CN116685331A - 用融合相关的小跨膜蛋白配制的蛋白脂质囊泡 - Google Patents

用融合相关的小跨膜蛋白配制的蛋白脂质囊泡 Download PDF

Info

Publication number
CN116685331A
CN116685331A CN202180079038.0A CN202180079038A CN116685331A CN 116685331 A CN116685331 A CN 116685331A CN 202180079038 A CN202180079038 A CN 202180079038A CN 116685331 A CN116685331 A CN 116685331A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
peg
dope
pdna
dmg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180079038.0A
Other languages
English (en)
Inventor
J·D·刘易斯
A·拉图里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Entos Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Entos Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Entos Pharmaceuticals Inc filed Critical Entos Pharmaceuticals Inc
Publication of CN116685331A publication Critical patent/CN116685331A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12211—Orthoreovirus, e.g. mammalian orthoreovirus
    • C12N2720/12222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

公开了一种用于将治疗性货物(如核酸、多肽和分子)递送至细胞的蛋白脂质囊泡(PLV)，所述蛋白脂质囊泡具有脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含一种或多种可电离脂质和一种或多种融合相关小跨膜(FAST)家族的蛋白及其嵌合体，其中可电离脂质与治疗性货物的摩尔比在2.5：1和20：1之间。将嵌合FAST蛋白掺入PLV平台中增强了mRNA和pDNA在体外和体内两者的细胞内递送和表达。这些PLV还显示出有利的免疫谱，并且毒性显著低于常规LNP。

Description

用融合相关的小跨膜蛋白配制的蛋白脂质囊泡
技术领域
本发明大体涉及脂质纳米颗粒递送平台。更具体地，本发明涉及蛋白脂质囊泡和包含其的组合物，其具有可电离的脂质和融合相关的跨膜蛋白两者，可电离的脂质和融合相关的跨膜蛋白能够包封治疗性货物并将其递送到细胞中。
背景技术
基因疗法治疗范围从单基因疾病到癌症的无数疾病的潜力导致超过2600次基因疗法临床试验，最终只有10种核酸药物得到美国食品和药物管理局(FDA)的监管批准(1)。质膜是外源性和带电大分子(如带负电荷的核酸)的高效物理屏障。病毒载体由于其高效的基因表达而在世界范围内主导基因治疗试验，并且已经在临床上证明成功。在2012年批准了Lipogene tiparvovec(Glybera)治疗脂蛋白脂酶缺乏症，催化了行业向使用腺相关病毒(AAV)载体的转变(2，3)。尽管比许多传统病毒载体更安全，但AAV的使用受到中和抗体的存在的限制，该中和抗体没有暴露于先前的AAV载体(4-7)。针对AAV载体的宿主免疫原性应答也可以抑制重复给药后的基因转移，除非采用多种AAV血清型(8，9)。临床试验已经证明全身性AAV基因疗法在治疗疾病如血友病()和粘多糖贮积症(NCT03612869)中的成功。最近探索使用AAV递送针对HIV-1gp120蛋白的单克隆IgG1抗体的临床试验证明了这一点，因为抗AAV免疫应答导致低基因转移和表达(10)。为了克服这些限制，近年来的焦点主要转移到非病毒递送载体的开发和优化。
非病毒递送载体如脂质纳米颗粒(LNPs)传统上用于基于RNA的基因治疗方法(siRNA、miRNA、mRNA)，并且具有成本、制造、和优于病毒载体的免疫原性优势(11-17)。最近FDA对帕提斯然(Onpattro)的批准为不久的将来更全身性的非病毒核酸疗法奠定了基础(18)。LNP用阳离子或可电离脂质配制，所述阳离子或可电离脂质中和核酸的阴离子电荷并通过电荷介导的脂质双层破坏促进包封的核酸的内体逃逸(19-22)。Onpattro利用可电离脂质DLin-MC3-DMA(MC3)，其可用于递送mRNA；一种广泛研究的用于开发疫苗的方法(22，23)。MC3在酸性内体区室中变成带正电荷，促进内体逃逸。虽然与阳离子脂质相比，可电离脂质具有显著改善的耐受性，但它们的作用机制增强了凋亡性细胞死亡，这转化为局部递送后的耐受性挑战和全身递送后的剂量限制性肝毒性(23-25)。
尽管在大的程度上被认为是非免疫原性的，但LNP和免疫系统之间的相互作用可能具有有害的全身作用，并导致促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌(26，27)。
LNP是纳米结构，其由不同类别的脂质如阳离子或可电离脂质(CIL)、结构脂质(磷脂和固醇脂质)和PEG缀合的脂质(PEG-脂质)的组合组成。这些脂质在与含有核酸的水相的受控微流体混合下自组装成LNP。LNP的最关键的组分，CIL负责与核酸静电结合并包封它们。这些CIL还负责促进核酸的内体逃逸。PEG-脂质防止LNP的聚集、降解和调理作用，而结构脂质促进纳米颗粒的稳定性和完整性。
与带正电荷的阳离子脂质相反，可电离脂质的电荷取决于周围环境的pH。可电离脂质由三个部分组成：胺头部基团、接头基团和疏水性尾部。具有小的头部基团和由不饱和烃组成的尾部的脂质倾向于采用圆锥形结构，而具有大的头部基团和饱和尾部的脂质倾向于采用圆柱形结构。
在LNP制剂中使用的一些脂质是免疫原性的，这对于在基因疗法中使用的LNP可能是有问题的，但对于LNP疫苗是有利的，并且表明根据临床用途在LNP制剂中策略性地使用不同类型的脂质可以极大地改善最终产品的安全性和功效(28)。已经显示阳离子脂质激活Toll样受体4，其进而促进强烈的促炎反应，诱导Th1型细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα(21)。与中性或阴离子LNP相比，还据报道静脉内注射的阳离子LNP诱导IFN-γ应答和白细胞中干扰素应答性基因转录物的水平升高。已经将阳离子脂质添加到蛋白质-脂质体疫苗中以充当佐剂并刺激更大的Th1免疫应答(29)，同时避免与疫苗免疫病理学有关的Th2免疫应答(产生IL-5和IL-13)的过度刺激(30)。阳离子脂质体的类型也极大地影响脂质体-DNA复合物的免疫激活，例如不含CpG的Lipofectamine2000脂质体诱导比DOTMA/DOPE或DOTMA/CHOL脂质体多5倍的细胞因子产生(31)。含有非CpG基序DNA的Lipofectamine2000脂质体还诱导由来自TLR9缺陷小鼠的巨噬细胞产生IFN-β和IL-6(31)。在癌症疫苗开发中，一些阴离子脂质体-蛋白质抗原混合物显示出与阳离子脂质相当的佐剂活性。与卵清蛋白混合的阴离子脂质DOPA诱导抗原特异性CD8(+)细胞毒性T淋巴细胞应答，并显著延迟小鼠中表达OVA的B16-OVA肿瘤的生长(29)。
细胞因子产生的水平也可以是LNP剂量依赖性的(或取决于LNP制剂中阳离子脂质与中性脂质的摩尔比)，这对于低全身剂量疫苗活性是有利的，但对于基因治疗中通常使用的较高全身剂量是危险的。
此外，LNP可以刺激补体激活相关的假变态反应(CARPA)，这是一种在严重情况下导致死亡的超敏反应(32-34)。可电离脂质的使用已经解决了围绕LNP使用的一些限制，然而，仍然存在限制其临床成功的安全性问题。尽管有前所未有的研究投资，但FDA仍然认为基因疗法是实验性的，其主要限制是缺乏用于细胞内核酸递送的安全有效的载体平台，并且具有除肝脏之外的更广泛的生物分布。
然而，病毒载体的使用已经引起了显著的安全性问题(3，41)。临床前数据已经证明了从病毒载体的插入诱变的潜力，其赋予癌症风险，这通过它们相对缺乏靶标选择性而进一步延续(42，43)。适于病毒载体最重要的阻碍是刺激免疫应答，这会促进有害的副作用并阻止基因从病毒转移。例如，腺相关病毒(AAV)的功效受到宿主体液免疫应答的限制，并且病毒递送平台生产成本也是高的并且具有固有的货物大小制约。
胞内核酸释放对于它们的功能是必要的，然而，使用阳离子和可电离脂质可能是适得其反的，因为它们刺激显著的毒性和免疫原性应答，从而减少了它们的临床用途。
需要开发不依赖于毒性组分的替代核酸递送策略，以确保基因、小分子、核酸、多肽递送疗法和核酸疫苗的广泛成功。
由于全身毒性的危险，许多可电离的脂质制剂已经重新用于肌内注射。Bahl等人(44)开发了一种基于信使RNA(mRNA)的流感疫苗，其与可电离的脂质DLin-MC3-DMA(MC3)一起配制。关于LNPs和其他非病毒载体的安全性问题继续阻碍它们在临床上的成功(45)。
发明内容
本发明的目的是提供用于将治疗性货物递送至细胞的组合物和/或蛋白脂质囊泡。
根据本发明的一个方面，提供了用于将治疗性货物如核酸、多肽和分子递送至细胞的蛋白脂质囊泡，所述蛋白脂质囊泡具有脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含一种或多种可电离脂质和一种或多种融合相关小跨膜(FAST)家族蛋白及其嵌合体，其中可电离脂质与核酸的摩尔比在2.5：1至20：1之间。
FAST蛋白是由无包膜病毒编码的膜融合蛋白的唯一实例，且长度约为100-200个残基的是最小的已知病毒融合蛋白。这些非糖基化蛋白不是病毒粒子的组分，但在病毒感染的细胞内表达并运输到质膜，在那里它们介导细胞-细胞膜融合，产生多核合胞体以促进细胞-细胞病毒传播(37)。FAST蛋白在生理pH下起作用并且不需要特异性细胞受体，允许它们融合几乎所有细胞类型(38)。
不同FAST蛋白之间的结构-功能关系指示，FAST的重叠结构基序可以与其它FAST蛋白交换以产生功能性融合蛋白(39，40)，在本文中称为嵌合FAST蛋白。嵌合FAST蛋白显示出优异的融合活性。当将嵌合FAST蛋白掺入蛋白脂质核酸递送载体(PLV)中时，其使得最小摩尔比的可电离脂质能够用于中和核酸的阴离子电荷的唯一目的，而不是促进内体逃逸。这些FAST-PLV显示出有利的毒性特征，同时通过利用正呼肠孤病毒FAST蛋白的优雅融合诱导特性来维持有效的全身基因表达。
将嵌合FAST蛋白掺入PLV平台增强了mRNA和pDNA两者在体外和体内的细胞内递送和表达。这些PLV还显示出有利的免疫谱，并且毒性显著低于常规LNP。
公开了通过将FAST蛋白的融合诱导活性与基于脂质的非病毒递送载体的改进的安全性和可扩展性组合来实现全身核酸递送的方法。鉴于FAST-PLV的小尺寸以及它们的功效、低免疫原性、高耐受性和到达肝外组织的能力，FAST-PLV应该具有实质性的临床效用，使得能够在不久的将来开发低成本的遗传药物、治疗剂和疫苗。
根据本发明的一个方面，提供了用于将治疗性货物递送至细胞的蛋白脂质囊泡，其包含：包含一种或多种可电离脂质的脂质纳米颗粒；以及融合相关小跨膜(FAST)家族蛋白及其嵌合体中的一种或多种。可电离脂质与治疗性货物的摩尔比在2.5：1至20：1之间。
在一个实施例中，一种或多种可电离脂质是DLin-KC2-DMA(KC2)、DODMA、DODAP、DOBAQ、DOTMA、18：1EPC、DOTAP、DDAB、18：0EPC、18：0DAP或18：0TAP。优选地，一种或多种可电离脂质是DODAP和/或DODMA。
在另一个实施例中，FAST蛋白是P10、P13、P14、P15、P16、P22或其嵌合体。
优选地，FAST蛋白是P14P15嵌合体、P10/P14嵌合体或P10/P15嵌合体。
更优选地，P14P15嵌合体包含P14的胞外结构域和跨膜结构域以及P15的胞内结构域；p14的胞外结构域，p15的跨膜结构域和胞内结构域；或p14的胞外结构域和胞内结构域以及p15的跨膜。
在另一个实施例中，蛋白脂质囊泡含有治疗性货物。所述治疗性货物是核酸、多肽或分子，其中所述核酸是pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA、遗传佐剂、启动子或分子基因编辑工具；所述多肽是肽、表位或抗原分子；并且，所述分子是小药物分子、生物分子、结构大分子或治疗分子。
在另一个实施例中，可电离脂质与治疗性货物的摩尔比为5：1、7.5：1、10：1或15：1。
在一个实施例中，脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODAP、DOPE和DMG-PEG，优选摩尔百分比为24：42：30：4。
在第二实施例中，脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODMA、DOPE和DMG-PEG，优选摩尔百分比为24：42：30：4。
在第三实施例中，脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODAP、DODMA、DOPE和DMG-PEG，优选摩尔百分比为24：21：21：30：4。
在第四实施例中，脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODAP、DOPE和DMG-PEG，摩尔百分比为6：60：30：4或3：63：30：4。
在第五实施例中，脂质纳米颗粒包含DODAP、DOPE和DMG-PEG，优选摩尔百分比为66：30：4。
在第六实施例中，脂质纳米颗粒包含DODAP、胆固醇、DOPE和DMG-PEG，优选摩尔百分比为49.5：24.75：23.75：2、49.5：38.5：10：2或61.7：26.3：19：3。
在另一个实施例中，所述蛋白脂质囊泡还包含连接到所述FAST蛋白或其嵌合蛋白的C-末端的铃蟾肽。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于将治疗性货物递送至细胞的组合物，其包含：如上所述的蛋白脂质囊泡；和由蛋白脂质载体包封的治疗性货物。
在一个实施例中，治疗性货物是核酸、多肽或分子，或其组合。所述治疗性货物是核酸、多肽或分子，其中所述核酸是pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA、遗传佐剂、启动子或分子基因编辑工具；所述多肽是肽、表位或抗原分子；并且，所述分子是小药物分子、生物分子、结构大分子或治疗分子。
在一个实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至10：1之间。
在第二实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在5：1至10：1之间。
在第三实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在4：1至7.5：1之间。
在第四实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至7.5：1之间。
在第五实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：21：21：30：4的DOTAP：DODAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在3：1至7.5：1之间。
在第六实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：21：21：30：4的DOTAP：DODAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至7.5：1之间。
在第七实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为3：63：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在7.5：1至15：1之间。
在第八实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为3：63：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比为在5：1至12：1之间。
在第九实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为6：60：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
在第十实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为6：60：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
在第十一实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为66：30：4的DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至20：1之间。
在第十二实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为66：30：4的DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在5：1至20：1之间。
在第十三实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：24.75：23.75：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
在第十四实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：24.75：23.75：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至15：1之间。
在第十五实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：38.5：10：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
在第十六实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：38.5：10：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至15：1之间。
在第十七实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为61.7：26.3：19：3的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
在第十八实施例中，脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为61.7：26.3：19：3的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至15：1之间。
在另一个实施例中，治疗性货物是C14orf132 siRNA。
根据本发明的一个方面，提供了如上所述的组合物将治疗性货物递送至宿主细胞的用途。
在一个实施例中，治疗性货物是核酸、多肽或分子。所述治疗性货物是核酸、多肽或分子，其中所述核酸是pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA、遗传佐剂、启动子或分子基因编辑工具；所述多肽是肽、表位或抗原分子；并且，所述分子是小药物分子、生物分子、结构大分子或治疗分子。
在另一个实施例中，宿主细胞是癌细胞、永生化细胞、原代细胞或肌细胞。优选地，宿主细胞是永生化细胞或原代细胞。
根据本发明的另一方面，提供了如上所述的含有C14orf 132 siRNA的组合物用于治疗转移性癌症的用途。
根据本发明的又一方面，提供了一种将治疗性货物递送至宿主细胞的方法，包括：将如上所述的组合物施用至细胞。
在一个实施例中，治疗性货物是核酸、多肽或分子。所述治疗性货物是核酸、多肽或分子，其中所述核酸是pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA、遗传佐剂、启动子或分子基因编辑工具；所述多肽是肽、表位或抗原分子；并且，所述分子是小药物分子、生物分子、结构大分子或治疗分子。
在另一个实施例中，宿主细胞是癌细胞、永生化细胞、原代细胞或肌细胞。优选地，宿主细胞是永生化细胞或原代细胞。
附图说明
将参考以下附图描述本公开的实施例，其中：
图1显示了p14endo15蛋白脂质载体(p14endo15-pLV)的工程化。(a)亲本P14和P15FAST蛋白以及各种嵌合构建体的胞外结构域、跨膜(TM)结构域和胞内结构域融合模块的排列。颜色方案描绘了每个融合模块的野生型来源(P14，绿色；P15，蓝色)。指示了胞外结构域中N-末端肉豆蔻酰化位点和相邻融合肽基序以及胞内结构域多元基序(++)和相邻两亲性螺旋的位置。嵌合体用贡献两个结构域的FAST蛋白作为骨架命名，随后是插入的域名缩写和FAST蛋白身份。数字指示每种蛋白质中的残基数。各种构建体的合胞体形成以4+标度评分，其中‘-’指示没有合胞体形成。(b)在转染后13小时捕获的用表达P14、P15或P14endo15的pcDNA3转染的Giemsa染色的QM5细胞的代表性图像。箭头指示合胞核。(c)合胞体形成的定量，表示为合胞核相对于总核的百分比。数据表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析和Tukey多重比较检验。****p<0.0001；
图2显示了P14Endo15-pLV的体外验证。(a)具有P14Endo15包封pDNA的优化的脂质配制品41N的透射电子显微镜图像。(b-c)用于评估具有包封pDNA的P14Endo15的优化的脂质制剂41N的(B)2D和(C)3D结构的原子力显微镜。(d)使用具有(右)和不具有(左)FAST蛋白(P14Endo15)的优化的脂质制剂41N包封pDNA-GFP，并将0.9nM与IMR-90、原代大鼠肝细胞、原代大鼠星形胶质细胞、HUVEC、和Hep3B细胞一起孵育96小时，然后拍摄荧光图像，并进行流式细胞术。对于除大鼠星形胶质细胞之外的所有其他细胞类型的GFP+级分呈现平均荧光强度(MFI)，其中由于-FAST组中的低转染效率，其针对总细胞群呈现。(e)FAST蛋白在体外减少可电离脂质的量并改善来自pDNA-Fluc的表达的能力。将ARPE-19细胞与包封在优化的脂质制剂41N内的pDNA-Fluc以不同的可电离脂质：pDNA摩尔比温育96小时，然后测定发光，所述脂质制剂41N具有和不具有FAST蛋白。(f)用包封在Lipofectamine 2000、MC3-LNP和Fast-PLV中的不同量的pDNA处理的HUVEC的细胞活力。(g)通过MC3-LNP或FAST-PLV递送的IMR-90细胞中pDNA-Fluc的表达。(h)在加入WI38细胞后48小时，以多种可电离脂质：mRNA摩尔比包封在优化的脂质制剂41N内的mRNA-Fluc的体外表达，所述优化的脂质制剂41N在有和没有FAST蛋白的情况下制备。数据表示为平均值±标准偏差。(i)使用具有和不具有FAST蛋白的优化脂质制剂41N以最佳3：1摩尔比包封mRNA-mCherry，并与HUVEC一起孵育48小时，然后拍摄荧光图像，并进行流式细胞术。由于FAST组中的低转染效率，呈现了总细胞群的中值荧光强度。(j)FAST-PLV将两种不同mRNA分子递送至相同细胞的能力。将HEP3B细胞与包封mRNA-eGFP和mRNA-mCherry的Fast-PLV一起孵育48小时，然后拍摄荧光图像，并进行流式细胞术。(k)FAST-PLV将pDNA-GFP和mRNA-mCherry两者递送至相同细胞的能力。将HEP3B细胞与包封pDNA-GFP和mRNA-mCherry的FAST-PLV一起孵育72小时，然后拍摄荧光图像，并进行流式细胞术；
