CN111936617A

CN111936617A - 经遗传工程化以分泌卵泡抑素的b细胞以及使用所述b细胞来治疗卵泡抑素相关的疾病、病况、病症及增强肌肉生长和力量的方法

Info

Publication number: CN111936617A
Application number: CN201980019277.XA
Authority: CN
Inventors: 马修·瑞恩·舒尔茨; 埃里克·J·赫比格; R·斯科特·麦基弗
Original assignee: Yimusovt Co
Current assignee: Yimusovt Co; Immusoft Corp
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2020-11-13
Also published as: US20210047619A1; EP3765601A1; RU2020133851A; JP2021515576A; WO2019178613A1; AU2019233929A1; JP2023138660A; CA3093716A1

Abstract

本发明涉及用于施用经遗传修饰以产生诸如卵泡抑素的治疗剂的自体和/或同种异体B细胞的方法。特别公开了用于施用单个最大有效剂量的经遗传修饰的B细胞和用于施用多剂量的经遗传修饰的B细胞的方法，所述B细胞表达卵泡抑素。本文公开的组合物和方法可用于长期体内递送卵泡抑素。

Description

经遗传工程化以分泌卵泡抑素的B细胞以及使用所述B细胞来治疗卵泡抑素相关的疾病、病况、病症及增强肌肉生长和力量的方法

相关技术的描述

肌营养不良(MD)是进行性遗传的神经肌肉病症，其特征在于肌肉萎缩和肌无力(Emery(2002)The Lancet,359:687-695)。许多形式的肌营养不良是致命的并且目前无法治愈。

杜氏肌营养不良(DMD)是最常见的X-连锁神经肌肉疾病。该疾病是由编码肌养蛋白的DMD基因突变引起的。这种蛋白的改变或缺失导致异常的肌膜撕裂。近端肌肉中肌肉纤维(萎缩性纤维和肥厚性纤维)直径的异常变化和持续的肌肉损伤是该疾病的标志。受损的肌肉释放细胞内酶肌酸激酶(CK)。结果，DMD患者的血清CK水平特征性地高(高达正常的10倍)。病理生理级联由于组织炎症、肌纤维坏死和用纤维脂肪组织替代肌肉而恶化。

DMD基因的另一种等位基因变体引起轻度形式的MD，被称为贝克肌营养不良(BMD)。BMD在临床上类似于DMD，但症状的发作在一生中较晚发生。

已经在MD中尝试了许多药剂，但是没有一种药剂被证明在阻止病程中是有效的。目前的治疗方式仍处于物理医学和康复领域。

许多使用皮质类固醇(例如，强的松和/或其衍生物)的试验已经证明了患有MD的个体的改善，特别是短期的改善。虽然皮质类固醇缓解疾病表型的确切机制尚不清楚，但认为皮质类固醇通过减少炎症、阻抑免疫系统、改善钙稳态、上调代偿性蛋白(compensatoryprotein)的表达和增加成肌细胞增殖而起作用(Khurana等人,(2003)Nat.Rev.DrugDiscovery 2:279-386)。然而，随着时间的推移施用的皮质类固醇可诱导肌肉萎缩，这主要影响近端肌肉，即DMD和BMD中受累的同样的肌肉。皮质类固醇诱导的肌肉和其它副作用可能限制皮质类固醇治疗的长期有效性。

转化生长因子-β(TGF-β)超家族包含共有共同序列元件和结构基序的多种生长因子。已知这些蛋白对脊椎动物和无脊椎动物中的多种细胞类型发挥生物学作用。超家族的成员在胚胎发育期间在模式形成和组织规格中执行重要功能，并且可以影响多种分化过程，包括脂肪生成、肌生成、软骨形成、心脏发生、血细胞生成、神经生成和上皮细胞分化。该家族分为两个一般分支：BMP/GDF和TGF-β/活化素/BMP10分支，它们的成员具有不同的，通常互补的作用。通过操纵TGF-β家族成员的活性，通常可以引起有机体中的显著生理变化。例如，皮埃蒙特牛(Piedmontese)和比利时蓝牛品种携带GDF8(也称为肌骨素)基因的功能丧失突变，这导致肌肉质量的显著增加。Grobet等人,Nat.Genet.1997,17(1):71-4。此外，在人中，GDF8的等位基因失活与增加的肌肉质量以及据报道的异常力量有关。Schuelke等人,N Engl J Med 2004,350:2682-8。此外，经遗传工程化以表达显性阴性活化素受体IIB(ActRIIB)或表达卵泡抑素的小鼠具有异常的肌肉质量(Lee,SJ和McPherron,AC,ProcNatl Acad Sci U S A.2001年7月31日；98(16):9306-11)，并且卵泡抑素在非人灵长类中的过表达增强肌肉生长和力量。Kota J等人,Sci Transl Med.2009年11月11日；1(6)。

因此，需要递送作为TGF-β信号传导的有效调节剂发挥功能的试剂的方法。

当前用于治疗慢性疾病和病症的方法包括治疗剂(如，治疗性多肽)的直接输注，经由病毒载体进行的基因疗法以及干细胞的过继转移(如，造血干细胞转移)。然而，这些方法中的每一种都有缺点。重组治疗性蛋白的注入受蛋白质有限的半寿期的困扰，并且所有这三种方法都提供了治疗剂的次优的组织穿透。诸如经由重组腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体的注入改变内源性组织以产生治疗剂通常导致从集中位置产生治疗剂。从一个位置产生治疗剂增加了产生组织中局部毒性的可能性。另外，由于重组病毒被认为是外来的，因此能够多次施用病毒载体而不会引起不良反应是不可能的，这意味着只有一次注射机会来获得正确剂量的治疗剂。考虑到程序(如使用病毒体内引入核酸至细胞中)中固有的生物变异，在单次注射的限制下获得期望的剂量将非常困难。

因此，在本领域中仍然需要长期治疗与TGF-β信号传导有关的许多慢性疾病和病症。

实施方案的概述

本公开内容总体上涉及用于施用和给药经遗传修饰的B细胞组合物以治疗慢性疾病和病症的组合物和方法。在各种实施方案中，本公开内容提供了用于施用和给药经遗传修饰以表达能够调节TGF-β信号传导的多肽(例如，卵泡抑素多肽)的B细胞的组合物和方法。在一些特定的实施方案中，本公开内容涉及用于施用和给药经遗传修饰以表达卵泡抑素多肽的B细胞的组合物和方法。在某些特定的实施方案中，本公开内容涉及用于施用和给药经遗传修饰以表达具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的卵泡抑素多肽的B细胞的组合物和方法。这种B细胞可用于各种实施方案中，例如，以增加对象(例如，人)的肌肉大小或力量。本公开内容提供了如在详述中描述的这些和其它优点。

在一些实施方案中，本发明提供了包含卵泡抑素基因的重组B细胞。在一些实施方案中，所述卵泡抑素基因与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述卵泡抑素基因是人卵泡抑素基因。在一些实施方案中，所述卵泡抑素基因是人卵泡抑素FST-344剪接位点变体。在一些实施方案中，所述B细胞是人B细胞。在一些实施方案中，已经用所述卵泡抑素基因转导了B细胞。在一些实施方案中，所述B细胞包含所述卵泡抑素基因，因为已经使用睡美人转座子系统用所述卵泡抑素基因转导所述B细胞。在一些实施方案中，所述B细胞由于转导有携带所述卵泡抑素基因的病毒而表达所述卵泡抑素基因。在一些实施方案中，所述B细胞包含所述卵泡抑素基因，因为已经用包含所述卵泡抑素基因的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒转导所述B细胞。在一些实施方案中，使用靶向整合方法将所述B细胞工程化以含有所述卵泡抑素基因。在一些实施方案中，所述靶向整合利用锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和/或CRISPR/Cas系统中的一种或多种，所述CRISPR/Cas系统包括但不限于CRISPR/Cas9系统。在一些实施方案中，通过使用选自以下的方法引入编码卵泡抑素的核酸，将所述B细胞工程化以包含所述卵泡抑素基因：逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺相关病毒载体，腺病毒载体，任何其它RNA或DNA病毒载体，使用化学或物理手段，如脂质转染、聚阳离子络合、电穿孔等引入的编码卵泡抑素的非病毒DNA和/或RNA。在一些实施方案中，所述卵泡抑素基因由所述重组B细胞分泌。在一些实施方案中，所述重组B细胞衍生自获自对象的B细胞或者衍生自获自对象的细胞的B细胞。在一些实施方案中，所述重组B细胞衍生自获自所述对象的B细胞祖细胞。在一些实施方案中，所述重组B细胞衍生自获自所述对象的细胞，所述细胞已经去分化成所述B细胞或B细胞祖细胞。在一些实施方案中，所述重组B细胞通过以下工程化：

(a)从所述对象的血液中收集和分离免疫细胞；

(b)用编码所述卵泡抑素的DNA转导所述细胞；

(c)离体扩增选定的细胞；和

(d)将所述扩增的细胞离体分化为浆细胞和/或浆母细胞。

在一些实施方案中，来自步骤a的分离的免疫细胞是CD19阳性细胞。在一些实施方案中，通过电穿孔进行步骤b中的转导。在一些实施方案中，电穿孔利用所述睡美人转座子系统。在一些实施方案中，所述分化的细胞是CD38(+)和CD20(-)。在一些实施方案中，本发明提供了方法，其包括向对象施用这种重组B细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了将卵泡抑素递送至有需要的对象的方法，其包括施用包含卵泡抑素基因的重组B细胞。在一些实施方案中，本发明提供了将卵泡抑素递送至有需要的对象的方法，其包括向所述对象施用本文公开的表达卵泡抑素多肽的重组B细胞中的任一种。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象患有肌肉病症。在一些实施方案中，所述肌肉病症是肌营养不良。在一些实施方案中，所述肌营养不良选自杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良或面肩肱型肌营养不良。在一些实施方案中，所述肌肉病症是炎性肌肉病症。在一些实施方案中，所述炎性肌肉病症是包涵体肌炎。在一些实施方案中，所述肌肉病症是肌肉损伤或创伤。在一些实施方案中，所述肌肉病症是肌肉废用。在一些实施方案中，在长期卧床休息或肢体固定后发生所述肌肉废用。在一些实施方案中，所述肌肉病症是肌肉萎缩或弱化。在一些实施方案中，所述肌肉萎缩或弱化是由衰老、癌症或慢性疾病引起的。在一些实施方案中，所述肌肉萎缩或弱化是由于肌肉减少症。在一些实施方案中，所述肌肉萎缩或弱化是由于脊髓性肌萎缩(SMA)。在一些实施方案中，所述肌肉萎缩或弱化是由于肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些实施方案中，所述肌肉萎缩或弱化是由于庞贝病。在一些实施方案中，所述对象具有健康的肌肉。在一些实施方案中，向具有健康肌肉的对象施用表达卵泡抑素多肽的B细胞增加了所述对象的肌肉大小或力量。

在一些特定的实施方案中，本公开内容提供了用于治疗肌营养不良的方法，其包括向患有肌营养不良的对象施用表达卵泡抑素多肽的B细胞。在一些实施方案中，所述对象患有贝克肌营养不良。在一些实施方案中，向所述对象施用所述重组B细胞实现了对所述对象的疾病、病症或病况的治疗。在一些实施方案中，向所述对象施用所述重组B细胞实现了肌营养不良的治疗。在一些实施方案中，向所述对象施用所述重组B细胞引起所述对象体重增加。在一些实施方案中，所述对象增加至少约4％的体重。在一些实施方案中，在30天内发生体重的显著增加。在一些实施方案中，在约30天内发生体重的显著增加。在一些实施方案中，向所述对象施用所述重组B细胞引起所述对象获得肌肉。在一些实施方案中，向所述对象施用所述重组B细胞使所述对象变得更强壮。在一些实施方案中，所述重组B细胞的施用导致所述对象的卵泡抑素的血浆水平增加。

在一些实施方案中，本发明提供了通过施用包含卵泡抑素基因的重组B细胞来治疗、预防或改善肌营养不良的方法。在一些实施方案中，治疗、预防或改善肌营养不良的方法包括施用本文公开的重组B细胞中的任一种。在一些实施方案中，所述方法包括向对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中，施用包括在次优单剂量浓度下的两个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中，施用包括三个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞是所述对象自体的。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞是所述对象同种异体的。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38-和CD138-。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138+。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138-。在一些实施方案中，所述施用包括静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射、或肌内注射。在一些实施方案中，所述施用包括静脉内注射。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞在培养后第2天或第3天进行工程化。在一些实施方案中，使用包括电穿孔的方法对所述经遗传修饰的B细胞进行工程化。在一些实施方案中，在工程化后培养的第4天、第5天、第6天、或第7天收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在工程化后培养的第8天或以后收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在工程化后培养的第10天或更早收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，收获的经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子。在一些实施方案中，在确定所述经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子的培养时间点收获所述经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中，在工程化前和工程化后的整个培养期内，使所述经遗传修饰的B细胞在包含IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-31和多聚化的CD40配体中的每一种的培养系统中生长。在一些实施方案中，所述多聚化的CD40配体是使用抗his抗体进行多聚化的HIS标记的CD40配体。在一些实施方案中，所述方法还包括在向所述对象施用之前扩增所述经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中，扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体显示高度的多克隆性。在一些实施方案中，所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.2％以下。在一些实施方案中，所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.05％以下。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞包含编码对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因的多核苷酸。在一些实施方案中，所述对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因含有在氨基酸22处的亮氨酸至酪氨酸的置换突变以及在氨基酸31处的苯丙氨酸至丝氨酸的置换突变。在一些实施方案中，所述方法包括在收获用于施用之前用甲氨蝶呤处理所述经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中，所述甲氨蝶呤处理是100nM至300nM。在一些实施方案中，所述甲氨蝶呤处理是200nM。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞在施用于所述对象后迁移至多种组织。在所述方法的一些实施方案中，向所述对象施用的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至选自以下的一种或多种组织：骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。在所述方法的一些实施方案中，施用于所述对象的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至所述对象的骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。

在一些实施方案中，本发明提供了经转导以表达卵泡抑素基因和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的经修饰的B细胞。

附图简述

图1显示了用表达卵泡抑素的B细胞处理导致小鼠血浆中增加的卵泡抑素水平。从左到右为对照组和处理组中的每一个：柱条分别对应于第21天、第28天和第35天。

图2显示了用表达卵泡抑素的B细胞处理的小鼠中的卵泡抑素的血浆水平与人IgG的水平相关，所述人IgG是移植的替代标志物。图2A-2D显示了用表达卵泡抑素的B细胞处理的四只单独的小鼠中的卵泡抑素的血浆水平。

图3显示了用或未用表达卵泡抑素的B细胞处理的小鼠体重变化百分比。

图4显示了用或未用表达卵泡抑素的B细胞处理的小鼠的力量评估。图4A显示了通过前腿握力测试评估的力量。图4B显示了通过四腿握力测试评估的力量。图4C显示了通过悬挂测试评估的力量。图下方提供的改善百分比显示了与未处理组相比，处理组的平均改善百分比。

图5显示了在表达卵泡抑素的B细胞中的体外卵泡抑素表达。图5A显示了通过ELISA测定的卵泡抑素蛋白表达。图5B显示了通过RT-PCR测定的卵泡抑素mRNA表达。

详述

除非另有明确相反的指示，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的分子生物学、重组DNA技术、蛋白质表达和蛋白质/肽/碳水化合物化学的常规方法，出于示例的目的，这些中的许多在下文被描述。此类技术在文献中有充分的解释。参见，如Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2000)；DNA Cloning:A PracticalApproach,第I&II卷(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑,1984)；Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications(P.Herdewijn编辑,2004)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编辑,1985)；Nucleic AcidHybridization:Modern Applications(Buzdin和Lukyanov编辑,2009)；Transcriptionand Translation(B.Hames&S.Higgins编辑,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编辑,1986)；Freshney,R.I.(2005)Culture of Animal Cells,a Manual of BasicTechnique,第5版Hoboken NJ,John Wiley&Sons；B.Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(第3版,2010)；Farrell,R.,RNA Methodologies:A Laboratory Guidefor Isolation and Characterization(第3版,2005)。以上讨论的公布仅为其在本申请的申请日期之前的公开内容而提供。本文全部都不应被解释为承认本发明无权因为是在先发明而先于此类公开。

定义和缩写

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在说明书和所附权利要求书中所使用的，除非相反地指明，否则以下术语具有所指示的含义。关于本说明书，只要如本文定义的术语定义与所引用的参考文献中针对相同术语给出的定义不同，本文明确定义的定义是该术语的正确定义。

除非特别指出，否则词语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”表示一个或多个/一种或多种。

“约”意指相对于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、尺寸、量、重量或长度，变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、尺寸、量、重量或长度。。在结合术语“约”使用的数值的上下文中讨论的任何实施方案中，特别地考虑到可以省略术语“约”。

“组合物”可包含活性剂和惰性或活性的载体，如，药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在特定的实施方案中，组合物是无菌的，基本上不含内毒素或者在使用的剂量或浓度下对接受者无毒。

除非上下文另外要求，否则在整个本说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”及其变型(如“包含(comprises)””和“包含(comprising)”)应以开放和包容的意义来解释，即“包括但不限于”。

“由……组成”意指包括并且限于短语“由...组成”后所列举的内容。因此，短语“由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其他要素。“基本上由……组成”意指包括在短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中指明的所列要素的活性或作用的的其他要素。因此，词组“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的，并且根据它们是否影响所列要素的活性或作用，其他要素可以存在或可以不存在。

