating RNA、saRNA)分子であってもよい。核酸は、自己増幅RNA分子であってもよい。核酸は、標的細胞においてsiRNA又はsaRNA分子を発現することができるDNAプラスミドであってもよい。核酸は、DNAプラスミド(直鎖状又は環状)、例えば、標的細胞において導入遺伝子を発現することができるプラスミドであってもよい。
導入遺伝子は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質であってもよい。ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は寄生微生物タンパク質を発現する組成物は、ワクチンとして使用され得る。例えば、有効量の組成物を対象に全身的に(例えば、静脈内に)送達して、対象の骨格筋におけるウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は寄生微生物タンパク質の発現を達成し、そのウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は寄生タンパク質に対する免疫応答をプライミングしてもよい。したがって、本発明は、対象にワクチン接種する方法、及び対象のワクチン接種における使用のための組成物を提供する。そのような例において、導入遺伝子は、本明細書に記載される免疫細胞、例えば、白血球、例えば、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、又は単球;リンパ節組織細胞において発現され得る。
導入遺伝子は、遺伝子療法における使用のための治療用タンパク質を発現し得る。遺伝子療法は、患者における遺伝性障害を治療するためのものであってもよい。遺伝性障害は、患者における単一遺伝子障害、例えば、筋ジストロフィーであってもよい。単一遺伝子障害が筋ジストロフィーである実施形態では、導入遺伝子は、ジストロフィンであってもよい。障害が虚血である実施形態では、導入遺伝子は、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、及び線維芽細胞増殖因子(FGF)であってもよい。障害が筋肉消耗性である実施形態では、導入遺伝子は、フォリスタチンであってもよい。障害が神経筋疾患である実施形態では、導入遺伝子は、酸性α-グルコシダーゼ(α-glucosidase、GAA)であってもよい。導入遺伝子は、本明細書に開示される組織のうちの1つ以上において発現され得るが、発現されたタンパク質は、組織から循環中に分泌され得る。
本発明は、ミオパチーを治療するための核酸療法を送達するために使用できることが想定される。また、本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、遺伝性筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、及び遠位型ミオパチーなどの筋ジストロフィーを治療するための核酸療法を送達するために使用できることも想定される。
核酸療法は、悪液質などの筋肉消耗状態を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、遺伝性筋障害、例えば、先天性筋緊張症、又は家族性周期性四肢麻痺などの他の筋障害を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、運動ニューロン疾患、例えば、ALS(amyotrophic lateral sclerosis、筋萎縮性側索硬化症)、球脊髄性筋萎縮症(spinal-bulbar muscular atrophy、SBMA)、又は脊髄性筋萎縮症(spinal muscular atrophy、SMA)を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、フリードライヒ運動失調症(Friedreich’s ataxia、FA)などのミトコンドリア病、又はカーンズ・セイヤー症候群(Kearns-Sayre syndrome、KSS)、リー脳症(亜急性壊死性脳筋症)、ミトコンドリアDNA枯渇症候群、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス及び卒中様発作(mitochondrial encephalomyopathy,lactic acidosis and stroke-like episode、MELAS)、ミトコンドリア神経胃腸管脳筋症(mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy、MNGIE)、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス脳筋症(myoclonus epilepsy with ragged red fibers、MERRF)、神経障害、運動失調及び網膜色素変性(neuropathy, ataxia and retinitis pigmentosa、NARP)、ピアソン症候群、若しくは進行性外眼筋麻痺(progressive external opthalmoplegia、PEO)などのミトコンドリアミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、先天性ミオパチー、例えば、capミオパチー、中心核ミオパチー、筋線維タイプ不均等症を伴う先天性ミオパチー、コアミオパチー、セントラルコア病、マルチミニコアミオパチー、ミオシン蓄積ミオパチー、ミオチュブラーミオパチー、又はネマリンミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、GNEミオパチー/野中ミオパチー/遺伝性封入体ミオパチー(hereditary inclusion-body myopathy、HIBM)、Laing型遠位型ミオパチー、Markesbery-Griggs遅発性遠位型ミオパチー、三好ミオパチー、Uddミオパチー/頸骨筋ジストロフィー、VCPミオパチー/IBMPFD、声帯及び咽頭遠位型ミオパチー、又はWelander遠位型ミオパチーなどの遠位型ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、甲状腺機能亢進性ミオパチー又は甲状腺機能低下性ミオパチーなどの内分泌性ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、皮膚筋炎、封入体筋炎、又は多発性筋炎などの炎症性ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、酸性マルターゼ欠損症(Acid maltase deficiency、AMD、ポンペ病)、カルニチン欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症、脱分枝酵素欠損症(debrancher enzyme deficiency)(コリ病、フォーブス病)、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ミオアデニレートデアミナーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症(垂井病)、ホスホグリセレートキナーゼ欠損症、ホスホグリセレートムターゼ欠損症、又はホスホリラーゼ欠損症(McArdle病)などの代謝性ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、筋原線維性ミオパチー又は肩甲腓骨型ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、先天性筋無力症候群(congenital myasthenic syndrome、CMS)、ランバート・イートン筋無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome、LEMS)、又は重症筋無力症(myasthenia gravis、MG)などの神経筋接合部疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、シャルコー・マリー・トゥース病(Charcot-Marie-Tooth disease、CMT)又は巨大軸索神経障害(giant axonal neuropathy、GAN)などの末梢神経疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、閉塞性血栓性血管炎/バージャー病、糖尿病性末梢神経障害(ALS、重症下肢虚血、及び足部潰瘍においても試験される)、末梢動脈疾患、下肢虚血、重症下肢虚血(包括的高度慢性下肢虚血及び糖尿病性下肢虚血としても知られる)、重症末梢動脈閉塞性疾患(peripheral artery occlusive disease、PAOD)、又は間欠性跛行/動脈硬化などの心臓血管疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、COVID-19、HIV、HBV、HCV、エボラ及びマールブルグウイルス、ウエストナイル熱、SARS、鳥インフルエンザ、HPV、サイトメガロウィルス、又はマラリアなどの感染疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、肉腫、黒色腫、乳がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、肝臓がん、急性骨髄性白血病、又はB細胞リンパ腫などのがんを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、落花生アレルギーなどのアレルギーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、多発性硬化症(multiple sclerosis、MS)を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome、MDS)を治療するためのものであってもよい。
ポンペ病は、グリコーゲンから末端α1-4及びα1-6グルコースを切断するリソソーム酵素であるヒト酸性α-グルコシダーゼ(GAA)の欠損に起因する。本発明の組成物は、ポンペ病を治療するために使用され得る。GAAをコードする核酸を含む本発明の組成物は、対象の標的組織に核酸を送達し、本明細書に記載される標的組織、特に肝臓及び骨格筋においてGAAを発現させるために、ポンペ病に罹患している対象に投与され得る。酵素は、組織から循環中に分泌され得る。
フォリスタチンは、骨格筋成長を抑制し、筋肉消耗を促進するTGF-βスーパーファミリーリガンドの阻害剤である。フォリスタチンをコードする核酸を含む本発明の組成物は、核酸を対象の標的組織に送達し、本明細書に記載される標的組織、特に肝臓及び骨格筋においてフォリスタチンを発現させるために、筋肉消耗障害に罹患している対象に投与され得る。タンパク質は、組織から循環中に分泌され得る。
したがって、本発明は、このような障害を治療するための方法、及びこのような治療における使用のための組成物を提供する。
デンドリマーのコアペプチドモチーフは、単一のアミノ酸残基又はジペプチド若しくはトリペプチドモチーフなどの短いペプチドモチーフである。コア配列は、任意のアミノ酸(L-及び/若しくはD-異性体)、例えば、グリシン(G)、セリン(S)、システイン(C)、アラニン(A)、リジン(K)、ロイシン(L)、バリン(V)、イソロイシン(I)、フェニルアラニン(F)、メチオニン(M)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、スレオニン(T)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アルギニン(R)、並びに/又はヒスチジン(H)を含んでもよい。コア配列はまた、天然に存在しないアミノ酸(L-及び/若しくはD-異性体)、例えば、ベータ-アラニン(B)及び/又はアミノヘキサン酸(X)を含んでもよい。コアがトリペプチドモチーフである場合、コアは、グリシン(G)、セリン(S)、及びシステイン(C)又はアラニン(A)のいずれかを含んでもよい。好ましくは、コアは、ヒスチジン(H)などのイオン化可能な残基を含む。コア配列は、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、及びシステイン(C)を含んでもよい。コア配列は、アルギニン(R)又はグリシン(G)、ヒスチジン(H)又はセリン(S)、及びシステイン(C)又はアラニン(A)を含んでもよい。例えば、コア配列は、GSC又はRHCであってもよい。トリペプチドモチーフは、アラニン(A)、リジン(K)、及びロイシン(L)を含んでもよい。例えば、コア配列は、KLAであってもよい。コアペプチドは、更なる部分、例えば、細胞特異的標的化ペプチドと共有結合してもよく、又は脂質分子で誘導体化されてもよい。デンドリマー、例えば、コアペプチドモチーフのアミノ酸のうちの1つ、いくつか、又は全ては、更なる部分、例えば、抗体、細胞特異的標的化ペプチド、糖リガンド、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、及びGalNAc(若しくはそれらを含むグリカン)、並びに/又は脂質置換基と共有結合してもよい。当業者は、溶解性又は核酸結合特徴に悪影響を及ぼさない更なる部分を容易に選択することができる。
組成物の脂質成分は、カチオン性脂質を含む脂質の混合物を含んでもよい。例えば、脂質成分は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及びN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含んでもよい。DOPE:DOTMA比は、所定の用途に最適な特性について容易に決定できるが、通常、1:5~5:1の範囲であろう。
好ましくは、その範囲は、3:1~1:3又は2:1~1:2である。最も好ましくは、DOPE:DOTMA比は、1:1である。他の実施形態では、脂質は、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンクロリド(DOTAP)を、例えば、単独の脂質として、又はDOPEと組み合わせて含む。
他の実施形態では、組成物の脂質成分は、DOPE及びDOTMAに加えて(又はその代わりに)他の脂質を含んでもよい。例示的な脂質成分を、以下に示す。
カチオン性脂質:
N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンクロリド(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride、DOTAP)
2,3-ジオレイルオキシ-N-(2[スペルミン-カルボキサミド]エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロアセテート(2,3-dioleyloxy-N-(2[spermine-carboxamido]ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate、DOSPA)
3p-[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール塩酸塩(3p-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride、DC-chol)
N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンクロリド(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride、DOTAP)
2,3-ジオレイルオキシ-N-(2[スペルミン-カルボキサミド]エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロアセテート(2,3-dioleyloxy-N-(2[spermine-carboxamido]ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate、DOSPA)
3p-[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール塩酸塩(3p-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride、DC-chol)
中性脂質:
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、DOPC)
コレステロール
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、DOPC)
コレステロール
陰イオン性脂質:
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DOPG)
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)(DOPG)
イオン化可能な脂質:
DLin-DMA
DLin-KC2-DMA
DLin-MC3-DMA
DLin-DMA
DLin-KC2-DMA
DLin-MC3-DMA
他の可能性のある脂質としては、4-(2-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロール-ヘミスクシネート、(4-(2-aminoethyl)-morpholino-cholesterol-hemisuccinate、MoChol)コレステロールヘミスクシネート(cholesterolhemisuccinate、CHEMS)、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine、PC)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine、PE)、ジミリストイルホスファチジルコリン(dimyristoylphosphatidylcholine、DMPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(dipalmitoylphosphatidylcholine、DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(distearoylphosphatidylcholine、DSPC)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(dimyristoylphosphatidylethanolamine、DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(dipalmitoylphosphatidylethanolamine、DPPE)、コレステロール-(3-イミダゾール-1-イルプロピル)カルバメート(cholesterol-(3-imidazol-1-yl propyl)carbamate、CHIM)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(dimethyldioctadecylammonium bromide、DDAB)、ジオレオイルホスファチジルセリン(dioleoylphosphatidylserine、DOPS)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、コレステロールスルフェート(cholesterol sulfate、chol-SO4)が挙げられる。
前述の脂質のいずれも、本発明の組成物において単独で、又は互いに組み合わせて使用することができることが想定される。更に、脂質は、PEG2000などのPEG基への連結を介して誘導体化することができる。
本発明は、核酸を標的細胞内へ送達する方法であって、標的細胞を本発明の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。標的細胞は、筋細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、骨髄由来サプレッサ細胞(MDSC)、腫瘍関連マクロファージ若しくは腫瘍関連好中球、幹細胞、又は腫瘍細胞であってもよい。この方法は、インビトロで実施してもよい。細胞は、患者から得られたものであってもよく、細胞は、方法が実施された後に患者に投与されてもよく、すなわち、方法は、エクスビボであってもよい。あるいは、この方法は、医学的使用又は処理の一部としてインビボで実施してもよい。この方法は、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、及び/又はミクロピノサイトーシスを介する細胞侵入を含む。このようなインビボ処理は、特定の標的組織(複数可)、例えば、対象の筋肉及び/又は肝臓へ核酸を送達するために、対象に組成物を投与することを包含し得る。組成物は、単回用量として、又は2回以上の用量として投与することができる。
本発明はまた、表2に示されるものなどの新規なデンドリマーを提供する。いくつかの実施形態では、デンドリマーは、第3世代デンドリマー、例えば、G1,2,3-LRデンドリマー、G1,2,3-rlデンドリマー、G1-LR,G2,3-RLデンドリマー、G1,2-RL,G3-LRデンドリマー、及びG1,2-LR,G3-RLデンドリマーであり、これらは、集合的に、第1のリジン残基及び2つの第1のジペプチドモチーフと、2つの第2のリジン残基及び4つの第2のジペプチドモチーフと、4つの第3のリジン残基及び8つの第3のジペプチドモチーフと、第1のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含むペプチドデンドリマーであって、(i)第1のリジン残基が、2つの第1のジペプチドモチーフと共有結合し、2つの第1のジペプチドモチーフがそれぞれ、2つの第2のリジン残基と共有結合し、(ii)各第2のリジン残基が、2つの第2のジペプチドモチーフと共有結合し、各第2のペプチドモチーフがそれぞれ、第3のリジン残基のうちの1つと共有結合し、(iii)各第3のリジン残基が、第3のジペプチドモチーフのうちの2つと共有結合し、第1、第2、及び第3のジペプチドモチーフが各々、ロイシン(L)及びアルギニン(R)を含み、第1、第2、及び第3のジペプチドモチーフのうちの少なくとも1つが、ロイシン-アルギニン(LR)ジペプチドモチーフからなる(「LR」モチーフは標準的なN末端からC末端への慣例に従って記載される)、ペプチドデンドリマーとして定義され得る。各アミノ酸残基は、独立して、L-アイソフォーム又はD-アイソフォームから選択される。これらの新規デンドリマーは、本発明の組成物の一部を形成することができ、本明細書に開示される本発明の他の態様において使用することができる。
本発明は、記載された態様及び好ましい特質の組み合わせを、そのような組み合わせが明らかに許容されないか又は明示的に回避される場合を除いて含む。
次に、本発明の原理を示す実施形態及び実験について、添付の図面を参照しながら説明する。
DNA送達のための異なるリジン及びロイシン配置を有するデンドリマーのトランスフェクション効率の比較。世代内のリジン及びロイシンの位置の変更は、(A)HeLa又は(B)Neuro2A細胞におけるトランスフェクション効率を有意に変化させない。デンドリマーG1,2,3-KLのそのバリアント、例えば、G1,2,3-K(全てのロイシンが除去されたG1,2,3-KLのバージョン)への構造的修飾、及び全てのL型アミノ酸のD型への置換は、(C)HeLa又は(D)Neuro2A細胞におけるトランスフェクション効率を有意に変化させない。(E)HeLa又は(F)Neuro2A細胞において、G0,1,2,3-KL(KLモチーフを有する第0世代のG1,2,3-KLのバージョン)の場合、有意差はない。条件:1×104個の細胞に0.25μgのpCI-Lucをトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±SEMを指す。D/Dは、DOTMA/DOPEである。
DNA送達についての、異なる世代(G1、G2、及びG3)並びにカチオン性残基(例えば、KL対RL)を有するデンドリマーのトランスフェクション効率の比較。(A)HeLa細胞におけるトランスフェクション効率、(B)Neuro2A細胞におけるトランスフェクション効率。D/Dを有するペプチドデンドリマーの存在下でルシフェラーゼ発現プラスミド(pCI-Luc)をトランスフェクトされた細胞(トランスフェクションの24時間後に測定)。発光値を、D/D DNA複合体(w/w 1:1、0.25μg)で処理した細胞についての類似値で割ることによって正規化して、トランスフェクションの%を得た。条件:1×104個の細胞に0.25μgのpCI-Lucをトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±SEMを指す。*は、p<0.05を示す。D/Dは、DOTMA/DOPEである。
DNA送達のための、DOTMA/DOPE、ポリエチレンイミン、及びLipofectamine 2000を含む他の市販のトランスフェクション試薬を用いたG1,2,3-RLのトランスフェクション効率の比較。(A)血清の非存在下でのHeLa細胞におけるトランスフェクション、(B)血清の存在下でのHeLa細胞におけるトランスフェクション、(C)血清の非存在下でのNeuro2A細胞におけるトランスフェクション、及び(D)血清の存在下でのNeuro2A細胞におけるトランスフェクション。D/Dを有するG1,2,3-RLの存在下でルシフェラーゼ発現プラスミド(pCI-Luc)をトランスフェクトされた細胞(トランスフェクションの24時間後に測定)。発光値を、D/D DNA複合体で処理した細胞についての類似値で割ることによって正規化して、トランスフェクションの%を得た。条件:1×104個の細胞に、0.25μgのpCI-Lucを4時間、無血清又は10%血清中でトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±SEMを指す。G1,2,3-RLは、HeLa及びNeuro2A細胞において他の試薬よりも有意に強力なトランスフェクションを媒介する。*は、p<0.05を示し、***は、p<0.001を示し、****は、p<0.0001を示す。D/Dは、DOTMA/DOPEである。
血清条件でのDNA送達についての、異なる世代(G1、G2、及びG3)並びにカチオン性残基(例えば、KL対RL)を有するデンドリマーのトランスフェクション効率の比較。(A)HeLa細胞におけるトランスフェクション効率、(B)Neuro2A細胞におけるトランスフェクション効率。D/Dを有するペプチドデンドリマーの存在下でルシフェラーゼ発現プラスミド(pCI-Luc)をトランスフェクトされた細胞(トランスフェクションの24時間後に測定)。発光値を、D/D DNA複合体(w/w 1:1、0.25μg)で処理した細胞についての類似値で割ることによって正規化して、トランスフェクションの%を得た。条件:1×104個の細胞に、0.25μgのpCI-Lucを4時間、10%血清中でトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±SEMを指す。G1,2,3-RL(N/P:5~20)は、HeLa及びNeuro2A細胞の両方において、他の群よりも有意に強力なトランスフェクションを媒介する。*は、p<0.05を示す。G1,2,3-RL(N/P:10、20)は、他の群よりも有意に強力なトランスフェクションを媒介する。***は、p<0.001を示す。D/Dは、DOTMA/DOPEである。
G1,2,3-RL-D/D-DNAナノ粒子の細胞取り込み経路。クロルプロマジンは、クラスリン媒介性エンドサイトーシスを阻害する。ゲニステイン及びロットレリンは、カベオラ媒介性エンドサイトーシス及びミクロピノサイトーシスをそれぞれ阻害する。
D/D及びフォリスタチンを発現するプラスミドDNAとともにG1,2,3-RLを含む組成物の静脈内投与後の骨格筋におけるフォリスタチン発現。マウスにG1,2,3-RL複合体を2回注射し、組織を採取して、フォリスタチンのmRNA発現レベルをqPCRによってアッセイした。
開示された組成物の静脈内投与後のマウスの体重。
DOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)及びルシフェラーゼを発現するミニサークルDNAとともにG1,2,3-RL又はG1,2,3-LRを含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。組成物を、20:1のNP比で注射した。マウスに組成物を注射し、24時間後に組織を採取して、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、及び骨格筋におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。
DOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)及びルシフェラーゼを発現するミニサークルDNAとともにG1,2-RL,3-LRを含む組成物の筋肉内投与後のマウス骨格筋におけるルシフェラーゼ発現。組成物を、20:1のNP比で注射した。マウスに組成物を注射し、48時間後に骨格筋組織を採取してルシフェラーゼシグナルを測定した。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2,3-RL(上パネル)又はG1,2-RL,3-LR(下パネル)を含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、8:1及び0.15:1のNP比で注射した。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。G1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LRを含む組成物は、0.15:1のNP比で注射された場合、肺、脾臓、及びリンパ節を含む免疫細胞に富む組織にmRNAを送達することができる。NP8:1で注射されたG1,2-RL,3-LRは、脾臓へのmRNAの送達を標的とすることができる。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2,3-RL(上パネル)又はG1,2-RL,3-LR(下パネル)を含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、8:1及び0.15:1のNP比で注射した。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、心臓、腎臓、脂肪組織、及び脳におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2,3-RL又はG1,2-RL,3-LRを含む組成物のNP比8:1での静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現の比較。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した(図12A、上パネル)。同じデータが、肺、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節(図12A、下パネル)と、筋肉(腓腹筋)、肝臓、心臓、腎臓、脂肪組織、及び脳(図12B)との間の比較を可能にするために提示される。NP比8:1で注射されたG1,2-RL,3-LRを含む組成物は、NP比8:1で注射されたG1,2,3-RLと比較してより高い効率で免疫細胞に富む組織にmRNAを送達することができる。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2,3-RLを含む2用量の組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。デンドリマー組成物を、NP比=0.15:1で注射した。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2,3-RL、G1,2-RL,3-LR、又はNTX1を含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、0.15:1のNP比で注射した。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。骨格筋標的化ドメイン及び細胞透過性ペプチドドメインを含むNTX1を含む組成物は、G1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LRを含む組成物と比較してより高い効率で免疫細胞に富む組織にmRNAを送達することができる。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2,3-RL、G1,2-RL,3-LR、又はNTX1を含む組成物の静脈内投与後の、デンドリマーを含まない、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAを含む組成物を注射したマウスと比較した、マウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、0.15:1のNP比で注射した。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2-RL,3-LRを含む組成物の静脈内投与後の、デンドリマーを含まない、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAを含む組成物を注射したマウスと比較した、マウス組織におけるルシフェラーゼ発現。デンドリマー組成物を、NP比=8:1で注射した。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。NTX1、G1,2,3-RL、及びG1,2-RL、3LRを含む組成物は各々、mRNA単独を含む組成物又はDOTMA/DOPE及びmRNAを含む組成物と比較して、全ての組織へのmRNAの送達の増加を示す。
デンドリマー組成物又は市販のトランスフェクション試薬をトランスフェクトした後のHeLa又はC2C12細胞におけるルシフェラーゼ及びeGFP発現。1)ルシフェラーゼmRNA単独、G1,2-RL,3-LR(NP=0.16:1)、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)、及びルシフェラーゼmRNAを含む組成物、若しくはLipofectamine 2000(商標)及びルシフェラーゼmRNAを含む組成物(左上パネル)、又は2)eGFP mRNA単独、G1,2-RL,3-LR(NP=0.16:1)、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)、及びeGFP mRNAを含む組成物、若しくはDLin-MC3-DMA:コレステロール:DSPC:DMG-PEG脂質ナノ粒子及びeGFP mRNAを含む組成物(右上パネル)を、HeLa細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼmRNA単独、G1,2-RL,3-LR(NP=8:1)、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)、及びルシフェラーゼmRNAを含む組成物、Lipofectamine 2000(商標)及びルシフェラーゼmRNA又はポリエチレンイミン及びルシフェラーゼmRNAを含む組成物(下パネル)を、C2C12細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ及びeGFP発現をトランスフェクションの24時間後に測定した。本発明のペプチドデンドリマーは、Lipofectamine 2000及びLNPなどの市販のトランスフェクション試薬と比較して、インビトロでHeLa細胞をトランスフェクトする際により効率的である。
NP比0.15:1又は8:1で蛍光標識されたsgRNA及びCas9 mRNAを、又はG1,2-RL,3-LRを蛍光標識されたsgRNA及びCas9 mRNAとともに、トランスフェクトした後のHeLa細胞におけるRNAトランスフェクション効率。sgRNAをTM-ローダミンで標識し、Cas9 mRNAをCy5フルオロフォアで標識した。細胞を2時間トランスフェクトし、フローサイトメトリーによってアッセイした。G1,2-RL、3LRを含む組成物に曝露されたHeLa細胞の100%が、sgRNA及びCas9 mRNAについて二重陽性であり、これは、極めて高いトランスフェクション効率を実証している。
NP比0.15:1又は8:1で、tracrRNA(trRNA)、crRNA、及びCas9 mRNAを、又はG1,2-RL,3-LRをtracrRNA、crRNA、及びCas9 mRNAとともに、トランスフェクトした後のHeLa細胞におけるRNAトランスフェクション効率。tracrRNAをATTO 55フルオロフォアで標識した。crRNAをフルオレセインで標識し、Cas9 mRNAをCy5フルオロフォアで標識した。細胞を2時間トランスフェクトし、フローサイトメトリーによってアッセイした。
tracrRNA(trRNA)、crRNA、又はCas9 mRNAのいずれかをトランスフェクトした後のHeLa細胞におけるRNAトランスフェクション効率。細胞には、G1,2-RL,3-LRをトランスフェクトした、又はトランスフェクトしなかった。tracrRNAをATTO 55フルオロフォアで標識した。crRNAをフルオレセインで標識し、Cas9 mRNAをCy5フルオロフォアで標識した。細胞を2時間トランスフェクトし、フローサイトメトリーによってアッセイした。
脾臓内の免疫細胞へのmRNA送達。マウスに、mRNA単独、又はmRNAとNTX1(NP=0.15:1)、G1,2-RL,3-LR(NP=0.15:1)、若しくはG1,2-RL,3-LR(NP=8:1)のいずれかとを静脈内注射した。mRNAをAlexaFluor488で標識した。脾臓を、処理のために注射の2時間後にマウスから採取した。脾臓に存在する広範囲の免疫細胞へのmRNAの送達は、NTX1、G1,2-RL,3-LR(NP8:1)、又はG1,2-RL,3-LR(NP0.15:1)を含む組成物を使用して可能である。
骨髄内の免疫細胞へのmRNA送達。マウスに、mRNA単独、又はmRNAとNTX1(NP=0.15:1)、G1,2-RL,3-LR(NP=0.15:1)、若しくはG1,2-RL,3-LR(NP=8:1)のいずれかとを静脈内注射した。mRNAをAlexaFluor488で標識した。骨髄を、処理のために注射の2時間後にマウスから採取した。
血液内の免疫細胞へのmRNA送達。マウスに、mRNA単独、又はmRNAとNTX1(NP=0.15:1)、G1,2-RL,3-LR(NP=0.15:1)、若しくはG1,2-RL,3-LR(NP=8:1)のいずれかとを静脈内注射した。mRNAをAlexaFluor488で標識した。血液を、処理のために注射の2時間後にマウスから採取した。血液中に存在する広範囲の免疫細胞へのmRNAの送達は、NTX1、G1,2-RL,3-LR(NP8:1)、又はG1,2-RL,3-LR(NP0.15:1)を含む組成物を使用して可能である。
リンパ節内の免疫細胞へのmRNA送達。マウスに、mRNA単独、又はmRNAとNTX1(NP=0.15:1)、G1,2-RL,3-LR(NP=0.15:1)、若しくはG1,2-RL,3-LR(NP=8:1)のいずれかとを静脈内注射した。mRNAをAlexaFluor488で標識した。リンパ節を、処理のために注射の2時間後にマウスから採取した。
HeLa及びC2C12細胞へのインビトロDNA送達。DNA単独、G1,2,3-RL(N:P=5:1)及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA、並びにG1,2,3-RL(N:P=5:1)及びDOPG/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA(上のパネル)、のいずれかをHeLa細胞にトランスフェクトした。DNA単独、ポリエチレンイミンとDNA、G1,2-RL,3-LR(N:P=8:1)及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1で)とDNA、並びにNTX2(N:P=8:1)及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA(下のパネル)、のいずれかを、C2C12細胞(筋肉由来細胞株)にトランスフェクトした。両方の実験で使用したDNAは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。NTX2は、筋標的化ペプチドASSLINA((LR)8(KRL)4(KRL)2KGSCGAASSLNIA(Acp)-NH2)にコンジュゲートされたG1,2-RL,3-LRデンドリマーである。
mRNA製剤投与後のアスパラギン酸トランスアミナーゼ(Aspartate transaminase、AST、26A、上パネル)、TNF-α(26A、下パネル)、IL-6(26B、上パネル)、及びIL-1β(26B、下パネル)のレベル。マウスを、mRNA単独、又はmRNA、デンドリマー、及びDOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)のいずれかで処理した。mRNAに対するデンドリマーのN:P比を、X軸に示す。2回投与されたG1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LRとは別に、全ての製剤を1回投与した。2用量を注射したマウスについては、1回目の用量を、2回目の用量の24時間前に注射した。AST又はサイトカインレベルの測定のために、2回目の投与の6時間後にマウスの血漿を採取した。1回投与したマウスについては、AST及びサイトカインレベルの測定のために、投与の6時間後に血漿を採取した。インビボでmRNAを送達するための本発明のデンドリマーの使用は、有意な肝臓毒性又は有意な免疫反応を引き起こさない。
DNA製剤投与後のアスパラギン酸トランスアミナーゼ(左上パネル)、TNF-α(右上パネル)、IL-6(左下パネル)、及びIL-1β(右下パネル)のレベル。マウスを、DNA単独、又はG1,2,3-RL及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)のいずれかで処理した。全ての製剤を2回投与した後、血漿試料を採取し、AST又はサイトカインレベルを測定した。インビボでDNAを送達するための本発明のデンドリマーの使用は、有意な肝臓毒性又は有意な免疫反応を引き起こさない。
インビトロでの脂質系によるペプチドデンドリマーのmRNAトランスフェクション。mRNA単独、又はmRNAとペプチドデンドリマー(N:P=0.16:1)及びDOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)を、HeLa細胞にトランスフェクトした。使用したmRNAは、eGFPレポーター遺伝子を発現した。24時間のトランスフェクション後、細胞を採取して、eGFP発現をアッセイした。eGFP発現を、各トランスフェクションのタンパク質の総量で正規化した。遺伝子発現レベルは、G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE、及びmRNA処理細胞のトランスフェクション値を正規化することによって計算した。様々なコアと、第1、第2、及び第3世代ペプチドモチーフと、を有する第1、第2、及び第3世代デンドリマーは、試験した条件下で細胞にmRNAを効果的にトランスフェクトすることができる。
インビトロでの脂質系によるペプチドデンドリマーのmRNAトランスフェクション。mRNA単独、又はmRNAとペプチドデンドリマー及びDOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)を、HeLa細胞にトランスフェクトした。G1,2-RL,3-LRのN:P比は0.16:1であったが、他の全てのデンドリマーのN:P比は8:1であった。使用したmRNAは、eGFPレポーター遺伝子を発現した。24時間のトランスフェクション後、細胞を採取して、eGFP発現をアッセイした。eGFP発現を、各トランスフェクションのタンパク質の総量で正規化した。遺伝子発現レベルは、G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE、及びmRNA処理細胞のトランスフェクション値を正規化することによって計算した。様々なコアと、第1、第2、及び第3世代ペプチドモチーフと、を有する第1、第2、及び第3世代デンドリマーは、試験した条件下で細胞にmRNAを効果的にトランスフェクトすることができる。
DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びルシフェラーゼを発現するmRNAとともにG1,2-RL,3-LR又はRHCG1-RL,2-LRを含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。デンドリマー組成物を、N:P比0.15:1又は8:1のいずれかで注射した。マウスに組成物を注射し、6時間後に組織を採取して、筋肉(腓腹筋)、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、及びリンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。世代2デンドリマーは、第3世代デンドリマーG1,2-RL,3-LRよりも高い効率で脾臓及び肺へのmRNA送達を標的とすることができる。
第3世代デンドリマーは、図式的に表される(左側にN末端及び右側にC末端を有する)。
本発明の態様及び実施形態について、上で特定した図面及び以下に続く技術的定義を参照して説明する。更なる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
現在の免疫療法応答率は約15~20%であり、治療転帰を改善する緊急の必要性が存在する。1つの戦略は、mRNAを送達してタンパク質(CEBPA、IRF8、cGAS-STING、SOCS1、及び/又はSOCS3など)を発現させて、腫瘍微小環境における骨髄細胞の免疫抑制表現型を元に戻すことであり、これは、免疫療法が応答性であるためのより好ましい環境を提供する。別の戦略は、mRNAを腫瘍内の免疫細胞内に移入して、サイトカイン(IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、及び/又はインターフェロンなど)を発現させ、免疫細胞を活性化させてがん細胞と戦うことであり得る。マクロファージが活性化されて腫瘍細胞を殺傷することができるように、mRNAをマクロファージに送達して、キメラ抗原受容体を発現させることも可能である。抗原提示細胞において腫瘍抗原を発現させるためにmRNAを送達することは、免疫系を活性化させてがん細胞を攻撃するのを助ける。これらの戦略は、全ての腫瘍、特に非小細胞肺がん、進行性黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胆管がん(Bile duct cancer)(胆管がん(Cholangiocarcinoma))、胆のうがん、神経内分泌腫瘍、肝細胞がん、結腸直腸がん、膵臓がん、及び固形腫瘍を治療するために適用することができる。
核酸の送達
本発明の組成物は、本明細書中に記載される核酸をヒト又は動物の身体の特定の組織に送達するために使用できる。例えば、以下の組織に送達する。
1.骨格筋
2.肝臓
3.肺
4.心臓
5.白色脂肪組織
6.褐色脂肪組織
7.脳
8.脾臓
9.骨髄
10.関節
11.腎臓
12.消化管
13.腫瘍
14.眼
15.胸腺
16.皮膚
17.リンパ節
18.膵臓
19.副腎
20.精巣
21.前立腺
22.卵巣
23.子宮
24.膀胱
25.横隔膜
本発明の組成物は、本明細書中に記載される核酸をヒト又は動物の身体の特定の組織に送達するために使用できる。例えば、以下の組織に送達する。
1.骨格筋
2.肝臓
3.肺
4.心臓
5.白色脂肪組織
6.褐色脂肪組織
7.脳
8.脾臓
9.骨髄
10.関節
11.腎臓
12.消化管
13.腫瘍
14.眼
15.胸腺
16.皮膚
17.リンパ節
18.膵臓
19.副腎
20.精巣
21.前立腺
22.卵巣
23.子宮
24.膀胱
25.横隔膜
mRNAトランスフェクション
mRNA送達におけるデンドリマーの世代数に対する影響を、完全成長培地条件においてHeLa細胞をトランスフェクトすることによって研究した。本発明者らは、第1又は第2世代デンドリマー(例えば、RHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL、2-LR)が細胞を効果的にトランスフェクトし、第3世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介することができることを示した(図28A)。第1又は第2世代デンドリマーは、完全成長培地中で第3世代デンドリマーと同様に細胞をトランスフェクトしないので、これは実際にDNAトランスフェクションとは非常に異なる(図4)。興味深いことに、世代1又は世代2デンドリマーのN:P比を0.16から8に増加させると、トランスフェクション効率が更に増加する(図29A)。
mRNA送達におけるデンドリマーの世代数に対する影響を、完全成長培地条件においてHeLa細胞をトランスフェクトすることによって研究した。本発明者らは、第1又は第2世代デンドリマー(例えば、RHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL、2-LR)が細胞を効果的にトランスフェクトし、第3世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介することができることを示した(図28A)。第1又は第2世代デンドリマーは、完全成長培地中で第3世代デンドリマーと同様に細胞をトランスフェクトしないので、これは実際にDNAトランスフェクションとは非常に異なる(図4)。興味深いことに、世代1又は世代2デンドリマーのN:P比を0.16から8に増加させると、トランスフェクション効率が更に増加する(図29A)。
本発明者らは、トランスフェクションに対するデンドリマーのコア配列の影響を研究し、GSC(例えば、G1,2-RL,3-LR由来)などのトリペプチド配列が有効であることを示した。KA及びYMなどのジペプチドコア配列も有効である。コアペプチド長のこの変化はmRNAトランスフェクションに影響せず、コア中に2つのアミノ酸を有するデンドリマーが、コア中に3つのアミノ酸を有するデンドリマーと同様にトランスフェクトすることを示唆している(図28A)。RFW、RYMなどの異なるトリペプチドコア配列は、GSCと同等に機能する。カチオン性基を含有するアルギニンがコアに付加されるが、このアルギニンがトランスフェクションを改善又は減少させることはない。興味深いことに、3つのアミノ酸がコアにおいてGCSからRHCに変化すると、トランスフェクションは50%改善することができる。これは、デンドリマーのコアにおけるヒスチジンなどのイオン化可能な基がトランスフェクションを改善し得ることを示唆する(図28A)。
12個のアミノ酸のコア配列(例えば、デンドリマー「線状GI,2-RL,3-LR」)の使用は、トランスフェクション効果がコア配列の長さの増加によって影響を受けないことを実証している(図28A)。この結果は、トランスフェクション効率に影響を与えることなく、より長いアミノ酸鎖及び/又はより長い構造をコアに導入することが可能であることを示した。実際、コアに27個のアミノ酸を含むNTX1は、G1,2-RL,3-RLよりも効果的にトランスフェクトする。これは、より長いコア配列が、実際にトランスフェクションを増強し得ることを実証する。NTX1からのトランスフェクションの増強は、コア配列内の細胞透過性ペプチドの存在による可能性が高い。
本発明者らは、トランスフェクションにおける世代内のアミノ酸の数に対する影響を調査した。したがって、本発明者らは、1つのアミノ酸(R)、2つのアミノ酸(RL又はLR)、3つのアミノ酸(RLR)、及び4つのアミノ酸(LRLR)のみを有するデンドリマーを試験した。これらの研究は、各世代において1、2、3又は4つのアミノ酸を有するデンドリマーが、依然としてmRNAを細胞に十分にトランスフェクトすることができることを示した(図28A)。各世代において異なる数のアミノ酸を有するデンドリマーを使用しても、トランスフェクション効率は影響を受けないことが示された。
G1,2-RL,3-LR構造に基づいて、本発明者らは、塩基性アミノ酸RをKに置換し、かつ/又は疎水性アミノ酸Lを、Eなどの酸性アミノ酸、並びに/若しくはM、F、ベータ-アラニン(B)、アミノヘキサン酸(X)、及びWなどの非極性側鎖を有するアミノ酸、並びに/又はQ、T及びYなどの極性側鎖を有するアミノ酸に変化させた3世代デンドリマーのライブラリーを設計した。
デンドリマー内でRをKに置換すると、mRNAトランスフェクション効率が低下する(図28A)。しかしながら、疎水性アミノ酸を他の疎水性アミノ酸及び/又は極性若しくは非極性側鎖を有するアミノ酸に変更することは、トランスフェクションに影響を及ぼさない可能性があるか、又はG1,2-RL,3-LRと比較してトランスフェクションを30~40%低下させる可能性がある。しかしながら、これらのデンドリマーは全て、mRNA単独対照よりも有意に高いmRNAトランスフェクションを誘導することができる。
本発明者らはまた、mRNAトランスフェクションに対するデンドリマー内のL又はD型アミノ酸の影響を調査した。G1,2-RL,3-LRデンドリマーに基づいて、本発明者らは、デンドリマーの各世代においてアミノ酸の一部又は全部をL型からD型に変化させてもトランスフェクション効率に影響を与えないことを見出した。デンドリマー内でリジンをジアミノ酪酸に置換することは、トランスフェクションを低下させるが、このデンドリマーのトランスフェクションは、mRNA単独対照よりも依然として有意に高い。
本発明者らは、DOTMA/DOPE(w/w 10:1)とともにG1-LL,2-RRをN:P比0.16:1で使用した本発明者らの製剤プロトコルを用いてmRNAを送達するためにG1-LL,2-RRを使用できることを実証した。興味深いことに、このデンドリマーは、インビトロ及びインビボで異なる製剤にASOを送達するために使用された(Saher 2018)。使用した製剤は、DOTMA/DOPE(ASOに対してw/w=2:1)及びN:P=20:1、G1-LL,2-RR対ASOであった。本発明者らは、これをトランスフェクト細胞(すなわち、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=2:1)及びN:P=20:1、G1-LL,2-RR対mRNA)に対して試みたが、トランスフェクション効率は低い。この製剤(DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=2:1)及びN:P=20:1、G1-LL,2-RR対mRNA)のmRNAトランスフェクション効率は、本発明者らの改良製剤(DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びN:P=0.16:1、G1-LL,2-RR対mRNA)のmRNAトランスフェクション効率の10%にしかならない。
本発明者らは、mRNA送達のために、異なる世代においてRL又はLR又はrlのいずれかを有する3世代デンドリマーを調査した。本発明者らは、これらのデンドリマーのほとんどが同様に細胞をトランスフェクトし、G1,2-RL,3-LRがmRNAトランスフェクションにおいて最も有効であることを見出した。全体として、本発明者らのデータは、各世代において疎水性アミノ酸及びカチオン性アミノ酸を有するデンドリマーが、細胞への有効なmRNA送達をもたらすことを示唆した。
G1,2-RL,3-LRよりも効果的に細胞をトランスフェクトする第1世代及び第2世代デンドリマーが存在するので、本発明者らは、トランスフェクションに関する更なる試験のためにこれらのデンドリマーを選択した。これらのデンドリマーは、一般に、様々なN:P比でG1,2-RL,3-LRよりも良好にトランスフェクトすることができる。特に、N:P=4:1のRHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL,2-LR、RHCG1-RLR、及びG1-LRLRは、G1,2-RL,3-LRよりも700%~1815%良好にトランスフェクトすることができる。これらのデータは、DNA及びmRNA送達の要件が非常に異なることを実証した。mRNAについては、第1又は第2世代デンドリマーが、完全成長培地条件において第3世代デンドリマーよりも良好に細胞をトランスフェクトする傾向がある。しかしながら、世代3のデンドリマーは、完全成長培地条件において、世代1又は世代2のデンドリマーよりも良好に細胞をDNAでトランスフェクトする(図4)。
mRNA送達に特に好ましい本発明の特定のデンドリマーとしては、RHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL,2-LR、G1,2-RL,3-LR、RHCG1-RLR、RHCG1,2-RLR、G1-LRL、RHCG1,2-RL,3-LR、及びG1,2,3-RLが挙げられる。
RNA干渉
本発明は、核酸の送達によって標的遺伝子発現の治療的下方制御を促進する。これらには、RNA干渉(RNA interference、RNAi)が含まれる。小RNA分子を用いて、遺伝子発現を制御してもよい。
本発明は、核酸の送達によって標的遺伝子発現の治療的下方制御を促進する。これらには、RNA干渉(RNA interference、RNAi)が含まれる。小RNA分子を用いて、遺伝子発現を制御してもよい。
これらには、低分子干渉RNA(small interfering RNA、siRNA)によるmRNAの標的分解、転写後遺伝子サイレンシング(post transcriptional gene silencing、PTGs)、マイクロRNA(micro-RNA、miRNA)によるmRNAの発生的に制御された配列特異的翻訳抑制、及び標的転写遺伝子サイレンシングが含まれる。
ヘテロクロマチン複合体の標的化及び特定の染色体遺伝子座でのエピジェネティック遺伝子サイレンシングにおけるRNAi機構及び小RNAの役割も実証されている。RNA干渉(RNAi)としても知られる二本鎖RNA(double-stranded RNA、dsRNA)依存性転写後サイレンシングは、dsRNA複合体が短期間でサイレンシングのために相同性の特定の遺伝子を標的とすることができる現象である。これは、配列同一性を有するmRNAの分解を促進するシグナルとして作用する。21-ntのsiRNAは、一般に、遺伝子特異的サイレンシングを誘導するのに十分な長さであるが、宿主応答を回避するのに十分な短さである。標的遺伝子産物の発現の減少は、siRNAの数個の分子によって誘導される90%サイレンシングを伴って広範囲であり得る。
当技術分野では、これらのRNA配列は、それらの起源に応じて、「短鎖若しくは低分子干渉RNA」(siRNA)又は「マイクロRNA」(miRNA)と呼ばれる。両方のタイプの配列を使用して、相補的RNAに結合し、mRNA排除(RNAi)を誘発するか、又はmRNAのタンパク質への翻訳を停止することによって、遺伝子発現を下方制御することができる。siRNAは、長い二本鎖RNAのプロセシングによって誘導され、天然に見出される場合、典型的には外因性起源である。マイクロ干渉RNA(miRNA)は、短ヘアピンのプロセシングによって誘導される、内因的にコードされた小分子非コードRNAである。siRNA及びmiRNAは両方とも、RNA切断なしに部分的に相補的な標的配列を有するmRNAの翻訳を阻害し、完全に相補的な配列を有するmRNAを分解することができる。
したがって、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御するための、本発明の組成物におけるこれらの配列の使用を提供する。
標的遺伝子の機能のRNA媒介下方制御の有効性を最適化するために、siRNAリガンドは、典型的には二本鎖であり、siRNA分子の長さは、mRNA標的のsiRNAによる認識を媒介するRISC複合体によるsiRNAの正確な認識を確実にするように、かつsiRNAが宿主応答を低下させるのに十分短くなるように選択されることが好ましい。
miRNAリガンドは、典型的には一本鎖であり、リガンドがヘアピンを形成することを可能にする部分的に相補的な領域を有する。miRNAは、DNAから転写されるが、タンパク質に翻訳されないRNA遺伝子である。miRNA遺伝子をコードするDNA配列は、miRNAよりも長い。このDNA配列は、miRNA配列及び近似逆相補体を含む。このDNA配列が一本鎖RNA分子に転写される場合、miRNA配列及びその逆相補塩基対は、部分的に二本鎖のRNAセグメントを形成する。マイクロRNA配列の設計は、John et al,2004で考察されている。
典型的には、siRNA又はmiRNAの効果を模倣することが意図されるRNAリガンドは、10~40リボヌクレオチド(又はその合成類似体)、より好ましくは17~30リボヌクレオチド、より好ましくは19~25リボヌクレオチド、及び最も好ましくは21~23リボヌクレオチドを有する。二本鎖siRNAを使用する本発明のいくつかの実施形態では、分子は、例えば、1つ又は2つの(リボ)ヌクレオチドの対称3’オーバーハング、典型的にはdTdT 3’オーバーハングのUUを有し得る。本明細書に提供される開示に基づいて、当業者は、例えば、AmbionのオンラインsiRNAファインダーなどのリソースを使用して、適切なsiRNA及びmiRNA配列を容易に設計することができる。siRNA及びmiRNA配列は、合成的に産生され、遺伝子下方制御を引き起こすために外因的に添加され得るか、又は発現系(例えば、ベクター)を使用して産生され得る。好ましい実施形態では、siRNAは、合成的に合成される。
より長い二本鎖RNAを細胞内でプロセシングして、siRNAを産生してもよい(例えば、Myerset al(2003)を参照されたい)。より長いdsRNA分子は、例えば、1つ又は2つの(リボ)ヌクレオチドの対称3’若しくは5’オーバーハングを有してもよく、又は平滑末端を有してもよい。より長いdsRNA分子は、25ヌクレオチド以上であり得る。好ましくは、より長いdsRNA分子は、25~30ヌクレオチド長である。より好ましくは、より長いdsRNA分子は、25~27ヌクレオチド長である。最も好ましくは、より長いdsRNA分子は、27ヌクレオチド長である。
一実施形態では、siRNA、より長いdsRNA、又はmiRNAは、ベクターからの転写によって内因的に(細胞内で)産生される。ベクターは、当技術分野で公知の任意の方法で細胞に導入してもよい。必要に応じて、RNA配列の発現は、組織特異的プロモーターを使用して制御できる。更なる実施形態では、siRNA、より長いdsRNA、又はmiRNAは、ベクターからの転写によって外因的に(インビトロで)産生される。