图3显示了包封pDNA-fLuc的P14Endo15-pLV在小鼠中的安全性和有效性验证。(a)来自注射多剂量的包封pDNA-Fluc的FAST-PLV或MC3-LNP的小鼠的肝脏切片的死后肝脏图像以及苏木精和伊红染色(放大倍数＝10X)。(b)-(h)在用PBS、MC3-LNP或包封pDNA-Fluc的FAST-PLV注射后24小时从小鼠收集血液样品，并使用Meso Scale Discovery V-PLEX测定促炎细胞因子的血清浓度：(b)TNF-α、(c)IL-6、(d)、IFN-γ、(e)IL-1β、(f)CXCL1、(g)IL-10、(h)IL-5。数据表示为平均值±标准偏差，每组n＝3只生物学上独立的小鼠，单因素方差分析和Tukey多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns，不显著。(i)注射包封在MC3-LNP或FAST-PLV内的pDNA-Fluc后24小时，小鼠的全身生物发光成像。静脉内注射包封在MC3-LNP内的pDNA-Fluc的小鼠接受0.5mg/kg pDNA-Fluc，注射包封pDNA-Fluc的FAST-PLV的小鼠接受5mg/kg或20mg/kg pDNA-Fluc。(j)来自组I中小鼠的全身发光的定量(每组n＝3只生物学上独立的小鼠)。(k)来自静脉内注射包封在MC3-LNP(0.5mg/kg)或FAST-PLV(5mg/kg或60mg/kg)内的pDNA-Fluc的小鼠的离体器官生物发光。(l)静脉内注射包封20mg/kg pDNA-Fluc的FAST-pLV并监测一年的小鼠的全身生物发光。(m)静脉内注射包封20mg/kg pDNA-fLUC的FAST-pLV后63天Fluc的免疫组织化学染色(放大倍数＝10X)。TNF-α，肿瘤坏死因子α；IFN-γ，干扰素-γ；CXCL1，趋化因子(C-X-C基序)配体1；
图4显示了包封mRNA-Fluc的P14Endo15-pLV在小鼠中的安全性和功效验证。(a)将FAST蛋白掺入41N脂质制剂中改善了肌内注射后mRNA-Fluc的体内表达。生物发光信号的定量来自组A。数据表示为平均值±标准偏差，每组n＝3只生物学上独立的小鼠。未配对的t-测试。**p<0.01(b)静脉内注射包封2mg/kg mRNA-Fluc的FAST-PLV后4小时，小鼠的全身生物发光。(c)静脉内注射包封2mg/kg mRNA-Fluc的FAST-PLV后4小时，小鼠的离体器官生物发光。(d)静脉内或肌内注射包封mRNA-EPO的FAST-PLV后的血清EPO浓度。每组n＝3只生物学上独立的小鼠。(e)小鼠肌内重复给药0.3mg/kg包封在FASTt-PLV内的mRNA-Fluc，每月一次，持续六个月。(f)注射后100小时来自组E中小鼠的全身生物发光的定量。(g)在组E和组F中所示的时程上计算的曲线下面积。(h)小鼠静脉内重复给药1.2mg/kg包封在FAST-PLV中的mRNA-Fluc，每月一次，持续六个月。(i)注射后100小时来自组H中小鼠的全身生物发光的定量。(j)在组H和组I中所示的时程上计算的曲线下面积。(k)经由ELISA评估从重复肌内或静脉内给药的小鼠收集的血清的抗-FAST抗体水平。(l)经由ELISA评估从重复肌内和静脉内给药的小鼠收集的血清的抗-FLuc抗体水平。(m)将来自重复给药小鼠的血清与包封pDNA-GFP的FAST-PLV一起孵育，然后添加到3T3细胞中。加入后96小时进行流式细胞术，并呈现GFP+群体的平均荧光强度。合并的血清是来自10只具有不同程度溶血的单独动物的等体积血清的组合，以控制基质干扰；
图5显示了包封pDNA-GFP的P14Endo15-pLV在非人灵长类动物中的安全性验证。(a)成年绿猴(Chlorocebus sabaeus)以2mL/min的速率静脉内输注包封1mg/kg pDNA-GFP的FAST-PLV。输注后两天，使用对pDNA骨架具有特异性的引物的定量PCR方法在30个组织中定量pDNA的量。(b)在静脉内输注包封1或6mg/kg pDNA-GFP的FAST-PLV后一天，用苏木精和伊红染色的组织的代表性图像(放大倍数＝10X)。(c)-(d)在指定时间点从注射包封两个剂量的pDNA的FAST-PLV的测试受试者收集血液样品，用于确定临床化学参数(c)ALT和(d)AST的血清浓度。阴影区域表示正常参数范围。(e)-(g)在指定时间点从注射包封两个剂量的pDNA的FAST-PLV的测试受试者收集血液样品，并使用Meso Scale Discovery V-Plex测定促炎细胞因子的血清浓度：(e)IFN-γ、(f)IL-6、(g)IL-1β。(h)-(i)，在指定时间点从注射包封两个剂量的pDNA的FAST-PLV的测试受试者收集血液样品，并经由ELISA测定法测定CARPA介质(h)C4d和(i)sC5b-9的血清浓度。ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸转氨酶；IFN-γ，干扰素-γ；
图6显示使用FAST-PLV递送编码促滤泡素抑制素的pDNA。(a)使用FAST-PLV包封pDNA-CMV-FST(+)或pDNA-CMV-GFP(-)并添加至C2C12小鼠成肌细胞。进行蛋白质印迹以检查FST的表达以及Akt和mTOR的磷酸化。高于磷酸化条带的数字表示相对于pDNA-CMV-GFP处理的C2C12裂解物的倍数增加。(b)经由ELISA测定的FAST-PLV添加至C2C12小鼠成肌细胞后FST的培养基浓度。(c)经由ELISA测定的用包封10mg/kg pDNA-CMV-FST或pDNA-TTR-FST的FAST-PLV静脉内注射C57BL/6小鼠后FST的血清水平(每组n＝3只生物学上独立的小鼠)。(d)静脉内注射PBS或包封10mg/kg pDNA-CMV-FST或pDNA-TTR-FST的FAST-pLV后15周，来自每组的代表性动物。注意，在PBS小鼠中脱发，可能与治疗无关，因为所有笼配对物呈现相同的状况。(e)静脉内注射PBS或包封10mg/kg pDNA-CMV-FST或pDNA-TTR-FST的FAST-pLV后15周小鼠的体重。单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，*p<0.05。(f)将来自组(E)的体重测量值归一化至注射前即刻获得的初始体重。单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，*p<0.05。(g)静脉内注射PBS或包封10mg/kg pDNA-CMV-FST或pDNA-TTR-FST的FAST-PLV后15周小鼠的后肢握力。单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，**p<0.01。(h)将来自组(G)的握力测量值归一化为注射前即刻即获得的初始握力读数。单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，**P<0.01。(i)在注射后46周，用PBS或5mg/kg pDNA-CMV-FST肌肉内注射到左GAS中的小鼠的后肢握力。非配对t-测试，*p<0.05。(j)用5mg/kg pDNA-CMV-FST肌内注射到左侧GAS内(用箭头指示)后46周的小鼠的大体解剖，具有代表性的WGA-488染色的GAS切片。(k)肌内注射pDNA-CMV-FST或PBS后46周，同侧和对侧GAS重量。非配对t-测试，**p<0.01。(l)将来自肌肉内注射pDNA-CMV-FST的小鼠的同侧和对侧GAS用WGA-488染色，并使用MyoVision软件测定横截面肌纤维面积。非配对t-测试，****p<0.0001。(m)注射后46周静脉内注射10mg/kg pDNA-CMV-FST的小鼠的后肢握力。非配对t-测试，**p<0.01。(n)静脉注射PBS或10mg/kg pDNA-CMV-FST后46周小鼠的大体解剖，具有GAS WGA-488染色的代表性图像。(o)静脉注射pDNA-CMV-FST或PBS后46周的GAS重量。非配对t-测试，*p<0.05。(p)使用MyoVision软件测定来自静脉内注射的pDNA-CMV-FST或PBS小鼠的WGA-488染色GAS的横截面肌纤维面积。非配对t-测试，****p<0.0001。FST，卵泡抑素；GFP，绿色荧光蛋白；GAS，腓肠肌；WGA-488，小麦胚芽凝集素Alexa Fluor 488；CMV，巨细胞病毒；TTR，甲状腺素运载蛋白；
图7显示了快速铃蟾肽PLV的合成和表征。(a)-(h)标准LNP(a,c,e,g)和FAST-PLVs(b,d,f,h)的原子力显微镜(AFM)。(i)铃蟾肽，一种14个氨基酸的配体，选择性结合胃泌素释放肽受体(GRPR)。(k)(a-d)快速铃蟾肽蛋白保留融合活性(合胞体测定)；
图8显示了FAST-PLV的配体定向靶向。(a)PC3和BPH细胞中GRPr蛋白水平的蛋白质印迹。β微管蛋白加载标准。细胞荧光显微镜显示FITC-葡聚糖向表达GRPr的细胞的递送增强。(b)在BPH和PC3细胞中由标准LNP、FAST-PLV和快速铃蟾肽PLV递送的细胞内FITC标记的葡聚糖的中值荧光强度。(c)在用游离铃蟾肽肽或GRPr siRNA同时处理的PC3细胞中，FAST-铃蟾肽PLV递送的FITC标记的葡聚糖的中值荧光强度；
图9显示了经由GRSR受体选择性靶向前列腺癌。不含融合铃蟾肽的64Cu标记的FAST-PLV制剂的PC-3肿瘤摄取的正电子发射断层扫描(PET)成像(a，左图)和含有融合铃蟾肽的64Cu标记的FAST-PLV制剂的PC-3肿瘤摄取的正电子发射断层扫描(PET)成像(右图)。(b)，标准化摄取值(SUV)显示90分钟内的信号衰减；
图10显示卡巴他赛FAST-PLV的优化。(a)POPC导致PLV比用DOPE配制的PLV具有更小的尺寸和更低的PDI。FAST蛋白不显著改变大小、PDI或ζ电位。(b)将FAST蛋白掺入基于DOPE的脂质制剂中显著增强了化学毒性；
图11显示原发性肿瘤生长和C14orf142表达。(a)肿瘤生长(mm3)，(b)体重(g)，(c)肿瘤重量(g)，(d)通过RT-qPCR的肿瘤C14orf142表达；
图12显示了肺、脑和肝的786-0RCC器官转移。人Alu qPCR结果显示在用携带FAST-PLV的阴性对照乱序相对于携带FAST-PLV的C14orf142siRNA处理后对相关转移负载的影响。n＝10只动物。*P<0.05相对于乱序双尾t-测试；
图13显示了通过FAST-PLV将siRNA(20875)递送至肝脏的体内评价。siRNA20875靶向肝脏表达的称为基因X的分泌蛋白。20875siRNA FAST-PLV制剂以3mg/kg静脉内注射。注射后48小时从小鼠收集肝、肺、脑和血清。测定了用siRNA 20875FAST-PLV处理后小鼠基因X的循环血清水平的显著降低。(a-b)小鼠肝、肺和脑蛋白的Western印迹，抗基因X抗体用于检测表达的基因X的水平。(c)血清中小鼠基因X的ELISA。(d-e)小鼠血清蛋白的蛋白质印迹，抗基因X抗体用于检测表达的基因X的水平；图14显示了(a)爬行动物呼肠孤病毒(Python)P14 FAST蛋白的氨基酸序列，包括胞外结构域、跨膜结构域、两亲性螺旋\和胞内结构域的代表性序列；和(b)狒狒呼肠孤病毒P15FAST蛋白，其包括胞外结构域、跨膜结构域、两亲性螺旋(AH)和胞内结构域的代表性序列；
图15显示了真正的FAST蛋白和具有它们的相对融合活性的内-、跨膜和胞外结构域嵌合构建体的示意图，(myr)肉豆蔻酸、(hp)疏水性补片、(ecto)胞外结构域、(tm)跨膜结构域、(endo)胞内结构域、(··)棕榈酰化半胱氨酸残基、(+++)多元区。通过观察Giemsa染色的单层中合胞体形成的程度来定性评分融合活性；
图16显示了P14endo15-pLV的脂质制剂的优化。(a)3种可电离(DODAP、DLin-MC3-DMA、DODMA)和2种阳离子(DOTMA、DOTAP)脂质在添加至WI-38细胞后72小时经由AlamarBlue测定的耐受性比较。(b)添加后96小时，不同的可电离脂质：pDNA摩尔比对ARPE-19细胞中pDNA-Fluc的体外表达的影响。(c)-(e)用将1.5nM pDNA-Fluc递送至VERO细胞的FAST蛋白配制的四种脂质制剂(41N、37N、33T、28M)的毒性和功效的比较。(c)用于测定pDNA-Fluc添加后24小时的细胞毒性的LDH测定。(d)添加pDNA-Fluc后72小时测定的发光。(e)表达作为细胞毒性的函数。数据表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析，Tukey多重比较，****p<0.0001。(f)-(I)在静脉内注射每种包封8mg/kg pDNA-Fluc的PLV脂质制剂后24小时从小鼠收集血液样品，并使用Meso Scale Discovery V-Plex测定促炎细胞因子的血清浓度：(f)TNF-α、(g)IL-6、(h)IFN-γ、(i)IL-1β、(j)CXCL1、(k)IL-10、(l)IL-5。单因素方差分析和Tukey多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。(m)肌肉内注射用脂质制剂41N或脂质制剂37N制造的包封1.25mg/kg pDNA-Fluc的fAST-PLV的小鼠的全身生物发光。(n)组M中生物发光信号的定量(每组n＝2只生物学上独立的小鼠)；
图17显示了重复肌内给药后P14Endo15-pLV的免疫原性。每月一次肌内注射10μg包封在P14Endo15-PLV内的mRNA-Fluc持续五个月的小鼠的全身发光；
图18显示了重复静脉内给药后P14Endo15-pLV的免疫原性。每月一次静脉内注射40μg包封在P14Endo15-PLV内的mRNA-Fluc持续五个月的小鼠的全身发光；
图19显示制剂37在体外递送pDNA时比28稍微更耐受，且制剂41在人脐静脉内皮细胞中最耐受，当递送pDNA-GFP时产生最高的平均荧光强度和与MC3相当的转染效率；
图20显示了在HUVEC中的单独实验，当与由37和33的1：1混合物组成的组合制剂相比时，制剂41显示出优异的pDNA-GFP转染；
图21显示了用包封具有不同量PEG的mRNA-mCherry的制剂28转染的SW 80细胞。4％PEG给出了约115nm的有利尺寸，其中包封效率为86.39％；
图22显示在RPE细胞中，制剂28表现出优异的pDNA-fLuc转染。然而，制剂41一致地证明了由P14E15引起的增强。所有制剂在较低电荷比下显示出由P14E15引起的一些增强，表明融合增强蛋白可有效减少可电离脂质的量。基于耐受性和P14E15增强，在体外广泛检查制剂41；
图23显示IMR-90细胞用10Gy辐照并放置1周，然后用包封在制剂41中的pDNA-Luc(顶部)或pDNA-GFP(底部)转染。(顶部)转染后72小时，在辐照的和正常的IMR-90细胞中测定发光，证明在辐照的细胞中的高表达。(底部)转染后72小时，用SA-β-gal染色辐照的细胞以鉴定衰老细胞，并进行成像细胞计数以确定SA-β-gal+和SA-β-gal-细胞中的GFP表达。注意：其他制剂在经辐照的细胞中导致高度毒性；
图24显示了FAST-pLV(用制剂41N和P14Endo15制备)通过多种给药途径-肌内和静脉内注射以及口服给药递送编码萤火虫荧光素酶的pDNA的能力；
图25显示了皮下给药后本发明制剂的持久性。单剂量的本发明制剂包封编码CAG-荧光素酶的pDNA。在第55天，通过离体发光成像在注射部位外未观察到表达；以及
图26显示了全身给药后PLV 41的持久性。单剂量的本发明制剂在具有细菌序列(pcDNA3)或不具有细菌序列(纳米质粒)的主链中包封编码CMV-荧光素酶的pDNA。
具体实施方式
以下描述仅通过示例的方式对优选实施例进行描述，而不限于用于实施本发明所需的特征的组合。
用融合相关小跨膜(FAST)蛋白或其嵌合体配制的基于蛋白脂质载体(PLV)的治疗性货物递送载体允许以最小摩尔比利用可电离脂质用于中和治疗性货物的阴离子电荷的唯一目的，而不是使用可电离脂质促进内体逃逸。将所述FAST蛋白或其嵌合体掺入所述PLV平台中增强了mRNA和pDNA在体外和体内两者的细胞内递送和表达。本发明的PLV还显示出有利的免疫谱，并且毒性显著低于常规LNP。
能够将治疗性货物递送至细胞的本发明的蛋白脂质囊泡包含含有一种或多种可电离脂质的脂质纳米颗粒；以及融合相关小跨膜(FAST)家族蛋白及其嵌合体中的一种或多种。可电离脂质与治疗性货物的摩尔比在2.5：1至20：1之间。
可电离脂质是本领域已知的，包括但不限于：DLin-KC2-DMA(KC2)、DODMA、DODAP、DOBAQ、DOTMA、18：1EPC、DOTAP、DDAB、18：0EPC、18：0DAP或18：0TAP。本发明的蛋白脂质囊泡优选包括DODAP和/或DODMA。
本发明的FAST蛋白包括在呼肠孤病毒科中发现的天然FAST蛋白，包括来自水呼肠孤病毒属和正呼肠孤病毒属的那些。水禽呼肠孤病毒(AqRV)主要负责感染鱼类，而正呼肠孤病毒(ORV)感染许多脊椎动物宿主，包括狒狒(BRV，狒狒正呼肠孤病毒)、人类(MRV，哺乳动物正呼肠孤病毒)、蝙蝠(NBV，纳尔逊湾正呼肠孤病毒；BRRV，布鲁姆正呼肠孤病毒)、爬行动物(RRV，爬行动物正呼肠孤病毒)以及驯养的陆地和水禽(ARV，禽类正呼肠孤病毒)。特别地，FAST蛋白ARV P10、BRV P13、RRV P14、BRV P15、AQV P16和AQV P22可用于本发明的pLV中。
FAST蛋白是由无包膜病毒编码的膜融合蛋白的唯一实例，且长度约为100-200个残基的是最小的已知病毒融合蛋白。这些非糖基化蛋白不是病毒粒子的组分，但在病毒感染的细胞内表达并运输到质膜，在那里它们介导细胞-细胞膜融合，产生多核合胞体以促进细胞-细胞病毒传播(37)。FAST蛋白在生理pH下起作用，并且不需要特异性细胞受体，允许它们融合几乎所有细胞类型(38)。FAST蛋白共享三个共同的结构域。单个跨膜结构域用作反向信号锚定序列以引导膜中的双向Nout/Cin I型拓扑结构。这种拓扑结构将非常小的N-末端胞外结构域(20-40个残基)定位在质膜外部，并在细胞质中定位相当长的(约40-140个残基)C-末端胞内结构域。
可以合成嵌合FAST蛋白，其组合来自不同FAST蛋白的结构域，例如P10、P14和P15肽，以形成功能性多肽。例如，如图1中所示，已经合成了许多不同的嵌合FAST蛋白。在不同的组合中，包含来自p14FAST蛋白的胞外结构域或其功能部分、来自p14FAST蛋白的跨膜结构域和来自p15FAST蛋白的胞内结构域或其功能部分的嵌合体，在本文中称为“p14endo15”；包含来自p14FAST蛋白的胞外结构域或其功能部分、来自p15FAST蛋白的跨膜结构域和来自p14FAST蛋白的胞内结构域或其功能部分的嵌合体，在本文中称为“p14TM15”；且包含来自p14FAST蛋白的胞外结构域或其功能部分、来自p15FAST蛋白的跨膜结构域和来自p15FAST蛋白的胞内结构域或其功能部分的嵌合体(在本文中称为“p15ecto14”)在本发明中特别有用。
将嵌合FAST蛋白掺入PLV平台增强了治疗性货物的细胞内递送以及体外和体内两者的mRNA和pDNA的表达。这些PLV还显示出有利的免疫谱，并且毒性显著低于常规LNP。
尽管PLV-FAST平台特别适用于递送基于核酸的治疗性货物，例如pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA(SAM)、遗传佐剂、启动子和分子基因编辑工具，但该平台也允许安全和有效地递送多肽，例如肽、表位、抗原和分子，例如小药物分子、生物分子、结构大分子、治疗性大分子。
遗传佐剂是本领域已知的，并且包括当与疫苗一起给予时可以调节免疫应答的任何上述形式的货物。类似地，分子编辑工具是本领域已知的，并且包括可用于编辑宿主基因组的那些工具(即：CRISPR/Cas9技术)。生物分子在本领域中类似地是已知的，并且包括由细胞或活生物体产生/制备的任何物质。如对于本领域技术人员而言已知的那样，结构大分子是有助于细胞或生物体的结构完整性的那些大分子(脂质、蛋白质、碳水化合物和/或核酸)。类似地，本领域内已知治疗性大分子包括可用作疾病和病症的治疗剂的那些分子。
利用FAST蛋白的膜融合诱导活性，开发了例如能够全身pDNA和mRNA递送的高度耐受的治疗性货物递送平台。为了实现这一点，合成并筛选嵌合FAST蛋白文库。用FAST蛋白质配制的蛋白-脂质载体代表了有效且可重新给药的治疗性货物递送平台，与常规非病毒方法相比，其能够以高耐受性实现广泛的生物分布。新型且高活性的嵌合FAST融合剂P14Endo15的发现使得能够重新设想常规脂质纳米颗粒制剂以去除胆固醇(如果需要)，利用替代的可电离脂质，并选择可电离脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的最佳比例以实现这些特征(图1)。不希望受到理论的束缚，P14endo15的优异融合活性可能由有效的P14胞外结构域融合肽和促进脂质与靶细胞膜混合的肉豆蔻酸酯部分介导，然后是P15胞内结构域融合-诱导脂质包装传感器(FLIP)基序分配到PLV膜中以促进孔形成和脂质体-细胞融合活性(90，91)。将P14Endo15掺入PLV平台导致体外和体内治疗性货物表达增强。
pDNAFAST-PLV的全身体内给药导致靶蛋白在广泛系列的器官中持久的、剂量依赖性的表达，没有可检测到的组织或免疫毒性，即使在比常规(临床批准的)LNP制剂的最大耐受剂量高几个数量级的剂量下也是如此。当全身施用时，常规LNP优先在肝脏中累积，由ApoE与LNP表面的结合介导。这种行为推动了基于肝靶向siRNA的LNP药物的临床开发(18，92，93)，同时限制了其更广泛的应用。肝外核酸递送对于诸如癌症的适应症特别重要，其需要广泛的生物分布以实现足够的摄取(3)。与常规LNP一样，大多数AAV血清型倾向于优先靶向肝脏，除了可以靶向神经元的AAV9的情况，尽管基因转移效率较低(63，94)。这对其他病症产生了问题，因为基因转移可能需要局部AAV递送，这对于所有病症都是不可能的(95)。另外，具有高转换率的细胞将快速稀释转基因，并且由于免疫原性应答，载体不能再次利用(96-99)。这为开发靶向播散性癌症的遗传药物带来了问题。基于证明相当广泛的pDNA肝外递送的NHP生物分布数据，FAST-PLV应在晚期癌症的治疗中具有实质性临床效用。
局部或全身施用的FAST-PLV递送编码FST-344的pDNA的能力，以及用于基因递送以实现肌肉组织中的可量化变化的能力(类似于先前关于AAV的报道)，证明了该非病毒平台的潜在临床效用(103-106)。同样，FAST-PLV的低免疫原性对于这种类型的基因疗法是有益的。在AAV基本上需要单剂量的终身基因表达的情况下，可以调整FAST-PLV施用以适应每个患者的需要。这也使得能够根据需要停止和开始治疗。下面讨论的数据还表明，通过改变pDNA启动子，可以将全身fast-PLV施用后的治疗性基因表达靶向特定组织类型，这在将来可以用于防止脱靶效应。
使用本文所述的FAST-PLV成功体内递送作为治疗性货物的pDNA代表了开发非病毒基因的有希望的步骤，因为DNA递送的治疗方法通常限于病毒平台(3，41)。另外，FAST-PLV能够将mRNA递送至广泛系列的肝外器官。通常，由于包封大分子如DNA的挑战，非病毒递送载体如LNP仅适用于基于RNA的基因治疗方法(41)。由于其大尺寸，相对于包封mRNA和siRNA的颗粒，pDNA需要更高摩尔比的阳离子组分来中和其阴离子电荷并促进递送。增加阳离子组分的量导致毒性的相应增加，阻止成功的全身递送。FAST-PLV代表可以包封pDNA和mRNA并且能够将两种核酸递送至同一细胞的第一种非病毒核酸递送载体之一。
使用腺病毒载体的最初基因治疗试验报告了严重的和危及生命的不良事件，促使转向AAV载体(2,107，108)。虽然已经用AAV载体获得了有希望的结果，但是它们的小货物容量和抗AAV免疫应答限制了它们的使用(6,108-110)。FAST-PLV的大货物容量表明了开发CRISPR/Cas9基因编辑技术的潜力(110,111)。成功的基因编辑需要将Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)递送至靶细胞。Cas9转基因约为4.2kb，这使它们处于AAV包装能力的上限(112)。为了克服该限制，通常需要多种AAV载体来分别递送Cas9和gRNA(113)，或者可以使用LNP和AAV的组合(114)。另外，可以对Cas9结构进行修饰，使得gRNA和Cas9序列能够包含在相同的AAV基因组中(109)。另一方面，利用FAST-PLV将使得Cas9和gRNA序列都能够包含在单个pDNA上。备选地，Cas9和gRNA可以共同包封到相同的pLV中，这将使得能够使用pDNA或mRNA，或两者的组合。
应当理解，对于本领域技术人员而言，对其的许多修改将是显而易见的。因此，以上描述和附图应被视为对本发明的说明，而不是限制性的。还应当理解，本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或改变，这些变型、用途或改变通常遵循本发明的原理，并且包括在本发明所属领域内的已知或惯常实践内并且可以应用于本文所述的基本特征并且如下在所附权利要求的范围内的与本公开的这种偏离。
实施例1：具有增强的融合活性的新型FAST蛋白质杂合体的工程化