在整个说明书中，提及“生物活性(biological activity)”或“生物活性(bioactivity)”是指由于施用本文考虑的任何化合物、药剂、多肽、缀合物、药物组合物导致的在体外测定或者在细胞、组织、器官或有机体(如，动物、或哺乳动物、或人)中诱导的任何响应。生物活性可以是指激动作用或拮抗作用。生物活性可能是有益的作用；或生物活性可能不是有益的，即毒性。在一些实施方案中，生物活性将是指药物或药物组合物对活的对象(如哺乳动物，如人)的正或负作用。因此，术语“具有生物活性的”意在描述具有如本文所述的生物活性的任何化合物。可以通过技术人员当前已知的任何适当手段来评估生物活性。此类测定可以是定性的或定量的。技术人员将容易理解需要采用不同的测定方法来评估不同多肽的活性；对于普通研究人员而言，这是一项日常工作。此类测定通常在对优化基本没有要求的实验室背景中易于实施，并且通常，可获得使用大多数实验室常用的各种技术为多种多肽提供简单、可靠且可重现的生物活性读数的商业试剂盒。当不可获得此类试剂盒时，普通技术研究人员可以轻松设计和优化针对靶多肽的内部生物活性测定方法，而无需进行过多实验；因为这是科学过程的常规方面。

提及术语“如”旨在意为“如但不限于”，因此应当理解，跟随其后的仅是特定实施方案的实例，而绝不应被解释为是限制性实例。除非另外指出，否则使用“如”旨在明确表示已经考虑了其他实施方案并且其被本发明涵盖。

在整个说明书中，提及“实施方案”或“一个实施方案”或“一实施方案”或“一些实施方案”或“某些实施方案”意指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的不同地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”或“在某些实施方案中”不一定全部指相同的实施方案。此外，具体的特征、结构或特性可以任何适合的方式组合在一个或多个实施方案中。

“增加”或“提高”的量通常是“统计上显著的”量，并且可包括是本文所述的量或水平的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(如100倍、500倍、1000倍)(包括介于之间且大于1的所有整数和小数点，如2.1、2.2、2.3、2.4等)的增加。类似地，“降低”或“减少”或“更少”的量通常是“统计上显著的”量，并且可包括是本文所述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(如，100倍、500倍、1000倍)(包括介于之间且大于1的所有整数和小数点，如1.5、1.6、1.7.1.8等)的减少。

术语“体外”、“离体”和“体内”在本文中旨在具有其常规的科学含义。因此，如，“体外”意指用分离的细胞组分发生的实验或反应，如例如在试管中使用适当的底物、酶、供体和任选的缓冲液/辅因子进行的酶促反应。“离体”意指使用已经从有机体中移出或独立于有机体繁殖的功能性器官或细胞进行的实验或反应。“体内”意指在正常完整状态的活有机体内发生的实验或反应。

“哺乳动物”包括人，并且包括家养动物，如实验室动物和家养宠物(如，猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马和兔)以及非家养动物如野生动物等。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能会发生或可能不会发生，并且该描述包括所述事件或情形发生的情况以及所述事件或情形不发生的情况。

“药物组合物”是指化合物(如治疗上有用的多肽)与本领域普遍接受的用于将所述化合物递送至动物(如，人)的介质的制剂。因此，此类介质可以包括任何药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

“药学上有效的赋形剂”和“药学上有效的载体”是本领域技术人员众所周知的，并且其制备方法对于技术人员也是显而易见的。此类组合物及其制备方法可以见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Company,1995，并入本文)。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”可互换使用。它们是指任意长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任意三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析限定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的任意序列的DNA、分离的任意序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以包含非核苷酸组分。聚合后，可以如通过与标记组分缀合来进一步修饰多核苷酸。

如本文所用的“对象”包括可用本发明的药剂治疗的表现出疾病或症状或者有表现出疾病或症状的风险的任何动物。合适的对象包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物以及家养动物或宠物(如猫或狗)。包括非人的灵长类动物，并且优选人患者。

“基本上”或“大体上”意指足够的或相当大的量、数量、大小；几乎完全或全部；例如，一些给定数量的95％或更高。

“治疗剂”是指当以治疗有效量向对象(如，优选哺乳动物，更优选人)施用时能够实现如以下定义的疾病或病况的治疗的任何化合物。

“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指当施用于对象(如，优选哺乳动物，更优选人)时足以在动物中实现疾病或病况的如以下定义的治疗的本发明化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、病况及其严重程度、施用方式以及待治疗的动物的年龄而变化，但是可以由本领域的普通技术人员考虑到他自己的知识和本公开内容来常规地确定。

如本文所用，“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”涵盖对患有目标疾病或病况的对象、优选人的目标疾病或病况的治疗，并且包括：(i)预防或抑制对象出现该疾病或病况，特别地，当此类对象易患该病况但尚未被诊断为患有该病况时；(ii)抑制疾病或病况，即阻止其发展；(iii)减轻疾病或病况，即引起疾病或病况消退；或(iv)减轻由疾病或病况引起的症状。如本文所用，术语“疾病”、“病症”和“病况”可以互换使用，或可以不同，因为具体的病、损伤或状况可能不具有已知的致病物(使得尚未找出病因)，因此尚未被认为是损伤或疾病，而仅仅被认为是不期望的状况或综合征，其中或多或少的具体症状集已由临床医生鉴定出。

概述

本发明尤其涉及已经通过引入核酸而改变的自体和/或同种异体B细胞来产生卵泡抑素并且还涉及施用经修饰的B细胞的方法(如以治疗疾病、病症或病况，如肌肉病症，如肌营养不良)。在一些实施方案中，术语“经工程化的B细胞”、“经遗传工程化的B细胞”、“经修饰的B细胞”和“经遗传修饰的B细胞”在本文中可互换使用以指代包含一种或多种核酸(如，转基因)以产生卵泡抑素(如，使得能够表达卵泡抑素多肽如治疗性卵泡抑素多肽的转基因)的此类改变的B细胞。具体而言，经修饰的B细胞可以以单剂量或多剂量施用。

因此，用于施用本文所述的经修饰的B细胞组合物的方法可用于长期体内递送和表达卵泡抑素。本公开内容总体上涉及用于获得足够的富集和数量的产生卵泡抑素的细胞以及足够水平的体内卵泡抑素同时确保产物安全性的方法。

如本文所用，短语“长期体内存活”和“长期存活”是指本文所述的经修饰的B细胞在施用后在对象体内存活10天或更多天。长期存活可以以天、周或甚至年测量。在一个实施方案中，大多数经修饰的B细胞在施用后在体内存活10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天或更多天。在一个实施方案中，大多数经修饰的B细胞在施用后在体内存活2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、47周、48周、49周、50周、51周、52周或更多周。在另一个实施方案中，经修饰的B细胞在体内存活1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年或更多年。另外，虽然本文所述的经修饰的B细胞可以在体内存活10天或更多天，但可以理解，大多数经修饰的B细胞在施用后在体内存活1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多天。因此，可以预期本文所述的经修饰的B细胞可用于短期治疗(如，4天)和长期治疗(如，30或更多天)的方法。

B细胞

在离开骨髓后，B细胞充当抗原呈递细胞(APC)并内化抗原。抗原通过受体介导的胞吞作用被B细胞摄取并被加工。抗原被加工成抗原肽，被装载到MHC II分子上，并在B细胞胞外表面上被呈递给CD4+T辅助细胞。这些T细胞结合MHC II/抗原分子并引起B细胞激活。受T细胞刺激后，激活的B细胞开始分化为更特化的细胞。生发中心B细胞可分化成长寿命的记忆B细胞或浆细胞。另外，二级免疫刺激可导致记忆B细胞产生另外的浆细胞。从记忆或非记忆B细胞形成浆细胞之前是形成前体浆母细胞，其最终分化成能产生大量抗体的浆细胞(参见，Trends Immunol.2009年6月；30(6):277-285；Nature Reviews,2005,5:231-242)。浆母细胞分泌的抗体多于B细胞，但少于浆细胞。它们迅速分裂，继续内化抗原并将抗原呈递给T细胞。浆母细胞具有迁移到趋化因子产生部位(如在骨髓中)的能力，由此它们可以分化成长寿命浆细胞。最终，浆母细胞可作为浆母细胞保留几天，然后死亡或不可逆地分化为成熟的完全分化的浆细胞。具体而言，能够归巢至含有浆细胞存活小生境(如，在骨髓中)的组织的浆母细胞能够取代驻留的浆细胞，从而成为长寿命浆细胞，所述长寿命浆细胞可持续多年分泌高水平的蛋白质。

本文所述的方法中使用的B细胞(如，以表达卵泡抑素)包括泛B细胞、记忆B细胞、浆母细胞和/或浆细胞。在一个实施方案中，经修饰的B细胞是记忆B细胞(如，其经修饰以表达卵泡抑素)。在一个实施方案中，经修饰的B细胞是浆母细胞(如，其经修饰以表达卵泡抑素)。在一个实施方案中，经修饰的B细胞是浆细胞(如，其经修饰以表达卵泡抑素)。

终末分化的浆细胞通常不表达常见的泛B细胞标志物如CD19和CD20，并且表达相对较少的表面抗原。浆细胞表达CD38、CD78、CD138和白介素-6受体(IL-6R)，并且缺乏CD45表达，并且这些标志物可用于如通过流式细胞术来鉴定浆细胞。CD27也是浆细胞的良好标志物，这是因为初始B细胞是CD27-，记忆B细胞是CD27+并且浆细胞是CD27++。记忆B细胞亚群也可表达表面IgG、IgM和IgD，而浆细胞不在细胞表面表达这些标志物。CD38和CD138在浆细胞上以高水平表达(参见维基百科(Wikipedia),The Free Encyclopedia.,“Plasmacell”Page Version ID:404969441；最后修订日期：2010年12月30日09:54UTC,2011年1月4日检索；还参见：Jourdan等人Blood.2009年12月10日；114(25):5173-81；TrendsImmunol.2009年6月；30(6):277-285；Nature Reviews,2005,5:231–242；NatureMed.2010,16:123-129；Neuberger,M.S.；Honjo,T.；Alt,Frederick W.(2004).Molecularbiology of B cells.Amsterdam:Elsevier,第189页-第191页；Bertil Glader；Greer,John G.；John Foerster；Rodgers,George G.；Paraskevas,Frixos(2008).Wintrobe'sClinical Hematology,2-Vol.Set.Hagerstwon,MD:Lippincott Williams&Wilkins.第347页；Walport,Mark；Murphy,Kenneth；Janeway,Charles；Travers,Paul J.(2008).Janeway's immunobiology.New York:Garland Science,第387-388页；Rawstron AC(2006年5月).“Immunophenotyping of plasma cells”.Curr Protoc Cytom)。

如本文所用，“静止的”，是指其中细胞未活跃增殖的细胞状态。

如本文所用，“激活的”，是指其中细胞响应于刺激而活跃地增殖和/或产生细胞因子的细胞状态。

如本文所用，术语“分化”和“分化的”，是指细胞表型从一种细胞类型或状态变为另一种细胞类型或状态。例如，转化成浆细胞的记忆B细胞是分化的。

术语“对象”旨在包括可以引起适应性免疫应答的活的有机体(如哺乳动物)。对象的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。在一个实施方案中，对象是人。B细胞可从多种来源获得，包括外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、感染部位的组织、脾脏组织和肿瘤。在优选的实施方案中，B细胞来源是PBMC。在本公开内容的某些实施方案中，可以使用本领域中可获得的许多B细胞系。

在本文所述的方法的某些实施方案中，B细胞可以使用本领域技术人员已知的许多技术，如FICOLL^TM(可以用于制备高密度溶液的蔗糖和表氯醇的共聚物)从收集自对象的血液单位中获得。在一个优选的实施方案中，通过清血法或白细胞分离术获得来自个体的循环血液的细胞。清血法的产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以将通过清血法收集的细胞洗涤以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续的处理步骤。在本文描述的方法的一个实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在替代的实施方案中，洗涤溶液缺乏钙并且可缺乏镁或可缺乏许多(即使不是全部)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的那样，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，如通过根据制造商的说明书使用半自动“流通式”(flow-through)离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器)。洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液如例如PBS中。可选地，可以去除清血法的样品中的不期望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。

可以使用本领域已知的技术从外周血或白细胞分离术分离B细胞。例如，可以使用FICOLL^TM(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)分离PBMC和使用本领域已知的多种抗体中的任一种如Rosette四聚体复合物系统(Rosette tetrameric complex system)(StemCellTechnologies,Vancouver,Canada)或MACS^TMMicroBead Technology(Miltenyi Biotec,SanDiego,CA)通过阴性或阳性选择对CD19+B细胞进行纯化。在某些实施方案中，如Jourdan等人(Blood.2009年12月10日；114(25):5173-81)所述分离记忆B细胞。例如，在使用抗CD2磁珠去除CD2+细胞之后，可以通过FACS对CD19+CD27+记忆B细胞进行分选。骨髓浆细胞(BMPC)可以使用抗CD138磁微珠分选法或其他类似方法和试剂进行纯化。人B细胞可以如使用CD19MicroBeads，人(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)分离。人记忆B细胞可以如使用记忆B细胞分离试剂盒，人(Memory B Cell Isolation Kit,human)(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)分离。

其他分离试剂盒可商购获得，如R&D Systems的MagCellect人B细胞分离试剂盒(Minneapolis,MN)。在某些实施方案中，如在(Defranco等人,(1982)J.Exp.Med.155:1523)中所述，可以通过在不连续的Percoll梯度上沉积来制备静息B细胞。

在一个实施方案中，使用基于梯度的纯化(如，FICOLL^TM)从血液样品中获得PBMC。在另一个实施方案中，从基于清血法的收集获得PBMC。在一个实施方案中，通过分离泛B细胞从PBMC中分离B细胞。分离步骤可利用阳性和/或阴性选择。在一个实施方案中，阴性选择包括使用抗CD3缀合的微珠耗尽T细胞，从而提供T细胞耗尽的级分。在进一步的实施方案中，通过针对CD27的阳性选择从泛B细胞或T细胞耗尽的级分中分离记忆B细胞。

在一个特定的实施方案中，通过耗尽不需要的细胞并随后用CD27 MicroBeads进行阳性选择，来分离记忆B细胞。可以使用针对CD2、CD14、CD16、CD36、CD43和CD235a(血型糖蛋白A)的生物素化抗体和抗生物素微珠的混合物来耗尽不需要的细胞，例如T细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞、粒细胞、血小板和红系细胞。

在一个实施方案中，获得了转换的记忆B细胞。如本文所用的“转换的记忆B细胞”或“转换的B细胞”是指已经进行同种型类别转换的B细胞。在一个实施方案中，针对IgG对转换的记忆B细胞进行阳性选择。在另一个实施方案中，通过耗尽表达IgD和IgM的细胞来获得转换的记忆B细胞。转换的记忆B细胞可以如使用转换的记忆B细胞试剂盒，人(SwitchedMemory B Cell Kit,human)(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)分离。

例如，在一个特定的实施方案中，可以用生物素化的CD2、CD14、CD16、CD36、CD43、CD235a(血型糖蛋白A)、抗IgM和抗IgD抗体的混合物对非靶细胞进行标记。随后可以用抗生物素微珠对这些细胞进行磁性标记。可以通过耗尽磁性标记的细胞来获得高纯度的转换的记忆B细胞。

在进一步的实施方案中，来自记忆B细胞独有的基因的启动子序列，如例如CD27基因(或记忆B细胞所特有但未在初始B细胞中表达的其他基因)用于驱动可选择标志物的表达，如例如允许在甲氨蝶呤存在下对记忆B细胞进行阳性选择的突变的二氢叶酸还原酶。在另一个实施方案中，来自泛B细胞基因如例如CD19基因的启动子序列用于驱动可选择标志物的表达，如例如允许在甲氨蝶呤存在下对记忆B细胞进行阳性选择的突变的二氢叶酸还原酶。在另一个实施方案中，使用CD3或通过添加环孢菌素来耗尽T细胞。在另一个实施方案中，通过阳性选择从泛B细胞中分离CD138+细胞。在又一个实施方案中，通过阳性选择从PBMC中分离CD138+细胞。在另一个实施方案中，通过阳性选择从泛B细胞中分离CD38+细胞。在又一个实施方案中，通过阳性选择从PBMC中分离CD38+细胞。在一个实施方案中，通过阳性选择从PBMC中分离CD27+细胞。在另一个实施方案中，使用本领域可获得的体外培养方法从PBMC选择性地扩增记忆B细胞和/或浆细胞。

体外培养B细胞

B细胞，如记忆B细胞，可以使用体外方法进行培养，以将B细胞激活并分化为浆细胞或浆母细胞或两者。如本领域技术人员将认识到的，可以使用标准的流式细胞术方法通过细胞表面蛋白表达模式来鉴定浆细胞。例如，终末分化的浆细胞表达相对较少的表面抗原，并且不表达常见的泛B细胞标志物如CD19和CD20。相反，可以通过CD38、CD78、CD138和IL-6R的表达和缺乏CD45的表达来鉴定浆细胞。CD27也可用于鉴定浆细胞，这是因为初始B细胞是CD27-，记忆B细胞是CD27+，并且浆细胞是CD27++。浆细胞表达高水平的CD38和CD138。

在一个实施方案中，B细胞是CD138-记忆B细胞。在一个实施方案中，B细胞是CD138+浆细胞。在一个实施方案中，B细胞是激活的并且具有CD138-、CD27+的细胞表面表型。

在一个实施方案中，B细胞是CD20、CD138-记忆B细胞。在一个实施方案中，B细胞是CD20-、CD138+浆细胞。在一个实施方案中，B细胞是激活的并且具有CD20-、CD138-、CD27+的细胞表面表型。

在一个实施方案中，B细胞是CD20-、CD38-、CD138-记忆B细胞。在一个实施方案中，B细胞是CD20-、CD38+、CD138+浆细胞。在一个实施方案中，B细胞是激活的并且具有CD20-CD38-CD138-CD27+的细胞表面表型。

在一个实施方案中，使B细胞与一种或多种B细胞激活因子接触，如已知激活和/或分化B细胞的多种细胞因子、生长因子或细胞系中的任一种(参见如,Fluckiger,等人，Blood 1998 92:4509-4520；Luo,等人,Blood 2009 1 13:1422-1431)。此类因子可选自但不限于以下：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34和IL-35、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-δ、C型趋化因子XCL1和XCL2、C-C型趋化因子(到目前为止包括CCL1-CCL28)和CXC型趋化因子(到目前为止包括CXCL1-CXCL17)和TNF超家族成员(如TNF-α、4-1BB配体、B细胞激活因子(BLyS)、FAS配体、sCD40L(包括多聚体形式的sCD40L；如，与抗聚组氨酸mAb组合的组氨酸标记的可溶重组CD40L以将多个sCD40L分子聚集在一起)、淋巴毒素、OX40L、RANKL、TRAIL)、CpG和其他toll样受体激动剂(如，CpG)。