あるいは、siRNA分子は、当該分野で公知の標準的な固相合成技術又は液相合成技術を使用して合成され得る。ヌクレオチド間の連結は、ホスホジエステル結合又は代替物であってもよく、例えば、式P(O)S、(チオエート);P(S)S、(ジチオエート);P(O)NR’2;P(O)R’;P(O)OR6;CO;又はCONR’2(式中、RはH(又は塩)又はアルキル(1~12C)であり、R6はアルキル(1~9C)である)の連結基は、-O-又は-S-を介して隣接するヌクレオチドに接合している。
長鎖型非コードRNA
哺乳動物ゲノムは広範に転写され、何千もの長鎖型非コードRNA分子(lncRNA)を含む膨大な数の転写物を産生する。lncRNAは、クロマチン状態、転写、RNA安定性、及び特定の遺伝子の翻訳を制御することができることが示されている。
哺乳動物ゲノムは広範に転写され、何千もの長鎖型非コードRNA分子(lncRNA)を含む膨大な数の転写物を産生する。lncRNAは、クロマチン状態、転写、RNA安定性、及び特定の遺伝子の翻訳を制御することができることが示されている。
RNA活性化(RNA activation、RNAa)
RNA活性化(RNAa)は、高度に制御され、進化的に保存された経路を介して遺伝子発現を増強するためにRNAによって媒介されるプロセスである。RNAaは、両末端に2ヌクレオチドオーバーハングを有する21ヌクレオチドdsRNAからなる非コードRNAのクラスである小活性化RNA(saRNA)によって誘導することができる。saRNAが配列特異的に遺伝子活性化を媒介するという事実にもかかわらず、saRNAは、siRNAと同一の構造及び化学成分を有する。遺伝子発現を活性化するために、saRNAのガイド鎖をAGO2にロードし、次いで複合体を核に輸送する。核内に入ると、ガイド鎖-AGO2複合体は、遺伝子プロモーター又は関連する転写物に直接結合し、RNAポリメラーゼIIを含む重要な成分を動員して、遺伝子活性化を開始する(Kwok et al.2019)。
RNA活性化(RNAa)は、高度に制御され、進化的に保存された経路を介して遺伝子発現を増強するためにRNAによって媒介されるプロセスである。RNAaは、両末端に2ヌクレオチドオーバーハングを有する21ヌクレオチドdsRNAからなる非コードRNAのクラスである小活性化RNA(saRNA)によって誘導することができる。saRNAが配列特異的に遺伝子活性化を媒介するという事実にもかかわらず、saRNAは、siRNAと同一の構造及び化学成分を有する。遺伝子発現を活性化するために、saRNAのガイド鎖をAGO2にロードし、次いで複合体を核に輸送する。核内に入ると、ガイド鎖-AGO2複合体は、遺伝子プロモーター又は関連する転写物に直接結合し、RNAポリメラーゼIIを含む重要な成分を動員して、遺伝子活性化を開始する(Kwok et al.2019)。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、標的配列に相補的なDNA又はRNAの一本鎖である。ASOは、標的核酸とハイブリダイズする。例えば、ASOは、細胞内のコード又は非コードRNA分子を標的とするために使用され得る。標的結合の後、ASO/標的複合体は、例えば、RNase Hによって酵素的に分解され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、標的配列に相補的なDNA又はRNAの一本鎖である。ASOは、標的核酸とハイブリダイズする。例えば、ASOは、細胞内のコード又は非コードRNA分子を標的とするために使用され得る。標的結合の後、ASO/標的複合体は、例えば、RNase Hによって酵素的に分解され得る。
メッセンジャーRNA(Messenger RNA、mRNA)
当業者は、メッセンジャーRNA(mRNA)が、リボソームによって対応するアミノ酸配列に翻訳される遺伝子のコード配列をとるRNAの一本鎖分子であることを承知している。mRNAは、酵素(RNAポリメラーゼ)が遺伝子を一次転写mRNA(プレmRNAとしても知られる)に変換する転写プロセス中に生成される。このプレmRNAは通常、最終的なアミノ酸配列をコードしない領域であるイントロンを依然として含む。これらはRNAスプライシングの過程で除去され、タンパク質をコードする領域であるエキソンのみが残る。このエキソン配列は、成熟mRNAを構成する。次いで、成熟mRNAがリボソームによって読み取られ、それによってコードされたタンパク質が産生される。本発明は、所望のタンパク質又はペプチドの発現を誘導する手段として、mRNA分子を標的細胞及び組織に送達するために使用され得る。mRNA送達によるペプチド/タンパク質発現の誘導は、一過性発現が所望される場合に特に有用である。
当業者は、メッセンジャーRNA(mRNA)が、リボソームによって対応するアミノ酸配列に翻訳される遺伝子のコード配列をとるRNAの一本鎖分子であることを承知している。mRNAは、酵素(RNAポリメラーゼ)が遺伝子を一次転写mRNA(プレmRNAとしても知られる)に変換する転写プロセス中に生成される。このプレmRNAは通常、最終的なアミノ酸配列をコードしない領域であるイントロンを依然として含む。これらはRNAスプライシングの過程で除去され、タンパク質をコードする領域であるエキソンのみが残る。このエキソン配列は、成熟mRNAを構成する。次いで、成熟mRNAがリボソームによって読み取られ、それによってコードされたタンパク質が産生される。本発明は、所望のタンパク質又はペプチドの発現を誘導する手段として、mRNA分子を標的細胞及び組織に送達するために使用され得る。mRNA送達によるペプチド/タンパク質発現の誘導は、一過性発現が所望される場合に特に有用である。
mRNA及びlncRNAは、典型的に、負に荷電した側及び疎水性側を有する大きな分子である。したがって、mRNA及びlncRNAは、カプセル化され、かつ標的組織及び細胞に送達されるために、疎水性相互作用と親水性相互作用との間のバランスを必要とする。疎水性相互作用と親水性相互作用との間のこのバランスは、例えば、両側に電荷を有するpDNA及びsiRNAなどの二本鎖核酸とは異なる。mRNA及びlncRNAは、例えば、ASOよりも有意に大きいので、カプセル化及び送達のための要件も異なる可能性が高い。したがって、mRNA及びlncRNA送達のためのデンドリマーの最適なNP比及びDOTMA/DOPEのw/w比は、ASO送達と比較して異なる。
修飾核酸
修飾ヌクレオチド塩基は、天然に存在する塩基に加えて使用することができ、それらを含有する核酸に有利な特性を付与することができる。
修飾ヌクレオチド塩基は、天然に存在する塩基に加えて使用することができ、それらを含有する核酸に有利な特性を付与することができる。
例えば、修飾塩基は、核酸分子の安定性を増加させ、それによって、必要とされる量を低下させ得る。修飾塩基の提供はまた、非修飾核酸よりも多かれ少なかれ安定である核酸分子を提供し得る。
「修飾ヌクレオチド塩基」という用語は、共有結合的に修飾された塩基及び/又は糖を有するヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドには、3’位のヒドロキシル基以外及び5’位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合した糖を有するヌクレオチドが含まれる。したがって、修飾ヌクレオチドはまた、2’置換糖、例えば、2’-O-メチル-;2’-O-アルキル;2’-O-アリル;2’-S-アルキル;2’-S-アリル;2’-フルオロ-;2’-ハロ又はアジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖;エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、及びセドヘプツロースを含み得る。
修飾ヌクレオチドは、当技術分野で公知であり、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン及びピリミジン、並びに他の複素環を含む。これらのクラスのピリミジン及びプリンは、当該分野で公知であり、プソイドイソシトシン、N4,N4-エタノシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデニン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンチル-アデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、-D-マンノシルクエオシン、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、プソオラシル(psueouracil)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、クエオシン、2-チオシトシン、5-プロピルウラシル、5-プロピルシトシン、5-エチルウラシル、5-エチルシトシン、5-ブチルウラシル、5-ペンチルウラシル、5-ペンチルシトシン、及び2,6,ジアミノプリン、メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルシトシンが挙げられる。
核酸ベースのワクチン
世界保健機関(World Health Organisation、WHO)によって定義されるDNAワクチン、及びRNAワクチンは、免疫応答が求められる抗原をコードするDNA配列又はRNAを含有するプラスミドを(ワクチン接種される対象の)適切な組織に直接導入することを伴い、標的抗原のインサイチュ産生に依存する。これらのアプローチは、両方のB細胞及びT細胞応答の刺激、改善されたワクチン安定性、任意の感染因子の非存在、並びに大規模製造の相対的な容易さを含む、伝統的なアプローチを超える多くの潜在的な利点を提供する。DNAワクチン接種の原理の証明として、動物における免疫応答は、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マラリア原虫、及びマイコプラズマを含む種々の感染因子由来の遺伝子を使用して得られている。場合によっては、動物における疾患からの保護も得られている。しかしながら、DNAワクチンの価値及び利点は、ケースバイケースで評価されなければならず、それらの適用性は、それに対して免疫化される薬剤の性質、抗原の性質、及び防御に必要な免疫応答のタイプに依存する。
世界保健機関(World Health Organisation、WHO)によって定義されるDNAワクチン、及びRNAワクチンは、免疫応答が求められる抗原をコードするDNA配列又はRNAを含有するプラスミドを(ワクチン接種される対象の)適切な組織に直接導入することを伴い、標的抗原のインサイチュ産生に依存する。これらのアプローチは、両方のB細胞及びT細胞応答の刺激、改善されたワクチン安定性、任意の感染因子の非存在、並びに大規模製造の相対的な容易さを含む、伝統的なアプローチを超える多くの潜在的な利点を提供する。DNAワクチン接種の原理の証明として、動物における免疫応答は、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マラリア原虫、及びマイコプラズマを含む種々の感染因子由来の遺伝子を使用して得られている。場合によっては、動物における疾患からの保護も得られている。しかしながら、DNAワクチンの価値及び利点は、ケースバイケースで評価されなければならず、それらの適用性は、それに対して免疫化される薬剤の性質、抗原の性質、及び防御に必要な免疫応答のタイプに依存する。
DNA及びRNAワクチン接種の分野は、急速に発展している。現在開発されているワクチンは、DNAを使用するだけでなく、DNAが細胞に入るのを補助し、それを特定の細胞に標的化するか、又は免疫応答を刺激若しくは指向するアジュバントとして作用し得るアジャンクトも含む。2020年の時点で、WHOは、市販のために認可された最初の核酸ワクチンが細菌細胞由来のプラスミドDNAを使用する可能性が高いが、将来、他のワクチンがRNAを使用し得るか、又は核酸分子及び他の実体の複合体を使用し得ることに注目した。しかしながら、2020年のCOVID-19パンデミックの開始とともに、最初のRNAベースのCOVID-19ワクチンを市場に出すために協奏的な努力がなされ、これらは2020年半ば~後半に使用が承認された。承認されて以来、これらのRNAベースのワクチンは、COVID-19に対して集団を免疫化するために世界中で成功裏に展開されてきた。
DNAワクチンの筋肉内送達は、他のワクチン技術と共通して、一般的なアプローチである(Lim et al,2020)。安定な発現がゲノム組み込みに依存しないので、これは、骨格筋における筋細胞(筋肉細胞)の低い複製速度に起因して、DNAワクチン接種の魅力的な標的となる。
現在市販されているRNAワクチンは、ペイロードとして抗原をコードするmRNAを使用している。RNAワクチンの有効性を増加させるために現在調査されている領域は、自己増幅RNAの使用である。自己増幅RNAは、mRNAの構造的特質の多くを共有し、5’キャップ、3’ポリAテール、並びに5’及び3’非翻訳領域(untranslated region、UTR)を含み得る。目的の抗原をコードすることに加えて、自己増幅RNAはまた、自己増幅のための系を含む。例えば、自己増幅RNAはまた、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RDRA)、プロモーター、及び目的の抗原をコードし得る。
対象翻訳機構によるRDRAの翻訳時に、RDRAは、自己増幅RNAに関与し、RNAを複製することができる。自己増幅のための系を含むことは、ワクチンにおいて必要とされる最小RNAを低下させ、結果として、対象が副作用を経験する可能性を低下させる。
医学療法:遺伝子療法
本発明は、遺伝子療法レジメンにおける使用を企図する。核酸は、標的細胞に導入された場合、治療用遺伝子産物、例えば、導入遺伝子の発現をもたらす組成物中に存在し得る。標的細胞としては、筋細胞、肝細胞、星細胞、脳細胞(ニューロン、アストロサイト)、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、幹細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、B細胞、T細胞、骨髄由来サプレッサ細胞、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連好中球、又は腫瘍細胞が挙げられる。
本発明は、遺伝子療法レジメンにおける使用を企図する。核酸は、標的細胞に導入された場合、治療用遺伝子産物、例えば、導入遺伝子の発現をもたらす組成物中に存在し得る。標的細胞としては、筋細胞、肝細胞、星細胞、脳細胞(ニューロン、アストロサイト)、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、幹細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、B細胞、T細胞、骨髄由来サプレッサ細胞、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連好中球、又は腫瘍細胞が挙げられる。
遺伝子療法が実用的であるためには、(1)治療用配列を標的細胞に指向させ、(2)治療用核酸の標的細胞集団の一部への取り込みを媒介し、かつ(3)治療用途のためのインビボでの使用に適しているDNA/RNA転移系を用いることが望ましい。
本発明の核酸含有組成物は、無菌の薬学的に許容される担体中で保存及び投与することができる。水、PBS、エタノール、脂質などを含む様々な滅菌溶液を使用することができる。DNA/RNAの濃度は、治療用量を提供するのに十分であり、これは細胞への輸送効率に依存する。
上記のように製剤化された遺伝子配列の実際の送達は、直接注入、肺及び他の上皮表面の点滴注入、又は静脈内注射を含む種々の技術によって行われ得る。投与は、ボーラス、複数回投与、又は持続注入などとして、注射針、トロカール、カニューレ、カテーテルなどによるものであり得る。
遺伝子編集
本発明は、CRISPR/Cas(例えば、CRISPR/Cas9系)、TALENS及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどの当技術分野で周知の技術を使用する遺伝子編集療法を含む、遺伝子編集療法における使用を企図する。
本発明は、CRISPR/Cas(例えば、CRISPR/Cas9系)、TALENS及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどの当技術分野で周知の技術を使用する遺伝子編集療法を含む、遺伝子編集療法における使用を企図する。
いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas系は、Casヌクレアーゼ、crispr RNA(crispr RNA、crRNA)、及びトランス活性化crRNA(trans-activating crRNA、trRNA又はtracrRNA)を含む。この系では、crRNAは、標的DNAに相補的な配列を含み、Casヌクレアーゼをゲノム内の標的部位に指向させる働きをし、tracrRNAは、Cas活性に必要とされるCasヌクレアーゼの結合足場として働く。いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas系は、Casヌクレアーゼと、Casヌクレアーゼを標的遺伝子中の標的部位に指向させるための単一ガイドRNA(single-guide RNA、sgRNA)とを含む。sgRNAは、単一核酸中に足場tracrRNAに融合された標的特異的crRNAを含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、Casタンパク質又はペプチド、例えば、Cas9タンパク質又はペプチドをコードするDNA又はmRNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、sgRNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、crRNA及び/又はtracrRNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、Casタンパク質又はペプチド、crRNA、及びtracrRNAをコードするDNA又はmRNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、Casタンパク質又はペプチド及びsgRNAをコードするDNA又はmRNAを含む。
CRISPR/Cas系を使用して、標的遺伝子の修復又は修飾を指示することもできる。例えば、CRISPR/Cas系は、DNA修復を促進するための、又は例えば、相同組換え修復を促進することによって外因性核酸配列を標的遺伝子に導入するための核酸鋳型を含むことができる。CRISPR/Cas系はまた、例えば、塩基編集技術を使用して、標的ゲノムDNAに標的化修飾を導入するために使用されてもよい。これは、例えば、国際公開第2017/070633(A2)号(参照により組み込まれる)に開示されるように、シチジンデアミナーゼなどの塩基エディターに融合されたCasタンパク質を使用して達成することができる。別の例では、CRISPR/Cas系は、ゲノム中の核酸配列を「書き換える」ために使用されてもよい。例えば、CRISPR/Cas系は、プライム編集系であり得る。このようなプライム編集系では、融合タンパク質が使用され得る。例えば、融合タンパク質は、触媒的に損なわれたCasドメイン(例えば、「ニッカーゼ」)及び逆転写酵素を含み得る。触媒的に損なわれたCasドメインは、DNAの一本鎖を切断して、ニックの入ったDNA二重鎖を生成することが可能であり得る。プライム編集系は、プライマー結合部位及び逆転写酵素鋳型配列を含む拡張sgRNAを含むプライム編集ガイドRNA(prime editing guide RNA、pegRNA)を含み得る。触媒的に損なわれたCasによるDNA二本鎖のニッキングの際に、プライマー結合部位は、ニッキングされたDNA鎖の3’末端がpegRNAにハイブリダイズすることを可能にし、一方、RT鋳型は、編集された遺伝子情報の合成のための鋳型として役立つ。
いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas遺伝子編集系は、目的の標的遺伝子の修復を指示する核酸鋳型を含み得る。他の実施形態では、Casタンパク質又はペプチドは、塩基エディターを含み得る。なお更なる実施形態では、CRISPR/Cas系は、プライム編集系であってもよい。
CRISPR/Cas遺伝子サイレンシング及び遺伝子活性化
CRISPR/Cas系は、遺伝子サイレンシング及び活性化における使用に適合されている。そのような系は、本発明で使用するために想定される。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、転写リプレッサ又はアクチベータに融合したCasタンパク質又はペプチドを含む融合タンパク質をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、触媒活性がない。融合タンパク質は、sgRNA又はcrRNAのいずれかによってゲノム中の目的の部位に指向され得る。目的の部位への融合タンパク質の結合に際して、転写リプレッサ又はアクチベータは、目的の遺伝子の発現を制御し得る。
CRISPR/Cas系は、遺伝子サイレンシング及び活性化における使用に適合されている。そのような系は、本発明で使用するために想定される。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、転写リプレッサ又はアクチベータに融合したCasタンパク質又はペプチドを含む融合タンパク質をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、触媒活性がない。融合タンパク質は、sgRNA又はcrRNAのいずれかによってゲノム中の目的の部位に指向され得る。目的の部位への融合タンパク質の結合に際して、転写リプレッサ又はアクチベータは、目的の遺伝子の発現を制御し得る。
併用療法
本発明の化合物又は本発明の方法によって同定される化合物は、腫瘍及びがんの治療を必要とする対象における腫瘍及びがんの治療に使用することができる。化合物は、単独で又は他の抗がん剤と組み合わせて投与してもよい。
本発明の化合物又は本発明の方法によって同定される化合物は、腫瘍及びがんの治療を必要とする対象における腫瘍及びがんの治療に使用することができる。化合物は、単独で又は他の抗がん剤と組み合わせて投与してもよい。
「抗がん剤」は、新生物状態の治療に有用な任意の薬剤を指す。抗がん剤の1つのクラスは、化学療法剤を含む。「化学療法」は、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、膀胱内、皮下、経皮、頬側、若しくは吸入を含む様々な方法によるか、又は坐剤の形態での、がん患者への1つ以上の化学療法薬及び/又は他の薬剤の投与を意味する。いくつかの化学療法剤は、細胞毒性である。
細胞毒性化学療法剤は、受容体媒介性ではない機構又は手段を介して細胞死を誘発する。細胞毒性化学療法剤は、細胞分裂、代謝又は細胞生存に必要な機能を妨害することによって細胞死を誘発する。この作用機序のために、急速に成長している(増殖又は分裂していることを意味する)細胞又は代謝的に活性な細胞は、そうでない細胞よりも優先的に死滅する。分裂又はエネルギー使用(これは細胞の機能を支持する代謝活性である)としての体内の異なる細胞の状態は、細胞死を引き起こす化学療法剤の用量を決定する。細胞毒性化学療法剤は、非排他的に、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍薬及び三酸化ヒ素、カルムスチン、フルダラビン、IDA ara-C、myalotang、GO、mustargen、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ベンダムスチン、放射線全身照射、シタラビン、エトポシド、メルファラン、ペントスタチン、及び放射線に関する。
抗がん剤はまた、血液及び肺がんを含む多様な範囲のがんの治療に使用することができるプロテインキナーゼ阻害剤を含む。プロテインキナーゼは、典型的には、細胞増殖、生存、及び移動を促進し、がんにおいて構成的に過剰発現されるか又は活性であることが多い。したがって、プロテインキナーゼの阻害剤は、がんの治療における一般的な薬物標的である。臨床で使用するためのキナーゼ阻害剤の例としては、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ボスチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、イブルチニブ、パルボシクリブ、ソラフェニブ、及びリボシクリブが挙げられる。
抗がん剤はまた、抗体を含む、免疫療法における使用のための薬剤を含む。免疫療法は、特定の疾患状況に応じて免疫応答を誘発、増幅、低下、又は抑制することができる。例えば、PDL1リガンドを発現する腫瘍細胞は、T細胞上に発現されるPD-1受容体に結合することによって、対象における正常な免疫応答を抑制する。このようにして、腫瘍細胞は、免疫誘導性アポトーシスに抵抗し、腫瘍進行を促進する。抗PD-1及び抗PDL1抗体は、この免疫チェックポイントを阻害し、かつ腫瘍細胞の免疫細胞媒介性死滅を促進するために、臨床において成功裏に使用されている。免疫療法の他の例としては、腫瘍溶解性ウイルス療法、T細胞療法、及びがんワクチンが挙げられる。
薬学的組成物
本明細書で提供される薬学的組成物は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤、例えば、溶媒、溶解促進剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤、又は抗菌保存剤を含んでもよい。「薬学的に許容される」とは、「一般に安全であるとみなされる」分子実体及び組成物、例えば、ヒトに投与された場合に、生理学的に忍容性があり、典型的にはアレルギー性又は同様の有害反応、例えば、胃の不調などを生じない分子実体及び組成物を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、連邦食品医薬品化粧品法(Federal Food, Drug and Cosmetic Act)のセクション204(s)及び409に基づくGRASリストとして、米国連邦政府又は州政府の規制当局によって承認された分子実体及び組成物を指し、これは、FDA若しくは同様のリスト、米国薬局方、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用のための別の一般的に認識された薬局方によるプレマーケットレビュー及び承認を受ける。使用される場合、組成物の賦形剤は、活性成分の安定性、生物学的利用能、安全性、及び/又は有効性に悪影響を及ぼさない。したがって、当業者は、剤形の成分のうちのいずれかの間に不適合性がない組成物が提供されることを理解するであろう。賦形剤は、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、抗酸化剤、抗菌剤、及び保存剤からなる群から選択され得る。
本明細書で提供される薬学的組成物は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤、例えば、溶媒、溶解促進剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤、又は抗菌保存剤を含んでもよい。「薬学的に許容される」とは、「一般に安全であるとみなされる」分子実体及び組成物、例えば、ヒトに投与された場合に、生理学的に忍容性があり、典型的にはアレルギー性又は同様の有害反応、例えば、胃の不調などを生じない分子実体及び組成物を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、連邦食品医薬品化粧品法(Federal Food, Drug and Cosmetic Act)のセクション204(s)及び409に基づくGRASリストとして、米国連邦政府又は州政府の規制当局によって承認された分子実体及び組成物を指し、これは、FDA若しくは同様のリスト、米国薬局方、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用のための別の一般的に認識された薬局方によるプレマーケットレビュー及び承認を受ける。使用される場合、組成物の賦形剤は、活性成分の安定性、生物学的利用能、安全性、及び/又は有効性に悪影響を及ぼさない。したがって、当業者は、剤形の成分のうちのいずれかの間に不適合性がない組成物が提供されることを理解するであろう。賦形剤は、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、抗酸化剤、抗菌剤、及び保存剤からなる群から選択され得る。
治療用産物の発現
本発明の組成物によって送達される核酸は、治療作用(例えば、標的遺伝子を直接下方制御又は上方制御するように作用することによって)を示し得るか、又はプロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む発現カセットを介して遺伝子産物(治療用タンパク質又は治療用核酸であり得る)を発現し得る。本明細書において、「作動可能に連結された」という用語は、選択されたヌクレオチド配列及び制御ヌクレオチド配列が、コード配列の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くような様式で共有結合している状況を含み得る。したがって、制御配列が、選択されたヌクレオチド配列の一部又は全てを形成するコード配列の転写を達成し得る場合、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結される。適切な場合、次いで、得られた転写物は、所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得る。
本発明の組成物によって送達される核酸は、治療作用(例えば、標的遺伝子を直接下方制御又は上方制御するように作用することによって)を示し得るか、又はプロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む発現カセットを介して遺伝子産物(治療用タンパク質又は治療用核酸であり得る)を発現し得る。本明細書において、「作動可能に連結された」という用語は、選択されたヌクレオチド配列及び制御ヌクレオチド配列が、コード配列の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くような様式で共有結合している状況を含み得る。したがって、制御配列が、選択されたヌクレオチド配列の一部又は全てを形成するコード配列の転写を達成し得る場合、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結される。適切な場合、次いで、得られた転写物は、所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得る。
投与経路