FAST蛋白家族包含六个结构相似的成员，根据其分子量(道尔顿)命名(即P10、P13、P14、P15、P16和P22)，并且不具有保守序列同一性，包括P10(禽类正呼肠孤病毒)、P14(爬行动物正呼肠孤病毒)和P15(狒狒正呼肠孤病毒)(36)。所有六种已知的FAST蛋白显示出二分膜拓扑结构，其中单跨膜(TM)结构域将约19-40个残基的最小N-末端胞外结构域连接到较长的C-末端细胞质胞内结构域(46)。这些结构域内包含的结构基序以及合胞体形成的速率和程度在家族成员之间显著变化(47)。FAST蛋白胞外结构域通常在倒数第二个N-末端甘氨酸上具有肉豆蔻酸酯部分，并且在其胞外结构域中都含有不同的膜去稳定化融合肽基序(例如，p14脯氨酸铰链环，p15 II型聚脯氨酸螺旋)(48，49)。FAST蛋白胞内结构域都含有参与蛋白质运输的近膜多元基序(50)，以及驱动孔形成的膜近侧膜曲率传感器(51)。与特定的TM结构域特征(40，52)一起，这些基序协同作用以重塑膜并促进膜融合。
FAST蛋白是模块化的，因为不同的元件或结构域可以执行冗余功能，例如来自所有FAST蛋白的疏水性补片、富含p15脯氨酸的区域和p10胞内结构域中的棕榈酰化半胱氨酸残基是全都使膜不稳定的不同结构域。同样，一些元件，如疏水性补片，保留相同的融合诱导功能，同时位于不同的结构域上；对于P14，其位于胞外结构域上，而在P15中，疏水性补片位于胞内结构域上(36、46、51)。
为了具有增强的融合活性的新的FAST蛋白质杂合体的工程化，使用FAST蛋白的模块性质来确定基序的特定组合是否可以组装成具有增强的融合活性的重组FAST蛋白，从高活性P14和P15 FAST蛋白开始(47)。产生嵌合P14和P15FAST蛋白文库，其中P14的胞外结构域、TMD或胞内结构域被P15的相应结构域取代，并使用合胞体形成测定对每种构建体的融合活性进行分级(图1a)。具有单独或一起的P15 TMD和P15胞内结构域的嵌合体(P14TM15、P15ecto14)保留融合活性。同时，没有来自p15骨架的背景之外的具有p15胞外结构域的嵌合体保留融合活性(p14ecto15，p15Endo14，p15TM14)，这表明p15胞外结构域需要反式定位的疏水性补片基序用于融合活性。六种嵌合蛋白中的三种是融合死亡的，而两种保持与亲本蛋白相当的融合活性。一个候选物P14Endo15具有比P14或P15亲本显著更高的活性(图1b、图1c)。该嵌合体包含P14胞外结构域，其含有具有稳健的膜去稳定活性的肉豆蔻酰化脯氨酸铰链环融合肽基序，其经由P14TM结构域连接到P15胞内结构域，其含有有效的两亲性螺旋-扭结-螺旋膜曲率传感器。基于这些结果，选择P14Endo15用于优化用于递送治疗性货物的新型PLV制剂。
实施例2：用于核酸递送的脂质和FAST蛋白质制剂的优化
常规LNP依赖于内体逃逸进行细胞内递送，这导致有限的核酸释放到胞质溶胶中，并且是配制用于基因治疗的LNP的主要限制之一(13，20，41)。为了确定将P14Endo15掺入脂质制剂中是否会通过促进PLV-细胞膜融合来显著改善核酸向胞质溶胶中的递送，同时由于需要脂质仅通过电荷中和来促进核酸包封而改变制剂要求以促进与常规LNP相比改善的耐受性，评估了一组阳离子和可电离脂质对人类成纤维细胞(WI-38)的毒性，包括阳离子脂质1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、以及可电离脂质1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、DLin-MC3-DMA(MC3)和1，2-二油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODMA)。其中，DODAP具有最有利的耐受性，DOTAP显示出略高的毒性(图16a)。这些脂质用于PLV制剂中以通过电荷中和促进核酸包封。通过测量DNA编码的萤火虫荧光素酶(pDNA-Fluc)在视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞中的递送和随后的表达来评估DODAP与pDNA的最佳摩尔比。5：1的可电离脂质DODAP与pDNA的比例导致最大表达(图16b)。
优化抗脂质蛋白制剂以确定阳离子脂质的最低摩尔比，所述阳离子脂质的最低摩尔比允许有效包封与体外最高耐受性偶联的阴离子核酸货物。然后使用pDNA有效负载来创建一组超过40种脂质的制剂，其以不同比例组合阳离子脂质(DOTAP)、可电离脂质(DODAP和/或DODMA)、胆固醇、辅助脂质(2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；DOPE)和聚乙二醇化脂质(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-2000；DMG-PEG)，以努力平衡细胞内递送和活性与耐受性。最初，使用微流体平台以以下脂质摩尔比(阳离子/可电离/辅助/聚乙二醇化)产生基于包封和尺寸的这些中最有希望的(标为28M、33T、37N和41N)：28M(24：42：30：4)、33T(24：21：21：30：4)、37N(6：60：30：4)和41N(0：66：30：4)(53-55)。为了评估FAST蛋白对其递送效率的贡献，将pDNA-Fluc包封在具有或不具有P14Endo15 FAST蛋白的每种制剂中，并确定所得尺寸、多分散指数(PDI)和ζ电位(表1)。
表1：含有和不含P14endo15嵌合FAST蛋白的脂质纳米颗粒制剂的物理特征。
制剂 平均尺寸(nm) 多分散指数 ζ电位
28m 62.2±6.9 0.1525±0.0058 +0.560±0.920
28m+P14Endo15 52.7±8.3 0.1865±0.0064 +1.738±0.167
33T 51.9±3.0 0.2211±0.0389 +0.429±0.166
33T+P14Endo15 59.3±5.0 0.1606±0.0079 +0.645±0.746
37N 75.8±16.6 0.1730±0.0044 +0.886±0.588
37N+P14Endo15 52.4±6.4 0.1740±0.0159 +6.442±2.905
41N 47.3±6.2 0.2000±0.0183 -10.550±0.573
41N+P14Endo15 61.7±11.7 0.1570±0.0072 -7.174±1.631
发现所有PLV制剂的直径<80nm，PDI<0.3，表明是单分散性的。在随后的实验中，各种脂质的其他组合显示在体外和体内有效，包括制剂38(3：63：30：4)、41C(49.5：24.75：23.75：2)、41C-1(49.5：38.5：10：2)、41CMP(61.7：26.3：19：3)(表2)。发现所有另外的PLV制剂的直径<80nm，PDI<0.3，表明单分散性。
表2：PLV制剂的组成
/>
在肾上皮(Vero)细胞中评价这些制剂的效力和细胞毒性。总之，制剂41N显示出最有利的耐受性(图16c)，并且比制剂37N的效力略低(图16d)。虽然制剂37N显示出大约3倍更高的效力，但是其毒性比41N高>6倍。制剂33T比其他制剂毒性大得多，并且从进一步分析中省略，而28M在耐受性方面与37N相似，具有显著更低的效力。效力与耐受性(加权相等)的直接比较表明，制剂41N评分高于37N，其进而评分显著高于28M和33T(图16e)。使用促炎细胞因子应答(TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β、CXCL1、IL-10、IL-5)作为免疫毒性的指标，通过用8mg/kg剂量的pDNA-Fluc静脉内注射小鼠体内证实了在Vero细胞中用FAST-PLV制剂获得的耐受性结果(56)。注射FAST-PLV制剂41N的小鼠诱导最低水平的促炎细胞因子，与注射PBS的对照小鼠中的促炎细胞因子相当(图16f-i)。与41N相比，制剂37N诱导几种细胞因子的适度、但一致性更高的增加，而制剂28M诱导所有细胞因子水平的显著升高(图16f-i)。这些体内耐受性结果反映了在Vero细胞中观察到的结果。然后通过肌内途径在免疫活性动物中进行含有pDNA-Fluc的41N和37N PLV的功效的直接比较。与体外效力相反，发现41nNpLV显著优于37N，几乎10倍(图16m，n)。不希望受到理论的束缚，这可能归因于较低的局部毒性和免疫刺激，这促进了pDNA递送的改善。基于所有这些结果，选择PLV制剂41N用于进一步开发和优化。
通过透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)评估41N pDNA FAST-PLV的大小和结构。TEM揭示了由外部脂质双层和负染色的内核构成的均匀球形结构(图2a)。AFM显示具有66.3±15.3nm的近似尺寸分布的均匀球形结构(图2b、图2c)，与动态光散射(DLS)测量一致(表16)。在一组培养的和原代细胞系中评估了用FAST蛋白和不用FAST蛋白以及用不同比例的可电离脂质与pDNA-GFP配制的41N pDNA-GFP pLV的效力。在所有测试的细胞系中，含有FAST的制剂显示出显著改善的效力，如通过GFP表达所测量的(图2d)，其在可电离脂质与pDNA的5：1比率下最大(图2e)。基于此，使用41N脂质制剂(摩尔比为66：30：4的DODAP、DOPE和DMG-PEG脂质)和5：1摩尔比的DODAP与pDNA完成优化的FAST-PLV制剂。
为了建立合适的参考点，在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人成纤维细胞(IMR-90)中比较了FAST-PLV对阳离子脂质制剂Lipofectamine 2000和由DLin-MC3-DMA组成的常规LNP制剂(MC3-LNP)的效力和耐受性(23)。含有pDNA-Fluc的FAST-PLV的毒性显著低于Lipofectamine 2000，具有与MC3-LNP相当的耐受性(图2f)。然而，FAST-PLV表现出比MC3-LNP显著更高的pDNA-Fluc表达(图2g)。
然后使用一定范围的DODAP与mRNA的摩尔比来评估含和不含FAST蛋白的41N PLV制剂中mRNA的递送。在DODAP：mRNA比率为3：1时发现WI-38细胞中mRNA-Fluc的最高表达，并且FAST蛋白的掺入在每种情况下均显著增强效力(图2h)。使用41N PLV将mRNA-mCherry递送到人原代内皮细胞(HUVEC)中也观察到类似的结果(图2i)。通过mRNA-mCherry和mRNA-eGFP在用含有1：1摩尔比的每种mRNA的PLV以组合的12nM剂量处理的细胞中的共表达来证明FAST-PLV将多种mRNA递送至相同细胞的能力(图2j)。此外，用1：6摩尔比的pDNA-GFP和mRNA-mCherry有效负载的混合物配制的FAST-PLV在组合的7nM剂量下显示两种报告物在细胞中的表达(图2k)。因此，与常规LNP相比，优化的41NFAST-PLV制剂适合于以高效力和低毒性将pDNA和/或mRNA包封和细胞内递送至培养的和原代细胞。
实施例3：通过P14endo15-PLV全身体内递送pDNA和mRNA的测定
由于P14endo15-PLV能够有效递送pDNA、mRNA以及两种不同mRNA货物的组合，或pDNA加mRNA，用于体外表达，因此检测了包封mRNA-fLuc的P14endo15-PLV在体内的递送和表达效率。DNA的安全且有效的全身递送是一个重大挑战，其中许多平台表现出低的体内耐受性，导致宿主免疫刺激和肝毒性(41,57,58)。在0.5mg/kg至80mg/kg DNA的剂量范围内，与常规MC3-LNP脂质制剂相比，评估FAST-PLV的体内生物分布、效力和耐受性。全身静脉内施用包封pDNA-FLUC的MC3-LNP高于1mg/kg的剂量导致小鼠在注射48小时内显著死亡，而FAST-PLV在>60mg/kg的剂量下耐受良好(表3-5)。
表3：注射一定剂量浓度范围的包封pDNA的P14endo15-pLV与包封pDNA的MC3-LNP的小鼠的耐受性和存活性。
表4：当包封在制剂41(P14E15-PLV)中时的最大耐受pDNA-fLUC剂量
P14E15-PLV剂量 存活的小鼠 总的注射小鼠
5mg/kg 3 3
6.5mg/kg 2 2
20mg/kg 6 6
60mg/kg 1 1
80mg/kg 1 1
表5：包封在MC3中时的最大耐受pDNA-Fluc剂量
用制剂41注射的所有小鼠存活，而接受大于1mg/kg MC3剂量的小鼠遭受严重的发病率和死亡率。
对1mg/kg和5mg/kg的MC3-LNP处理的小鼠的死后分析揭示了显著的肝毒性，这在肉眼视觉检查时是容易显而易见的(图3a)，其中组织学分析表明肝损伤的特征在于出血(图3b)。相比之下，通过肉眼视觉或组织学检查，用剂量高达20mg/kg的fAST-PLV治疗的小鼠未显示肝脏病理学的迹象(图3a、图3b)。在静脉内注射以5mg/kg和20mg/kg pDNA剂量施用的FAST-PLV或以0.5mg/kg剂量pDNA施用的MC3-LNP(用于全身递送mRNA的典型剂量)后，还检查了小鼠中的细胞因子应答作为毒性的免疫指标(23)。接受任一剂量的包封pDNA-Fluc的FAST-PLV的小鼠显示任何检查的细胞因子没有显著增加，而所有细胞因子，特别是IL-6、TNF-α和IL-5，在用MC3-LNP处理的小鼠中显著升高(图3c-图3i)。
全身发光成像用于评价FAST-PLV的体内递送能力。结果显示在5mg/kg与20mg/kgFAST-PLV剂量之间FLuc表达的剂量依赖性增加，其中5mg/kg剂量的FAST-PLV产生与0.5mg/kg剂量的MC3-LNP相当的信号(图3j、图3k)，而离体生物发光显示5mg/kg FAST-PLV在多个器官中产生与0.5mg/kg MC3-LNP相当的FLuc信号(图3l)。还在全身施用20mg/kg pDNA-fLuc FAST-PLV后365天内通过全身发光成像在免疫活性小鼠中评估了体内pDNA表达的持久性。在前两天观察到强烈且广泛的全身发光信号，其降低至维持超过20周的稳定状态，其中表达在施用后持续一年(图3m)。注射后63天动物的肺、肝和脾的免疫组织化学显示在所检查的每个组织中fLuc的广泛表达(图3m)。
接下来，评估了FAST-PLV在体内递送mRNA的能力。将FAST蛋白掺入mRNA-Fluc PLV中导致肌内注射后表达显著增加(图4a)。在以2mg/kg的剂量静脉内注射包封mRNA-Fluc的FAST-PLV后4小时观察到广泛的全身发光(图4b)，并且离体发光成像证实荧光素酶在广泛系列的器官中表达，包括肺、肝、脾、肾和脑(图4c)。接下来，检查了FAST-PLV递送治疗性mRNA货物的能力。目前由多个研究组研究正在递送包封编码人促红细胞生成素(EPO)的mRNA的LNP。作为潜在的贫血治疗方式(13，17，25，59)。因此，研究了静脉内注射包封0.5mg/kg或1.25mg/kg mRNA-EPO的FAST-PLV以及肌内注射包封0.3mg/kg mRNA-EPO的FAST-PLV后小鼠中的循环EPO水平。注射后8小时，在注射低剂量和高剂量mRNA-EPO的小鼠中观察到全身FAST-PLV注射后血清EPO水平分别达到7000pg/ml和13000pg/ml的大峰值。令人惊讶的是，仅肌内注射0.3mg/kg mRNA-EPO导致注射后8小时可检测的血清EPO浓度刚好低于2000pg/mL。对于低全身剂量和肌肉内注射的小鼠，循环EPO水平在注射后48小时恢复到接近基线水平，而对于高全身剂量小鼠，循环EPO水平在注射后72小时恢复到接近基线水平(图4d)。总体而言，全身体内施用包封pDNA或mRNA的FAST-PLV显示出持久的剂量依赖性表达和对广泛系列器官的生物分布，其中在显著高于用常规LNP可以实现的剂量下，肝脏或免疫毒性没有显著增加。
实施例4：通过肌内或全身途径重复给药FAST-PLV(P14Endo15)不会产生显著的免疫原性应答。
施用的生物药物如单克隆抗体或病毒基因治疗载体以抗药物或抗载体抗体的形式引发适应性免疫应答，其可以干扰或中和药物的作用，制约了它们在需要重复给药的应用中的使用(5，6，8)。考虑到在目前的FAST-PLV平台中掺入新的病毒衍生的融合蛋白，进行实验以确定FAST-PLV是否产生能够在肌内或静脉内重复施用时降低其体内效率的免疫应答。为此目的，在小鼠中以0.3mg/kg经由肌内注射(图4e-图4g)或1.2mg/kg静脉内(图4h-图4j)施用包封mRNA-Fluc的FAST-PLV，每月一次，持续六个月。在每次肌内注射后观察到荧光素酶的显著表达(图4e)，其中在每次注射中观察到表达略微增加，这可能归因于先前剂量的残留表达随时间累积(图4f、图4g)。当静脉内重复施用FAST-PLV时，未观察到总发光强度随时间的显著变化(图4h-图4j)。在第五次和最后一次FAST-PLV施用后一个月，使用间接ELISA，定量下限(LLOQ)为50ng/ml，在这些小鼠的血清中定量针对FAST蛋白的抗体。在肌内施用后，四种中的两种动物没有可检测到的抗-FAST抗体水平，并且两只动物具有刚好高于LLOD的水平，为221.6±40.6和173.5±36.3ng/ml。在静脉内重复施用FAST-PLV的三只小鼠中，一只没有可检测到的抗-FAST抗体，而两只具有335.2±5.1和453.7±71.1ng/ml的水平(图4k)。有趣的是，在所有静脉内重复给药的动物和四只肌内重复给药的动物中的两只中检测到高滴度的抗fluc抗体(图4l)，这可能有助于解释全身重复给药后荧光素酶表达的变异性(图4h)。为了确定检测水平的抗-FAST抗体是否具有中和活性，在体外转染测定中评估了在来自重复给药小鼠和对照小鼠的血清存在下pDNA-GFP pLV的活性。当血清处理的FAST-PLV用于体外转染3T3细胞时，没有观察到GFP表达的降低(图4m)，表明没有中和活性。已经确定，将包封两种不同剂量的mRNA-Fluc的P14Endo15-pLV重复肌内或静脉内注射到小鼠中产生一致的报告基因表达，耐受性良好，并且不刺激不利的免疫应答，使得该递送平台高度适合于重复剂量基因疗法。
实施例5：FAST-PLV在非人灵长类动物中安全且有效地递送pDNA，对组织具有广泛的生物分布。
在非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)中进一步检查了全身给药后不同剂量的FAST-PLV的安全性、耐受性和生物分布。在施用后两天，使用定量PCR方法在30个组织中定量以1mg/kg剂量的pDNA在FAST-PLV中通过静脉内施用递送的pDNA-GFP货物的生物分布。在所有测试的器官中检测到显著水平的pDNA，其中在肺、脾、胆囊和骨髓中检测到最高水平。特别感兴趣的是肝脏pDNA累积排名第六的事实，与常规LNP不同，这表明可以实现肝外pDNA递送(图5a)。在静脉内给予1mg/kg和6mg/kg pDNA剂量的FAST-PLV后，类似地评估耐受性。在评估的任何器官中未观察到显著的异常(图5b)，并且在测试的任何器官中未注意到治疗相关的变化(表6)。
表6.两种不同剂量携载质粒DNA的FAST-PLV非人灵长类动物组织病理学研究1mg/kg和6mg/kg。
所有病理学发现以0至5的尺度评分：0＝无可见病变，1＝最小，2＝轻度，3＝中度，4＝显著，5＝严重。
第一个数字表示所报告的损伤等级；括号中的第二个数字表示具有发现的受试者数量/评估的受试者总数。
在用于研究的老年、野生非洲绿猴群组的所有动物中报告了一些发现。例如，在所有动物的肝脏中观察到的单核细胞浸润，以及空泡化和水变性(与肝细胞糖原增加一致)在非洲绿猴的正常变异性内。另外，检测到的门静脉周含铁血黄素和色素巨噬细胞是先前寄生虫迁移轨迹的典型特征--与野生捕获动物的使用一致(60，61)。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的循环水平在研究期间保持在正常范围内(图5c、图5d)。肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平在输注后立即升高，但在输注后21天降低到预期范围内。所有其他临床化学参数在研究期间保持在正常范围内(表7)。
表7.非人灵长类动物的临床化学组成。
/>
/>
/>
在FAST-PLV输注后1-4小时观察到全身性促炎细胞因子的瞬时升高，其在输注后12-72小时恢复到基线水平(图5e-图5g和表8)。
表8.非人灵长类动物中的细胞因子组成。
/>
在FAST-PLV输注后，在趋化因子分泌上观察到类似的模式，在输注后72小时趋化因子恢复到基线值(表9)。
表9.非人灵长类中的趋化因子组成。
/>
细胞因子和趋化因子的升高不是剂量依赖性的，提示与静脉内输注相关的因素，例如局部炎症，可能是主要的促成因素。还评估了补体激活相关的假性变态反应(CARPA)，其可以引起响应于静脉内注射含脂质实体的潜在危险的超敏反应(33，34)。在FAST-PLV输注后，S蛋白结合的C末端复合物(sC5b-9)的血清水平没有显著增加(图5h)，而C4d的血清水平通过1mg/kg剂量升高约3倍，但不受6mg/kg剂量的影响(图5i)。缺乏剂量依赖性反应表明FAST-PLV的施用不太可能有助于这种升高。(图5h，图5i)。
在给予6mg/kg pDNA FAST-PLV后25天，还评估了这些动物中抗-FAST抗体的存在。在三只猴子中的一只中检测到抗-FAST抗体，其水平为144.72±13.5ng/ml。为了确定检测水平的抗-FAST抗体是否具有中和活性，评估了在来自重复给药和对照动物的血清存在下pDNA-GFP PLV的活性，并且当血清处理的FAST-PLV用于体外转染3T3细胞时，没有观察到GFP表达的减少(图17a)。总之，这些数据表明FAST-PLV在非人灵长类动物中是安全且良好耐受的，具有广泛的生物分布和显著递送至肝外器官的证据。
实施例6：本递送平台的实用性也在肌肉消耗性疾病的基因治疗小鼠模型中得到证实，显示用FAST-PLV卵泡抑素基因治疗增加后肢肌肉大小和握力。
为了确定FAST-PLV递送编码治疗性货物的pDNA的能力，我们开发了一种基因治疗方法来提高蛋白质卵泡抑素(FST)的表达。FST通过对肌肉生长抑制素(抑制肌肉生长的转化生长因子-β家族的一个成员)表现出拮抗作用而促进骨骼肌肥大(62)。AAV基因递送载体已用于评估FST基因疗法作为肌肉萎缩病症的潜在治疗(63，64)。因此，进行实验以确定在FAST-PLV中递送编码FST-344剪接变体的pDNA是否将是基于AAV的疗法的可行替代方案。当将pDNA-CMV-FST FAST-PLV与C2C12小鼠成肌细胞一起温育时，观察到稳健的FST表达相对(图6a)。在加入pDNA-CMV-FST FAST-PLV后24和48小时，FST表达与Akt和mTOR磷酸化的增加相关(图6a)(65)。生长培养基中的FST也以时间依赖性方式增加，在添加pDNA-CMV-FSTFAST-PLV后72小时水平达到10，000pg/ml(图6b)。
接下来，检查了使用两种不同启动子全身施用pDNAFAST pLVs在体内驱动FST表达的能力。由于FST主要在肝脏中产生，因此与普遍存在的CMV启动子相比，评估了由肝脏启动子(甲状腺素运载蛋白(TTR))驱动时的表达(66)。在小鼠中静脉内施用10mg/kg的pDNA-CMV-FST或pDNA-TTR-FSTFAST-PLV导致注射后一天血清FST浓度的显著峰值，其中水平在施用后3-7天恢复到接近基线水平。接受pDNA-CMV-FST pLV的动物达到1700pg/ml的一天峰值血清FST浓度，而接受pDNA-TTR-FSTFAST-PLV的动物具有2300pg/ml的峰值FST血清浓度(图6c)。15周后，施用FST-FAST-PLV基因疗法导致动物显示出更完整的骨架和肌肉组织，而PBS注射的对照动物看起来更瘦，具有突出的骨盆和椎骨(图6d)。15周后接受pDNA-TTR-FSTFAST-PLV的小鼠与PBS对照小鼠相比具有显著更高的体重(图6e、图6f)。这种观察到的体重增加与这些动物中握力的显著增加一致(图6g、图6h)。
还检查了局部和全身施用Fast-PLV FST基因疗法的相对影响。通过在左腓肠肌(GAS)肌肉中单次肌内注射5mg/kg或以10mg/kg全身给予小鼠pDNA-CMV-FST FAST-PLV。相对于施用PBS对照的小鼠，肌内施用到左GAS肌肉中导致后肢握力显著增加(图6i)。大体解剖表明，局部FST施用和表达导致相对于对侧非注射GAS的GAS尺寸和重量显著增加(图6j，图6k)，并且如由WGA染色所示，相对于非注射GAS，注射GAS的横截面肌纤维面积显著增加(图6j，图6l)。在全身静脉内施用10mg/kg pDNA-CMV-FST后，测量到后肢握力的显著增加(图6m)。大体解剖显示后肢肌肉大小和GAS重量显著增加(图6n、图6o)。相对于对照动物，GAS的WGA染色显示横截面肌纤维面积显著增加(图6n、图6p)。这些数据表明，局部或全身施用的FAST-PLV可以有效地递送治疗性pDNA有效负载以产生局部或全身效应。
实施例7：通过将铃蟾肽配体融合到P14Endop15嵌合FAST蛋白的羧基末端来开发靶向FAST-pLV制剂。通过将小药物分子卡巴他赛递送至体外前列腺癌细胞和体内肿瘤来测试FAST-铃蟾肽PLV的准确靶向。