可以将B细胞激活因子以各种浓度添加到体外细胞培养物中，以实现期望的结果(如，扩增或分化)。在一个实施方案中，B细胞激活因子用于扩增培养的B细胞。在一个实施方案中，B细胞激活因子用于使培养的B细胞分化。在另一个实施方案中，B细胞激活因子用于扩增和分化培养的B细胞。在一个实施方案中，以相同的浓度提供B细胞激活因子以用于扩增和分化。在另一个实施方案中，B细胞激活因子以第一浓度提供以用于扩增并以第二浓度提供以用于分化。考虑B细胞激活因子可以1)用于扩增B细胞但不分化B细胞，2)用于分化B细胞但不扩增B细胞，或3)用于扩增和分化B细胞。

例如，在一些实施方案中，用含有选自CD40L、IL-2、IL-4和IL-10的一种或多种B细胞激活因子的B细胞培养基培养B细胞，以扩增B细胞。在一个实施方案中，在0.25-5.0μg/mlCD40L的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，CD40L的浓度是0.5μg/ml。在一个实施方案中，交联剂(如与HIS标记的CD40L组合的抗HIS抗体)用于产生CD40L的多聚体。在一个实施方案中，使用蛋白多聚化结构域(如，IgG的Fc区或亮氨酸拉链结构域)，将CD40L的分子共价连接或保持在一起。在一个实施方案中，将CD40L与珠粒缀合。在一个实施方案中，CD40L由饲养细胞表达。在一个实施方案中，在1-10ng/ml IL-2的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-2的浓度是5ng/ml。在一个实施方案中，在1-10ng/ml IL-4的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-4的浓度是2ng/ml。在一个实施方案中，在10-100ng/ml IL-10的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-10的浓度是40ng/ml。

在一个实施方案中，用含有选自CD40L、IL-2、IL-4、IL-10、IL-15和IL-21的一种或多种B细胞激活因子的B细胞培养基培养B细胞以扩增B细胞。在一个实施方案中，在0.25-5.0μg/ml CD40L的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，CD40L的浓度是0.5μg/ml。在一个实施方案中，交联剂(如与HIS标记的CD40L组合的抗HIS抗体)用于产生CD40L的多聚体。在一个实施方案中，使用蛋白多聚化结构域(如，IgG的Fc区或亮氨酸拉链结构域)，将CD40L的分子共价连接或保持在一起。在一个实施方案中，将CD40L与珠粒缀合。在一个实施方案中，CD40L由饲养细胞表达。在一个实施方案中，在1-10ng/ml IL-2的情况下培养B细胞。在一个实施方案中，IL-2的浓度是5ng/ml。在一个实施方案中，在1-10ng/ml IL-4的情况下培养B细胞。在一个实施方案中，IL-4的浓度是2ng/ml。在一个实施方案中，在10-100ng/mlIL-10的情况下培养B细胞。在一个实施方案中，IL-10的浓度是40ng/ml。在一个实施方案中，在50-150ng/ml IL-15的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-15的浓度是100ng/ml。在一个实施方案中，在50-150ng/ml IL-21的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-21的浓度是100ng/ml。在一个特定的实施方案中，用含有CD40L、IL-2、IL-4、IL-10、IL-15和IL-21的B细胞培养基培养B细胞以用于扩增B细胞。

例如，在一个实施方案中，用含有B细胞激活因子CD40L、IL-2、IL-4、IL-10、IL-15和IL-21的B细胞培养基培养B细胞以用于扩增B细胞，其中将CD40L与交联剂交联以产生CD40L的多聚体。可以在整个培养期(如7天培养期)期间维持此类培养系统，其中将B细胞转染或以其他方式工程化以表达目标转基因(如，外源多肽如例如FST)。可以将转基因整合到B细胞中(如，经由病毒或非病毒载体)。可以经由使用转座子在B细胞中表达转基因。由于将转基因靶向整合至B细胞的基因组中，转基因可以在B细胞中表达。靶向整合可经由同源重组进行。同源重组可在由核酸酶诱导的双链断裂处发生。核酸酶可以是如锌指核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)、兆核酸酶(如，归巢核酸内切酶)，或经由CRISPR/CAS9核酸酶系统。

在另一个实例中，在一个实施方案中，用含有选自CD40L、IFN-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-15、IL-21和P类CpG寡脱氧核苷酸(p-ODN)的一种或多种B细胞激活因子的B细胞培养基培养B细胞以使B细胞分化。在一个实施方案中，在25-75ng/ml CD40L的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，CD40L的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中，在250-750U/ml IFN-α的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IFN-α的浓度是500U/ml。在一个实施方案中，在5-50U/ml IL-2的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-2的浓度是20U/ml。在一个实施方案中，在25-75ng/ml IL-6的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-6的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中，在10-100ng/ml IL-10的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-10的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中，在1-20ng/ml IL-15的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-15的浓度是10ng/ml。在一个实施方案中，在10-100ng/ml IL-21的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，IL-21的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中，在1-50μg/ml p-ODN的情况下，培养B细胞。在一个实施方案中，p-ODN的浓度是10μg/ml。

在一个实施方案中，使B细胞接触饲养细胞或将B细胞在饲养细胞上培养。在一个实施方案中，饲养细胞是基质细胞系，如鼠基质细胞系S17或MS5。在另一个实施方案中，在表达CD40配体(CD40L，CD154)的成纤维细胞的存在下，在一种或多种B细胞激活因子细胞因子如IL-10和IL-4的情况下，培养分离的CD19+细胞。在一个实施方案中，提供与表面如组织培养板或珠粒结合的CD40L。在另一个实施方案中，在饲养细胞的存在下或不存在下，在CD40L和一种或多种细胞因子或因子的情况下，培养纯化的B细胞，所述细胞因子或因子选自IL-10、IL-4、IL-7、p-ODN、CpG DNA、IL-2、IL-15、IL6和IFN-α。

在另一个实施方案中，B细胞激活因子是通过转染至B细胞或其他饲养细胞中提供的。在该上下文中，可以使用一种或多种促进B细胞分化为抗体分泌细胞的因子和/或一种或多种提高抗体产生细胞寿命的因子。此类因子包括例如Blimp-1、TRF4、抗凋亡因子如Bcl-xl或Bcl5，或者CD40受体的组成型活性突变体。此外，促进下游信号分子分子表达的因子如TNF受体相关因子(TRAF)也可用于B细胞的激活/分化中。在这方面，TNF受体超家族的细胞激活、细胞存活和抗凋亡功能主要由TRAF1-6介导(参见如,R.H.Arch,等人,GenesDev.12(1998),第2821页-第2830页)。TRAF信号传导的下游效应子包括NF-κB和AP-1家族中的转录因子，其可以打开参与细胞和免疫功能各个方面的基因。此外，已显示，NF-κB和AP-1的激活可经由抗凋亡基因的转录提供免于凋亡的细胞保护。

在另一个实施方案中，爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)衍生的蛋白质用于激活和/或分化B细胞或提高抗体产生细胞的寿命。EBV衍生的蛋白质包括但不限于EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2、EBER、miRNA、EBV-EA、EBV-MA、EBV-VCA和EBV-AN。

在某些实施方案中，使用本文提供的方法使B细胞与B细胞激活因子接触尤其导致细胞增殖(即扩增)、将lgM+细胞表面表型调节成与激活的成熟B细胞一致的表型、分泌Ig和同种型转换。可使用已知且可商购获得的细胞分离试剂盒如MiniMACS^TM细胞分离系统(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach,Germany)分离CD19+B细胞。在某些实施方案中，CD40L成纤维细胞在用于本文所述的方法中之前进行辐照。在一个实施方案中，在IL-3、IL-7、Flt3配体、血小板生成素、SCF、IL-2、IL-10、G-CSF和CpG中的一种或多种的存在下培养B细胞。在某些实施方案中，该方法包括在一种或多种上述因子的存在下，与转化的基质细胞(如MS5)一起培养B细胞，从而提供低水平的与板或珠粒结合的锚定CD40L和/或CD40L。

如上所讨论的，B细胞激活因子诱导B细胞的扩增、增殖或分化。因此，使B细胞与上面列出的一种或多种B细胞激活因子接触以获得扩增的细胞群。可以在转染之前扩增细胞群。可选地或另外，可以在转染后扩增细胞群。在一个实施方案中，扩增B细胞群包括用IL-2、IL-4、IL-10和CD40L培养细胞(参见如，Neron等人,PLoS ONE,2012 7(12):e51946)。在一个实施方案中，扩增B细胞群包括用IL-2、IL-10、CpG和CD40L培养细胞。在一个实施方案中，扩增B细胞群包括用IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-21和CD40L培养细胞。在一个实施方案中，扩增B细胞群包括用IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-21和多聚化的CD40L培养细胞。

在另一个实施方案中，B细胞群的扩增由引入B细胞的转基因诱导和/或增强。例如，含有重组受体或经工程化的受体的B细胞在结合其配体(如，可溶性配体或细胞表面表达的配体)后诱导细胞信号传导途径(如，CD40的信号传导下游)。在一个实施方案中，由于CD40转基因的表达导致B细胞过表达CD40。在另一个实施方案中，B细胞表达工程化的受体，包括如重组工程化的抗体。在一个实施方案中，工程化的受体类似于嵌合抗原受体(CAR)并且包含scFv和B细胞受体(如CD40)的细胞内信号传导部分的融合蛋白。

在一个实施方案中，由向细胞培养物中添加的小分子化合物诱导和/或增强B细胞群的扩增。例如，结合CD40并使其二聚体化的化合物可用于触发CD40信号传导途径。

如本领域技术人员所知，多种培养基中的任一种都可以用于本发明的方法中(参见如，Current Protocols in Cell Culture,2000-2009，John Wiley&Sons,Inc.)。在一个实施方案中，用于本文所述的方法中的培养基包括但不限于伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基(含有或不含胎牛或其他适当的血清)。说明性培养基还包括但不限于IMDM、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20。在进一步的实施方案中，培养基可以包含表面活性剂、抗体、人血浆蛋白粉或还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸，2-巯基乙醇)、一种或多种抗生素和/或添加剂如胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和环孢菌素。在一些实施方案中，也可以使用IL-6、可溶性CD40L和交联的增强剂。

将B细胞在一定条件下培养且培养足够的时间段以达到期望的分化和/或激活。在某些实施方案中，将B细胞在一定条件下培养且培养足够时间段，使得10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％的B细胞根据需要分化和/或激活。在一个实施方案中，B细胞被激活并分化成浆母细胞和浆细胞的混合群。如本领域技术人员将认识到的，可以使用如本文中其他地方所述的标准的流式细胞术方法通过细胞表面蛋白质表达模式，如CD38、CD78、IL-6R、CD27^高和CD138中的一种或多种的表达和/或CD19、CD20和CD45中的一种或多种的表达的缺乏或减少来鉴定浆母细胞和浆细胞。如本领域技术人员将认识到的，记忆B细胞通常是CD20+CD19+CD27+CD38-，而早期浆母细胞是CD20-CD19+CD27++CD38++。在一个实施方案中，使用本文所述的方法培养的细胞是CD20-、CD38+、CD138-。在另一个实施方案中，细胞具有CD20-、CD38+、CD138+的表型。在某些实施方案中，将细胞培养1-7天。在进一步的实施方案中，将细胞培养7天、14天、21天或更久。因此，可以将细胞在适当的条件下培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或更多天。将细胞重新涂铺，并可使用本领域已知的技术根据需要添加或更换培养基和补充物。

在某些实施方案中，将B细胞在一定条件下培养且培养足够的时间段，使得至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞分化和激活以产生Ig和/或表达转基因。

可通过诸如³H-尿苷掺入RNA(随着B细胞分化，RNA合成增加)或通过³H-胸苷掺入(其测量与细胞增殖相关的DNA合成)的技术来测量B细胞激活的诱导。在一个实施方案中，可以将白介素-4(IL-4)以适当的浓度(如，约10ng/ml)添加到培养基，以增强B细胞增殖。

可选地，B细胞激活被测量为免疫球蛋白分泌的函数。例如，将CD40L与IL-4(如10ng/ml)和IL-5(如5ng/ml)或其他激活B细胞的细胞因子一起加入静息B细胞。流式细胞术也可用于测量激活的B细胞特有的细胞表面标志物。参见如，Civin CI,Loken MR,Int'lJ.Cell Cloning 987；5:1-16；Loken,MR等人,Flow Cytometry Characterization ofErythroid,Lymphoid and Monomyeloid Lineages in Normal Human Bone Marrow,inFlow Cytometry in Hematology,Laerum OD,Bjerksnes R.编辑,Academic Press,NewYork 1992；第31页–第42页；和LeBein TW等人,Leukemia 1990；4:354-358。

在培养适当的时间段，诸如，例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更多天(通常大约3天)后，可以添加另外体积的培养基。在培养期间的各个时间点收获来自各个培养物的上清液并针对IgM和IgG1对其进行定量，如Noelle等人,(1991)J.Immunol.146:1118-1124中所述。在一个实施方案中，将培养物收获并使用流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT或本领域已知的其他测定针对目标转基因的表达进行测量。

在另一个实施方案中，ELISA用于测量抗体同种型产生，如IgM或目标转基因产物。在某些实施方案中，使用可商购获得的抗体如山羊抗人IgG作为捕获抗体进行IgG确定，然后使用多种适当的检测试剂中的任一种如生物素化的山羊抗人Ig、链霉亲和素碱性磷酸酶和底物进行检测。

在某些实施方案中，将B细胞在一定条件下培养且培养足够的时间段，使得细胞数量比培养开始时的B细胞数量大1倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍或更多倍。在一个实施方案中，细胞数量比培养开始时的B细胞数量大10-1000倍(包括在其中的连续的整数)。例如，扩增的B细胞群比最初分离的B细胞群大至少10倍。在另一个实施方案中，扩增的B细胞群比最初分离的B细胞群大至少100倍。在一个实施方案中，扩增的B细胞群比最初分离的B细胞群大至少500倍。

B细胞的工程化

在各种实施方案中，本公开内容提供了转染、感染或以其他方式将转基因(例如，卵泡抑素转基因)掺入B细胞中的方法，使得所述转基因在B细胞中表达。在一些实施方案中，本文所述的或本领域已知的任何整合方法可用于在B细胞中表达卵泡抑素。

在一个实施方案中，用转基因转染经遗传修饰的B细胞。在特定的实施方案中，所述经遗传修饰的B细胞具有卵泡抑素转基因。

用于转染B细胞的示例性方法提供于WO 2014/152832和WO 2016/100932中，这两者通过引用整体并入本文。B细胞的转染可使用本领域可获得的将DNA或RNA引入B细胞中的多种方法中任一种来实现。合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、压力介导的转染或“细胞挤压”(如，CellSqueeze微流体系统，SQZ Biotechnologies)、使用逆转录病毒或其他病毒如牛痘进行的纳米颗粒介导的或脂质体介导的转染和转导。参见，如,Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,aLaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories；Davis等人,1986,BasicMethods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人,1981,Gene 13:197；US 5,124,259；US 5,297,983；US 5,283,185；US 5,661,018；US6,878,548；US 7,799,555；US 8,551,780；和US 8,633,029。可商购获得的适用于B细胞的电穿孔技术一个实例是Nucleofector^TM转染技术。

转染可在分离的B细胞在上述一种或多种激活和/或分化因子的存在下进行体外培养之前或期间进行。例如，在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天、第30天、第31天、第32天、第33天、第34天、第35天、第36天、第37天、第38天或第39天转染细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第1天、第2天或第3天转染细胞。在一个特定的实施方案中，在第2天转染细胞。例如，在体外培养的第2天对细胞进行电穿孔以用于递送如质粒、转座子、微环或自我复制RNA。在另一个实施方案中，在体外培养的第4天、5天、6天或7天转染细胞。在特定的实施方案中，在体外培养的第6天转染细胞。在另一个实施方案中，在体外培养的第5天转染细胞。

在一个实施方案中，在激活之前，将细胞转染或以其他方式工程化(如，经由卵泡抑素转基因的靶向整合)。在另一个实施方案中，在激活期间，将细胞转染或以其他方式工程化(如，经由卵泡抑素转基因的靶向整合)。在一个实施方案中，在激活之后，将细胞转染或以其他方式工程化(如，经由卵泡抑素转基因的靶向整合)。在一个实施方案中，在分化之前，将细胞转染或以其他方式工程化(如，经由卵泡抑素转基因的靶向整合)。在另一个实施方案中，在分化期间，将细胞转染或以其他方式工程化(如，经由卵泡抑素转基因的靶向整合)。在一个实施方案中，在分化之后，将细胞转染或以其他方式工程化(如，经由卵泡抑素转基因的靶向整合)。

在一个实施方案中，非病毒载体用于将DNA或RNA(如，包含编码卵泡抑素多肽的序列的DNA或RNA)递送至记忆B细胞和/或浆细胞。例如，不需要病毒整合系统即可促进记忆B细胞和/或浆细胞转染的系统包括但不限于转座子(如，睡美人或其他转座子系统，如Piggybac)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)、兆核酸酶、微环、复制子、人工染色体(如，细菌人工染色体、哺乳动物人工染色体和酵母人工染色体)、质粒、粘粒和噬菌体。