本発明の態様による組成物は、静脈内、非経口、動脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、経口、及び経鼻を含むがこれらに限定されないいくつかの経路による投与のために製剤化することができる。組成物は、ヒト又は動物対象への注入によって、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腫瘍内注入によって投与することができる。
本発明の態様による組成物は、静脈内、非経口、動脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、経口、及び経鼻を含むがこれらに限定されないいくつかの経路による投与のために製剤化することができる。組成物は、ヒト又は動物対象への注入によって、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腫瘍内注入によって投与することができる。
対象
処理される対象は、任意の動物又はヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。対象は、男性であっても女性であってもよい。対象は、患者であってもよい。治療的使用は、ヒト又は動物(獣医学的使用)におけるものであってもよい。
***
処理される対象は、任意の動物又はヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。対象は、男性であっても女性であってもよい。対象は、患者であってもよい。治療的使用は、ヒト又は動物(獣医学的使用)におけるものであってもよい。
***
特定の形態で、又は開示された機能を実施するための手段、又は開示された結果を得るための方法若しくはプロセスに関して表現された、前述の説明、以下の特許請求の範囲、又は添付の図面に開示された特質は、必要に応じて、別々に、又はそのような特質の任意の組み合わせで、本発明をその多様な形態で実現するために利用することができる。
本発明は、上述の例示的な実施形態に関連して説明されてきたが、多くの等価な修正形態及び変形形態が、本開示を与えられたときに当業者には明らかになるであろう。したがって、上述した本発明の例示的な実施形態は、例示的なものであり、限定的なものではないと考えられる。説明された実施形態に対する様々な変更が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。
疑義を回避するために、本明細書で提供される任意の理論的説明は、読者の理解を向上させる目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のうちのいずれにも束縛されることを望まない。
本明細書で使用される任意のセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」及び「含む(include)」という用語、並びに「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、及び「含んでいる(including)」などの変形は、述べられた整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の排除を意味しないことが理解されるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。範囲は、本明細書において、「約」1つの特定の値から、及び/又は「約」別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、1つの特定の値から、及び/又は他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。数値に関する「約」という用語は任意選択であり、例えば、+/-10%を意味する。
実施例1-脂質と組み合わせてカチオン性残基及び疎水性残基を提示するペプチドデンドリマーを用いた遺伝子送達
序論
カチオン性脂質に基づく核酸送達系は、現在までに記載されている最も研究された効率的な非ウイルスベクタープラットフォームのうちの1つであり、天然アミノ酸を有するペプチドベクターの合理的な設計及び開発は、アミノ酸の非毒性の性質に起因して、治療用途のために特に魅力的である。本発明者らは、ペプチドデンドリマーを使用して、核酸送達のための構造フレームワークを開発した。構造フレームワークは、リジン残基に結合した3層のペプチド(又はジペプチド)モチーフを含む。本発明者らは、各世代(層)におけるカチオン性アミノ酸残基(Lys又はArg)の分布により、表面上のみに局在する電荷を有するデンドリマーよりも効率的にトランスフェクトするペプチドデンドリマーが得られることを見出した(Kwok et al,2013)。固相ペプチドデンドリマー合成手順を使用して、本発明者らは、樹状足場内に組み込まれた全てのアミノ酸残基の位置を正確に操作することができる。これは、デンドリマーの構造及び機能のより大きな制御を可能にし、これは、修飾が主に分子の表面上で行われたポリマー又は他のデンドリマーなどの以前に研究された系では通常不可能であった。ペプチドデンドリマー/脂質ベクターは、高いトランスフェクション効率、結果の良好な再現性、及び低い毒性を示した。
序論
カチオン性脂質に基づく核酸送達系は、現在までに記載されている最も研究された効率的な非ウイルスベクタープラットフォームのうちの1つであり、天然アミノ酸を有するペプチドベクターの合理的な設計及び開発は、アミノ酸の非毒性の性質に起因して、治療用途のために特に魅力的である。本発明者らは、ペプチドデンドリマーを使用して、核酸送達のための構造フレームワークを開発した。構造フレームワークは、リジン残基に結合した3層のペプチド(又はジペプチド)モチーフを含む。本発明者らは、各世代(層)におけるカチオン性アミノ酸残基(Lys又はArg)の分布により、表面上のみに局在する電荷を有するデンドリマーよりも効率的にトランスフェクトするペプチドデンドリマーが得られることを見出した(Kwok et al,2013)。固相ペプチドデンドリマー合成手順を使用して、本発明者らは、樹状足場内に組み込まれた全てのアミノ酸残基の位置を正確に操作することができる。これは、デンドリマーの構造及び機能のより大きな制御を可能にし、これは、修飾が主に分子の表面上で行われたポリマー又は他のデンドリマーなどの以前に研究された系では通常不可能であった。ペプチドデンドリマー/脂質ベクターは、高いトランスフェクション効率、結果の良好な再現性、及び低い毒性を示した。
本発明者らは、(1)樹状骨格、(2)デンドリマーの緻密性、(3)樹状サイズ、(4)デンドリマービルディングブロックキラリティ、及び(5)デンドリマー内のアミノ酸組成が、遺伝子導入を改善するための重要なパラメータであり得ると仮定した。本発明者らは、交互のLysLeuモチーフを有する有効なG1,2,3-KLに基づく新しいデンドリマーライブラリーを生成することによって構造的特質を調査し、トランスフェクション活性が世代依存性であり、3世代がトランスフェクションに最適であることを見出した。各世代において均一な電荷分布を達成することは重要であるが、各世代内の電荷の正確な位置は重要ではない。キラリティが異なるデンドリマー及び各世代内でのアミノ酸の数が異なるデンドリマーを使用した場合に、いくらかの活性が観察された。しかしながら、デンドリマー内で陽イオンアミノ酸をLysからArgに(すなわち、LysLeuからArgLeuモチーフに)変化させると、血清条件におけるトランスフェクションが改善された。これは、全身送達を介したインビボ遺伝子導入を可能にし、デンドリマー-DNA複合体の改善された安定性と相関する。G1,2,3-RL複合体は、組織パネルへの遺伝子送達において有効である。
結果
核酸送達の有効性を決定する際の分子認識単位の役割
疎水性及びカチオン性特性のバランスを一定に保ちながら、DNAパッケージング及び送達に対するデンドリマーの分子認識単位の微調整に対する効果を評価するために、本発明者らは、G1,2,3-KLの誘導体に基づいて、異なる(1)骨格、(2)緻密性、(3)サイズ、(4)ビルディングブロックにおけるキラリティ、及び(5)アミノ酸組成を有するデンドリマーを調査した。デンドリマー-DNAは、DOTMA/DOPE(D/D)と複合体を形成する。広く使用されているヒト子宮頸がんHeLa細胞及びマウス神経芽細胞腫Neuro2A細胞でのトランスフェクション効率を、以下の表からの特定のデンドリマーを使用して評価した。
核酸送達の有効性を決定する際の分子認識単位の役割
疎水性及びカチオン性特性のバランスを一定に保ちながら、DNAパッケージング及び送達に対するデンドリマーの分子認識単位の微調整に対する効果を評価するために、本発明者らは、G1,2,3-KLの誘導体に基づいて、異なる(1)骨格、(2)緻密性、(3)サイズ、(4)ビルディングブロックにおけるキラリティ、及び(5)アミノ酸組成を有するデンドリマーを調査した。デンドリマー-DNAは、DOTMA/DOPE(D/D)と複合体を形成する。広く使用されているヒト子宮頸がんHeLa細胞及びマウス神経芽細胞腫Neuro2A細胞でのトランスフェクション効率を、以下の表からの特定のデンドリマーを使用して評価した。
mRNA及びDNA送達についてのインビボ及びインビトロトランスフェクション効率もまた、以下の表からの特定のデンドリマーを使用して評価し、以下の実施例において考察した。
流体力学的サイズ、多分散性指数、及びゼータ電位を、表1及び2に開示されるデンドリマーのセットについて決定した。
樹状構造、対称性、トポロジー、及びキラリティの変動
種々の樹状構造は、足場内の異なるアミノ酸分布及び分岐点間のアミノ酸の数を提供して、多様な緻密性及びサイズを示す構造を与える(例えば、上記の表1を参照されたい)。
種々の樹状構造は、足場内の異なるアミノ酸分布及び分岐点間のアミノ酸の数を提供して、多様な緻密性及びサイズを示す構造を与える(例えば、上記の表1を参照されたい)。
トポロジー変動の影響を調査するために、一部又は全てのKLの位置が逆転したデンドリマー(G1,2-LK,3-KL及びG1,2,3-LK)をG1,2,3-KLと比較する。G1,2,3-LKは、G1,2,3-KLと比較して、DNA結合及びトランスフェクションに対して有意差を有しなかった(図1A、B)。総電荷はG1,2,3-KLと同じであるが、サイズ及び分子量が低下している(G1,2,3-Kの電荷当たりのMWはG1,2,3-KLよりも1.5倍低い)G1,2,3-Kについては、トランスフェクション効率がいくらか低下し、G1,2,3-KLほど有効ではない(図1C、D)。G1,2,3-Kは、2.5のより低いN/P比でより良好にトランスフェクトされたが、N/P比を増加させると、G1,2,3-KLと比較した場合、効果がより低くなる傾向がある。
キラリティの影響を調査するために、D型アミノ酸を有するG1,2,3-KLデンドリマーを合成した(D-G1,2,3KLと示す)。デンドリマーのL型アミノ酸をD型に置換することは、トランスフェクションに有意な影響を及ぼさなかった(図1C、D)。
トランスフェクションにおける焦点でのアミノ酸配列の重要性を、G0,1,2,3-KL及びAla-G1,2,3-KLを試験することによって研究した。焦点におけるGlySerCys配列は、以前に研究された全てのデンドリマーにおいて一定であり、更なる荷電した残基を有するLysLeuAlaによって置換された。変化はトランスフェクションの結果に影響を及ぼさなかった(図1E、F)。
全体として、上記の結果は、デンドリマーの各世代における電荷分布がトランスフェクション効率の決定因子であることを示す。最適な構造に関する更なる変動は、トランスフェクション活性をわずかに変化させ得るが、全体的な効果は、電荷分布それ自体が変化しない限り、重要ではない。この観察は、電荷が外側世代(outer generation)に集中しているだけであり、各世代にわたって均一に分布していないという本発明者らの以前の観察と一致しており、トランスフェクション効率は大幅に減少した。
異なる世代のKL及びRLデンドリマーのトランスフェクション効率の比較
送達効率におけるKL反復単位に基づくG1からG2、G3への世代数を調査した。また、KL単位をRL反復単位で置換して、pKaが異なるプロトン化塩基性基の影響を比較した。興味深いことに、本発明者らは、細胞における世代とトランスフェクションとの関係を観察した(図2)。トランスフェクションに対する世代依存性は、第1世代デンドリマーG1-KL又はG1-RLが、荷電残基としてリジン又はアルギニンを用いてHeLa又はNeuro2A細胞をトランスフェクトしないことを明らかにする。これは、複合体安定性アッセイによって示されるように(データは示さず)、G1ペプチドが、プラスミドDNAを完全にカプセル化して安定なナノ粒子を形成するのに十分なほど物理的に大きくないという事実に起因し得る。
送達効率におけるKL反復単位に基づくG1からG2、G3への世代数を調査した。また、KL単位をRL反復単位で置換して、pKaが異なるプロトン化塩基性基の影響を比較した。興味深いことに、本発明者らは、細胞における世代とトランスフェクションとの関係を観察した(図2)。トランスフェクションに対する世代依存性は、第1世代デンドリマーG1-KL又はG1-RLが、荷電残基としてリジン又はアルギニンを用いてHeLa又はNeuro2A細胞をトランスフェクトしないことを明らかにする。これは、複合体安定性アッセイによって示されるように(データは示さず)、G1ペプチドが、プラスミドDNAを完全にカプセル化して安定なナノ粒子を形成するのに十分なほど物理的に大きくないという事実に起因し得る。
しかしながら、第2世代については、アルギニン含有G1,2-RLは、G1,2-KLと比較してより高いトランスフェクション効率を示す(HeLa細胞では10又は20のN/P比で、及びNeuro2A細胞では20のN/P比で)(図2)。G1,2-KLに対するG1,2-RLのこのようなトランスフェクションの優位性は、G1,2-KLよりも安定なトランスフェクション複合体をDNAと形成するG1,2-RLの能力と一致する(データは示さず)。G2デンドリマーの最適N/P比は、それぞれの最良の活性について、G3デンドリマーの最適N/P比よりも有意に高い。本発明者らの結果はまた、G1,2-KLがNeuro2A細胞よりも高い効率でHeLa細胞をトランスフェクトしたことを示した。これは、ある種の形質転換体の活性が、プロテオグリカンなどの異なる成分、及びトランスフェクション複合体結合及び最終的に細胞への遺伝子送達に影響を及ぼし得る細胞表面上のそれらの濃度に起因して、細胞依存性であり得るという事実を強調する。
全体として、G3デンドリマーは、HeLa及びNeuro2A細胞の両方において効率的にトランスフェクトする。本発明者らの第3世代デンドリマーは、HeLa及びNeuro2A細胞において、ポリエチレンイミン(Polyethylenimine、PEI)、リポフェクチン(DOTMA/DOPEとしても知られる)、及びLipofectamine 2000などの広く使用されている一部の市販試薬よりも2~600倍良好にトランスフェクトした(図3)。
血清の存在下では、G1,2,3-RL-デンドリマー/DOTMA/DOPE製剤は、DOTMA/DOPE単独よりも最大800倍効率的であった(D/D単独を使用したトランスフェクションを100%と定義する)。G1,2,3-KLは、HeLa細胞において、D/D単独と比較してトランスフェクション効率を200倍改善した(図4A)。Neuro 2A細胞において、G1,2,3-KL及びG1,2,3-RLの活性は、DOTMA/DOPE単独よりもそれぞれ340倍及び1500倍高かった(図4B)。この観察は、RLデンドリマーがKLデンドリマーよりも強くDNAに結合し、したがってそれらがより安定であり、血清中の荷電成分からの攻撃に対して耐性があるという事実によって説明することができる。
トランスフェクション試薬によって媒介される細胞毒性は、インビボ用途のための重要なパラメータである。デンドリマー含有製剤の毒性を対照の毒性と比較した。デンドリマーの修飾のほとんどは、HeLa細胞に対してより高い毒性を誘導せず、細胞生存率は、G1,2,3-KL(約40%以上)及び市販の試薬Lipofectamine 2000(約20%)に匹敵し、補充脂質(D/D、約40%)と同様であった。世代数を1から3に増加させても、毒性は増加しなかった。デンドリマー製剤によって引き起こされる毒性の実際の機構はよく知られていないが、製剤からの毒性の一部は、以前に示されたようにD/Dの添加によるものであり、D/D単独対照からも生じた。実際、脂質-デンドリマー-DNA複合体の大部分は、D/D対照と比較してより高い毒性を媒介しなかったが、デンドリマー複合体の大部分は、広く使用されているLipofectamine 2000と比較してより高い細胞生存率をもたらした。無効なG1-KL又はRL製剤も40%の細胞死を誘導したので、デンドリマー複合体の毒性は、トランスフェクション効率に直接関連しなかった。Neuro2A細胞において、ほとんどのデンドリマー-DNA複合体は、HeLa細胞におけるほど毒性ではなかった(80%以上の細胞生存率)。全体として、トランスフェクション後の細胞生存率は、参照試薬Lipofectamine 2000(約45%)よりも有意に高かった。
取り込み機構
本発明の組成物の取り込み機構を調査した。クラスリン媒介性エンドサイトーシスを阻害するために、クロルプロマジンを用いた。ゲニステイン及びロットレリンも使用した。これらの薬剤は、カベオラ媒介性エンドサイトーシス及びミクロピノサイトーシスをそれぞれ阻害することが報告されている。
本発明の組成物の取り込み機構を調査した。クラスリン媒介性エンドサイトーシスを阻害するために、クロルプロマジンを用いた。ゲニステイン及びロットレリンも使用した。これらの薬剤は、カベオラ媒介性エンドサイトーシス及びミクロピノサイトーシスをそれぞれ阻害することが報告されている。
本発明者らは、クロルプロマジンの添加がトランスフェクションを80%有意に阻害することを観察し(図5B)、クラスリン媒介性エンドサイトーシスがデンドリマー系によるDNA送達において重要な役割を果たすことを示唆した。ゲニステイン及びロットレリンは、トランスフェクションを約50%阻害した(図5D、F)。これは、ペプチドデンドリマー系が、少なくとも3つの異なる経路を介して細胞取り込みを媒介し、クラスリン媒介性エンドサイトーシスが内在化のための重要な経路であることを示唆した。異なる細胞内在化経路を誘発する能力は、異なる細胞型によるナノ粒子の取り込みを可能にし、したがって、このデンドリマー系がインビボでDNAカーゴを送達するという事実を説明するであろう。
考察
本発明者らは、トランスフェクションに対するRL及びKL(すなわち、疎水性基とカチオン性基との組み合わせ)ベースの第3世代デンドリマーの電荷分布の影響を以前に報告している(Kwok et al,2013)。3つの世代にわたって均一な分布を提供することにより、効率的なトランスフェクション試薬(DOTMA/DOPEと組み合わせて)が得られたが、表面上(第3世代)のみに電荷が集中することで、DNAトランスフェクションが有意に低下した。本明細書(例えば、上記表1)に開示される第3世代デンドリマーバリアントに関する本調査により、効率的なトランスフェクションのためには、樹状構造における電荷分布が、足場内のアミノ酸のトポロジー及びキラリティよりも重要であることが分かる。
本発明者らは、トランスフェクションに対するRL及びKL(すなわち、疎水性基とカチオン性基との組み合わせ)ベースの第3世代デンドリマーの電荷分布の影響を以前に報告している(Kwok et al,2013)。3つの世代にわたって均一な分布を提供することにより、効率的なトランスフェクション試薬(DOTMA/DOPEと組み合わせて)が得られたが、表面上(第3世代)のみに電荷が集中することで、DNAトランスフェクションが有意に低下した。本明細書(例えば、上記表1)に開示される第3世代デンドリマーバリアントに関する本調査により、効率的なトランスフェクションのためには、樹状構造における電荷分布が、足場内のアミノ酸のトポロジー及びキラリティよりも重要であることが分かる。
本発明者らは、世代数がトランスフェクションに重要であり、世代数の増加がトランスフェクション効率を増強する傾向があることを実証する。改善されたトランスフェクション効率は、改善された複合体安定性と一致する。例えば、G1,2,3-RLは、血清条件でのトランスフェクション及びインビボ遺伝子送達に非常に有効なデンドリマーである(データは示さず)。
全身投与により、G1,2,3-RL-DOTMA/DOPE複合体は、アッセイされる全ての組織における機能的遺伝子発現のためのDNAを送達する。遺伝子発現は、肝臓及び骨格筋において特に高く、毒性は観察されなかった。全ての異なる組織へのDNAの送達は、G1,2,3-RL及びDOTMA/DOPE複合体が、全ての細胞型において異なるレベルで発現されるカーゴ取り込みプロセスであるクラスリン媒介性エンドサイトーシス、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、及びマクロピノサイトーシスを介して細胞内在化を媒介し得るという観察と一致する(データは示さず)。
G1,2,3-RL、DOTMA/DOPE、DNA組成物の生体分布は、当該分野で記載されている他の系とは異なる。例えば、脂質ベース、ペプチドベースの系、及びデンドリマーPAMAM足場は、主にIV投与後に肺及び脾臓にDNAを送達することが観察された。PEI及び両親媒性ペプチドは、DNAを肺及び肝臓に効果的に送達したが、PEIの使用で毒性が観察された。対照的に、本発明は、毒性なしに筋肉に送達する有効な手段を提供する。腎臓及び脾臓における比較的低い遺伝子発現は、本発明の組成物が腎臓及び細網内皮系によるクリアランスに供されないことを意味する。したがって、肝臓における高い遺伝子発現は、主に肝細胞及び星細胞への送達を示唆する(データは示さず)。
本発明の組成物は、核酸を脳に機能的に送達することもできる。血液脳関門(blood brain barrier、BBB)を通る又はその周囲の経路は確かではないが、内皮細胞がカーゴを障壁の一端でエンドサイトーシスし、他端でエキソサイトーシスするプロセスであるトランスサイトーシスが可能である。トランスサイトーシスは、ボラ型両親媒性物質系などの他の合成系によってBBBを迂回してカーゴを送達することが報告されている。
驚くべきことに、本発明の組成物は、ほとんどの非ウイルス遺伝子送達系がこの標的への効果的でない送達を示すという事実にもかかわらず(データは示さず)、DNAを骨格筋に効果的に送達する。骨格筋は、カベオリン3(caveolin 3、Cav3)のみを発現し、これは、本発明の送達系がCav3成分と相互作用して有効な細胞内在化を媒介することを示唆し得る。
本発明のペプチドデンドリマーは、アミノ酸組成、デンドリマーのトポロジー、並びにC末端及びN末端上の可能な修飾に関して利用可能である大きな化学的空間を有する、効率的かつ潜在的に標的に合わせたトランスフェクション試薬を提供する、汎用性のプラットフォームを表す。ペプチドデンドリマー/DOTMA/DOPE系は、生物学的障壁を迂回して、他のアジュバントなしでDNAプラスミドを細胞核にインビボで送達することができる。エンドソーム脱出及び/又は核局在化を助ける細胞特異的標的化ドメイン、ペプチド、又は他の分子をデンドリマーにコンジュゲートして、細胞/組織標的化送達及び遺伝子発現を更に改善することができることが想定される。
材料及び方法
分取RP-HPLC後に、G1,2,3-KL((KL)8(KKL)4(KKL)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(72.3mg、10.3μmol、9%)。分析用RP-HPLC:tR=1.47分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C218H422N60O39S計算値/実測値:4540.1/4539.0[M]+。
分取RP-HPLC後に、G1,2,3-KL((KL)8(KKL)4(KKL)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(72.3mg、10.3μmol、9%)。分析用RP-HPLC:tR=1.47分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C218H422N60O39S計算値/実測値:4540.1/4539.0[M]+。
分取RP-HPLC後に、G1,2-KL((KL)4(KKL)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(90.5mg、27.9μmol、41%)。分析用RP-HPLC:tR=1.36分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C96H182N28O19S計算値/実測値:2096.8/2096.0[M]+。
分取RP-HPLC後に、G1-KL((KL)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(46.0mg、41.7μmol、60%)。分析用RP-HPLC:tR=1.23分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C38H74N12O9S計算値/実測値:875.1/875.4[M]+。
分取RP-HPLC後に、G1,2,3-RL((RL)8(KRL)4(KRL)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(14.6mg、2.0μmol、2%)。分析用RP-HPLC:tR=1.50分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。HRMS(NSI+):C218H422N88O39S計算値/実測値:4932.3/4931.4[M]+;5106.3/5105.7[M+TFA+Na+K]+;5220.3/5219.9[M+2TFA+Na+K]+;5616.4/5616.3[M+6TFA]+;5730.4/5730.3[M+7TFA]+;5844.5/5844.3[M+8TFA]+;5958.5/5958.3[M+9TFA]+;6072.5/6072.3[M+10TFA]+。
分取RP-HPLC後に、G1,2-RL((RL)4(KRL)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(143.2mg、42.1μmol、38%)。分析用RP-HPLC:tR=1.45分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C96H190N40O19S計算値/実測値:2264.9/2264.0[M]+。
分取RP-HPLC後に、G1-RL((RL)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(78.5mg、56.6μmol、51%)。分析用RP-HPLC:tR=1.37分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C38H74N16O9S計算値/実測値:931.2/931.2[M]+;1045.2/1045.4[M+1TFA]+。
分取RP-HPLC後に、G1,2-LK,3-KL((KL)8(KLK)4(KLK)2KCGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(56.7mg、8.1μmol、7%)。分析用RP-HPLC:tR=1.47分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C218H422N60O39S計算値/実測値:4540.1/4539.0[M]+。
分取RP-HPLC後に、G1,2,3-LK,((LK)8(KLK)4(KLK)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(32.4mg、4.6μmol、4%)。分析用RP-HPLC:tR=1.41分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C218H422N60O39S計算値/実測値:4540.1/4539.0[M]+。
Ala-G1,2,3-KL((LysLeu)8(LysLysLeu)4(LysLysLeu)2LysGlySerAla-NH2を、TentaGel S RAM(登録商標)樹脂(500mg、0.22mmol g-1)から得、Ala-G1,2,3-KLを、分取RP-HPLC後に泡状無色固体として得た(36.6mg、5.2μmol、5%)。分析用RP-HPLC:tR=1.46分(2.2分かけて100%A:100%D、λ=214nm)。MS(ESI+):C218H422N60O39実測値/計算値:4508.0/4508.1[M]+。
分取RP-HPLC後に、G1,2,3-K((K)8(KK)4(KK)2KGSC-NH2)を泡状無色固体として得た(79.9mg、14.6μmol、12%)。分析用RP-HPLC:tR=1.17分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C134H268N46O25S計算値/実測値:2955.9/2956.0[M]+。
分取RP-HPLC後に、G0,1,2,3-KL((KL)8(KKL)4(KKL)2KKLC-NH2)を泡状無色固体として得た(54.2mg、7.5μmol、6%)。分析用RP-HPLC:tR=1.47分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C225H437N61O38S計算値/実測値:4637.3/4638.0[M]+。
分取RP-HPLC後に、D-G1,2,3-KL((kl)8(kkl)4(kkl)2kgsc-NH2)を泡状無色固体として得た(28.3mg、4.0μmol、5%)。分析用RP-HPLC:tR=1.44分(2.2分でA/D 100/0~0/100、λ=214nm)。MS(ESI+):C218H422N60O39S計算値/実測値:4540.1/4540.0[M]+、少量の不純物を含有
DNAトランスフェクション
細胞株、トランスフェクション試薬、及びプラスミド。HeLa細胞を、5%CO2及び37℃の加湿雰囲気中で、10%(v/v)FCS及び1%(v/v)P/Sを含むRPMI培地中で維持した。プラスミドpCI-Lucは、ルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミドpCI(Promega、Southampton,UK)から誘導された。分岐PEI(25kDa)は、Sigma-Aldrichから購入した。Lipofectamine 2000(L2000)及びリポフェクチン(DOTMA:DOPE(1:1(w/w))は、Invitrogenから入手した。PEI、L2000、及びリポフェクチンを製造者の指示に従って陽性対照トランスフェクション剤として使用した。
細胞株、トランスフェクション試薬、及びプラスミド。HeLa細胞を、5%CO2及び37℃の加湿雰囲気中で、10%(v/v)FCS及び1%(v/v)P/Sを含むRPMI培地中で維持した。プラスミドpCI-Lucは、ルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミドpCI(Promega、Southampton,UK)から誘導された。分岐PEI(25kDa)は、Sigma-Aldrichから購入した。Lipofectamine 2000(L2000)及びリポフェクチン(DOTMA:DOPE(1:1(w/w))は、Invitrogenから入手した。PEI、L2000、及びリポフェクチンを製造者の指示に従って陽性対照トランスフェクション剤として使用した。