虽然FAST-PLV通过增强渗透性和保留(EPR)效应利用被动靶向以优先在肿瘤中累积，但是合成了修饰的FAST蛋白，其掺入额外的靶向部分以增加它们对癌细胞的选择性(67-74)。将框内铃蟾肽肽添加到FAST蛋白的C-末端，并通过AFM与LNP相比表征颗粒(图7a-图7h，图7k)。铃蟾肽是与胃泌素释放肽受体(GRPR)结合的14个氨基酸的肽配体，其已经被验证用于前列腺癌的PET-成像(图7i)(75-78)。FAST-铃蟾肽蛋白在合胞体测定中保留融合活性(图7j)。与正常前列腺组织相比，GRPR表达在大多数前列腺癌细胞中增加，并且在高达57％的骨转移中检测到(79)。通过分析荧光标记的葡聚糖向高表达GRPR的前列腺癌细胞PC3的递送来表征治疗性货物的FAST-PLV递送的铃蟾肽配体定向靶向。使用低表达GRPR细胞系BPH作为比较(图8a、图8b)。添加游离铃蟾肽或GRPG siRNA减少FITC-葡聚糖的递送，表明FAST-铃蟾肽嵌合体能够靶向细胞(图8c)。
体内研究表明，GRSR受体促进了FAST-铃蟾肽在体内对前列腺癌肿瘤的选择性靶向。不含融合铃蟾肽的64Cu标记的FAST-PLV制剂(图9a，左图)和含融合铃蟾肽的64Cu标记的FAST-PLV制剂(图9b，右图)的PC-3肿瘤摄取的正电子发射断层扫描(PET)成像，显示90分钟内信号衰减的标准化摄取值(SUV)(图9a、b)。
化学疗法作为改善存活的癌症治疗的出现已经将注意力集中在对有效预防和控制副作用的需要上。对于前列腺癌，在这种情况下最近的化疗剂是卡巴他赛，当疾病在多西他赛(另一种紫杉烷化疗)之时或之后进展时批准使用(80，81)。卡巴他赛的经验表明，与多西他赛相比，其副作用，特别是中性粒细胞减少并发症、腹泻和疲劳/虚弱更频繁和严重地发生，多西他赛显著限制了其在这种易受伤害的患者群体中的使用(82-85)。
为了解决这一问题，开发了通过将卡巴他赛包封在用铃蟾肽配体靶向的融合相关小跨膜(FAST)蛋白配制的PLV中而具有改善的功效和安全性特征的卡巴他赛制剂。当在PLV中配制时，FAST蛋白催化PLV和展示靶受体的靶细胞的质膜之间的脂质的直接混合。评估了用铃蟾肽肽修饰的FAST-PLV特异性靶向表达高水平胃泌素释放肽受体(GHSR)的癌细胞同时避免正常健康细胞的能力。该实验针对前列腺癌，但也评价了对也过表达GHSR的其它癌症如乳腺癌和胰腺癌的活性(86)。表达并纯化了与靶向GHSR的14残基铃蟾肽肽融合的新FAST蛋白，并优化了掺入该蛋白的FAST-PLV制剂。包封卡巴他赛的FAST-铃蟾肽PLV在配体展示、大小、多分散性和表面特征方面进行表征(图10a)。将FAST蛋白掺入到包封卡巴他赛的基于DOPE的脂质制剂中显著增强化学毒性。
实施例8：使用siRNA靶向C14orf142 Fast-PLV疗法将减少体内ccRCC肿瘤生长和转移。
确定了生产性细胞运动性和体内成功转移性传播所需的一组新的功能基因。该组上的新蛋白质靶标之一编码核蛋白C14orf142，其在转移性透明细胞RCC(cRCC)中上调。最近在GON7鉴定的C14orf142是EKC/KEOPS复合物的组分，其是在以腺嘌呤开始阅读密码子的tRNA中的位置37处的腺苷上形成苏氨酰氨基甲酰基所需的。不受到理论的束缚，GON7可能支持复合物中的催化亚基。为了表征C14orf142对透明细胞RCC血管外渗和体内远端转移的影响，在8周龄雄性免疫缺陷(NSG)小鼠的右侧皮下注射超三倍体肾细胞癌(RCC)细胞(700万786-O RCC细胞)。注射后7天，开始第一轮阴性对照有效负载(乱序)与C14orf142 siRNA处理。剂量为150μg，每周两次，通过尾静脉注射，且研究终点为8周(一旦对照小鼠肿瘤达到1cm3肿瘤体积)。通过静脉内施用途径施用C14orf132siRNA-FAST-PLV减少ccRCC肿瘤生长和转移(图11、图12)。通过FAST-PLV体内评估siRNA(20875)递送至肝脏(图13)。
实施例9。创建嵌合FAST蛋白的大文库。
FAST蛋白家族包含六个结构相似的成员，根据它们的分子量(道尔顿)命名(P10、P13、P14、P15、P16和P22)，但没有保守的序列同一性。所有六种已知的FAST蛋白显示出二分膜拓扑结构，其中单个跨膜结构域将约19-40个残基的最小N-末端胞外结构域连接到较长的C-末端细胞质胞内结构域(46)。
包含在这些结构域内的结构基序以及合胞体形成的速率和程度在家族成员之间显著变化(47)。与特定的TMD结构域特征(40，52)一起，这些基序协同作用以重塑膜并促进膜融合。通过合胞体测定测量的FAST蛋白家族成员的融合活性范围从高(p14)到中高(p15)到低(p10)。
FAST蛋白胞外结构域通常在倒数第二个N-末端甘氨酸上具有肉豆蔻酸酯部分，并且全部含有不同的膜去稳定化融合肽基序。例如，P14含有脯氨酸铰链环，而P15含有II型聚脯氨酸螺旋(48，49)。必需的肉豆蔻酰化(Myr)基序(GxxxS/T)与相邻的14-残基保守区(NFVNHaPgEAIvtGLeK)一起作为融合肽(FP)(残基2-21)起作用，促进快速脂质双层去稳定化和膜合并。
C-末端胞内结构域包含三个功能元件，一个内在无序的胞质尾(87，88)，一个近膜多碱基基序(89)，和一个两亲性α-螺旋(疏水性补片)(87，90)。胞内结构域与促进细胞-细胞膜融合和合胞体形成所需的细胞配偶体(例如，P14中的PPPY基序结合肌动蛋白重塑蛋白)相互作用。
FAST蛋白是模块化的，因为不同的元件或结构域可以执行冗余功能；P15脯氨酸富集区域、P10的棕榈酰化半胱氨酸残基和存在于所有FAST蛋白中的疏水性补片是使膜不稳定的不同结构域。
利用FAST蛋白的模块性质来确定基序的特定组合是否可以组装成具有增强的融合活性的重组FAST蛋白(47)。本发明人集中于P10、P13、P14、P15、P16和P22的所有跨膜、胞内结构域和胞外结构域组合。
p14克隆也用作模板，用于使用巢式引物的顺序PCR以产生p14ecto10和p14endo10，其中p14的胞外结构域或胞内结构域分别被ARV p10的胞外结构域或胞内结构域替换。将p15克隆用作模板，用于使用嵌套引物的顺序PCR以产生p14endo 15，其中p14胞内结构域被p15的胞内结构域替代。在每种情况下，贡献三个结构域中的两个的蛋白质被称为“骨架”。p14蛋白是FAST蛋白家族中唯一的成员，其中已经产生了完整的嵌合文库，其中所有结构域都被ARV p10或p15的结构域单独替换(图14)。为了具有增强的融合活性的新型FAST蛋白质杂合体的工程化，嵌合P14和P15FAST蛋白文库，其中P14的胞外结构域、TMD或胞内结构域被P15的相应结构域取代，并且通过在合胞体形成测定中测量的活性对每种构建体的融合活性进行分级(图15)。
方法
材料
下列脂质购自NOF Co.(Tokyo，日本)：1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)，1，2-二油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODMA)，1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG)。2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)购自AvantiPolar Lipids(Alabaster，美国)。DLin-MC3-DMA(MC3)购自Precision Bio Laboratories(Edmonton，加拿大)。将具有驱动DNA编码的插入物的巨细胞病毒(CMV)启动子、绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(FLuc)的质粒DNA(pDNA)克隆到由Entos Pharmaceuticals(Edmonton，加拿大)生产的P10质粒载体中。这些pDNA制备物由Precision BioLaboratories扩增和纯化。将在甲状腺素运载蛋白(TTR)和CMV启动子下编码促滤泡素抑制素344剪接变体的pDNA克隆到NTC纳米质粒中，并由Nature Technology Company(Lincoln，美国)生产。具有mRNA编码插入物的CleanCap mRNA；单体红色荧光蛋白(mCherry)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和萤火虫荧光素酶(FLuc)购自TriLink Biotechnologies(SanDiego，美国)。Lipofectamine 2000和CyQuant LDH细胞毒性测定购自Thermo FisherScientific(Edmonton，加拿大)。Harris改性苏木精购自Fisher Scientific(Ottawa，加拿大)。曙红Y和刃天青购自Millipore Sigma(Oakville，加拿大)。抗萤火虫荧光素酶抗体(ab181640)和抗GAPDH抗体(ab8245)购自Abcam(Cambridge，United Kingdom)。兔多克隆P14Endo15抗体由New England Peptide(Gardner，美国)使用靶序列Ac-PSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTC-酰胺生产。山羊抗卵泡抑素抗体(AF669)购自R&DSystems(Minneapolis，美国)。磷酸-AKT Ser473(4069)、泛-AKT(2920)、磷酸-mTORSer2448(2971)和mTOR(2972)抗体购自Cell Signaling Technology(Danvers，美国)。
细胞和培养
鹌鹑纤维肉瘤(QM5)细胞在含有3％胎牛血清(FBS；Sigma)和0.5％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific，Edmonton，Canada)的培养基199中培养。人肝细胞癌细胞(Hep3B)、人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)、人肺成纤维细胞(IMR-90和WI-38)、小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)、Vero CCL-81细胞(Cercopithecus aethiops上皮肾细胞)和小鼠成肌细胞(C2C12)购自ATCC(Manassas，VA)，并在含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的高葡萄糖-DMEM中培养。人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)由Ian MacDonald博士(Alberta大学)惠赠，并在含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM/F12中培养。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由Allan Murray博士(University of Alberta)惠赠，并在EGM-2 BulletKit(Lonza，目录号CC-3162)中培养。Sprague-Dawley大鼠原代肝细胞购自Cell Biologics，并在来自CellBiologics的完全肝细胞培养基试剂盒(Cat No.M1365)中培养。原代大鼠星形胶质细胞购自Cell Applications Inc。(San Diego，United States)并在大鼠星形胶质细胞生长培养基(Cat No.R821-500)中培养。将哺乳动物粘附细胞在组织培养物处理的75 75cm2烧瓶(VWR 10062-860)中生长，直到细胞80％汇合或培养基中的营养物在具有5％ CO2的湿润气氛的37℃培养箱(Nuaire NU-5510)中耗尽。将草地夜蛾蛹卵巢组织(SF9)细胞在25℃下逐步培养至2×106-4×106个细胞/ml从25ml至100ml，并最终加入2L Wave生物反应器中。锥虫蓝测定用于检查细胞活力。
FAST蛋白的纯化
裂解Sf9细胞，并通过0.2μm过滤澄清上清液。使用AKTA亲和纯化柱从上清液中纯化FAST蛋白，然后进行透析和阳离子交换纯化(AKTA)。通过SDS-PAGE和western blot对蛋白样品进行质量控制分析；通过合胞体形成测定进行功能验证。
Western印迹
在冰冷的Pierce RIPA缓冲液(Thermo Scientific，Cat.No.89900)中裂解细胞。使用Pierce BCA蛋白测定法(Thermo Scientific，Cat.No.23225)测定蛋白的量。将来自每种裂解物的等量的总蛋白质加载到Mini-PROTEAN 4-20％梯度TGX预制凝胶(Bio-Rad，Cat.No.456-1095)上。将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Cat.No.1620112)上。将膜用荧光Western封闭缓冲液(Rockland，Cat.No.MB-070)在室温下封端1小时。将一抗在封闭缓冲液中1：1000稀释，并在4℃振荡下加入膜过夜。将山羊抗兔Alexa Fluor 680(Thermo Scientific，Cat.No.A27042)、驴抗山羊Alexa Fluor 680(Thermo Scientific，Cat.No.A-21084)或山羊抗小鼠Alexa Fluor 750(Thermo Scientific，Cat.No.A-21084)在封闭缓冲液中1:10 000稀释，并在室温下在黑暗中加入1小时。在Li-Cor Odyssey上观察膜。
合胞体的形成和抑制
将QM5鹌鹑纤维肉瘤细胞以3.5×105的密度接种在含有10％ FBS的培养基199中的12孔簇板中，且培养过夜，然后根据制造商的说明书用Lipofectamine 2000和1μg表达P14、P14endo15或P15的pcDNA 3质粒转染。将细胞在转染后以指定的间隔在HBSS中的3.7％甲醛中固定，并根据制造商的说明书用Hoechst 33342和WGA-Alexa 647染色。在ZeissAxio Observer A1倒置显微镜上在孔(n＝3)内的预定坐标处捕获每种条件的图像(n＝5)。然后用合胞体手动鉴定合胞体，并使用Fiji成像软件定量总核。
脂质制剂
命名为28M、33T、37N和41N的脂质制剂是通过将阳离子脂质(DOTAP)、可电离脂质(DODAP和/或DODMA)、辅助脂质(DOPE)和PEG化脂质(DMG-PEG 2000)以下列脂质摩尔比混合制备的：28M(24：42：30：4)、33T(24：21：21：30：4)、37N(6：60：30：4)和41N(0：66：30：4)。将脂质在37℃水浴中加热1分钟，每次涡旋10秒，然后合并并涡旋10秒。将合并的脂质混合物在旋转蒸发器中以60rpm在真空下脱水2小时，然后用14mL 100％乙醇再水合，并在37℃下超声处理(Branson2510超声波仪)，超声处理设定为60。将脂质制剂分成500μL批次并储存在-20℃。MC3-LNP制剂由摩尔比为50：10：38.5：1.5的DLin-MC3-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-脂质组成(11)。
核酸定量
使用NanoDrop方法，根据制造商的说明书(NanoDrop 2000Spectrophotometer，Thermo Scientific，Edmonton，Canada)，通过260nm和280nm处的吸光度测量核酸浓度和纯度。
FAST-PLV构建
除非另有说明，否则用脂质制剂41N制备FAST-PLV。使用NanoAssemblr台式微流体混合仪器(分别为Precision Nanosystems，Vancouver，BC，NIT0013和NA-1.5-88)来混合有机溶液和水溶液并制备PLV。有机溶液由脂质制剂组成。水溶液由核酸货物、5nM FAST(P14endo15)蛋白和10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.0)组成。台式NanoAssemblr运行方案由12mL/min的总流速和3：1的水相与有机相流速比组成。将PLV在一端夹住的8000MWCO透析管(Biodesign，D102)中透析。将加载的管用5mL双蒸水冲洗，并在环境温度下在500mL透析缓冲液(ENT1844)中在温和搅拌(60rpm)下透析1小时，并用新鲜透析缓冲液重复两次。根据制造商的说明书，使用100kDa超滤器(Amicon，UFC810096)浓缩PLV。PLV通过0.2μm AcrodiscSupor过滤器(Amicon，UFC 910008)过滤除菌。
体外转染
使用血细胞计数器计数细胞，将3,000-5,000个细胞接种到96孔或将20,000-40,000个细胞接种到48孔组织培养物处理的板并放置过夜。将细胞用10-2000ng包封在Fast-PLV、MC3-LNP或Lipofectamine 2000中的pDNA转染96孔板(最终300μL细胞培养基)和用1000ng包封在Fast-PLV、MC3-LNP或Lipofectamine 2000中的pDNA转染48孔板(最终1000μL细胞培养基)。根据制造说明书制备Lipofectamine 2000。适于mRNA的最佳转染时间为24-48小时，而适于pDNA的最佳转染时间为72-96小时。荧光素酶报告基因测定用于测量不同细胞系中fLuc的表达水平。从96孔板中生长的细胞中除去细胞培养基，并用1×PBS洗涤细胞。将50微升报告裂解缓冲液(Promega E397A)的等分试样加入细胞中。将细胞混合并在室温下孵育10-20分钟。将D-荧光素(150μg/mL，GoldBio，LUCK-100)溶解于100mM Tris-HCl(pH7.8)、5mM MgCl2、2mM EDTA、4mM DTT、250μM乙酰-CoA和150μM ATP(129)中。在测量前立即将荧光素底物(100μL)加入每个孔中。使用MARS数据分析软件进行分析，通过FLUOSTAROmega荧光计测量发光。处理表达绿色荧光蛋白(GFP)或mCherry的细胞用于流式细胞术分析。将细胞胰蛋白酶化并重悬于400μL(48孔板的每孔)的FACS缓冲液中，然后转移至5mL流式细胞术管(Sarstedt 75x 12mm PS目录号(Cat.no.)55.1579)中并用BD LSRFortessaX20 SORP分析。除非另有说明，否则在荧光团+群体上呈现的平均荧光强度(MFI)。
PLV特征和包封效率
根据浓度，用0.2μM注射器过滤的PBS缓冲液将由NanoAssemblr Benchtop制备的PLV以1：50至1：20，000稀释两次。按照制造商的说明书，使用Malvern Zetasizer系列和通用“DIP”细胞试剂盒(Malvern，ZEN1002)对最终样品测量大小(或粒度)、多分散指数(PDI)和ζ电位。使用改进的Quant-iT PicoGreen dsDNA测定法计算核酸包封效率，对测定方案进行以下修改(Thermo Fisher Scientific，Edmonton，Canada)。将PLV与TE+Triton(2％)以1：1混合以获得总DNA浓度，或与单独的TE混合以获得未包封的DNA浓度。还将DNA标准品在TE+Triton(2％)中稀释，并将样品在37℃下孵育10分钟，然后用TE+Triton(1％)或单独的TE稀释最后一次，铺板在黑色96孔平底板中，并用FLUOstar Omega读板器(BMG Labtech，415-1147)测量。通过使用以下等式计算包封效率：
包封效率＝[(总DNA浓度-未包封的DNA浓度)/总DNA浓度]x100原子力显微镜
通过原子力显微镜(AFM，Bruker Dimension Edge)评价最终的包封pDNA的Fast-PLV，用于目测验证测量的颗粒大小。将PLV用0.1μm过滤的PBS稀释至0.1μg/mL。将稀释的样品溶液的等分试样(2μL)立即铺展在干净的载玻片上。将样品在环境温度(25℃)下干燥5分钟，并用滤纸除去任何过量的水溶液。将样品再干燥15分钟，然后以1Hz的扫描速度成像。使用TED Pella TAP300悬臂进行敲击模式，所引用的弹簧常数为20-75N/m。由于由AFM的小扫描区域的限制，检查不同区域的2D和3D图像。使用Gwyddion软件，使用高度、相位和振幅模式进行图像分析。
透射电子显微镜
通过透射电子显微镜评估最终的包封pDNA的FAST-PLV。将5μL等分试样的千倍稀释的FAST-PLV置于300目碳涂覆的铜网上1小时以在表面上干燥，然后用0.1μm过滤水洗涤两次。除去过量液体后，使用0.1μm过滤的1％乙酸双氧铀对样品进行负染色。在JEOL JEM-ARM200CF S/TEM电子显微镜中检查干燥的样品。
用Alamar Blue进行活力测定
用指定浓度的测试化合物处理96孔板中的细胞培养物。24-96小时后，将1/10体积的阿尔玛蓝溶液(440μM刃天青；Sigma R70175GM)加入到培养基中的细胞中，并在37℃5％CO2下孵育2-4小时。使用Omega Fluostar(BMG Labtech)读板器测量经处理细胞的荧光(540nm的激发波长和590nm的发射)。使用下式计算细胞活力：
活力＝(处理吸光度-培养基背景吸光度)/(载体吸光度-培养基背景吸光度)
乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定
将Vero细胞接种到96孔板中，并按照制造商的说明书进行CyQuant LDH细胞毒性测定以确定不同脂质制剂的毒性。简言之，将pDNA-Fluc包封在每种脂质制剂(28M、33T、37N和41N)内，并以1.5nM的pDNA浓度添加到细胞中。pDNA添加后24小时，收集50μL细胞培养基用于LDH吸光度。使用以下等式计算细胞毒性：
细胞毒性％＝(脂质处理的LDH活性-载体LDH活性)/(最大LDH活性-载体LDH活性)x100
啮齿动物实验：伦理学和研究设计
所有动物研究均根据加拿大动物护理委员会(CCAC)的指导方针进行，并由阿尔伯塔大学动物护理和使用委员会批准。使用25至35g体重的雄性和雌性C57BL/6(CharlesRiver Laboratories，Saint-Constant，Canada)进行体内研究。在SPF条件下将动物分组圈养在IVC中，温度和湿度恒定，光照以固定的光/暗循环(12小时/12小时)。通过侧尾静脉用200μL测试剂进行静脉内注射。用50μL测试剂在后肢的半腱肌和半膜肌中进行肌内注射。在指定的时间点通过侧尾静脉或心脏穿刺将血液收集到血清收集管(Sarstedt，Montreal，Canada)中。使用BIOSEB握力计(PanLab，目录号(Cat.No.)BSBioGS3BS 76-1066)上的T形棒附件一式五份地测量后肢握力。使用体内成像系统(In Vivo Xtreme，Bruker，Montreal，Canada)计算骨密度(130)。
全身和离体生物发光
在注射FAST-PLV后的指定时间点，给小鼠腹膜内注射0.25ml D-荧光素(PBS中30mg/ml)并使其恢复5分钟。然后将小鼠在通气麻醉室中用含2％异氟烷的氧气麻醉，并在D-荧光素注射后～10分钟用体内成像系统(In Vivo Xtreme，Bruker，Montreal，Canada)成像。所有图像都是用未注射的对照小鼠拍摄的，以用作参考点来确定每个图像的下限阈值。呈现分组实验，其中上限阈值在时间点之间保持一致；然而，基于未注射的对照小鼠在其不再显示任何信号时的信号来设置下限阈值。使用Bruker Molecular Imaging软件进行发光信号的定量。绘制手动ROI以涵盖每只小鼠的整个区域。从来自每只实验小鼠的总和强度中减去来自未注射对照小鼠的总和强度(光子/秒)，以归一化不同的时间点和对照，用于每个图像上的背景信号漂移。对于离体图像，将主要器官与来自未注射的对照小鼠的器官配对。将30mg/mL D-荧光素与上述体外150μg/mL D-荧光素(129)以1：1的比例混合，并在成像前立即加入器官中。包括未注射的对照小鼠器官，每组作为参考点以确定下限阈值。
非人灵长类动物研究