在一些实施方案中，此类非病毒依赖性载体系统还可经由本领域已知的或下述病毒载体递送。例如，在一些实施方案中，病毒载体(如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)用于递送一种或多种非病毒载体(如，例如上述锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)、兆核酸酶或能够促进靶向整合的任何其他酶/互补载体、多核苷酸和/或多肽中的一种或多种。因此，在一些实施方案中，细胞(如，B细胞，如记忆B细胞和/或浆细胞)可经由靶向整合方法进行工程化以表达外源序列(如，编码卵泡抑素多肽的序列)。此类方法是本领域已知的，并且可包括在细胞中使用一种或多种核酸酶(如，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas、兆核酸酶)切割内源基因座和向细胞施用卵泡抑素转基因，使得该转基因整合至内源性基因座中并在细胞中表达。可将卵泡抑素转基因包含在供体序列中，将所述供体序列在核酸酶切割位点处或附近整合至宿主细胞的DNA中。

外源序列(如编码卵泡抑素多肽的序列)的整合可经由重组发生。如本领域技术人员所清楚的，“重组”是指两个多核苷酸之间遗传信息交换的过程，包括但不限于通过非同源末端连接(NHEJ)进行的供体捕获和同源重组。该重组可以是同源重组。为了本公开的目的，“同源重组(HR)”是指此类交换的特殊形式，其例如在经由同源定向修复机制修复细胞中的双链断裂期间发生。该过程利用了核苷酸序列的同源性，由此“供体”分子(如，包含此类序列的供体多核苷酸序列或供体载体)被细胞的DNA修复机制用作修复“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)的模板，并且通过这些手段引起遗传信息从供体转移至靶标。在HR定向整合的一些实施方案中，供体分子可含有与基因组同源的至少2个区域(“同源臂”)。在一些实施方案中，同源臂的长度可以为如至少50-100个碱基对。同源臂可以与其中待发生靶向整合的切割位点侧翼的基因组DNA区域具有显著的DNA同源性。供体分子的同源臂可以位于待整合到靶基因组或靶DNA基因座中的DNA(如，包含编码卵泡抑素的DNA)的侧翼。染色体断裂，然后使用质粒DNA的同源区域作为模板进行修复，可能导致侧接有同源臂的插入转基因转移到基因组中。参见，如,Koller等人(1989)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 86(22):8927-8931；Thomas等人(1986)Cell 44(3):419-428。可通过在靶区域附近故意产生双链断裂来将这种类型的同源定向靶向整合的频率增加高达10⁵倍(Hockemeyer等人(2009)NatureBiotech.27(9):851-857；Lombardo等人(2007)Nature Biotech.25(11):1298-1306；Moehle等人(2007)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 104(9):3055-3060；Rouet等人(1994)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 91(13):6064-6068。

根据本公开内容，能够介导基因组基因座靶向切割使得可将转基因(如，卵泡抑素转基因)整合至靶细胞的基因组中(如，通过重组如HR)的任何核酸酶都可以用于工程化细胞(如，记忆B细胞或浆母细胞)。

双链断裂(DSB)或缺口可以通过位点特异性核酸酶如锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应因子结构域核酸酶(TALEN)、兆核酸酶，或使用CRISPR/Cas9系统用经工程化的crRNA/tractRNA(单导向RNA)指导特异性切割来产生。参见，例如，Burgess(2013)Nature ReviewsGenetics 14:80-81,Urnov等人(2010)Nature 435(7042):646-51；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20090263900；20090117617；20100047805；20110207221；20110301073和国际公开WO 2007/014275，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入。

在一些实施方案中，细胞(如记忆B细胞或浆母细胞)经由锌指核酸酶介导的供体构建体(如，卵泡抑素供体构建体)的靶向整合来工程化。锌指核酸酶(ZFN)是由于通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的“锌指DNA结合蛋白”(ZFP)(或结合结构域)与核酸酶的偶联而引起的能够特异性识别并切割靶核苷酸序列的酶。ZFN可以包含与ZFP DNA结合结构域可操作地连接的任何合适的切割结构域(如，核酸酶)以形成可促进靶DNA序列的位点特异性切割的经工程化的ZFN(参见，如,Kim等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA93(3):1156-1160)。例如，ZFN可以包含与FOK1酶或FOK1酶的一部分连接的靶标特异性ZFP。在一些实施方案中，在ZFN介导的靶向整合方法中使用的ZFN利用两个独立的分子，每个分子都包含各自结合ZFP的FOK1酶的亚基，每个ZFP对靶切割位点侧翼的DNA序列具有特异性，并且当两个ZFP结合它们相应的靶DNA位点时，使FOK1酶亚基彼此接近并且结合在一起，从而激活切割靶切割位点的核酸酶活性。ZFN已经在多种有机体中用于基因组修饰(例如，美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；以及国际公开WO 07/014,275，其通过引用整体并入本文)。定制的ZFP和ZFN可以从如SigmaAldrich(St.Louis,MO)商购获得，并且使用这种定制的ZFN可以常规地靶向和切割DNA的任何位置。

在一些实施方案中，细胞(例如，记忆B细胞或浆母细胞)经由CRISPR/Cas(如，CRISPR Cas9)核酸酶介导的供体构建体(如，卵泡抑素供体构建体)的整合而工程化。CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)/Cas(CRISPR相关的)核酸酶系统是可用于基因组工程的基于细菌系统的经工程化的核酸酶系统。它基于许多细菌和古细菌的适应性免疫应答的一部分。当病毒或质粒入侵细菌时，入侵者的DNA区段通过“免疫”应答转化为CRISPR RNA(crRNA)。该crRNA然后通过部分互补区域与称为tracrRNA的另一类型的RNA缔合，以将Cas9核酸酶引导至与靶DNA中crRNA同源的区域(称为“前间隔序列(protospacer)”)。Cas9切割DNA，以在crRNA转录物内包含的20个核苷酸指导序列指定的位点处的DSB处产生平末端。Cas9需要crRNA和tracrRNA两者用于位点特异性DNA识别和切割。该系统现在已经被工程化使得crRNA和tracrRNA可以组合成一个分子(“单导向RNA”)，并且可以将单导向RNA的crRNA等效部分进行工程化以引导Cas9核酸酶靶向任何期望的序列(参见Jinek等人(2012)Science 337,第816-821页，Jinek等人,(2013),eLife 2:e00471，和David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。因此，CRISPR/Cas系统可经工程化以在基因组的期望靶标处产生DSB，并且可通过使用修复抑制剂引起易错修复增加来影响DSB的修复。如技术人员将清楚的，除Cas9外，其他CRISPR核酸酶也是已知的并且适用于本发明。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas核酸酶介导的整合利用了II型CRISPR。II型CRISPR是最充分表征的系统之一，并且按四个连续步骤进行靶向DNA双链断裂。第一，从CRISPR基因座转录两种非编码RNA，即前crRNA阵列和tracrRNA。第二，tracrRNA与前crRNA的重复区域杂交，并介导前crRNA加工成含有单个间隔子序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA:tracrRNA复合物经由crRNA上的间隔子和与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的靶DNA上的前间隔序列之间的沃森-克里克碱基配对将Cas9引导至靶DNA(靶标识别的另外的要求)。第四，Cas9介导靶DNA的切割，以在前间隔序列内产生双链断裂。

Cas9相关的CRISPR/Cas系统包含两种RNA非编码组分：tracrRNA和前crRNA阵列，其含有通过相同的直接重复(DR)间隔的核酸酶引导序列(间隔子)。为了使用CRISPR/Cas系统完成基因组工程，这些RNA的两种功能都必须存在(参见Cong等人,(2013)Sciencexpress1/10.1126/science 1231143)。在一些实施方案中，tracrRNA和前crRNA是经由单独的表达构建体或作为单独的RNA提供的。在其他实施方案中，构建嵌合RNA，其中将经工程化的成熟crRNA(赋予靶标特异性)与tracrRNA(提供与Cas9的相互作用)融合以产生嵌合cr-RNA-tracrRNA杂合物(也称为单导向RNA)。(参见Jinek同上和Cong同上)。

在一些实施方案中，可以将含有crRNA和tracrRNA的单导向RNA进行工程化，以引导Cas9核酸酶靶向任何期望的序列(如,Jinek等人,(2012)Science 337,第816页-第821页，Jinek等人,(2013),eLife 2:e00471,David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。因此，可以对CRISPR/Cas系统进行工程化，以在基因组的期望靶标处产生DSB。

定制的CRISPR/Cas系统可以从如Dharmacon(Lafayette,CO)商购获得，并且可以使用此类定制的单导向RNA序列常规地靶向和切割DNA的任何位置。用于重组的单链DNA模板可以被合成(如，经由本领域已知的和可商购获得的寡核苷酸合成方法)，或者被提供在载体如诸如AAV的病毒载体中。

在一些实施方案中，细胞(如，记忆B细胞或浆母细胞)经由TALE核酸酶(TALEN)介导的供体构建体(如，卵泡抑素供体构建体)的靶向整合来工程化。“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单个“重复单元”(也被称为“重复”)的长度通常为33-35个氨基酸，并且表现出与天然存在的TALE蛋白质内的其他TALE重复序列的至少一些序列同源性。TAL效应子可含有核定位序列、酸性转录激活结构域和串联重复的集中结构域，其中每个重复含有约34个氨基酸，这些氨基酸对于这些蛋白质的DNA结合特异性是关键的。(如，Schornack S,等人(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272)。TAL效应子取决于在串联重复中发现的包含约102bp的序列，并且所述重复通常彼此91-100％同源(如，Bonas等人,(1989)MoI GenGenet218:127-136)。这些DNA结合重复可以被工程化为具有新的重复组合和数量的蛋白质，以制备能够与新序列相互作用并激活非内源性报道基因表达的人工转录因子(如，Bonas等人,(1989)Mol Gen Genet 218：127-136)。经工程化的TAL蛋白质可与FokI切割半结构域连接，以产生TAL效应子结构域核酸酶融合(TALEN)以切割靶标特异性DNA序列(如，Christian等人,(2010)Genetics epub10.1534/genetics.110.120717)。

定制的TALEN可以从如Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)商购获得，并且可以常规地靶向和切割DNA的任何位置。

在一些实施方案中，细胞(如记忆B细胞或浆母细胞)经由兆核酸酶介导的供体构建体(如卵泡抑素供体构建体)的靶向整合来工程化。兆核酸酶(或“归巢核酸内切酶”)是在大于12个碱基对的识别序列处结合并切割双链DNA的核酸内切酶。天然存在的兆核酸酶可以是单体的(如I-SceI)或二聚体的(如I-CreI)。天然存在的兆核酸酶识别15-40个碱基对切割位点，并且通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还参见美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82:115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs目录。术语“兆核酸酶”包括单体兆核酸酶、二聚体兆核酸酶和缔合以形成二聚体兆核酸酶的单体。

在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物利用包括经工程化的(非天然存在的)归巢核酸内切酶(兆核酸酶)的核酸酶。归巢核酸内切酶和兆核酸酶如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII的识别序列是已知的。还参见美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人(1989)Gene82:115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs目录。此外，归巢核酸内切酶和兆核酸酶的DNA结合特异性可经工程化以结合非天然靶位点。参见，例如，Chevalier等人(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962；Ashworth等人(2006)Nature441:656-659；Paques等人(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公布号20070117128。归巢核酸内切酶和兆核酸酶的DNA结合结构域可在核酸酶作为一个整体的背景下改变(即，使得核酸酶包括同源切割结构域)或可与异源切割结构域融合。定制的兆核酸酶可从如New England Biolabs(Ipswich,MA)商购获得，并且可以常规地靶向和切割DNA的任何位置。

B细胞的工程化可以包括如经由一种或多种编码核酸酶的载体将一种或多种核酸酶(如，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas、兆核酸酶)施用于B细胞，使得B细胞摄取了包含编码的核酸酶的载体。载体可以是病毒载体。

在一些实施方案中，核酸酶在细胞(如，记忆B细胞或浆细胞)中切割特定的内源基因座(如安全港基因(safe harbor gene)或目标基因座)，并且施用一条或多条外源(供体)序列(如，转基因)(如包含这些外源序列的一种或多种载体)。在这样的实施方案中，供体序列可以编码卵泡抑素(如，卵泡抑素转基因)。核酸酶可在靶DNA中诱导双链(DSB)或单链断裂(缺口)。在一些实施方案中，可以在将转基因(如，卵泡抑素转基因)整合至细胞基因组中的位点处经由同源定向修复(HDR)、非同源修复机制(如NHEJ介导的末端捕获)或核苷酸(如内源序列)的插入和/或缺失来进行供体转基因(如，卵泡抑素供体转基因)的靶向插入。在一个实施方案中，转染B细胞的方法包括在使B细胞与载体接触之前电穿孔B细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第1天至第12天的某一天对细胞进行电穿孔。在一个实施方案中，在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天对细胞进行电穿孔。在一个实施方案中，在体外培养的第2天对细胞进行电穿孔，以递送质粒。

在一个实施方案中，使用转座子转染细胞。如本文所用，术语“转座的”在一些实施方案中可以指用转座子转染的这样的细胞。许多转座子系统是本领域已知的，并且适用于本发明。例如，睡美人转座子系统和Piggybac转座子系统在本领域是众所周知的，并且适用于本发明。参见，例如，Hackett P.B.等人,Evaluating Risks of InsertionalMutagenesis by DNA Transposons in Gene Therapy,Transl Res.2013年4月；161(4):265–283；Hudecek M等人,Going non-viral:the Sleeping Beauty transposon systembreaks on through to the clinical side,Crit Rev Biochem Mol Biol.2017年8月；52(4):355-380，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，使用睡美人转座子转染细胞。在一些实施方案中，睡美人转座子可以是T2睡美人转座子或T4睡美人转座子。在一些实施方案中，睡美人转座子系统的利用可以包括用编码转座子系统机构的DNA构建体和编码卵泡抑素多肽的DNA构建体转染(如，经由电穿孔)B细胞。在一些实施方案中，编码转座子系统机构的DNA构建体可以是pCMV-SB100x。在一些实施方案中，睡美人转座子系统的利用可以包括用编码卵泡抑素多肽的DNA构建体转染(如，经由电穿孔)B细胞，并且还用编码转座子系统机构的mRNA转染B细胞。在一些实施方案中，编码转座子系统机构的mRNA编码SB100x转座酶。在一些实施方案中，使用Piggybac转座子转染细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第1天至第12天的某一天使用转座子(如，T2或T4睡美人转座子或者Piggybac转座子)转染细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天使用转座子(如，T2或T4睡美人转座子或者Piggybac转座子)转染细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第1天至第12天的某一天使用微环转染细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天使用微环转染细胞。

在一个实施方案中，在体外培养的第1天至第12天的某一天使用睡美人转座子(如T2或T4睡美人转座子)转染细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第2天，使用睡美人转座子(如T2或T4睡美人转座子)系统经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第5天使用睡美人转座子(如T2或T4睡美人转座子)系统经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第8天使用睡美人转座子(如T2或T4睡美人转座子)系统经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第11天使用睡美人转座子(如T2或T4睡美人转座子)系统经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第14天使用睡美人转座子(如T2或T4睡美人转座子)系统经由电穿孔转导细胞。

在一个实施方案中，在体外培养的第1天至第12天的某一天使用Piggybac转座子转染细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第2天使用Piggybac转座子经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第5天使用Piggybac转座子经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第8天使用Piggybac转座子经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第11天使用Piggybac转座子经由电穿孔转导细胞。在一个实施方案中，在体外培养的第14天使用Piggybac转座子经由电穿孔转导细胞。

在一个实施方案中，在足以转染至少一部分B细胞的条件下，使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的载体接触。在一个实施方案中，在足以转染至少5％的B细胞的条件下，使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的载体接触。在进一步的实施方案中，在足以转染至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的B细胞的条件下，使B细胞与载体接触。在一个特定的实施方案中，转染如本文所述在体外培养的B细胞，在这种情况下使培养的B细胞与如本文所述的载体在足以转染至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的B细胞的条件下接触。

病毒载体可用于转导记忆B细胞和/或浆细胞。病毒载体的实例包括但不限于基于腺病毒的载体、基于腺相关病毒(AAV)的载体、逆转录病毒载体、逆转录病毒-腺病毒载体和衍生自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(参见，如，Krisky,Gene Ther.5:1517-30,1998；Pfeifer,Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177-211,2001，其各自通过引用整体并入)。

在一个实施方案中，在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天用病毒载体(如，慢病毒载体)转导细胞。在特定的实施方案中，在体外培养的第5天用病毒载体转导细胞。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒。在一个实施方案中，在体外培养的第1天用麻疹病毒假型慢病毒转导细胞。

在一个实施方案中，使用本领域多种已知技术中的任一种用逆转录病毒载体转导B细胞(参见，如Science 12April 1996 272:263-267；Blood 2007,99:2342-2350；Blood2009,1 13:1422-1431；Blood2009年10月8日；1 14(15):3173-80；Blood.2003；101(6):2167-2174；Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009))。B细胞的病毒转导的另外描述可以见于WO 2011/085247和WO 2014/152832，其各自通过引用整体并入本文。

例如，可以分离来自供体的PBMC、B或T淋巴细胞以及其他B细胞癌细胞，如B-CLL，并将它们在IMDM培养基或RPMI 1640(GibcoBRL Invitrogen,Auckland,New Zealand)或如本文所述的其他合适的培养基(无血清或补充有血清(如，5-10％FCS、人AB血清和血清替代品)和青霉素/链霉素和/或其他适合的补充剂如转铁蛋白和/或胰岛素)中培养。在一个实施方案中，将细胞以1x 10⁵个细胞接种在48孔板中，并以本领域技术人员可以使用常规方法进行常规优化的各种剂量添加浓缩载体。在一个实施方案中，将B细胞转移至在补充有10％AB血清、5％FCS、50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhlL-15和5ng/ml rhlL-2的RPMI中的MS5细胞单层，并根据需要定期更新培养基。如本领域技术人员将认识到的，可以根据需要使用其他适合的培养基和补充剂。