トランスフェクション手順。トランスフェクションの24時間前に、HeLa細胞を96ウェルプレートに播種して(100μL/ウェル中10,000細胞)、70%コンフルエンスに到達させた。プラスミドトランスフェクション複合体は、デンドリマー(100μL、N/P比に応じて60μg~105μg)をリポフェクチン(4μg;100μL)と混合することによって形成した。これらの混合物を、pCI-Luc(4μg;100μL)とともに、25℃で30分間、OptiMEM中において異なるN/P比でインキュベートした。トランスフェクション対照複合体(PEI、リポフェクチン又はL2000)(OptiMEM中合計100μL)を、それぞれの製造業者の推奨濃度でpCI-Luc(4μg;100μL)と混合した。無血清培地中でのトランスフェクションのために、DNA複合体を細胞上に重層する前に、OptiMEMを添加して複合体を希釈し、各複合体が96ウェルプレートの1つのウェル中に100μLの総容量中に0.25μgのDNAを含有するようにした。血清培地中でのトランスフェクションのために、DNA複合体を細胞上に重層する前に、完全成長培地を添加して複合体を希釈し、各複合体が96ウェルプレートの1つのウェル中に100μLの総容量中に0.25μgのDNAを含有するようにした。細胞から完全培地を除去した後、複合体をプレートに加えた。プレートを37℃で4時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション溶液を完全成長培地で24時間置換してから、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。
導入遺伝子発現アッセイ。細胞をPBSで2回洗浄し、レポーター溶解緩衝液(20μL、Promega)とともに4℃で20分間、次いで-80℃で一晩インキュベートした。細胞を室温で解凍した後、ルシフェラーゼアッセイ緩衝液(100μL、Promega;製造者のプロトコルに従って調製した)を各ウェルに加えた。発光生成物を、FLUOstar Optimaルミノメーター(BMG Labtech)において相対光単位(Relative Light Unit、RLU)によって測定した。
タンパク質含量決定。溶解物(20μL)をBio-Rad Protein Assay Reagent(180μL、Bio-Rad、Hemel Hempstead,UK)と混合することによって、各細胞溶解物のタンパク質含量を決定した。10分間のインキュベーション後、590nmでの吸光度を測定し、BSA標準曲線を使用してタンパク質濃度に変換した。タンパク質1mg当たりのRLUは、ルシフェラーゼ活性を表した。これら2つの値の比が、タンパク質単位当たりの活性(RLU/mg)である。トランスフェクション図に示された値は、DOTMA/DOPEを用いた対照トランスフェクション実験に対して正規化した後に表され、パーセンテージとして示されている。
細胞生存率。細胞を「トランスフェクション手順」に記載したようにトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。その後、細胞を室温で1時間乾燥させた(核染色剤を浸透させるため)。クリスタルバイオレット溶液(Sigma-Aldrichによって供給されたストック溶液50μL)を細胞に添加した。それらを室温で15分間インキュベートした。蒸留水(5回)で洗浄した後、細胞を室温で30分間乾燥させた。次いで、MeOH(200μL)を添加し、懸濁液を室温で1時間インキュベートした。生細胞によって保持されたクリスタルバイオレット染色剤の相対量を、550nmでのメタノール溶液の吸光度によって決定した。
蛍光消光アッセイ
PicoGreen(Invitrogen)をDNAに添加し、TE緩衝液(10mM Tris/HCl、pH7.5;1mM EDTA)を添加して、最終DNA濃度0.002μg/μLとした。PicoGreenをDNAに1:150(v/v)の比で添加し、100μLの溶液ごとに0.2μgのDNAを含有させた。混合物を室温で10分間インキュベートした。インキュベーションの間、異なる量のトランスフェクション試薬をTE緩衝液で希釈した。次いで、50μLのリポフェクチン(0.2μg)及び50μLのデンドリマー(量は、0.625:1から40:1まで変化させた選択されたN/P比に依存する)を、平底96ウェルプレートのウェルごとに添加した。その後、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)をウェルごとに添加した。対照として、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)を100μLのTE緩衝液に添加した。室温で30分間インキュベートした後、100μLのTE緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、PicoGreenシグナルを、蛍光プレートリーダー(FLUOstar Optima,BMG Labtech)を用いて、485nmでの励起及び520nmでの発光で検出した。複合体からのPicoGreenシグナルをDNA対照に対して正規化して、検出されたPicoGreenシグナルのパーセンテージを得た。
PicoGreen(Invitrogen)をDNAに添加し、TE緩衝液(10mM Tris/HCl、pH7.5;1mM EDTA)を添加して、最終DNA濃度0.002μg/μLとした。PicoGreenをDNAに1:150(v/v)の比で添加し、100μLの溶液ごとに0.2μgのDNAを含有させた。混合物を室温で10分間インキュベートした。インキュベーションの間、異なる量のトランスフェクション試薬をTE緩衝液で希釈した。次いで、50μLのリポフェクチン(0.2μg)及び50μLのデンドリマー(量は、0.625:1から40:1まで変化させた選択されたN/P比に依存する)を、平底96ウェルプレートのウェルごとに添加した。その後、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)をウェルごとに添加した。対照として、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)を100μLのTE緩衝液に添加した。室温で30分間インキュベートした後、100μLのTE緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、PicoGreenシグナルを、蛍光プレートリーダー(FLUOstar Optima,BMG Labtech)を用いて、485nmでの励起及び520nmでの発光で検出した。複合体からのPicoGreenシグナルをDNA対照に対して正規化して、検出されたPicoGreenシグナルのパーセンテージを得た。
複合体解離アッセイ
PicoGreen(Invitrogen)をDNAに添加し、TE緩衝液(10mM Tris/HCl、pH7.5;1mM EDTA)で0.002μg/μLの最終DNA濃度まで希釈した(100μLごとの溶液が0.2μgのDNAを含有するように、PicoGreenを1:150(v/v)の比でDNAに添加した)。混合物を室温で10分間インキュベートした。インキュベーションの間、異なる量のトランスフェクション試薬をTE緩衝液で希釈した。次いで、50μLのリポフェクチン(0.2μg)及び50μLのデンドリマー(量は、0.625:1から40:1まで変化させた選択されたN/P比に依存する)を、平底96ウェルプレートのウェルごとに添加した。その後、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)をウェルごとに添加した。対照として、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)を100μLのTE緩衝液に添加した。室温で30分間インキュベートした後、100μLのTE緩衝液で希釈した異なる濃度のヘパリン(0.2~1.4U/mL、Sigma-Aldrich)を、DNA複合体又はDNA単独(0.2μg、総体積200μL)に添加した。室温で30分間インキュベートした後、PicoGreenからの蛍光シグナルを、マイクロプレートリーダー(FLUOstar Optima,BMG Labtech)を使用して、励起485nm及び発光520nmで記録した。DNA対照を用いてシグナルを正規化した。
PicoGreen(Invitrogen)をDNAに添加し、TE緩衝液(10mM Tris/HCl、pH7.5;1mM EDTA)で0.002μg/μLの最終DNA濃度まで希釈した(100μLごとの溶液が0.2μgのDNAを含有するように、PicoGreenを1:150(v/v)の比でDNAに添加した)。混合物を室温で10分間インキュベートした。インキュベーションの間、異なる量のトランスフェクション試薬をTE緩衝液で希釈した。次いで、50μLのリポフェクチン(0.2μg)及び50μLのデンドリマー(量は、0.625:1から40:1まで変化させた選択されたN/P比に依存する)を、平底96ウェルプレートのウェルごとに添加した。その後、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)をウェルごとに添加した。対照として、100μLのDNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)を100μLのTE緩衝液に添加した。室温で30分間インキュベートした後、100μLのTE緩衝液で希釈した異なる濃度のヘパリン(0.2~1.4U/mL、Sigma-Aldrich)を、DNA複合体又はDNA単独(0.2μg、総体積200μL)に添加した。室温で30分間インキュベートした後、PicoGreenからの蛍光シグナルを、マイクロプレートリーダー(FLUOstar Optima,BMG Labtech)を使用して、励起485nm及び発光520nmで記録した。DNA対照を用いてシグナルを正規化した。
インビボルシフェラーゼDNA発現アッセイ
デンドリマー、脂質、及びDNA製剤をマウスに注射し、組織を単離し、静脈内及び筋肉内注射のそれぞれ24時間後及び48時間後にルシフェラーゼ発現分析のために急速凍結した。
デンドリマー、脂質、及びDNA製剤をマウスに注射し、組織を単離し、静脈内及び筋肉内注射のそれぞれ24時間後及び48時間後にルシフェラーゼ発現分析のために急速凍結した。
組織を、プロテアーゼ阻害剤を補充した1×レポーター溶解緩衝液でホモジナイズした。組織に応じて、1.5~3倍の溶解緩衝液を組織のホモジナイズに使用した。ホモジナイズ後、溶解物を遠心分離し、上清をルシフェラーゼ発現及びタンパク質含量のアッセイに使用した。ルシフェラーゼ発現レベルを、製造業者の指示に従って、ルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を使用して、ルミノメーターで測定した。Bioradタンパク質アッセイキットを使用して、製造業者の指示に従って595nmの吸光度でタンパク質含量を測定した。
インビボルシフェラーゼmRNA発現アッセイ
ペプチドデンドリマー-脂質-mRNA粒子
ペプチドデンドリマーをそれぞれの濃度に希釈し、NP=0.15:1又は8:1などの所望のNP比のためにmRNAと混合した。溶液を室温で10分間インキュベートした。DOTMA/DOPEなどの脂質をそれぞれの濃度に希釈し、NP=4.7:1などの所望のNP比のためにデンドリマー-mRNA複合体と混合した。溶液を室温で20分間インキュベートした。必要に応じて、注射前に溶液を更に希釈する。
ペプチドデンドリマー-脂質-mRNA粒子
ペプチドデンドリマーをそれぞれの濃度に希釈し、NP=0.15:1又は8:1などの所望のNP比のためにmRNAと混合した。溶液を室温で10分間インキュベートした。DOTMA/DOPEなどの脂質をそれぞれの濃度に希釈し、NP=4.7:1などの所望のNP比のためにデンドリマー-mRNA複合体と混合した。溶液を室温で20分間インキュベートした。必要に応じて、注射前に溶液を更に希釈する。
脂質-mRNA粒子制御
DOTMA/DOPEをそれぞれの濃度に希釈し、デンドリマー-mRNA複合体と混合した。溶液を室温で20分間インキュベートした。必要に応じて、注射前に溶液を更に希釈する。
DOTMA/DOPEをそれぞれの濃度に希釈し、デンドリマー-mRNA複合体と混合した。溶液を室温で20分間インキュベートした。必要に応じて、注射前に溶液を更に希釈する。
マウス及び送達経路
本発明者らの研究において行われた全ての動物手順は、UK法に従っており、倫理承認を含んでいた。6~8週齢の雌CD-1マウス(n=39)を、到着時に1週間馴化させた。全てのマウスを秤量し、製剤を、30Gインスリンシリンジ(BD biosciences)を使用して尾静脈を介して静脈内に送達した(100μl)。
本発明者らの研究において行われた全ての動物手順は、UK法に従っており、倫理承認を含んでいた。6~8週齢の雌CD-1マウス(n=39)を、到着時に1週間馴化させた。全てのマウスを秤量し、製剤を、30Gインスリンシリンジ(BD biosciences)を使用して尾静脈を介して静脈内に送達した(100μl)。
生物発光イメージング(Bioluminescence imaging、BLI)
全てのマウスを注射の6時間後に撮像した。BLIは、IVIS Lumina II(Perkin Elmer)イメージングシステムを使用して実施した。マウスにD-ルシフェリン(30mg/mL、XenoLight、Perkin Elmer)を150mg/kgの用量で投与した。マウスを、5%イソフルランを含むチャンバー内でD-ルシフェリンを投与した6分後に麻酔し、次いで、2.5%イソフルランで維持しながら、加熱したイメージングプラットフォーム上に置いた。得られたシグナルが有効な検出範囲(オープンフィルター、ビニング8、f-ストップ1)内にあることを確実にするように設定された曝露時間で、D-ルシフェリン投与の10分後にマウスを撮像した。生物発光シグナルを、Living Imageソフトウェア(Perkin Elmer)を使用して、規定された関心領域(region of interest、ROI)における光子束(光子/秒)を測定することによって定量した。インビボ全身イメージングの後、マウスを安楽死させ、心臓血液を採取し、エクスビボイメージングのために組織を抽出した。ここで、各組織を、PBS中に0.3mg/mLのD-ルシフェリンを含有する24ウェルイメージングプレート(黒色面、Eppendorf)の個々のウェルに入れた。イメージングプレートをイメージングプラットフォーム(Lumina IIシステム)の中心に置き、上で詳述した取得設定を使用してシグナルを測定した。最後に、組織を保存バイアルに入れ、液体窒素中で急速冷凍した。
全てのマウスを注射の6時間後に撮像した。BLIは、IVIS Lumina II(Perkin Elmer)イメージングシステムを使用して実施した。マウスにD-ルシフェリン(30mg/mL、XenoLight、Perkin Elmer)を150mg/kgの用量で投与した。マウスを、5%イソフルランを含むチャンバー内でD-ルシフェリンを投与した6分後に麻酔し、次いで、2.5%イソフルランで維持しながら、加熱したイメージングプラットフォーム上に置いた。得られたシグナルが有効な検出範囲(オープンフィルター、ビニング8、f-ストップ1)内にあることを確実にするように設定された曝露時間で、D-ルシフェリン投与の10分後にマウスを撮像した。生物発光シグナルを、Living Imageソフトウェア(Perkin Elmer)を使用して、規定された関心領域(region of interest、ROI)における光子束(光子/秒)を測定することによって定量した。インビボ全身イメージングの後、マウスを安楽死させ、心臓血液を採取し、エクスビボイメージングのために組織を抽出した。ここで、各組織を、PBS中に0.3mg/mLのD-ルシフェリンを含有する24ウェルイメージングプレート(黒色面、Eppendorf)の個々のウェルに入れた。イメージングプレートをイメージングプラットフォーム(Lumina IIシステム)の中心に置き、上で詳述した取得設定を使用してシグナルを測定した。最後に、組織を保存バイアルに入れ、液体窒素中で急速冷凍した。
エンドサイトーシス実験
細胞を各阻害剤(クロルプロマジン、ゲンステイン(genstein)、及びロットレリン)とともに37℃で30分間プレインキュベートした。続いて、トランスフェクションのセクションに記載したように、阻害剤の存在下、37℃で更に4時間、トランスフェクションを実施した。
細胞を各阻害剤(クロルプロマジン、ゲンステイン(genstein)、及びロットレリン)とともに37℃で30分間プレインキュベートした。続いて、トランスフェクションのセクションに記載したように、阻害剤の存在下、37℃で更に4時間、トランスフェクションを実施した。
インビボ研究
DNAを含む組成物を使用したFST発現の誘導
1日目及び3日目に、フォリスタチンを発現するDNAを単独で、又はフォリスタチンを発現するDNAをG1,2,3-RL及びD/D脂質とともにマウスに注射した。5日目に、RNA抽出のために組織を採取した。次いで、qPCRのためにmRNAからcDNAを合成した。マウスの骨格筋におけるフォリスタチン(follistatin、FST)の相対的発現レベルを図6に示す。
DNAを含む組成物を使用したFST発現の誘導
1日目及び3日目に、フォリスタチンを発現するDNAを単独で、又はフォリスタチンを発現するDNAをG1,2,3-RL及びD/D脂質とともにマウスに注射した。5日目に、RNA抽出のために組織を採取した。次いで、qPCRのためにmRNAからcDNAを合成した。マウスの骨格筋におけるフォリスタチン(follistatin、FST)の相対的発現レベルを図6に示す。
免疫原性/忍容性
体重を、上記で議論したDNA送達のためのタイプのIVプロトコルの間にモニタした。重量損失は観察されなかった(図7を参照されたい)。
体重を、上記で議論したDNA送達のためのタイプのIVプロトコルの間にモニタした。重量損失は観察されなかった(図7を参照されたい)。
1日目及び3日目に、注射を受けなかったマウス、又はDNAのみ若しくはDNA、G1,2,3-RL及びD/D製剤を静脈内注射したマウスについて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(Aspartate aminotransferase、AST)及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(Alanine aminotransferase、ALT)レベルもモニタした。全ての群について、ASTレベルは実質的に200U/L未満のままであり、ALTレベルは100U/L未満のままであった。(AST及びALTのこれらのレベルは、肝臓損傷(四塩化炭素によって誘導される)の疾患モデルにおける7000U/Lを超える閾値レベルよりもはるかに低い(Bonnet et al 2008))。
免疫原性をチェックするために、マウスにおいてサイトカインレベルも測定した。AST及びALTレベルの測定のために5日目に血清を採取した。実質的な上昇は観察されなかった。IFN-ガンマについて、レベルは2pg/mL未満のままであり、有意な増加はなかった(他の非ウイルス系はIFN-ガンマを60,000pg/mLまで上昇させることができた(Bonnet et al 2008))。TNF-アルファについては、レベルは20pg/mL未満のままであり、有意な増加はなかった(リポ多糖類はTNF-アルファを5000pg/mLまで増加させることができた(Bonnet et al 2008))。IL-6については、本発明の組成物を投与したマウス群のレベルは、20pg/mL未満のままであり、有意な増加はなかった(他の非ウイルス系は、IL-6レベルを15000pg/mLまで増加させることができた(Bonnet et al 2008))。IL-1ベータ及びIL-10についても、レベルは非常に低いままであり、有意な増加はなかった。
DNAを含む組成物を使用したルシフェラーゼ発現の誘導
注射後のルシフェラーゼ発現を検出するために調製したデンドリマー、脂質、及びDNA製剤をマウスに注射した。静脈内及び筋肉内注射のそれぞれ24時間後及び48時間後に、組織を単離し、ルシフェラーゼ発現分析のために急速凍結した。
注射後のルシフェラーゼ発現を検出するために調製したデンドリマー、脂質、及びDNA製剤をマウスに注射した。静脈内及び筋肉内注射のそれぞれ24時間後及び48時間後に、組織を単離し、ルシフェラーゼ発現分析のために急速凍結した。
静脈内注射されたG1,2,3-RL及びG1,2,3-LRの両方を含む組成物は、ルシフェラーゼ発現によって決定されるような、骨格筋へのDNAの標的化送達を標的とし、G1,2,3-LRは、骨格筋への最も有効な送達を示した(図8)。
筋肉内注射されたG1,2-RL,3-LRを含む組成物はまた、ルシフェラーゼ発現によって決定されるように、骨格筋にDNAを送達することができる(図9)。
mRNAを含む組成物を使用したルシフェラーゼ発現の誘導
DOTMA/DOPEと、ルシフェラーゼをコードするmRNAと、G1,2,3-RL(図10、上パネル;「G1,2,3-RL、脂質、及びmRNA製剤」)又はG1,2-RL,3-LR(図10、下パネル;(「G1,2,3-RL、脂質、及びmRNA製剤」)のいずれかと、を含む組成物をマウスに注射した。各製剤を調製し、8:1及び0.15:1のNP比で注射した。注射後のルシフェラーゼ発現を検出するためにマウスを準備した。
DOTMA/DOPEと、ルシフェラーゼをコードするmRNAと、G1,2,3-RL(図10、上パネル;「G1,2,3-RL、脂質、及びmRNA製剤」)又はG1,2-RL,3-LR(図10、下パネル;(「G1,2,3-RL、脂質、及びmRNA製剤」)のいずれかと、を含む組成物をマウスに注射した。各製剤を調製し、8:1及び0.15:1のNP比で注射した。注射後のルシフェラーゼ発現を検出するためにマウスを準備した。
G1,2,3-RL又はG1,2-RL,3-LR製剤のいずれかのNP比を変化させると、マウス組織におけるmRNAの生体内分布が変化する。0.15:1のNP比は、脾臓及びより低い程度でリンパ節を特異的に標的とするNP=8:1と比較して、肺、脾臓、及びリンパ節を含む広範囲の免疫細胞組織を標的とする(図10)。これは、組成物のNP比を変化させることによって、組成物の組織分布が変化し得ることを実証する。例えば、NP比の増加は、リンパ系器官への標的化を改善することができる。
G1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LR、脂質、並びにmRNA製剤はまた、筋肉、肝臓、心臓、腎臓、及び脂肪組織を含む組織にmRNAを首尾よく送達することができる(図11)。特に、G1,2-RL,3-LR、脂質、及びmRNA製剤は、8:1又は0.15:1のいずれかのNP比で、腓腹筋及び大腿四頭筋組織、肝臓、心臓、腎臓、及び脂肪組織において有意な発現を誘導することができた。
ルシフェラーゼ発現の比較を、G1,2,3-RLと、DOTMA/DOPEと、mRNAと、を含む組成物を注射したマウスと、G1,2-RL.3-LRと、DOTMA/DOPEと、mRNAと、を含む組成物を注射したマウスとの間で実施した。試験した全ての組織への送達の増加が、G1,2,3-RLと比較してG1,2-RL,3-LRについて観察された(図12)。これは、デンドリマー配列の選択が、特定の組織を標的とするために使用され得ることを実証する。
反復投与実験
組成物を繰り返し投与し、組織への送達を維持することができるかどうかを決定するために、DOTMA/DOPE、mRNA及びペプチドデンドリマーの単回投与又は反復投与(24時間間隔で2回投与)のいずれかを受けたマウス間の比較を実施した。いずれかの組成物を2回投与されたマウスは、mRNA単独と比較してルシフェラーゼ発現の増加を示した。典型的には、2回投与を受けたマウスにおけるルシフェラーゼ発現は、単回投与を受けたマウスと比較して、ほぼ同程度のルシフェラーゼ発現又は増加したルシフェラーゼ発現のいずれかを示した。ルシフェラーゼ発現を処理の6時間後にアッセイした。
組成物を繰り返し投与し、組織への送達を維持することができるかどうかを決定するために、DOTMA/DOPE、mRNA及びペプチドデンドリマーの単回投与又は反復投与(24時間間隔で2回投与)のいずれかを受けたマウス間の比較を実施した。いずれかの組成物を2回投与されたマウスは、mRNA単独と比較してルシフェラーゼ発現の増加を示した。典型的には、2回投与を受けたマウスにおけるルシフェラーゼ発現は、単回投与を受けたマウスと比較して、ほぼ同程度のルシフェラーゼ発現又は増加したルシフェラーゼ発現のいずれかを示した。ルシフェラーゼ発現を処理の6時間後にアッセイした。
組織/細胞標的化ペプチド-デンドリマー融合タンパク質
ルシフェラーゼ発現の比較を、DOTMA/DOPEと、mRNAと、G1,2,3-RL、G1,2-RL,3-LR、又はNXT1のうちの1つと、を含む組成物間で実施した(図14)。NXTIデンドリマーは、筋肉標的化ペプチド及び細胞透過性ペプチドを含むコアペプチド配列を有するG1,2-RL,3-LRデンドリマーを含む。NXT1は、筋肉を含む多くの組織へのmRNA送達を媒介する上で、G1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LRよりも有効である。驚くべきことに、NXT1はまた、G1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LRと比較して、脾臓及びリンパ節へのmRNAの送達においてより有効である。NXT1及びG1,2-RL,3-LRは、肺へのmRNAの送達において同様の効率を示す。
ルシフェラーゼ発現の比較を、DOTMA/DOPEと、mRNAと、G1,2,3-RL、G1,2-RL,3-LR、又はNXT1のうちの1つと、を含む組成物間で実施した(図14)。NXTIデンドリマーは、筋肉標的化ペプチド及び細胞透過性ペプチドを含むコアペプチド配列を有するG1,2-RL,3-LRデンドリマーを含む。NXT1は、筋肉を含む多くの組織へのmRNA送達を媒介する上で、G1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LRよりも有効である。驚くべきことに、NXT1はまた、G1,2,3-RL及びG1,2-RL,3-LRと比較して、脾臓及びリンパ節へのmRNAの送達においてより有効である。NXT1及びG1,2-RL,3-LRは、肺へのmRNAの送達において同様の効率を示す。
デンドリマーは、脂質単独と比較して、組織へのmRNA送達を増加させる
デンドリマーの存在が組織へのmRNAの送達を改善するかどうかを決定するために、:i)mRNA単独;ii)mRNA及びDOTMA/DOPE;iii)G1,2,3-RL、DOTMA/DOPE、及びmRNA;iv)G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE、及びmRNA、又はv)NTX1、mRNA、及びDOTMA/DOPE、のいずれかを含む組成物をマウスに注射して、注射後のルシフェラーゼ発現の検出のために準備した。各デンドリマー組成物中のNP比は、0.15:1であった。図15に実証されるように、G1,2,3-RL、G1,2-RL,3-LR、及びNTX1のいずれかの存在は、mRNA単独又はmRNA及びDOTMA/DOPE単独と比較して、肺、脾臓、及びリンパ節へのmRNA送達の効率を改善する。
デンドリマーの存在が組織へのmRNAの送達を改善するかどうかを決定するために、:i)mRNA単独;ii)mRNA及びDOTMA/DOPE;iii)G1,2,3-RL、DOTMA/DOPE、及びmRNA;iv)G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE、及びmRNA、又はv)NTX1、mRNA、及びDOTMA/DOPE、のいずれかを含む組成物をマウスに注射して、注射後のルシフェラーゼ発現の検出のために準備した。各デンドリマー組成物中のNP比は、0.15:1であった。図15に実証されるように、G1,2,3-RL、G1,2-RL,3-LR、及びNTX1のいずれかの存在は、mRNA単独又はmRNA及びDOTMA/DOPE単独と比較して、肺、脾臓、及びリンパ節へのmRNA送達の効率を改善する。
i)mRNA単独、ii)mRNA、G1,2-RL,3-LR、及びDOTMA/DOPE、又はiii)mRNA及びDOTMA/DOPE、のいずれかを含む組成物を注射したマウス間でも比較を実施した。この実験におけるNP比は、8:1であった。これは、脾臓へのmRNA送達が、mRNA単独又はmRNA及び脂質と比較して、デンドリマーの存在下で有意に増強されることを実証する。更に、肺、及びリンパ節におけるルシフェラーゼの発現は、脂質単独と比較して、デンドリマーを含む組成物において減少する。このデータは更に、G1,2-RL,3-LRが、DOTA/DOPE単独と比較して、脾臓へのmRNA送達の特異性を改善することを実証する。
市販の脂質送達系に対するデンドリマー:脂質送達系の比較
G1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPE(NP=0.16:1)を含む組成物又は市販のLipofectamine(商標)2000のいずれかを使用して、ルシフェラーゼをコードするmRNAをHeLa細胞にトランスフェクトした。図17の左上のパネルに示すように、NP比=0.16:1のG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを含む組成物は、市販のトランスフェクション試薬Lipofectamine(商標)2000と比較して、インビトロでのトランスフェクション効率を約1桁増加させる。同様に、NP比=0.16:1のG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを使用してeGFPをコードするmRNAをトランスフェクトしたHeLa細胞は、DLin-MC3-DMA:コレステロール:DSPC:DMG-PEG脂質ナノ粒子送達系を使用してトランスフェクトしたmRNAと比較して、eGFP発現を約4倍増加させた(図17、右上パネル)。
G1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPE(NP=0.16:1)を含む組成物又は市販のLipofectamine(商標)2000のいずれかを使用して、ルシフェラーゼをコードするmRNAをHeLa細胞にトランスフェクトした。図17の左上のパネルに示すように、NP比=0.16:1のG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを含む組成物は、市販のトランスフェクション試薬Lipofectamine(商標)2000と比較して、インビトロでのトランスフェクション効率を約1桁増加させる。同様に、NP比=0.16:1のG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを使用してeGFPをコードするmRNAをトランスフェクトしたHeLa細胞は、DLin-MC3-DMA:コレステロール:DSPC:DMG-PEG脂質ナノ粒子送達系を使用してトランスフェクトしたmRNAと比較して、eGFP発現を約4倍増加させた(図17、右上パネル)。
mRNA単独、G1,2-RL,3-LR(N:P=8:1)及びDOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)とmRNA、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)とmRNA、ポリエチレンイミンとmRNA、及びLipofectamine 2000とmRNA、のいずれかをC2C12細胞に24時間トランスフェクトした。図17の下パネルに示されるように、デンドリマー製剤は、市販の脂質ベースのトランスフェクション試薬と比較して、C2C12細胞へのmRNAの送達を改善する。