在St.Kitts Biomedical Research Foundation(SKBRF)，St Kitts，West Indies的Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的指导下，由Virscio，Inc.进行所有生命NHP程序。SKBRF研究设施由国际实验动物护理评估和认证协会(AAALACInternational)完全认证。非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)是圣基特岛上的入侵物种，并且在IACUC监督下使用批准的做法在当地采购。在研究期间，将动物圈养在通风良好的室外围封物中。将PLV以2mL/min的速率输注到隐静脉或头静脉中。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下禁食过夜后，通过股静脉或隐静脉静脉切开术收集血液。将血液在室温下转移到没有凝块激活剂的Vacutainer血清收集管(BD Medical，New Jersey，United States)中1小时以允许凝血，然后在4℃以3000rpm离心10分钟。在预定处死时，用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为8mg/kg和1.6mg/kg，IM)使动物镇静，并用戊巴比妥钠(25-30mg/kg IV)安乐死。角膜反射丧失后，用冷冻的肝素化0.9％盐水进行经心脏灌注，并取出脑和脊髓。灌注后，进行大体尸检。记录所有异常发现，收集相关组织并在福尔马林中后固定用于组织病理学。将血清样品送至Antech Diagnostics(Los Angeles，CA)进行临床化学评估。
pDNA在切除组织中的生物分布
成年绿猴(Chlorocebus sabaeus)静脉内输注包封在FAST-PLV中的1mg/kg pDNA，且两天后处死。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen，Toronto，Canada)方案按照制造商的说明书分离DNA。将细胞以300x g离心5分钟，将沉淀重悬于200μl PBS中，加入20μl蛋白酶K和200μl缓冲液AL(不加入乙醇)。将混合物涡旋并在热混合器(Labnet International，Inc，Edison，NJ)中在56℃下温育10分钟。使用对pDNA骨架具有特异性的引物的PCR测定来测量切除的组织中pDNA的水平。使用已知量的pDNA产生标准曲线，并用于定量每个组织中存在的量。
中尺度发现
Meso Scale Discovery QuickPlex SQ 120(MSD，Rockville，MD)按照制造商的说明与小鼠和非人灵长类动物样品一起使用。按照软件方案，用MSD Workbench 4.0软件分析数据。Meso Scale Discovery V-Plex NHP细胞因子24-Plex试剂盒(MSD，Rockville，MD)用于定量测定24种促炎细胞因子的血清浓度，包括IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL12/IL23p40亚基、IL-15、IL-16、IL17A、CXCL1、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、VEGF、IP10、嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-4、MDC、MIP-1α、MIP-1β和TARC。使用Meso Scale DiscoveryV-Plex促炎组1小鼠试剂盒定量测定10种促炎细胞因子的血清浓度：IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、CXCL1(KC/GRO)和TNF-α。
抗药物抗体滴度：P14Endo15和fLuc的间接电化学发光免疫测定(ECLIA)将重组萤火虫荧光素酶蛋白(NBP1-48355，Novus Biologicals，Centennial，United States)或纯化的P14Endo15蛋白以1μg/mL涂覆在标准结合板(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)上，在室温下振荡1小时。将板用PBS中的0.05％Tween-20洗涤三次，然后加入封闭剂A(封闭缓冲液，MSD)。孵育30分钟后，将板用PBS-T再洗涤。在封闭剂A中制备连续稀释的P14Endo15抗体和荧光素酶抗体标准品。将小鼠和非人灵长类动物血清样品在封闭剂A中以1：10 0稀释。将抗体标准品和稀释的小鼠血清样品加载到板上，并在环境温度下振荡孵育1小时。再次用PBS-T洗涤板，然后在标准品(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)中加入1μg/ml Sulfo-Tag抗兔或抗山羊二抗，并在小鼠血清样品(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)中加入1μg/ml Sulfo-Tag抗小鼠二抗。在用PBS-T洗涤后，将读取缓冲液(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)添加到板中，并在Meso QuickPlex SQ 120(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)中读取板。
MicroVue补体C3a、C4d和sC5b-9酶免疫测定
测量NHP血清中补体成分片段如C3a、C4d和sC5b-9的水平，以确定pLV是否激活补体系统(C3、C4和C5)。施用PLV后，在0.5、1.0、1.5和12小时收集血液，并立即提取血清。根据制造商的说明书，使用Quidel MicroVue Complement C3a/C4d/sC5b-9Plus EIA试剂盒(Quidel A032 XUS，San Diego，CA)，使用100μL血清来确定C3a、C4d和sC5b-9的水平，包括高和低对照。在PLV施用之前采集的血清样品用于确定C3a、C4d和sC5b-9的基线水平。根据制造商的说明，使用FLUOstar Omega酶标仪测量样品的光密度。
促滤泡素抑制素ELISA
使用人促滤泡素抑制素ELISA试剂盒(Peprotech，目录号900-K299)定量血清和培养基促滤泡素抑制素水平，所述试剂盒稍作修改以使其适应MSD系统。将捕获FST抗体以1μg/mL涂覆在MSD标准结合板上，在室温下振荡过夜。将板用PBS中的0.05％Tween-20洗涤三次，然后加入封闭剂A(封闭缓冲液，MSD)。孵育1小时后，用PBS-T再洗涤板。在具有10％小鼠血清的封闭剂A中制备连续稀释的卵泡抑素标准品。在封闭剂A中以1：10稀释制备小鼠血清样品。将血清样品和卵泡抑素标准品在4℃振荡孵育过夜。将板用PBS-T再洗涤，并在室温下在振荡下以1μg/mL的浓度加入生物素化的卵泡抑素检测抗体2小时。将板用PBS-T洗涤三次，然后在室温下加入1μg/mL Sulfo-Tag链霉亲和素(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)1小时。将板用PBS-T洗涤三次，然后将读取缓冲液(Meso ScaleDiscovery；MSD，Rockville，United States)添加到板中，然后用Meso QuickPlex SQ 120(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)分析。
人促红细胞生成素(EPO)ELISA
使用Meso Scale Discovery开发的U-Plex Human EPO Assay Kit(Cat.No.K151VXK-2)，按照制造商的说明书，对血清EPO水平进行定量，简言之，在样品和标准给药前，用生物素化的捕获抗体涂覆板，室温下在板上温育样品1小时，然后加入检测抗体1小时。将MSD Gold Read Buffer B(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，UnitedStates)加入板中，然后用MESO QuickPlex SQ 120(Meso Scale Discovery；MSD，Rockville，United States)分析。
组织学：免疫组织化学和H&E染色
收集主要器官，包括心脏、肝、脾、肺和肾，福尔马林固定，且石蜡包埋，产生4-6μm切片。将切片在二甲苯中脱蜡，并使用梯度乙醇至水洗涤再水合。将用于H&E染色的样品在苏木精中染色8分钟，在酸性醇中简单区分，并用Scott自来水(pH 8)发蓝。然后将载玻片在酸化曙红中染色30秒，且脱水，清洁，然后封片。使用全景扫描(3D Histech，Budapest，Hungary)生成全载玻片图像，并由经认证的DVM病理学家(Greenfield PathologyServices，Greenfield，United States)审查以评估器官特异性毒性。通过将再水化的载玻片浸入10mM柠檬酸钠(pH 6)中并加热直至沸腾来进行IHC样品的热诱导抗原修复。将载玻片在含有0.1％Tween-20的TBS中的10％正常兔血清(目录号869019-M，Sigma，Oakville，Canada)和1％牛血清白蛋白(BSA，目录号A9418，Sigma，Oakville，Canada)中在环境温度下封闭1小时。将抗萤火虫荧光素酶抗体在封闭缓冲液中以1：1000稀释，并在载玻片上孵育过夜。用PBS中的3％ H2O2封闭内源性过氧化物酶。将HRP缀合的兔抗山羊二抗(ab97100，Abcam，Cambridge，United Kingdom)在含有0.1％Tween-20的1％ BSA TBS中稀释至1：200，并在环境温度下加入载玻片1小时。将样品用EnVision FLEX DAB+色原(GV82511-2，Agilent Dako，Santa Clara，United States)染色20分钟。通过在H2O中冲洗来终止反应。将载玻片用苏木精复染并脱水、清洁，然后封片。将用于测定肌纤维面积的腓肠肌在O.C.T.化合物(Fisher Scientific，目录号23-730-571)中快速冷冻并使用低温恒温器切片。将10μm切片温热至室温并用3.7％甲醛固定15分钟。用PBS洗涤细胞三次。在室温下用5μg/mL小麦胚芽凝集素Alexa Fluor-488(Thermo Scientific，目录号W11261)覆盖切片10分钟。将细胞用PBS洗涤三次，并使用ProLong Gold抗褪色试剂(Thermo Scientific，目录号P36930)封固。使用EVOS FL倒置显微镜(Advanced Microscopy Group，Bothell，UnitedStates)使切片可视化，并且每个切片拍摄7-15个图像。使用MyoVision软件测定横截面肌纤维面积(131)。
统计分析
当分别比较两组或两组以上时，进行双尾学生t-测试或单因素方差分析(ANOVA)。使用Microsoft Excel和Prism 7.0(GraphPad)进行统计分析。数据表示为平均值±s.d。如果p<0.05，则认为差异是显著的(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，除非另有说明)。
参考文献
1.Roberts TC，Langer R，Wood MJA。寡核苷酸药物传递研究进展。NatureReviews Drug Discovery 2020
2.Thomas CE，Ehrhardt A，Kay MA。Progress and problems with the use ofviral vectors for gene therapy(病毒载体用于基因治疗的进展和问题)。NatureReviews Genetics 2003；4:346-58
3.Ginn SL，Amaya AK，Alexander IE，Edelstein M，Abedi MR。Gene therapyclinical trials worldwide to 2017：an update。The Journal of Gene Medicine2018；20:e3015-e
4.Boutin S，Monteilhet V，Veron P，Leborgne C，Benveniste O，Montus MF等。Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associatedvirus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9in the healthy population:implications forgene therapy using AAV vectors(健康人群中血清IgG和抗腺相关病毒(AAV)1、2、5、6、8和9型的中和因子的流行：使用AAV载体进行基因治疗的意义)。Human gene therapy 2010；21:704-12
5Nayak S,Herzog RW.Progress and prospects:immune responses to viralvectors.Gene therapy 2010；17:295-304
6.Masat E，Pavani G，Mingozzi F.Humoral immunity to AAV vectors in genetherapy：challenges and potential solutions(AAV载体在基因治疗中的体液免疫：挑战和潜在解决方案)。Discovery medicine 2013；15：37 9-89
7.Ferreira V，Twisk J，Kwikkers K，Aronica E，Brisson D，Methot J等，Immuneresponses to intramuscular administration of alipogene tiparvovec(AAV1-LPL(S447X))in a phase II clinical trial of lipoprotein lipase deficiency genetherapy(在脂蛋白脂酶缺乏基因治疗的II期临床试验中肌内给予alipogene tiparvovec(AAV1-LPL(S447X))的免疫应答)。Human gene therapy2014；25:180-8
8.Bessis N，Garciacozar FJ，Boissier MC。Immune responses to genetherapy vectors:influence on vector function and effector mechanisms(基因治疗载体的免疫反应：对载体功能的影响和效应机制)。Gene Therapy 2004；11:S10-S79.Halbert CL，Rutledge EA，Allen JM，Russell DW，Miller AD。Repeat transductionin the mouse lung by using adeno-associated virus vectors with differentserotypes(通过使用具有不同血清型的腺相关病毒载体在小鼠肺中重复转导)。Journalof virology 2000；74:1524-32
10.Priddy FH，Lewis DJM，Gelderblom HC，Hassanin H，Streatfield C，Labranche C，等。Adeno-associated virus vectored immunoprophylaxis to preventHIV in healthy adults：a phase 1randomised controlled trial(腺相关病毒载体免疫预防在健康成人中预防HIV：1期随机对照试验)。The Lancet HIV 2019；6:e230-e9
11.Jayaraman M，Ansell SM，Mui BL，Tam YK，Chen J，Du X等。Maximizing thepotency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo(最大化siRNA脂质纳米颗粒用于体内肝基因沉默的效力)。Angewandte Chemie(Internationaled in English)2012；51:8529-33
12.Miao L，Li L，Huang Y，Delcassian D，Chahal J，Han J，等。Delivery ofmRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy bySTING-mediated immune cell activation(含杂环脂质的mRNA疫苗的递送通过STING介导的免疫细胞活化增加抗肿瘤功效)。Nature Biotechnology2019；37:1174-85
13.Kauffman KJ，Dorkin JR，Yang JH，Heartlein MW，Derosa F，Mir FF等，Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivowith fractional factorial and definitive screening designs(用分数析因和确定筛选设计优化用于体内mRNA递送的脂质纳米颗粒制剂)。Nano Letters 2015；15:7300-6
14.Semple SC，Akinc A，Chen J，Sandhu AP，Mui BL，Cho CK等。Rational designof cationic lipids for siRNA delivery(用于siRNA递送的阳离子脂质的合理设计)。Nature Biotechnology 2010；28:172-6。
15.Gu F，Zhang L，Teply BA，Mann N，Wang A，Radovic-Moreno AF，等。Acombinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAitherapeutics(通过使用自组装的生物整合嵌段共聚物精确工程化靶向纳米颗粒)。Proceedings of the National Academy of Sciences 2008；105:2586LP-91
16.Akinc A,Zumbuehl A,Goldberg M,Leshchiner ES,Busini V,Hossain N,等。A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAitherapeutics(用于递送RNAi治疗剂的脂质样材料的组合文库)。Nature biotechnology2008；26:561-9
17.Sabnis S,Kumarasinghe ES,Salerno T,Mihai C,Ketova T,Senn JJ。等。ANovel Amino Lipid Series for mRNA Delivery:Improved Endosomal Escape andSustained Pharmacology and Safety in Non-human Primates(用于mRNA递送的新型氨基脂质系列：改善的内体逃逸和在非人灵长类动物中的持续药理学和安全性)。Moleculartherapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 2018；26:1509-19
18.Akinc A,Maier MA,Manoharan M,Fitzgerald K,Jayaraman M,Barros S,等。The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containingnucleic acid-based drugs(Onpattro故事与含核酸类药物的纳米药物的临床转化)。Nature Nanotechnology 2019；14:1084-7
19.Wan C,Allen TM,Cullis PR。Lipid nanoparticle delivery systems forsiRNA-based therapeutics(用于基于siRNA的治疗剂的脂质纳米颗粒递送系统)。DrugDelivery and Translational Research 2014；4:74-83
20.Cullis PR,Hope MJ。Lipid Nanoparticle Systems for Enabling GeneTherapies(用于实现基因治疗的脂质纳米颗粒系统)。Molecular Therapy 2017；25:1467-75
21.Reichmuth AM,Oberli MA,Jaklenec A,Langer R,Blankschtein D。mRNAvaccine delivery using lipid nanoparticles(使用脂质纳米颗粒递送mRNA疫苗)。TherDeliv 2016；7:319-34
22.Kulkarni JA,Cullis PR,Van Der Meel R。Lipid nanoparticles enablinggene therapies:from concepts to clinical utility(脂质纳米粒促进基因治疗：从概念到临床应用)。Nucleic acid therapeutics 2018；28:146-57
23.Hassett KJ,Benenato KE,Jacquinet E,Lee A,Woods A,Yuzhakov O等。Optimization of Lipid Nanoparticles for Intramuscular Administration of mRNAVaccines(用于肌肉内施用mRNA疫苗的脂质纳米颗粒的优化)。Molecular Therapy-Nucleic Acids 2019；15:1-11
24.Xue HY,Liu S,Wong HL。Nanotoxicity:a key obstacle to clinicaltranslation of siRNA-based nanomedicine(纳米毒性：基于siRNA的纳米药物临床转化的关键障碍)。Nanomedicine(London,England)2014；9:295-31225.Sedic M,Senn JJ,LynnA,Laska M,Smith M,Platz SJ,等。Safety Evaluation of Lipid Nanoparticle–Formulated Modified mRNA in the Sprague-Dawley Rat and Cynomolgus Monkey(在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中评估脂质纳米颗粒配制的修饰的mRNA)。VeterinaryPathology 2017；55:341-54
26.Zhang J-S,Liu F,Huang L。Implications of pharmacokinetic behaviorof lipoplex for its inflammatory toxicity(脂质复合物的药代动力学行为对其炎症毒性的意义)。Advanced Drug Delivery Reviews 2005；57:689-98
27.Zolnik BS,González-Fernández A,Sadrieh N,Dobrovolskaia MA。Nanoparticles and the immune system(纳米粒子与免疫系统)。Endocrinology 2010；151:458-65
28.Kedmi R,Ben-Arie N,Peer D。The systemic toxicity of positivelycharged lipid nanoparticles and the role of Toll-like receptor 4in immuneactivation(荷正电脂质纳米粒的全身毒性及Toll样受体4在免疫激活中的作用)。Biomaterials 2010；31:6867-75
29.Yanasarn N,Sloat BR,Cui Z。Negatively charged liposomes show potentadjuvant activity when simply admixed with protein antigens(当带负电荷的脂质体简单地与蛋白质抗原混合时，其显示出强的佐剂活性)。Mol Pharm 2011；8:1174-85
30.Peeples L。News feature:Avoiding pitfalls in the pursuit of aCOVID-19(新特征：在获取新冠时要避免误区)。Vaccin Proc Natl Acad Sci 2020；117
31.Inglut CT,Sorrin AJ,Kuruppu T,Vig S,Cicalo J,Ahmad H等。Immunological and Toxicological Considerations for the Design of Liposomes(脂质体设计的免疫学和毒理学考虑)。Nanomaterials(Basel)2020；10