某些实施方案涉及使用逆转录病毒载体或衍生自逆转录病毒的载体。“逆转录病毒”是有包膜的RNA病毒，其能够感染动物细胞，并在感染的早期利用逆转录酶以从其RNA基因组中产生DNA拷贝，然后通常将所述DNA拷贝整合到宿主基因组中。逆转录病毒载体的实例莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的载体，在靶细胞如造血前体细胞及其分化后代中提供长期稳定表达的基于鼠干细胞病毒的逆转录病毒载体(参见，如,Hawley等人,PNAS USA93:10297-10302,1996；Keller等人,Blood 92:877-887,1998)，杂合载体(参见，如,Choi,等人,Stem Cells 19:236-246,2001)和复杂的逆转录病毒来源的载体，如慢病毒载体。

在一个实施方案中，在足以转导至少一部分B细胞的条件下，使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的逆转录病毒载体接触。在一个实施方案中，在足以转导至少2％的B细胞的条件下，使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的逆转录病毒载体接触。在进一步的实施方案中，在足以转导至少2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％静息B细胞的条件下，使B细胞与载体接触。在一个特定的实施方案中，转导如本文所述的在体外培养的分化和激活的B细胞，在这种情况下，使培养的分化/激活的B细胞与如本文所述的载体在足以转导至少2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的分化和激活的B细胞的条件下接触。

在某些实施方案中，在转导之前，用金黄色葡萄球菌Cowan(SAC；Calbiochem,SanDiego,CA)和/或技术人员已知且常规优化的适当浓度的IL-2预刺激细胞。可以使用如技术人员已知的以及在本文中描述的其他B细胞激活因子(如，PMA)。

如上所述，某些实施方案采用慢病毒载体。术语“慢病毒”是指能够感染分裂细胞和非分裂细胞的复杂逆转录病毒的一个属。慢病毒的实例包括HIV(人免疫缺陷病毒；包括1型HIV和2型HIV)、绵羊髓鞘脱落(visna-maedi)、山羊关节炎脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体可来源于这些慢病毒中的任一种或多种(参见，如Evans等人,Hum Gene Ther.10:1479-1489,1999；Case等人,PNAS USA96:2988-2993,1999；Uchida等人,PNAS USA 95:1 1939-1 1944,1998；Miyoshi等人,Science 283:682-686,1999；Sutton等人,J Virol 72:5781-5788,1998；和Frecha等人,Blood.1 12:4843-52,2008，其各自通过引用整体并入)。

有文献证明，静息T细胞和静息B细胞可以通过携带大多数HIV辅助蛋白(vif、vpr、vpu和nef)的VSVG包被的LV进行转导(参见，如Frecha等人,2010Mol.Therapy 18:1748)。在某些实施方案中，逆转录病毒载体包含来自慢病毒基因组如HIV基因组或SIV基因组的某些最小序列。慢病毒的基因组通常组织成5'长末端重复(LTR)区、gag基因、pol基因、env基因、辅助基因(如nef、vif、vpr、vpu、tat、rev)和3'LTR区。病毒LTR分为三个区域，称为U3、R(重复)和U5。U3区含有增强子和启动子元件，U5区含有聚腺苷酸化信号，并且R区将U3和U5区分开。R区的转录序列出现在病毒RNA的5'端和3'端(参见，如,“RNA Viruses:A PracticalApproach”(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,2000)；O Narayan,J.Gen.Virology.70:1617-1639,1989；Fields等人,Fundamental Virology RavenPress.,1990；Miyoshi等人,J Virol.72:8150-7,1998；和美国专利第6,013,516号，其各自通过引用整体并入)。慢病毒载体可以包含慢病毒基因组的这些元件中的任一种或多种，以根据需要调控载体的活性，或者它们可以在这些元件中的一种或多种中含有缺失、插入、置换或突变，如以减少慢病毒复制的病理作用，或将慢病毒载体限于单轮感染。

通常，最小逆转录病毒载体包含某些5'LTR和3'LTR序列、一个或多个目标基因(待在靶细胞中表达)、一个或多个启动子以及用于包装RNA的顺式作用序列。如本文所述和本领域已知的，可以包括其他调控序列。通常将病毒载体克隆到可以被转染到包装细胞系如真核细胞(如293-HEK)中的质粒中，并且通常还包含可用于在细菌中复制质粒的序列。

在某些实施方案中，病毒载体包含来自逆转录病毒如慢病毒的5'和/或3'LTR的序列。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。优选地，LTR序列是HIV LTR序列。

在某些实施方案中，病毒载体包括来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的灭活或“自我灭活”的3'LTR。“自我灭活的3'LTR”是3'长末端重复(LTR)，其含有防止LTR序列驱动下游基因表达的突变、置换或缺失。来自3'LTR的U3区的拷贝充当用于在整合原病毒中产生两个LTR的模板。因此，当具有失活的缺失或突变的3'LTR整合为原病毒的5'LTR时，就不可能从5'LTR转录。这消除了病毒增强子/启动子与任何内部增强子/启动子之间的竞争。自灭活3'LTR描述于例如Zufferey等人,J Virol.72:9873-9880,1998；Miyoshi等人,J Virol.72:8150-8157,1998；和Iwakuma等人,J Virology 261:120-132,1999中，其各自通过引用整体并入。自灭活3'LTR可由本领域已知的任何方法生成。在某些实施方案中，3'LTR的U3元件含有其增强子序列的缺失，优选TATA盒、Spl和/或NF-κB位点。由于自灭活的3'LTR，整合至宿主细胞基因组中的原病毒将包含灭活的5'LTR。

本文提供的载体通常包含编码期望在一种或多种靶细胞中表达的蛋白质(如卵泡抑素)的基因。但是，本文提供的载体还可以包含编码期望在一种或多种靶细胞中表达的其他分子(诸如例如siRNA)的基因。在一些实施方案中，在病毒载体中，目标基因(如卵泡抑素)优选位于5'LTR序列和3'LTR序列之间。此外，在一些实施方案中，目标基因(如卵泡抑素)优选与其他遗传元件例如转录调控序列如启动子和/或增强子处于功能关系中，一旦基因被整合至靶细胞中就以特定方式调控目标基因(如卵泡抑素)的表达。在某些实施方案中，有用的转录调控序列是在时间和空间上对活性都高度调控的序列。

在某些实施方案中，可以将一个或多个另外的基因作为一种安全措施并入，例如以允许在异源群体如人患者中选择性杀灭或耗尽转染的靶细胞。在一个非限制性示例性实施方案中，所述基因是胸苷激酶基因(TK)，其表达使得靶细胞易于受药物更昔洛韦的作用的影响。在一些实施方案中，另外的基因是细胞表面蛋白标签。在一些实施方案中，所述基因是自杀基因。在一些实施方案中，自杀基因是被二聚化药物激活的半胱天冬酶9自杀基因(参见，如,Tey等人,Biology of Blood and Marrow Transplantation 13:913-924,2007)。

在某些实施方案中，可以将编码标志物蛋白的一个或多个另外的基因置于病毒或非病毒载体中的主要基因(如，卵泡抑素基因)之前或之后，以允许鉴定和/或选择表达期望蛋白(如，卵泡抑素)的细胞。某些实施方案掺入了可以促进鉴定和/或选择表达期望蛋白(如，卵泡抑素)的细胞的另外的细胞表面蛋白。某些实施方案掺入了荧光标志物蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)，以及目标主要基因(如，卵泡抑素基因)。如果包括一个或多个另外的报道基因，则也可以包括IRES序列或2A元件，从而将目标主要基因(如，卵泡抑素基因)与报道基因和/或任何其他目标基因分开。

某些实施方案可以采用编码一种或多种可选择标志物的基因。实例包括在真核细胞或原核细胞中有效的可选择标志物，如编码在选择培养基中生长的转化宿主细胞存活或生长所必需的因子的用于抗药性的基因。示例性选择基因编码赋予对抗生素或其他毒素(如G418、潮霉素B、嘌呤霉素、博莱霉素、乌本苷、杀稻瘟菌素、氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性、补充营养缺陷型缺陷的蛋白质，，或供应可存在于单独的质粒上并通过用病毒载体共转染引入。在一个实施方案中，基因编码赋予甲氨蝶呤抗性的突变型二氢叶酸还原酶(DHFR)。某些其他实施方案可采用编码可用于标记和检测或纯化转染细胞的一种或细胞表面受体(如低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)或者用作转导标签系统的其他此类受体的基因。参见如Lauer等人,Cancer Gene Ther.2000年3月；7(3):430-7。

某些病毒载体如逆转录病毒载体使用一种或多种异源启动子、增强子或两者。在某些实施方案中，在病毒构建体中，可以用启动子或增强子序列替换来自逆转录病毒或慢病毒5'LTR的U3序列。某些实施方案采用位于病毒载体的5'LTR和3'LTR序列之间并与目标基因(如，卵泡抑素基因)可操作地连接的“内部”启动子/增强子。

“功能关系”和“可操作地连接”意指但不限于该基因(如，卵泡抑素基因)相对于启动子和/或增强子处于正确的位置和取向，使得当启动子和/或增强子与适当的调控分子接触时基因(如，卵泡抑素基因)的表达将受到影响。可以使用调控(如增加、减少)包装细胞系中病毒RNA基因组的表达、调控感染的靶细胞中所选目标基因的表达或两者的任何增强子/启动子组合。

启动子是由允许聚合酶结合和转录发生的DNA序列形成的表达控制元件。启动子是未翻译的序列，位于所选目标基因的起始密码子上游(5')(通常在约100至1000bp内)，并控制与其可操作地连接的编码多核苷酸序列的转录和翻译。启动子可以是诱导型的或组成型的。诱导型启动子响应于培养条件的一些变化(如温度变化)而在其控制下启动提高水平的从DNA的转录。启动子可以是单向的或双向的。双向启动子可用于共表达两种基因，如目标基因(如卵泡抑素)和选择标志物。可选地，可以使用包含在同一载体中呈相反取向的两个启动子的双向启动子构型，每个启动子控制不同基因的表达。

如用于将启动子可操作地连接至多核苷酸编码序列的方法一样，多种启动子是本领域已知的。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于指导所选目标基因的表达。某些实施方案采用异源启动子，这是因为与天然启动子相比，它们通常允许更高的转录和更高的期望蛋白质产率。

某些实施方案可以采用异源病毒启动子。此类启动子的实例包括从病毒(如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组中获得的那些。某些实施方案可以采用异源哺乳动物启动子，如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子或与目标基因(如，卵泡抑素基因)的天然序列相关的启动子。通常，启动子与靶细胞如激活的B淋巴细胞、浆B细胞、记忆B细胞或其他淋巴细胞靶细胞相容。

某些实施方案可以采用RNA聚合酶II和III启动子中的一种或多种。RNA聚合酶III启动子的合适选择可见于例如Paule和White.Nucleic Acids Research.,第28卷，pp1283-1298,2000，将其通过引用整体并入。RNA聚合酶II和III启动子还包括可分别指导RNA聚合酶II或III转录其下游RNA编码序列的任何合成的或经工程化的DNA片段。此外，用作病毒载体的一部分的RNA聚合酶II或III(Pol II或III)启动子可以是诱导型的。任何合适的诱导型Pol II或III启动子可与本文所述的方法一起使用。示例性Pol II或III启动子包括Ohkawa和Taira,Human Gene Therapy,第11卷，pp577-585，2000；和Meissner等人,NucleicAcids Research,第29卷，pp1672-1682,2001中提供的四环素响应性启动子，其各自通过引用整体并入。

可以使用的组成型启动子的非限制性实例包括泛素的启动子、CMV启动子(参见，如,Karasuyama等人,J.Exp.Med.169:13,1989)、β-肌动蛋白(参见，如,Gunning等人,PNASUSA 84:4831-4835,1987)、延伸因子-1α(EF-1α)启动子、CAG启动子和pgk启动子(参见，如,Adra等人,Gene 60:65-74,1987)；Singer-Sam等人,Gene 32:409-417,1984；和Dobson等人,Nucleic Acids Res.10:2635-2637,1982，其各自通过引用并入)。组织特异性启动子的非限制性实例包括lck启动子(参见，如Garvin等人,Mol.Cell Biol.8:3058-3064,1988；和Takadera等人,Mol.Cell Biol.9:2173-2180,1989)、成肌素启动子(Yee等人,Genes andDevelopment 7:1277-1289.1993)和thyl启动子(参见，如,Gundersen等人,Gene1 13:207-214,1992)。

启动子的另外实例包括泛素-C启动子、人μ重链启动子或Ig重链启动子(如，MH)，及人κ轻链启动子或Ig轻链启动子(如，EEK)，其在B-淋巴细胞中有功能。MH启动子含有在侧接有基质结合区的iEμ增强子前的人μ重链启动子，并且EEK启动子含有在内含子增强子(iEκ)、基质结合区和3'增强子(3Eκ)之前的κ轻链启动子(参见，如,Luo等人,Blood.1 13:1422-1431,2009，和美国专利申请公布号2010/0203630)。因此，某些实施方案可以采用这些启动子或增强子元件中的一种或多种。

在一个实施方案中，一个启动子驱动可选标志物表达和第二启动子驱动目标基因(如，卵泡抑素基因)的表达。例如，在一个实施方案中，EF-1α启动子驱动选择标志物(如，DHFR)的产生和微型CAG启动子(参见，如,Fan等人Human Gene Therapy 10:2273–2285,1999)驱动目标基因(如，卵泡抑素)的表达。

如上所述，某些实施方案采用增强子元件，如内部增强子来增加目标基因的表达。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长约10至300bp，作用于启动子以增加其转录。增强子序列可来源于哺乳动物基因(如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、胰岛素)，如ιεμ增强子、ιεκ内含子增强子和3'εκ增强子。还包括来自真核病毒的增强子，包括复制起点后侧(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在抗原特异性多核苷酸序列的5'位或3'位剪接到载体中，但是优选位于启动子的5'位点。本领域技术人员将基于期望的表达模式选择适当的增强子。

在某些实施方案中，选择启动子以允许目标基因(如，卵泡抑素基因)的诱导型表达。在本领域中已知用于诱导型表达的许多系统，包括四环素响应系统和lac操纵子-阻遏子系统。还预期启动子的组合可用于获得目标基因(如，卵泡抑素基因)的期望表达。技术人员将能够基于目标有机体和/或靶细胞中基因的期望表达模式来选择启动子。

某些病毒载体包含顺式作用包装序列，以促进基因组病毒RNA掺入病毒颗粒。实例包括psi序列。此类顺式作用序列是本领域中已知的。在某些实施方案中，本文所述的病毒载体可表达两种或更多种基因，这可例如通过掺入可操作地连接至除第一基因之外的每个单独基因的内部启动子、通过掺入促进共表达的元件如内部核糖体进入序列(IRES)元件(美国专利第4,937,190号，通过引入并入)或2A元件、或两者来实现。仅以举例说明的方式，当单个载体包含编码具有期望特异性的免疫球蛋白分子的每条链的序列时，可以使用IRES或2A元件。例如，第一编码区(编码重链或轻链)可位于紧接启动子下游，并且第二编码区(编码另一条链)可位于第一编码区下游，其中IRES或2A元件位于第一和第二编码区之间，优选紧接在第二编码区之前。在其他实施方案中，IRES或2A元件用于共表达不相关基因，如报告基因、可选择标志物、细胞表面蛋白或增强免疫功能的基因。可使用的IRES序列的实例包括但不限于脑脊髓炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、泰累尔氏鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)、人鼻病毒(HRV)、柯萨基病毒(CSV)、脊髓灰质炎病毒(POLIO)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)和瘟病毒(如，猪瘟弱毒(HOCV)和牛病毒腹泻病毒(BVDV))的IRES元件(参见，如,Le等人,Virus Genes 12:135-147,1996；和Le等人,Nuc.Acids Res.25:362-369,1997，其各自通过引用整体并入)。2A元件的一个实例包括来自口蹄疫病毒的F2A序列。

在某些实施方案中，本文提供的载体还含有另外的遗传元件，以达到期望的结果。例如，某些病毒载体可以包括促进病毒基因组的核进入靶细胞的信号，如HIV-1皮瓣信号。作为进一步的实例，某些病毒载体可以包括促进原病毒整合位点在靶细胞中表征的元件，如tRNA琥珀抑制剂序列。某些病毒载体可以含有一种或多种经设计以增强目标基因(如，卵泡抑素基因)表达的遗传元件。例如，可以将土拨鼠肝炎病毒响应元件(WRE)置于构建体中(参见，如,Zufferey等人,J.Virol.74:3668-3681,1999；和Deglon等人,Hum.GeneTher.11:179-190,2000，其各自通过引用整体并入)。作为另一个实例，鸡β-珠蛋白隔离子也可以包括在构建体中。已经表明，由于甲基化和异染色质化作用，这种元件减少了使靶细胞中整合的DNA沉默的可能性。此外，隔离子可以保护内部增强子、启动子和外源基因免受染色体上整合位点处周围DNA的正或负位置效应。某些实施方案采用了这些遗传元件中的每一种。在另一个实施方案中，本文提供的病毒载体还可以含有遍在染色质开放元件(UCOE)以增加表达(参见如,Zhang F等人,Molecular Therapy:The journal of theAmerican Society of Gene Therapy 2010年9月；18(9):1640–9.)。

在某些实施方案中，本文提供的病毒载体(如逆转录病毒，慢病毒)用主要靶向选定的细胞类型的一种或多种选定的病毒糖蛋白或包膜蛋白进行“假分型(pseudo-typed)”。假分型(pseudo-typing)通常是指将一种或多种异源病毒糖蛋白掺入至细胞表面病毒颗粒，通常允许病毒颗粒感染不同于其正常靶细胞的选定细胞。“异源”元件来源于不同于病毒载体的RNA基因组所来源的病毒的病毒。通常，病毒载体的糖蛋白编码区已如通过缺失进行了遗传改变，以防止其自身糖蛋白的表达。仅以举例说明的方式，通常在用异源病毒糖蛋白进行假分型之前，将HIV衍生的慢病毒载体的包膜糖蛋白gp41和/或gp120缺失。