インビトロCRISPR実験
Label IT(登録商標)核酸標識キット(Mirus Bio LLC)を製造説明書に従って使用してRNAを標識した。簡潔に述べると、tracerRNA(trRNA)と融合したCRISPR RNA(crRNA)からなる単一ガイドRNA(sgRNA)をTM-ローダミンフルオロフォアで標識し、Cas9 mRNAをCy5フルオロフォアで標識した。crRNA及びtrRNAを、それぞれフルオレセイン及びATTO 550フルオロフォアでタグ化した。
Label IT(登録商標)核酸標識キット(Mirus Bio LLC)を製造説明書に従って使用してRNAを標識した。簡潔に述べると、tracerRNA(trRNA)と融合したCRISPR RNA(crRNA)からなる単一ガイドRNA(sgRNA)をTM-ローダミンフルオロフォアで標識し、Cas9 mRNAをCy5フルオロフォアで標識した。crRNA及びtrRNAを、それぞれフルオレセイン及びATTO 550フルオロフォアでタグ化した。
HeLa細胞に、(1)NP比=0.15:1のG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPE、又は(2)NP比=8:1のG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEのいずれかの製剤と標識RNAの異なる組み合わせをトランスフェクトした。全ての組成物における脂質対RNA比は10:1 w/wであり、DOTMA:DOPEは1:1の重量比であった。細胞を各製剤とともに2時間インキュベートし、続いてトリプシン処理し、固定した。細胞におけるRNA取り込みのパーセンテージを、フローサイトメトリーによってアッセイした。製剤を含まないRNAのみを対照として使用した。
sgRNA+Cas9 mRNA製剤に曝露されたHeLa細胞のおよそ100%が、sgRNA及びCas9 mRNAに対して二重陽性であることが分かり、G1,2-RL,3-LRデンドリマーが非常に有効なトランスフェクション試薬であることを実証した(図18)。
crRNA、trRNA及びCas9 mRNAを含むデンドリマー及び脂質製剤において、デンドリマー製剤は、細胞の約4%において3つ全ての成分の送達を媒介することができる(図19)。crRNA、trRNA、又はCas9 mRNAのうちの1つのみを含むデンドリマー及び脂質製剤では、陽性細胞のパーセンテージが変動する。trRNA又はCas9 mRNAのいずれかを含む組成物では、細胞の約100%が核酸について陽性である。対照的に、crRNAのみを含む組成物に曝露された場合、細胞の4%のみがcrRNAに対して陽性である(図20)。まとめると、このデータは、G1,2-RL,3-LRデンドリマーが、細胞への比較的短いRNA(例えば、本研究において使用されるcrRNAは、36ヌクレオチド長であった)の送達を首尾よく媒介することができる一方で、トランスフェクトされるRNAの長さが増加するにつれて、RNAの送達の成功が増加することを実証する(本研究において使用されるtrRNA及びCas9 mRNAは、それぞれ、67及び5421ヌクレオチド長であった)。
免疫細胞標的化
15匹の5~7週齢の雌CD-1マウス(Charles River UK)に、Alexa Fluor488のみで標識されたmRNA、又はNTX1及びDOTMA/DOPEを有するAlexa Fluor488で標識されたmRNA、又はG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを有するAlexa Fluor488で標識されたmRNA、又はG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを有するAlexa Fluor488で標識されたmRNAのいずれか1mg/kgを、それぞれ、5ml/kgの用量体積を使用する静脈内注射によって投与した。群1にはビヒクルを与え、群5には対照としてmRNAのみを与えた。全ての群のマウスを、IV投与の2時間後に殺処分した。安楽死の時点で、全血、脾臓、鼠径リンパ節、及び大腿骨を全てのマウスから収集した。フローサイトメトリー分析のために、EDTA処理した全血、脾臓、鼠径リンパ節、及び骨髄から白血球(White Blood Cell、WBC)を得た。要約すると、骨髄(bone marrow、BM)を大腿骨から洗い流し、脾臓及びリンパ節を70μmフィルターに通すことによって単一細胞懸濁液に処理した。血液、BM及び脾臓中の赤血球を溶解した後、全ての組織から単離したWBCを異なる抗体パネルで染色して、免疫細胞の特定の亜集団を同定した。96ウェルプレートフォーマットで染色を実施した後、ACEA Novocyte 3005フローサイトメーターを使用して試料を分析した。
15匹の5~7週齢の雌CD-1マウス(Charles River UK)に、Alexa Fluor488のみで標識されたmRNA、又はNTX1及びDOTMA/DOPEを有するAlexa Fluor488で標識されたmRNA、又はG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを有するAlexa Fluor488で標識されたmRNA、又はG1,2-RL,3-LR及びDOTMA/DOPEを有するAlexa Fluor488で標識されたmRNAのいずれか1mg/kgを、それぞれ、5ml/kgの用量体積を使用する静脈内注射によって投与した。群1にはビヒクルを与え、群5には対照としてmRNAのみを与えた。全ての群のマウスを、IV投与の2時間後に殺処分した。安楽死の時点で、全血、脾臓、鼠径リンパ節、及び大腿骨を全てのマウスから収集した。フローサイトメトリー分析のために、EDTA処理した全血、脾臓、鼠径リンパ節、及び骨髄から白血球(White Blood Cell、WBC)を得た。要約すると、骨髄(bone marrow、BM)を大腿骨から洗い流し、脾臓及びリンパ節を70μmフィルターに通すことによって単一細胞懸濁液に処理した。血液、BM及び脾臓中の赤血球を溶解した後、全ての組織から単離したWBCを異なる抗体パネルで染色して、免疫細胞の特定の亜集団を同定した。96ウェルプレートフォーマットで染色を実施した後、ACEA Novocyte 3005フローサイトメーターを使用して試料を分析した。
NTX1及びG1,2-RL,3-LRは、脾臓に存在する免疫細胞におけるmRNAの取り込みを媒介した(図21)。デンドリマー及び脂質とともに製剤化されたmRNAは、(A)B細胞、(B)T細胞、(C)単球及びマクロファージ、(D)好中球、並びに(E)樹状細胞によって取り込まれた。特に、デンドリマー及び脂質製剤は、注射から比較的短い時間内(注射後2時間)に単球及びマクロファージ、好中球、並びに樹状細胞にmRNAを送達することができる。NTX1(NP=0.15:1)及びG1,2-RL,3LR(NP=0.15:1及び8:1)は、単球/マクロファージ、好中球、及び樹状細胞の約5%以上へのmRNAの送達を媒介する。注射から組織採取までの期間が短いことを考慮すると、分析される免疫細胞型のそれぞれへのmRNAの送達が経時的に増加すると仮定することは妥当である。
NTX1及びG1,2-RL,3-LRは、骨髄に存在する免疫細胞におけるmRNAの取り込みを媒介した(図22)。デンドリマー及び脂質とともに製剤化されたmRNAは、(A)単球及びマクロファージ、(B)樹状細胞、(C)CD38+細胞、(D)B細胞、並びに(E)好中球によって取り込まれた。特に、デンドリマー及び脂質製剤は、注射から比較的短い時間内(注射後2時間)に単球及びマクロファージ、好中球、並びに樹状細胞にmRNAを送達することができる。注射から組織採取までの期間が短いことを考慮すると、分析される免疫細胞型のそれぞれへのmRNAの送達が経時的に増加すると仮定することは妥当である。
インビトロDNA送達
図25の上のパネルは、DNA単独、G1,2,3-RL(N:P=5:1)及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA、並びにG1,2,3-RL(N:P=5:1)及びDOPG/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA、のいずれかをトランスフェクトしたHela細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す。G1,2,3-RL及びDOTMA/DOPE又はDOPG/DOPEのいずれかを含む組成物は、インビトロでHeLa細胞を首尾よくトランスフェクトすることができる。
図25の上のパネルは、DNA単独、G1,2,3-RL(N:P=5:1)及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA、並びにG1,2,3-RL(N:P=5:1)及びDOPG/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA、のいずれかをトランスフェクトしたHela細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す。G1,2,3-RL及びDOTMA/DOPE又はDOPG/DOPEのいずれかを含む組成物は、インビトロでHeLa細胞を首尾よくトランスフェクトすることができる。
同様に、図25の下パネルは、DNA単独、ポリエチレンイミンとDNA、G1,2-RL,3-LR(N:P=8:1)及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1で)とDNA、並びにNTX2(N:P=8:1)及びDOTMA/DOPE(DNAに対してw/w=1:1)とDNA、のいずれかをトランスフェクトされたC2C12細胞(筋肉由来細胞株)におけるルシフェラーゼ発現を示す。NTX2は、筋標的化ペプチドASSLINA((LR)8(KRL)4(KRL)2KGSCGAASSLNIA(Acp)-NH2)にコンジュゲートされたG1,2-RL,3-LRデンドリマーである。両方のデンドリマーは、インビトロでC2C12細胞を首尾よくトランスフェクトすることができる。筋肉標的化ドメインを含むデンドリマーは、筋肉標的化ドメインを含まないデンドリマーと比較してトランスフェクション効率を更に増加させる。
インビボ毒性アッセイ
マウスにmRNA製剤を1回又は2回注射した。2回のIV注射では、2回目の注射の24時間前にマウスに注射した。2回目のIV注射の6時間後、マウスの血漿を採取し、ASTレベル及び他のサイトカインレベルを測定した。1回注射したマウスについては、ASTレベル及び他のサイトカインレベル測定のために、注射の6時間後に血漿を採取した。
マウスにmRNA製剤を1回又は2回注射した。2回のIV注射では、2回目の注射の24時間前にマウスに注射した。2回目のIV注射の6時間後、マウスの血漿を採取し、ASTレベル及び他のサイトカインレベルを測定した。1回注射したマウスについては、ASTレベル及び他のサイトカインレベル測定のために、注射の6時間後に血漿を採取した。
アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)は、肝臓の健康の尺度として使用することができ、薬剤の肝臓毒性を決定するためのマーカーとしても使用することができるバイオマーカーである。試験した全てのデンドリマー-脂質-mRNA組成物は、DOTMA/DOPE単独を含む組成物と比較してASTレベルの有意な増加を示さず、実際には、mRNA単独と比較してASTレベルの減少を示した(図26A、上パネル)。これらの結果は、試験したデンドリマー組成物が有意な肝臓毒性を示さないことを示している。
種々のデンドリマー-脂質-mRNA製剤の注射を受けたマウスにおいても、TNF-α、IL-6及びIL-1βを測定した。図26Aの下パネル、並びに図26Bの上及び下パネルに示すように、試験したデンドリマー組成物はいずれも、mRNA単独又はDOTMA/DOPE及びmRNA組成物と比較して、それぞれTNF-α、IL-6又はIL-1βの血漿レベルを有意に増加させなかった。これらのデータは、デンドリマー組成物が、前記組成物に曝露されたマウスにおいて有意な免疫反応を引き起こさないことを実証する。これは更に、インビボでmRNAを組織に送達する際に使用するためのデンドリマー組成物の安全性を実証する。
マウスにはまた、DNA又はG1,2,3-RL、DNA及びDOTMA/DOPE組成物を含む製剤のいずれかを注射し、24時間後にAST、TNF-α、IL-6及びIL-1βの血漿レベルを測定した。図27に示すように、デンドリマーを含む製剤の注射は、AST(左上)、TNF-α(右上)、IL-6(左下)、又はIL-1β(右下)のいずれの血漿レベルにおいても有意な増加を引き起こさなかった。これらのデータは、本発明のデンドリマーを使用するDNAの送達が安全であり、肝臓損傷又はその間の有害な免疫反応を引き起こさないことを示す。
ペプチドデンドリマートランスフェクション効率の比較
mRNA送達におけるデンドリマーの世代数に対する影響を、完全成長培地条件においてHeLa細胞をトランスフェクトすることによって研究した。本発明者らは、第1又は第2世代デンドリマー(例えば、RHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL、2-LR)が細胞を効果的にトランスフェクトし、第3世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介することができることを示した(図28)。第1又は第2世代デンドリマーは、完全成長培地中で第3世代デンドリマーと同様に細胞をトランスフェクトしないので、これは実際にDNAトランスフェクションとは非常に異なる(図4)。興味深いことに、世代1又は世代2デンドリマーのN:P比を0.16から8に増加させると、トランスフェクション効率が更に増加する(図29)。
mRNA送達におけるデンドリマーの世代数に対する影響を、完全成長培地条件においてHeLa細胞をトランスフェクトすることによって研究した。本発明者らは、第1又は第2世代デンドリマー(例えば、RHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL、2-LR)が細胞を効果的にトランスフェクトし、第3世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介することができることを示した(図28)。第1又は第2世代デンドリマーは、完全成長培地中で第3世代デンドリマーと同様に細胞をトランスフェクトしないので、これは実際にDNAトランスフェクションとは非常に異なる(図4)。興味深いことに、世代1又は世代2デンドリマーのN:P比を0.16から8に増加させると、トランスフェクション効率が更に増加する(図29)。
本発明者らは、トランスフェクションに対するデンドリマーのコア配列の影響を研究した。本発明者らは、3つのアミノ酸のコア配列GSCを、G1,2-RL,3-LRから、KA及びYMなどの2つのアミノ酸のみに変えた。この変化はmRNAトランスフェクションに影響せず、コアに2つのアミノ酸を有するデンドリマーが、コアに3つのアミノ酸を有するデンドリマーと同様にトランスフェクトすることを示唆している。次に、本発明者らは、3つのアミノ酸のコア配列を、GSCと比較して、RFW、RYMなどの異なるアミノ酸に置換する。カチオン性基を含有するアルギニンがコアに付加されるが、このアルギニンがトランスフェクションを改善又は減少させることはない。興味深いことに、3つのアミノ酸がコアにおいてGCSからRHCに変化すると、トランスフェクションは50%改善する。これは、デンドリマーのコアにおけるヒスチジンなどのイオン化可能な基がトランスフェクションを改善し得ることを示唆する(図28A)。
本発明者らは、デンドリマー(線状G1,2-RL,3-LR)のコアに12個のアミノ酸を導入したが、トランスフェクション効果は影響を受けなかった(図28A)。この結果は、トランスフェクション効率に影響を与えることなく、より長いアミノ酸鎖及び/又はより長い構造をコアに導入することが可能であることを示す。実際、コアに27個のアミノ酸を含むNTX1は、G1,2-RL,3-RLよりも効果的にトランスフェクトする。これは、より長いコア配列が、実際にトランスフェクションを増強し得ることを実証する。NTX1からのトランスフェクションの増強は、コア配列内の細胞透過性ペプチドの存在による可能性が高い。
本発明者らはまた、トランスフェクションにおける世代内のアミノ酸の数に対する影響を調査する。したがって、本発明者らは、1つのアミノ酸(R)、2つのアミノ酸(RL又はLR)、3つのアミノ酸(RLR)、及び4つのアミノ酸(LRLR)のみを有するデンドリマーを試験した。本発明者らのトランスフェクション研究は、各世代において1、2、3又は4個のアミノ酸を有するデンドリマーが、依然としてmRNAを細胞内に十分にトランスフェクトすることができることを示す(図28A)。本発明者らは更に、各世代において異なる数のアミノ酸を有するデンドリマーを試験し、トランスフェクション効率が影響を受けないことを示した。
G1,2-RL,3-LR構造に基づいて、本発明者らは、塩基性アミノ酸RをKに置換し、かつ/又は疎水性アミノ酸Lを、Eなどの酸性アミノ酸、並びに/若しくはM、F、ベータ-アラニン(B)、アミノヘキサン酸(X)、及びWなどの非極性側鎖を有するアミノ酸、並びに/又はQ、T及びYなどの極性側鎖を有するアミノ酸に変化させた3世代デンドリマーのライブラリーを設計した。
デンドリマー内でRをKに置換すると、mRNAトランスフェクション効率が低下する(図28A)。しかしながら、疎水性アミノ酸を他の疎水性アミノ酸及び/又は極性若しくは非極性側鎖を有するアミノ酸に変更することは、トランスフェクションに影響を及ぼさない可能性があるか、又はG1,2-RL,3-LRと比較してトランスフェクションを30~40%低下させる可能性がある。下線パターンははっきりせず、更なる調査が実施される。しかしながら、これらのデンドリマーは全て、mRNA単独対照よりも有意に高いmRNAトランスフェクションを誘導することができる。
本発明者らはまた、mRNAトランスフェクションに対するデンドリマー内のL又はD型アミノ酸の影響を調査した。G1,2-RL,3-LRデンドリマーに基づいて、本発明者らは、デンドリマーの各世代においてアミノ酸の一部又は全部をL型からD型に変化させてもトランスフェクション効率に影響を与えないことを見出した。デンドリマー内でリジンをジアミノ酪酸に置換することは、トランスフェクションを低下させるが、このデンドリマーのトランスフェクションは、mRNA単独対照よりも依然として有意に高い。
本発明者らは、DOTMA/DOPE(w/w 10:1)とともにG1-LL,2-RRをN:P比0.16:1で使用した本発明者らの製剤プロトコルを用いてmRNAを送達するためにG1-LL,2-RRを使用できることを実証した。興味深いことに、このデンドリマーは、インビトロ及びインビボで異なる製剤にASOを送達するために使用された(Saher 2018)。使用した製剤は、DOTMA/DOPE(ASOに対してw/w=2:1)及びN:P=20:1、G1-LL,2-RR対ASOであった。本発明者らは、これをトランスフェクト細胞(すなわち、DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=2:1)及びN:P=20:1、G1-LL,2-RR対mRNA)に対して試みたが、トランスフェクション効率は低い。この製剤(DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=2:1)及びN:P=20:1、G1-LL,2-RR対mRNA)のmRNAトランスフェクション効率は、本発明者らの改良製剤(DOTMA/DOPE(mRNAに対してw/w=10:1)及びN:P=0.16:1、G1-LL,2-RR対mRNA)のmRNAトランスフェクション効率の10%にしかならない。
本発明者らは、mRNA送達のために、異なる世代においてRL又はLR又はrlのいずれかを有する第3世代デンドリマーを調査した。本発明者らは、これらのデンドリマーのほとんどが同様に細胞をトランスフェクトし、G1,2-RL,3-LRがmRNAトランスフェクションにおいて最も有効であることを見出した。全体として、本発明者らのデータは、各世代において疎水性アミノ酸及びカチオン性アミノ酸を有するデンドリマーが、細胞への有効なmRNA送達をもたらすことを示唆した。
G1,2-RL,3-LRよりも効果的に細胞をトランスフェクトする第1世代及び第2世代デンドリマーが存在するので、本発明者らは、トランスフェクションに関する更なる試験のためにこれらのデンドリマーを選択した。本発明者らは、これらのデンドリマーが一般に、様々なN:P比でG1,2-RL,3-LRよりも良好にトランスフェクトできることを示した。特に、N:P=4:1のRHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL,2-LR、RHCG1-RLR、及びG1-LRLRは、G1,2-RL,3-LRよりも700%~1815%良好にトランスフェクトすることができる。これらのデータは、DNA及びmRNA送達の要件が非常に異なることを実証した。mRNAについては、第1又は第2世代デンドリマーが、完全成長培地条件において第3世代デンドリマーよりも良好に細胞をトランスフェクトする傾向がある。しかしながら、世代3のデンドリマーは、完全成長培地条件において、世代1又は世代2のデンドリマーよりも良好に細胞をDNAでトランスフェクトする(図4)。
図30は、8:1のNP比で送達されたRHCペプチドコアを含む世代2デンドリマーが、主に脾臓(上パネル)及びより低い程度で肺(下パネル)へのmRNA送達を標的とすることを示す。NP比0.15:1では、肺へのmRNA送達は、NP比8:1と比較して増加する。
mRNA発現の調節
mRNA発現は、PEG2000脂質を含む組成物をマウスに注射することによって調節することができる。G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE/PEG2000、及びmRNAを含む組成物を注射したマウスは、G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE、及びmRNAを含む組成物を注射したマウスと比較して、ルシフェラーゼ発現が減弱していた。
mRNA発現は、PEG2000脂質を含む組成物をマウスに注射することによって調節することができる。G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE/PEG2000、及びmRNAを含む組成物を注射したマウスは、G1,2-RL,3-LR、DOTMA/DOPE、及びmRNAを含む組成物を注射したマウスと比較して、ルシフェラーゼ発現が減弱していた。
番号付けされた項
以下の番号付けされた項は、本発明の特定の特質及び特質の組み合わせを示す。
1.医薬における使用のための組成物であって、当該組成物が、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含み、ペプチドデンドリマーが、第1のリジン残基及び2つの第1のペプチドモチーフと、2つの第2のリジン残基及び4つの第2のペプチドモチーフと、4つの第3のリジン残基及び8つの第3のペプチドモチーフと、第1のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含み、
(i)第1のリジン残基が、2つの第1のペプチドモチーフと共有結合し、2つの第1のペプチドモチーフは、それぞれ2つの第2のリジン残基と共有結合し、
(ii)各第2のリジン残基が、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合し、各第2のペプチドモチーフは、それぞれ、第3のリジン残基のうちの1つと共有結合し、
(iii)各第3のリジン残基が、第3のペプチドモチーフのうちの2つと共有結合し、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフが、独立して、モノペプチド又はジペプチドモチーフからなり、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々が、a)アルギニン(R)若しくはリジン(K)、及び/又はb)ロイシン(L)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、若しくはイソロイシン(I)を含み、各アミノ酸残基が、独立して、L-アイソフォーム又はD-アイソフォームから選択される、組成物。
2.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも2つが、アルギニン(R)を含む、項1に記載の使用のための組成物。
3.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも2つが、ロイシン(L)を含む、項1又は2に記載の使用のための組成物。
4.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々が、ジペプチドモチーフである、項1~3のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
5.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々が、ロイシン(L)及びアルギニン(R)を含む、項4に記載の使用のための組成物。
6.核酸が、二本鎖領域を含む、項1~5のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
7.核酸が、DNAプラスミドである、項6に記載の使用のための組成物。
8.核酸が、mRNA分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)であるか、又はそれをコードする、項1~7のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
9.核酸が、CRISPR配列を含む、項1~8のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
10.核酸が、siRNA又はsaRNA分子である、項6に記載の使用のための組成物。
11.DNAプラスミドが、標的細胞においてsiRNA又はsaRNA分子を発現することができる、項7に記載の使用のための組成物。
12.核酸が、標的細胞において導入遺伝子を発現することができる、項7又は8に記載の使用のための組成物。
13.導入遺伝子が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質である、項12に記載の使用のための組成物。
14.ワクチンとしての使用のための、項13に記載の使用のための組成物。
15.患者における遺伝性障害のための遺伝子療法における使用のための、項12に記載の使用のための組成物。
16.遺伝性障害が、患者において筋ジストロフィーを引き起こす、項15に記載の使用のための組成物。
17.遺伝性障害が、患者においてミオパチーを引き起こす、項15に記載の使用のための組成物。
18.導入遺伝子が、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、及び/又は線維芽細胞増殖因子(FGF)である、糖尿病性下肢虚血を治療する方法における使用のための、項12に記載の組成物。
19.コアペプチド配列が、トリペプチドモチーフからなる、項1~18のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
20.トリペプチドモチーフが、グリシン(G)、セリン(S)、及びシステイン(C)、及び/又はアラニン(A)を含む、項18に記載の組成物。
19.脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及び/又はN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含む、項1~18のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
20.脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及びジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)を含む、項1~19のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
21.使用が、患者の筋肉への核酸の送達を含む、項1~20のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
22.項1~21のいずれか1つに記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
23.核酸を標的細胞内に送達する方法であって、標的細胞を項1~20のいずれか1つに記載の組成物と接触させることを含み、標的細胞が、筋細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、又は腫瘍細胞である、方法。
24.第1のリジン残基及び2つの第1のペプチドモチーフと、2つの第2のリジン残基及び4つの第2のペプチドモチーフと、4つの第3のリジン残基及び8つの第3のペプチドモチーフと、第1のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含む、ペプチドデンドリマーであって、
(i)第1のリジン残基が、2つの第1のペプチドモチーフと共有結合し、2つの第1のペプチドモチーフは、それぞれ2つの第2のリジン残基と共有結合し、
(ii)各第2のリジン残基が、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合し、各第2のペプチドモチーフは、それぞれ、第3のリジン残基のうちの1つと共有結合し、
(iii)各第3のリジン残基が、第3のペプチドモチーフのうちの2つと共有結合し、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフが各々、(i)ロイシン-アルギニン(LR)ジペプチドモチーフ、又は(ii)アルギニン-ロイシン(RL)モチーフのいずれかからなり、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも1つが、(i)ロイシン-アルギニン(LR)であり、各アミノ酸残基が、独立して、L-アイソフォーム又はD-アイソフォームから選択される、ペプチドデンドリマー。
25.核酸と、脂質と、項24に記載のペプチドデンドリマーと、を含む、組成物。
26.医薬における使用のための、項25に記載の組成物。
27.核酸を細胞にインビトロで又はエクスビボで送達するための、項25に記載の組成物の使用。
28.ポンペ病、筋肉消耗性疾患、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における使用のための、項1~22又は24~26のいずれか1つに記載の組成物又はペプチドデンドリマー。
以下の番号付けされた項は、本発明の特定の特質及び特質の組み合わせを示す。