32.Goncalves GAR,Paiva RdMA。Gene therapy:advances,challenges andperspectives(基因治疗：进展、挑战与展望)。Einstein(Sao Paulo,Brazil)2017；15:369-75
33.Szebeni J。Complement activation-related pseudoallergy:A stressreaction in blood triggered by nanomedicines and biologicals(补体激活相关的假性变态反应：纳米药物和生物制剂引发的血液应激反应)。Molecular Immunology 2014；61:163-73
34.Szebeni J,P,Rozsnyay Z,Weiszhár Z,Urbanics R,Rosivall L等。Liposome-induced complement activation and related cardiopulmonary distressin pigs:factors promoting reactogenicity of Doxil and AmBisome(猪脂质体诱导的补体激活和相关的心肺窘迫：促进Doxil和Ambisome反应原性的因素)。Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine 2012；8:176-84
35.White JM,Delos SE,Brecher M,Schornberg K。Structures and mechanismsof viral membrane fusion proteins:multiple variations on a common theme(病毒膜融合蛋白的结构和机制：一个共同主题的多个变异)。.Crit Rev Biochem Mol Biol2008；43:189-219
36.Ciechonska M,Duncan R。Reovirus FAST proteins:virus-encodedcellular fusogens(呼肠孤病毒快速蛋白质：病毒编码的细胞融合蛋白)。Trends inmicrobiology 2014；22:715-24
37.Duncan R。Fusogenic Reoviruses and Their Fusion-Associated SmallTransmembrane(FAST)Proteins(融合性呼肠孤病毒及其融合相关小跨膜(FAST)蛋白)。Annual review of virology 2019；6:341-63
38.Top D,de Antueno R,Salsman J,Corcoran J,Mader J,Hoskin D,等。Liposome reconstitution of a minimal protein-mediated membrane fusion machine(最小蛋白介导的膜融合机的脂质体重构)。The EMBO journal 2005；24:2980-8
39.Clancy EK,Duncan R。Helix-Destabilizing,β-Branched,and PolarResidues in the Baboon Reovirus p15 Transmembrane Domain Influence theModularity of FAST Proteins(狒狒呼肠孤病毒P15跨膜结构域中的螺旋去稳定化、β-分支和极性残基影响FAST蛋白的模块性)。Journal of Virology 2011；85:4707LP-19
40.Clancy EK,Duncan R。Reovirus FAST protein transmembrane domainsfunction in a modular,primary sequence-independent manner to mediate cell-cell membrane fusion(呼肠孤病毒FAST蛋白跨膜结构域以模块化、一级序列非依赖性方式介导细胞-细胞膜融合)。J Virol 2009；83:2941-50
41.Yin H,Kanasty RL,Eltoukhy AA,Vegas AJ,Dorkin JR,Anderson DG。Non-viral vectors for gene-based therapy(用于基于基因的疗法的非病毒载体)。NatureReviews Genetics 2014；15:541-55
42.Waehler R,Russell SJ,Curiel DT。Engineering targeted viral vectorsfor gene therapy(用于基因治疗的靶向病毒载体的工程化)。Nature reviews Genetics2007；8:573-87
43.Baum C,Kustikova O,Modlich U,Li Z,Fehse B。Mutagenesis andOncogenesis by Chromosomal Insertion of Gene Transfer Vectors(通过基因转移载体的染色体插入的诱变和肿瘤发生)。Human Gene Therapy 2006；17:253-63
44.Bahl K,Senn JJ,Yuzhakov O,Bulychev A,Brito LA,Hassett KJ,等。Preclinical and Clinical Demonstration of Immunogenicity by mRNA Vaccinesagainst H10N8 and H7N9 Influenza Viruses(通过针对H10N8和H7N9流感病毒的mRNA疫苗的免疫原性的临床前和临床证明)。Molecular therapy:the journal of the AmericanSociety of Gene Therapy 2017；25:1316-27
45.Ickenstein LM,Garidel P。Lipid-based nanoparticle formulations forsmall molecules and RNA drugs(用于小分子和RNA药物的基于脂质的纳米颗粒制剂)。Expert Opinion on Drug Delivery 2019；16:1205-26
46.Dawe S,Corcoran JA,Clancy EK,Salsman J,Duncan R。Unusualtopological arrangement of structural motifs in the baboon reovirus fusion-associated small transmembrane protein(狒狒呼肠孤病毒融合相关小跨膜蛋白中结构基序的异常拓扑排列)。J Virol 2005；79:6216-26
47.Salsman J,Top D,Boutilier J,Duncan R。Extensive syncytium formationmediated by the reovirus FAST proteins triggers apoptosis-induced membraneinstability(由呼肠孤病毒快速蛋白介导的广泛合胞体形成触发凋亡诱导的膜不稳定性)。J Virol 2005；79:8090-100
48.Corcoran JA,Duncan R。Reptilian Reovirus Utilizes a Small Type IIIProtein with an External Myristylated Amino Terminus To Mediate Cell-CellFusion(爬行动物呼肠孤病毒利用具有外部肉豆蔻酰化氨基末端的III型小蛋白来介导细胞-细胞融合)。Journal of Virology 2004；78:4342
49.Top D,Read JA,Dawe SJ,Syvitski RT,Duncan R。Cell-cell membranefusion induced by p15 fusion-associated small transmembrane(FAST)proteinrequires a novel fusion peptide motif containing a myristoylated polyprolinetype II helix(由P15融合相关小跨膜蛋白(FAST)诱导的细胞-细胞膜融合需要含有肉豆蔻酰化聚脯氨酸II型螺旋的新融合肽基序)。J Biol Chem 2012；287:3403-14
50.Parmar HB,Barry C,Duncan R。Polybasic trafficking signal mediatesgolgi export,ER retention or ER export and retrieval based on membrane-proximity(多元运输信号介导高尔基体输出、ER保留或基于膜接近的ER输出和回收)。PLoSOne 2014；9:e94194
51.Read J,Clancy EK,Sarker M,de Antueno R,Langelaan DN,Parmar HB,等。Reovirus FAST Proteins Drive Pore Formation and Syncytiogenesis Using a NovelHelix-Loop-Helix Fusion-Inducing Lipid Packing Sensor(呼肠孤病毒快速蛋白使用新型螺旋-环-螺旋融合诱导脂质包装传感器驱动孔形成和合胞体发生)。PLoS Pathog2015；11:e1004962
52.Clancy EK,Duncan R。Helix-destabilizing,beta-branched,and polarresidues in the baboon reovirus p15 transmembrane domain influence themodularity of FAST proteins(狒狒呼肠孤病毒P15跨膜结构域中的螺旋去稳定化、β-分支和极性残基影响FAST蛋白的模块性)。J Virol 2011；85:4707-19
53.Belliveau NM,Huft J,Lin PJ,Chen S,Leung AK,Leaver TJ,等。Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for InVivo Delivery of siRNA(用于体内递送siRNA的高效极限尺寸脂质纳米颗粒的微流体合成)。Molecular therapy Nucleic acids 2012；1:e37-e
54.Leung AKK,Tam YYC,Chen S,Hafez IM,Cullis PR。Microfluidic Mixing:AGeneral Method for Encapsulating Macromolecules in Lipid Nanoparticle Systems(微流控混合：在脂质纳米颗粒系统中包封大分子的一般方法)。
The Journal of Physical Chemistry B 2015；119:8698-706
55.Chen D,Love KT,Chen Y,Eltoukhy AA,Kastrup C,Sahay G,等。RapidDiscovery of Potent siRNA-Containing Lipid Nanoparticles Enabled byControlled Microfluidic Formulation(通过受控微流体制剂实现有效的含siRNA的脂质纳米颗粒的快速发现)。Journal of the American Chemical Society 2012；134:6948-51
56.Elsabahy M,Wooley KL。Cytokines as biomarkers of nanoparticleimmunotoxicity(细胞因子作为纳米颗粒免疫毒性的生物标志物)。Chemical Societyreviews 2013；42:5552-76
57.Lv H,Zhang S,Wang B,Cui S,Yan J。Toxicity of cationic lipids andcationic polymers in gene delivery(阳离子脂质和阳离子聚合物在基因递送中的毒性)。Journal of Controlled Release 2006；114:100-9
58.Goswami R,Subramanian G,Silayeva L,Newkirk I,Doctor D,Chawla K,等。Gene Therapy Leaves a Vicious Cycle(基因治疗留下一个恶性循环)。Frontiers inoncology 2019；9:297-
59.Arteta MY,Kjellman T,Bartesaghi S,Wallin S,Wu X,Kvist AJ等。Successful reprogramming of cellular protein production through mRNAdelivered by functionalized lipid nanoparticles(通过由官能化脂质纳米颗粒递送的mRNA成功重编程细胞蛋白质产生)。Proceedings of the National Academy ofSciences 2018；115:E3351-E60
60.Lowenstine LJ。A primer of primate pathology:lesions and nonlesions(灵长类动物病理学入门：病变与非病变)。Toxicologic Pathology 2003；31:92-102
61.Ward KW,Coon DJ,Magiera D,Bhadresa S,Nisbett E,Lawrence MS。Exploration of the African green monkey as a preclinical pharmacokineticmodel:intravenous pharmacokinetic parameters(探索非洲绿猴作为临床前药代动力学模型：静脉内药代动力学参数)。Drug Metab Dispos 2008；36:715-20
62.Lee SJ,McPherron AC。Regulation of myostatin activity and musclegrowth(肌肉生长抑制素活性和肌肉生长的调节)。Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 2001；98:9306-11
63.Mendell JR,Al-Zaidy S,Shell R,Arnold WD,Rodino-Klapac LR,Prior TW,等。Single-Dose Gene-Replacement Therapy for Spinal Muscular Atrophy(单剂量基因替代治疗脊髓性肌萎缩症)。New England Journal of Medicine 2017；377:1713-22
64.Al-Zaidy SA,Sahenk Z,Rodino-Klapac LR,Kaspar B,Mendell JR。Follistatin Gene Therapy Improves Ambulation in Becker Muscular Dystrophy(Follistatin基因治疗可改善Becker型肌营养不良症患者的步行能力)。Journal ofneuromuscular diseases 2015；2:185-92
65.Winbanks CE,Weeks KL,Thomson RE,Sepulveda PV,Beyer C,Qian H,等。Follistatin-mediated skeletal muscle hypertrophy is regulated by Smad3 andmTOR independently of myostatin(卵泡抑素介导的骨骼肌肥大由Smad3和mTOR独立于肌肉生长抑制素调节)。The Journal of cell biology 2012；197:997-1008
66.Hansen JS,Rutti S,Arous C,Clemmesen JO,Secher NH,Drescher A,等。Circulating Follistatin Is Liver-Derived and Regulated by the Glucagon-to-Insulin Ratio(循环卵泡抑素是肝源性的，并由胰高血糖素与胰岛素的比率调节)。TheJournal of Clinical Endocrinology&Metabolism2016；101:550-60
67.Cho CF,Yu L,Nsiama TK,Kadam AN,Raturi A,Shukla S,等。Viralnanoparticles decorated with novel EGFL7 ligands enable intravital imaging oftumor neovasculature(用新型EGFL7配体修饰的病毒纳米颗粒能够实现肿瘤新血管系统的活体成像)。Nanoscale 2017；9:12096-109
68.Wang B,Wu H,Chai C,Lewis J,Pichiorri F,Eisenstat DD,等。MicroRNA-1301suppresses tumor cell migration and invasion by targeting the p53/UBE4Bpathway in multiple human cancer cells(微小RNA-1301通过靶向多种人癌细胞中的p53/UBE4B途径来抑制肿瘤细胞迁移和侵袭)。Cancer Letters 2017；401:20-32
69.Cho CF,Shukla S,Simpson EJ,Steinmetz NF,Luyt LG,Lewis JD。Moleculartargeted viral nanoparticles as tools for imaging cancer(分子靶向病毒纳米颗粒作为癌症成像工具)。Methods Mol Biol 2014；1108:211-30
70.Wang H,Yang Z,Gu J。Therapeutic Targeting of Angiogenesis with aRecombinant CTT Peptideâ “Endostatin Mimicâ “Kringle 5 Protein.2014
71.Perez-Medina C,Abdel-Atti D,Zhang Y,Longo VA,Irwin CP,Binderup T,等。Amodular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescenceimaging of nanoparticle tumor targeting(纳米粒子肿瘤靶向的体内PET和近红外荧光成像的模块化标记策略)。J Nucl Med 2014；55:1706-11
72.Lu C,McFarland MS,Nesbitt RL,Williams AK,Chan S,Gomez-Lemus J,等。Ghrelin receptor as a novel imaging target for prostatic neoplasms Ghrelin(受体作为前列腺肿瘤的新显像靶点)。Prostate 2012；72:825-33
73.Cho C-F,Amadei GA,Breadner D,Luyt LG,Lewis JD。Discovery of NovelIntegrin Ligands from Combinatorial Libraries Using a Multiplex“Beads on aBead”Approach(使用多重“珠上珠”方法从组合文库中发现新的整联蛋白配体)。NanoLetters 2012；12:5957-65
74.Pink DBS,Schulte W,Parseghian MH,Zijlstra A,Lewis JD。Real-timevisualization and quantitation of vascular permeability in vivo:implicationsfor drug delivery(体内血管通透性的实时可视化和定量：药物递送的意义)。PloS one2012；7:e33760-e
75.Mena E,Lindenberg LM,Choyke PL。New targets for PET molecularimaging of prostate cancer(前列腺癌PET分子显像的新靶点)。2019.Elsevier.
76.Mriouah J,Nesbitt RL,Richter S,Wuest M,Pink D,Sosnowski D,等。
Abstract 5143:Fusogenic targeted liposomes:novel nanotherapy forspecific treatment of prostate cancer(摘要5143：融合靶向脂质体：用于前列腺癌特异性治疗的新型纳米疗法)。Cancer Research 2017；77:5143-
77.Steinmetz NF,Ablack AL,Hickey JL,Ablack J,Manocha B,Mymryk JS,等。Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticlestargeted to gastrin-releasing Peptide receptors(使用靶向胃泌素释放肽受体的病毒纳米颗粒对人前列腺癌进行活体成像)。Small 2011；7:1664-72
78.Martin AL,Hickey JL,Ablack AL,Lewis JD,Luyt LG,Gillies ER。Synthesis of bombesin-functionalized iron oxide nanoparticles and theirspecific uptake in prostate cancer cells(蛙皮素功能化氧化铁纳米颗粒的合成及其在前列腺癌细胞中的特异性摄取)。Journal of nanoparticle research:aninterdisciplinary forum for nanoscale science and technology 2009；12:1599-608
79.Ischia J,Patel O,Bolton D,Shulkes A,Baldwin GS。Expression andfunction of gastrin-releasing peptide(GRP)in normal and cancerous urologicaltissues(胃泌素释放肽(GRP)在正常及癌性泌尿系统组织中的表达及功能)。BJUinternational 2014；113:40-7
80.Ross JS,Slodkowska EA,Symmans WF,Pusztai L,Ravdin PM,HortobagyiGN。The HER-2receptor and breast cancer:ten years of targeted anti-HER-2therapy and personalized medicine(HER-2受体与乳腺癌：靶向抗HER-2治疗和个体化医学十年)。Oncologist 2009；14:320-68
81.Heidenreich A,Bastian PJ,Bellmunt J,Bolla M,Joniau S,van der KwastT,等。EAU guidelines on prostate cancer.Part II:Treatment of advanced,relapsing,and castration-resistant prostate cancer(EAU前列腺癌指南第二部分：晚期、复发性和去势难治性前列腺癌的治疗)。Eur Urol 2014；65:467-79
82.Cutumisu M,Vasquez C,Uhlich M,Beatty PH,Hamayeli-Mehrabani H,Djebah R,等。PROSPeCT:A Predictive Research Online System for Prostate CancerTasks(PROSPeCT：前列腺癌任务的预测性研究在线系统)。JCO-CCI 2019:1-12
83.Dinakaran D,Chen H,Wuest M,Wuest F,Murray D,Usmani N,等。6Novel X-RAY Activated Photodynamic(RadioPDT)Nanoparticles for Deep Seated Tumours(6用于深部肿瘤的新型X射线活化光动力(RadioPDT)纳米颗粒)。Radiotherapy and Oncology2019；139:S6