在某些实施方案中，病毒载体用靶向B淋巴细胞的异源病毒糖蛋白进行假分型。在某些实施方案中，病毒糖蛋白允许选择性感染或转导静息或静止B淋巴细胞。在某些实施方案中，病毒糖蛋白允许选择性感染B淋巴细胞浆细胞、浆母细胞和激活的B细胞。在某些实施方案中，病毒糖蛋白允许感染或转导静止B淋巴细胞、浆母细胞、浆细胞和激活的B细胞。在某些实施方案中，病毒糖蛋白允许感染B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞。在一个实施方案中，病毒载体用VSV-G进行假分型。在另一个实施方案中，异源病毒糖蛋白来源于麻疹病毒(如埃德蒙顿麻疹病毒)的糖蛋白。某些实施方案假分型麻疹病毒糖蛋白血凝素(H)、融合蛋白(F)或两者(参见，如,Frecha等人,Blood.1 12:4843-52,2008；和Frecha等人,Blood.114:3173-80,2009，其各自通过引用整体并入)。在一个实施方案中，病毒载体用长臂猿白血病病毒(GALV)进行假分型。在一个实施方案中，病毒载体用猫内源性逆转录病毒(RD114)进行假分型。在一个实施方案中，病毒载体用狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)进行假分型。在一个实施方案中，病毒载体用鼠白血病病毒(MLV)进行假分型。在一个实施方案中，病毒载体用长臂猿白血病病毒(GALV)进行假分型。在进一步的实施方案中，病毒载体包括用于将载体靶向特定细胞类型的嵌入的抗体结合结构域，如一个或多个可变区(如，重链和轻链可变区)。

病毒载体的产生可以使用本领域已知的任何合适的遗传工程化技术来完成，包括但不限于限制核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、PCR扩增和DNA测序的标准技术，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.(1989))；Coffin等人(Retroviruses.Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.(1997))和“RNA Viruses:A Practical Approach”(Alan J.Cann,编辑,Oxford University Press,(2000)所述。

可以使用本领域已知的各种方法来产生合适的逆转录病毒颗粒，其基因组包含病毒载体的RNA拷贝。作为一种方法，可以将病毒载体引入包装细胞系，所述包装细胞系将基于病毒载体的病毒基因组RNA包装至具有期望靶细胞特异性的病毒颗粒中。包装细胞系通常反式提供将病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中并感染靶细胞所需的病毒蛋白质，包括结构性gag蛋白、酶促pol蛋白和包膜糖蛋白。

在某些实施方案中，包装细胞系稳定表达某些必需的或期望的病毒蛋白质(如，gag、pol)(参见，如，美国专利第6,218,181号，其通过引用并入本文)。在某些实施方案中，用质粒瞬时转染包装细胞系，所述质粒编码某些必需的或期望的病毒蛋白质(如，gag、pol、糖蛋白)，包括本文所述的麻疹病毒糖蛋白序列。在一个示例性实施方案中，包装细胞系稳定表达gag和pol序列，然后用编码病毒载体的质粒和编码糖蛋白的质粒转染细胞系。引入期望的质粒之后，将病毒颗粒如通过超速离心法收集并相应处理，以获得浓缩的病毒颗粒原液。示例性包装细胞系包括293(ATCC CCL X)细胞系、HeLa(ATCC CCL 2)细胞系、D17(ATCC CCL 183)细胞系、MDCK(ATCC CCL 34)细胞系、BHK(ATCC CCL-10)细胞系和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞系。

治疗剂

如本文所用的“目标基因”或“基因”或“目标核酸”是指待在靶标转染的细胞中表达的转基因。在特定的实施方案中，所述基因是卵泡抑素基因。尽管可以使用术语“基因”，但这并不意味着这是在基因组DNA中存在的基因并且可以与术语“核酸”互换使用。通常，目标核酸提供用于编码治疗剂(如，卵泡抑素)的合适核酸，并且可以包含cDNA或DNA，并且可以包含或不可包含内含子，但通常不包含内含子。如在别处所指出的，目标核酸可操作地连接至表达控制序列，以在靶细胞中有效地表达目标蛋白质。在某些实施方案中，本文所述的载体可以包含一种或多种目标基因，并且可以包括2种、3种、4种或5种或更多种目标基因，如例如可以使用如本文所述的内部启动子来组织的免疫球蛋白的重链和轻链。

如本文所用的叙述“多核苷酸”或“核酸”表示mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。术语通常是指长度为至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式)的聚合形式。术语包括DNA和RNA的单链和双链形式。目标核酸或基因可以是编码目标蛋白质的任何核酸。

在一些实施方案中，本文公开的任何一个实施方案可利用作为卵泡抑素蛋白的目标基因。在一些实施方案中，卵泡抑素蛋白可以是SEQ ID NO:1-4所示的卵泡抑素蛋白中的任一种。因此，在一些实施方案中，如本文所述的递送至经遗传修饰的B细胞的治疗剂可以是卵泡抑素蛋白。

卵泡抑素

在各个方面，本公开内容涉及经工程化以表达卵泡抑素(如，一种或多种卵泡抑素多肽)的B细胞。如本文所用，术语“卵泡抑素”是指来源于任何物种的卵泡抑素(FST)蛋白和卵泡抑素相关蛋白家族。卵泡抑素是在高等动物的几乎所有组织中表达的自分泌糖蛋白。它最初分离自卵泡液，并且被鉴定为抑制促卵泡激素(FSH)从垂体前叶分泌的蛋白质部分，因此被称为FSH抑制蛋白(FSP)。随后，已经确定其主要功能是TGF-β超家族成员的结合和中和，所述超家族成员包括例如活化素，一种增强FSH在垂体前叶中分泌的旁分泌激素。

在一些实施方案中，术语“卵泡抑素多肽”或“卵泡抑素”用于指包含卵泡抑素家族的任何天然存在的多肽以及其保留有用的活性，包括例如配体结合(如，肌骨素、GDF-11、活化素A、活化素B)或肝素结合的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物(peptidomimetic)形式)的多肽。例如，在一些实施方案中，卵泡抑素多肽可以包括这样的多肽，其包含衍生自与卵泡抑素多肽的序列具有至少约80％的同一性，并且优选至少85％、90％、95％、97％、99％或更高的同一性的任何已知卵泡抑素序列的氨基酸序列。

卵泡抑素是基于蛋白质的选择性mRNA剪接和可变糖基化的分子量范围为31kDa至49kDa的单链多肽。编码卵泡抑素(FST)的人基因在染色体5q11.2上具有跨越5329bp的6个外显子，并产生两种主要转录物：转录物变体FST344(1122bp)和转录物FST317(1386bp)。FST中的外显子1编码卵泡抑素信号肽，外显子2编码卵泡抑素N-末端结构域，并且外显子3-5中的每一个编码卵泡抑素模块。由于选择性剪接，使用外显子6A(其编码FST344中的酸性区域)或外显子6B(其含有FST317的终止密码子中的两个碱基)中的任一个(Shimasaki,S等人,1988)。

这些选择性剪接的mRNA(FST344和FST317)导致在去除29个氨基酸的信号肽后分别产生315个氨基酸(即FST315)和288个氨基酸(即FST288)的两种卵泡抑素蛋白，并且卵泡抑素315可以进一步蛋白水解降解成卵泡抑素303(FST303)。氨基酸序列的分析已经揭示天然人卵泡抑素多肽包含5个结构域(从N-末端侧开始)：信号序列肽(SEQ ID NO:1的氨基酸1-29)、N-末端结构域(FSN)(SEQ ID NO:1的氨基酸30-94)、卵泡抑素结构域I(FSDI)(SEQID NO:1的氨基酸95-164)、卵泡抑素结构域II(FSDII)(SEQ ID NO:1的氨基酸168-239)和卵泡抑素结构域III(FSDIII)(SEQ ID NO:1的氨基酸245-316)。参见PNAS,U.S.A.,1988,第85卷,第12期,pp 4218-4222。

人卵泡抑素-288(FST288)前体(即FST317)具有以下氨基酸序列，其中信号肽以粗体表示，N-末端结构域(FSN)由单下划线表示，并且卵泡抑素结构域I-III(FSI、FSII、FSIII)由双下划线表示。

加工的(成熟的)人卵泡抑素变体(FST288)具有以下氨基酸序列，其中N-末端结构域由单下划线表示，并且卵泡抑素结构域I-III由双下划线表示。此外，应理解，在第一个半胱氨酸之前的任何初始氨基酸G或N可以通过加工除去或有意除去而没有任何结果，并且还包括包含这种略小的多肽的多肽。

人卵泡抑素-315(FST315)前体(即，FST344)具有以下氨基酸序列，其中信号肽以粗体表示，N端结构域(FSN)由单下划线表示，并且卵泡抑素结构域I-III(FSI、FSII、FSIII)以双下划线表示(NCBI登记号AAH04107.1；344个氨基酸)。

加工的(成熟的)人FST315具有以下氨基酸序列，其中N-末端结构域由单下划线表示，并且卵泡抑素结构域I-III由双下划线表示。此外，应理解，在第一个半胱氨酸之前的任何初始氨基酸G或N可以通过加工除去或有意除去而没有任何结果，并且还包括包含这种略小的多肽的多肽。

本公开内容的卵泡抑素多肽可以包括卵泡抑素蛋白的任何天然存在的结构域以及其保留有用活性的变体(如，突变体、片段和肽模拟物形式)。例如，众所周知的是，FST315和FST288对活化素(活化素A和活化素B)和肌骨素(及密切相关的GDF11)都具有高亲和力，并且认为卵泡抑素结构域(如，FSN和FSD I-III)参与这种TGF-β配体的结合。然而，认为这三个结构域中的每一个可能对这些TGF-β配体具有不同的亲和力。例如，研究已经证明，仅包含串联的N-末端结构域(FSN)和两个FSDI结构域的多肽构建体对肌骨素保留高亲和力，当通过基因表达引入小鼠时，对活化素显示出很小的亲和力或没有显示出亲和力并促进全身性肌肉生长(Nakatani等人,The FASEB Journal,Vol.22477-487(2008))。

因此，本公开内容部分地涵盖变体卵泡抑素蛋白，相对于天然存在的FST蛋白，其显示出给定TGF-β配体的选择性结合和/或抑制(如，维持对肌骨素的高亲和力，同时对活化素具有显著降低的亲和力)。

因此，本公开内容提供了用于经遗传修饰B细胞的编码本公开的治疗剂(如，卵泡抑素)的多核苷酸(分离的或纯化的或纯的多核苷酸)，包含此类多核苷酸的载体(包括克隆载体和表达载体)，以及根据本公开内容用多核苷酸或载体转化或转染的细胞(如，宿主细胞)。在某些实施方案中，本公开内容中公开的实施方案中的任一个可以利用选自SEQ IDNO:1-4的卵泡抑素多肽的卵泡抑素(如，用于在B细胞中表达)。在某些实施方案中，本公开内容中公开的实施方案中的任一个可以利用作为人卵泡抑素FST344剪接位点变体的卵泡抑素(如，用于在B细胞中表达)。在某些实施方案中，考虑了编码本公开内容的目标蛋白质(如，卵泡抑素)的多核苷酸(DNA或RNA)。在本文中还考虑了编码目标蛋白质的表达盒。

本公开内容还涉及包括本公开内容的多核苷酸的载体并且特别涉及重组表达构建体。在一个实施方案中，本公开内容考虑了包含编码本公开内容的蛋白质(如，卵泡抑素)的多核苷酸以及引起或促进此类蛋白质编码序列的转录、翻译和加工的多核苷酸序列的载体。与原核和真核宿主一起使用的适当的克隆和表达载体描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,NY,(1989)中。示例性克隆/表达载体包括克隆载体、穿梭载体和表达构建体，其可基于质粒、噬菌粒、噬粒(phasmids)、粘粒、病毒、人工染色体或本领域已知的适用于扩增、转移和/或表达其中所含的多核苷酸的任何核酸媒介物。

如本文所用，除非另有关于病毒载体的描述，否则“载体”意指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。示例性载体包括质粒、微环、转座子(如，睡美人转座子)、酵母人工染色体、自复制RNA和病毒基因组。某些载体可以在宿主细胞中自主复制，而其他载体可以整合到宿主细胞的基因组中并从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)，其含有与表达控制序列可操作地连接的核酸序列，因此能够指导那些序列的表达。在某些实施方案中，表达构建体衍生自质粒载体。说明性构建体包括修饰的pNASS载体(Clontech,Palo Alto,CA)，其具有编码氨苄青霉素抗性基因的核酸序列、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点；pDEF38和pNEF38(CMC ICOS Biologies,Inc.)，其具有CHEF1启动子；和pD18(Lonza)，其具有CMV启动子。其他合适的哺乳动物表达载体也是众所周知的(参见，如,Ausubel等人,1995；Sambrook等人，同上；还参见，如来自Invitrogen,San Diego,CA；Novagen,Madison,Wl；Pharmacia,Piscataway,NJ的目录)。

可以制备有用的构建体，其包括在合适的调控控制下的二氢叶酸还原酶(DHFR)编码序列以促进增强的融合蛋白产生水平，所述水平由施加适当选择剂(如，甲氨蝶呤)后的基因扩增产生。在一个实施方案中，使用编码治疗性基因(如，FST)以及抗药性DHFR的双功能转座子结合在甲氨蝶呤(MTX)中的孵育来富集成功转座的B细胞，产生了更有效的产物。

通常，重组表达载体将包括复制起点和允许宿主细胞转化的可选择标志物，以及来源于高度表达的基因以指导下游结构序列转录的启动子，如上所述。与根据本公开内容的多核苷酸可操作连接的载体产生克隆或表达构建体。示例性克隆/表达重建体含有可操作地连接至本公开内容的多核苷酸的至少一种表达控制元件，如启动子。在根据本公开内容的载体和克隆/表达构建体中还考虑了另外的表达控制元件，如增强子、因子特异性结合位点、终止子和核糖体结合位点。根据本公开内容的多核苷酸的异源结构序列在适当的阶段与翻译起始和终止序列组装。因此，例如，本文提供的编码核酸可以包含在多种表达载体构建体(如，微环)中的任一种中，作为用于在宿主细胞中表达此类蛋白质的重组表达构建体。

适当的DNA序列可以例如通过多种程序插入载体中。通常，通过本领域已知的程序将DNA序列插入适当的限制性核酸内切酶切割位点中。考虑了用于克隆，DNA分离，扩增和纯化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应和各种分离技术的标准技术。多种标准技术描述于例如Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,Boston,MA,1993)；Sambrook等人(Molecular Cloning,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY,1989)；Maniatis等人(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY,1982)；Glover(编辑)(DNA Cloning Vol.I and II,IRL Press,Oxford,UK,1985)；Hames和Higgins(编辑)(Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK,1985)；和其他地方。

表达载体中的DNA序列与至少一种适当的表达控制序列(如，组成型启动子或调控启动子)可操作地连接，以指导mRNA合成。此类表达控制序列的代表性实例包括如上所述的真核细胞或其病毒的启动子。启动子区可以使用CAT(氯霉素转移酶)载体、卡那霉素载体或其他具有可选标志物的载体从任何期望基因中选择。真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-1。适当的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员水平内，并且本文描述了包括与编码根据本公开内容的蛋白质或多肽的核酸可操作地连接的至少一个启动子或调控启动子的某些特别优选的重组表达构建体的制备。

还考虑了本公开内容的多核苷酸的变体。多核苷酸变体与如本文所述的限定序列的多核苷酸中的一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％并且优选95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，或在约65-68℃0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者约42℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺的严格杂交条件下与限定序列的那些多核苷酸中的一个杂交。多核苷酸变体保留了编码具有本文所述的功能性的结合结构域或其融合蛋白的能力。

术语“严格的”用于指本领域中通常理解为严格的条件。杂交严格性主要由温度、离子强度和变性剂(如甲酰胺)的浓度决定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例是约65-68℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠、或约42℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。也可以使用更严格的条件(如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其他变性剂)；然而，杂交速率将受到影响。在其中涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(对于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(对于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(对于23个碱基的寡核苷酸)下在6x SSC，0.05％焦磷酸钠中洗涤。

本公开内容的另一方面提供了用或以其他方式含有本公开内容的多核苷酸或载体/表达构建体(如，卵泡抑素多核苷酸或载体/表达构建体)中的任一种转化或转染的宿主细胞。使用本领域已知的任何方法，包括转化、转染和转导(如，本文公开的方法中的任一种)，将本公开内容的多核苷酸或克隆/表达构建体引入合适的细胞中。宿主细胞包括经历离体细胞疗法(包括离体基因疗法)的对象的细胞。当携带根据本公开内容的多核苷酸、载体或蛋白时考虑为本公开内容的一方面的真核宿主细胞除了对象自身的细胞(如，人患者自身的细胞)之外还包括VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包括能够修饰表达的多价结合分子的糖基化模式的修饰的CHO细胞，参见美国专利申请公布号2003/0115614)、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞、HepG2细胞、N细胞、3T3细胞、草地贪夜蛾细胞(如Sf9细胞)、酿酒酵母细胞和任何其他的本领域已知可用于表达和任选分离根据本公开内容的蛋白或肽的真核细胞。还考虑了原核细胞，包括大肠肝菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、链霉菌或本领域已知的适用于表达和任选分离根据本公开内容的蛋白质或肽的任何原核细胞。在从原核细胞分离蛋白质或肽中，特别地考虑到可以使用本领域已知的用于从包涵体提取蛋白质的技术。根据本文的教导，适当的宿主的选择在本领域技术人员的范围内。考虑了糖基化本公开内容的融合蛋白的宿主细胞。

术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指含有重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指此类细胞的后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能会在后代中发生，因此此类后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以在被修饰为适于激活启动子、选择转化子或扩增特定基因的常规营养培养基中培养。选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件如温度、pH等对本领域普通技术人员而言是显而易见的。也可以使用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman(1981)Cell 23:175描述的猴肾成纤维细胞的COS-7系，以及能够表达相容载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包括复制起点、合适的启动子和任选的增强子，和还有任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列，以及5'侧翼非转录序列，例如如本文中关于多价结合蛋白质表达构建体制备所述。来源于SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。可以通过本领域技术人员熟悉的多种方法实现构建体引入宿主细胞中，包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染或电穿孔(Davis等人(1986)Basic Methods in MolecularBiology)。