1.医薬における使用のための組成物であって、当該組成物が、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含み、ペプチドデンドリマーが、第1のリジン残基及び2つの第1のペプチドモチーフと、2つの第2のリジン残基及び4つの第2のペプチドモチーフと、4つの第3のリジン残基及び8つの第3のペプチドモチーフと、第1のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含み、
(i)第1のリジン残基が、2つの第1のペプチドモチーフと共有結合し、2つの第1のペプチドモチーフは、それぞれ2つの第2のリジン残基と共有結合し、
(ii)各第2のリジン残基が、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合し、各第2のペプチドモチーフは、それぞれ、第3のリジン残基のうちの1つと共有結合し、
(iii)各第3のリジン残基が、第3のペプチドモチーフのうちの2つと共有結合し、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフが、独立して、モノペプチド又はジペプチドモチーフからなり、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々が、a)アルギニン(R)若しくはリジン(K)、及び/又はb)ロイシン(L)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、若しくはイソロイシン(I)を含み、各アミノ酸残基が、独立して、L-アイソフォーム又はD-アイソフォームから選択される、組成物。
2.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも2つが、アルギニン(R)を含む、項1に記載の使用のための組成物。
3.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも2つが、ロイシン(L)を含む、項1又は2に記載の使用のための組成物。
4.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々が、ジペプチドモチーフである、項1~3のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
5.第1、第2、及び第3のペプチドモチーフの各々が、ロイシン(L)及びアルギニン(R)を含む、項4に記載の使用のための組成物。
6.核酸が、二本鎖領域を含む、項1~5のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
7.核酸が、DNAプラスミドである、項6に記載の使用のための組成物。
8.核酸が、mRNA分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)であるか、又はそれをコードする、項1~7のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
9.核酸が、CRISPR配列を含む、項1~8のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
10.核酸が、siRNA又はsaRNA分子である、項6に記載の使用のための組成物。
11.DNAプラスミドが、標的細胞においてsiRNA又はsaRNA分子を発現することができる、項7に記載の使用のための組成物。
12.核酸が、標的細胞において導入遺伝子を発現することができる、項7又は8に記載の使用のための組成物。
13.導入遺伝子が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質である、項12に記載の使用のための組成物。
14.ワクチンとしての使用のための、項13に記載の使用のための組成物。
15.患者における遺伝性障害のための遺伝子療法における使用のための、項12に記載の使用のための組成物。
16.遺伝性障害が、患者において筋ジストロフィーを引き起こす、項15に記載の使用のための組成物。
17.遺伝性障害が、患者においてミオパチーを引き起こす、項15に記載の使用のための組成物。
18.導入遺伝子が、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、及び/又は線維芽細胞増殖因子(FGF)である、糖尿病性下肢虚血を治療する方法における使用のための、項12に記載の組成物。
19.コアペプチド配列が、トリペプチドモチーフからなる、項1~18のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
20.トリペプチドモチーフが、グリシン(G)、セリン(S)、及びシステイン(C)、及び/又はアラニン(A)を含む、項18に記載の組成物。
19.脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及び/又はN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含む、項1~18のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
20.脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及びジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)を含む、項1~19のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
21.使用が、患者の筋肉への核酸の送達を含む、項1~20のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
22.項1~21のいずれか1つに記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
23.核酸を標的細胞内に送達する方法であって、標的細胞を項1~20のいずれか1つに記載の組成物と接触させることを含み、標的細胞が、筋細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、又は腫瘍細胞である、方法。
24.第1のリジン残基及び2つの第1のペプチドモチーフと、2つの第2のリジン残基及び4つの第2のペプチドモチーフと、4つの第3のリジン残基及び8つの第3のペプチドモチーフと、第1のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含む、ペプチドデンドリマーであって、
(i)第1のリジン残基が、2つの第1のペプチドモチーフと共有結合し、2つの第1のペプチドモチーフは、それぞれ2つの第2のリジン残基と共有結合し、
(ii)各第2のリジン残基が、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合し、各第2のペプチドモチーフは、それぞれ、第3のリジン残基のうちの1つと共有結合し、
(iii)各第3のリジン残基が、第3のペプチドモチーフのうちの2つと共有結合し、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフが各々、(i)ロイシン-アルギニン(LR)ジペプチドモチーフ、又は(ii)アルギニン-ロイシン(RL)モチーフのいずれかからなり、第1、第2、及び第3のペプチドモチーフのうちの少なくとも1つが、(i)ロイシン-アルギニン(LR)であり、各アミノ酸残基が、独立して、L-アイソフォーム又はD-アイソフォームから選択される、ペプチドデンドリマー。
25.核酸と、脂質と、項24に記載のペプチドデンドリマーと、を含む、組成物。
26.医薬における使用のための、項25に記載の組成物。
27.核酸を細胞にインビトロで又はエクスビボで送達するための、項25に記載の組成物の使用。
28.ポンペ病、筋肉消耗性疾患、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における使用のための、項1~22又は24~26のいずれか1つに記載の組成物又はペプチドデンドリマー。
参考文献
本発明及び本発明が属する技術分野の状況をより完全に記載及び開示するために、多くの刊行物が上で引用されている。これらの参考文献についての完全な引用を以下に示す。これらの参考文献の各々の全体は、本明細書中に組み込まれる。
本発明及び本発明が属する技術分野の状況をより完全に記載及び開示するために、多くの刊行物が上で引用されている。これらの参考文献についての完全な引用を以下に示す。これらの参考文献の各々の全体は、本明細書中に組み込まれる。
Kwok et al.Comparative structural and functional studies of nanoparticle formulations for DNA and siRNA delivery;Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine 7;210-219(2011)。
Kwok et al.Peptide Dendrimer/Lipid Hybrid Systems Are Efficient DNA Transfection Reagents:Structure-Activity Relationships Highlight the Role of Charge Distribution Across Dendrimer Generations;ACS Nano 7;54668-4682(2013)。
Kwok et al.Systematic Comparisons of Formulations of Linear Oligolysine Peptides with siRNA and Plasmid DNA;Chem Biol Drug Des 87:747-763(2016)。
Kwok et al.Developing small activating RNA as a therapeutic:current challenges and promises Therapeutic delivery 10(3):151-164(2019)
Saher et al.Novel peptide-dendrimer/lipid/oligonucleotide ternary complexes for efficient cellular uptake and improved splice-switching activity;Eur J Pharmaceutics and Biopharmaceutics 132:29-40(2018)。
Saher et al.Sugar and Polymer Excipients Enhance Uptake and Splice-Switching Activity of Peptide-Dendrimer/Lipid/Oligonucleotide Formulations.Pharmaceutics.11(12):666(2019)
Sheridan et al.Gene therapy finds its niche.Nat Biotechnol 29(2),121-8(2011)。
Braum.Non-viral Vector for Muscle-Mediated Gene Therapy;Chapter 9 Muscle Gene Therapy,Springer Nature Switzerland AG D.Duan,J.R.Mendell(eds.)157-178(2019)。
Ren et al.Structural basis of DOTMA for its high intravenous transfection activity in mouse;Gene Therapy 7,764-768(2000)。
John et al.Human MicroRNA Targets;PLoS Biology,11(2),1862-1879(2004)。
Myers et al.Recombinant Dicer efficiently converts large dsRNAs into siRNAs suitable for gene silencing;Nature Biotechnology 21:324-328(2003)。
Lim et al.Engineered Nanodelivery Systems to Improve DNA Vaccine Technologies;Pharmaceutics 12(1)30(2020)。
Luo et al.Arginine functionalized peptide dendrimers as potential gene delivery vehicles.Biomaterials 33,4917-4927(2012)。
Bonnet et al.Systemic Delivery of DNA or siRNA Mediated by Linear Polyethylenimine(L-PEI)Does Not Induce an Inflammatory Response.Pharmaceutical Res.25,2972(2008)。
Wang et al.Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.Nat Rev Drug Discov.18(5):358-378(2019)。
Philippidis.Fourth Boy Dies in Clinical Trial of Astellas’ AT132.Human Gene Therapy.32,19-20(2021).Qiu et al.Developing Biodegradable Lipid Nanoparticles for Intracellular mRNA Delivery and Genome Editing.Acc.Chem.Res.54(21),4001-4011(2021)。
Benizri et al.Bioconjugated Oligonucleotides:Recent Developments and Therapeutic Applications.Bioconjug Chem.30(2):366-383.(2019)。
Jasinski et al.The Effect of Size and Shape of RNA Nanoparticles on Biodistribution.Mol Ther.26(3),784-792(2018)。
Huang et al.Delivery of Therapeutics Targeting the mRNA-Binding Protein HuR Using 3DNA Nanocarriers Suppresses Ovarian Tumor Growth.Cancer Research.76(6),1549-1559(2016)。
For standard molecular biology techniques,see Sambrook,J.,Russel,D.W.Molecular Cloning,A Laboratory Manual.3 ed.2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press
Claims (167)
- 医薬における使用のための、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む、組成物であって、
前記ペプチドデンドリマーが、少なくとも、コアペプチド配列と、第1の分岐残基と、2つの第1のペプチドモチーフと、を含み、前記分岐残基が、リジン、2,4-ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であり、
前記核酸が、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、又は少なくとも50ヌクレオチドの核酸を含む、組成物。 - 前記核酸が、RNAである、請求項1に記載の使用のための組成物。
- 前記RNAが、mRNA、ssRNA、dsRNA、sgRNA、crRNA、tracrRNA、lncRNA、siRNA、saRNA、及び/又は自己増幅RNAから選択される、請求項2に記載の使用のための組成物。
- 前記RNAが、mRNAである、請求項3に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、DNAである、請求項1に記載の使用のための組成物。
- 前記DNAが、ssDNA、dsDNA、プラスミド、及び/又はcDNAを含む、請求項5に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、RNA核酸及びDNA核酸を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記RNA核酸及びDNA核酸が、単一核酸分子の一部である、請求項7に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、修飾核酸を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、導入遺伝子をコードし、標的細胞において前記導入遺伝子を発現することができる、請求項1~9のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記使用が、内因性遺伝子の発現又は活性を調節することによる対象における疾患の治療を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記調節が、前記遺伝子の前記発現及び/又は前記遺伝子の更なるコピーの外因性発現の増加である、請求項11に記載の使用のための組成物。
- 前記調節が、前記遺伝子の前記発現の減少である、請求項11に記載の使用のための組成物。
- 前記内因性遺伝子が、タンパク質又はペプチドに翻訳される、請求項11~13のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記タンパク質又はペプチドが、抗原、ホルモン、受容体、キメラ抗原受容体、転写因子、並びに/又はサイトカイン、例えば、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、及び/若しくはインターフェロンを含む、請求項14に記載の使用のための組成物。
- 前記導入遺伝子が、腫瘍抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質を含む、請求項10に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、ワクチンである、請求項1~16のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、自己増幅RNAを含むか又はコードする、請求項17に記載の使用のための組成物。
- 前記使用が、前記対象における遺伝性障害の治療を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、前記対象において非機能的であるか、下方制御されているか、不活性であるか、又は損なわれている遺伝子の機能的バージョンを発現する、請求項19に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系の1つ以上の成分をコードする、かつ/又は含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系が、CRISPR/Cas系である、請求項21に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、Casタンパク質若しくはペプチドをコードし、かつ/又はsgRNA、crRNA、及び/若しくはtracrRNAを含む、請求項21又は22に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、Casタンパク質又はペプチドをコードするmRNA、及びsgRNAを含むRNA配列を含む、請求項23に記載の使用のための組成物。
- 前記Casタンパク質又はペプチドをコードするmRNA、及び前記sgRNAを含むRNA配列が、別個の分子である、請求項24に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNA、crRNA、tracrRNA、及びCasタンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上が、存在する場合、単一核酸の一部である、請求項23又は24に記載の使用のための組成物。
- 前記sgRNA、crRNA、tracrRNA、及びCasタンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上が、存在する場合、2つ以上の核酸上に存在する、請求項23又は24に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、脾臓、リンパ組織、肺、骨、胸腺、肝臓、腫瘍組織、心臓組織、骨格筋、腎臓、脂肪組織、及び/又は脳を標的とする、請求項1~27のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、脾臓、リンパ組織、肺、及び/又は骨を標的とする、請求項28に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、RNA、例えば、mRNAである、請求項29に記載の使用のための組成物。
- 前記使用が、前記核酸が、白血球、例えば、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、若しくは単球;リンパ節組織細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、筋細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、幹細胞、及び/又は腫瘍細胞である細胞に送達されるように、前記組成物を対象に投与することを含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記使用が、前記核酸が免疫細胞に送達されるように、前記組成物を対象に投与することを含む、請求項1~31のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、前記細胞において免疫分子又は転写因子を発現する、請求項31又は32に記載の使用のための組成物。
- 前記免疫分子が、T細胞受容体、キメラ抗原受容体、サイトカイン、デコイ受容体、抗体、共刺激受容体、共刺激リガンド、チェックポイント阻害剤、免疫コンジュゲート、又は腫瘍抗原である、請求項33に記載の使用のための組成物。
- 前記細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、単球、骨髄由来サプレッサ細胞(MDSC)、腫瘍関連マクロファージ、又は腫瘍関連好中球である、請求項31~34のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、RNA、例えば、mRNAである、請求項35に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、前記対象におけるがんを治療する方法における使用のためのものである、請求項1~36のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記がんが、血液がん、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群;又は肺がん、噴門がん、肉腫、若しくは肝臓がんである、請求項37に記載の使用のための組成物。
- 前記方法が、抗がん剤の投与を含む、請求項37又は38に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、前記対象における肺疾患又は自己免疫疾患を治療する方法における使用のためのものである、請求項1~39のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記方法が、前記対象におけるポンペ病、筋肉消耗性疾患、ミオパチー、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療である、請求項19~28のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、DNAである、請求項41に記載の使用のための組成物。
- 前記方法が、前記対象における糖尿病性四肢虚血などの四肢虚血のための治療であり、前記導入遺伝子が、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)及び/又は線維芽細胞増殖因子(FGF)である、請求項1~31のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記2つの第1のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項1~43のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、2つの第2の分岐残基(例えば、リジン)及び4つの第2のペプチドモチーフを更に含み、
前記第2の分岐残基のうちの一方が、前記第1のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の前記第2の分岐残基が、他方の前記第1のペプチドモチーフと共有結合し、各第2の分岐残基が、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合する、請求項1~44のいずれか一項に記載の使用のための組成物。 - 前記4つの第2のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項45に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、4つの第3の分岐残基(例えば、リジン)及び8つの第3のペプチドモチーフを更に含み、
各第2のペプチドモチーフが、各第3の分岐残基が1つの第2のペプチドモチーフと共有結合するように、前記第3の分岐残基のうちの1つとそれぞれ共有結合し、各第3の分岐残基が、2つの第3のペプチドモチーフと共有結合する、請求項45又は46に記載の使用のための組成物。 - 前記8つの第3のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項47に記載の使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項44~48のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、非極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項44~49のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、酸性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項44~50のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項44~51のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、ロイシン(L)及び/又はアルギニン(R)残基を含む、請求項44~52のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記コア配列が、少なくとも2つのアミノ酸を含む、請求項44~53のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記コア配列が、30個までのアミノ酸を含む、請求項44~54のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記コア配列が、ヒスチジンなどのイオン化可能なアミノ酸を含む、請求項44~54のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、表2に示される構造を含む、請求項1~56のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、組織及び/又は細胞標的化モチーフを更に含む、請求項1~57のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記組織又は細胞標的化モチーフが、筋標的化モチーフ、例えば、GAASSLNIA(配列番号1)、インテグリン標的化モチーフ、例えば、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸、又は化学修飾、例えば、マンノース糖鎖付加を含む化学修飾を含む、請求項58に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、細胞透過性ペプチド(CPP)を更に含む、請求項1~59のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記細胞透過性ペプチドが、ペプチド配列XRXRRBRRXRRBRXB(配列番号2)(式中、Xは6-アミノヘキサン酸であり、Bはベータ-アラニンである)を含む、請求項60に記載の使用のための組成物。
- 前記細胞透過性ペプチドが、TAT由来配列を含む、請求項60に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、アルキル鎖、アルケニル鎖、抗体若しくはその断片、標的化ペプチド、糖、細胞透過性ペプチド、エンドソームエスケープペプチド、核局在化モチーフ、及び/又は脂肪酸を更に含む、請求項1~62のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記コアペプチド配列にコンジュゲートしている、請求項63に記載の使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖若しくはアルケニル鎖、抗体若しくはその断片、前記標的化ペプチド、糖、標的化ペプチド、細胞透過性ペプチド、エンドソームエスケープペプチド、核局在化モチーフ、及び/又は脂肪酸が、前記ペプチドデンドリマーのC末端にコンジュゲートしている、請求項63又は64に記載の使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖若しくはアルケニル鎖、抗体若しくは前記その断片、標的化ペプチド、糖、標的化ペプチド、細胞透過性ペプチド、エンドソームエスケープペプチド、核局在化モチーフ、及び/又は脂肪酸が、前記ペプチドデンドリマーのN末端にコンジュゲートしている、請求項63~65のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、約5個の炭素~約50個の炭素、好ましくは約12個~約30個の炭素を含む、請求項63~66のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、及び/又はイオン化可能な脂質を含む、請求項1~67のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、飽和脂肪酸を含む、請求項1~68のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、不飽和脂肪酸を含む、請求項1~69のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、1、2、3、4、5、又は6個の脂肪酸鎖を含む、請求項69又は70に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及び/又はN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含む、請求項1~71のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及びジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)を含む、請求項1~72のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- N/P比が、約0.01:1~100:1である、請求項1~73のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記N/P比が、1:1~50:1である、請求項74に記載の使用のための組成物。
- 対象への投与後に、肝臓よりも脾臓及び/又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項75に記載の使用のための組成物。
- 前記N/P比が、0.01:1~1:1である、請求項75に記載の使用のための組成物。
- 対象への投与後に、肝臓よりも肺、脾臓、及び/又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項77に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質が、正に荷電した粒子を形成する、請求項1~78のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質が、負に荷電した粒子又は中性電荷を有する粒子を形成する、請求項1~79のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 標的組織又は細胞への前記核酸の送達が、脂質ベースの核酸送達系を使用した同じ組織又は細胞型への同じ核酸の送達と比較して、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、75%、85%、90%、95%、100%増加する、請求項28~32のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記標的組織が、脾臓、リンパ節、肺、肝臓、又は骨である、請求項81に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質ベースの核酸送達系が、DOTMA/DOPEである、請求項81又は82に記載の使用のための組成物。
- 前記投与が、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、皮内、又は腹腔内である、請求項1~83のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、液体内に含まれる、請求項1~84のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む組成物であって、前記ペプチドデンドリマーが、少なくとも、コアペプチド配列と、第1の分岐残基と、2つの第1のペプチドモチーフと、を含み、前記分岐残基が、リジン、2,4-ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であり、
前記核酸が、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、又は少なくとも50ヌクレオチドの一本鎖核酸を含む、組成物。 - 前記一本鎖核酸が、RNAである、請求項86に記載の組成物。
- 前記RNAが、mRNA、ssRNA、sgRNA、crRNA、tracrRNA、lncRNA、及び/又は自己増幅RNAから選択される、請求項87に記載の組成物。
- 前記RNAが、mRNAである、請求項88に記載の組成物。
- 前記組成物が、2つ以上のRNAを含む、請求項86~89のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が、ssDNAである、請求項86に記載の組成物。
- 前記組成物が、RNA核酸及びDNA核酸を含む、請求項86~91のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記RNA核酸及びDNA核酸が、単一核酸分子の一部である、請求項92に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が、修飾核酸を含む、請求項86~93のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が導入遺伝子をコードし、標的細胞において前記導入遺伝子を発現することができる、請求項86~94のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が、内因性遺伝子の発現又は活性を調節することができる、請求項86~95のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記調節が、前記遺伝子の前記発現及び/又は前記遺伝子の更なるコピーの外因性発現の増加である、請求項96に記載の組成物。
- 前記調節が、前記遺伝子の前記発現の減少である、請求項96に記載の組成物。
- 前記内因性遺伝子が、タンパク質又はペプチドに翻訳される、請求項96~98のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質又はペプチドが、抗原、ホルモン、受容体、キメラ抗原受容体、転写因子、並びに/又はサイトカイン、例えば、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、及び/若しくはインターフェロンを含む、請求項99に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、及び/又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質を含む、請求項95に記載の組成物。
- 前記組成物が、ワクチンである、請求項86~101のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が、自己活性化RNAを含むか又はコードする、請求項108に記載の組成物。
- 使用が、対象における遺伝性障害の治療を含む、請求項86~100のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸が、前記対象において非機能的であるか、下方制御されているか、不活性であるか、又は損なわれている遺伝子の機能的バージョンを発現する、請求項104に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系の1つ以上の成分をコードする、かつ/又は含む、請求項86~105のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系が、CRISPR/Cas系である、請求項106に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が、Casタンパク質若しくはペプチドをコードし、かつ/又はsgRNA、crRNA、及び/若しくはtracrRNAを含む、請求項106又は107に記載の組成物。
- 前記一本鎖核酸が、Casタンパク質又はペプチドをコードするmRNA、及びsgRNAを含む、請求項108に記載の組成物。
- 前記sgRNA、crRNA、tracrRNA、及びCasタンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上が、存在する場合、単一核酸の一部である、請求項108又は109に記載の組成物。
- 前記sgRNA、crRNA、tracrRNA、及びCasタンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上が、存在する場合、2つ以上の核酸上に存在する、請求項108又は109に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記核酸を脾臓、リンパ組織、肺、骨、肝臓、心臓組織、腫瘍組織、骨格筋、腎臓、脂肪組織、及び/又は脳に標的化するのに適している、請求項86~111のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記核酸を脾臓、リンパ組織、肺、及び/又は骨に標的化するのに適している、請求項112に記載の組成物。
- 前記核酸が、RNA、例えば、mRNAである、請求項113に記載の組成物。
- 対象におけるがんを治療する方法における使用のための、請求項86~114のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記がんが、血液がん、例えば、白血病、リンパ種若しくは骨髄腫、噴門がん、肉腫、又は肝臓がんである、請求項115に記載の使用のための組成物。
- 前記方法が、抗がん剤の投与を含む、請求項115又は116に記載の使用のための組成物。
- 対象における肺疾患又は自己免疫疾患を治療する方法における使用のための、請求項86~114のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象におけるポンペ病、筋肉消耗性疾患、ミオパチー、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における使用のための、請求項86~114のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸が、DNAである、請求項119に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、前記核酸を前記対象における白血球、例えば、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、若しくは単球;リンパ節組織細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、又は腫瘍細胞に送達する、請求項86~120のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記使用が、前記核酸が免疫細胞に送達されるように、前記組成物を対象に投与することを含む、請求項86~121のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、前記細胞において免疫分子又は転写因子を発現する、請求項121又は122に記載の使用のための組成物。
- 前記免疫分子が、T細胞受容体、サイトカイン、デコイ受容体、抗体、共刺激受容体、共刺激リガンド、チェックポイント阻害剤、免疫コンジュゲート、又は腫瘍抗原である、請求項123に記載の使用のための組成物。
- 前記細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、又は単球である、請求項121~124のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記核酸が、RNA、例えば、mRNAである、請求項125に記載の使用のための組成物。
- 前記2つの第1のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項86~97のいずれか一項に記載の組成物又は請求項115~126のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、2つの第2の分岐残基(例えば、リジン)及び4つの第2のペプチドモチーフを更に含み、前記第2の分岐残基のうちの一方が、前記第1のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の前記第2の分岐残基が、他方の前記第1のペプチドモチーフと共有結合し、各第2の分岐残基が、2つの第2のペプチドモチーフと共有結合する、請求項127に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記4つの第2のペプチドモチーフが、独立して、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項128に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、4つの第3の分岐残基(例えば、リジン)及び8つの第3のペプチドモチーフを更に含み、
各第2のペプチドモチーフが、各第3の分岐残基が1つの第2のペプチドモチーフと共有結合するように、前記第3の分岐残基のうちの1つとそれぞれ共有結合し、各第3の分岐残基が、2つの第3のペプチドモチーフと共有結合する、請求項127又は128に記載の組成物又は使用のための組成物。 - 前記8つの第3のペプチドモチーフが、独立して、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項130に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項127~131のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、非極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項127~132のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、酸性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項127~133のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項127~134のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記第1、第2、及び/又は第3のペプチドモチーフが、ロイシン(L)及び/又はアルギニン(R)残基を含む、請求項127~135のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、表2に示される構造を含む、請求項86~136のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、組織及び/又は細胞標的化モチーフを含む、請求項86~137のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記組織標的化モチーフが、筋標的化モチーフ、例えば、GAASSLNIA(配列番号1)、インテグリン標的化モチーフ、例えば、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸、又は化学修飾、例えば、マンノース糖鎖付加を含む化学修飾を含む、請求項138に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、細胞透過性ペプチドを含む、請求項86~139のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記細胞透過性ペプチドが、TAT由来配列を含む、請求項140に記載の使用のための組成物。
- 前記細胞透過性ペプチドが、ペプチド配列XRXRRBRRXRRBRXB(配列番号2)(式中、Xは6-アミノヘキサン酸であり、Bはベータ-アラニンである)を含む、請求項140に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、アルキル鎖、アルケニル鎖、抗体若しくはその断片、糖、及び/又は脂肪酸を含む、請求項86~142のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記コアペプチド配列にコンジュゲートしている、請求項143に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記ペプチドデンドリマーのC末端にコンジュゲートしている、請求項144に記載の使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記ペプチドデンドリマーのN末端にコンジュゲートしている、請求項144に記載の使用のための組成物。
- 前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、約5個の炭素~約50個の炭素、好ましくは約12個~約30個の炭素を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、前記ペプチドデンドリマーのC末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む、請求項143に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマーが、前記ペプチドデンドリマーのN末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む、請求項143に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、及び/又はイオン化可能な脂質を含む、請求項86~149のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、飽和脂肪酸を含む、請求項86~150のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、不飽和脂肪酸を含む、請求項86~151のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、1、2、3、4、5、又は6個の脂肪酸鎖を含む、請求項151又は152に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及び/又はN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含む、請求項86~153のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)及びジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)を含む、請求項86~154のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- N/P比が、約0.01:1~100:1である、請求項86~155のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記N/P比が、1:1~50:1である、請求項156に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 対象への投与後に、肝臓よりも脾臓及び/又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項157に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記N/P比が、0.01:1~1:1である、請求項156に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 対象への投与後に、肝臓よりも肺、脾臓、及び/又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項159に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 標的細胞を前記組成物とインビトロで接触させた後、前記標的細胞への前記核酸の送達が、脂質ベースの核酸送達系を使用した同じ細胞型への同じ核酸の送達と比較して、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、75%、85%、90%、95%、100%増加する、請求項86~160のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的細胞が、がん細胞又は免疫細胞である、請求項161に記載の使用のための組成物。
- 前記脂質ベースの核酸送達系が、Lipofectamine 2000である、請求項161又は162に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質が、正に荷電した粒子を形成する、請求項86~163のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記組成物が、液体内に含まれる、請求項86~164のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。
- 前記組成物が、粉末組成物である、請求項86~165のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸の送達を必要とする対象の細胞内へ核酸を送達する方法であって、薬学的有効量の請求項1~165のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB2101301.6A GB202101301D0 (en) | 2021-01-29 | 2021-01-29 | In vivo delivery |
GB2101301.6 | 2021-01-29 | ||
GBGB2103551.4A GB202103551D0 (en) | 2021-01-29 | 2021-03-15 | In vivo delivery |
GB2103551.4 | 2021-03-15 | ||
PCT/EP2022/052145 WO2022162200A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-01-28 | Nucleic Acid Delivery |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024505924A true JP2024505924A (ja) | 2024-02-08 |
Family
ID=80786422
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023546009A Pending JP2024505924A (ja) | 2021-01-29 | 2022-01-28 | 核酸送達 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240108753A1 (ja) |
EP (1) | EP4284438A1 (ja) |
JP (1) | JP2024505924A (ja) |
KR (1) | KR20230138490A (ja) |
AU (1) | AU2022212598A1 (ja) |
CA (1) | CA3206711A1 (ja) |
WO (1) | WO2022162200A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024028465A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-08 | Nuntius Therapeutics Limited | Hybrid peptide dendrimer systems and extrahepatic delivery |
GB202212806D0 (en) | 2022-09-02 | 2022-10-19 | Nuntius Therapeutics Ltd | Methods for characterisation of nanocarriers |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10202104041PA (en) | 2015-10-23 | 2021-06-29 | Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
-
2022
- 2022-01-28 US US18/274,869 patent/US20240108753A1/en active Pending
- 2022-01-28 KR KR1020237028688A patent/KR20230138490A/ko unknown
- 2022-01-28 WO PCT/EP2022/052145 patent/WO2022162200A1/en active Application Filing
- 2022-01-28 CA CA3206711A patent/CA3206711A1/en active Pending
- 2022-01-28 EP EP22708035.5A patent/EP4284438A1/en active Pending
- 2022-01-28 AU AU2022212598A patent/AU2022212598A1/en active Pending
- 2022-01-28 JP JP2023546009A patent/JP2024505924A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022162200A1 (en) | 2022-08-04 |
EP4284438A1 (en) | 2023-12-06 |
AU2022212598A1 (en) | 2023-08-31 |
US20240108753A1 (en) | 2024-04-04 |
WO2022162200A9 (en) | 2022-10-13 |
CA3206711A1 (en) | 2022-08-04 |
KR20230138490A (ko) | 2023-10-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Xiao et al. | Emerging mRNA technologies: delivery strategies and biomedical applications | |
Ibba et al. | Advances in mRNA non-viral delivery approaches | |
Li et al. | Nanoscale platforms for messenger RNA delivery | |
Wagner | Polymers for siRNA delivery: inspired by viruses to be targeted, dynamic, and precise | |
Rezaee et al. | Progress in the development of lipopolyplexes as efficient non-viral gene delivery systems | |
McCarthy et al. | Development and characterization of self-assembling nanoparticles using a bio-inspired amphipathic peptide for gene delivery | |
Guo et al. | Nanoparticles escaping RES and endosome: challenges for siRNA delivery for cancer therapy | |
Sharma et al. | A review of the tortuous path of nonviral gene delivery and recent progress | |
Hayashi et al. | Cell penetrating peptide-mediated systemic siRNA delivery to the liver | |
Kaneda et al. | Non‐viral vectors for cancer therapy | |
Li et al. | Ionizable lipid-assisted efficient hepatic delivery of gene editing elements for oncotherapy | |
Li et al. | Non-viral strategies for delivering genome editing enzymes | |
Tao et al. | Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposome: bio-behavioral study | |
Cheng et al. | The effect of guanidinylation of PEGylated poly (2-aminoethyl methacrylate) on the systemic delivery of siRNA | |
JP2024505924A (ja) | 核酸送達 | |
Wang et al. | Incorporation of histone derived recombinant protein for enhanced disassembly of core-membrane structured liposomal nanoparticles for efficient siRNA delivery | |
Le Saux et al. | Interest of extracellular vesicles in regards to lipid nanoparticle based systems for intracellular protein delivery | |
Rouatbi et al. | Pre-clinical non-viral vectors exploited for in vivo CRISPR/Cas9 gene editing: An overview | |
Shuai et al. | mRNA delivery via non-viral carriers for biomedical applications | |
Karim et al. | Scope and challenges of nanoparticle-based mRNA delivery in cancer treatment | |
WO2018232502A1 (en) | TRANSFECTION REAGENTS FOR NUCLEIC ACID ADMINISTRATION | |
Zhang et al. | Ionizable drug delivery systems for efficient and selective gene therapy | |
CN116685331A (zh) | 用融合相关的小跨膜蛋白配制的蛋白脂质囊泡 | |
Liu et al. | PH-sensitive self-assembled carboxymethyl chitosan-modified DNA/polyethylenimine complexes for efficient gene delivery | |
CN117460537A (zh) | 核酸递送 |