84.Evans SM,Millar JL,Moore CM,Lewis JD,Huland H,Sampurno F,等。Cohortprofile:the TrueNTH Global Registry-an international registry to monitor andimprove localised prostate cancer health outcomes(队列概况：Truenth全球注册中心-一个监测和改善局部前列腺癌健康结果的国际注册中心)。BMJ Open 2017；7:e017006
85.Wang T,Abou-Ouf H,Hegazy SA,Alshalalfa M,Stoletov K,Lewis J等。Ankyrin G expression is associated with androgen receptor stability,invasiveness,and lethal outcome in prostate cancer patients(锚蛋白G表达与前列腺癌患者雄激素受体稳定性、侵袭性和致死结局相关)。Journal of Molecular Medicine2016；94:1411-22
86.Puri A,Kramer-Marek G,Campbell-Massa R,Yavlovich A,Tele SC,Lee SB,et al.HER2-specific affibody-conjugated thermosensitive liposomes(Affisomes)for improved delivery of anticancer agents.J Liposome Res 2008；18:293-307
87.Barry C,Duncan R。Multifaceted sequence-dependent and-independentroles for reovirus FAST protein cytoplasmic tails in fusion pore formationand syncytiogenesis(呼肠孤病毒快速蛋白胞质尾在融合孔形成和合胞体形成中的多面序列依赖性和非依赖性作用)。J Virol 2009；83:12185-95
88.Uversky VN。Intrinsically disordered proteins from A to Z(从A到Z的固有无序蛋白质)。The international journal of biochemistry&cell biology2011；43:1090-103
89.Parmar HB,Barry C,Kai F,Duncan R。Golgi complex–plasma membranetrafficking directed by an autonomous,tribasic Golgi export signal(高尔基复合体-由自主的三基高尔基体输出信号引导的质膜运输)。Molecular Biology of the Cell2014；25:866-78
90.Read J,Clancy EK,Sarker M,de Antueno R,Langelaan DN,Parmar HB等。Reovirus FAST Proteins Drive Pore Formation and Syncytiogenesis Using a NovelHelix-Loop-Helix Fusion-Inducing Lipid Packing Sensor(呼肠孤病毒快速蛋白使用新型螺旋-环-螺旋融合诱导脂质包装传感器驱动孔形成和合胞体发生)。PLOS Pathogens2015；11:e1004962
91.Corcoran JA,Syvitski R,Top D,Epand RM,Epand RF,Jakeman D等。Myristoylation,a protruding loop,and structural plasticity are essentialfeatures of a nonenveloped virus fusion peptide motif(豆蔻酰化、突出环和结构可塑性是无包膜病毒融合肽基序的基本特征)。J Biol Chem 2004；279:51386-94
92.Fitzgerald K,White S,Borodovsky A,Bettencourt BR,Strahs A,ClausenV等。A Highly Durable RNAi Therapeutic Inhibitor of PCSK9(一种PCSK9的高度持久的RNAi治疗性抑制剂)。N Engl J Med 2017；376:41-51
93.Fitzgerald K,White S,Borodovsky A,Bettencourt BR,Strahs A,ClausenV等。A Highly Durable RNAi Therapeutic Inhibitor of PCSK9(一种PCSK9的高度持久的RNAi治疗性抑制剂)。New England Journal of Medicine 2016；376:41-51
94.Nathwani AC,Reiss UM,Tuddenham EGD,Rosales C,Chowdary P,McIntosh J等。Long-Term Safety and Efficacy of Factor IX Gene Therapy in Hemophilia B(IX因子基因治疗血友病B的长期安全性和有效性)。New England Journal of Medicine2014；371:1994-2004
95.Keeler AM,Flotte TR。Recombinant adeno-associated virus genetherapy in light of Luxturna(and Zolgensma and Glybera):where are we,and howdid we get here？(根据Luxturna(和Zolgensma和Glybera)的重组腺相关病毒基因治疗：我们在哪里，以及我们如何到达这里？)Annual review of virology 2019；6:601-21
96.Flotte TR,Schwiebert EM,Zeitlin PL,Carter BJ,Guggino WB。Correlation between DNA transfer and cystic fibrosis airway epithelial cellcorrection after recombinant adeno-associated virus serotype 2gene therapy(重组腺相关病毒血清型2基因治疗后DNA转移与囊性纤维化气道上皮细胞校正的相关性)。Human gene therapy 2005；16:921-8
97.Flotte TR,Zeitlin PL,Reynolds TC,Heald AE,Pedersen P,Beck S等。Phase I Trial of Intranasal and Endobronchial Administration of a RecombinantAdeno-Associated Virus Serotype 2(rAAV2)-CFTR Vector in Adult Cystic FibrosisPatients:A Two-Part Clinical Study(在成人囊性纤维化患者中鼻内和支气管内施用重组腺相关病毒血清型2(rAAV2)-CFTR载体的I期试验：一项两部分临床研究)。Human GeneTherapy 2003；14:1079-88
98.Manno CS,Pierce GF,Arruda VR,Glader B,Ragni M,Rasko JJE等。Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX andlimitations imposed by the host immune response(通过AAV-因子IX成功转导血友病中的肝脏和由宿主免疫应答施加的限制)。Nature Medicine 2006；12:342-7
99.Mingozzi F,Meulenberg JJ,Hui DJ,Basner-Tschakarjan E,Hasbrouck NC,Edmonson SA等。AAV-1–mediated gene transfer to skeletal muscle in humansresults in dose-dependent activation of capsid-specific T cells(AAV-1介导的基因转移至人类骨骼肌导致衣壳特异性T细胞的剂量依赖性活化)。Blood 2009；114:2077-86
100.Ambegia E,Ansell S,Cullis P,Heyes J,Palmer L,MacLachlan I。Stabilized plasmid–lipid particles containing PEG-diacylglycerols exhibitextended circulation lifetimes and tumor selective gene expression(含有PEG-二酰基甘油的稳定的质粒-脂质颗粒表现出延长的循环寿命和肿瘤选择性基因表达)。Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 2005；1669:155-63
101.Ambegia E,Ansell S,Cullis P,Heyes J,Palmer L,MacLachlan I。Stabilized plasmid–lipid particles containing PEG-diacylglycerols exhibitextended circulation lifetimes and tumor selective gene expression(含有PEG-二酰基甘油的稳定的质粒-脂质颗粒表现出延长的循环寿命和肿瘤选择性基因表达)。Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 2005；1669:155-63
102.Paunovska K,Gil CJ,Lokugamage MP,Sago CD,Sato M,Lando GN等。Analyzing 2000in vivo drug delivery data points reveals cholesterol structureimpacts nanoparticle delivery(分析2000个体内药物递送数据点揭示胆固醇结构影响纳米颗粒递送)。ACS nano 2018；12:8341-9
103.Mendell JR,Sahenk Z,Al-Zaidy S,Rodino-Klapac LR,Lowes LP,AlfanoLN等。Follistatin Gene Therapy for Sporadic Inclusion Body Myositis ImprovesFunctional Outcomes(Follistatin基因治疗散发性包涵体肌炎改善功能结局)。Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 2017；25:870-9
104.Kota J,Handy CR,Haidet AM,Montgomery CL,Eagle A,Rodino-Klapac LR等。Follistatin gene delivery enhances muscle growth and strength in nonhumanprimates(卵泡抑素基因递送增强非人灵长类动物的肌肉生长和强度)。Sciencetranslational medicine 2009；1:6ra15-6ra
105.Haidet AM,Rizo L,Handy C,Umapathi P,Eagle A,Shilling C等。Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single geneadministration of myostatin inhibitors(肌生长抑制素抑制剂单基因给药对骨骼肌质量和强度的长期增强)。Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 2008；105:4318-22
106.Mendell JR,Sahenk Z,Malik V,Gomez AM,Flanigan KM,Lowes LP,等。Aphase 1/2a follistatin gene therapy trial for becker muscular dystrophy(Becker型肌营养不良症的1/2a期卵泡抑素基因治疗试验)。Molecular therapy:thejournal of the American Society of Gene Therapy 2015；23:192-201
107.Raper SE,Chirmule N,Lee FS,Wivel NA,Bagg A,Gao G-p等。Fatalsystemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylasedeficient patient following adenoviral gene transfer(腺病毒基因转移后鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷患者的致命性全身炎症反应综合征)。Molecular Genetics and Metabolism2003；80:148-58
108.Wang D,Tai PWL,Gao G。Adeno-associated virus vector as a platformfor gene therapy delivery(腺相关病毒载体作为基因治疗递送的平台)。Naturereviews Drug discovery 2019；18:358-78
109.Chew WL,Tabebordbar M,Cheng JKW,Mali P,Wu EY,Ng AHM等。Amultifunctional AAV–CRISPR–Cas9 and its host response(多功能AAV-CRISPR-Cas9及其宿主应答)。Nature Methods 2016；13:868-74
110.Mali P,Yang L,Esvelt KM,Aach J,Guell M,DiCarlo JE等。RNA-GuidedHuman Genome Engineering via Cas9(经由Cas9的RNA指导的人基因组工程)。Science2013；339:823-6
111.Sander JD,Joung JK。CRISPR-Cas systems for editing,regulating andtargeting genomes(用于编辑、调节和靶向基因组的CRISPR-Cas系统)。NatureBiotechnology 2014；32:347-55
112.Colella P,Ronzitti G,Mingozzi F。Emerging issues in AAV-mediatedin vivo gene therapy(AAV介导的体内基因治疗的新问题)。Molecular Therapy-Methods&Clinical Development 2018；8:87-104
113.Long C,Amoasii L,Mireault AA,McAnally JR,Li H,Sanchez-Ortiz E等。Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mousemodel of muscular dystrophy(出生后基因组编辑部分恢复肌营养不良症小鼠模型中的肌营养不良蛋白表达)。Science 2016；351:400-3
114.Yin H,Song C-Q,Dorkin JR,Zhu LJ,Li Y,Wu Q等。Therapeutic genomeediting by combined viral and non-viral delivery of CRISPR system componentsin vivo(通过CRISPR系统组分在体内的组合病毒和非病毒递送进行治疗性基因组编辑)。Nature Biotechnology 2016；34:328-33
115.Baden LR,El Sahly HM,Essink B,Kotloff K,Frey S,Novak R等。Efficacyand safety of the mRNA-1273SARS-CoV-2vaccine(mRNA-1273SARS-CoV-2疫苗的功效和安全性)。New England Journal of Medicine 2021；384:403-16
116.Wu K,Choi A,Koch M,Ma L,Hill A,Nunna N等。Preliminary Analysis ofSafety and Immunogenicity of a SARS-CoV-2Variant Vaccine Booster(SARS-CoV-2变异疫苗加强免疫安全性和免疫原性的初步分析)。medRxiv 2021:2021.05.05.21256716
117.Sahin U,Muik A,Derhovanessian E,Vogler I,Kranz LM,Vormehr M,等。COVID-19vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses(COVID-19疫苗BNT162B1激发人抗体和Th1T细胞应答)。Nature 2020；586:594-9
118.Corbett KS,Edwards DK,Leist SR,Abiona OM,Boyoglu-Barnum S,Gillespie RA等。SARS-CoV-2mRNA vaccine design enabled by prototype pathogenpreparedness(通过原型病原体准备实现SARS-CoV-2mRNA疫苗设计)。Nature 2020；586:567-71
119.Anderson EJ,Rouphael NG,Widge AT,Jackson LA,Roberts PC,Makhene M等。Safety and Immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA-1273 Vaccine in Older Adults(SARS-CoV-2mRNA-1273疫苗在老年人中的安全性和免疫原性)。New England Journal ofMedicine 2020
120.Jorritsma SHT,Gowans EJ,Grubor-Bauk B,Wijesundara DK。Deliverymethods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines(增加DNA疫苗的细胞摄取和免疫原性的递送方法)。Vaccine 2016；34:5488-94
121.Hannaman D,Dupuy LC,Ellefsen B,Schmaljohn CS。A Phase 1clinicaltrial of a DNA vaccine for Venezuelan equine encephalitis delivered byintramuscular or intradermal electroporation(通过肌内或皮内电穿孔递送的委内瑞拉马脑炎DNA疫苗的1期临床试验)。Vaccine 2016；34:3607-12
122.Houser KV,Yamshchikov GV,Bellamy AR,May J,Enama ME,Sarwar U等。DNAvaccine priming for seasonal influenza vaccine in children and adolescents6to 17years of age:A phase 1randomized clinical trial(6-17岁儿童和青少年季节性流感疫苗的DNA疫苗引发：1期随机临床试验)。PloS one 2018；13:e0206837-e
123.Modjarrad K,Roberts CC,Mills KT,Castellano AR,Paolino K,MuthumaniK等。Safety and immunogenicity of an anti-Middle East respiratory syndromecoronavirus DNA vaccine:a phase 1,open-label,single-arm,dose-escalation trial(抗中东呼吸综合征冠状病毒DNA疫苗的安全性和免疫原性：1期、开放标签、单臂、剂量递增试验)。Lancet Infect Dis 2019；19:1013-22
124.Tebas P,Kraynyak KA,Patel A,Maslow JN,Morrow MP,Sylvester AJ,等。IntradermalEbola GP DNA Vaccine Is Temperature Stable and SafelyDemonstrates Cellular and Humoral Immunogenicity Advantages in HealthyVolunteers(/>埃博拉GP DNA疫苗是温度稳定的，并且在健康志愿者中安全地证明细胞和体液免疫原性优势)。The Journal of Infectious Diseases 2019；220:400-10
125.Pardi N,Hogan MJ,Porter FW,Weissman D。mRNA vaccines—a new era invaccinology(mRNA疫苗-疫苗学的新时代)。Nat Rev Drug Discov 2018；17
126.Basu A,Chakraborty S。Faculty Opinions recommendation of Zikavirus protection by a single low-dose nucleoside-modified mRNA vaccination(教师意见推荐通过单次低剂量核苷修饰的mRNA疫苗接种进行寨卡病毒保护)。FacultyOpinions–Post-Publication Peer Review of the Biomedical Literature:FacultyOpinions Ltd；2017.
127.Jackson LA,Anderson EJ,Rouphael NG,Roberts PC,Makhene M,Coler RN等。An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2—Preliminary Report(一种抗SARS-CoV-2的mRNA疫苗-初步报告)。New England Journal of Medicine 2020
128.Roche JA,Ford-Speelman DL,Ru LW,Densmore AL,Roche R,Reed PW等。Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivogene transfer by electroporation(通过电穿孔进行体内基因转移后骨骼肌的生理和组织学变化)。American journal of physiology Cell physiology2011；301:C1239-C50
129.Oba Y,Ojika M,Inouye S。Firefly luciferase is a bifunctionalenzyme:ATP-dependent monooxygenase and a long chain fatty acyl-CoA synthetase(萤火虫荧光素酶是一种双功能酶：ATP依赖性单加氧酶和长链脂肪酰辅酶A合成酶)。FEBSletters 2003；540:251-4
130.Vizard DL,Wood DO,Papineni RV,Feke GD,Orton SP,McLaughlin WE。Analytical radiography for planar radiographic images implemented with amulti-modal system(用多模态系统实现的平面射线照相图像的分析射线照相术.[中国核科技信息与经济研究院])。Comput Methods Programs Biomed2010；99:88-97