细胞和组合物

在一个实施方案中，已经在体外激活/分化并转染本文所述的经修饰的B细胞以表达如本文所述的治疗剂(如，卵泡抑素)。在一个实施方案中，已在体外激活/分化并工程化(如，使用靶向转基因整合方法，如锌指核酸酶、TALEN、兆核酸酶或CRISPR/CAS9介导的转基因整合)本文所述的经修饰的B细胞以表达如本文所述的治疗剂(如，卵泡抑素)。在一个实施方案中，组合物包含已分化为血浆B细胞、已经被转染或以其他方式工程化并表达一种或多种目标蛋白质(如，卵泡抑素)的B细胞。靶细胞群，如本公开内容的转染的或以其他方式工程化和激活的B细胞群可以单独施用，或与稀释剂和/或其他组分如细胞因子或细胞群组合作为药物组合物施用。

在一个实施方案中，在经修饰的B细胞对特定的趋化物具有最优迁移能力的时间点，体外激活/分化后，从培养物中收获已经被工程化以表达一种或多种目标蛋白质(如，卵泡抑素)的经修饰的B细胞。在一些实施方案中，最优迁移能力可以在B细胞培养的第7天、第8天或第9天。在一些实施方案中，最优迁移能力可以在转染或工程化后B细胞培养的第5天、第6天或第7天。在一些实施方案中，最优迁移能力可以在转染或工程化后B细胞培养的第8天或者在转染或工程化后培养的第8天之后(如，第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天或晚于第20天)。在一些实施方案中，最优迁移能力可在B细胞培养的第10天之前。在一些实施方案中，最优迁移能力可在转染或工程化后B细胞培养的第8天之前。在一些实施方案中，最优迁移能力可在B细胞培养的第6天或第7天。在一些实施方案中，最优迁移能力可在转染或工程化后B细胞培养的第4天或第5天。在一些实施方案中，最优迁移能力可在B细胞培养的第9天之前。在一些实施方案中，最优迁移能力可在转染或工程化后B细胞培养的第7天之前。在一些实施方案中，最优迁移能力对于归巢至CXCL12的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中，最优迁移能力对于归巢至接受经修饰的B细胞的一次或多次施用的对象骨髓的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中，在培养的约第7天至约第9天，以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在转染或工程化后培养的约第5天至约第7天，以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在培养约第10天之前以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在转染或工程化后培养约第8天之前，以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，最优迁移能力对于归巢至CXCL13的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中，最优迁移能力对于归巢至接受经修饰的B细胞的一次或多次施用的对象中的炎症部位的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中，在培养的约第6天或约第7天，以至CXCL13和/或对象中的炎症部位的最优迁移能力，收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在转染或工程化后培养的约第4天或约第5天，以至CXCL13和/或对象中的炎症部位的最优迁移能力，收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在培养约第10天之前，以至CXCL13和/或炎症部位的最优迁移能力，收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中，在转染或工程化后培养约第8天之前，以至CXCL13和/或炎症部位的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。

在一些实施方案中，最优迁移能力对于归巢至CXCL12和CXCL13的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中，在B细胞培养的第7天，以对于归巢至CXCL12和CXCL13的最优迁移能力收获B细胞。在一些实施方案中，在转染或工程化后B细胞培养的第5天，以归巢至CXCL12和CXCL13的最优迁移能力收获B细胞。

在一些实施方案中，当至少约20％的B细胞在趋化性测定中迁移至特定趋化物时收获经工程化的B细胞。例如但不受实例限制，当至少约20％的B细胞在趋化性测定中迁移至CXCL12时可收获经工程化的B细胞(如，产生FST的B细胞)。或者，在另一个非限制性实例中，当至少约20％的B细胞在趋化性测定中迁移至CXCL13时，可收获经工程化的B细胞(如，产生FST的B细胞)。此外，当至少约30％的B细胞在趋化性测定中迁移至特定趋化物(如，CXCL12或CXCL13)时，或当至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％或至少约70％的B细胞在趋化性测定中迁移至特定趋化物(如，CXCL12或CXCL13)时，可收获经工程化的B细胞(如，产生FST的B细胞)。此外，当大于70％的B细胞在趋化性测定中迁移时，可收获经工程化的B细胞(如产生IDUA的B细胞)。此类趋化性测定是本领域中已知的。

简而言之，本公开内容的细胞组合物可包含与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的已被转染并表达如本文所述的治疗剂(如，卵泡抑素)的分化并激活的B细胞群。这类组合物可包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、乳酸林格氏液等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(如氢氧化铝)；和防腐剂。本公开内容的组合物优选被配制为静脉内施用或皮下施用。

在一个实施方案中，在施用之前评估细胞组合物的纯度。在另一个实施方案中，测试细胞组合物的治疗剂产生的稳健性。在一个实施方案中，测试细胞组合物的无菌性。在另一个实施方案中，筛选细胞组合物以确认其匹配接受者对象。

在一个实施方案中，在施用于对象之前，评估了经工程化的B细胞群的多克隆性。在一些实施方案中，确保最终细胞产物的多克隆性是重要的安全参数。具体而言，优势克隆的出现可以被认为可能导致体内肿瘤发生或自身免疫性疾病。可以通过本领域已知的或本文描述的任何手段来评估多克隆性。例如，在一些实施方案中，通过对经工程化的B细胞群中表达的B细胞受体进行测序(如，通过深度测序)来评估多克隆性。由于B细胞受体在B细胞发育过程中经历了变化，从而使其在B细胞之间是独特的，因此该方法允许量化有多少细胞共有相同的B细胞受体序列(意味着它们是克隆的)。因此，在一些实施方案中，在经工程化的B细胞群中表达相同B细胞受体序列的B细胞越多，该群体的克隆就越多，因此将该群体施用于对象的安全性就越低。相反，在一些实施方案中，在经工程化的B细胞群中表达相同B细胞受体序列的B细胞越少，该群体的克隆就越少(即更多多克隆的)，因此将该群体施用于对象的安全性就越高。

在一些实施方案中，在已确定经工程化的B细胞具有足够的多克隆后，将其施用于对象。例如，在确定在最终群体中没有特定的B细胞克隆占总B细胞群的约0.2％以上之后，可将经工程化的B细胞施用于对象。在确定在最终群体中没有特定的B细胞克隆占总B细胞群的约0.1％以上或者总B细胞群的约0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％或约0.04％以上之后，可将经工程化的B细胞施用于对象。在特定的实施方案中，在确定在最终群体中没有特定的B细胞克隆占总B细胞群的约0.03％以上之后，可将经工程化的B细胞(如，其产生卵泡抑素)施用于对象。

在一个实施方案中，在4℃下储存和/或运输细胞组合物。在另一个实施方案中，将细胞组合物冷冻以用于储存和/或运输。可以将细胞组合物冷冻在如-20℃或-80℃。在一个实施方案中，冷冻细胞组合物的步骤包括液氮。在一个实施方案中，使用控制速率的冷冻机冷冻细胞组合物。因此，本文所述的方法还可包括解冻步骤。

使用方法

本发明的一个方面涉及经由递送经工程化以表达治疗剂(如，卵泡抑素)的修饰的B细胞体内递送治疗剂(如，卵泡抑素)。在特定的实施方案中，经修饰以表达卵泡抑素的B细胞用于治疗和/或预防慢性疾病和病症的方法和/或用于增加患者的肌肉大小或力量的方法。

本文所述的经修饰的B细胞可以以适合于待治疗或预防的疾病或病症的方式施用。

尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度的因素决定。

在一个实施方案中，向对象施用单个剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中，向对象依序施用两个或更多个剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中，向对象依序施用三个剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中，以每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每季度一次、每半年(semiannually)一次、每年一次或每两年(biannually)一次向对象施用一定剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中，当由经修饰的B细胞产生的治疗剂的量减少时，向对象施用第二剂量或随后剂量的经修饰的B细胞。

在一个实施方案中，以一定的频率(如，每周、每两周、每月、每两月或每季度)向对象施用一定剂量的经修饰的B细胞，直至在对象中检测到期望量(如有效量)的治疗剂(如，卵泡抑素)。在一个实施方案中，在对象中监测治疗剂(如，卵泡抑素)的量。在一个实施方案中，当由经修饰的B细胞产生的治疗剂的量减少到期望量以下时，向对象施用随后剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中，期望量是产生期望效果的范围。例如，在用于治疗肌营养不良(如贝克肌营养不良)的方法中，卵泡抑素的期望量可以是接受经修饰的B细胞的对象血浆中的量。在一些实施方案中，期望量可以是导致对象一定水平的体重增加的卵泡抑素的量。在一些实施方案中，期望量可以是导致对象一定水平的力量增加的卵泡抑素的量。在一些实施方案中，期望量可以是导致对象一定水平的身体质量增加的卵泡抑素的量。

当指示“有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑患者(对象)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度及状况的个体差异确定待施用的本公开内容的组合物的精确量。B细胞组合物也可以以适当剂量多次施用。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，如,Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。

可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗来确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。也可以在测量生物样品(如，体液，如血浆或组织样品)中的治疗剂(如，卵泡抑素)的水平之后调整治疗，测量生物样品(如，体液，如血浆或组织样品)中的治疗剂(如，卵泡抑素)的水平也可以用于评估治疗功效，并且可以相应地进行调整以增加或减少治疗。

在本公开内容的一些方面，用于多剂量方案的经修饰的B细胞的最优剂量可通过以下来确定：首先确定对象的B细胞的最优单剂量浓度，减少最优单剂量浓度中存在的B细胞的数量以提供经修饰的B细胞的次优单剂量浓度，以及向对象施用两个或更多个剂量的次优单剂量浓度的经修饰的B细胞。在一些方面，向对象施用2个、3个或更多个剂量的次优单剂量浓度的经修饰的B细胞。在一些方面，向对象施用2个、3个或更多个剂量的次优单剂量浓度的经修饰的B细胞导致体内协同产生经修饰的B细胞经工程化以表达的治疗性多肽。在一些方面，次优单剂量浓度为最优单剂量浓度的1/2或3、4、5、6、7、8、9、10倍，或小于最优单剂量浓度。在一些方面，治疗性多肽是卵泡抑素。

在本公开内容的一些方面，可以施用较低数量的在10⁶/千克范围内(每位患者10⁶-10¹¹)的本公开的转染的B细胞。在某些实施方案中，将B细胞以1x 10⁴、5x 10⁴、1x 10⁵、5x10⁵、1x 10⁶、5x 10⁶、1x 10⁷、5x 10⁷、1x 10⁸、5x 10⁸、5x 10⁹、1x 10¹⁰、5x 10¹⁰、1x 10¹¹、5x10¹¹或1x 10¹²个细胞施用于对象。B细胞组合物可以以在这些范围内的剂量多次施用。所述细胞可以是正在接受治疗的患者的自体的或异源的(如，同种异体的)。如果需要的话，治疗还可以包括施用丝裂原(如PHA)或本文所述的淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(如GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-13、IL-21、Flt3-L、RANTES、MIP1α、BAFF等)以增强免疫应答的诱导和输注的B细胞的植入。

可以以任何方便的方式(包括通过气雾剂吸入、注射、摄食、输注、植入或移植)来进行主题组合物的施用。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、鞘内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。本文所述的组合物可以直接施用于患者进入神经系统。在一个实施方案中，将本公开内容的B细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在另一个实施方案中，如本文所述的B细胞组合物优选通过i.v.注射施用。可将B细胞的组合物直接注入肿瘤、淋巴结、骨髓或感染部位。

在又一个实施方案中，可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer,1990,Science249:1527-1533；Sefton 1987,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等人,1980；Surgery 88:507；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见MedicalApplications of Controlled Release,1974,Langer和Wise(编辑),CRC Pres.,BocaRaton,Fla.；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance,1984,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York；Ranger and Peppas,1983；J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人,1985,Science 228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)。在又一个实施方案中，可将控释系统置于治疗性靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，如，Medical Applications of Controlled Release,1984,Langer和Wise(编辑),CRCPres.,Boca Raton,Fla.,第2卷，pp.115-138)。

也可以使用任意数量的基质施用本公开内容的B细胞组合物。在组织工程的背景下，已经使用了基质许多年(参见，如,Principles of Tissue Engineering(Lanza,Langer和Chick(编辑)),1997。本公开内容在用作人造淋巴器官支持和维持B细胞的新背景下利用此类基质。因此，本公开内容可以利用已证明在组织工程中具有实用性的那些基质组合物和制剂。因此，可以用于本公开内容的组合物、装置和方法中的基质类型几乎是不受限的，并且可包括生物基质和合成基质。在一个特定的实例中，利用美国专利第5,980,889号；第5,913,998号；第5,902,745号；第5,843,069号；第5,787,900号；或第5,626,561号所示的组合物和装置。基质包含通常与当施用于哺乳动物宿主时具有生物相容性相关的特征。基质可以由天然和/或合成的材料形成。在需要将永久性结构或可移除结构留在动物体内的情况下，基质是不可生物降解的，如植入物；或可生物降解的。基质可以采取海绵、植入物、管、telfa垫、纤维、中空纤维、冻干组分、凝胶、粉末、多孔组合物或纳米颗粒的形式。此外，可以设计基质以允许接种细胞或产生的细胞因子或其他活性剂持续释放。在某些实施方案中，本公开内容的基质是柔性且有弹性的，并且可以被描述为可以渗透物质如无机盐、水性流体和包括氧气在内的溶解气态物质的半固体支架。

本文使用基质作为生物相容性物质的实例。然而，目前的公开内容不限于基质，因此，无论术语基质(matrice)或基质(matrices)出现在何处，这些术语均应被理解为包括这样的装置和其他物质，其允许细胞滞留或细胞穿越，具有生物相容性并且能够允许大分子直接穿越通过物质，使得该物质本身是半透膜，或与特定的半渗透物质结合使用。

在本公开内容的某些实施方案中，与许多相关治疗形式结合(如之前、同时或之后)来向患者施用使用本文所述的方法或本领域已知的其他方法转染和激活的B细胞，所述治疗形式包括但不限于用药剂如抗病毒剂的治疗，化疗，放射，免疫抑制剂如环孢菌素、bisulfin、硼替佐米、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506，抗体，或其他免疫消融剂(immunoablative agent)如CAMPATH，抗CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素、氟达拉滨(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)、蛋白酶体(硼替佐米)，或抑制对于生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993；Isoniemi(同上))。在进一步的实施方案中，本公开的细胞组合物与骨髓移植、使用化疗剂如氟达拉滨、体外放射线疗法(XRT)、环磷酰胺或者抗体如OKT3或CAMPATH进行T细胞消融疗法(T cell ablative therapy)结合(如之前、同时或之后)施用于患者。在一个实施方案中，在B细胞消融疗法如与CD20反应的药剂如

之后施用本公开内容的细胞组合物。在一个实施方案中，在使用药剂如硼替佐米进行的B细胞消融疗法之后施用本公开内容的细胞组合物。例如，在一个实施方案中，对象可经历用高剂量化疗进行的标准治疗，然后是外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，对象接受本公开内容的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

待施用于患者的上述治疗的剂量将随所治疗病况的确切性质和治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践来缩放供人施用的剂量。

经修饰的B细胞可用于治疗或预防各种疾病和病症。在特定的实施方案中，经修饰以表达卵泡抑素的B细胞用于增加患者肌肉大小或力量的方法中。例如，本公开内容提供了增加对象的肌肉大小或力量的方法，所述方法包括施用有效量的表达卵泡抑素多肽的B细胞。增加的肌肉大小或力量通常可以在整个对象中发生，或者它可以在靶向肌肉中发生。靶向肌肉可能是受损的、弱化的或缺乏的，如可以是在多种肌肉病症中的情况一样，所述肌肉病症包括肌营养不良(如杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、Emery Dreifuss肌营养不良、肢带型肌营养不良、脊柱强直综合征、Ulirich综合征、福山型肌营养不良、Walker-Warburg综合征、肌-眼-脑病、面肩肱型肌营养不良)，先天性肌营养不良，肌强直性营养不良(Steinert病)，非营养不良性肌强直，周期性麻痹，脊髓性肌萎缩，家族性肌萎缩性侧索硬化，遗传性运动和感觉神经病，Charcot-Marie-Tooth病，慢性炎性神经病，远端肌病，肌管/中央核性肌病，线状体肌病(nemaline myopathy)，迷你核心病，中心性核心病，desminopathy，包涵体肌炎，线粒体肌病，先天性肌无力综合征，脊髓灰质炎后肌肉功能障碍以及Emery(2002)The Lancet,359:687-695；和Khurana等人,(2003)Nat.Rev.DrugDisc.,2:379-386)中所述的病症，炎性肌肉病症(如包涵体肌炎)，肌肉损伤或创伤，肌肉废用(可能在长期卧床休息或肢体固定后发生)和由于各种类型的衰老、癌症或慢性疾病导致的肌肉萎缩或弱化。例如，在一些情况下，肌肉可能由于肌肉减少症而受损、弱化或缺乏。在一些情况下，肌肉可能由于脊髓性肌萎缩(SMA)而受损、弱化或缺乏。在一些情况下，肌肉可能由于肌萎缩性侧索硬化症(ALS)而受损、弱化或缺乏。在一些情况下，肌肉可能由于庞贝病而受损、弱化或缺乏。所述方法还可以增加健康肌肉中的肌肉大小或力量。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗个体中的疾病或病症的方法，其包括向有需要的对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗个体中的肌肉病症的方法，所述方法包括向患有或疑似患有这样的肌肉病症的对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)，其中所述肌肉病症是肌营养不良。在一些实施方案中，所述肌营养不良选自杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、Emery Dreifuss肌营养不良、肢带型肌营养不良、脊柱强直综合征、Ulirich综合征、福山型肌营养不良、Walker-Warburg综合征、肌-眼-脑病、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、肌强直性营养不良(Steinert病)、非营养不良性肌强直、周期性麻痹、脊髓性肌萎缩、家族性肌萎缩性侧索硬化、遗传性运动和感觉神经病、Charcot-Marie-Tooth病、慢性炎性神经病、远端肌病、肌管/中央核性肌病、线状体肌病(nemaline myopathy)、迷你核心病、中心性核心病、desminopathy、包涵体肌炎、线粒体肌病、先天性肌无力综合征、脊髓灰质炎后肌肉功能障碍以及Emery(2002)The Lancet,359:687-695；和Khurana等人,(2003)Nat.Rev.DrugDisc.,2:379-386)中所述的病症。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗个体中的肌肉病症的方法，其包括向患有或疑似患有这样的肌肉病症的对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)，其中所述肌肉病症是炎性肌肉病症。在一些实施方案中，所述炎性病症是包涵体肌炎。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗个体中的肌肉病症的方法，其包括向患有或疑似患有这样的肌肉病症的对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)，其中所述肌肉病症由肌肉损伤或创伤引起。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗个体中的肌肉病症的方法，其包括向患有或疑似患有这样的肌肉病症的对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)，其中所述肌肉病症由肌肉废用(如，可能在长期卧床或肢体固定后发生)引起。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗个体中的肌肉病症的方法，其包括向患有或疑似患有这样的肌肉病症的对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)，其中所述肌肉病症选自由于各种类型的衰老、癌症或慢性疾病导致的肌肉萎缩或弱化。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗表现出轻度、中度或重度的肌无力、肌肉消耗和/或对独立行走的影响的个体的方法，其包括向对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗表现出轻度、中度或重度的肌肉脆性、肌肉肥大、肌肉假性肥大、关节挛缩、骨骼变形、心肌病、吞咽受损、肠和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知损害、行为功能障碍、社会化缺损、脊柱侧凸和/或呼吸功能受损的个体的方法，其包括向对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)。

在特定的实施方案中，本公开内容提供了用于治疗个体中的肌营养不良的方法，其包括向患有或疑似患有贝克肌营养不良的对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)。

在一些实施方案中，将单个最大有效剂量的卵泡抑素+B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)施用于对象。在一些实施方案中，将两个或更多个剂量的卵泡抑素+B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)施用于对象，从而使移植的卵泡抑素+B细胞的量最大化。在一些实施方案中，施用于对象的两个或更多个剂量的卵泡抑素+B细胞(如表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)包含比单个最大有效剂量的卵泡抑素+B细胞更少的卵泡抑素+B细胞。在一些实施方案中，当以低于卵泡抑素+B细胞的最大有效单剂量的卵泡抑素+B细胞的剂量向对象施用两个或更多个剂量的卵泡抑素+B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)时，导致出现卵泡抑素产生的协同增加。在一个实施方案中，向对象施用卵泡抑素+B细胞导致在健康对照对象中观察到正常水平的卵泡抑素。在一个实施方案中，向对象施用卵泡抑素+B细胞导致对象中卵泡抑素的水平高于正常水平。在一个实施方案中，向对象施用卵泡抑素+B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)增加对象的力量。在一个实施方案中，与正常水平相比，向对象施用卵泡抑素+B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)增加对象的力量。在一个实施方案中，向对象施用卵泡抑素+B细胞(如，表达FST344转录物变体的卵泡抑素+B细胞)防止对象失去力量。

实施例

实施例1

表达卵泡抑素的B细胞的产生

产生用于转座和表达人卵泡抑素(FST)的睡美人转座子和转座酶构建体。组装转座子以在B细胞中实现FST基因整合和表达。我们使用EEK启动子(由来自人免疫球蛋白基因的启动子和增强子元件以及先前描述的其它调控元件组成)以在B细胞中实现高水平表达。为了测试FST转座和表达，从两个单独的供体中分离人B细胞，在B细胞培养基中培养扩增，并在具有5％CO2的37℃培养箱中温育，在第3天用pKT2/EEK-FST344加上编码SB100x转座酶的mRNA进行电穿孔。电穿孔后第2天、第5天、第8天和第11天(即培养的第5天、第7天、第11天和第14天)制备的细胞裂解物含有比野生型非转染细胞显著增加的FST，显示了SB转座子系统在扩增的人B细胞中实现高水平FST表达的有效性(图5A)。值得注意的是，从第5天略微降低后(可能是由于初始附加型FST表达)，FST表达在第7天-第14天持续存在，表明构建体稳定整合到B细胞中。实际上，RT-PCR确认了FST插入物稳定整合到B细胞基因组中(图5B)。在以下实施例中，这些表达FST的B细胞被称为FST+B细胞。

实施例2

FST的体内产生

为了确定根据本公开内容工程化的B细胞是否能够促进体内FST产生的增加，我们用实施例1中产生的FST+B细胞注射野生型小鼠。

具体地，四只小鼠在第0天接受静脉内(尾静脉)注射媒介物(500μl磷酸盐缓冲盐水(PBS))或者在媒介物(PBS)中稀释至500μl的2×10⁶人FST+B细胞。另外，在第-7天，用3x10⁶个富集CD4+T细胞的初级自体外周血细胞腹膜内(i.p.)输注小鼠来为pKT2/EEK-FST加上编码转座B细胞的SB100x转座酶的mRNA提供支持。我们在用FST+B细胞处理的小鼠的血浆中观察到人FST的两倍增加，这为成功的人B细胞过继转移提供了强有力的证据(图1)。FST水平在输注后约28天达到峰值，并在第35天降至接近正常水平。虽然未在FST缺陷型动物中进行，但来自该实验的结果仍然提供了在向wt小鼠中引入高效的FST+B细胞群后可以实现的人FST水平的实例。我们发现FST的血浆水平与人IgG的血浆水平相关；因此，提供了FST+B细胞过继转移和植入的证据(图2A-2D)。

为了确定FST+B细胞是否对处理的小鼠具有任何作用，我们在输注后35天监测对照和FST+B细胞处理的小鼠的体重。如图3所示，FST+B细胞比媒介物对照处理的小鼠平均增长4.1％(0.9克)。此外，体重增加的增加对应于前腿握力测试(与媒介物对照相比，FST+B细胞处理的小鼠中的16％的改善)(图4A)；四腿握力测试(与媒介物对照相比，FST+B细胞处理的小鼠中的23％的改善)(图4B)；悬挂测试(与媒介物对照相比，FST+B细胞处理的小鼠的23％的改善)(图4C)中的显著力量改善。

因此，这些数据显示了B细胞可用于本文公开的方法中以表达FST并将FST递送至对象以诱导体重增加和力量改善。

可以将上述各种实施方案进行组合以提供另外的实施方案。在本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。如果必要，可以修改实施方案的各方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供另外的实施方案。

可以根据以上详述对实施方案进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求所享有的等效物的全部范围。因此，该权利要求不受公开内容的限制。

序列表

<110> 益缪索夫特公司(Immunsoft Corporation)

马修·瑞恩·舒尔茨(Scholz, Matthew Rein)

埃里克·J·赫比格(Herbig, Eric J.)

R·斯科特·麦基弗(McIvor, R. Scott)

<120> 经遗传工程化以分泌卵泡抑素的B细胞以及使用所述B细胞来治疗卵泡抑素相关的疾病、病况、病症及增强肌肉生长和力量的方法

<130> IMCO-008/01WO 312423-2028

<150> US 62/644,362

<151> 2018-03-16

<150> US 62/644,356

<151> 2018-03-16

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 317

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys

20 25 30

Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr

35 40 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

50 55 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile

65 70 75 80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

85 90 95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105 110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys

115 120 125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135 140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr

145 150 155 160

Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

165 170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

180 185 190

Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly

195 200 205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215 220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile

225 230 235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280 285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295 300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

305 310 315

<210> 2

<211> 288

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu

1 5 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys

35 40 45

Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu

50 55 60

Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn

65 70 75 80

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile

85 90 95

Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

100 105 110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu

115 120 125

Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys

130 135 140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

145 150 155 160

Val Thr Cys Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr

165 170 175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

180 185 190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200 205

Lys Cys Ile Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly

210 215 220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

225 230 235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala

245 250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265 270

Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280 285

<210> 3

<211> 344

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys

20 25 30

Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr

35 40 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

50 55 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile

65 70 75 80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

85 90 95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105 110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys

115 120 125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135 140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr

145 150 155 160

Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

165 170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

180 185 190

Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly

195 200 205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215 220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile

225 230 235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280 285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295 300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser

305 310 315 320

Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe

325 330 335

Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp

340

<210> 4

<211> 315

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu

1 5 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys

35 40 45

Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu

50 55 60

Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn

65 70 75 80

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile

85 90 95

Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

100 105 110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu

115 120 125

Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys

130 135 140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

145 150 155 160

Val Thr Cys Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr

165 170 175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

180 185 190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200 205

Lys Cys Ile Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly

210 215 220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

225 230 235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala

245 250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265 270

Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280 285

Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp

290 295 300

Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp

305 310 315

Claims

1.重组B细胞，其包含卵泡抑素基因。

2.如权利要求1所述的B细胞，其中所述卵泡抑素基因与启动子可操作地连接。

3.如权利要求1或2所述的B细胞，其中所述卵泡抑素基因是人卵泡抑素基因。

4.如权利要求1-3中任一项所述的B细胞，其中所述卵泡抑素基因是人卵泡抑素FST-344剪接位点变体。

5.如前述权利要求中任一项所述的B细胞，其中所述B细胞是人B细胞。

6.如前述权利要求中任一项所述的B细胞，其中已经用所述卵泡抑素基因转导或转座所述B细胞。

7.如权利要求1-6中任一项所述的B细胞，其中所述B细胞包含所述卵泡抑素基因，因为已经使用转座子系统用所述卵泡抑素基因转导所述B细胞。

8.如权利要求7所述的B细胞，其中所述转座子系统是睡美人转座子系统或Piggybac转座子系统。

9.如权利要求1-7中任一项所述的B细胞，其中所述B细胞由于转导有携带所述卵泡抑素基因的病毒而表达所述卵泡抑素基因。

10.如权利要求1-7中任一项所述的B细胞，其中所述B细胞包含所述卵泡抑素基因，因为已经用包含所述卵泡抑素基因的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒转导所述B细胞。

11.如权利要求1-7中任一项所述的B细胞，其中使用靶向整合方法将所述B细胞工程化以含有所述卵泡抑素基因。

12.如权利要求11所述的B细胞，其中所述靶向整合利用锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和/或CRISPR/Cas系统中的一种或多种，所述CRISPR/Cas系统包括但不限于CRISPR/Cas9系统。

13.如权利要求1-7中任一项所述的B细胞，其中通过使用选自以下的方法引入编码卵泡抑素的核酸，将所述B细胞工程化以包含所述卵泡抑素基因：逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺相关病毒载体，腺病毒载体，任何其它RNA或DNA病毒载体，使用化学或物理手段，如脂质转染、聚阳离子络合、电穿孔等引入的编码卵泡抑素的非病毒DNA和/或RNA。

14.如前述权利要求中任一项所述的B细胞，其中所述卵泡抑素蛋白由所述重组B细胞分泌。

15.向对象递送卵泡抑素的方法，其包括施用包含卵泡抑素基因的重组B细胞。

16.向有需要的对象递送卵泡抑素的方法，其包括施用权利要求1-14中任一项所述的重组B细胞。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述对象是人。

19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述对象患有肌营养不良。

20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述对象患有贝克肌营养不良。

21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中向所述对象施用所述重组B细胞实现了对所述对象的疾病、病症或病况的治疗。

22.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中向所述对象施用所述重组B细胞实现了肌营养不良的治疗。

23.如权利要求15-22中任一项所述的方法，其中向所述对象施用所述重组B细胞引起所述对象体重增加。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述对象增加至少约4％的体重。

25.如权利要求24所述的方法，其中在30天内发生体重的显著增加。

26.如权利要求24所述的方法，其中在约30天内发生体重的显著增加。

27.如权利要求15-26中任一项所述的方法，其中向所述对象施用所述重组B细胞使所述对象获得肌肉质量。

28.如权利要求15-27中任一项所述的方法，其中向所述对象施用所述重组B细胞使所述对象变得更强壮。

29.如权利要求15-28中任一项所述的方法，其中所述重组B细胞的施用导致所述对象的卵泡抑素的血浆水平增加。

30.治疗、预防或改善肌肉病症的方法，其通过施用包含卵泡抑素基因的重组B细胞来进行。

31.治疗、预防或改善肌营养不良的方法，其通过施用权利要求1-13中任一项所述的重组B细胞来进行。

32.如权利要求1-13中任一项所述的重组B细胞，其中所述重组B细胞衍生自获自所述对象的B细胞或者衍生自获自所述对象的细胞的B细胞。

33.如权利要求32所述的重组B细胞，其中所述重组B细胞衍生自获自所述对象的B细胞祖细胞。

34.如权利要求32所述的重组B细胞，其中所述重组B细胞衍生自获自所述对象的细胞，所述细胞已经去分化成所述B细胞或B细胞祖细胞。

35.如权利要求1-13和32-34中任一项所述的重组B细胞，其中所述重组B细胞通过以下工程化：

(a)从所述对象的血液中收集和分离免疫细胞；

(b)用编码所述卵泡抑素的DNA转导所述细胞；

(c)离体扩增选定的细胞；和

(d)将所述扩增的细胞离体分化为浆细胞和/或浆母细胞。

36.如权利要求35所述的重组B细胞，其中来自步骤a的分离的免疫细胞是CD19阳性细胞。

37.如权利要求35或36所述的重组B细胞，其中通过电穿孔进行步骤b中的转导。

38.如权利要求37所述的重组B细胞，其中所述电穿孔利用所述睡美人转座子系统。

39.如权利要求35-38中任一项所述的重组B细胞，其中所述分化的细胞是CD38(+)和CD20(-)。

40.方法，其包括向对象施用权利要求35-39中任一项所述的重组B细胞。

41.如权利要求15-31和35-40中任一项所述的方法，其中所述方法包括向对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰的B细胞。

42.如权利要求41所述的方法，其中施用包括在次优单剂量浓度下的两个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。

43.如权利要求41所述的方法，其中施用包括三个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。

44.如权利要求41所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞是所述对象自体的。

45.如权利要求41所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞是所述对象同种异体的。

46.如权利要求41所述的方法，其中所述对象是人。

47.如权利要求41所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38-和CD138-。

48.如权利要求41所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138+。

49.如权利要求41所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138-。

50.如权利要求41所述的方法，其中所述施用包括静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射、鞘内注射、前房内注射或肌内注射。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述施用包括静脉内注射。

52.如权利要求15-31和35-51中任一项所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞在培养后第2天或第3天进行工程化。

53.如权利要求52所述的方法，其中使用包括电穿孔的方法对所述经遗传修饰的B细胞进行工程化。

54.如权利要求15-31和35-53中任一项所述的方法，其中

(a)在体外培养的第1天至第12天的某一天收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象，

(b)在工程化后培养的第4天、第5天、第6天、或第7天、或第8天收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。

55.如权利要求15-31和35-54中任一项所述的方法，其中在工程化后开始培养的第8天或以后收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。

56.如权利要求55所述的方法，其中在工程化后开始培养的第10天或更早收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。

57.如权利要求15-31和35-56中任一项所述的方法，其中收获的经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子。

58.如权利要求15-31和35-57中任一项所述的方法，其中在确定所述经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子的培养时间点收获所述经遗传修饰的B细胞。

59.如权利要求15-31和35-58中任一项所述的方法，其中在工程化前和工程化后的整个培养期内，使所述经遗传修饰的B细胞在包含IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-31和多聚化的CD40配体中的每一种的培养系统中生长。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述多聚化的CD40配体是使用抗his抗体进行多聚化的HIS标记的CD40配体。

61.如权利要求15-31和35-60中任一项所述的方法，其还包括在向所述对象施用之前扩增所述经遗传修饰的B细胞。

62.如权利要求61所述的方法，其中扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体显示高度的多克隆性。

63.如权利要求61所述的方法，其中所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.2％以下。

64.如权利要求61所述的方法，其中所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.05％以下。

65.如权利要求15-31和35-64中任一项所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞包含编码选择标志物的多核苷酸。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述选择标志物是对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因含有在氨基酸22处的亮氨酸至酪氨酸的置换突变以及在氨基酸31处的苯丙氨酸至丝氨酸的置换突变。

68.如权利要求15-31和35-67中任一项所述的方法，其包括在收获用于施用之前用甲氨蝶呤处理所述经遗传修饰的B细胞。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述甲氨蝶呤处理是100nM至300nM。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述甲氨蝶呤处理是200nM。

71.如权利要求15-31和35-70中任一项所述的方法，其中所述经遗传修饰的B细胞在施用于所述对象后迁移至多种组织。

72.如权利要求15-31和35-71中任一项所述的方法，其中向所述对象施用的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至选自以下的一种或多种组织：骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。

73.如权利要求72所述的方法，其中施用于所述对象的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至所述对象的骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。

74.修饰的B细胞，其经转导以表达卵泡抑素基因和DHFR基因。

75.治疗肌肉病症的方法，其包括向对象施用经遗传修饰以表达卵泡抑素的B细胞。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述肌肉病症选自肌营养不良、炎性肌肉病症、肌肉损伤或创伤、肌肉废用和肌肉萎缩或弱化。

77.如权利要求75或76所述的方法，其中所述肌营养不良是杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良或面肩肱型肌营养不良。

78.如权利要求75或76所述的方法，其中所述炎性肌肉病症是包涵体肌炎。

79.如权利要求75或76所述的方法，其中在长期卧床休息或肢体固定后发生所述肌肉废用。

80.如权利要求75或76所述的方法，其中所述肌肉萎缩或弱化是由衰老、癌症或慢性疾病引起的。

81.如权利要求75所述的方法，其中所述肌肉病症是肌肉减少症。

82.如权利要求75所述的方法，其中所述肌肉病症是脊髓性肌萎缩(SMA)。

83.如权利要求75所述的方法，其中所述肌肉病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

84.如权利要求75所述的方法，其中所述肌肉病症是庞贝病。

85.如权利要求75-84中任一项所述的方法，其中所述卵泡抑素包含SEQ ID NO:1-4中任一项所示的氨基酸序列。