131.Wen Y,Murach KA,Vechetti IJ,Jr.,Fry CS,Vickery C,Peterson CA等。MyoVision:software for automated high-content analysis of skeletal muscleimmunohistochemistry(MyoVision：用于骨骼肌免疫组织化学的自动化高含量分析的软件)。J Appl Physiol(1985)2018；124:40-51。

Claims (63)

1.一种用于将治疗性货物递送至细胞的蛋白脂质囊泡，其包含：
包含一种或多种可电离脂质的脂质纳米颗粒；和
FAST家族蛋白及其嵌合体中的一种或多种；
其中可电离脂质与治疗性货物的摩尔比在2.5：1至20：1之间。
2.根据权利要求1所述的蛋白脂质囊泡，其中所述一种或多种可电离脂质是DLin-KC2-DMA(KC2)、DODMA、DODAP、DOBAQ、DOTMA、18：1EPC、DOTAP、DDAB、18：0EPC、18：0DAP或18：0TAP。
3.根据权利要求2所述的蛋白脂质囊泡，其中所述一种或多种可电离脂质是DODAP和/或DODMA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述FAST蛋白是P10、P13、P14、P15、P16、P22或其嵌合体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述FAST蛋白是P14P15嵌合体、P10/P14嵌合体或P10/P15嵌合体。
6.根据权利要求5所述的蛋白脂质囊泡，其中所述P14P15嵌合体包含P14的胞外结构域和跨膜以及P15的胞内结构域；p14的胞外结构域，p15的跨膜结构域和胞内结构域；或p14的胞外结构域和胞内结构域以及p15的跨膜。
7.根据权利要求6所述的蛋白脂质囊泡，其中所述P14P15嵌合体包含P14的胞外结构域和跨膜以及P15的胞内结构域。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白脂质囊泡，还包含治疗性货物。
9.根据权利要求7所述的蛋白脂质囊泡，其中所述治疗性货物是核酸、多肽或分子。
10.根据权利要求9所述的蛋白脂质囊泡，其中所述核酸是pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA、遗传佐剂、启动子或分子基因编辑工具。
11.根据权利要求9所述的蛋白脂质囊泡，其中所述多肽是肽、表位或抗原分子。
12.根据权利要求9所述的蛋白脂质囊泡，其中所述分子是小药物分子、生物分子、结构大分子或治疗分子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述摩尔比为5：1、7.5：1、10：1或15：1。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODAP、DOPE和DMG-PEG。
15.根据权利要求14所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODMA、DOPE和DMG-PEG。
17.根据权利要求16所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG。
18.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODAP、DODMA、DOPE和DMG-PEG。
19.根据权利要求18所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：21：21：30：4的DOTAP：DODAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG。
20.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含DOTAP、DODAP、DOPE和DMG-PEG。
21.根据权利要求20所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为6：60：30：4或3：63：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG。
22.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含DODAP、DOPE和DMG-PEG。
23.根据权利要求22所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为66：30：4的DODAP：DOPE：DMG-PEG。
24.根据权利要求1-13中任一项所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含DODAP、胆固醇、DOPE和DMG-PEG。
25.根据权利要求24所述的蛋白脂质囊泡，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：24.75：23.75：2、49.5：38.5：10：2或61.7：26.3：19：3的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的蛋白脂质囊泡，还包含附接至FAST蛋白或其嵌合体的C末端的铃蟾肽。
27.一种用于将治疗性货物递送至细胞的组合物，其包含：
权利要求1至26中任一项所述的蛋白脂质囊泡；和
由蛋白脂质载体包封的治疗性货物。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述治疗性货物是核酸、多肽或分子。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述核酸是pDNA、mRNA或siRNA。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至10：1之间。
31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在5：1至10：1之间。
32.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在4：1至7.5：1之间。
33.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：42：30：4的DOTAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至7.5：1之间。
34.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：21：21：30：4的DOTAP：DODAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在3：1至7.5：1之间。
35.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为24：21：21：30：4的DOTAP：DODAP：DODMA：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至7.5：1之间。
36.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为3：63：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在7.5：1至15：1之间。
37.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为3：63：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至12：1之间。
38.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为6：60：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
39.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为6：60：30：4的DOTAP：DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
40.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为66：30：4的DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至20：1之间。
41.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为66：30：4的DODAP：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在5：1至20：1之间。
42.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：24.75：23.75：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
43.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：24.75：23.75：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至15：1之间。
44.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：38.5：10：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
45.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为49.5：38.5：10：2的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至15：1之间。
46.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为61.7：26.3：19：3的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与pDNA的摩尔比在5：1至15：1之间。
47.根据权利要求29所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔百分比为61.7：26.3：19：3的DODAP：胆固醇：DOPE：DMG-PEG，并且可电离脂质与mRNA的摩尔比在2.5：1至15：1之间。
48.根据权利要求29-47中任一项所述的组合物，其中所述治疗性货物是C14orf132siRNA。
49.根据权利要求28至47中任一项所述的组合物用于将治疗性货物递送至宿主细胞的用途。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述治疗性货物是核酸、多肽或分子。
51.根据权利要求50所述的用途，其中所述核酸是pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA、遗传佐剂、启动子或分子基因编辑工具。
52.根据权利要求50所述的用途，其中所述多肽是肽、表位或抗原分子。
53.根据权利要求50所述的用途，其中所述分子是小药物分子、生物分子、结构大分子或治疗分子。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的用途，其中所述宿主细胞是癌细胞、永生化细胞、原代细胞或肌细胞。
55.根据权利要求54所述的用途，其中所述宿主细胞是永生化细胞或原代细胞。
56.根据权利要求48所述的组合物用于治疗转移性癌症的用途。
57.一种将治疗性货物递送至宿主细胞的方法，包括：
将权利要求28至47中任一项所述的组合物施用于细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述治疗性货物是核酸、多肽或分子。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述核酸是pDNA、mRNA、siRNA、miRNA、自扩增mRNA、遗传佐剂、启动子或分子基因编辑工具。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述多肽是肽、表位或抗原分子。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述分子是小药物分子、生物分子、结构大分子或治疗分子。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是癌细胞、永生化细胞、原代细胞或肌细胞。
63.根据权利要求62所述的用途，其中所述宿主细胞是永生化细胞或原代细胞。
CN202180079038.0A 2020-10-01 2021-10-01 用融合相关的小跨膜蛋白配制的蛋白脂质囊泡 Pending CN116685331A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3094859A CA3094859A1 (en) 2020-10-01 2020-10-01 Proteolipid vesicles formulated with fusion associated small transmembrane proteins
CA3,094,859 2020-10-01
PCT/CA2021/051377 WO2022067446A1 (en) 2020-10-01 2021-10-01 Proteolipid vesicles formulated with fusion associated small transmembrane proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116685331A true CN116685331A (zh) 2023-09-01

Family

ID=80929852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180079038.0A Pending CN116685331A (zh) 2020-10-01 2021-10-01 用融合相关的小跨膜蛋白配制的蛋白脂质囊泡

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP4221754A1 (zh)
JP (1) JP2023543623A (zh)
KR (1) KR20230082033A (zh)
CN (1) CN116685331A (zh)
AU (1) AU2021351517A1 (zh)
CA (3) CA3094859A1 (zh)
IL (1) IL301848A (zh)
MX (1) MX2023003774A (zh)
WO (2) WO2022067446A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024050551A2 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Oncosenx, Inc. Compositions and methods for in vivo expression of chimeric antigen receptors
CN117548163B (zh) * 2024-01-11 2024-04-09 杭州联川生物技术股份有限公司 一种微流控芯片

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2325088A1 (en) * 2000-12-01 2002-06-01 Fusogenix Inc. Novel membrane fusion proteins derived from poikilothermic reovirus
JP4688483B2 (ja) * 2004-04-15 2011-05-25 株式会社テクノネットワーク四国 フォリスタチン変異体ポリペプチド
US7915230B2 (en) * 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
CN103038345B (zh) * 2010-04-29 2017-07-21 Ionis制药公司 转甲状腺素蛋白表达的调节
WO2012040825A1 (en) * 2010-09-29 2012-04-05 Innovascreen Inc. Recombinant polypeptides for membrane fusion and uses thereof
HUE039189T2 (hu) * 2013-03-15 2018-12-28 Translate Bio Inc Nukleinsavak bejuttatásának szinergista fokozása kevert kiszerelésekkel
EP3270944B1 (en) * 2015-03-17 2019-10-23 Vrije Universiteit Brussel Optimized liver-specific expression systems for fviii and fix
US20210047619A1 (en) * 2018-03-16 2021-02-18 Immusoft Corporation B cells genetically engineered to secrete follistatin and methods of using the same to treat follistatin-related diseases, conditions, disorders and to enhance muscle growth and strength
JP2022505876A (ja) * 2018-10-26 2022-01-14 フリーイェ・ユニヴェルシテイト・ブリュッセル 遺伝子治療を向上させる新しいツール及びその使用
WO2020160303A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Baxalta Incorporated Gene therapy of hemophilia b using viral vectors encoding recombinant fix variants with increased expression
TW202115126A (zh) * 2019-06-11 2021-04-16 美商舒爾人類基因療法公司 用於治療血漿激肽釋放酶失調所介導之疾病的抗體腺相關病毒載體遞送
JP2023515692A (ja) * 2020-03-04 2023-04-13 ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド 代謝性肝障害の治療のための組成物と方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3233729A1 (en) 2023-04-06
IL301848A (en) 2023-06-01
WO2022067446A1 (en) 2022-04-07
WO2023056070A3 (en) 2023-10-05
CA3094859A1 (en) 2022-04-01
EP4221754A1 (en) 2023-08-09
AU2021351517A1 (en) 2023-05-25
MX2023003774A (es) 2023-06-28
CA3194553A1 (en) 2022-04-07
JP2023543623A (ja) 2023-10-17
AU2021351517A9 (en) 2024-02-08
KR20230082033A (ko) 2023-06-08
WO2023056070A2 (en) 2023-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pilkington et al. From influenza to COVID-19: Lipid nanoparticle mRNA vaccines at the frontiers of infectious diseases
Li et al. The nano delivery systems and applications of mRNA
Ibba et al. Advances in mRNA non-viral delivery approaches
ES2906907T3 (es) Un péptido anfipático
CN113271926A (zh) 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
JP2018537521A (ja) 広域インフルエンザウイルスワクチン
Li et al. Non-viral strategies for delivering genome editing enzymes
CN116685331A (zh) 用融合相关的小跨膜蛋白配制的蛋白脂质囊泡
CN115697298A (zh) 脂质纳米颗粒
Le Saux et al. Interest of extracellular vesicles in regards to lipid nanoparticle based systems for intracellular protein delivery
Karim et al. Scope and challenges of nanoparticle-based mRNA delivery in cancer treatment
US20240108753A1 (en) Nucleic acid delivery
Higuchi et al. Material design for next-generation mRNA vaccines using lipid nanoparticles
Yu et al. The clinical progress and challenges of mRNA vaccines
CN115087437A (zh) 脂质组合物及其用于将治疗活性剂递送至内皮的用途
WO2021030312A1 (en) Methods and compositions for reducing gene or nucleic acid therapy-related immune responses
CN115304756B (zh) 一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
KR20220117133A (ko) 양이온성 분자 수송체 및 SARS-CoV-2 mRNA의 이온 복합체를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 예방 백신 조성물
Wang et al. mRNA therapy for myocardial infarction: A review of targets and delivery vehicles
Wang et al. Innovative translational platforms for rapid developing clinical vaccines against COVID‐19 and other infectious disease
CN117460537A (zh) 核酸递送
Zhang et al. Charge‐Reversed Exosomes for Targeted Gene Delivery to Cartilage for Osteoarthritis Treatment
Wilson Polymeric Nanoparticle Engineering for Delivery of Nucleic Acids
CN116712406A (zh) 一种病毒样纳米粒子核酸药物递送系统、制备方法及应用
Balcorta et al. Nucleic Acid Delivery Nanotechnologies for In Vivo Cell Programming

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination